TW201934753A - 具有新穎結構之治療性酶融合蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關一種二聚合治療性酶與免疫球蛋白Fc區之間之融合蛋白、其製法、及包含該融合蛋白之組成物。
Description
本發明係有關一種包含二聚合治療性酶之酶融合蛋白、其製法、及含該酶融合蛋白之組成物。
溶酶體為細胞質器官,其功能在於降解大分子,如:蛋白質、多核苷酸、多醣、與脂質。溶酶體之內部環境為酸性,其中包含促進生物性大分子水解之水解酶酵素。已發現溶酶體在通過細胞內胞吞作用吸收分子時扮演某種角色。
溶酶體儲積症(下文中稱為LSD)為一種遺傳代謝疾患,其特徵在於溶酶體功能喪失。LSD係因缺少會降解如:脂質、蛋白質、多醣等等物質之酶所造成,且其等發生率通常為100,000分之一,以體染色體隱性遺傳特性遺傳。當特定降解性酶缺乏或缺失時,及當此等降解性酶不足時,即出現LSD,所造成過量物質無法降解而累積,最後造成細胞功能問題。如同許多其他遺傳疾患,LSD會由患者遺傳。此外,此等疾病各由涉及不同酶轉譯之任何基因突變所造成。造成此等疾病之酶通常具有類似生化性質,且所有LSD均由物質在溶酶體中異常累積所造成。目前,已知約50種不同LSD型態(例如:尼曼匹克症(Niemann-Pick disease)、法布瑞氏症(Fabry’s disease)、高雪氏症(Gaucher disease)、
韓特氏症候群(Hunter syndrome)、馬洛托-拉米氏症候群(Maroteaux-Lamy syndrome)等等)。
法布瑞氏症已知為一種LSD,係一種因缺乏或缺失α-半乳糖苷酶A(一種存在於溶酶體中之水解酶)之酶活性而發生之先天性鞘糖脂代謝疾患。
α-半乳糖苷酶A為一種水解醯基鞘胺醇三己糖(Gb3)成為乳糖基神經醯胺之酶,已知α-半乳糖苷酶A失調會造成Gb3在血管壁及不同身體部位中異常累積,因而發生法布瑞氏症。
治療此等LSD之代表性方法可為酶置換療法(ERT),目前已有許多相關研究正在進行(Frances M.Platt等人,J Cell Biol.2012 Nov 26;199(5):723至34)。特定言之,由於LSD為一種由特定酶中之遺傳缺陷引起之疾患,需要置換療法來治療該酶缺陷。酶置換療法為LSD之標準療法,該療法之效應在於藉由置換所缺乏之酶來緩和已出現之症狀或延緩該疾病之惡化。
然而,具有此等治療效力之蛋白質通常具有低的安定性,因此容易變性及被血液中蛋白酶降解。因此,為了維持此等蛋白質之血中濃度及藥效,必需經常投與。
然而,以呈注射形式投與給患者之蛋白質藥物為例,為了維持活性多肽血中濃度而頻繁注射可能造成患者嚴重疼痛。為了解決此等問題,已持續努力藉由提高治療性酶之血液安定性及及長期維持其高度血液濃度,來達到最大藥效。治療性酶之此等長效性調配物需要提高治療性酶之安定性,並同時維持藥物本身夠高程度之效力,而且不可以導致患者免疫反應。
因此,需要發展一種對標靶疾病具有治療效力之治療劑,其中維持融合蛋白之活性,同時延長融合蛋白在活體內保持安定之時間期。
本發明之目的在於提供一種如下式1之酶融合蛋白:
其中X與X'各獨立為相同或不同類型之治療性酶;L與L'為連接基,各獨立為相同或不同類型之連接基;F為免疫球蛋白Fc區;|為共價鍵;及:為共價鍵或非共價鍵。
本發明另一個目的係提供一種包含該酶融合蛋白之醫藥組成物,供預防或治療LSD。
本發明又另一個目的係提供一種編碼該酶融合蛋白之多核苷酸。
本發明又另一個目的係提供一種包含該多核苷酸之表現載體。
本發明又另一個目的係提供一種其中已引入該表現載體之轉形體。
本發明又另一個目的係提供一種製備該酶融合蛋白之方法,其包括培養該轉形體以得到培養物;及從培養物中回收酶融合蛋白。
本發明之一個態樣係提供一種酶融合蛋白,其中治療性酶與免疫球蛋白Fc區共同融合。
本發明之一個特定具體實施例中,該酶融合蛋白可由下式1代表:
其中X與X'各獨立為相同或不同類型之治療性酶;L與L'為連接基,各獨立為相同或不同類型之連接基;F為免疫球蛋白Fc區;|為共價鍵;及:為共價鍵或非共價鍵。
根據前述特定具體實施例之酶融合蛋白中,該治療性酶可以透過非共價鍵形成二聚體。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,該治療性酶可以形成呈彼此反向平行構型之二聚體。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,相較於未與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酶,該酶融合蛋白具有提高之安定性及降低對溶酶體受體之結合親和性。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,該酶可選自由下列各者所組成之群組:β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神經醯胺酶、酸性神經鞘磷脂酶、半乳糖腦苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、B、β-己糖胺酶A、B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、N-乙醯基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、溶酶體酸性脂酶、α-N-乙醯基-D-胺基葡萄糖苷酶、
葡萄糖腦苷脂酶、丁醯基膽鹼酯酶、殼多醣酶、麩胺酸脫接基酶、雪瑞素(imiglucerase)、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙醯基水解酶、中性內切肽酶、與髓過氧化酶。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,該酶可為α-半乳糖苷酶A或β-半乳糖苷酶。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,該免疫球蛋白Fc區可在原始免疫球蛋白Fc區之至少一個胺基酸具有一個選自由:取代、添加、刪除、修飾、與其組合所組成群組之變異。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,具有胺基序列SEQ ID NO:8之免疫球蛋白Fc區中,第2個胺基酸被脯胺酸取代;第71個胺基酸被麩醯胺取代;或第2個胺基酸被脯胺酸取代及第71個胺基酸被麩醯胺取代。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,該免疫球蛋白Fc區中可能沒有發生鏈交換。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,該免疫球蛋白Fc區可能選自由以下各者所組成之群組:(a)CH1功能域、CH2功能域、CH3功能域、與CH4功能域;(b)CH1功能域與CH2功能域;(c)CH1功能域與CH3功能域;(d)CH2功能域與CH3功能域;及(e)CH1功能域、CH2功能域、CH3功能域、與CH4功能域中之一個或兩個或更多個功能域與免疫球蛋白鉸鏈區或一部分鉸鏈區之間之組合。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,該免疫球蛋白Fc區可呈單體形式。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,該免疫球蛋白Fc區可由鉸鏈區、CH2功能域、與CH3功能域所組成。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,在該免疫球蛋白Fc區中:可移除可以形成二硫鍵之區;可移除原始Fc之N-末端某個胺基酸殘基;可在原始Fc型之N-末端添加甲硫胺酸殘基;可移除補體-結合位點;或可刪除抗體-依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)位點。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,該免疫球蛋白Fc區係無糖基化。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,該免疫球蛋白Fc區可為衍生自:IgG、IgA、IgD、IgE、或IgM之Fc片段。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,該免疫球蛋白Fc區可為具有衍生自選自由:IgG、IgA、IgD、IgE、及IgM所組成群組之免疫球蛋白之不同來源之功能域之雜合體。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,該免疫球蛋白Fc區為IgG4 Fc區。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,該IgG4 Fc區之鉸鏈區可被IgG1鉸鏈區取代。
