JP2023549322A

JP2023549322A - 治療学的酵素融合タンパク質のファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーの予防及び治療用途

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Publication number: JP2023549322A
Application number: JP2023525997A
Authority: JP
Inventors: ジンヨンキム; チョロンパク; サンユンキム; ウォンキキム; スヨンパク
Original assignee: ハンミファーマシューティカルカンパニーリミテッド
Priority date: 2020-11-13
Filing date: 2021-11-15
Publication date: 2023-11-24
Also published as: MX2023005579A; AU2021377712A1; CN116419759A; EP4245310A1; WO2022103220A1; CA3196264A1; US20230416714A1; IL302857A; CO2023006516A2; KR20220065720A

Abstract

本発明は、治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域の融合タンパク質のニューロパチーの予防または改善用途に関する。

Description

本発明は、治療学的酵素を含む酵素融合タンパク質のファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーの予防及び治療用途に関する。

ニューロパチー（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）とは、糖尿、外傷、自己免疫疾患、腎疾患、腫瘍、飲酒、遺伝疾患などの多様な理由により神経系に機能的障害または病的変化が起きる疾病である。ニューロパチーの原因となる遺伝疾患であるとともにリソソーム蓄積疾患の一つであるファブリー病は、アルファガラクトシダーゼ（ａｌｐｈａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の酵素活性の欠乏または不足により蓄積されたＧｂ３及び１ｙｓｏ－Ｇｂ３が神経系に影響を及ぼし、多様な末梢神経症状（例えば、多発ニューロパチー（ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、小径線維ニューロパチー（ｓｍａｌｌｆｉｂｅｒｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、神経障害性の痛み）が現れることが知られている。

アルファガラクトシダーゼは、Ｇｂ３（ｇｌｏｂｏｔｒｉａｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）及び１ｙｓｏ－Ｇｂ３をラクトシルセラミド（ｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）に分解する酵素であり、前記酵素の異常により血管壁と身体の多様な部位にＧｂ３及びｌｙｓｏ－Ｇｂ３が非正常に蓄積されることにより、ファブリー病が発病することが知られている。アルファガラクトシダーゼの欠陥によりＧｂ３及び１ｙｓｏ－Ｇｂ３が細胞、特に、後根神経節（ｄｏｒｓａｌｒｏｏｔｇａｎｇｌｉｏｎ，ＤＲＧ）と呼ばれる神経細胞集合体で沈着すれば、空胞化（ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ）など、細胞の変形が生じ、結局、感覚及び感覚運動性障害をもたらす。このような理由によりファブリー病患者は、温度感覚に対する閾値が上昇し、刺すような、やけどをしたような耐えられない末梢神経症状や自律神経系症状、中枢神経症状などが伴う。

ファブリー病をはじめとするリソソーム蓄積疾患の治療のための方法として、酵素補充療法（ＥＲＴ：ｅｎｚｙｍｅ－ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｔｈｅｒａｐｙ）が主に研究されている（ＦｒａｎｃｅｓＭ．Ｐｌａｔｔｅｔａｌ．，ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ．２０１２Ｎｏｖ２６；１９９（５）：７２３－３４）。特に、ファブリー病は、アルファガラクトシダーゼの欠陥により生じる疾病であるため、アルファガラクトシダーゼの補充治療が必須である。

しかし、このような治療効果を奏するタンパク質は、一般に、安定性が低く容易に変性し、血液内タンパク質加水分解酵素により分解されるため、血中濃度及び活性を維持するためには、患者に頻繁に投与しなければならない。しかし、血中濃度を維持するために頻繁に注射を打つことは患者にとてつもない苦痛を引き起こす。このような問題を解決するために、酵素補充療法に用いられる治療剤の血中安定性を増加させ、血中薬物濃度を長い間、高く持続させながらタンパク質の活性が維持された治療剤の開発が必要である。

よって、体内で高い持続性を有しながらも末梢感覚神経に対する保護効果を奏し、ニューロパチーを治療できる治療剤の開発の重要性が台頭している。

国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号国際特許公開第９６／３２４７８号

ＦｒａｎｃｅｓＭ．Ｐｌａｔｔｅｔａｌ．，ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ．２０１２Ｎｏｖ２６；１９９（５）：７２３－３４Ｐｅａｒｓｏｎｅｔａｌ（１９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５］：２４４４Ｒｉｃｅｅｔａｌ．，２０００，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔａｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２：３８７（１９８４）Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］［Ｆ．，］［ＥＴＡＬ，ＪＭＯＬＥＣＢＩＯＬ２１５］：４０３（１９９０）ＧｕｉｄｅｔｏＨｕｇｅＣｏｍｐｕｔｅｒｓ，ＭａｒｔｉｎＪ．Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９４［ＣＡＲＩＬＬＯＥＴＡ／．］（１９８８）ＳＩＡＭＪＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ４８：１０７３ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２ＳｃｈｗａｒｔｚａｎｄＤａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，ＡｔｌａｓＯｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３－３５８（１９７９）Ｇｒｉｂｓｋｏｖｅｔａｌ（１９８６）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：６７４５ｖａｎｄｅｒＮｅｕｔＫｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ，ｅｔａｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１７：１５５４－１５５７．２００７Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７９

末梢感覚神経に対する保護効果を奏し、ニューロパチーを治療できる治療剤を開発することが求められる。

本発明の一つの目的は、下記化学式（１）で表される、酵素融合タンパク質を含むファブリー病に起因する又は伴うニューロパチー（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある：

ここで、Ｘ及びＸ’はアルファガラクトシダーゼであり；
Ｌ及びＬ’はリンカーで、それぞれ独立に同一または異なる種類のリンカーであり；
Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域の一つのポリペプチド鎖であり；
｜は共有結合であり；
：は共有または非共有結合である。

本発明のもう一つの目的は、前記酵素融合タンパク質またはこれを含む組成物をこれを必要とする個体に投与する段階を含むファブリー病に起因する又は伴うニューロパチー（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）の予防または治療方法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、ファブリー病に起因する又は伴うニューロパチー（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）の予防または治療のための前記酵素融合タンパク質またはこれを含む組成物の用途を提供することにある。

本発明は、治療学的酵素を含む融合タンパク質のファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーの予防または改善用途に関し、前記酵素融合タンパク質は、増加した持続時間により患者に有用に用いられ得る。

アルファガラクトシダーゼ－Ｆｃ融合タンパク質（α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ－Ｆｃ）及びアガルシダーゼベータのニューロパチー治療効果を比較した結果である。アルファガラクトシダーゼ－Ｆｃ融合タンパク質（α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ－Ｆｃ）及びアガルシダーゼベータの後根神経節における空胞化（ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ）した神経細胞数値を示した結果である。

本発明を具現する一つの様態は、治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域が融合された酵素融合タンパク質を含むファブリー病に起因する又は伴うニューロパチー（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）の予防または治療用薬学的組成物である。

