KR20230143985A - 신규한 구조를 갖는 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이량체의 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역의 융합단백질, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 구조를 갖는 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도 {Therapeutic enzyme fusion protein having a novel structure and use thereof}
본 발명은 이량체의 치료학적 효소를 포함하는 효소 융합단백질, 이의 제조 방법과 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
리소좀은 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 다당류 및 지질과 같은 거대분자를 분해하는 기능을 하는 세포질 소기관이다. 리소좀의 내부는 산성 환경이며 생물학적 거대분자들의 가수분해를 촉진하는 가수분해 효소(hydrolase enzymes)를 함유한다. 리소좀은 또한 세포 내 이입(endocytosis)을 통한 분자의 흡수에 있어서 어떠한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다.
리소좀 축적 질환 (Lysosomal Storage Disorders, LSDs)은 유전적 대사 질환의 일종으로 리소좀의 기능이 상실되어 나타난다. 리소좀 축적 질환은 지질, 단백질, 다당류 등의 물질을 분해하는 효소의 결핍으로 인해 나타나는데, 보통 100,000명중 1명꼴로 나타나며 열성 질환으로 유전된다. 리소좀 축적 질환은 이렇게 분해 작용을 하는 특정 효소가 결핍되었거나 그 양이 매우 적을 때 나타나며, 이렇게 분해 효소가 결핍되었을 때 과량의 물질이 분해되지 않고 축적되어 결국 세포의 기능에도 문제를 일으키게 되는 것이다. 다른 많은 유전 질환들과 마찬가지로 리소좀 축적 질환은 부모로부터 유전된다. 또한 각각의 질환은 각기 다른 효소를 번역하는 서로 다른 유전자의 변이에 의해 발생한다. 이러한 질병의 원인이 되는 효소들은 대개 비슷한 생화학적 특성을 가지며, 모든 리소좀 축적 질환들은 리소좀 내 비정상적인 물질 축적에 의해 발생한다. 현재 알려져 있는 대표적인 리소좀 축적 질환으로는 니만-피크병 (Niemann-Pick disease), 파브리병 (Fabry's disease), 고셰병 (Gaucher disease), 헌터증후군 (Hunter syndrome), 마로토 라미 증후군 (Maroteaux-Lamy syndrome) 등과 같은 약 50여종의 질환이 알려져 있다
리소좀 축적 질환 중 하나로 알려진 파브리병(Fabry's disease)은 리소좀에 존재하는 가수분해 효소인 알파 갈락토시다제 A(alpha-galactosidase A)의 효소 활성 결핍 또는 부족에 의한 결과로 나타나는 당지질(glycosphingolipid)의 선천성 대사이상의 일종이다.
알파 갈락토시다제 A는 Gb3 (globotriaosylceramide)를 락토실세라마이드(lactosylceramide)로 분해하는 효소로서, 상기 효소의 이상에 의해 혈관벽과 신체의 다양한 부위에 Gb3가 비정상적으로 축적됨으로써, 파브리병이 발병되는 것으로 알려져 있다.
리소좀 축적 질환을 치료하기 위한 방법으로 대표적으로는 효소-대체 요법 (ERT: enzyme-replacement therapy)이 있으며 관련된 많은 연구가 진행되고 있다 (Frances M. Platt et al., J Cell Biol. 2012 Nov 26;199(5):723-34). 특히 리소좀 축적 질환은 특정 효소의 유전적 결함으로 인해 생기는 병이므로, 결함이 있는 효소의 보충치료가 필수적이다. 효소 보충 치료는 리소좀 축적 질환에서 표준이 되는 치료로서, 부족한 효소를 보충하는 것을 통해 기존의 증상이 완화되거나 질환의 진행을 늦추는 효과를 볼 수 있다.
그러나, 이러한 치료 효과를 나타내는 단백질은 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고, 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되므로, 혈중 농도 및 활성을 유지하기 위해서는 환자에게 자주 투여해야 한다.
그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 치료학적 효소 류의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 치료학적 효소 류의 지속성 제제는 치료학적 효소 류의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 활성이 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
따라서, 목적하는 질병에 대한 치료 효과를 가지는 치료제로서, 생체 내에서 안정하게 지속성이 증가되면서 융합된 단백질의 활성이 유지되는 치료제의 개발이 필요하다.
본 발명의 하나의 목적은 하기 화학식 1으로 표시되는, 효소 융합단백질을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
여기서, X 및 X'은 치료학적 효소로 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 효소이고,
L 및 L'은 링커로, 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 링커이며;
F는 면역글로불린 Fc 영역이며;
|은 공유 결합이고;
:는 공유 또는 비공유 결합임.
본 발명의 다른 목적은 상기 효소 융합 단백질을 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disorder, LSD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 효소 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 상기 배양물로부터 효소 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 효소 융합단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명을 구현하는 하나의 양태는 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역이 융합된 효소 융합단백질이다.
하나의 구체예에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 효소 융합단백질은 하기 화학식 1으로 표시되는, 효소 융합단백질인 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
여기서, X 및 X'은 치료학적 효소로 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 효소이고,
L 및 L'은 링커로, 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 링커이며;
F는 면역글로불린 Fc 영역이며;
|은 공유 결합이고;
:는 공유 또는 비공유 결합임.
앞선 구체예에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 치료학적 효소는 비공유 결합을 통해 이량체를 형성하는 것인, 효소 융합단백질인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 치료학적 효소는 서로 반평행(anti-parallel)으로 이량체를 형성한 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 효소 융합단백질은 Fc 영역이 융합되지 않은 치료학적 효소에 비해 안정성이 증가되고, 리소좀 수용체에 대한 결합력이 감소된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 효소는 베타글루코시다제 (beta-glucosidase), 알파 갈락토시다제 (alpha-galactosidase), 베타 갈락토시다제 (beta-galactosidase), 이두로니다제 (iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제 (Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제 (acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제 (acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제 (acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제 (galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 (arylsulfatase) A, B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, B, 헤파린-N-설파타제 (heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제 (alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제 (beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 (N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제 (alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제 (butyrylcholinesterase), 키티나제 (Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 리파아제 (lipase), 우리카제 (Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제 (Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제 (neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 효소는 알파 갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 또는 베타 갈락토시다제 (beta-galactosidase)인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 천연형 면역글로불린 Fc 영역에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 Fc 영역의 2번째 아미노산이 프롤린으로 치환되거나; 71번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나; 또는 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 사슬 교환이 일어나지 않는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 (a) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인; (b) CH1 도메인 및 CH2 도메인; (c) CH1 도메인 및 CH3 도메인; (d) CH2 도메인 및 CH3 도메인; 및 (e) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역 또는 힌지 영역의 일부와의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 단량체(monomer) 형태인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 일부 아미노산이 제거되거나, 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가되거나, 보체결합부위가 제거되거나 또는 ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 면역글로불린 Fc 단편인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM으로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 IgG4 Fc 영역의 힌지 영역이 IgG1 힌지 영역으로 치환된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 효소 융합단백질은 서열번호 13로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 효소 융합단백질을 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disorder, LSD) 의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
하나의 구체예에 따른 조성물로서, 상기 리소좀 축적 질환은 뮤코다당체침작증 (mucopolysaccharidosis, MPS), 글리코겐 축적병(Glycogen storage disease), 스핑고지질증 (sphingolipidosis), 니만-피크병 (Niemann-Pick disease), 파브리병 (Fabry's disease), 고셰병 (Gaucher disease), 헌터증후군 (Hunter syndrome), 및 마로토 라미 증후군 (Maroteaux-Lamy syndrome)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 조성물로서, 상기 조성물은 효소의 리소좀 수용체에 대한 결합력을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 효소 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 효소 융합단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
하나의 구체예에 따른 효소 융합단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계, 및 상기 배양물로부터 효소 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이량체의 치료학적 효소를 포함하는 융합단백질에 관한 것으로, 상기 치료학적 효소에 면역글로불린 Fc 영역이 융합되어 치료학적 효소의 안정성이 높아지고, 신장에 의한 효소 제거 메커니즘이 감소된, 효소 융합단백질에 관한 것이다. 본 발명의 효소 융합단백질은 증가된 지속시간에 의해 환자에게 유용하게 이용될 수 있으며, 이량체의 치료학적 효소를 포함함으로써, 제조 단계를 감소시킬 수 있어 생산 비용의 절감을 꾀할 수 있다.