根據前述特定具體實施例中任一者之酶融合蛋白中,該酶融合蛋白可包括SEQ ID NO:13之胺基酸序列。
本發明另一項態樣提供一種包含酶融合蛋白之醫藥組成物,供預防或治療LSD。
根據特定具體實施例之組成物中,LSD係選自由以下各者所組成群組:黏多醣症(MPS)、肝醣儲積症、神經鞘脂質代謝障礙症、尼曼匹克症、法布瑞氏症、高雪氏症(Gaucher disease)、韓特氏症候群、與馬洛托-拉米氏症候群。
根據前述特定具體實施例之組成物中,該組成物可以降低酶對溶酶體受體之結合親和性。
本發明再另一態樣提供一種編碼該酶融合蛋白之多核苷酸。
本發明再另一態樣提供一種包含該多核苷酸之表現載體。
本發明再另一態樣提供一種其中已引入該表現載體之轉形體。
本發明再另一態樣提供一種製備酶融合蛋白之方法。
根據特定具體實施例製備酶融合蛋白之方法中,該方法包括培養該轉形體以得到培養物;及從培養物中回收酶融合蛋白。
本發明係有關一種包含二聚合治療性酶之融合蛋白,更明確言之,係有關一種酶融合蛋白,其中由免疫球蛋白Fc區與治療性酶融合,因此可提高治療性酶安定性,及降低酶被腎臟排除之機轉。本發明酶融合蛋白由於已延長持續時間,因此可被患者有效利用。此外,本發明酶融合蛋白包含二聚合治療性酶,因此可以減少製備步驟及降低製造成本。
第1圖顯示說明α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白活性之測定結果。
第2圖顯示重組半乳糖苷酶(agalsidase)-β與α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之間之活體外酶活性比較結果。
第3圖顯示重組半乳糖苷酶-β與α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之間之活體外細胞內吸收活性比較結果之圖式。
第4圖顯示重組半乳糖苷酶-β與α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之間之藥物動力學表現比較結果之圖式。
下文將詳細說明較佳具體實施例。同時,本文所揭示之各說明與具體實施例亦可應用於其他說明與具體實施例。亦即,本文所揭示各種不同元素之所有組合均屬於本發明之範疇。此外,本發明之範疇不應受下文所提供之特定揭示內容之限制。
此外,彼等習此相關技藝者依據例行實驗將了解或可證實本申請案中所說明本發明之特定具體實施例之許多等效物,且此等等效物均旨在包括在本發明中。
本說明書全文中,不僅採用天然胺基酸之常用單字母或三字母代碼,其他胺基酸通常亦可採用彼等三字母代碼,如:α-胺基異丁酸(Aib)、Sar(N-甲基甘胺酸)、α-甲基-麩胺酸等等。此外,本文中以縮寫表示之胺基酸係依據以下IUPAC-IUB規則說明:丙胺酸 A;精胺酸 R;天冬醯胺 N;天冬胺酸 D;
半胱胺酸 C;麩胺酸 E;麩醯胺 Q;甘胺酸 G;組胺酸 H;異白胺酸 I;白胺酸 L;離胺酸 K;甲硫胺酸 M;苯基丙胺酸 F;脯胺酸 P;絲胺酸 S;蘇胺酸 T;色胺酸 W;酪胺酸 Y;與纈胺酸 V。
本發明一項態樣提供一種如式1之酶融合蛋白:
其中X與X'分別獨立為相同或不同類型之治療性酶;L與L'為連接基,各獨立為相同或不同類型之連接基;F為免疫球蛋白Fc區;|為共價鍵;及:為共價鍵或非共價鍵。
本文所採用術語「酶融合蛋白」可以指其中由免疫球蛋白Fc區與治療性酶融合,使該治療性酶得以維持其活性,同時可以相較於未與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酶,降低其對溶酶體受體之結合親和性,藉以延長其血液半衰期。本發明酶融合蛋白可用為酶置換療法(ERT)之藥物。該酶置換療法可以透
過藉由補充造成該疾病之缺陷或缺乏之酶,而恢復已破壞之酶功能來預防或治療疾病。
本發明者已利用免疫球蛋白Fc區製備融合蛋白,以延長治療性酶之血液半衰期。特定言之,使用IgG4 Fc類似物作為Fc區,其中可能糖基化之序列已被取代,以抑制糖基化,此外,IgG4 Fc之鉸鏈序列被取代,以抑制鏈交換。
此外,已證實在製備本發明酶融合蛋白時,當各治療性酶與免疫球蛋白Fc區融合而形成二聚體(特定言之,依反向平行構型連接之二聚體)時,可以延長該酶融合蛋白於活體內之持續時間期,同時維持該治療性酶之活性,此外可以減少該酶融合蛋白之製備步驟,藉以能有效生產。
因此,本發明酶融合蛋白具有之優點在於相較於未與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酶,可以維持酶活性,同時提高酶之安定性,而降低製造成本。
本文所採用術語「治療性酶」係指用於治療因缺少、缺乏、功能障礙等等所發生疾病之酶,該酶可藉由酶置換療法、投與法等等治療罹患該疾病之個體。明確言之,該酶可為治療可能因溶酶體酶缺少、缺乏等等而發生LSD之酶,但酶不受此限制。
包括在本發明酶融合蛋白中之治療性酶沒有特別限制,但可能包括具有可以比未與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酶型態更延長其在活體內持續時間期優點之任何治療性酶。本發明之例示性具體實施例中,該酶融合蛋白為治療性酶之融合蛋白。
包括在本發明酶融合蛋白中之治療性酶可以為透過非共價鍵而形成二聚體者,但治療性酶不受此限制。明確言之,當在轉形體中表現融合蛋白且免疫球蛋白Fc區形成二聚體時,治療性酶可能形成二聚體。
此治療性酶之二聚體可能呈由兩種彼此相同之酶形成之形式,或呈由兩種不同酶形成之形式。構成二聚體之明確酶類型沒有限制,只要此等酶在活體內具有所需活性即可。
同時,此等構成二聚體之治療性酶可能呈平行二聚體或反向平行二聚體形式,端賴其等連結之方向而定,但治療性酶不受其等限制。
本發明之例示性具體實施例中,製備其中由α-半乳糖苷酶(亦即,治療性酶)與免疫球蛋白Fc區融合之融合蛋白,且已證實α-半乳糖苷酶透過非共價鍵形成反向平行二聚體,而融合蛋白之免疫球蛋白Fc區則形成二聚體。此外,已證實即使為融合蛋白與免疫球蛋白Fc區融合之狀態,該融合蛋白仍可以維持酶活性(實例2)。
本發明之另一例示性具體實施例中,比較其中α-半乳糖苷酶與免疫球蛋白Fc區融合之融合蛋白及未與免疫球蛋白Fc區融合之重組半乳糖苷酶(agalsidase)-β。結果證實,該融合蛋白儘管已與Fc區融合,仍維持其活體外酶活性及細胞內吸收活性(實例2與3),且亦證實此等融合蛋白由於已與Fc區融合,而具有優異之藥物動力學表現(實例4)。
本文所採用術語「平行二聚體」意指形成二聚體之各單體之胺基酸序列之N-末端與C-末端在各單體形成二聚體時呈相同方向。特定言之,可能透過非共價鍵或共價鍵形成二聚體,但形成平行二聚體之方法不受此限制。
本文所採用術語「反向平行二聚體」意指形成二聚體之各單體之胺基酸序列之N-末端與C-末端在各單體形成二聚體時呈彼此不同方向。特定言之,可能透過非共價鍵或共價鍵形成二聚體,但形成反向平行二聚體之方法不受此限制。
換言之,本發明酶融合蛋白中:(i)一種治療性酶(X)之N-末端與另一種治療性酶(X')之N-末端可能依相同方向形成二聚體;(ii)一種治療性酶(X)之C-末端與另一種治療性酶(X')之C-末端可能依相同方向形成二聚體;(iii)一種治療性酶(X)之N-末端與另一種治療性酶(X')之C-末端可能依相同方向形成二聚體;或(iv)一種治療性酶(X)之C-末端與另一種治療性酶(X')之N-末端可能依相同方向形成二聚體。(i)與(ii)項中之二聚體稱為平行二聚體,及(iii)與(iv)項中之二聚體稱為反向平行二聚體。此等二聚體可以藉由’共價鍵或非共價鍵形成,但二聚體之形成不受此限制。
