WO2019125059A1 - 신규한 구조를 갖는 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 구조를 갖는 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2019125059A1
WO2019125059A1 PCT/KR2018/016487 KR2018016487W WO2019125059A1 WO 2019125059 A1 WO2019125059 A1 WO 2019125059A1 KR 2018016487 W KR2018016487 W KR 2018016487W WO 2019125059 A1 WO2019125059 A1 WO 2019125059A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
region
enzyme
fusion protein
immunoglobulin
domain
Prior art date
Application number
PCT/KR2018/016487
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
정의준
김진영
최인영
정성엽
Original Assignee
한미약품 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to JP2020534256A priority Critical patent/JP7403455B2/ja
Priority to EA202091239A priority patent/EA202091239A1/ru
Priority to EP18891205.9A priority patent/EP3708661A4/en
Priority to CN201880083193.8A priority patent/CN111511910A/zh
Priority to BR112020012346-3A priority patent/BR112020012346A2/pt
Priority to CA3086474A priority patent/CA3086474A1/en
Priority to AU2018388331A priority patent/AU2018388331A1/en
Priority to NZ765453A priority patent/NZ765453B2/en
Application filed by 한미약품 주식회사 filed Critical 한미약품 주식회사
Priority to SG11202005510SA priority patent/SG11202005510SA/en
Priority to US16/955,525 priority patent/US20210009984A1/en
Priority to MX2020006635A priority patent/MX2020006635A/es
Publication of WO2019125059A1 publication Critical patent/WO2019125059A1/ko
Priority to IL275248A priority patent/IL275248A/en
Priority to PH12020550927A priority patent/PH12020550927A1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme fusion protein comprising a dimeric therapeutic enzyme, a method for producing the same, and a composition comprising the enzyme fusion protein.
  • Lysosomes are cytoplasmatic organelles that function to degrade macromolecules such as proteins, polynucleotides, polysaccharides and lipids.
  • the interior of lysosomes is an acidic environment and contains hydrolase enzymes that promote the hydrolysis of biological macromolecules. Lysosomes have also been found to play a role in the absorption of molecules through endocytosis.
  • Lysosomal Storage Disorders are a type of genetic metabolic disease characterized by loss of function of lysosomes. Lysosomal accumulation diseases are caused by deficiency of enzymes that degrade substances such as lipids, proteins and polysaccharides, usually 1 in 100,000, and they are inherited as febrile diseases. Lysosomal accumulation occurs when the enzyme is deficient or the quantity is very small. When the enzyme is deficient, the excessive amount of the substance is not decomposed and accumulates, resulting in a problem in the function of the cell. Like many other genetic diseases, lysosomal storage diseases are inherited from parents. In addition, each disease is caused by mutation of different genes that translate different enzymes.
  • Enzymes responsible for these diseases usually have similar biochemical properties, and all lysosomal disorders are caused by abnormal accumulation of substances in the lysosome.
  • lysosomal accumulation diseases include Niemann-Pick disease, Fabry's disease, Gaucher disease, Hunter syndrome, Maroteaux-Lamy syndrome ) are known to be present in about 50 kinds of diseases
  • Fabry's disease which is known to be one of the lysosomal accumulation diseases, is caused by a deficiency or lack of enzymatic activity of alpha-galactosidase A, a hydrolytic enzyme present in lysosomes, and congenital glycosphingolipid It is a kind of metabolism.
  • Alpha galactosidase A is an enzyme that breaks down Gb3 (globotriaosylceramide) into lactosylceramide. Abnormal accumulation of Gb3 in the blood vessel wall and various parts of the body due to the abnormality of the enzyme causes Fabry disease It is known.
  • ERT enzyme-replacement therapy
  • proteins showing such therapeutic effects are generally poor in stability and are easily denatured and degraded by protein hydrolytic enzymes in the blood, they are frequently administered to patients in order to maintain their blood concentration and activity.
  • One object of the present invention is to provide an enzyme fusion protein represented by the following formula (1).
  • X and X ' are therapeutic enzymes each independently of the same or different type of enzyme
  • L and L 'are linkers each independently of the same or different kind of linker
  • F is an immunoglobulin Fc region
  • LSD lysosomal storage disorder
  • the present invention also provides a method for producing the enzyme fusion protein.
  • the present invention relates to a fusion protein comprising a therapeutic enzyme of a dimer, wherein an immunoglobulin Fc region is fused to the therapeutic enzyme to increase the stability of the therapeutic enzyme, and an enzyme fusion mechanism Lt; / RTI > protein.
  • the enzyme fusion protein of the present invention can be usefully used in patients by an increased duration, and by including a therapeutic enzyme of a dimer, it is possible to reduce the production steps, thereby reducing the production cost.
  • Fig. 1 is a graph showing the activity of alpha-galactosidase-Fc fusion protein.
  • Figure 2 compares in vitro enzymatic activity of agarcidase beta and alpha-galactosidase-Fc fusion protein.
  • FIG. 3 is a graph comparing in vitro intracellular absorption activities of agalcidase beta and alpha-galactosidase-Fc fusion protein.
  • Figure 4 compares pharmacokinetics of agalcidase beta and alpha-galactosidase-Fc fusion protein.
  • One embodiment of the present invention is an enzyme fusion protein in which a therapeutic enzyme and an immunoglobulin Fc region are fused.
  • An enzyme fusion protein according to one embodiment is characterized in that the enzyme fusion protein is an enzyme fusion protein represented by the following formula (1).
  • X and X ' are therapeutic enzymes each independently of the same or different type of enzyme
  • L and L 'are linkers each independently of the same or different kind of linker
  • F is an immunoglobulin Fc region
  • the enzyme fusion protein according to the preceding embodiment is characterized in that the therapeutic enzyme forms a dimer through non-covalent binding.
  • the enzyme fusion protein according to any one of the preceding embodiments, wherein the enzyme fusion protein is characterized in that the stability is increased and the binding ability to the lysosome receptor is reduced as compared to the therapeutic enzyme in which the Fc region is not fused.