도 1은 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질의 활성을 측정한 도이다.
도 2는 아갈시다제 베타 및 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질의 in vitro 효소 활성을 비교한 도이다.
도 3은 아갈시다제 베타 및 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질의 in vitro 세포내 흡수 활성을 비교한 도이다.
도 4는 아갈시다제 베타 및 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질의 약물 동태를 비교한 도이다.
본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-methylglycine) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.
알라닌 A 아르기닌 R
아스파라긴 N 아스파르트산 D
시스테인 C 글루탐산 E
글루타민 Q 글리신 G
히스티딘 H 이소류신 I
류신 L 리신 K
메티오닌 M 페닐알라닌 F
프롤린 P 세린 S
트레오닌 T 트립토판 W
티로신 Y 발린 V
본 발명을 구현하는 하나의 양태는 하기 화학식 1으로 표시되는, 효소 융합단백질을 제공한다.
[화학식 1]
여기서, X 및 X'은 치료학적 효소로 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 효소이고,
L 및 L'은 링커로, 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 링커이며;
F는 면역글로불린 Fc 영역이며;
|은 공유 결합이고;
:는 공유 또는 비공유 결합임.
본 발명에서 용어, “효소 융합단백질”은 치료학적 효소에 면역글로불린 Fc 영역이 융합된 것으로, 면역글로불린 Fc 영역의 융합으로 인해, 면역글로불린 Fc 영역과 융합되지 않은 치료학적 효소에 비하여, 치료학적 효소의 활성은 유지되면서도 리소좀 수용체에 대한 결합력이 감소되어, 혈중 반감기가 증가되는 것일 수 있다. 본 발명의 효소 융합단백질은 효소 대체 요법 (enzymatic replacement therapy, ERT)의 약물로서 사용될 수 있다. 상기 효소 대체 요법은 질환의 원인이 되는 결핍 또는 부족 효소를 보충함으로써, 저하된 효소 기능의 회복을 통해 질병을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명자들은 치료학적 효소 류의 혈중 반감기를 증가시키기 위해 면역글로불린 Fc 영역과의 융합단백질을 제작하였다. 여기서 Fc 영역은 당화를 억제하기 위해 잠재적인 당화 서열을 치환시키고, 추가적으로 IgG4 Fc의 hinge 서열을 치환시켜 사슬 교환 (chain exchange)이 억제된 IgG4 Fc 유도체를 사용하였다.
또한, 본 발명의 효소 융합단백질을 제조하는 데 있어서, 면역글로불린 Fc 영역과 융합되는 치료학적 효소가 이량체, 특히 반평행(anti-parallel) 형태로 연결된 이량체를 형성할 경우, 효소의 활성을 유지하면서도 체내 지속성이 증가될 뿐만 아니라, 상기 효소 융합단백질의 제조 단계를 줄일 수 있어, 효율적인 생산이 가능한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 효소 융합단백질은 Fc 영역이 융합되지 않은 치료학적 효소에 비해 안정성이 증가되면서도 효소 활성을 유지할 수 있고, 생산 비용이 절감되는 장점을 갖는다.
본 발명의 용어, “치료학적 효소”는, 효소의 부족, 결핍, 기능 이상 등에 의해 발병되는 질병을 치료하기 위한 효소로서, 효소 대체 요법 (enzyme replacement therapy), 투여 등을 통해 상기 질병을 가진 개체를 치료할 수 있는 효소를 의미한다. 구체적으로, 리소좀 효소의 부족 또는 결핍 등으로 인해 발병하는 리소좀 축적 질환의 치료를 위한 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 효소 융합단백질에 포함될 수 있는 치료학적 효소는 특별히 제한되지 않으며, 융합되지 않은 형태의 치료학적 효소보다 생체 내 지속 시간을 늘려 이점을 얻을 수 있는 치료학적 효소이면 본 발명의 효소 융합단백질에 포함될 수 있다. 본 발명의 한 실시 형태에서 상기 효소 융합단백질은 치료학적 효소의 융합단백질이다.
본 발명의 효소 융합 단백질에 포함되는 치료학적 효소는 비공유 결합을 통해 이량체를 형성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 치료학적 효소는 융합단백질이 형질전환체에서 발현되어 면역글로불린 Fc영역이 이량체(dimer)를 형성할 때, 치료학적 효소도 이량체 (dimer)를 형성하는 것일 수 있다.
이러한 치료학적 효소의 이량체는 서로 동일한 2개의 효소가 이량체를 형성한 것일 수도 있고, 또는 서로 상이한 2개의 효소가 이량체를 형성한 것일 수도 있으며, 상기 이량체를 구성하는 효소는 체내에서 목적하는 활성을 갖는 이상, 구체적인 종류에 제한되지 않는다.
한편, 상기 이량체를 구성하는 치료학적 효소는 서로 연결되는 방향에 따라, 평행 이량체 (parallel dimer) 또는 반평행 이량체 (anti-parallel dimer)일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서는, 치료학적 효소인 알파 갈락토시다제가 면역글로불린 Fc 영역과 융합되어 발현된 융합단백질을 제조하였으며, 상기 융합단백질의 면역글로불린 Fc 영역이 이량체(dimer)를 형성하면서 알파 갈락토시다제가 비공유 결합을 통해 반평행 이량체를 형성하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 융합단백질이 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 형태에서도 효소의 활성을 유지하는 것을 확인하였다 (실시예 2).
또 다른 실시예에서는 알파 갈락토시다제가 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 융합 단백질과 Fc 영역이 융합되지 않은 아갈시다제 베타를 비교하여, Fc 영역과의 융합에도 불구하고 in vitro 효소 활성 및 세포내 흡수 활성을 유지하는 것을 확인하였으며(실시예 2 및 3), Fc 영역과의 융합에 의해 약물 동태가 우수한 것을 확인하였다 (실시예 4).
본 발명의 용어, “평행 이량체(parallel dimer)”는 각각의 단량체가 이량체를 형성할 때 각각의 단량체의 아미노산 서열의 N-말단과 C-말단이 같은 방향으로 이량체를 형성하는 것을 의미한다. 이때 이량체의 형성은 비공유결합 또는 공유결합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “반평행 이량체(anti-parallel dimer)”는 각각의 단량체가 이량체를 형성할 때, 각각의 단량체의 아미노산 서열의 N-말단과 C-말단이 서로 다른 방향으로 이량체를 형성하는 것을 의미한다. 이때 이량체의 형성은 비공유결합 또는 공유결합일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
다시 말해, 본 발명의 효소 융합단백질에서, (ⅰ) 하나의 치료학적 효소(X)의 N-말단과 다른 하나의 치료학적 효소(X')의 N-말단이 동일한 방향으로 이량체를 형성하거나, (ⅱ) 하나의 치료학적 효소(X)의 C-말단과 다른 하나의 치료학적 효소(X')의 C-말단이 동일한 방향으로 이량체를 형성하거나, (ⅲ) 하나의 치료학적 효소(X)의 N-말단과 다른 하나의 치료학적 효소(X')의 C-말단이 동일한 방향으로 이량체를 형성하거나, 또는 (ⅳ) 하나의 치료학적 효소(X)의 C-말단과 다른 하나의 치료학적 효소(X')의 N-말단이 동일한 방향으로 이량체를 형성할 수 있다. 상기 (ⅰ) 및 (ⅱ)의 경우를 평행 이량체, 상기 (ⅲ) 및 (ⅳ)의 경우를 반평행 이량체라고 하며, 상기 이량체의 형성은 공유 결합 (covalent bond) 또는 비공유 결합 (non-covalent bond)에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 이량체의 형성에 있어서, 평행 또는 반평행 이량체 형성은 면역글로불린 Fc 영역이 이량체를 형성함에 따라 이에 연결된 단량체의 알파 갈락토시다제 A가 공유 또는 비공유 결합을 통해 이량체를 형성하는 것일 수 있다
본 발명의 반평행 이량체 형태의 치료학적 효소를 포함하는 융합 단백질은 이를 제조하는 과정에 있어서, 제조 단계를 감소시켜 생산비용을 절감시킬 수 있고, 생체내에서 pH 변화에 의한 이량체 형태의 불안정성을 감소시키면서 효소 활성 유지할 수 있는 우수한 장점이 있다.