明確言之,形成上述二聚體時,平行二聚體或反向平行二聚體之形成可以在免疫球蛋白Fc區形成二聚體時,使得其所連接之α-半乳糖苷酶A單體透過共價鍵或非共價鍵二聚體連接形成二聚體。
本發明包含呈反向平行構型之二聚合治療性酶之融合蛋白中,製備該融合蛋白之過程之卓越優點在於其可減少製備步驟數量,藉以降低製造成本,並可維持酶活性,同時降低二聚體型態因活體內pH變化造成之不安定性。
本發明治療性酶可為選自由以下各者所組成群組之治療性酶:β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神經醯胺酶、酸性神經鞘磷脂酶、半乳糖腦苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、B、β-己糖胺酶A、B、肝素N-
硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、N-乙醯基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、溶酶體酸性脂酶、α-N-乙醯基-D-胺基葡萄糖苷酶、葡萄糖腦苷脂酶、丁醯基膽鹼酯酶、殼多醣酶、麩胺酸脫羧基酶、雪瑞素、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙醯基水解酶、中性內切肽酶、與髓過氧化酶。本發明治療性酶可為衍生自人類之酶,但任何對LSD具有治療效力之治療性酶,不論其來源或類型均可包括在本發明內。
更明確言之,該酶可能為α-半乳糖苷酶A或β-半乳糖苷酶。
本文所採用術語「α-半乳糖苷酶A」為存在於脾臟、腦、肝臟等等之溶酶體中之酶,其會水解醣脂與醣蛋白之末端α-半乳糖基部分(moiety),且為同二聚合醣蛋白。明確言之,已知α-半乳糖苷酶A會水解神經醯胺三己糖苷,催化蜜二糖水解成半乳糖與葡萄糖,特定言之,已知與一種LSD法布瑞氏症有關。
本發明中,α-半乳糖苷酶A可與重組半乳糖苷酶-α或重組半乳糖苷酶-β(亦即,重組體形式)交換使用,且任何具有等效活性且對LSD展現治療效力之酶,不論其序列、來源、製法等等,均可包括在本發明範疇內,沒有限制。明確言之,α-半乳糖苷酶可由多核苷酸序列SEQ ID NO:5編碼,且可包括胺基酸序列SEQ ID NO:6,但α-半乳糖苷酶之序列不受其等限制。
包括在本發明酶融合蛋白中之治療性酶可為天然型,且由一部分治療性酶組成之片段、或其中有些胺基酸已發生選自由:取代、添加、刪除、與修飾、及其組合所組成群組之變異之治療性酶類似物,均可包括在本發明內,沒有限制,只要其具有等同天然型治療性酶之活性即可。
此外,治療性酶之類似物包括所有彼等在天然型治療性酶之胺基末端與/或羧基末端添加一或多個胺基酸者。
用於取代或添加之胺基酸,不僅可使用常出現在人類蛋白質中之20種胺基酸,亦可使用非典型或非天然胺基酸。非典型胺基酸之商品來源可包括Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.、Genzyme Pharmaceuticals等等。包括此等胺基酸及非典型肽序列之肽可以合成及購自商品供應商,例如:American Peptide Company,Bachem(USA)、或Anygen(Korea),但商品來源不受此限制。
本文所採用術語「片段」係指已脫除原始治療性酶或原始治療性酶類似物之胺基或接基末端一或多個胺基酸之形式。原始治療性酶或其類似物不論片段大小或胺基酸類型,只要其等具有治療性酶之活性,均屬於本發明範疇內。
治療性酶類似物可包括相應治療性酶之生物相似藥(biosimilar)與生物改良藥(biobetter)。例如:在生物仿相似藥方面,考量其在宿主中之表現與已知治療性酶之差異、糖基化特徵與糖基化程度之差異、相應酶之特定胺基酸殘基與取代度不為100%取代之標準序列之取代度差異,其等屬於可用為本發明酶融合蛋白之生物仿製藥酶。治療性酶可採用相關技藝已知方法製造,明確言之,於動物細胞、大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、植物細胞、活體動物等等中進行基因重組法,且製造方法沒有限制,且可自市售商品購買酶及使用,但酶不受此等限制。
此外,治療性酶可包括與上述酶或其類似物具有至少60%、70%、或80%,更明確言之90%,及甚至更明確言之91%、92%、93%、94%、95%、
96%、97%、98%、或99%或更高同源性之胺基酸序列,且治療性酶可由微生物採用重組技術製得或可自商品取得,但治療性酶不受此等限制。
本文所採用術語「同源性」代表與野生型胺基酸序列或野生型核苷酸序列之相似度,且同源性比對可採用肉眼進行或採用容易購得之比對程式進行。兩種或更多種序列之間之同源性可以採用市面上之電腦程式計算百分比(%)。可以計算相鄰序列之同源性(%)。
有關治療性酶或其類似物之序列及編碼其等之核苷酸序列之資訊可得自已知資料庫(例如:NCBI等等)。
治療性酶可依相關技藝已知方法製備或製造,且明確言之,可以培養動物細胞,在其中嵌入動物表現載體後,再從培養物中純化該酶,或可從市售商品購得酶後使用,但酶不受此限制。
本發明酶融合蛋白可以為其中治療性酶與免疫球蛋白Fc區透過肽連接基融合者。亦即,式1之L或L'可以為肽連接基,但L或L'不受特別限制,只要其等可以使免疫球蛋白Fc區與治療性酶融合即可。
肽連接基可包括至少一個胺基酸,例如:1至1,000個胺基酸,相關技藝已知之任何肽連接基(例如:包括[GS]x連接基、[GGGS]x連接基、與[GGGGS]x連接基等等,其中x為自然數1或更大(例如:1、2、3、4、5、或更大),但肽連接基不受其等特別限制。明確言之,本發明肽連接基可由10至50個胺基酸之序列組成,更明確言之,20至40個胺基酸之序列,且可由胺基酸序列SEQ ID NO:11組成。
為了本發明目的,肽連接基與治療性酶及免疫球蛋白Fc融合之位置沒有限制,只要肽連接基可連接治療性酶與免疫球蛋白Fc,同時維持治療
性酶活性即可,明確言之,在治療性酶與免疫球蛋白Fc區之兩端,及更明確言之,在治療性酶之C-末端與免疫球蛋白Fc區之N-末端,但位置不受此限制。
本文所採用術語「N-末端」及「C-末端」係分別指蛋白質之胺基端與羧基端。例如:「N-末端」或「C-末端」可能不僅包括N-末端或C-末端之最後一個胺基酸殘基,亦可包括鄰接N-末端或C-末端胺基酸殘基之胺基酸殘基,明確言之,從末端本身算起第1個胺基酸殘基至第20個胺基酸殘基,但N-末端或C-末端不受此限制。
本發明之具體實施例中,其中由IgG4之N-末端與治療性酶之C-末端融合之融合蛋白(SEQ ID NO:13)係經由合成法製備,使得α-半乳糖苷酶(治療性酶)在基因階段與連接基-IgG4融合,並證實在已經過融合蛋白轉形之轉形體中表現該融合蛋白(實例2)。
本發明中,肽連接基可為一種連接由單體之免疫球蛋白Fc區所形成二聚體之各免疫球蛋白Fc區之連接基,且連接各免疫球蛋白Fc區之連接基可以為相同或不同類型。
成為本發明酶融合蛋白之部分之免疫球蛋白Fc區可以為一種在各單體之免疫球蛋白Fc區之間形成二聚體者。
本文所採用術語「免疫球蛋白Fc區」係指免疫球蛋白分子中包括重鏈恆定區2(CH2)與/或重鏈恆定區3(CH3)的一區,排除重鏈與輕鏈之可變區。為了本發明目的,此等免疫球蛋白Fc區可包括經修飾之鉸鏈區,但不受此限制。明確言之,免疫球蛋白Fc區可為一種在原始免疫球蛋白Fc區之至少一個胺基酸具有一個選自由:取代、添加、刪除、修飾、與其組合所組成群組之變異者,但免疫球蛋白Fc區不受此限制。
免疫球蛋白Fc區為在製造藥物時用作載劑之材料,且近來已積極進行使用免疫球蛋白Fc區之融合蛋白研究,以安定蛋白質及防止其等被腎臟排除。免疫球蛋白為血液之主要組成份,有5種不同型態(亦即IgG、IgM、IgA、IgD、及IgE)。最常用於融合蛋白研究之型態為IgG,其再分成四種亞型。使用免疫球蛋白Fc製備之融合蛋白可增加蛋白質大小,藉以預防其被腎臟排除,亦結合FcRn受體,因此透過胞吞作用及再循環至細胞中而具有延長血液半衰期之作用。