一つの具体例による薬学的組成物として、前記酵素融合タンパク質は、下記化学式（１）で表される、酵素融合タンパク質であることを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記酵素はＸとＸ’が互いに逆平行（ａｎｔｉ－ｐａｒａｌｌｅｌ）で二量体を形成したことを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域は非グリコシル化されたことを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域は配列番号１５のアミノ酸配列を有するヒンジ領域を含むことを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭに由来したことを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧＦｃ領域に由来したことを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４Ｆｃ領域に由来したことを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域に由来したことを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、（ａ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン；（ｂ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン；（ｃ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン；（ｄ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン；及び（ｅ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインの１個または２個以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域またはヒンジ領域の一部との組合わせで構成された群から選択されることを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域は配列番号８のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＦｃ領域の２番目のアミノ酸がプロリンで置換されたもの；７１番目のアミノ酸がグルタミンで置換されたもの；または２番目のアミノ酸はプロリンで、７１番目のアミノ酸はグルタミンで置換されたものであることを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記免疫グロブリンＦｃ領域は配列番号９のアミノ酸配列を有する単量体を含むことを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記リンカーは１個～１００個のアミノ酸からなることを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記ペプチドリンカーは［ＧＳ］ｘ、［ＧＧＧＳ］ｘまたは［ＧＧＧＧＳ］ｘのアミノ酸配列からなり、ここで、ｘは自然数１～２０のうちの一つであることを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記ペプチドリンカーは配列番号１１のアミノ酸配列であることを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記ニューロパチーは多発ニューロパチー、または小径線維ニューロパチーであることを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記薬学的組成物は末梢感覚神経に対する保護効果を奏することを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記薬学的組成物は後根神経節（ｄｏｒｓａｌｒｏｏｔｇａｎｇｌｉｏｎ，ＤＲＧ）細胞の空胞化（ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ）を抑制することを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記酵素融合タンパク質はこれを必要とする個体に投与される回数が融合タンパク質ではなく酵素に比べて減少したことを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記薬学的組成物は２週に１回または１カ月に１回個体に投与されることを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記酵素融合タンパク質は配列番号１３のアミノ酸配列を含む単量体を含むことを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記酵素融合タンパク質は一分子のアルファガラクトシダーゼと一分子の免疫グロブリンＦｃ領域がペプチドリンカーを介して連結された単量体が二量体を形成したことを特徴とする。

前述した具体例のいずれか一つによる薬学的組成物であって、前記Ｘ及びＸ’は、それぞれ同一または異なるアミノ酸配列を含む酵素であることを特徴とする。

本発明を具現するもう一つの様態は、前記酵素融合タンパク質またはこれを含む組成物をこれを必要とする個体に投与する段階を含む、ファブリー病に起因する又は伴うニューロパチー（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）の予防または治療方法である。

本発明を具現するもう一つの様態は、ファブリー病に起因する又は伴うニューロパチー（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）の後遺症の予防または治療のための薬剤の製造において前記酵素融合タンパク質またはこれを含む組成物の用途である。

本発明を具現するもう一つの様態は、ファブリー病に起因する又は伴うニューロパチー（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）の予防または治療のための前記酵素融合タンパク質またはこれを含む組成物の用途である。

本発明を実施するための具体的な内容を説明すると次の通りである。一方、本願で開示されるそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用され得る。即ち、本願で開示された多様な要素の全ての組合わせが本発明の範疇に属する。また、下記の具体的な記述により本発明の範疇が制限されるとは見られない。

また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本発明の特定様態に対する多数の等価物を認知または確認することができる。また、このような等価物は、本発明に含まれることが意図される。

本明細書全体を通して、天然に存在するアミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられるだけでなく、Ａｉｂ（α－アミノイソ酪酸）、Ｓａｒ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）などの他のアミノ酸に対して一般に許容される３文字コードが用いられる。また、本明細書において略語で言及したアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法に従って記載したものである。

本発明を具現する一つの様態は、下記化学式（１）で表される、酵素融合タンパク質を含むファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーの予防または治療用薬学的組成物を提供する：

一つの具現例として、前記薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤と前記化学式（１）で表される酵素融合タンパク質を薬学的有効量で含む薬学的組成物であってもよい。本発明において、「薬学的有効量」とは、前記酵素融合タンパク質がファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーに対して予防または治療効果を奏しながらも患者に毒性や副作用を示さない安全な投与用量を意味し、具体的には末梢感覚神経に対する保護効果を奏したり、後根神経節（ｄｏｒｓａｌｒｏｏｔｇａｎｇｌｉｏｎ，ＤＲＧ）細胞の空胞化（ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ）を抑制する効果が得られる用量を意味するが、これに制限されない。

本発明において用語「酵素融合タンパク質」は、治療学的酵素に免疫グロブリンＦｃ領域が融合されたものであり、免疫グロブリンＦｃ領域の融合により、免疫グロブリンＦｃ領域と融合されていない治療学的酵素に比べて、治療学的酵素の活性は維持されながらも、リソソーム受容体に対する結合力が減少し、血中半減期が増加するものであってもよい。本発明の酵素融合タンパク質は、酵素補充療法（ｅｎｚｙｍａｔｉｃｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｔｈｅｒａｐｙ，ＥＲＴ）の薬物として用いられる。前記酵素補充療法は、疾患の原因となる欠乏または不足酵素を補充することにより、低下した酵素機能の回復を通じて疾病を予防または治療できる。

本発明者らは、治療学的酵素の血中半減期を増加させるために、免疫グロブリンＦｃ領域との融合タンパク質を製作した。本発明の酵素融合タンパク質に含まれるＦｃ領域は、糖化を抑制するために潜在的な糖化配列を置換させ、さらにＩｇＧ４Ｆｃのヒンジ配列を置換させて鎖交換（ｃｈａｉｎｅｘｃｈａｎｇｅ）が抑制されたＩｇＧ４Ｆｃ領域であってもよいが、これに制限されない。

前記化学式（１）において、Ｆである免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ヒンジ配列が置換されたＩｇＧ４Ｆｃ領域）は、リンカーを介して治療学的酵素と連結されて単量体を形成することができ、前記単量体は、他の免疫グロブリンＦｃ領域及び治療学的酵素を含む単量体と二量体を形成できる。この時、前記二量体は、免疫グロブリンＦｃ領域同士の共有結合、治療学的酵素同士の共有または非共有結合で二量体を形成するものであってもよいが、これに制限されない。特に、前記免疫グロブリンＦｃ領域と融合される治療学的酵素が二量体、特に逆平行の（ａｎｔｉ－ｐａｒａｌｌｅｌ）形態で連結された二量体を形成する場合、酵素の活性を維持しながらも体内持続性が増加することを確認し、従って、本発明の酵素融合タンパク質は、Ｆｃ領域が融合されていない治療学的酵素に比べて安定性が増加する長所がある。

本発明の用語「治療学的酵素」とは、酵素の不足、欠乏、機能異常などにより発病する疾病を治療するための酵素であり、酵素補充療法（ｅｎｚｙｍｅｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｔｈｅｒａｐｙ）、投与などを通じて前記疾病を有する個体を治療できる酵素を意味する。本発明の酵素融合タンパク質に含まれ得る治療学的酵素は特に制限されず、融合されていない形態の治療学的酵素より生体内持続時間を増やして利点が得られる治療学的酵素であれば、本発明の酵素融合タンパク質に含まれ得る。本発明の一実施形態において酵素融合タンパク質は、治療学的酵素の融合タンパク質である。

本発明において、前記治療学的酵素は、アルファガラクトシダーゼであってもよい。

本発明の酵素融合タンパク質に含まれる治療学的酵素は、非共有結合を通じて二量体を形成するものであってもよいが、これに制限されない。具体的には、前記治療学的酵素は、融合タンパク質が形質転換体で発現されて免疫グロブリンＦｃ領域が二量体（ｄｉｍｅｒ）を形成する時、治療学的酵素も二量体（ｄｉｍｅｒ）を形成するものであってもよい。

このような治療学的酵素の二量体は、互いに同一の２個の酵素が二量体を形成したものであってもよく、または互いに相違する２個の酵素が二量体を形成したものであってもよく、前記二量体を構成する酵素は、体内で目的とする活性を有する以上、具体的な種類に制限されない。

一方、前記二量体を構成する治療学的酵素は、互いに連結される方向に応じて、平行二量体（ｐａｒａｌｌｅｌｄｉｍｅｒ）または逆平行の二量体（ａｎｔｉ－ｐａｒａｌｌｅｌｄｉｍｅｒ）であってもよいが、これに制限されるものではない。具体的な例示として、前記化学式（１）において、前記酵素は、ＸとＸ’が互いに逆平行（ａｎｔｉ－ｐａｒａｌｌｅｌ）で二量体を形成したものであってもよいが、これに制限されない。