본 발명의 상기 치료학적 효소는 베타글루코시다제 (beta-glucosidase), 알파 갈락토시다제 (alpha-galactosidase), 베타 갈락토시다제 (beta-galactosidase), 이두로니다제 (iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제 (Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제 (acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제 (acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제 (acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제 (galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 (arylsulfatase) A, B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, B, 헤파린-N-설파타제 (heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제 (alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제 (beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 (N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제 (alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제 (butyrylcholinesterase), 키티나제 (Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 리파아제 (lipase), 우리카제 (Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제 (Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제 (neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료학적 효소일 수 있고, 사람 유래의 효소일 수 있으나, 리소좀 축적 질환에 대한 치료 효과를 가지는 치료학적 효소라면, 효소의 유래나 종류의 제한 없이 본 발명에 포함될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 효소는 알파 갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 또는 베타 갈락토시다제 (beta-galactosidase)일 수 있다.
본 발명의 용어, “알파 갈락토시다제 (alpha galactosidase) A"는 비장, 뇌, 간 등의 리소좀에 존재하는 효소로서, 당지질과 당단백에서 끝 알파 갈락토실 (galactosyl) 모이어티를 가수분해하는 효소로서, 호모다이머릭 (homodimeric) 당단백이다. 구체적으로, 상기 알파 갈락토시다제 A는 세라마이드 trihexoside를 가수분해하고, 갈락토스와 포도당으로 melibiose의 가수분해를 촉매하는 것으로 알려져 있으며, 특히, 리소좀 축적 질환인 파브리병(Fabry's disease)와 연관된 것으로 알려져 있다.
본 발명에서, 상기 알파 갈락토시다제 A는 재조합 형태인 아갈시다제 알파 (agalidase alpha) 또는 아갈시다제 베타 (agalsidae beta)와 혼용되어 사용될 수 있으며, 이와 동등한 활성을 갖고 리소좀 축적 질환에 치료 효과를 나타내는 효소인 한 서열이나 유래, 제법 등에 제한 없이 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 알파 갈락토시다제는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있고, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 치료학적 효소는 천연형 효소일 수 있으며, 상기 천연형 효소의 일부로 구성된 단편, 혹은 일부 아미노산의 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난, 치료학적 효소의 아날로그 (analog) 역시 천연형 치료학적 효소와 동등한 활성을 갖는 한, 본 발명에 제한 없이 포함된다.
또한, 상기 치료학적 효소의 아날로그는 천연형 치료학적 효소의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가된 것을 모두 포함한다.
상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "단편"은 천연형 치료학적 효소 또는 천연형 치료학적 효소의 아날로그의 아미노 말단 혹은 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 제거된 형태를 말한다. 치료학적 효소의 활성을 갖는 한, 단편의 크기나 제거되는 아미노산의 종류에 관계없이 본 발명의 범주에 포함된다.
상기 치료학적 효소 아날로그는 해당 치료학적 효소의 바이오시밀러와 바이오베터 형태를 포함하는데, 바이오시밀러의 예를 들자면 공지 치료학적 효소와 발현 숙주의 차이, 당화의 양상과 정도의 차이, 특정 위치의 잔기가 해당 효소의 기준 서열에 비추어 볼 때 100% 치환이 아닌 경우, 그 치환 정도의 차이도 본 발명의 효소 융합단백질에서 사용할 수 있는 바이오시밀러 효소에 해당한다. 상기 치료학적 효소는 당업계에서 알려진 방법으로 준비 또는 제조할 수 있으며, 구체적으로, 유전자 재조합을 통해 동물세포, 대장균, 효모, 곤충세포, 식물세포, 살아있는 동물 등에서 생산할 수 있으며 생산 방법은 이에 한정되지 않으며, 상업적으로 이용 가능한 치료학적 효소를 구입하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 치료학적 효소 또는 이의 아날로그와 60%, 70%, 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 치료학적 효소는 재조합 기술에 의해 미생물로부터 수득하거나, 상업적으로 이용가능 한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "상동성"이란 야생형(wild type) 아미노산 서열 및 야생형 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행한다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다. 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
상기 치료학적 효소 또는 이의 유도체의 서열 및 이를 코딩하는 염기서열의 정보는 NCBI 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다.
상기 치료학적 효소는 당업계에서 알려진 방법으로 준비 또는 제조할 수 있으며, 구체적으로, 동물세포 발현 벡터를 삽입한 동물세포를 배양하여, 배양물로부터 정제할 수 있고, 또는 상업적으로 이용 가능한 효소를 구입하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 효소 융합단백질은 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역이 펩타이드 링커를 통해 융합된 것일 수 있다. 즉, 상기 화학식 1의 L 또는 L'은 펩타이드 링커일 수 있으나, 면역글로불린 Fc 영역과 치료학적 효소를 융합할 수 있는 한, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 펩타이드 링커는 1개 이상의 아미노산을 포함할 수 있으며, 예컨대 1개부터 1000개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 당업계에 알려진 임의의 펩타이드 링커, 그 예로 [GS]x 링커, [GGGS]x 링커 및 [GGGGS]x 링커 등을 포함하며, 여기서 x는 1 이상의 자연수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 펩타이드 링커는 10 내지 50개, 보다 구체적으로, 20 내지 40개 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 목적상 치료학적 효소의 활성을 유지하면서 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역을 연결할 수 있는 한, 펩타이드 링커가 치료학적 효소 및 면역글로불린 Fc에 융합되는 위치는 제한되지 않는다. 구체적으로, 치료학적 효소 및 면역글로불린 Fc 영역의 양 말단, 보다 구체적으로, 치료학적 효소의 C-말단, 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, “N-말단” 또는 “C-말단”은, 각각 단백질의 아미노 말단 및 카르복실 말단을 의미하는 것으로, 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, N-말단 또는 C-말단의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 N-말단 또는 C-말단 주위의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20 번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 치료학적 효소인 알파 갈락토시다제와 링커-IgG4를 유전자 수준에서 융합되도록 합성하여, 치료학적 효소의 C-말단에 IgG4의 N-말단이 융합된 융합단백질 (서열번호 13)을 제조하고, 상기 융합단백질이 형질도입된 형질전환체에서 발현되는 것을 확인하였다 (실시예 2).
본 발명에서, 상기 펩타이드 링커는 단량체의 면역글로불린 Fc 영역이 형성하는 이량체 면역글로불린 Fc 영역에 각각 연결되는 것일 수 있으며, 각 면역글로불린 Fc 영역에 연결되는 링커는 서로 동일하거나, 다른 종류일 수 있다.
본 발명의 효소 융합단백질의 일 구성 요소(moiety)인 면역글로불린 Fc 영역은 단량체의 면역글로불린 Fc 영역이 이량체를 형성한 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및/또는 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 포함하는 부위를 의미한다. 본 발명의 목적상 이와 같은 Fc 영역은 변이된 힌지영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 천연형 면역글로불린 Fc 영역에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
면역글로불린 Fc 영역은 약물을 제조하는데 있어서 캐리어로 이용되는 물질로, 단백질을 안정화하고 신장에서 제거되는 것을 방지하기 위하여, 최근에는 면역글로불린 Fc 영역을 이용한 융합단백질 연구가 활발히 진행되고 있다. 면역글로불린은 혈액의 주요 구성성분으로 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE와 같이 5가지 종류가 있는데 융합단백질 연구에 자주 사용되는 종류는 IgG로 이는 IgG1~4의 4가지 subtype으로 분류된다. 면역글로불린 Fc 영역을 이용한 융합단백질은 단백질의 크기를 증가시켜 신장에서 제거되는 것을 방지하고, FcRn 수용체와 결합하여 세포 내로 endocytosis 및 recycling을 통해 혈중 반감기를 증가시키는 역할을 하게 된다.