此等免疫球蛋白Fc區可包括重鏈恆定區中之鉸鏈區,且免疫球蛋白Fc區單體可利用該鉸鏈區形成二聚體,但免疫球蛋白Fc區不受此限制。此外,本發明免疫球蛋白Fc區可能為延長之Fc區,包括完整或一部分之重鏈恆定區1(CH1)與/或輕鏈恆定區1(CL1),排除免疫球蛋白之重鏈與輕鏈之可變區,只要免疫球蛋白Fc區具有與其原始型態相同或更優效力即可。此外,本發明免疫球蛋白Fc區可為其中已排除對應於CH2與/或CH3之一部分相當長胺基酸序列的一區。
明確言之,本發明免疫球蛋白Fc區可為選自由下列各者所組成群組之一:(a)CH1功能域、CH2功能域、CH3功能域、與CH4功能域;(b)CH1功能域與CH2功能域;(c)CH1功能域與CH3功能域;(d)CH2功能域與CH3功能域;及(e)CH1功能域、CH2功能域、CH3功能域、與CH4功能域中一個或兩個或更多個功能域與免疫球蛋白鉸鏈區或一部分鉸鏈區之間之組合,但免疫球蛋白Fc區不受此限制。更明確言之,免疫球蛋白Fc區可為一種由鉸鏈區、CH2功能域、與CH3功能域組成者,但免疫球蛋白Fc區不受此限制。
一個具體實施例中,鉸鏈區可為其中具有下列胺基酸序列之一部分鉸鏈序列已被刪除或修飾者。
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO:14)
明確言之,鉸鏈區可能為具有變異的一區,其中一部分鉸鏈區已刪除,而僅包括一個半胱胺酸(Cys)殘基;或可能為其中涉及鏈交換之絲胺酸(Ser)殘基被脯胺酸(Pro)殘基取代的一區,及更明確言之,為其中鉸鏈序列之第2個絲胺酸被脯胺酸殘基取代的一區,但鉸鏈區不受此限制。
本發明中,免疫球蛋白Fc區可藉由包括呈其原始型或修飾型鉸鏈區之鉸鏈區來提高融合之治療性酶之安定性,同時預防在Fc區中出現鏈交換及形成單體。
本發明中,免疫球蛋白Fc區可呈單體形式,但免疫球蛋白Fc區不受此限制。明確言之,於上式1中以F代表之免疫球蛋白Fc區可呈單體形式,並以透過肽連接基與治療性酶單體融合來表現。由於免疫球蛋白Fc區之單體會形成二聚體,因此該與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酶可利用非共價鍵形成二聚體,但不受此限制。
用為藥物載劑之免疫球蛋白Fc區之缺點在於其會引起不期望之免疫反應,例如:具有效應子功能,如:抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。此等功能係透過免疫球蛋白Fc區與Fc受體或補體之結合,或透過Fc區之糖基化而發生。此外,Fc本身極可能在活體內出現不安定。
本發明中,本發明者已藉由取代免疫球蛋白Fc區中鉸鏈區之序列,而儘力解決上述問題。明確言之,本發明免疫球蛋白Fc區可為其中強力之
糖基化序列被取代以調節糖基化或涉及鏈交換之序列被取代者,或可能對應於這兩種例子。更明確言之,本發明酶融合蛋白之免疫球蛋白Fc區可能為沒有發生鏈交換者。
明確言之,本發明免疫球蛋白Fc區可為其中在SEQ ID NO:8之免疫球蛋白Fc區之第2個胺基酸與/或第71個胺基酸被不同胺基酸取代的一區,以防止鏈交換及N-糖基化。更明確言之,本發明免疫球蛋白Fc區可能為1)其中第2個胺基酸(亦即,絲胺酸)被脯胺酸取代的一區,2)其中第71個胺基酸(亦即,天冬醯胺)被麩醯胺取代的一區,或3)其中第2個胺基酸被脯胺酸取代及第71個胺基酸被麩醯胺取代的一區,明確言之,由胺基酸序列SEQ ID NO:9代表之免疫球蛋白Fc區,但免疫球蛋白Fc區不受此限制。除了上述變異外,免疫球蛋白Fc區可包括適當變異作為藥物載劑,以提高治療性酶之安定性。
明確言之,免疫球蛋白Fc區可為其中免疫球蛋白IgG4 Fc之鉸鏈區被IgG1鉸鏈區取代的一區,但免疫球蛋白Fc區不受此限制。
本發明實施例中,免疫球蛋白Fc之第2個胺基酸被脯胺酸取代,及免疫球蛋白Fc之第71個胺基酸被麩醯胺取代,藉以降低鏈交換及N-糖基化(實例1)。
本文所採用術語「鏈交換」係指當使用IgG4 Fc作為蛋白質融合體之載劑時之問題,IgG4 Fc會與存在於活體內之IgG4形成雜合體,或呈單體並改變原始結構成為治療活性低之結構,過去曾有報告指出,已與蛋白質融合之蛋白質融合體很難用於治療目的(van der Neut Kolfschoten,等人,Science,317:1554至1557.2007)。
此外,另一特定具體實施例中,本發明免疫球蛋白Fc區不僅包括原始胺基酸序列,而且包括其序列類似物。胺基酸類似物係指其原始胺基酸序列中至少一個胺基酸殘基出現選自由以下各者所組成群組之變異:取代、添加、刪除、修飾、及其組合。
例如:已知對連結具有重要性之IgG Fc中位置214至238、297至299、318至322、或327至331之胺基酸殘基即可用為適於變異之位點。
此外,可能有各種不同型態之類似物,例如:其中已移除會形成二硫鍵之位點者;其中已移除原始Fc中數個N-末端胺基酸者;或其中在原始Fc之N-末端增加甲硫胺酸殘基者等。此外,可移除補體結合位點(例如:C1q結合位點)或抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)位點,以移除效應子功能。製備免疫球蛋白Fc區之序列類似物之技術已揭示於國際公開案案號WO 97/34631、WO 96/32478等等。
蛋白質或肽分子中,不會改變分子之完整活性之胺基酸取代法係相關技藝上習知者(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常見之取代法發生在Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、與Asp/Gly之胺基酸殘基之間。有些例子中,胺基酸可經過磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法呢基化、乙醯基化、醯胺化等等修飾。
此外,上述Fc類似物可為彼等具有與本發明Fc區相同生物活性,且已提高Fc區對抗熱、pH等等之結構安定性之類似物。
此外,此等Fc區可得自從人類或動物(如:牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、天竺鼠等等)中單離之原始型,或可為得自轉形動物細胞或微生物之重組體或其類似物。本文中,Fc區可從原始Fc獲得,其係自人類或動物生物體中單離完整免疫球蛋白,並利用蛋白酶處理。木瓜酶消解原始Fc區形成Fab與Fc區,而胃蛋白酶處理則產生pF'c與F(ab)2片段。此等片段可經過分子大小篩選層析法,單離出Fc或pF'c。更特定具體實施例中,Fc區可為重組體免疫球蛋白Fc區,其中人類衍生之Fc區係得自微生物。
此外,免疫球蛋白Fc區可呈原始聚醣形式、比其原始型增加或減少聚醣之形式、或呈脫糖基化型或無糖基化型。可藉由常用方法增加、減少、或移除免疫球蛋白Fc聚醣,如:化學法、酶促法、及使用微生物之遺傳工程法。特定言之,其中已移除Fc區之聚醣之免疫球蛋白Fc區顯示顯著降低對補體(C1q)之結合親和性,及降低或移除抗體-依賴性細胞毒性或補體-依賴性細胞毒性,因此不會誘發活體內不必要之免疫反應。因此,脫糖基化或無糖基化免疫球蛋白Fc區之免疫球蛋白Fc區可能為符合本發明原始目的作為藥物載劑之更適合形式。
本文所採用術語「脫糖基化」係指藉由酶移除Fc區之糖部分,及術語「無糖基化」係指在原核生物(更明確言之,大腸桿菌(E.coli))中產生之未糖基化Fc區。
同時,免疫球蛋白Fc區可衍生自人類或動物,包括:牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、與天竺鼠等,於更特定具體實施例中,可衍生自人類。
此外,免疫球蛋白Fc區可為衍生自:IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、或其組合或雜合體之Fc區。更特定具體實施例中,其可衍生自IgG或IgM,其
等為人類血液中含量最高之蛋白質之一,且在甚至更特定具體實施例中,其可衍生自IgG,已知其可加強配體結合性蛋白質之半衰期。更特定具體實施例中,該免疫球蛋白Fc區可為IgG4 Fc區,一項甚至更特定具體實施例中,其可為衍生自人類IgG4之無糖基化Fc區,及在最特定具體實施例中,免疫球蛋白Fc區之胺基酸序列為SEQ ID NO:9,且編碼該胺基酸序列之多核苷酸序列可為SEQ ID NO:7,但免疫球蛋白Fc區並不受此限制。