本発明の実施例では、治療学的酵素であるアルファガラクトシダーゼが免疫グロブリンＦｃ領域と融合されて発現された融合タンパク質を製造し、前記融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域が二量体（ｄｉｍｅｒ）を形成しながらアルファガラクトシダーゼが非共有結合を通じて逆平行の二量体を形成することを確認した（実施例１）。

本発明の用語、「平行二量体（ｐａｒａｌｌｅｌｄｉｍｅｒ）」とは、それぞれの単量体が二量体を形成する時にそれぞれの単量体のアミノ酸配列のＮ末端とＣ末端が同じ方向に二量体を形成することを意味する。この時、二量体の形成は、非共有結合または共有結合であってもよいが、これに制限されるものではない。

本発明の用語「逆平行の二量体（ａｎｔｉ－ｐａｒａｌｌｅｌｄｉｍｅｒ）」とは、それぞれの単量体が二量体を形成する時、それぞれの単量体のアミノ酸配列のＮ末端とＣ末端が互いに異なる方向に二量体を形成することを意味する。この時、二量体の形成は、非共有結合または共有結合であってもよいが、これに制限されるものではない。

言い換えれば、本発明の酵素融合タンパク質において、（ｉ）一つの治療学的酵素（Ｘ）のＮ末端ともう一つの治療学的酵素（Ｘ’）のＮ末端が同じ方向に二量体を形成したり、（ｉｉ）一つの治療学的酵素（Ｘ）のＣ末端ともう一つの治療学的酵素（Ｘ’）のＣ末端が同じ方向に二量体を形成したり、（ｉｉｉ）一つの治療学的酵素（Ｘ）のＮ末端ともう一つの治療学的酵素（Ｘ’）のＣ末端が同じ方向に二量体を形成したり、または（ｉｖ）一つの治療学的酵素（Ｘ）のＣ末端ともう一つの治療学的酵素（Ｘ’）のＮ末端が同じ方向に二量体を形成できる。前記（ｉ）及び（ｉｉ）の場合を平行二量体、前記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の場合を逆平行の二量体といい、前記二量体の形成は、共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔｂｏｎｄ）または非共有結合（ｎｏｎ－ｃｏｖａｌｅｎｔｂｏｎｄ）によるものであってもよいが、これに制限されるものではない。

具体的には、前記二量体の形成において、平行または逆平行の二量体の形成は、免疫グロブリンＦｃ領域が二量体を形成することにより、これに連結された単量体のアルファガラクトシダーゼが共有または非共有結合を通じて二量体を形成するものであってもよい。

本発明の酵素融合タンパク質に含まれる酵素は、アルファガラクトシダーゼ（ａｌｐｈａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）であってもよい。本発明の目的上、酵素融合タンパク質は、二量体の治療学的酵素を含んでもよく、具体的には、アルファガラクトシダーゼが二量体を形成するものであってもよく、または、アルファガラクトシダーゼと異なる治療学的酵素が二量体を形成するものであってもよいが、これに制限されるものではない。本発明の融合タンパク質の一例として、前記化学式（１）において、Ｘ及びＸ’はアルファガラクトシダーゼであってもよく、ＸとＸ’のアミノ酸配列は同一または異なってもよい。例えば、Ｘ及びＸ’がいずれも天然型アルファガラクトシダーゼであってもよく、または、Ｘ及びＸ’のいずれか一つは天然型アルファガラクトシダーゼであり、もう一つは天然型アルファガラクトシダーゼにおいて一部の配列が変形された変異体であってもよいが、これに制限されない。または、Ｘ及びＸ’は互いに異なる配列を有するアルファガラクトシダーゼの変異体であってもよいが、これに制限されない。

本発明の用語、アルファガラクトシダーゼ（ａｌｐｈａｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ， α－ＧＡＬ）またはアルファガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬＡ）は、脾臓、脳、肝臓などのリソソームに存在する酵素であり、糖脂質と糖タンパクにおいて末端アルファガラクトシル（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ）部分を加水分解する酵素であり、ホモダイマーの（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ）糖タンパクである。具体的には、前記アルファガラクトシダーゼは、セラミドｔｒｉｈｅｘｏｓｉｄｅを加水分解し、ガラクトースとブドウ糖にｍｅｌｉｂｉｏｓｅの加水分解を触媒することが知られており、特に、リソソーム蓄積疾患であるファブリー病（Ｆａｂｒｙ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）と関連することが知られている。

本発明において、前記アルファガラクトシダーゼは、組換え形態であるアガルシダーゼアルファ（ａｇａｌｓｉｄａｓｅａｌｐｈａ）またはアガルシダーゼベータ（ａｇａｌｓｉｄａｓｅｂｅｔａ）を含み、これと同等の活性及び治療効果を奏する酵素である限り、配列や由来、製法などに制限なく本発明の範疇に含まれてもよい。具体的には、前記アルファガラクトシダーゼは、配列番号５のポリヌクレオチド配列によりコードされてもよく、配列番号６のアミノ酸配列を含んでもよく、（必須で）構成されるものであってもよいが、これに制限されない。または、本発明のアルファガラクトシダーゼは、天然型アルファガラクトシダーゼまたは配列番号６のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％以上、９０％以上、より具体的には、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに制限されない。

本願において特定の配列番号で「構成される」ペプチドと記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるペプチドと同一もしくは相当する活性を有する場合であれば、当該配列番号のアミノ酸配列前後の無意味な配列の追加または自然に発生し得る突然変異、またはそのサイレント突然変異（ｓｉｌｅｎｔｍｕｔａｔｉｏｎ）を除外することではなく、このような配列の追加もしくは突然変異を有する場合であっても、本願の範囲内に属することが自明である。即ち、一部の配列の差があるとしても、一定水準以上の相同性を示し、天然型アルファガラクトシダーゼと同等または類似の活性を示すと、本発明の範囲に属することができる。

本出願において、用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と相互に関連した程度を意味し、百分率で表すことができる。

用語の相同性及び同一性はしばしば互換的に使用することができる。

任意の２つのペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎｅｔａｌ（１９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５］：２４４４でのようなデフォルトパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを使用して決定されてもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：ＴｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＯｐｅｎＳｏｆｔｗａｒｅＳｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅｅｔａｌ．，２０００，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して決定されてもよい（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔａｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２：３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］［Ｆ．，］［ＥＴＡＬ，ＪＭＯＬＥＣＢＩＯＬ２１５］：４０３（１９９０）；ＧｕｉｄｅｔｏＨｕｇｅＣｏｍｐｕｔｅｒｓ，ＭａｒｔｉｎＪ．Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９４，及び［ＣＡＲＩＬＬＯＥＴＡ／．］（１９８８）ＳＩＡＭＪＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ４８：１０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定することができる。

ポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２において公知となっているように、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎｅｔａｌ．（１９７０），ＪＭｏｌＢｉｏｌ．４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定されてもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（すなわち、アミノ酸）の数を除した値と定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含む）、及びＳｃｈｗａｒｔｚａｎｄＤａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，ＡｔｌａｓＯｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３－３５８（１９７９）により開示されているように、Ｇｒｉｂｓｋｏｖｅｔａｌ（１９８６）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：６７４５の加重比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。従って、本発明で用いられたものとして、用語「相同性」または「同一性」は配列間の関連性（ｒｅｌｅｖａｎｃｅ）を示す。

前記治療学的酵素またはこの誘導体の配列及びこれをコードする塩基配列の情報はＮＣＢＩなど、公知のデータベースから得ることができる。

本発明の治療学的酵素は、天然型酵素であってもよく、前記天然型酵素の一部で構成された断片、あるいは一部のアミノ酸の置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、追加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）、除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及びこれらの組合わせからなる群から選択された変形が起こった、治療学的酵素のアナログ（ａｎａｌｏｇ）も天然型治療学的酵素と同等の活性を有する限り、本発明に制限なく含まれる。