이러한 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 영역을 포함할 수 있으며, 상기 힌지 영역으로 인하여 단량체인 면역글로불린 Fc 영역이 이량체를 형성할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
구체적으로, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 및 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 예로, 상기 힌지 영역은 하기의 아미노산 서열을 갖는 힌지 서열 중 일부가 결실 또는 변이된 것일 수 있다.
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro (서열번호 14)
구체적으로, 상기 힌지 영역의 일부가 결실되어, 하나의 시스테인 (Cys) 잔기만을 포함하도록 변이된 것일 수 있고, 사슬 교환 (chain exchange)에 관여하는 세린 (Ser) 잔기를 프롤린 (Pro) 잔기로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 힌지 서열의 2번째 세린 잔기가 프롤린 잔기로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 힌지 영역 또는 변이된 힌지 영역을 포함함으로써, Fc 영역에서의 사슬 교환 및 단량체 형성이 일어나지 않을 뿐만 아니라, 융합된 치료학적 효소의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 단량체(monomer)의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 화학식 1에서 F인 면역글로불린 Fc 영역은 단량체의 형태로 펩타이드 링커를 통해 단량체의 치료학적 효소와 융합 발현되는 것일 수 있다. 상기 단량체의 면역글로불린 Fc 영역이 이량체를 형성함에 따라 상기 면역글로불린 Fc 영역에 융합된 치료학적 효소 역시 비공유 결합에 의해 이량체를 형성할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
약물의 캐리어로서 이용되는 면역글로불린 Fc 영역은 의도하지 않은 면역반응을 일으킬 수 있는 단점이 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 항체 의존적 세포 독성 (ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 또는 보체-의존적 세포 독성 (CDC, complement-dependent cytotoxicity)과 같은 효력 기능 (effector function)을 갖게 된다. 이러한 기능은 면역글로불린 Fc 영역의 Fc 수용체와의 결합, 보체 결합, 또는 Fc 영역의 당화 (glycosylation)을 통하여 일어나게 된다. 또한, Fc 그 자체의 생체 내 불안정성이 발생하기 쉽다.
본 발명자들은 면역글로불린 Fc 영역 내 힌지 영역의 서열을 치환함으로써, 이러한 문제점을 해결하고자 하였다. 구체적으로, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 당화를 조절하기 위해 잠재적 당화 서열이 치환된 것이거나, 또는, 사슬 교환에 관여하는 서열이 치환된 것일 수 있고, 또는, 두 경우 모두에 해당할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 효소 융합단백질의 면역글로불린 Fc 영역은 사슬 교환이 일어나지 않는 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은, 사슬 교환 및 N-글리코실화를 방지하기 위해, 서열번호 8의 면역글로불린 Fc 영역의 2번째 아미노산 및/또는 71번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 서열번호 8의 면역글로불린 Fc 영역의 1) 2번째 아미노산 (세린)이 프롤린으로 치환되거나, 2) 71번째 아미노산 (아스파라긴)이 글루타민으로 치환되거나, 또는 3) 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환된 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 9의 아미노산 서열로 표현되는 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 언급된 변이 외에도 치료학적 효소의 안정성을 증대키시는, 약물의 캐리어로서 적합한 변이를 함유할 수 있다.
구체적으로, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 면역글로불린 IgG4 Fc의 힌지 영역이 IgG1 힌지 영역으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 면역글로불린 Fc의 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환하여, 사슬 교환 및 N-글리코실화가 감소되도록 하였다 (실시예 1).
본 발명의 용어, “사슬 교환 (chain exchange)”은 IgG4 Fc를 단백질 융합체의 캐리어로 사용시, 생체내에 존재하는 IgG4와 하이브리드를 형성하거나 단량체로 존재하여 원래의 구조를 변경시켜 치료학적으로 낮은 활성을 갖는 구조를 갖게 되는 문제를 의미하는 것으로, 단백질이 융합된 융합단백질인, 단백질 융합체를 치료용 목적으로 사용시 큰 어려움이 있는 것으로 보고되었다 (van der Neut Kolfschoten, et at., Science, 317:1554-1557. 2007).
또한, 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변이가 일어난 것을 의미한다.
예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황산화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
또한, 상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 것일 수 있다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거, 또는 비당쇄화된 된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명의 용어, "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 더 구체적인 실시 형태에서는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 더 구체적인 실시 형태에서는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 보다 더 구체적인 실시 형태에서는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 더욱 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역이며, 더욱 더 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이며, 가장 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9이고, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 7일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
또한, 본 발명의 치료학적 효소 또는 효소 융합단백질은 N-말단 및/또는 C-말단이 변형되지 않은 것일 수 있으나, 생체 내의 단백질 절단 치료학적 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 및/또는 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태 역시 본 발명에 따른 치료학적 효소 또는 효소 융합단백질의 범주에 포함된다. C-말단이 변형되지 않은 경우, 본 발명에 따른 치료학적 효소 또는 효소 융합단백질의 말단은 카르복실기를 가지나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
특히, 화학적으로 합성한 단백질의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화 (acetylation) 및/또는 C-말단을 아미드화 (amidation)할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 따로 가리키는 바가 없으면, 본 발명에 따른 "효소" 또는 “융합단백질”에 대한 명세서 상세한 설명이나 청구 범위의 기술은 해당 효소 또는 융합단백질은 물론이고, 해당 효소 또는 융합단백질의 염(예컨대, 상기 융합단백질의 약학적으로 허용 가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함하는 범주에도 적용된다. 따라서 명세서에 "효소" 또는 "융합단백질" 이라고만 기재되어 있더라도 해당 기재 내용은 그 특정 염, 그 특정 용매화물, 그 특정 염의 특정 용매화물에도 마찬가지로 적용된다. 이러한 염 형태는 예를 들어 약학적으로 허용되는 임의의 염을 사용한 형태일 수 있다. 상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서，과도한 독성，자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.
본 발명의 용어, "약학적으로 허용되는 염" 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산， 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 용어, "용매화물"은 본 발명에 따른 효소, 융합단백질 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.
본 발명의 효소 융합단백질은 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 치료학적 효소인 알파 갈락토시다제 (alpha-galactosidase)를 펩타이드 링커-면역글로불린 Fc와 융합된 형태로 발현하는 재조합 벡터를 제조하여, 이를 CHO 세포주에서 발현시켜 제조하였다 (실시예 1 내지 2).
그러나, 본 발명의 효소 융합단백질은 상기 실시예에서 기술된 방법 외에도, 공지된 다른 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 효소 융합단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 효소 융합단백질은 리소좀 축적 질환에 대한 치료 효과를 나타내는 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역을 융합시켜, 치료학적 효소의 활성을 유지하면서, 체내 안정성을 높임으로써 치료학적 효소의 반감기를 증가시킬 수 있다. 특히, 변이된 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 치료학적 효소는, 사슬 교환 및 당화가 약화되어, Fc 영역과 융합되지 않은 치료학적 효소에 비해 리소좀 수용체에 대한 결합력이 낮아, 높은 지속성을 가질 수 있고, 이는 리소좀 축적 질환의 치료에 있어, 유용한 효과를 나타내는 것이다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 효소 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disorder, LSD) 의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 치료학적 효소의 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물의 효소 융합단백질은 알파 갈락토시다제 A(alpha-galactosidase)와 면역글로불린 Fc 영역이 융합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 융합단백질은 면역글로불린 Fc 영역이 이량체를 형성할 때 융합단백질 내의 치료학적 효소인 알파 갈락토시다제 A 역시 이량체를 형성하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 알파 갈락토시다제 A의 이량체는 상호 비공유 결합에 의한 이량체 형성이며, 특히, 서로 반평행의 방향으로 이량체를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 용어, “리소좀 (lysosome)은 세포질에 존재하는 소기관 중 하나로서, 가수 분해 효소를 많이 포함하고 있어서, 체내에서 거대 분자, 세균 등의 이물질을 분해하여, 상기 분해된 산물이 세포의 다른 부분에서 재활용되도록 돕는 소기관이다. 상기 리소좀의 기능은 다수의 효소에 의해 수행되는데, 변이나 부족 등으로 인하여 특정 효소가 기능을 상실하게 되면, 리소좀의 분해 기능이 상실되는 결과를 낳게 되어, 결국 분해되어야 할 거대 분자 등이 세포 내에 축적되어 세포의 손상 등을 유발하며, 이로 인하여 질병이 발병하게 된다.