本文所採用術語「組合」意指來自相同來源之編碼單鏈免疫球蛋白Fc區之多肽與來自不同來源之單鏈多肽連接形成二聚體或多聚體。亦即,該二聚體或多聚體可由選自由:IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc、與IgE Fc之Fc片段所組成群組之兩個或更多個片段製成。
此外,本發明治療性酶或酶融合蛋白可為彼等其中蛋白質之N-末端與/或C-末端未經修飾者,但為了保護治療性酶免於被蛋白酶裂解及提高治療性酶活體內安定性,彼等其中在治療性酶之N-末端與/或C-末端經過化學修飾或被有機基團保護、或治療性酶之胺基末端經過添加胺基酸而修飾等等之治療性酶或酶融合蛋白亦包括在根據本發明蛋白質之範疇內。當治療性酶之C-末端未經修飾時,根據本發明之治療性酶或酶融合蛋白之末端可能具有羧基末端,但本發明治療性酶或酶融合蛋白不受其等特別限制。
特定言之,由於化學合成蛋白質之N-末端及C-末端帶有電荷,因此N-末端可經過乙醯化及/或C-末端可經過醯胺化,以移除此等電荷,但方法不受其等特別限制。
除非本說明書中另有其他說明,否則有關本發明之詳細說明或申請專利範圍中所說明根據本發明之「酶」或「融合蛋白」之技術不僅可應用於本
發明酶或融合蛋白,亦可應用於包括該酶或融合蛋白之所有鹽(例如:融合蛋白之醫藥上可接受之鹽)、或其溶劑合物之範疇。因此,雖然本說明書中僅簡單稱為「酶」或「融合蛋白」,但該說明同時適用於特定鹽、特定溶劑合物、及特定鹽之特定溶劑合物。此等鹽型可能呈例如:使用任何醫藥上可接受之鹽之形式,但鹽的類型沒有特別限制。彼等鹽型例如:可能為對哺乳動物安全且有效之形式,但鹽型不受其等特別限制。
本文所採用術語「醫藥上可接受」係指在醫學-藥理學判斷下,可以有效用於計畫用途,不會引起過度毒性、刺激性、或過敏反應等等之物質。
本文所採用術語「醫藥上可接受之鹽」係指衍生自醫藥上可接受之無機鹽、有機鹽、或鹼類之鹽。合適酸類實例可包括鹽酸、溴酸、硫酸、硝酸、過氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等等。衍生自合適鹼類之鹽類實例可包括鹼金屬,如:鈉、鉀等等;鹼土金屬,如:鎂;銨等等。
此外,本文所採用術語「溶劑合物」係指由溶劑分子與根據本發明酶、融合蛋白或其鹽之間形成之複合物。
本發明酶融合蛋白可採用相關技藝已知之方法製備。
本發明具體實施例中,重組載體之製備係使其中α-半乳糖苷酶(亦即治療性酶)呈與肽連接基-免疫球蛋白Fc融合之形式表現,且此等治療性酶之製備係由其等在CHO細胞株中表現(實例1與2)。
然而,本發明酶融合蛋白可採用上述實施例中說明之彼等方法以外之其他方法製備。本發明酶融合蛋白可包括胺基酸序列SEQ ID NO:13,但胺基酸序列不受此限制。
根據本發明酶融合蛋白經由治療性酶與免疫球蛋白Fc區融合,而提高治療性酶之活體內安定性,同時維持該治療性酶之活性,可延長對LSD具有治療效力之治療性酶之半衰期。特定言之,與經修飾免疫球蛋白Fc區融合之治療性酶已降低鏈交換及糖基化,因此對溶酶體受體可具有比未與Fc融合之治療性酶所具更低之結合親和性,因此具有高持續性,證實此等治療性酶可以有效治療LSD。
本發明又另一項態樣提供一種供預防或治療LSD之醫藥組成物,其包含該酶融合蛋白作為活性成份。
根據本發明之組成物之特徵在於延長活體內持續時間及提高治療性酶之安定性。
明確言之,本發明醫藥組成物之酶融合蛋白可能為一種其中α-半乳糖苷酶A已與免疫球蛋白Fc區共同融合者,但酶融合蛋白不受此限制。
此外,當免疫球蛋白Fc區形成二聚體時,根據本發明之組成物可為一種其中融合蛋白中之α-半乳糖苷酶A(亦即,治療性酶)亦形成二聚體者,及更明確言之,α-半乳糖苷酶A之二聚體係由共同非共價鍵形成之二聚體,特定言之,其特徵在於二聚體係呈反向平行方向形成。
本文所採用術語「溶酶體」係一種存在於細胞質中之細胞器,包含許多種水解酶,因此會分解身體內不要之物質,如:大分子、細菌等等,並協助細胞中其他部分利用該分解產物。溶酶體之功能可由許多種酶執行。當特定一
種酶因變異、缺乏等等而喪失其功能時,其會造成溶酶體喪失分解功能,並造成必需分解之大分子等等累積在細胞中,並誘發細胞損傷等等,而引發疾病。
本文所採用術語「溶酶體儲積症(LSD)」係指因上述溶酶體功能喪失所引起,且需要利用缺陷酶之酶置換療法之罕見遺傳疾病。LSD可包括:黏多醣症(MPS)、肝醣儲積症、神經鞘脂質代謝障礙症、尼曼匹克症、法布瑞氏症、高雪氏症、韓特氏症候群、馬洛托-拉米氏症候群等等。
本文所採用術語「法布瑞氏症」為一種LSD,係與性染色體連結且由X失活引起之隱性遺傳形式。法布瑞氏症為因缺失或缺乏α-半乳糖苷酶A(其係存在於溶酶體中之水解酶)活性而發生鞘糖脂之先天性代謝疾患。已知α-半乳糖苷酶A缺陷會造成醯基鞘胺醇三己糖(Gb3)在血管壁及不同身體部位(例如:皮膚、腎臟、心臟、神經系統等等)中異常累積,因而影響血液循環及降低營養素供應。會出現無汗症(不排汗)、感覺異常、嚴重疼痛、角質瘤、角膜斑、心臟絕血、心肌梗塞、腎衰竭等等症狀,造成腎衰竭,最終造成死亡。
本文所採用術語「預防」係指藉由投與酶融合蛋白或包含該酶融合蛋白之組成物來抑制或延緩LSD發生之所有舉動,術語「治療」係指藉由投與酶融合蛋白或包含該酶融合蛋白之組成物來改善或有利地改變LSD症狀之所有舉動。
本文所採用術語「投與」係指採用任何適當方法將特定物質引入患者中,組成物之投與途徑可為任何可以在活體內傳送組成物至標靶之常用途徑,例如:經腹膜內投與、經靜脈內投與、經肌內投與、經皮下投與、經皮內投與、經口投與、局部投與、經鼻內投與、經肺內投與、經直腸內投與等等。然而,由於肽在口服投與時即被消解,因此供口服投與之組成物中之活性成份最好經
過包覆或調配,以保護對抗胃內之降解,且明確言之,可呈注射形式投與。此外,該醫藥組成物可採用某些可以運送活性成份至標靶細胞之裝置投與。
本發明醫藥組成物之總有效劑量可呈單一劑量投與患者,或可依據分段治療療程,依多重劑量長期投與。本發明醫藥組成物中,活性成份含量可能隨疾病嚴重性變化。明確言之,本發明融合蛋白之總每日劑量可為每1kg患者體重約0.0001mg至500mg。然而,該融合蛋白之有效劑量係考量各種不同因素決定,其中除了醫藥組成物之投與途徑與治療頻率外,尚包括患者年齡、體重、健康條件、性別、疾病嚴重性、膳食、排泄速率等等。在此方面,彼等習此相關技藝之人士很容易決定適合本發明醫藥組成物特定用途之有效劑量。根據本發明之醫藥組成物沒有特別限制調配物、投與途徑、與方法,只要其展現本發明效力即可。
本發明中,用為載劑之酶融合蛋白之實際劑量可依據用為活性成份之治療性酶型態及各種不同因素決定,如:所治療疾病、投與途徑、患者之年齡、性別、與體重、疾病嚴重性等等。由於本發明酶融合蛋白具有顯著優異之活體內持續性,因此包含本發明酶融合蛋白之醫藥調配物之投與劑量、次數、與頻率可以大幅減少。
本發明醫藥組成物可進一步包含醫藥上可接受之載劑、賦形劑、或稀釋劑。該醫藥上可接受之載劑可為非天然物。
本文所採用術語「醫藥上可接受」係指具有足量以產生治療效力且不會引起副作用之性質,很容易由習此相關技藝者依據醫學領域習知之因素決定,如:疾病類型、患者之年齡、體重、健康條件、性別、藥物敏感性、投與
途徑、投與方法、投與頻率、治療持續時間、計畫混合或同時投與之藥物(群)等等。
該醫藥上可接受之載劑可包括用於經口投與之:結合劑、助滑劑、崩解劑、賦形劑、溶解劑、勻散劑、安定劑、懸浮劑、著色劑、調味劑等等;用於注射之:緩衝劑、防腐劑、止痛劑、溶解劑、等滲劑、安定劑等等,其等可組合使用;及用於局部投與之:基質、賦形劑、潤滑劑、防腐劑等等。
本發明組成物之調配物型態可依各種不同方式,與上述醫藥上可接受之載劑組合製成。例如:經口投與之組成物可調配成錠劑、口含錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、藥片(wafer)等等。注射用之組成物可調配成單位劑量之安瓿或多劑量容器。此外,組成物亦可調配成溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放性調配物等等。