  • an enzyme fusion protein according to any one of the preceding embodiments, wherein the enzyme is selected from the group consisting of beta-glucosidase, alpha-galactosidase, beta-galactosidase, Iduronidase, iduronate-2-sulfatase, galactose-6-sulfatase, acid alpha-glucosidase, acidic sera Acid ceramidase, acid sphingomyelinsase, galactocerebrosidsase, arylsulfatase A, B, beta-hexosaminidase A, B, heparin N-sulfatase, alpha-D-mannosidase, beta-glucuronidase, N-acetylgalactosamine- N-acetylgalactosamine-6 sulfatase, lysosomal acid lipase, alpha-N-acetyl-
  • the enzyme fusion protein according to any one of the preceding embodiments is characterized in that the enzyme is alpha-galactosidase A or beta-galactosidase.
  • the immunoglobulin Fc region comprises at least one amino acid substitution, addition, deletion, modification (s), deletion, modification (s), and / or deletion of at least one amino acid in the native immunoglobulin Fc region, ), And a combination thereof.
  • the immunoglobulin Fc region is selected from the group consisting of: a second amino acid of the immunoglobulin Fc region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 substituted with proline;
  • the 71st amino acid is replaced by glutamine;
  • the second amino acid is proline, and the 71st amino acid is substituted by glutamine.
  • an enzyme fusion protein according to any one of the preceding embodiments, wherein said immunoglobulin Fc region comprises (a) a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain and a CH4 domain; (b) a CH1 domain and a CH2 domain; (c) CH1 domain and CH3 domain; (d) a CH2 domain and a CH3 domain; And (e) a combination of one or more of the CH1 domain, CH2 domain, CH3 domain, and CH4 domain with a portion of the immunoglobulin hinge region or hinge region.
  • an enzyme fusion protein according to any one of the preceding embodiments, wherein the immunoglobulin Fc region is in the form of a monomer.
  • immunoglobulin Fc region is characterized by comprising a hinge region, a CH2 domain and a CH3 domain.
  • the immunoglobulin Fc region is an enzyme fusion protein according to any one of the preceding embodiments, wherein the site capable of forming a disulfide bond is removed, a part of the amino acid at the N-terminus is removed from the native Fc, - the methionine residue is added to the terminal, the complement binding site is removed, or the antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) site is removed.
  • ADCC antibody dependent cell mediated cytotoxicity
  • immunoglobulin Fc region is an immunoglobulin Fc fragment derived from IgG, IgA, IgD, IgE or IgM.
  • the immunoglobulin Fc region is a hybrid of a domain having different origins derived from an immunoglobulin selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE, and IgM, do.
  • immunoglobulin Fc region is an IgG4 Fc region.
  • an enzyme fusion protein according to any one of the preceding embodiments, characterized in that the enzyme fusion protein comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • Another embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of lysosomal storage disorder (LSD) comprising said enzyme fusion protein.
  • LSD lysosomal storage disorder
  • lysosomal accumulation disease is selected from the group consisting of mucopolysaccharidosis (MPS), glycogen storage disease, sphingolipidosis, Niemann-Pick disease, Fabry's disease, Gaucher disease, Hunter's syndrome, and Maroteaux-Lamy syndrome. ≪ Desc / Clms Page number 2 >
  • composition according to the preceding embodiment characterized in that the composition reduces the binding of the enzyme to the lysosome receptor.
  • Another embodiment of the present invention provides a polynucleotide encoding said enzyme fusion protein.
  • Another embodiment of the present invention provides an expression vector comprising said polynucleotide.
  • Another embodiment of the present invention provides a transformant into which the above expression vector has been introduced.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preparing an enzyme fusion protein.
  • a method of producing an enzyme fusion protein which comprises culturing the transformant to obtain a culture, and recovering the enzyme fusion protein from the culture.
  • One embodiment of the present invention provides an enzyme fusion protein represented by the following formula (1).
  • X and X ' are therapeutic enzymes each independently of the same or different type of enzyme
  • L and L 'are linkers each independently of the same or different kind of linker
  • F is an immunoglobulin Fc region
  • the term " enzyme fusion protein " refers to a fusion of an immunoglobulin Fc region to a therapeutic enzyme, which, due to the fusion of the immunoglobulin Fc region, While the binding capacity to the lysosome receptor is reduced, leading to an increase in blood half-life.
  • the enzyme fusion protein of the present invention can be used as a drug for enzymatic replacement therapy (ERT). Such an enzyme replacement therapy can prevent or treat diseases through restoration of degraded enzyme function by supplementing deficient or deficient enzymes which cause diseases.
  • the present inventors have made fusion proteins with immunoglobulin Fc regions to increase the blood half-life of therapeutic enzymes.
  • the Fc region was substituted with a potential glycosylation sequence to inhibit glycation, and an IgG4 Fc derivative in which the chain exchange was inhibited by substituting the hinge sequence of IgG4 Fc was used.
  • the therapeutic enzyme fused with the immunoglobulin Fc region forms a dimer, in particular, a dimer connected in anti-parallel form
  • the sustained activity in the body is increased while the preparation step of the enzyme fusion protein can be reduced and efficient production is possible.
  • the enzyme fusion protein of the present invention has an advantage that the enzyme activity can be maintained while the stability is increased, and the production cost is reduced as compared with the therapeutic enzyme in which the Fc region is not fused.
  • " therapeutic enzyme " of the present invention is an enzyme for treating a disease caused by lack of enzyme, deficiency, dysfunction or the like, and is used as an enzyme replacement therapy, ≪ / RTI > Specifically, it may be, but is not limited to, an enzyme for the treatment of a lysosomal accumulation disease caused by a lack or lack of a lysosomal enzyme.
  • the therapeutic enzyme that can be included in the enzyme fusion protein of the present invention is not particularly limited and any therapeutic enzyme that can gain an advantage over the unfused form of the therapeutic enzyme by increasing the duration of the enzyme in vivo, .
  • the enzyme fusion protein is a fusion protein of a therapeutic enzyme.