本発明の用語、「断片」とは、天然型治療学的酵素または天然型治療学的酵素のアナログのアミノ末端あるいはカルボキシ末端に一つまたはそれ以上のアミノ酸が除去された形態をいう。治療学的酵素の活性を有する限り、断片の大きさや除去されるアミノ酸の種類に関係なく本発明の範疇に含まれる。

また、前記治療学的酵素のアナログは、天然型治療学的酵素のアミノ及び／又はカルボキシ末端に一つまたはそれ以上のアミノ酸が追加されたことをいずれも含む。

また、前記治療学的酵素のアナログは、天然型治療学的酵素の配列において一つ以上のアミノ酸残基が置換されるか、追加されたものであってもよく、前記置換されるか、付加されるアミノ酸としては、ヒトタンパク質において通常観察される２０種のアミノ酸だけでなく、異常又は非自然発生アミノ酸を用いることができる。異常アミノ酸の市販元には、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ、Ｇｅｎｚｙｍｅｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。これらのアミノ酸が含まれるペプチドと定型的なペプチド配列は、民間のペプチド合成会社、例えば米国のＡｍｅｒｉｃａｎｐｅｐｔｉｄｅｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、又は韓国のＡｎｙｇｅｎにおいて合成及び購入が可能であるが、特にこれに制限されない。

前記治療学的酵素アナログは、当該治療学的酵素のバイオシミラーとバイオベター形態を含むが、バイオシミラーの例としては、公知の治療学的酵素と発現宿主の差、糖化の様相と程度の差、特定位置の残基が当該酵素の基準配列に照らしてみると、１００％の置換ではない場合、その置換程度の差も本発明の酵素融合タンパク質で用いることができるバイオシミラー酵素に該当する。前記治療学的酵素は、当業界において知られている方法で準備または製造することができ、具体的には、遺伝子組換えを通じて動物細胞、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、生きている動物などから生産でき、生産方法はこれに限定されず、商業的に利用可能な治療学的酵素を購入して用いることができるが、これに制限されない。

前記治療学的酵素は、当業界において知られている方法で準備または製造することができ、具体的には、動物細胞発現ベクターを挿入した動物細胞を培養し、培養物から精製することができ、または商業的に利用可能な酵素を購入して用いることができるが、これに制限されない。

本発明の酵素融合タンパク質は、治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域がペプチドリンカーを介して融合されたものであってもよい。即ち、前記化学式（１）のＬまたはＬ’はペプチドリンカーであってもよいが、免疫グロブリンＦｃ領域と治療学的酵素を融合できる限り、特に制限されるのではない。

前記ペプチドリンカーは１個以上のアミノ酸を含み、例えば、１個～１０００個、１個～５００個、１個～１００個、または１個～５０個のアミノ酸を含み、当業界において知られた任意のペプチドリンカー、その例として［ＧＳ］ｘリンカー、［ＧＧＧＳ］ｘリンカー及び［ＧＧＧＧＳ］ｘリンカーなどを含み、ここで、ｘは１以上の自然数（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）であってもよく、具体的な例として、前記ｘは、自然数１～２０のうちの一つであってもよいが、これに制限されない。具体的には、本発明のペプチドリンカーは、１０～５０個、より具体的には、２０～４０個のアミノ酸配列で構成されてもよく、配列番号１１のアミノ酸配列で構成されるものであってもよい。

本発明の目的上、治療学的酵素の活性を維持しながら治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域を連結できる限り、ペプチドリンカーが治療学的酵素及び免疫グロブリンＦｃに融合される位置は制限されない。具体的には、治療学的酵素及び免疫グロブリンＦｃ領域の両末端、より具体的には、治療学的酵素のＣ末端、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端であってもよいが、これに制限されない。

本発明の用語、「Ｎ末端」または「Ｃ末端」とは、それぞれタンパク質のアミノ末端及びカルボキシル末端を意味することであり、その例として、これに制限されないが、Ｎ末端またはＣ末端の最末端のアミノ酸残基だけでなく、Ｎ末端またはＣ末端周囲のアミノ酸残基をいずれも含み得、具体的には、最末端から最初～２０番目のアミノ酸残基を含み得る。

本発明の一実施例では、治療学的酵素であるアルファガラクトシダーゼとリンカー－ＩｇＧ４を遺伝子の水準で融合されるように合成し、治療学的酵素のＣ末端にＩｇＧ４Ｆｃ領域のＮ末端が融合された融合タンパク質（配列番号１３）を製造し、前記融合タンパク質が形質導入された形質転換体で発現されることを確認した（実施例１）。

本発明の酵素融合タンパク質の具体的な一例として、アルファガラクトシダーゼが免疫グロブリンＦｃ領域が共有結合でペプチドリンカーを介して連結されて形成された単量体を含み、２個の単量体の免疫グロブリンＦｃ領域間に共有結合、治療学的酵素間に共有または非共有結合により二量体を形成したものであってもよいが、これに制限されない。

他の具体例として、本発明の酵素融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列を含んでもよく、（必須で）構成された単量体を含むものであってもよく、または、前記単量体が形成した二量体の構造を有するものであってもよいが、これに制限されない。

本発明において、前記ペプチドリンカーは、単量体の免疫グロブリンＦｃ領域が形成する二量体免疫グロブリンＦｃ領域にそれぞれ連結されるものであってもよく、各免疫グロブリンＦｃ領域に連結されるリンカーは互いに同一または異なる種類であってもよい。

本発明の用語「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いた、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び／又は重鎖定常領域３（ＣＨ３）部分を含む部位を意味する。本発明の目的上、このようなＦｃ領域は変異されたヒンジ領域を含めてもよいが、これに制限されない。具体的には、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型免疫グロブリンＦｃ領域で少なくとも一つ以上のアミノ酸で置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、追加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）、除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及びこれらの組合わせからなる群から選択された変形が起こったものであってもよいが、これに制限されない。

また、本発明において、前記化学式（１）の酵素融合タンパク質のＦはＩｇＧ、具体的にはＩｇＧ４Ｆｃ領域に由来した免疫グロブリンＦｃ領域であってもよく、非グリコシル化されたものあってもよいが、これに制限されない。また、ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域において一つ以上のアミノ酸が置換された免疫グロブリンＦｃ領域であってもよいが、これに制限されない。

前記化学式（１）の酵素融合タンパク質において、前記Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域の一つのポリペプチド鎖であってもよいが、これに制限されない。

前記化学式（１）のＦの具体的な例として、配列番号８のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＦｃ領域の２番目のアミノ酸がプロリンで置換されたもの；７１番目のアミノ酸がグルタミンで置換されたもの；または２番目のアミノ酸はプロリンで、７１番目のアミノ酸はグルタミンで置換された単量体を含むもの；もしくは配列番号９の単量体を含むものであってもよいが、これに制限されない。

免疫グロブリンＦｃ領域は、薬物を製造するにおいてキャリアとして用いられる物質であり、タンパク質を安定化して腎臓から除去されることを防止するために、最近は、免疫グロブリンＦｃ領域を用いた融合タンパク質研究が活発に行われている。

免疫グロブリンは、血液の主要構成成分としてＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのように５種類があるが、融合タンパク質の研究に頻繁に用いられる種類はＩｇＧであり、これは、ＩｇＧ１～４の４種類のｓｕｂｔｙｐｅに分類される。免疫グロブリンＦｃ領域を用いた融合タンパク質は、タンパク質の大きさを増加させて腎臓から除去されることを防止し、ＦｃＲｎ受容体と結合して細胞内にｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ及びｒｅｃｙｃｌｉｎｇを通じて血中半減期を増加させる役割をする。