본 발명의 용어, “리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD)”은, 상기와 같은 리소좀 기능의 상실로 인한 희귀 유전병을 의미하며, 결함이 있는 효소를 이용한 효소 대체 요법 (enzymatic replacement therapy)가 필수적이다. 상기 리소좀 축적 질환은 뮤코다당체침작증 (mucopolysaccharidosis, MPS), 글리코겐 축적병(Glycogen storage disease), 스핑고지질증 (sphingolipidosis), 니만-피크병 (Niemann-Pick disease), 파브리병 (Fabry's disease), 고셰병 (Gaucher disease), 헌터증후군 (Hunter syndrome), 및 마로토 라미 증후군 (Maroteaux-Lamy syndrome) 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 용어, "파브리병(Fabry's disease)"은 리소좀 축적 질환 중 하나이며, 성염색체 열성으로 유전하며, X염색체가 불활성화되어 발생한다. 리소좀에 존재하는 가수분해 효소인 알파 갈락토시다제 A(alpha-galactosidase A)의 활성이 결핍되거나, 부족하여 나타나는 당지질(glycosphingolipid)의 선천성 대사이상이다. 상기 알파 갈락토시다제 A의 이상에 의해 혈관벽과 신체의 다양한 부위, 예를 들어, 피부, 신장, 심장, 신경계에 Gb3 (globotriaosylceramide)가 비정상적으로 축적되며, 혈류와 영양 공급 감소에 영향을 준다고 알려져 있다. 땀감소증, 선단지각이상증, 심한 통증, 혈관각화종, 각막혼탁, 심장허혈, 심근경색증, 신장이상 등의 증상이 나타나며, 결국 신장이 제 기능을 못하게 되어 사망하기에 이른다.
본 발명에서 용어 "예방"은 상기 효소 융합단백질 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 목적하는 질환, 리소좀 축적 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 효소 융합단백질 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 목적하는 질환, 예컨대 리소좀 축적 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 조성물이 생체 내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있다. 그러나 경구 투여 시 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 융합단백질의 바람직한 전체 용량은 하루에 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 mg 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 결합체의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 조성물의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 효소 융합단백질의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성 성분인 치료학적 효소의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 효소 융합단백질은 혈중 지속성과 생체 내 활성이 매우 우수하므로, 본 발명의 효소 융합단백질을 포함하는 약학적 조성물의 투여 량, 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 담체는 비자연적으로 존재하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 그 외에도 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 효소 융합단백질은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타티온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트제, 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers) 등이 약제로 사용될 수 있다.
이에 제한되지 않으나, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 상기 성분 (유효성분)을 0.01 내지 99% 중량 대 부피로 함유할 수 있다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 본 발명에 따른 효소 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 효소 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이에 제한되는 것은 아니나, 치료학적 효소를 코딩하는 부분과 펩타이드 링커-면역글로불린 Fc 영역을 코딩하는 부분이　연결된 형태의 폴리뉴클레오티드가 될 수 있고, 구체적으로, 치료학적 효소의 C-말단에 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단이 GGGGS 링커를 통해 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.　보다 구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 서열을 포함할 수 있으나, 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역의 융합단백질을 코딩할 수 있는 이상, 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어 "재조합 벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 펩티드, 가령 효소 융합단백질을 발현시킬 수 있도록 목적 펩티드, 가령 효소 융합단백질이 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 제조물을 의미한다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 하여 구축될 수 있다.
상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 재조합 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 재조합 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용하여 제작될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 본 발명의 효소 융합단백질을 생산하기 위해 숙주세포를 형질전환시키는데 사용된다. 또한 본 발명의 일부인, 이러한 형질전환 세포는 본 발명의 핵산 단편 및 벡터의 증식에 사용되거나, 본 발명의 효소 융합단백질의 재조합 생산에 사용된 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다.
본 발명의 용어, "형질전환"은 표적 단백질 (예를 들어, 치료학적 효소, 효소 융합단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명에서 목적하는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 발명에 적합한 숙주는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(Sf9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 본 발명의 목적상, 효소 융합단백질을 발현 및 생산할 수 있는 한, 제한되지 않으나, 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포일 수 있다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 본 발명에 따른 효소 융합단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 제조방법은 (a)형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 배양물로부터 효소 융합단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 형질전환체의 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 숙주세포 배양의 요건을 충족해야 한다. 숙주세포의 생장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다.
사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 사카로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.
마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양 도중에 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예: 공기)를 주입한다.
본 발명에 따른 형질전환체의 배양은 보통 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 또한 배양은 원하는 치료학적 효소 또는 효소 융합단백질의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 지속되는데, 이러한 목적으로 배양은 보통 10 내지 160시간 동안 지속될 수 있다.
전술한 바와 같이 숙주세포에 따라 적절한 배양 조건을 조성해주면 본 발명에 따른 형질전환체는 인슐린 아날로그를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주세포의 특징에 따라 생산된 치료학적 효소 또는 효소 융합단백질은 숙주세포의 세포질 내, 원형질막 공간(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다.
숙주세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예: 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(예: 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 적용할 수 있다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 효소 융합단백질 또는 이를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 효소 융합단백질은 리소좀 축적 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 치료학적 효소를 포함하므로, 이를 포함하는 효소 융합단백질, 또는 상기 효소 융합단백질을 함유하는 약학적 조성물의 투여로, 리소좀 축적 질환이 의심되는 개체에서 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 용어, “개체”는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disorder, LSD)이 의심되는 개체로서, 상기 리소좀 축적 질환 의심 개체는 해당 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나, 본 발명의 효소 융합단백질 또는 이를 포함하는 상기 조성물로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명의 방법은 효소 융합단백질을 포함하는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
한편, 이에 제한되지 않으나, 상기 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 방법은 하나 이상의 리소좀 축적 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 화합물 또는 물질을 투여하는 것을 더 포함하는 병용요법일 수 있다.
본 발명의 용어, "병용"은 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다.
상기 리소좀 축적 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 효소 융합단백질의 투여 용량은 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 μg 내지 500 mg일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하는 또 다른 양태는 상기 효소 융합단백질, 또는 이를 포함하는 조성물을 리소좀 축적 질환에 대한 예방 또는 치료용 약제 (혹은 약학적 조성물)의 제조에 사용하는 용도를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 효소 융합단백질의 제작
본 발명자들은 반평행(anti-parallel) 이량체의 치료학적 효소를 포함하는 효소 융합단백질을 생산하기 위해, 천연형 알파-갈락토시다제 (alpha-galactosidase) 와 링커 (서열번호 10), Fc 면역글로불린 영역(서열번호 7)을 유전자 수준에서 융합하고 발현 벡터에 합성하였다.
구축된 융합단백질의 서열 중 Fc 영역에서 사슬 교환 (chain exchange)과 N-글리코실화 부위 (N-glycosylation site)를 제거하기 위하여 부위 특이적 변이 (site-directed mutagenesis) PCR기법을 이용하였다.
구체적으로, 서열번호 1,2 의 프라이머를 이용하여 사슬 교환에 관여하는 Fc 영역 (서열번호 8)의 2번째 아미노산인 세린 (Serine)을 프롤린 (Proline)으로 대체하였고, 서열번호 3, 4의 프라이머를 이용하여 N-글리코실화가 이 이루어지는 Fc 영역의 71번째 아미노산인 아스파라긴 (Asparagine)을 글루타민 (Glutamine)으로 치환하였다.