  • the therapeutic enzyme contained in the enzyme fusion protein of the present invention may be, but is not limited to, form dimers through non-covalent bonds.
  • the therapeutic enzyme may be a therapeutic enzyme that forms a dimer when the fusion protein is expressed in a transformant and the immunoglobulin Fc region forms a dimer.
  • the dimer of such a therapeutic enzyme may be one in which two enzymes identical to each other form a dimer or two enzymes different from each other may form a dimer and the enzyme constituting the dimer may be a It is not limited to a specific kind.
  • the therapeutic enzymes constituting the dimer may be, but are not limited to, a parallel dimer or an anti-parallel dimer depending on the direction in which they are connected to each other.
  • the fusion protein which is a fusion protein with the immunoglobulin Fc region, which is a therapeutic enzyme, alpha-galactosidase was prepared, and the immunoglobulin Fc region of the fusion protein forms a dimer, Lactosidase was found to form an antiparallel dimer through noncovalent binding. Furthermore, it was confirmed that the fusion protein retained the activity of the enzyme even in the form fused with the immunoglobulin Fc region (Example 2).
  • a fusion protein fused with an immunoglobulin Fc region and an agarcidase beta not fused with an Fc region were compared with each other, and in vitro enzyme activity and intracellular uptake (Examples 2 and 3), and it was confirmed that the pharmacokinetics were excellent by fusion with the Fc region (Example 4).
  • " parallel dimer " of the present invention means that, when each monomer forms a dimer, the N- and C-termini of the amino acid sequence of each monomer form a dimer in the same direction do.
  • the dimer formation may be non-covalent bond or covalent bond, but is not limited thereto.
  • " anti-parallel dimer " of the present invention means that when each monomer forms a dimer, the N-terminal and C-terminal ends of the amino acid sequence of each monomer ≪ / RTI >
  • the dimer formation may be non-covalent bond or covalent bond, but is not limited thereto.
  • the N-terminus of one therapeutic enzyme (X) and the N-terminus of another therapeutic enzyme (X ') form dimers in the same direction
  • the C-terminus of one therapeutic enzyme (X) and the C-terminus of another therapeutic enzyme (X ') form dimers in the same direction
  • one therapeutic enzyme Terminus of the other therapeutic enzyme (X ') forms a dimer in the same direction
  • the C-terminus of one therapeutic enzyme (X) Terminus of the therapeutic enzyme (X ') in the same direction can form a dimer.
  • the case of (i) and (ii) is referred to as a parallel dimer, and the case of (iii) and (iv) is referred to as an antiparallel dimer.
  • the formation of the dimer is a covalent bond or non-covalent bond -covalent bond, but is not limited thereto.
  • parallel or antiparallel dimer formation can be achieved by forming dimers of the immunoglobulin Fc region so that the alpha-galactosidase A of the monomers linked thereto forms dimers through shared or non- It can be shaping
  • the fusion protein comprising the therapeutically active enzyme of the present invention in the form of an antiparallel dimer can reduce the production cost by reducing the production steps in the process of producing the fusion protein and it is possible to reduce the production cost by controlling the dimer type instability While maintaining the activity of the enzyme.
  • the therapeutic enzymes of the present invention may be selected from the group consisting of beta-glucosidase, alpha-galactosidase, beta-galactosidase, iduronidase, Galactose-6-sulfatase, acid alpha-glucosidase, acid ceramidase, acidic alpha-glucosidase, (A), (B), heparin-N-sulfatase (A), and the like.
  • heparin N-sulfatase alpha-D-mannosidase, beta-glucuronidase, N-acetylgalactosamine -6 sulfatase, lysosomal acid lipase, alpha-N-acetyl-glucosaminidase
  • glucocerebrosidase butyrylcholinesterase, chitinase, glutamate decarboxylase, imiglucerase, lipase
  • the enzyme may be alpha-galactosidase A or beta-galactosidase.
  • alpha galactosidase A is an enzyme present in lysosomes such as spleen, brain, liver and the like, which hydrolyzes an end alpha-galactosyl moiety in glycolipids and glycoproteins Specifically, the alpha-galactosidase A is known to hydrolyze ceramide trihexoside and catalyze the hydrolysis of melibiose with galactose and glucose, and in particular, to a lysosomal accumulation disease It is known to be associated with Fabry's disease.
  • the above-mentioned alpha-galactosidase A can be used in combination with agalidase alpha or agalsidae beta, which is a recombinant form, and has an equivalent activity and has therapeutic effect on lysosomal accumulation diseases And the like, and can be included in the scope of the present invention without limitation to the sequence, the origin, the production method, and the like.
  • the alpha galactosidase may be encoded by the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and may include, but is not limited to, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • analogs of the therapeutic enzymes include all of the addition of one or more amino acids to the amino and / or carboxy terminus of a naturally occurring therapeutic enzyme.
  • the substituted or added amino acids may use atypical or non-naturally occurring amino acids as well as the 20 amino acids normally found in human proteins.
  • Commercial sources of atypical amino acids include Sigma-Aldrich, ChemPep and Genzyme pharmaceuticals.
  • Such amino acid-containing peptides and regular peptide sequences can be synthesized and purchased through commercialized peptide synthesis companies, such as the American peptide company in the United States or Bachem in Korea, or Anygen in Korea, but are not limited thereto.
  • fragment of the present invention refers to a form in which one or more amino acids are removed from the analog amino terminal or carboxy terminal of a natural type therapeutic enzyme or a natural type therapeutic enzyme. As long as it has the activity of the therapeutic enzyme, regardless of the size of the fragment or the kind of the amino acid to be removed.
  • Such therapeutic analogs include biosimilar and biobeta forms of the corresponding therapeutic enzymes.
  • biosimilars include, but are not limited to, differences between known therapeutic enzymes and expression hosts, differences in the pattern and degree of glycation, When the residue is not 100% substitution in view of the reference sequence of the enzyme, the difference in degree of substitution corresponds to the biosimilar enzyme that can be used in the enzyme fusion protein of the present invention.