本発明において、Ｆｃ領域と言えば、免疫グロブリンのパパイン消化から得る天然型配列だけでなくその誘導体、例えば、天然配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより置換されて天然のものとは異なる配列など変形体も含まれる。前記誘導体、置換体、変形体はＦｃＲｎに結合する能力を有することを前提とする。本発明において、Ｆはヒト免疫グロブリン領域であってもよいが、これに制限されない。本発明による化学式（１）の酵素融合タンパク質において、Ｆは一つのポリペプチド鎖を含む単量体の免疫グロブリンＦｃ領域であり、前記ポリペプチド鎖はジスルフィド結合により２個のポリペプチド鎖の二量体を形成し、本発明の酵素融合タンパク質は二量体の免疫グロブリンＦｃ領域を含む構造であってもよい。特に、前記２つの鎖のうち１つの鎖の窒素原子を介してのみ連結されている構造であるが、これに限定されるものではない。前記窒素原子を介する連結は、リシンのεアミノ原子やＮ末端のアミノ基に還元的アミノ化により連結されるものであってもよい。

還元的アミノ化反応とは、反応物のアミン基又はアミノ基が他の反応物のアルデヒド（すなわち、還元的アミノ化が可能な官能基）と反応してアミンを生成し、次いで還元反応によりアミン結合を形成する反応を意味し、当該技術分野で周知の有機合成反応である。

一つの具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、Ｎ末端プロリンの窒素原子を通じて互いに連結されたものあってもよいが、これに制限されない。

また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然のものと実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。さらに、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が欠失した領域であってもよい。

本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、及び５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインの少なくとも１つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組合わせであってもよい。しかし、これに制限されるものではない。より具体的には、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインからなるものあってもよいが、これに制限されるものではない。

本発明において、前記化学式（１）のＦ（免疫グロブリンＦｃ領域）は単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の形態であってもよいが、これに制限されない。具体的には、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、同一の起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンを含むものであってもよいが、これに制限されない。

本発明において、前記化学式（１）においてＦである免疫グロブリンＦｃ領域は、単量体の形態でペプチドリンカーを介して単量体の治療学的酵素と融合発現されるものであってもよい。前記単量体の免疫グロブリンＦｃ領域が二量体を形成することにより、前記免疫グロブリンＦｃ領域に融合された治療学的酵素も非共有結合により二量体を形成できるが、これに制限されるものではない。

このような免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖定常領域にヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域を含んでもよく、前記ヒンジ領域により単量体である免疫グロブリンＦｃ領域が二量体を形成できるが、これに制限されるものではない。

本発明において、免疫グロブリンＦｃ領域はＮ末端に特定のヒンジ配列を含んでもよい。

本発明の用語、「ヒンジ配列」は、重鎖に位置してジスルフィド結合（ｉｎｔｅｒｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄ）を通じて免疫グロブリンＦｃ領域の二量体を形成する部位を意味する。

一つの例として、前記ヒンジ領域は、下記アミノ酸配列を有するヒンジ配列中の一部が欠失または変異されたものであってもよい。

Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号１４）

具体的には、前記ヒンジ領域の一部が欠失し、一つのシステイン（Ｃｙｓ）残基のみを含むように変異されたものであってもよく、鎖交換（ｃｈａｉｎｅｘｃｈａｎｇｅ）に関与するセリン（Ｓｅｒ）残基をプロリン（Ｐｒｏ）残基で置換されたものであってもよい。より具体的には、前記ヒンジ配列の２番目のセリン残基がプロリン残基で置換されたものであってもよいが、これに制限されない。

一例として、本発明のヒンジ領域は、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号１５）の配列を含むか、（必須で）構成されたものであってもよく、免疫グロブリンＦｃ領域は、前記配列番号１５のヒンジ領域配列を含めてもよいが、これに制限されない。

本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型ヒンジ領域または変異されたヒンジ領域を含むことにより、一分子の免疫グロブリンＦｃ領域が共有結合を通じて二量体を形成できるが、これに制限されない。

薬物のキャリアとして用いられる免疫グロブリンＦｃ領域は、意図していない免疫反応を引き起こす短所があることが知られている。例えば、抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ，ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）または補体依存的細胞傷害（ＣＤＣ，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）のようなエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎ）を有するようになる。このような機能は免疫グロブリンＦｃ領域のＦｃ受容体との結合、補体結合、またはＦｃ領域のグリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を通じて生じるようになる。また、Ｆｃそのものの生体内の不安定性が発生しやすい。

本発明者らは、免疫グロブリンＦｃ領域内ヒンジ領域の配列を置換することにより、このような問題を解決しようとした。具体的には、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、糖化を調節するために潜在的糖化配列が置換されたものであってもよく、または、鎖交換に関与する配列が置換されたものであってもよく、または、２つの場合の両方に該当してもよい。より具体的には、本発明の酵素融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域は、鎖交換が起こらないものであってもよい。

具体的には、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、鎖交換及びＮ－グリコシル化を防止するために、配列番号８の免疫グロブリンＦｃ領域の２番目のアミノ酸及び／又は７１番目のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであってもよい。より具体的には、配列番号８の免疫グロブリンＦｃ領域の１）２番目のアミノ酸（セリン）がプロリンで置換されたり、２）７１番目のアミノ酸（アスパラギン）がグルタミンで置換されたり、または３）２番目のアミノ酸はプロリンで、７１番目のアミノ酸はグルタミンで置換されたものであってもよく、具体的には、配列番号９のアミノ酸配列で表される免疫グロブリンＦｃ領域であってもよいが、これに制限されない。前記言及された変異以外にも治療学的酵素の安定性を増大させる、薬物のキャリアとして適した変異を含有し得る。

具体的には、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンＩｇＧ４Ｆｃのヒンジ領域がＩｇＧ１ヒンジ領域で置換されたものあってもよいが、これに制限されない。

本発明の一実施例では、免疫グロブリンＦｃの２番目のアミノ酸はプロリンで、７１番目のアミノ酸はグルタミンで置換し、鎖交換及びＮ－グリコシル化が減少するようにした（実施例１）。

本発明の用語、「鎖交換（ｃｈａｉｎｅｘｃｈａｎｇｅ）」とは、ＩｇＧ４Ｆｃをタンパク質融合体のキャリアとして使用時に、生体内に存在するＩｇＧ４とハイブリッドを形成したり単量体として存在して本来の構造を変更させて治療学的に低い活性を有する構造を有するようになる問題を意味することであり、タンパク質が融合された融合タンパク質である、タンパク質融合体を治療用目的で使用時に大きな困難があることが報告された（ｖａｎｄｅｒＮｅｕｔＫｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ，ｅｔａｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１７：１５５４－１５５７．２００７）。

また、他の具体的な様態において、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなくこの配列誘導体を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、追加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）、除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及びこれらの組合わせからなる群から選択された変異が起きたことを意味する。

例えば、ＩｇＧＦｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４～２３８、２９７～２９９、３１８～３２２又は３２７～３３１番目のアミノ酸残基が修飾に適した部位として用いられてもよい。

また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去された誘導体、天然ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が欠失された誘導体、天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加された誘導体など、様々な誘導体が用いられる。さらに、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を作製する技術は、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号、国際特許公開第９６／３２４７８号などに開示されている。

分子の活性を全体的に変化させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野で公知である（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７９）。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、アミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）などにより修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。

また、前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を向上させたものであってもよい。

また、このようなＦｃ領域は、ヒトや、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然のものから得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換えたもの又はその誘導体であってもよい。ここで、天然のものから得る方法は、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素で処理することにより得る方法であってもよい。パパインで処理するとＦａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンで処理するとｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）２に切断される。これらは、サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。より具体的な実施形態において、ヒト由来のＦｃ領域は、微生物から得られた組換え免疫グロブリンＦｃ領域である。

また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然糖鎖、天然のものに比べて増加した糖鎖、天然のものに比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去、または非グリコシル化された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法、微生物を用いた遺伝工学的手法などの通常の方法が用いられてもよい。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が低減又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域は、薬物のキャリアとしての本来の目的に適する。

本発明の用語「糖鎖の除去（Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域を意味し、非グリコシル化（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）とは、原核生物、より具体的な実施形態においては大腸菌で産生されてグリコシル化されていないＦｃ領域を意味する。

一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト起源、又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、より具体的な実施形態においてはヒト起源である。