同時,合適載劑、賦形劑、與稀釋劑之實例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤糖醇、麥芽糖醇、澱粉、金合歡膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油等等。此外,組成物可能進一步包含填料、抗結塊劑、潤滑劑、保濕劑、調味劑、防腐劑等等。
此外,酶融合蛋白可與核准用為製藥藥物之各種不同醫藥上可接受之載劑混合使用,如:生理食鹽水或有機溶劑。為了提高安定性或吸收性,可使用碳水化合物(如:葡萄糖、蔗糖、或葡聚醣)、及抗氧化劑(如:抗壞血酸或麩胱甘肽)、螯合劑、低分子量蛋白質、或其他安定劑作為製藥藥物。
該醫藥組成物可包含含量為0.01%至99%(重量/體積)之上述成份(活性成份),但含量不受此限制。
本發明再另一態樣提供一種編碼根據本發明酶融合蛋白之多核苷酸。
編碼根據本發明之酶融合蛋白之多核苷酸可為一種多核苷酸形式,其中由編碼治療性酶的部分連接編碼肽連接基-免疫球蛋白Fc區的部分,及明確言之,可為編碼融合蛋白之多核苷酸,其中由免疫球蛋白Fc區之N-末端透過GGGGS連接基連接治療性酶之C-末端,但多核苷酸不受此限制。更明確言之,本發明多核苷酸可包括序列SEQ ID NO:12,但序列不受此限制,只要該多核苷酸可以編碼治療性酶與免疫球蛋白Fc區之間之融合蛋白即可。
本發明再另一態樣提供一種包括多核苷酸之重組表現載體。
本文所採用術語「重組載體」係指DNA構築體,其中標靶肽(例如:酶融合蛋白)係以可操作方式連接適當控制序列,即可在適當宿主中表現標靶肽(例如:酶融合蛋白)。根據本發明之重組載體可以構築成供典型選殖之載體或呈供表現之載體,且可利用原核生物或真核生物作為宿主細胞來構築。
控制序列包括可以啟動轉錄之啟動子、任何控制轉錄之操作序列、編碼適當mRNA核糖體-結合功能域之序列、及控制終止轉錄及轉譯之序列。重組載體在轉形進入合適宿主細胞中後,即可不受宿主基因組控制進行複製或功能,或可整合進入宿主基因組本身。
本發明所使用重組載體沒有特別限制,只要該載體可以在宿主細胞中複製而且可以採用相關技藝已知任何載體構築即可。載體實例可包括天然
或重組體質體、黏質體、病毒、及噬菌體。本發明可使用之載體沒有特別限制,任何已知表現載體均可使用。
重組載體係用於轉形宿主細胞,供製造本發明酶融合蛋白。此外,此等經轉形細胞(屬於本發明之一部分)可用於擴增核酸片段及載體,或其等可為用於重組生產本發明酶融合蛋白之培養細胞或細胞株。
本文所採用術語「轉形」係指一種將包括編碼標靶蛋白質(例如:治療性酶、酶融合蛋白)之多核苷酸之重組載體引進宿主細胞中之過程,藉以在宿主細胞中表現由該多核苷酸編碼之蛋白質。轉形之多核苷酸只要其可在宿主細胞中表現,包括不論是否嵌入宿主細胞之染色體中及是否位於染色體內部或位於外部,兩種例子均可行。
此外,多核苷酸包括編碼標靶蛋白質之DNA及RNA。多核苷酸可呈任何形式嵌入,只要其可引進宿主細胞中並在其中表現即可。例如:多核苷酸可呈表現匣形式引入宿主細胞中,該表現匣係一種包括自我表現所需之所有必要元素之基因構築體。表現匣一般包括以可操作方式連接多核苷酸之啟動子、轉錄終止訊號、核糖體結合功能域、及轉譯終止訊號。表現匣可呈可以自我複製之表現載體形式。此外,多核苷酸本身可引入宿主細胞中,並以可操作方式連接其在宿主細胞中表現時所必要之序列,但多核苷酸不受此限制。
此外,本文所採用術語「以可操作方式連接」係指啟動子序列之間之功能性連結,其啟動並介導編碼本發明標靶肽之多核苷酸及上述基因序列之轉錄。
適用於本發明之宿主沒有特別限制,只要可以表現本發明多核苷酸即可。適當宿主實例包括屬於埃希氏菌屬(Escherichia)之細菌,如:大腸桿菌
(E.coli);屬於桿菌屬(Bacillus)之細菌,如:枯草桿菌(Bacillus subtilis);屬於假單胞菌屬(Pseudomonas)之細菌,如:戀臭假單孢菌(Pseudomonas putida);酵母,如:畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe);昆蟲細胞,如:秋行軍蟲(Spodoptera frugiperda)(Sf9);及動物細胞,如:CHO、COS、BSC等等。
本發明再另一態樣提供一種已引進表現載體之轉形體。
為了本發明目的,已引進本發明表現載體之轉形體沒有限制,只要轉形體可以表現並產生酶融合蛋白即可,但轉形體可能為屬於埃希氏菌屬(Escherichia)之細菌,如:大腸桿菌;屬於桿菌屬之細菌,如:枯草桿菌;屬於假單胞菌屬之細菌,如:戀臭假單孢菌;酵母,如:畢赤酵母、釀酒酵母、及粟酒裂殖酵母;昆蟲細胞,如:秋行軍蟲(Sf9);及動物細胞,如:CHO、COS、BSC等等。
本發明再另一態樣提供一種製備根據本發明酶融合蛋白之方法。
明確言之,該方法可包括(a)培養轉形體,以得到培養物;及(b)從培養物中回收該酶融合蛋白,但方法不受此限制。
本發明中,用於培養轉形體之培養基必需符合依適當方式培養宿主細胞之要求。宿主細胞生長之培養基中可包含之碳源可由彼等習此相關技藝者依據其所製備之轉形體型態適當選擇,並可選擇適當培養條件來控制培養時間期與培養量。
培養基採用之糖源實例可包括糖類及碳水化合物,如:葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉、及纖維素;油類與脂肪,如:大豆油、葵花
油、蓖麻油、及椰子油;脂肪酸,如:棕櫚酸、硬脂酸、及亞油酸;醇類,如:甘油及乙醇;及有機酸類,如:乙酸。此等材料可能單獨使用或組合使用。
所使用之氮源實例可包括蛋白腖、酵母抽出物、肉汁、麥芽抽出物、玉米糖漿、大豆粉、與尿素,或無機化合物,如:硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、與硝酸銨。氮源亦可能單獨使用或組合使用。
所使用之磷源實例可包括磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或對應之含鈉鹽。此外,培養基可包含金屬鹽,如:生長所需之硫酸鎂或硫酸鐵。
最後,可使用基本生長材料,如:胺基酸及維生素。此外,亦可使用培養基之適當前驅物。上述來源可以在培養期間,採用批式培養或連續培養,適當加至培養物中。培養物之pH可使用鹼性化合物(如:氫氧化鈉、氫氧化鉀、及氨)或酸性化合物(如:磷酸或硫酸)適當調整。此外,可以添加消泡劑(如:脂肪酸聚二醇酯)來防止起泡。此外,為了維持培養物之有氧狀態,可以在培養物中注入氧氣或含氧氣體(例如:空氣)。
本發明轉形體可以在20℃至45℃培養,及明確言之,在25℃至40℃。此外,持續培養至所需治療性酶或酶融合蛋白達到最大產量時為止,因此通常持續培養10小時至160小時。
如上述,當根據宿主細胞提供適當培養條件時,本發明轉形體可以產生治療性酶或酶融合蛋白,且所產生之治療性酶或酶融合蛋白根據載體組成及宿主細胞特性,可能分泌至細胞質中或分泌至宿主細胞周質空間或細胞外。
表現在宿主細胞內部或外部之蛋白質可採用常用方法純化。純化法實例可包括鹽析法(例如:硫酸銨沉澱法、磷酸鈉沉澱法等等)、溶劑沉澱法(例如:使用丙酮或乙醇之蛋白質分段沉澱法等等)、透析法、凝膠過濾法、離子交
換法、或層析法(如:逆向管柱層析法)、超濾法等等,且此等方法可以單獨使用或組合使用。
本發明再另一態樣提供一種為個體預防或治療LSD之方法,包括投與酶融合蛋白或包含酶融合蛋白之組成物。
由於本發明酶融合蛋白包含可以預防或治療LSD之治療性酶,因此可以對疑似罹患LSD之個體投與包含治療性酶之酶融合蛋白或包含酶融合蛋白之醫藥組成物,進行預防或治療。
本文所採用術語「個體」係指疑似罹患LSD之個體,且該疑似罹患LSD之個體係指已罹患LSD或處於發展出LSD風險之哺乳動物,包括人類、大鼠、牛等等,但包括可接受本發明酶融合蛋白或包含該酶融合蛋白之組成物治療之任何個體,沒有限制。
本發明方法可包括投與醫藥有效量之包含酶融合蛋白之醫藥組成物。組成物之適當總每日劑量可由操作者在正確醫學判斷之範圍內決定,且組成物可以一天投與一次或分成小劑量投與數次。然而,針對本發明之目的,該組成物針對任何特定患者之明確醫療有效劑量較佳係依各種不同因素有差別地施用,包括要達成之效應型態與程度、是否包括通常併用之其他藥劑之明確組成物、患者之年齡、體重、健康條件、性別與膳食、投與時間、投與途徑、組成物之排泄速率、治療持續時間、與特定組成物組合使用或同時使用之其他藥物、及醫學界習知之類似因素。