  • Such therapeutic enzymes can be prepared or produced by methods known in the art and can be produced in an animal cell, an E. coli, a yeast, an insect cell, a plant cell, a living animal, etc. through genetic recombination, And commercially available therapeutic enzymes can be purchased and used, but the present invention is not limited thereto.
  • compositions comprising 60%, 70%, 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, or 99% or more homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the therapeutic enzyme may be obtained from microorganisms by recombinant techniques, or may be commercially available, but is not limited thereto.
  • homology of the present invention is intended to indicate the similarity between a wild type amino acid sequence and a wild type nucleic acid sequence, and comparison of homology is performed using a visual program or a comparison program that is easy to purchase. Commercially available computer programs can calculate homology between two or more sequences as a percentage (%). The homology (%) can be calculated for an adjacent sequence.
  • sequence of the therapeutic enzyme or derivative thereof and the nucleotide sequence encoding the same can be obtained from a known database such as NCBI.
  • the therapeutic enzyme may be prepared or prepared by a method known in the art. Specifically, an animal cell into which an animal cell expression vector has been inserted may be cultured and purified from the culture, or a commercially available enzyme may be purchased But are not limited thereto.
  • the enzyme fusion protein of the present invention may be one in which the therapeutic enzyme and the immunoglobulin Fc region have been fused through a peptide linker. That is, L or L 'in the above formula (1) may be a peptide linker, but is not particularly limited as long as it can fuse an immunoglobulin Fc region with a therapeutic enzyme.
  • the peptide linker may comprise one or more amino acids, and may include, for example, from 1 to 1000 amino acids, including any peptide linkers known in the art, such as [GS] x linkers, [GGGS] [GGGGS] x linker, etc., where x can be a natural number (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, or more) of 1 or more, but is not limited thereto.
  • the peptide linker of the present invention may be composed of 10 to 50, more specifically, 20 to 40 amino acid sequences, and may be composed of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 11.
  • the location of peptide linkers fused to therapeutic enzymes and immunoglobulin Fc is not limited as long as the therapeutic enzymes can be linked to the immunoglobulin Fc region while maintaining the activity of the therapeutic enzymes.
  • the therapeutic enzymes and both ends of the immunoglobulin Fc region are not limited thereto.
  • " N-terminus " or " C-terminus " of the present invention refers to the amino terminal and carboxyl terminus of a protein, respectively. Examples include, but are not limited to, N-terminal or C- Terminal amino acid residue as well as the N-terminal or C-terminal amino acid residue, and may specifically include the first to 20th amino acid residues from the most terminal.
  • the therapeutic enzymes, alpha-galactosidase and linker-IgG4 are fused at the gene level, and a fusion protein in which the N-terminal of IgG4 is fused to the C- No. 13) was prepared, and it was confirmed that the fusion protein was expressed in the transfected transformant (Example 2).
  • the peptide linker may be respectively linked to a dimeric immunoglobulin Fc region formed by the immunoglobulin Fc region of the monomer, and the linkers connected to each immunoglobulin Fc region may be the same or different species .
  • An immunoglobulin Fc region that is a moiety of the enzyme fusion protein of the present invention may be one in which the immunoglobulin Fc region of the monomer forms a dimer.
  • immunoglobulin Fc region of the present invention means a region that includes a heavy chain constant region 2 (CH2) and / or a heavy chain constant region 3 (CH3) portion except for the heavy chain and light chain variable region of the immunoglobulin.
  • such Fc regions may include, but are not limited to, mutated hinge regions.
  • the immunoglobulin Fc region is selected from the group consisting of substitution, addition, deletion, modification, and combinations of at least one amino acid in the native immunoglobulin Fc region It is to be understood that variations have occurred, but are not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region is a substance used as a carrier in the production of drugs. In order to stabilize the protein and prevent it from being removed from the kidney, researches on fusion proteins using the immunoglobulin Fc region have been actively conducted. IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE are the major constituents of blood. Immunoglobulins are classified into four subtypes of IgG1 to IgG4. Fusion proteins using the immunoglobulin Fc region increase the size of the protein, prevent it from being removed from the kidney, and bind to the FcRn receptor to increase the half-life of blood through endocytosis and recycling into the cell.
  • Such an immunoglobulin Fc region may include a hinge region in the heavy chain constant region, and the immunoglobulin Fc region, which is a monomer due to the hinge region, may form a dimer, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region may contain a heavy chain constant region 1 (CH1) and / or a heavy chain constant region 1 < / RTI > (CL1). It may also be a region in which some long amino acid sequences corresponding to CH2 and / or CH3 have been removed.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention comprises 1) CH1 domain, CH2 domain, CH3 domain and CH4 domain, 2) CH1 domain and CH2 domain, 3) CH1 domain and CH3 domain, 4) CH2 domain and CH3 domain, 5) a combination of an immunoglobulin hinge region (or a portion of a hinge region) with one or more of the CH1, CH2, CH3 and CH4 domains.
  • the immunoglobulin Fc region may consist of a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain, but is not limited thereto.
  • the hinge region may be one in which a part of the hinge sequence having the following amino acid sequence is deleted or mutated.
  • a part of the hinge region may be deleted so as to include only one cysteine (Cys) residue, and the serine (Ser) residue involved in the chain exchange may be replaced with a proline (Pro) . More specifically, the second serine residue of the hinge sequence may be replaced by a proline residue, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region includes a native hinge region or a mutated hinge region, thereby not only preventing chain exchange and monomer formation in the Fc region, but also enhancing the stability of the fused therapeutic enzyme.
  • the immunoglobulin Fc region may be in the form of a monomer, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region of F in Formula 1 may be expressed as a monomer in fusion with a therapeutic enzyme of a monomer through a peptide linker.
  • the therapeutic enzyme fused to the immunoglobulin Fc region may also form dimer by noncovalent bonding, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region used as a carrier of the drug is known to have the drawback that it can cause an unintended immune response.
  • an effector function such as antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC). This function occurs through binding of the immunoglobulin Fc region to the Fc receptor, complement binding, or glycosylation of the Fc region.