また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来のものであってもよく、それらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）又はそれらのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）によるＦｃ領域であってもよい。より具体的な実施形態においては、ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来のものであり、さらに具体的な実施形態においては、リガンド結合タンパク質の半減期を延長させることが知られているＩｇＧ由来のものである。より具体的な実施形態において前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４Ｆｃ領域であり、一層具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域であり、最も具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列は配列番号９であり、これをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号７であってもよいが、これらに限定されるものではない。

一方、本発明において「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、二量体又は多量体を形成する時、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが相違する起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。即ち、ＩｇＧＦｃ、ＩｇＡＦｃ、ＩｇＭＦｃ、ＩｇＤＦｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなるグループから選択された２個以上の断片から二量体又は多量体の製造が可能である。

また、本発明の治療学的酵素または酵素融合タンパク質はＮ末端及び／又はＣ末端が変形されていないものであってもよいが、生体内のタンパク質切断治療学的酵素から保護し、安定性を増加させるために、そのＮ末端及び／又はＣ末端などが化学的に修飾されたり有機基で保護されたり、またはペプチド末端などにアミノ酸が追加されて変形された形態も本発明による治療学的酵素または酵素融合タンパク質の範疇に含まれる。Ｃ末端が変形されていない場合、本発明による治療学的酵素または酵素融合タンパク質の末端はカルボキシル基を有するが、特にこれに制限されるものではない。

特に、化学的に合成したタンパク質の場合、Ｎ及びＣ末端が電荷を帯びているため、このような電荷を除去するために、Ｎ末端をアセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）及び／又はＣ末端をアミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）できるが、特にこれに制限されない。

本発明の用語、「Ｎ末端」とは、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端を意味することであり、アミノ末端の最末端、または最末端から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個以上のアミノ酸まで含むものであってもよい。本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ配列をＮ末端に含んでもよいが、これに制限されない。

本明細書において特に指すところがなければ、本発明による「酵素」または「融合タンパク質」に関する明細書の詳細な説明や請求の範囲の技術は、当該酵素または融合タンパク質はもちろん、当該酵素または融合タンパク質の塩（例えば、前記融合タンパク質の薬学的に許容可能な塩）、またはこの溶媒和物の形態をいずれも含む範疇にも適用される。従って、明細書に「酵素」または「融合タンパク質」とだけ記載されていても当該記載内容はその特定塩、その特定溶媒和物、その特定塩の特定溶媒和物にも同様に適用される。このような塩形態は、例えば、薬学的に許容される任意の塩を用いた形態であってもよい。前記塩の種類は特に制限されない。ただし、個体、例えば、哺乳類に安全で効果的な形態であることが好ましいが、特にこれに制限されるものではない。

前記用語「薬学的に許容される」とは、医薬学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、又はアレルギー反応などを誘発することなく所望の用途に効果的に使用可能な物質を意味する。

本発明の用語、「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容される無機酸、有機酸、又は塩基から誘導された塩を含む。適した酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを挙げることができる。適した塩基から誘導された塩はナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、及びアンモニウムなどを含んでもよい。

また、本発明の用語「溶媒和物」とは、本発明による酵素、融合タンパク質又はその塩が溶媒分子と複合体を形成したことをいう。

本発明の酵素融合タンパク質は、当業界の公知となった方法で製造され得る。

本発明の酵素融合タンパク質を製造する一つの例としては、治療学的酵素であるアルファガラクトシダーゼ（ａｌｐｈａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）をペプチドリンカー－免疫グロブリンＦｃと融合された形態で発現する組換えベクターを製造し、これを細胞株で発現させることであってもよいが、これに制限されず、本明細書で記述された方法以外にも、公知となった他の方法により製造され得る。本発明の酵素融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されるものではない。

本発明による酵素融合タンパク質は、治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域を融合させ、治療学的酵素の活性を維持しながら、体内安定性を高めることにより治療学的酵素の半減期を増加させることができる。特に、変異された免疫グロブリンＦｃ領域と融合された治療学的酵素は、鎖交換及びグリコシル化が弱化し、Ｆｃ領域と融合されていない治療学的酵素に比べてリソソーム受容体に対する結合力が低く、高い持続性を有することができ、これは、目的とする疾患の治療において、有用な効果を奏することである。

以上の内容は、本発明の他の具体例あるいは他の様態にも適用され得るが、これに制限されるものではない。

本発明の薬学的組成物は、前記酵素融合タンパク質を薬理学的有効量で含み、選択的に、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、ファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーの予防または治療用薬学的組成物であってもよい。本発明による組成物は、治療学的酵素の生体内持続性及び安定性が増加したことを特徴とする。

本発明のアルファガラクトシダーゼを含む酵素融合タンパク質は、アルファガラクトシダーゼの欠陥により腎臓組織で蓄積されるＬｙｓｏ－Ｇｂ３の水準を減少させ、これを通じてＬｙｓｏ－Ｇｂ３の蓄積による疾病（例えば、ニューロパチー）の治療に用いられ得る。

Ｌｙｓｏ－Ｇｂ３（Ｇｌｏｂｏｔｒｉａｏｓｙｌｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎ）はＧｂ３（ｇｌｏｂｏｔｒｉａｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）の脱アシル化した形態であり、Ｌｙｓｏ－Ｇｂ３またはＧｂ３が末梢痛覚受容ニューロンで直接的な役割をすることが知られており、この水準を減少させることによりニューロパチーの治療効果が得られる。

本発明の薬学的組成物は、前記酵素融合タンパク質を含めてニューロパチーの予防または治療効果を奏するものであってもよい。

本発明において用語「ニューロパチー（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）」とは、神経系に機能的障害または病的変化が起きる疾病を意味する。その原因により砒素ニューロパチー（ａｒｓｅｎｉｃａｌｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、糖尿病性ニューロパチー（ｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、虚血性ニューロパチー（ｉｓｃｈｅｍｉｃｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、または外傷性ニューロパチー（ｔｒａｕｍａｔｉｃｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）に区別される。または、遺伝病、例えば、シャルコー・マリー・トゥース（Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ，ＣＭＴ）、家族性アミロイドーシス（Ｆａｍｉｌｉａｌａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、ファブリー病、及び異染性白質ジストロフィー（ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）などもニューロパチーの原因となり得る。本発明において、ニューロパチーは、ファブリー病に起因する又はファブリー病に伴って現れるニューロパチーであってもよい。

ファブリー病患者では、アルファガラクトシダーゼの欠陥によりＬｙｓｏ－Ｇｂ３が分解されずに蓄積され、蓄積されたＬｙｓｏ－Ｇｂ３が神経系に影響を及ぼして多様な末梢神経症状が現れることが知られている。

本発明の酵素融合タンパク質は、酵素補充療法の治療に用いられ得るところ、アルファガラクトシダーゼの結合によるファブリー病に起因するまたは伴うニューロパチー、またはファブリー病に起因して発病し、ファブリー病に伴うニューロパチーに予防または治療的効果を奏することができる。

本発明の目的上、本発明によるファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーの予防または治療用薬学的組成物は、多発ニューロパチー（ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）または小径線維ニューロパチー（ｓｍａｌｌｆｉｂｅｒｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）に対する予防または治療的効果を奏するものであってもよいが、これに制限されない。また、本発明のニューロパチーはニューロパチー性の痛みを伴うものであってもよいが、これに制限されない。

本発明の酵素融合タンパク質またはこれを含む薬学的組成物は、末梢感覚神経に対する保護効果を奏し、また、後根神経節（ｄｏｒｓａｌｒｏｏｔｇａｎｇｌｉｏｎ，ＤＲＧ）細胞の空胞化（ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ）を抑制するものであってもよいが、これに制限されない。

後根神経節細胞の構造的及び機能的変形（例えば、空胞化）は、ニューロパチーを誘発することが知られているが、本発明の酵素融合タンパク質は、このような変形を抑制し、神経細胞を保護することにより感覚及び感覚運動性障害を防止し、改善できる効果を奏する。