同時,預防或治療LSD之方法可能為組合療法,其進一步包括投與對至少一種LSD具有治療效力之化合物或物質,但方法不受此限制。
本文所採用術語「組合」必需理解為指同時、分開、或連續投與。當連續或分開投與時,距離第二種成份之投與間隔必需不會損失該組合之有利效應。
具有LSD治療活性之酶融合蛋白之投與劑量可為每1kg患者體重約0.0001μg至500mg,但劑量沒有特別限制。
本發明再另一態樣提供一種以酶融合蛋白、或包含酶融合蛋白之組成物於製備供預防或治療LSD之醫藥(或醫藥組成物)上之用途。
下文中,本發明將參考下列實例更詳細說明。然而,此等實例僅供說明目的,且本發明範圍不受此等實例限制。
實例1:酶融合蛋白之製法
製造包括呈反向平行二聚體形式之治療性酶之酶融合蛋白時,本發明者已取原始α-半乳糖苷酶、連接基(SEQ ID NO:10)、與Fc免疫球蛋白區(SEQ ID NO:7)在基因階段融合,並將融合產物嵌入表現載體中。
採用定點誘變PCR技術移除所構築融合蛋白之Fe區中之鏈交換及N-糖基化位點。
明確言之,針對Fc區(SEQ ID NO:8),涉及鏈交換之Fc區之第2個胺基酸(亦即,絲胺酸)係使用引子(SEQ ID NO:1與2)被脯胺酸取代,及涉及N-糖基化之Fc區之第71個胺基酸(亦即,天冬醯胺)係使用引子(SEQ ID NO:3與4)被麩醯胺取代。
採用限制酶,由編碼所合成α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之多核苷酸嵌入表現載體(XOGC載體)中。BamHI與XhoI二者均為不會裂解α-半乳糖苷酶與Fc免疫球蛋白區之限制酶。取經過上述限制酶裂解之α-半乳糖苷酶-Fc嵌入被相同限制酶裂解之XOGC載體中,藉由完成可以表現α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之載體。當免疫球蛋白Fc區形成二聚體時,α-半乳糖苷酶形成反向平行二聚體。
α-半乳糖苷酶-Fc之DNA與蛋白質序列示於下表2,其中下加線部分代表訊號序列,粗字體代表經取代之胺基酸,斜體字部分代表連接基。
實例1所製備酶融合蛋白表現載體稱為α-半乳糖苷酶-Fc。
實例2:證實酶融合蛋白之活體外酶活性
實例2-1:α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之製法
將實例1所製備α-半乳糖苷酶-Fc表現載體(pX0GC-α半乳糖苷酶-Fc)轉形至CHO-S細胞株中,藉以製成可以大量生產α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之細胞株。
明確言之,讓CHO-S細胞懸浮培養在1L錐形瓶(Corning Inc.,目錄編號431147)中,使用無血清培養基(FreeStyleTM CHO Expression Medium,Thermo Fisher Scientific,目錄編號12651014)進行增殖。當培養容器內之細胞到
達5×108個細胞之匯合度(confluency)時,使用FreeStyleTM MAX(Thermo Fisher Scientific,目錄編號16447-100)進行轉形。亦即,分別在兩支試管中添加10mL OptiProTM SFM(Thermo Fisher Scientific,目錄編號12309-019),然後在其中一支試管中添加500μg DNA,在另一支試管中添加500μL FreeStyleTM MAX。混合各試管中之兩種溶液,置於室溫10分鐘,分別加至已預先換成新鮮FreeStyleTM CHO表現培養基(Thermo Fisher Scientific,目錄編號12651014)之細胞中。細胞在培養箱(37℃,5% CO2)中,旋轉速率125rpm培養約96小時。
然後在第4天,離心回收培養物之上清液,測定活體外酶活性,以檢測根據α-半乳糖苷酶-Fc製法之酶活性變化。
實例2-2:證實α-半乳糖苷酶-Fc之活體外酶活性
為了檢測α-半乳糖苷酶-Fc之活體外酶活性,讓所產生之α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白與pNP-gal(對硝基苯基-α-D-哌喃半乳糖苷)(係一種已知之酶受質),在37℃達成溫度平衡30分鐘。然後,由受質溶液與α-半乳糖苷酶-Fc在37℃反應30分鐘,測定所產生之吸光度,以測定α-半乳糖苷酶-Fc之活體外酶活性。
從活體外酶活性測定結果證實,α-半乳糖苷酶-Fc之表現程度為1,649ng/mL(第1圖)。此等結果顯示,本發明酶融合蛋白之α-半乳糖苷酶形成反向平行二聚體,而反向平行二聚體之α-半乳糖苷酶則維持顯著高度之酶活性。
實例2-3:α-半乳糖苷酶與α-半乳糖苷酶-Fc之活體外酶活性之比較
同時,由實例1所製備α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之活體外酶活性與α-半乳糖苷酶(agalsidase)-β(其不連接Fc區)之活體外酶活性比較。
明確言之,由α-半乳糖苷酶-Fc及α-半乳糖苷酶-β與pNP-gal(對硝基苯基-α-D-哌喃半乳糖苷)(係一種已知之酶受質),在37℃達成溫度平衡30分鐘。然後,由受質溶液與α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白在37℃反應20分鐘。然後測定最終所產生4-硝基苯酚之吸光度,以比較α-半乳糖苷酶-Fc與α-半乳糖苷酶-β之間之酶活性。
結果證實,α-半乳糖苷酶-Fc與α-半乳糖苷酶-β之酶活性(比活性)分別為70.9μmol/分鐘/mg與67.6μmol/分鐘/mg(第2圖)。由此等結果證實,α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白具有酶活性95.4%,此活性程度類似未與Fc區連接之酶之活性程度。此表示本發明α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白即使與Fc區連接,亦不會損失其酶活性。
實例3:證實α-半乳糖苷酶-Fc之活體外細胞內吸收活性
已知α-半乳糖苷酶被吸收進入細胞中後,係透過甘露糖-6-磷酸受體(M6PR)產生作用。因此,本發明者如下證實α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白具有細胞吸收活性。
明確言之,由CCD986SK細胞(人類皮膚纖維母細胞)(已知會表現M6PR)分別使用α-半乳糖苷酶-β與α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白處理,於37℃誘發細胞內吸收。24小時後,採用酶活性測定法證實重組半乳糖苷酶(agalsidase)-β與α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之存在。
由α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之濃度與其細胞內吸收度之間相關性分析結果發現,Km值(其係代表最大吸收速率一半值之米氏常數(Michaelis-Menten constant)為11.55nM,因此顯示類似α-半乳糖苷酶-β(Km=10.92nM)之細
胞內吸收活性程度(第3圖)。由此等結果證實,本發明α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白即使與Fc區連接,亦不會損失細胞內吸收活性。
實例5:於ICR小鼠中證實α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之藥效學性能
於ICR小鼠(3隻小鼠/組)中,在根據各組所收集每個血液樣本中,依每個血液樣本收集時間點,比較α-半乳糖苷酶-β(對照組)與實例所製備α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白(試驗組,其係在實例中製備)之血中安定性與藥物動力學係數。