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • the present inventors tried to solve this problem by replacing the sequence of the hinge region in the immunoglobulin Fc region.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention may be substituted with a potential glycosylation sequence to control glycation, or may be substituted with a sequence involved in chain exchange, or both cases .
  • the immunoglobulin Fc region of the enzyme fusion protein of the present invention may be one in which no chain exchange occurs.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention may be one in which the second amino acid and / or the 71st amino acid of the immunoglobulin Fc region of SEQ ID NO: 8 is replaced with another amino acid in order to prevent chain exchange and N-glycosylation have. More specifically, the first amino acid (serine) of the immunoglobulin Fc region of SEQ ID NO: 8 is replaced by proline, or 2) the 71st amino acid (asparagine) is replaced by glutamine, or 3) , The 71st amino acid may be substituted with glutamine, and specifically, it may be an immunoglobulin Fc region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, but is not limited thereto. In addition to the above-mentioned mutations, mutations that increase the stability of therapeutic enzymes may be suitable as carriers of the drug.
  • the immunoglobulin Fc region may be a hinge region of an immunoglobulin IgG4 Fc substituted with an IgG1 hinge region, but is not limited thereto.
  • the second amino acid of the immunoglobulin Fc is substituted with proline, and the 71st amino acid is replaced with glutamine to reduce chain exchange and N-glycosylation (Example 1).
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention includes a naturally occurring amino acid sequence as well as a sequence derivative thereof.
  • An amino acid sequence derivative means that at least one amino acid residue in a natural amino acid sequence has undergone a mutation selected from the group consisting of substitution, addition, deletion, modification, and combinations thereof.
  • amino acid residues 214 to 238, 297 to 299, 318 to 322 or 327 to 331, which are known to be important for binding, can be used as sites suitable for modification.
  • various kinds of derivatives can be used, such as a site capable of forming a disulfide bond is removed, some amino acids at the N-terminus are removed from the native Fc, or a methionine residue is added at the N-terminus of the native Fc Do.
  • the complement binding site for example, the C1q binding site may be removed and the antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) site may be removed.
  • ADCC antibody dependent cell mediated cytotoxicity
  • Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not globally alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges involve amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly.
  • phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation, and amidation may be used, or may be modified.
  • the Fc derivative described above exhibits biological activity equivalent to that of the Fc region of the present invention, and may have increased structural stability against heat, pH, etc. of the Fc region.
  • the Fc region may also be obtained from natural forms isolated in vivo in animals such as humans, cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats or guinea pigs, and may be obtained from transformed animal cells or microorganisms Recombinant or derivative thereof.
  • the method of obtaining from the native form may be a method of separating the whole immunoglobulin from the living body of human or animal, and then obtaining the protein by treating the proteolytic enzyme. When papain is treated, it is cleaved into Fab and Fc, and when pepsin is treated, it is cleaved into pF'c and F (ab) 2.
  • Fc or pF'c can be isolated using size-exclusion chromatography or the like. In a more specific embodiment, it is a recombinant immunoglobulin Fc region obtained from a microorganism from a human-derived Fc region.
  • the immunoglobulin Fc region may be a natural type sugar chain, an increased sugar chain compared to the native type, a reduced sugar chain or sugar chain as compared to the native type, or an ung sugarified form.
  • Conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms can be used to increase or decrease immunoglobulin Fc sugar chains.
  • the immunoglobulin Fc region in which sugar chains are removed from Fc is significantly reduced in binding force with complement (c1q), and antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity is reduced or eliminated, resulting in unnecessary immune response in vivo Do not.
  • forms that are more consistent with the original purpose of the drug as a carrier will be referred to as immunoglobulin Fc regions in which the sugar chain is removed or unglycosylated.
  • Deglycosylation refers to an Fc region in which the sugar is removed by an enzyme. Aglycosylation is produced in prokaryotes, in a more specific embodiment, in Escherichia coli, it means.
  • the immunoglobulin Fc region may be an animal origin such as human or cattle, goat, pig, mouse, rabbit, hamster, rat, guinea pig, etc., and in a more specific embodiment is human origin.
  • the immunoglobulin Fc region may be an Fc region derived from IgG, IgA, IgD, IgE, IgM or a combination thereof or a hybrid thereof.
  • IgG or IgM most abundant in human blood, and in more specific embodiments, is derived IgG known to enhance the half-life of the ligand binding protein.
  • said immunoglobulin Fc region is an IgG4 Fc region, and in a more specific embodiment said immunoglobulin Fc region is a non-glycosylated Fc region from human IgG4, and in a most specific embodiment said immunoglobulin Fc region
  • the amino acid sequence of the region is SEQ ID NO: 9, and the polynucleotide sequence encoding it is SEQ ID NO: 7, but is not limited thereto.
  • the term " combination" means that when a dimer or a multimer is formed, a polypeptide encoding the same-originated short-chain immunoglobulin Fc region forms a bond with a short-chain polypeptide having a different origin. That is, it is possible to prepare a dimer or a multimer from two or more fragments selected from the group consisting of Fc fragments of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc and IgE.
  • the therapeutic enzyme or enzyme fusion protein of the present invention may be one in which the N-terminal and / or the C-terminal is unmodified.
  • And / or C-terminal thereof are chemically modified or protected with an organic terminal, or a modified form in which an amino acid is added to the terminal of the peptide or the like, is also included in the category of therapeutic enzymes or enzyme fusion proteins according to the present invention.
  • the terminus of the therapeutic enzyme or enzyme fusion protein according to the present invention has a carboxyl group, but is not particularly limited thereto.
  • the N-terminal and the C-terminal are charged, so that the N-terminal is acetylated and / or the C-terminal is amidated, But is not limited thereto.
  • the description or claims of the specification for "enzymes” or “fusion proteins” according to the present invention should be understood to include the enzymes or fusion proteins, as well as the salts of the enzymes or fusion proteins (eg, A pharmaceutically acceptable salt of said fusion protein), or a solvate form thereof.
  • the salts of the enzymes or fusion proteins eg, A pharmaceutically acceptable salt of said fusion protein
  • Such salt forms can be, for example, in the form of any pharmaceutically acceptable salt.