即ち、本発明の酵素融合タンパク質及びこれを含む組成物は、末梢感覚神経の機能を保護し、ニューロパチーを誘発する細胞の変形を抑制することにより、ファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーに対する予防または治療効果を奏することができる。

本発明において用語「予防」とは、前記酵素融合タンパク質またはこれを含む組成物の投与によりファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーを抑制または遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、前記酵素融合タンパク質またはこれを含む組成物の投与によりファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーの症状が好転したり有益になった全ての行為を意味する。

本発明において用語「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は特にこれに制限されないが、前記組成物が生体内標的に到達できる任意の一般的な経路を通じて投与され、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などになり得る。しかし、経口投与時にペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり胃腸における分解から保護されるように剤形化することが好ましい。具体的には、注射剤の形態で投与されてもよい。また、薬学的組成物は、有効成分が標的細胞に移動できる任意の装置により投与されてもよい。

本発明の組成物の総有効量は、単回投与量（ｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅ）で患者に投与してもよく、複数回投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅ）で長期間投与する分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与してもよい。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含有量を変えてもよい。具体的には、本発明の融合タンパク質の総用量は、１日体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ～５００ｍｇであることが好ましい。しかし、前記融合タンパク質の用量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌、排泄率などの様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるので、これらを考慮すると、当該分野における通常の知識を有する者であれば、前記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定することができるであろう。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を奏するものであれば、その剤形、投与経路及び投与方法が特に限定されるものではない。

本発明の酵素融合タンパク質の実際の投与量は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、及び疾患の重症度などの種々の関連因子とともに、活性成分である治療学的酵素の種類に応じて決定される。本発明の酵素融合タンパク質は血中持続性と生体内活性に非常に優れるため、本発明の酵素融合タンパク質を含む薬学的組成物の投与量、投与回数及び頻度を顕著に減少させることができる。

具体的には、本発明の酵素融合タンパク質は安定性が高く、持続性が増加したものであり、融合タンパク質の形態ではなく酵素に比べて長い時間酵素活性を維持でき、従って、治療のために目標とする標的組織において持続的な露出を通じて優れた薬理効果を奏することができる。

本発明の一実施例でも投与回数を減らしてアルファガラクトシダーゼ遺伝子欠損マウスに酵素融合タンパク質を投与した場合に、融合タンパク質ではなく、酵素と同等であるか、またはさらに優れた治療効果を奏することを確認した。これについて、前記酵素融合タンパク質は、これを必要とする個体に投与される回数が融合タンパク質ではなく酵素に比べて減少したものであってもよいが、これに制限されない。

前記融合タンパク質の形態ではない酵素は、本発明の酵素融合タンパク質とは異なって、キャリア（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域）が結合していない酵素そのものを意味し得、その例としてはＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）（アガルシダーゼベータ）を挙げることができるが、これに制限されない。

具体的には、本発明による酵素融合タンパク質は、患者体重１ｋｇ当たり約０．０００１μｇ～５００ｍｇ、具体的には患者体重１ｋｇ当り、約０．００１ｍｇ～１００ｍｇ、具体的には０．０１ｍｇ～５０ｍｇ、より具体的に０．１ｍｇ～１０ｍｇであり、１週に１回、２週に１回、４週に１回、または１カ月に１回投与されるものであってもよく、投与間隔が増えても体内で酵素融合タンパク質の薬理活性が維持されるため、患者の利便性を高めることができる。

本発明による薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含んでもよい。このような担体は、非自然的に存在するものであってもよい。

本発明において用語「薬学的に許容可能な」とは、治療効果を発揮する程度の十分な量と副作用を起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康状態、性別、薬物に対する感受性、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合、または同時用いられる薬物などの医学分野における公知の要素により当業者が容易に決定することができる。

薬学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素及び香料などを用いることができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤及び安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤及び保存剤などを用いることができる。

本発明の薬学的組成物の剤形は、上述したような薬学的に許容される担体と混合して多様に製造され得る。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ及びウェハなどの形態に製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態に製造することができる。それ以外にも溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル及び徐放型製剤などに剤形化することができる。

一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが用いられる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含んでもよい。

また、前記酵素融合タンパク質は、生理食塩水や有機溶媒のように薬剤に許容される様々な担体（ｃａｒｒｉｅｒ）と混合して用いることができ、安定性や吸収性を向上させるために、グルコース、スクロース、デキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ）、グルタチオンなどの抗酸化剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）、キレート剤、低分子タンパク質、他の安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ）などを薬剤として用いることができる。

これに制限されないが、本発明の前記薬学的組成物は、前記成分（有効成分）を０．０１～９９％重量対体積で含有することができる。

本発明を具現するもう一つの様態は、前記酵素融合タンパク質またはこれを含む組成物を個体に投与する段階を含むファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーの予防または治療方法を提供する。

前記酵素融合タンパク質、組成物、ニューロパチー、予防及び治療については、前述した通りである。

本発明の酵素融合タンパク質は、ファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーを予防または治療できる治療学的酵素を含むため、酵素融合タンパク質、または前記酵素融合タンパク質を含有する薬学的組成物の投与により、ファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーが疑われる個体で予防または治療することができる。

本発明の用語「個体」とはニューロパチーが疑われる個体であり、前記ニューロパチーの疑いのある個体は、当該疾患が発病しているか、または発病し得るヒトを含むラット、家畜などを含むほ乳動物を意味するが、本発明の酵素融合タンパク質あるいはこれを含む前記組成物で治療可能な個体は制限なく含まれる。特に、前記個体はファブリー病が発病しているか、またはファブリー病の発病リスクが高い個体であってもよいが、ファブリー病と関連してニューロパチーが発病しているか、または発病し得る個体であれば、制限なく本発明の範疇に含まれる。

本発明の方法は、酵素融合タンパク質を含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与することを含んでもよい。適した総１日使用量は正しい医学的判断の範囲内で処置医により決定され、１回又は数回に分けて投与できる。しかし、本発明の目的上、特定患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって他の製剤が用いられるかどうかをはじめとする具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と共に用いられたり同時に用いられる薬物をはじめとする多様な因子と医薬分野によく知られている類似因子により異なって適用することが好ましい。

投与経路、投与用量及び用法については、前述した通りである。

一方、これに制限されないが、前記ニューロパチーの予防または治療方法は、一つ以上のニューロパチーに対する治療的活性を有する化合物または物質を投与することをさらに含む併用療法であってもよい。

本発明の用語「併用」は、同時、個別または順次投与を示すことと理解されなければならない。前記投与が順次または個別の場合、２次成分の投与の間隔は、前記併用の有益な効果を失わないようにするものでなければならない。

本発明を具現する他の様態は、前記酵素融合タンパク質、またはこれを含む組成物のファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーの予防または治療用途を提供する。

本発明を具現する他の様態は、前記酵素融合タンパク質、またはこれを含む組成物のファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーに対する予防または治療用薬剤（あるいは薬学的組成物）を製造するための用途を提供する。

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は、専ら本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものではない。

実施例１：アルファガラクトシダーゼＦｃ融合タンパク質（α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ－Ｆｃ）の製作
本発明者らは、逆平行の（ａｎｔｉ－ｐａｒａｌｌｅｌ）二量体の治療学的酵素を含むアルファガラクトシダーゼ－Ｆｃ融合タンパク質（以下、酵素融合タンパク質と混用される）を生産するために、天然型アルファガラクトシダーゼ（ａｌｐｈａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）とリンカー（配列番号１０）、Ｆｃ免疫グロブリン領域（配列番号７）を遺伝子の水準で融合し、発現ベクターに合成した。

構築された酵素融合タンパク質の配列中、Ｆｃ領域で鎖交換とＮ－グリコシル化部位（Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ）を除去するために、部位特異的変異ＰＣＲ技法を用いた。