합성된 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현벡터인 XOGC벡터에 제한효소를 이용하여 삽입하였다. BamHI과 XhoI의 제한효소는 알파 갈락토시다제와 Fc 면역글로불린 영역을 모두 자르지 않는 제한효소이다. 상기 제한효소로 잘려진 알파 갈락토시다제-Fc를 동일한 제한효소로 잘려진 X0GC벡터에 삽입하여 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질을 발현하는 벡터를 완성하였다. 알파 갈락토시다제는 면역글로불린 Fc영역이 이량체를 형성할 때 반평행 이량체를 형성하게 된다.
알파 갈락토시다제-Fc의 DNA 및 단백질 서열은 하기 표 2와 같다. 하기 표 2의 단백질 서열에서 밑줄은 신호서열을, 볼드는 아미노산이 치환된 부분을, 그리고 이탤릭체는 링커를 나타낸다.
상기 실시예에서 제조된 효소 융합단백질 발현 벡터를 알파 갈락토시다제 -Fc로 명명하였다.
실시예 2: 효소 융합단백질의 in vitro 효소 활성 확인
실시예 2-1: 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질의 제조
상기 실시예에서 제조한 알파 갈락토시다제 -Fc 발현 벡터(pX0GC-alpha galactosidase-Fc)를 CHO-S 세포주에 형질도입하여 알파 갈락토시다제 -Fc 융합 단백질을 대량 생산할 수 있는 세포주를 제조하였다.
구체적으로, 무혈청 배지(FreeStyle CHO Expression Medium, Thermo Fisher사, cat. No. 12651014)를 이용하여 CHO-S 세포를 1L 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask; Corning사, cat. No. 431147)에서 부유배양하며, 배양 용기 내의 세포가 5 ⅹ 108 개까지 증식하였을 때, 프리스타일 맥스 (Thermo Fisher사, cat. No. 16447-100)를 이용하여 형질전환시켰다. 즉, 두 개의 튜브에 각각 10mL의 OptiPro SFM(Thermo Fisher사, cat. No. 12309-019)을 넣고, 하나의 튜브에는 500 νg의 DNA를 넣고, 또 하나의 튜브에는 500 νL의 프리스타일 맥스를 넣고 두 용액을 섞어 상온에서 10분간 정치한 후, 미리 새로운 프리스타일 CHO 발현 배지(Thermo Fisher사, cat. No. 12651014)로 교체하여준 세포에 넣어주었다. 상기 세포를 37, 5% CO2, 125 rpm 조건으로 배양기에서 약 96시간 동안 배양하였다.
이 후, 배양 4일 째에 원심분리를 통해 배양 상등액을 회수 한 후, 알파 갈락토시다제-Fc 생산에 따른 효소 활성 변화를 측정하고자, 상기 상등액에서 in vitro 시험관 효소 활성 측정을 진행하였다.
실시예 2-2: 알파 갈락토시다제-Fc의 in vitro 효소 활성 확인
알파 갈락토시다제-Fc의 in vitro 효소 활성을 확인하고자, 상기 생산된 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질을 효소 기질로 알려진 pNP-Gal(p-nitrophenyl-a-D-galactopyranoside)과 37℃에서 30분간 온도 평형을 이루도록 하였다. 이 후 기질 용액과 알파 갈락토시다제-Fc를 37℃에서 30분 동안 반응시키고, 이의 흡광도를 측정함으로써 알파 갈락토시다제-Fc의 in vitro 효소 활성을 측정하였다.
그 결과, in vitro 효소 활성 측정으로부터, 알파 갈락토시다제-Fc의 발현량이 1,649 ng/mL임을 확인하였다(도 1). 이와 같은 결과는 본 발명의 효소 융합단백질의 알파 갈락토시다제가 반평행 이량체를 형성하며, 상기 반평행 이량체의 알파 갈락토시다제가 이의 효소 활성을 유의미한 수준으로 유지함을 시사하는 것이다.
실시예 2-3: 알파 갈락토시다제 및 알파 갈락토시다제-Fc의 in vitro 효소 활성 비교
한편, 상기 실시예에서 제조된 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질을 Fc 영역이 결합하지 않은 아갈시다제 베타(Agalsidase beta)와 in vitro 효소 활성을 비교하고자 하였다.
구체적으로, 알파 갈락토시다제-Fc 및 아갈시다제 베타를 효소 기질인 pNP-Gal(p-nitrophenyl-a-D-galactopyranoside)과 37℃에서 30분간 온도 평형을 이루도록 한 후, 기질 용액과 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질을 37℃에서 20분 동안 반응시켰다. 이 후 최종적으로 생성되는 4-Nitrophenol에 대한 흡광도를 측정함으로써 알파 갈락토시다제-Fc 및 아갈시다제 베타의 효소활성을 측정 비교 하였다.
그 결과, 알파 갈락토시다제-Fc 및 아갈시다제 베타의 효소 활성 (specific activity)이 각각 70.9, 67.6 μmol/min/mg 임을 확인하였다(도 2). 이와 같은 결과로부터 알파 갈락토시다제-Fc 융합 단백질이 Fc 영역이 결합하지 않은 효소와 비교하여 95.4 %로 유사한 활성을 갖는 것을 확인하였다. 이는 Fc 영역의 결합에도 본 발명의 알파 갈락토시다제-Fc 융합 단백질은 효소 활성을 상실하지 않는 것을 의미한다.
실시예 3: 알파 갈락토시다제-Fc의 in vitro 세포내 흡수 활성 확인
알파 갈락토시다제는 만노스-6-인산 수용체 (M6PR, mannose-6-phosphate receptor)를 통해 세포에 흡수된 후 작용하는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명자들은 알파 갈락토시다제-Fc의 융합 단백질이 나타내는 세포 흡수 활성을 다음과 같이 확인하였다.
구체적으로, M6PR를 발현하는 것으로 알려진 CCD986SK 세포 (인간 피부 섬유아세포)에 아갈시다제 베타 및 알파 갈락토시다제-Fc 융합 단백질을 각각 처리한 후, 37 ℃에서 세포 내 흡수를 유도하였다. 24시간 후, 세포 내 존재하는 아갈시다제 베타 및 알파갈락토시다제-Fc 융합 단백질을 효소 활성 측정법을 통해 확인하였다.
알파 갈락토시다제-Fc 융합 단백질의 농도와 세포 내 흡수 양간의 관계를 분석한 결과, 최고의 흡수 속도 절반을 나타내는 미하엘리스-멘텐 (Michaelis-Menten) 상수인 Km값은 11.55 nM로 아갈시다제 베타와 (Km =10.92 nM) 유사한 세포 내 흡수활성을 보였다(도 3). 이로부터, Fc 영역의 결합에도 본 발명의 알파 갈락토시다제-Fc 융합 단백질은 세포내 흡수 활성을 상실하지 않는 것을 확인하였다.
실시예 5: 알파갈락토시다제-Fc 융합단백질의 ICR 마우스에서 약물동태 확인
각 군 별 채혈시점당 3 마리의 ICR 마우스 (mouse)에 아갈시다제 베타 (대조군)와 상기 실시예에서 제조한 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질(시험군)의 혈액 내 안정성 및 약물 동력학 계수를 비교하였다.
구체적으로, 대조군과 시험군을 아갈시다제 기준으로 각 1.0 mg/kg씩 정맥 내 및 피하 주사하였다. 대조군 정맥 내 주사 투여군은 주사 후 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2 및 4 시간 후에 채혈하였다. 시험군 정맥 내 주사 군은 주사 후 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216 시간 후에 채혈 하였고, 피하 주사 투여군은 주사 후 0, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192 및 216시간 후에 채혈하였다. 혈청 내 단백질 양은 in vitro 시험관 효소 활성 측정을 통해 정량화하였다.