  • the kind of the salt is not particularly limited. However, it is preferable to be a safe and effective form for an individual such as a mammal, but the present invention is not particularly limited thereto.
  • pharmaceutically acceptable means a substance that can be effectively used in a desired application without causing undue toxicity, irritation, or allergic reaction within the scope of medical judgment.
  • salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases include, for example, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, , Benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, and benzenesulfonic acid.
  • Salts derived from suitable bases may include alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium.
  • solvate of the present invention means that the enzyme, fusion protein or salt thereof according to the present invention forms a complex with a solvent molecule.
  • the enzyme fusion protein of the present invention can be produced by a known method in the art.
  • a recombinant vector expressing the therapeutic enzyme alpha-galactosidase in a form fused with a peptide linker-immunoglobulin Fc was prepared and expressed in a CHO cell line (Examples 1 and 2).
  • the enzyme fusion proteins of the present invention can be produced by other known methods in addition to the methods described in the above embodiments.
  • the enzyme fusion protein of the present invention may include, but is not limited to, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the enzyme fusion protein according to the present invention can increase the half-life of the therapeutic enzyme by enhancing the stability of the therapeutic enzyme while maintaining the activity of the therapeutic enzyme by fusing the therapeutic enzyme and the immunoglobulin Fc region exhibiting the therapeutic effect on the lysosomal accumulation disease .
  • therapeutic enzymes fused with mutated immunoglobulin Fc regions have weaker chain exchange and glycosylation, have lower binding capacity to lysosomal receptors than therapeutic enzymes that are not fused with the Fc region, can have high persistence, This represents a useful effect in the treatment of lysosomal accumulation diseases.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a lysosomal storage disorder (LSD) comprising the enzyme fusion protein as an active ingredient.
  • LSD lysosomal storage disorder
  • composition according to the present invention is characterized by increased in vivo persistence and stability of the therapeutic enzyme.
  • the enzyme fusion protein of the pharmaceutical composition of the present invention may be a fusion of an alpha-galactosidase A and an immunoglobulin Fc region, but is not limited thereto.
  • the fusion protein of the present invention may be one in which a therapeutic enzyme in the fusion protein, alpha-galactosidase A, also forms a dimer when the immunoglobulin Fc region forms a dimer, and more specifically,
  • the dimers of Shidaja A are characterized by dimer formation by mutual noncovalent bonding, in particular dimer formation in antiparallel directions.
  • " lysosome " of the present invention is one of the organelles existing in the cytoplasm and contains a large amount of hydrolytic enzymes to decompose foreign substances such as macromolecules and bacteria in the body, It is an organelle that helps to be recycled in parts.
  • the function of the lysosome is carried out by a plurality of enzymes. When a specific enzyme is lost due to a side or lack thereof, the lysis function of the lysosome is lost. As a result, Accumulation and damage of the cell, which causes diseases.
  • " lysosomal storage disease " (LSD) of the present invention means a rare genetic disease caused by loss of lysosomal function as described above, and it is essential that enzymatic replacement therapy using a defective enzyme is used to be.
  • the lysosomal accumulation diseases include mucopolysaccharidosis (MPS), glycogen storage disease, sphingolipidosis, Niemann-Pick disease, Fabry's disease, Gaucher ' s disease, Hunter ' s syndrome, and Maroteaux-Lamy syndrome.
  • Fabry ' s disease is one of the lysosomal accumulation diseases, inherited by sex chromosomal recessive disorders, and is caused by inactivation of the X chromosome. It is a congenital metabolic abnormality of glycosphingolipid, which is deficient or deficient in the activity of alpha-galactosidase A, a hydrolytic enzyme present in lysosomes. It is known that abnormalities of alpha-galactosidase A abnormally accumulate Gb3 (globotriaosylceramide) in various parts of the blood vessel wall and body, for example, skin, kidney, heart and nervous system, have. Sweating, swelling of the extremities, severe pain, vascular keratosis, corneal opacity, cardiac ischemia, myocardial infarction, and kidney abnormalities, resulting in death of the kidney due to inability to function.
  • Gb3 globotriaosylceramide
  • prophylactic in the present invention means any action that inhibits or delays a disease, lysosomal accumulation disease, or the like, which is intended by administration of the enzyme fusion protein or a composition comprising it, refers to any action that results in the improvement or improvement of the symptoms of a desired disease, such as a lysosomal storage disorder, by administration of the composition.
  • administering means introducing a predetermined substance into a patient in any suitable manner, and the route of administration of the composition is not particularly limited, but any conventional route in which the composition can reach an in vivo target For example, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, oral, topical, intranasal, intrapulmonary, rectal, and the like .
  • the oral composition is formulated so as to coat the active agent or protect it from decomposition at the top. Specifically, it can be administered in the form of an injection.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device capable of transferring the active ingredient to the target cell.
  • the total effective amount of the composition of the present invention may be administered to a patient in a single dose and may be administered by a fractionated treatment protocol administered over a prolonged period of time in multiple doses.
  • the content of the active ingredient may be varied depending on the degree of the disease.
  • the preferred total dose of the fusion protein of the invention can be from about 0.0001 mg to 500 mg per kg of patient body weight per day.
  • the dose of the conjugate is determined depending on various factors such as the patient's age, body weight, health condition, sex, severity of disease, diet and excretion rate as well as administration route and frequency of treatment of the pharmaceutical composition, It will be understood by those of ordinary skill in the art that appropriate effective dosages may be determined according to the particular use of the composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited to its formulation, administration route and administration method as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • the actual dosage of the enzyme fusion protein of the present invention will depend on the type of therapeutic enzyme that is the active ingredient, together with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient, and the severity of the disease. Since the enzyme fusion protein of the present invention is excellent in blood persistence and bioactivity, the dosage, administration frequency and frequency of the pharmaceutical composition containing the enzyme fusion protein of the present invention can be remarkably reduced.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be non-naturally occurring.