具体的には、配列番号１、２のプライマーを用いて鎖交換に関与するＦｃ領域（配列番号８）の２番目のアミノ酸であるセリンをプロリンに代替し、配列番号３、４のプライマーを用いてＮ－グリコシル化がなされるＦｃ領域の７１番目のアミノ酸であるアスパラギンをグルタミンで置換した。

合成されたアルファガラクトシダーゼＦｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターであるＸＯＧＣベクターに制限酵素を用いて挿入した。ＢａｍＨＩとＸｈｏＩの制限酵素は、アルファガラクトシダーゼとＦｃ免疫グロブリン領域をいずれも切断しない制限酵素である。前記制限酵素で切断されたアルファガラクトシダーゼ－Ｆｃを同一の制限酵素で切断されたＸＯＧＣベクターに挿入してアルファガラクトシダーゼ－Ｆｃ融合タンパク質を発現するベクターを完成した。アルファガラクトシダーゼは、免疫グロブリンＦｃ領域が二量体を形成する時、逆平行の二量体を形成するようになる。

アルファガラクトシダーゼ－ＦｃのＤＮＡ及びタンパク質配列は、下記表２の通りである。下記表２のタンパク質配列において下線は信号配列を、ボールドはアミノ酸が置換された部分を、そしてイタリック体はリンカーを示す。

前記実施例で製造された酵素融合タンパク質発現ベクターをアルファガラクトシダーゼ－Ｆｃと命名した。

実施例２：アルファガラクトシダーゼＦｃ融合タンパク質（α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ－Ｆｃ）の生体内（ｉｎｖｉｖｏ）ニューロパチーの改善効果
Ｌｙｓｏ－Ｇｂ₃の蓄積により痛み及び温度感覚喪失を含む末梢神経系感覚／感覚運動性障害に対する本発明の酵素融合タンパク質の効果を確認するために、次のように実験した。

アルファガラクトシダーゼ遺伝子欠損マウス（α－ＧａｌＡＫＯ，ＪａｃｋｓｏｎｌａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔｏｃｋＮｏ．００３５３５）でアルファガラクトシダーゼＦｃ融合タンパク質（α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ－Ｆｃ）の投与によるニューロパチー（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）の治療効果を評価するために、マウスを５グループで準備した。最初のグループの野生型マウス（ｗｉｌｄｔｙｐｅ，ｎ＝６）はアルファガラクトシダーゼ－Ｆｃ融合タンパク質の賦形剤を投与し、２番目のグループからはアルファガラクトシダーゼ遺伝子欠損マウス（ｎ＝７）試験群で、グループ－２：アルファガラクトシダーゼ－Ｆｃ融合タンパク質賦形剤の投与、グループ－３：アガルシダーゼベータ１．０ｍｇ／ｋｇ（２週１回、静脈投与）、グループ４：アルファガラクトシダーゼ－Ｆｃ融合タンパク質１．０ｍｇ／ｋｇ（２週１回、皮下投与）、グループ－５：アルファガラクトシダーゼ－Ｆｃ融合タンパク質２．０ｍｇ／ｋｇ（４週１回、皮下投与）がある。

末梢神経系感覚の評価のために、マウスで投与前そして投与後１２週と投与後２０週にそれぞれ熱板テスト（ｈｏｔｐｌａｔｅｔｅｓｔ）を進行し、温度感覚の改善程度を評価した。これら動物は、５５℃の温度に調整された熱板上でガラスシリンダ（ｇｌａｓｓｃｙｌｉｎｄｅｒ）内に位置させてマウスの行動を観察し、後足が熱板から離れるまでの反応時間（潜伏時間）を測定した。

その結果、アルファガラクトシダーゼ遺伝子欠損マウスは野生型マウスに比べ、熱板テストで遥かに高い潜時閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｌａｔｅｎｃｙ）を示した。アルファガラクトシダーゼ－Ｆｃ融合タンパク質の反復投与時に、賦形剤対照群及びアガルシダーゼベータ投与群に比べて低い潜時閾値を示した。特に、アルファガラクトシダーゼ－Ｆｃ融合タンパク質を反復投与したマウスでは、潜時閾値が野生型ラットの水準の統計学的に匹敵する水準に有意に低くなることを確認した（図１）。

また、２０週に腰推（ｌｕｍｂａｒｓｐｉｎｅ）から感覚神経細胞の神経細胞体が位置する後根神経節（ｄｏｒｓａｌｒｏｏｔｇａｎｇｌｉｏｎ，ＤＲＧ）をｔｏｌｕｉｄｉｎｅｂｌｕｅで染色し、組織学的に分析してアルファガラクトシダーゼ－Ｆｃ融合タンパク質のニューロパチーの改善効力を細胞単位で評価した。

両実験の統計処理は、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ）（ ^*～^***ｐ＜０．０５～０．００１）及び独立標本Ｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄＴｔｅｓｔ）（⁺⁺ｐ＜０．０１）を用いて賦形剤群（対照群）及び試験群間の統計的な有意性を比較した。

その結果、細胞水準の組織学的分析では、図１の熱板テストの結果と一致するようにアルファガラクトシダーゼ遺伝子欠損マウスで野生型マウスに比べて卓越した水準で後根神経節で空胞化（ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ）された神経細胞の増加が確認された。このような細胞の病変は、２０週間アルファガラクトシダーゼ－Ｆｃ融合タンパク質を投薬したマウスグループで統計的に有意な水準に抑制されることが確認され、ただし、アガルシダーゼベータ投与群では、賦形剤投薬群に比べて有意な改善効果が奏されなかった（図２）。

このような実験結果は、アルファガラクトシダーゼ－Ｆｃ融合タンパク質がリソソーム内で向上した安定性を有し、これに基づいて末梢感覚神経保護及び神経細胞の変形抑制を通じてニューロパチーでも保護効果または治療的効力を示すことを示唆する。

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims

下記化学式（１）で表される、酵素融合タンパク質を含むファブリー病に起因する又は伴うニューロパチー（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）の予防または治療用薬学的組成物：

ここで、Ｘ及びＸ’はアルファガラクトシダーゼであり；
Ｌ及びＬ’はリンカーで、それぞれ独立に同一または異なる種類のリンカーであり；
Ｆは免疫グロブリンＦｃ領域の一つのポリペプチド鎖であり；
｜は共有結合であり；
：は共有または非共有結合である。
前記酵素は、ＸとＸ’が互いに逆平行（ａｎｔｉ－ｐａｒａｌｌｅｌ）で二量体を形成したものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、非グリコシル化されたものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号１５のアミノ酸配列を有するヒンジ領域を含むものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号８のアミノ酸配列で２番目のアミノ酸がプロリンで置換されたもの；７１番目のアミノ酸がグルタミンで置換されたもの；または２番目のアミノ酸はプロリンで、７１番目のアミノ酸はグルタミンで置換されたものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記リンカーは、１個～１００個のアミノ酸からなることを特徴とするペプチドリンカーである、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記ペプチドリンカーは、［ＧＳ］ｘ、［ＧＧＧＳ］ｘまたは［ＧＧＧＧＳ］ｘのアミノ酸配列からなり、ここで、ｘは自然数１～２０のうちの一つであることを特徴とする、請求項６に記載の薬学的組成物。
前記ペプチドリンカーは、配列番号１１のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
前記ニューロパチーは、多発ニューロパチー、または小径線維ニューロパチーである、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記薬学的組成物は、末梢感覚神経に対する保護効果を奏する、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記薬学的組成物は、後根神経節（ｄｏｒｓａｌｒｏｏｔｇａｎｇｌｉｏｎ，ＤＲＧ）細胞の空胞化（ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ）を抑制するものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記酵素融合タンパク質は、これを必要とする個体に投与される回数が融合タンパク質ではなく酵素に比べて減少したものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記薬学的組成物は、２週に１回または１カ月に１回個体に投与される、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記酵素融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む単量体を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記Ｘ及びＸ’は、それぞれ同一または異なるアミノ酸配列を含む酵素である、請求項１に記載の薬学的組成物。