明確言之,依據α-半乳糖苷酶,由α-半乳糖苷酶-β(對照組)與α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白(試驗組),以1.0mg/kg之濃度,分別經靜脈內及皮下注射,投與對照組與試驗組之ICR小鼠。靜脈注射投與組在注射後0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、與4小時,及皮下注射投與組在注射後0、1、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192與216小時,收集血液樣本。透過測定活體外酶活性,定量血液樣本中蛋白質含量。
α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之結果顯示半衰期(T1/2)、血中最大藥物濃度(Cmax)、與曲線下面積(AUC)均比未與Fc區連接之對照組提高。AUC代表活體內曝露到藥物分子之程度(第4圖,表3)。由此等結果證實,本發明α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白不論投與途徑,均因與Fc區連接而展現高度血液半衰期、血中最大藥物濃度(Cmax)、與生體可用率(AUC)。
此等結果顯示,本發明之新穎融合蛋白型態可以提高α-半乳糖苷酶(亦即,彼等已知對LSD具有治療效力之治療性酶實例)之半衰期及活體內生體可用率,可用為LSD之治療劑,同時可以維持酶活性。
承上文,熟悉本發明相關技藝者咸了解,本發明可能在不改變本發明之技術觀念或基本特徵下呈其他特定形式實施。因此,本文所揭示之具體實施例僅供說明之目的,不應構成本發明範疇之限制。反之,本發明不僅旨在涵蓋具體實施例,而且也涵蓋可能包括在由附錄之申請專利範圍所界定本發明精神與範疇內之各種不同替代物、修飾、等效物、與其他實施例。
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Claims (26)
- 一種如下式1之酶融合蛋白,
- 如申請專利範圍第1項所述之酶融合蛋白,其中,該治療性酶透過非共價鍵形成二聚體。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶融合蛋白,其中,該治療性酶形成彼此呈反向平行構型之二聚體。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶融合蛋白,其中,該酶融合蛋白相較於未與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酶,具有提高之安定性及降低與溶酶體受體之結合親和性。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶融合蛋白,其中,該酶係選自由下列各者所組成之群組:β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神經醯胺酶、酸性神經鞘磷脂酶、半乳糖腦苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、B、β-己糖胺酶A、B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、N-乙醯基半 乳糖胺-6-硫酸酯酶、溶酶體酸性脂酶、α-N-乙醯基-D-胺基葡萄糖苷酶、葡萄糖腦苷脂酶、丁醯基膽鹼酯酶、殼多醣酶、麩胺酸脫羧基酶、雪瑞素、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙醯基水解酶、中性內切肽酶、與髓過氧化酶。
- 如申請專利範圍第5項所述之酶融合蛋白,其中,該酶為α-半乳糖苷酶A或β-半乳糖苷酶。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶融合蛋白,其中,該免疫球蛋白Fc區在原始免疫球蛋白Fc區之至少一個胺基酸具有選自由:取代、添加、刪除、修飾、與其組合所組成群組之變異。
- 如申請專利範圍第7項所述之酶融合蛋白,其中,在具有胺基序列SEQ ID NO:8之免疫球蛋白Fc區中,第2個胺基酸被脯胺酸取代;第71個胺基酸被麩醯胺取代;或第2個胺基酸被脯胺酸取代及第71個胺基酸被麩醯胺取代。
- 如申請專利範圍第8項所述之酶融合蛋白,其中,該免疫球蛋白Fc區中沒有發生鏈交換。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶融合蛋白,其中,該免疫球蛋白Fc區係選自由下列各者所組成之群組:(a)CH1功能域、CH2功能域、CH3功能域、與CH4功能域;(b)CH1功能域與CH2功能域;(c)CH1功能域與CH3功能域;(d)CH2功能域與CH3功能域;及(e)CH1功能域、CH2功能域、CH3功能域、與CH4功能域中之一個或兩個或更多個功能域與免疫球蛋白鉸鏈區或一部分鉸鏈區之間之組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶融合蛋白,其中,該免疫球蛋白Fc區係呈單體形式。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶融合蛋白,其中,該免疫球蛋白Fc區係由鉸鏈區、CH2功能域、與CH3功能域組成。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶融合蛋白,其中,在該免疫球蛋白Fc區中,(a)移除可以形成二硫鍵之區;(b)移除原始Fc之N-末端某個胺基酸殘基;(c)在原始Fc型之N-末端添加甲硫胺酸殘基;(d)移除補體-結合位點;或(e)刪除抗體-依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)位點。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶融合蛋白,其中,該免疫球蛋白Fc區係無糖基化。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶融合蛋白,其中,該免疫球蛋白Fc區為衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、或IgM之Fc片段。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶融合蛋白,其中,該免疫球蛋白Fc區為具有衍生自選自由:IgG、IgA、IgD、IgE、及IgM所組成群組之免疫球蛋白之不同來源之功能域之雜合體。
- 如申請專利範圍第16項所述之酶融合蛋白,其中,該免疫球蛋白Fc區為IgG4 Fc區。
- 如申請專利範圍第17項之酶融合蛋白,其中該IgG4 Fc區之鉸鏈區被IgG1鉸鏈區取代。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶融合蛋白,其中,該酶融合蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO:6。
- 一種預防或治療溶酶體儲積症(LSD)之醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1至19項中任一項所述之酶融合蛋白。
- 如申請專利範圍第20項所述之醫藥組成物,其中,該溶酶體儲積症(LSD)係選自由下列各者所組成之群組:黏多醣症(MPS)、肝醣儲積症、神經鞘脂質代謝障礙症、尼曼匹克症、法布瑞氏症、高雪氏症、韓特氏症候群、與馬洛托-拉米氏症候群。
- 如申請專利範圍第19項所述之醫藥組成物,其中,該組成物降低酶對溶酶體受體之結合親和性。
- 一種多核苷酸,其編碼如申請專利範圍第1至19項中任一項所述之酶融合蛋白。
- 一種表現載體,其包含如申請專利範圍第21項所述之多核苷酸。
- 一種轉形體,其中已引入如申請專利範圍第22項所述之表現載體。
- 一種製備酶融合蛋白之方法,其包括:(a)培養如申請專利範圍第25項所述之轉形體,以得到培養物;及(b)從該培養物中回收酶融合蛋白。
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