  • pharmaceutically acceptable in the present invention means that the compound does not cause a sufficient amount and side effects sufficient to exhibit the therapeutic effect, and the kind of the disease, the age, body weight, health, sex, , The route of administration, the manner of administration, the frequency of administration, the duration of treatment, the formulations, or the medicaments used concurrently, well known in the medical arts.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizing agent, a dispersing agent, a stabilizer, a suspending agent, a coloring matter and a perfume in the case of oral administration, A solubilizer, an isotonic agent, and a stabilizer may be used in combination.
  • a base, an excipient, a lubricant and a preservative may be used.
  • Formulations of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in a variety of ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • oral administration may be in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc.
  • unit dosage ampoules or multiple dosage forms may be prepared.
  • it can be formulated into solutions, suspensions, tablets, pills, capsules and sustained release formulations.
  • suitable carriers, excipients and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used. Further, it may further include a filler, an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and an antiseptic agent.
  • the enzyme fusion protein can be used in combination with various carriers permitted as medicaments such as physiological saline or an organic solvent.
  • various carriers permitted as medicaments such as physiological saline or an organic solvent.
  • carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, ascorbic acid antioxidants such as ascorbic acid or glutathione, chelating agents, low molecular proteins or other stabilizers may be used as the drug.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain the above component (active ingredient) in a weight ratio of 0.01 to 99% by weight.
  • Another aspect of the present invention provides a polynucleotide encoding an enzyme fusion protein according to the present invention.
  • the polynucleotide encoding the enzyme fusion protein of the present invention can be, but is not limited to, a polynucleotide in which a portion encoding a therapeutic enzyme and a portion encoding a peptide linker-immunoglobulin Fc region are linked, , But is not limited to, a polynucleotide encoding a fusion protein wherein the N-terminus of the immunoglobulin Fc region is linked to the C-terminus of the therapeutic enzyme via a GGGGS linker. More specifically, the polynucleotide of the present invention may comprise the sequence of SEQ ID NO: 12, but is not limited thereto, as long as it is capable of coding fusion proteins of therapeutic enzymes and immunoglobulin Fc regions.
  • Another embodiment of the present invention provides a recombinant expression vector comprising said polynucleotide.
  • recombinant vector in the present invention means a DNA construct in which a target peptide, for example, an enzyme fusion protein, is operably linked to a suitable regulatory sequence so as to express a target peptide, such as an enzyme fusion protein, in a suitable host.
  • the recombinant vector according to the present invention can be typically constructed as a vector for cloning or as a vector for expression, and can be constructed with prokaryotic or eukaryotic cells as host cells.
  • the regulatory sequence includes a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence controlling the termination of transcription and translation.
  • the recombinant vector can be transcribed into an appropriate host cell and then cloned or functioned independently of the host genome and integrated into the genome itself.
  • the recombinant vector used in the present invention is not particularly limited as long as it is replicable in the host cell and can be produced using any vector known in the art. Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages in their natural or recombinant state.
  • the vector usable in the present invention is not particularly limited, and known expression vectors can be used.
  • the recombinant vector is used to transform a host cell to produce an enzyme fusion protein of the present invention.
  • Such transformed cells which are also part of the present invention, can be used for the propagation of nucleic acid fragments and vectors of the present invention, or can be cultured cells or cell lines used for recombinant production of the enzyme fusion proteins of the present invention.
  • transformed of the present invention means that a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding a target protein (e. G., A therapeutic enzyme, an enzyme fusion protein) is introduced into the host cell such that the polynucleotide encodes To allow expression of the protein.
  • a target protein e. G., A therapeutic enzyme, an enzyme fusion protein
  • the polynucleotide includes DNA and RNA encoding a target protein.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as far as it is capable of being introduced into a host cell and expressed.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all the elements necessary for its expression.
  • the expression cassette can typically include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may also be introduced into the host cell in its own form and operably linked to the sequence necessary for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that the gene sequence is functionally linked to a promoter sequence that initiates and mediates transcription of the polynucleotide encoding the peptide of interest in the present invention.
  • the host suitable for the present invention is not particularly limited as far as it is capable of expressing the polynucleotide of the present invention.
  • Specific examples of the host which can be used in the present invention include bacteria belonging to the genus Escherichia such as E. coli ; Bacteria of the genus Bacillus such as Bacillus subtilis ; Bacteria of the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida ; Yeasts such as Pichia pastoris , Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe ; Insect cells such as Spodoptera frugiperda (Sf9); And animal cells such as CHO, COS, BSC, and the like.
  • Another embodiment of the present invention provides a transformant into which the above expression vector has been introduced.
  • the transformant to which the expression vector of the present invention is introduced is not limited as long as it is capable of expressing and producing the enzyme fusion protein.
  • Escherichia genus such as Escherichia coli
  • Bacteria of the genus Bacillus such as Bacillus subtilis
  • Bacteria of the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida
  • Yeasts such as Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe
  • Insect cells such as Spodoptera frugiperda (SF9)
  • animal cells such as CHO, COS, BSC, and the like.
  • Another aspect of the present invention provides a method for producing an enzyme fusion protein according to the present invention.
  • the method comprises: (a) culturing a transformant to obtain a culture; And (b) recovering the enzyme fusion protein from the culture.
  • the medium used for culturing the transformant in the present invention should meet the requirements of host cell culture in an appropriate manner.
  • the carbon source that may be contained in the medium for the growth of host cells may be appropriately selected according to the judgment of a person skilled in the art depending on the type of the transformant prepared and suitable culture conditions may be adopted for controlling the culture time and amount .
  • Sugar sources that may be used include sugars and carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, Fatty acids such as linoleic acid, glycerol, alcohols such as ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials may be used individually or as a mixture.
  • nitrogen sources examples include peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate.
  • the nitrogen source may also be used individually or as a mixture.
  • Potassium which may be used include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts.
  • the culture medium may contain a metal salt such as magnesium sulfate or iron sulfate necessary for growth.
  • essential growth materials such as amino acids and vitamins can be used.
  • suitable precursors may be used in the culture medium.