그 결과, 알파 갈락토시다제-Fc 융합 단백질의 경우 Fc 영역이 결합하지 않은 대조군에 대비하여 혈중 반감기(T1/2), 혈중 최고 약물 농도 (Cmax), AUC(area under curve) 모두 증가하였다. 상기 AUC는 약물 분자에 대한 체내 노출 정도를 나타낸다. (도 4, 표 3). 이로부터, Fc 영역의 결합에 의해 본 발명의 알파 갈락토시다제-Fc 융합 단백질이 투여 경로와 무관하게 높은 혈중 반감기, 혈중 최고 약물 농도 (Cmax), 생체 내 이용률 (AUC)을 나타내는 것을 확인하였다.
이와 같은 결과들은 리소좀 축적 질환에 치료 효과를 갖는 것으로 알려져 있는 치료학적 효소의 한 예인 알파 갈락토시다제의 반감기 증가 및 생체 내 이용률을 증가시킨 본 발명의 새로운 형태의 융합 단백질이 효소 활성을 유지하면서 리소좀 축적 질환의 치료제로서 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> Therapeutic enzyme fusion protein having a novel structure and use thereof <130> KPA171393-KR-P1D1 <150> KR 10-2017-0178378 <151> 2017-12-22 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc(S2P)_F <400> 1 ctggcggtgg cggatcgcca ccatgcccag cacctgagtt cct 43 <210> 2 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc(S2P)_R <400> 2 aggaactcag gtgctgggca tggtggcgat ccgccaccgc cag 43 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc(N71Q)_F <400> 3 agccgcggga ggagcagttc caaagcacgt accgtgtggt cag 43 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc(N71Q)_R <400> 4 ctgaccacac ggtacgtgct ttggaactgc tcctcccgcg gct 43 <210> 5 <211> 1287 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgcagctga ggaacccaga actacatctg ggctgcgcgc ttgcgcttcg cttcctggcc 60 ctcgtttcct gggacatccc tggggctaga gcactggaca atggattggc aaggacgcct 120 accatgggct ggctgcactg ggagcgcttc atgtgcaacc ttgactgcca ggaagagcca 180 gattcctgca tcagtgagaa gctcttcatg gagatggcag agctcatggt ctcagaaggc 240 tggaaggatg caggttatga gtacctctgc attgatgact gttggatggc tccccaaaga 300 gattcagaag gcagacttca ggcagaccct cagcgctttc ctcatgggat tcgccagcta 360 gctaattatg ttcacagcaa aggactgaag ctagggattt atgcagatgt tggaaataaa 420 acctgcgcag gcttccctgg gagttttgga tactacgaca ttgatgccca gacctttgct 480 gactggggag tagatctgct aaaatttgat ggttgttact gtgacagttt ggaaaatttg 540 gcagatggtt ataagcacat gtccttggcc ctgaatagga ctggcagaag cattgtgtac 600 tcctgtgagt ggcctcttta tatgtggccc tttcaaaagc ccaattatac agaaatccga 660 cagtactgca atcactggcg aaattttgct gacattgatg attcctggaa aagtataaag 720 agtatcttgg actggacatc ttttaaccag gagagaattg ttgatgttgc tggaccaggg 780 ggttggaatg acccagatat gttagtgatt ggcaactttg gcctcagctg gaatcagcaa 840 gtaactcaga tggccctctg ggctatcatg gctgctcctt tattcatgtc taatgacctc 900 cgacacatca gccctcaagc caaagctctc cttcaggata aggacgtaat tgccatcaat 960 caggacccct tgggcaagca agggtaccag cttagacagg gagacaactt tgaagtgtgg 1020 gaacgacctc tctcaggctt agcctgggct gtagctatga taaaccggca ggagattggt 1080 ggacctcgct cttataccat cgcagttgct tccctgggta aaggagtggc ctgtaatcct 1140 gcctgcttca tcacacagct cctccctgtg aaaaggaagc tagggttcta tgaatggact 1200 tcaaggttaa gaagtcacat aaatcccaca ggcactgttt tgcttcagct agaaaataca 1260 atgcagatgt cattaaaaga cttactt 1287 <210> 6 <211> 429 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu 20 25 30 Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu 35 40 45 Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile 50 55 60 Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly 65 70 75 80 Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met 85 90 95 Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg 100 105 110 Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly 115 120 125 Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly 130 135 140 Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala 145 150 155 160 Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser 165 170 175 Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn 180 185 190 Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met 195 200 205 Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn 210 215 220 His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys 225 230 235 240 Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val 245 250 255 Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn 260 265 270 Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala 275 280 285 Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser 290 295 300 Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn 305 310 315 320 Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn 325 330 335 Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala 340 345 350 Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala 355 360 365 Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile 370 375 380 Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr 385 390 395 400 Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln 405 410 415 Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 420 425 <210> 7 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc varinat <400> 7 ccaccatgcc cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 60 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 120 agccaggaag accctgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 180 gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc caaagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 240 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 300 ggcctcccat cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 360 caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 420 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 480 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 540 tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaacgtctt ctcatgctcc 600 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctctgggt 660 aaatga 666 <210> 8 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc variant <400> 8 Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220 <210> 9 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc varinat <400> 9 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220 <210> 10 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 10 ggcggcggag gttcaggtgg tggtggctct ggcggtggag ggtcgggggg aggcggctct 60 ggaggagggg gctccggtgg gggaggtagc 90 <210> 11 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 12 <211> 2043 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha galactosidase-Fc fusion protein <400> 12 atgcagctga ggaacccaga actacatctg ggctgcgcgc ttgcgcttcg cttcctggcc 60 ctcgtttcct gggacatccc tggggctaga gcactggaca atggattggc aaggacgcct 120 accatgggct ggctgcactg ggagcgcttc atgtgcaacc ttgactgcca ggaagagcca 180 gattcctgca tcagtgagaa gctcttcatg gagatggcag agctcatggt ctcagaaggc 240 tggaaggatg caggttatga gtacctctgc attgatgact gttggatggc tccccaaaga 300 gattcagaag gcagacttca ggcagaccct cagcgctttc ctcatgggat tcgccagcta 360 gctaattatg ttcacagcaa aggactgaag ctagggattt atgcagatgt tggaaataaa 420 acctgcgcag gcttccctgg gagttttgga tactacgaca ttgatgccca gacctttgct 480 gactggggag tagatctgct aaaatttgat ggttgttact gtgacagttt ggaaaatttg 540 gcagatggtt ataagcacat gtccttggcc ctgaatagga ctggcagaag cattgtgtac 600 tcctgtgagt ggcctcttta tatgtggccc tttcaaaagc ccaattatac agaaatccga 660 cagtactgca atcactggcg aaattttgct gacattgatg attcctggaa aagtataaag 720 agtatcttgg actggacatc ttttaaccag gagagaattg ttgatgttgc tggaccaggg 780 ggttggaatg acccagatat gttagtgatt ggcaactttg gcctcagctg gaatcagcaa 840 gtaactcaga tggccctctg ggctatcatg gctgctcctt tattcatgtc taatgacctc 900 cgacacatca gccctcaagc caaagctctc cttcaggata aggacgtaat tgccatcaat 960 caggacccct tgggcaagca agggtaccag cttagacagg gagacaactt tgaagtgtgg 1020 gaacgacctc tctcaggctt agcctgggct gtagctatga taaaccggca ggagattggt 1080 ggacctcgct cttataccat cgcagttgct tccctgggta aaggagtggc ctgtaatcct 1140 gcctgcttca tcacacagct cctccctgtg aaaaggaagc tagggttcta tgaatggact 1200 tcaaggttaa gaagtcacat aaatcccaca ggcactgttt tgcttcagct agaaaataca 1260 atgcagatgt cattaaaaga cttacttggc ggcggaggtt caggtggtgg tggctctggc 1320 ggtggagggt cggggggagg cggctctgga ggagggggct ccggtggggg aggtagccca 1380 ccatgcccag cacctgagtt cctgggggga ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc 1440 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 1500 caggaagacc ctgaggtcca gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1560 aagacaaagc cgcgggagga gcagttccaa agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1620 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc 1680 ctcccatcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1740 gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1800 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1860 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1920 agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga acgtcttctc atgctccgtg 1980 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 2040 tga 2043 <210> 13 <211> 680 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha galactosidase-Fc fusion protein <400> 13 Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu 20 25 30 Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu 35 40 45 Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile 50 55 60 Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly 65 70 75 80 Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met 85 90 95 Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg 100 105 110 Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly 115 120 125 Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly 130 135 140 Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala 145 150 155 160 Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser 165 170 175 Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn 180 185 190 Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met 195 200 205 Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn 210 215 220 His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys 225 230 235 240 Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val 245 250 255 Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn 260 265 270 Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala 275 280 285 Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser 290 295 300 Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn 305 310 315 320 Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn 325 330 335 Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala 340 345 350 Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala 355 360 365 Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile 370 375 380 Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr 385 390 395 400 Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln 405 410 415 Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu Gly Gly Gly 420 425 430 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 435 440 445 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro Cys Pro Ala 450 455 460 Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 465 470 475 480 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 485 490 495 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 500 505 510 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 515 520 525 Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 530 535 540 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 545 550 555 560 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 565 570 575 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 580 585 590 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 595 600 605 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 610 615 620 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 625 630 635 640 Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe 645 650 655 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 660 665 670 Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 675 680 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10

Claims (28)

  1. 하기 화학식 1으로 표시되는, 효소 융합단백질:
    [화학식 1]

    여기서, X 및 X'은 치료학적 효소로 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 효소로서,
    상기 효소는 베타글루코시다제 (beta-glucosidase), 알파 갈락토시다제 (alpha-galactosidase), 베타 갈락토시다제 (beta-galactosidase), 이두로니다제 (iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제 (Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제 (acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제 (acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제 (acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제 (galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 (arylsulfatase) A, B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, B, 헤파린-N-설파타제 (heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제 (alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제 (beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 (N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제 (alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제 (butyrylcholinesterase), 키티나제 (Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 리파아제 (lipase), 우리카제 (Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제 (Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제 (neutral endopeptidase), 및 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase) 로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    L 및 L'은 펩타이드 링커로, 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 링커이며;
    F는 면역글로불린 Fc 영역이며;
    |은 공유 결합이고;
    :는 공유 또는 비공유 결합임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 링커는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 효소 융합단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 치료학적 효소는 비공유 결합을 통해 이량체를 형성하는 것인, 효소 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 치료학적 효소는 서로 반평행(anti-parallel)으로 이량체를 형성한 것인, 효소 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 효소 융합단백질은 Fc 영역이 융합되지 않은 치료학적 효소에 비해 안정성이 증가되고, 리소좀 수용체에 대한 결합력이 감소된 것인, 효소 융합단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 효소는 알파 갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 또는 베타 갈락토시다제 (beta-galactosidase)인 것인, 효소 융합단백질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 천연형 면역글로불린 Fc 영역에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 것인, 효소 융합단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 Fc 영역의 2번째 아미노산이 프롤린으로 치환되거나; 71번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나; 또는 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환된 것인, 효소 융합단백질.
  9. 제7항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 효소 융합단백질.
  10. 제8항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 사슬 교환이 일어나지 않는 것인, 효소 융합단백질.
  11. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 (a) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인; (b) CH1 도메인 및 CH2 도메인; (c) CH1 도메인 및 CH3 도메인; (d) CH2 도메인 및 CH3 도메인; 및 (e) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역 또는 힌지 영역의 일부와의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 효소 융합단백질.
  12. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 단량체(monomer) 형태인 것인, 효소 융합 단백질.
  13. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 이루어진 것인, 효소 융합 단백질.
  14. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 일부 아미노산이 제거되거나, 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가되거나, 보체결합부위가 제거되거나 또는 ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거된 것인, 효소 융합단백질.
  15. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것인, 효소 융합단백질.
  16. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 면역글로불린 Fc 단편인 것인, 효소 융합단백질.
  17. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM으로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 것인, 효소 융합단백질.
  18. 제17항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인 것인, 효소 융합단백질.
  19. 제18항에 있어서, 상기 면역글로불린 IgG4 Fc 영역의 힌지 영역이 IgG1 힌지 영역으로 치환된 효소 융합단백질.
  20. 제1항에 있어서, 상기 효소 융합단백질은 서열번호 6으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 것인, 효소 융합단백질.
  21. 제1항에 있어서, 상기 효소 융합단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 효소 융합단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 효소 융합단백질을 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disorder, LSD) 의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 리소좀 축적 질환은 뮤코다당체침작증 (mucopolysaccharidosis, MPS), 글리코겐 축적병(Glycogen storage disease), 스핑고지질증 (sphingolipidosis), 니만-피크병 (Niemann-Pick disease), 파브리병 (Fabry's disease), 고셰병 (Gaucher disease), 헌터증후군 (Hunter syndrome), 및 마로토 라미 증후군 (Maroteaux-Lamy syndrome)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 조성물은 효소의 리소좀 수용체에 대한 결합력을 감소시키는 것인, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 효소 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  26. 제25항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  27. 제26항의 발현 벡터가 도입된 형질전환체.
  28. (a) 제27항의 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 배양물로부터 효소 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 효소 융합단백질을 제조하는 방법.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2020327019A1 (en) * 2019-08-07 2022-03-03 Amicus Therapeutics, Inc. Methods of treating Fabry disease in patients having a mutation in the GLA gene
MX2023004335A (es) 2020-10-14 2023-05-04 Denali Therapeutics Inc Proteinas de fusion que comprenden enzimas sulfoglucosamina sulfohidrolasa y metodos de estas.
AU2021378707A1 (en) * 2020-11-13 2023-06-01 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Use of therapeutic enzyme fusion protein in prevention and treatment of renal diseases caused by or accompanied by Fabry disease
JP2023549322A (ja) * 2020-11-13 2023-11-24 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 治療学的酵素融合タンパク質のファブリー病に起因する又は伴うニューロパチーの予防及び治療用途
KR20230134822A (ko) * 2022-03-15 2023-09-22 주식회사 녹십자 α-갈락토시다제 A의 융합단백질을 포함하는 액상 제제
KR20230134823A (ko) * 2022-03-15 2023-09-22 주식회사 녹십자 α-갈락토시다제 A의 융합단백질을 포함하는 동결 건조 제제

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0654085T3 (da) 1992-01-23 1997-09-22 Merck Patent Gmbh Monomere og dimere antistof-fragment-fusionsproteiner
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
KR20020073127A (ko) * 1999-09-17 2002-09-19 겐자임 트랜스제닉스 코포레이션 형질전환에 의하여 생성된 융합 단백질
US7629309B2 (en) * 2002-05-29 2009-12-08 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
EP1871787A2 (en) * 2005-04-11 2008-01-02 Sanofi Pasteur Polymyxin b analogs for lps detoxification
CA2635623C (en) * 2005-12-30 2015-02-17 Michael Super Anti-cd19 antibodies with reduced immunogenicity
EP2162472B1 (en) * 2007-05-30 2013-02-27 Postech Academy-Industry- Foundation Immunoglobulin fusion proteins
WO2015009052A1 (ko) * 2013-07-16 2015-01-22 일동제약 주식회사 하이브리드 면역글로불린 fc와 효소의 융합단백질
SG11201600734YA (en) * 2013-07-31 2016-02-26 Amgen Inc Stabilization of fc-containing polypeptides
SG11201705376SA (en) 2014-12-30 2017-08-30 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Glucagon derivative having improved stability
CN108136010A (zh) * 2015-10-08 2018-06-08 宏观基因有限公司 用于治疗癌症的联合疗法
JP7065770B2 (ja) * 2015-12-08 2022-05-12 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 酵素の内部移行のための組成物および方法
AR107483A1 (es) * 2016-01-29 2018-05-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de enzimas terapéuticas
TWI832818B (zh) * 2017-07-07 2024-02-21 南韓商韓美藥品股份有限公司 新穎的治療性酵素融合蛋白及其用途

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