  • the abovementioned raw materials can be added to the culture batches in a batch manner or in a continuous manner by an appropriate method during cultivation.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid can be used in a suitable manner to adjust the pH of the culture.
  • bubble formation can be suppressed by using a defoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester.
  • An oxygen or oxygen-containing gas (such as air) is injected into the culture to maintain aerobic conditions.
  • the cultivation of the transformant according to the present invention is usually carried out at a temperature of 20 ° C to 45 ° C, specifically 25 ° C to 40 ° C.
  • the culture is continued until the desired amount of the desired therapeutic enzyme or enzyme fusion protein is obtained.
  • the culture can usually last for 10 to 160 hours.
  • the transformant according to the present invention when appropriate culture conditions are established according to the host cell, the transformant according to the present invention produces insulin analogue.
  • Therapeutic enzymes or enzyme fusion proteins produced according to the constitution of the vector and the characteristics of the host cell May be secreted into the cytoplasm, periplasmic space, or extracellular space of the cell.
  • Proteins expressed in or outside the host cell can be purified in a conventional manner.
  • purification methods include salting out (eg ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation), solvent precipitation (eg, protein fraction precipitation using acetone, ethanol, etc.), dialysis, gel filtration, ion exchange, reverse phase column chromatography Chromatography and ultrafiltration can be applied alone or in combination.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating a lysosomal accumulation disease comprising administering to said individual an enzyme fusion protein or composition comprising the same.
  • the enzyme fusion protein of the present invention includes a therapeutic enzyme capable of preventing or treating a lysosomal accumulation disease, administration of the enzyme fusion protein containing the enzyme fusion protein, or the pharmaceutical composition containing the enzyme fusion protein, Can be prevented or treated.
  • " individual " of the present invention refers to a subject suspected of having a lysosomal storage disorder (LSD), and the suspected individual of the lysosomal storage disease includes a rat, a livestock, etc. including a human, Means an animal which is capable of being treated with the enzyme fusion protein of the present invention or the composition comprising it.
  • LSD lysosomal storage disorder
  • the methods of the invention can include administering a pharmaceutical effective amount of a pharmaceutical composition comprising an enzyme fusion protein.
  • the appropriate total daily dose may be determined by the treatment within the scope of appropriate medical judgment, and may be administered once or several times.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient will depend upon the nature and extent of the reaction to be achieved, the particular composition, including whether or not other agents are used, the age, weight, Sex and diet of the patient, the time of administration, the route of administration and the rate of administration of the composition, the duration of the treatment, the drugs used or concurrently used with the specific composition, and similar factors well known in the medical arts.
  • the method of preventing or treating the lysosomal accumulation disorder may be a combination therapy, which further comprises administering a compound or a substance having therapeutic activity against one or more lysosomal storage diseases.
  • combined should be understood to indicate simultaneous, separate or sequential administration. If the administration is sequential or separate, the interval of administration of the second component should be such that the beneficial effects of the combination are not lost.
  • the dose of the enzyme fusion protein having the therapeutic activity for the lysosomal accumulation disease may be about 0.0001 ⁇ g to 500 mg per kg of the patient's body weight, but is not particularly limited thereto.
  • Another embodiment of the present invention provides the use of the enzyme fusion protein, or a composition comprising it, for the preparation of a medicament (or pharmaceutical composition) for the prevention or treatment of a lysosomal accumulation disorder.
  • the present inventors have found that a combination of a natural alpha-galactosidase and a linker (SEQ ID NO: 10), an Fc immunogen, and an immunoglobulin to produce an enzyme fusion protein containing an anti-parallel dimer therapeutic enzyme,
  • the globulin region (SEQ ID NO: 7) was fused at the gene level and synthesized into an expression vector.
  • a site-directed mutagenesis PCR technique was used to remove the chain exchange and N-glycosylation site in the Fc region of the constructed fusion protein sequence.
  • Serine which is the second amino acid of the Fc region (SEQ ID NO: 8) involved in the chain exchange, was replaced with Proline using the primers of SEQ ID NOS: 1 and 2, and primers of SEQ ID NOS: 3 and 4 Asparagine, which is the 71st amino acid of the Fc region where N-glycosylation took place, was replaced with glutamine.
  • the polynucleotide encoding the synthesized alpha galactosidase-Fc fusion protein was inserted into the XOGC vector, which is an expression vector, using restriction enzymes.
  • the restriction enzymes BamHI and XhoI are restriction enzymes that do not cleave both the alpha-galactosidase and Fc immunoglobulin domains.
  • the restriction enzyme-digested alpha-galactosidase-Fc was inserted into the X0GC vector cut with the same restriction enzyme to complete a vector expressing the alpha-galactosidase-Fc fusion protein.
  • Alpha galactosidase forms an antiparallel dimer when the immunoglobulin Fc region forms a dimer.
  • alpha-galactosidase-Fc The DNA and protein sequences of alpha-galactosidase-Fc are shown in Table 2 below.
  • the underlined signal sequence the bold represents the amino acid-substituted portion, and the italic type represents the linker.
  • the enzyme fusion protein expression vector prepared in the above example was named alpha-galactosidase-Fc.
  • Example 2-1 Preparation of alpha-galactosidase-Fc fusion protein
  • a CHO-S cell line was transfected with the alpha-galactosidase-Fc expression vector (pX0GC-alpha galactosidase-Fc) prepared in the above Example to prepare a cell line capable of mass-producing the alpha-galactosidase-Fc fusion protein .
  • CHO-S cells were suspended in 1 L Erlenmeyer flask (Corning, cat. No. 431147) using serum-free medium (FreeStyle CHO Expression Medium, Thermo Fisher, cat. No. 12651014) , And when cells in the culture container were grown to 5 x 10 8 cells, transformed with Freestyle Max (Thermo Fisher, cat. No. 16447-100).
  • serum-free medium FreeStyle CHO Expression Medium, Thermo Fisher, cat. No. 12651014
  • Freestyle Max Thermo Fisher, cat. No. 16447-100.
  • insert 10 mL of OptiPro SFM Thermo Fisher, cat. No. 12309-019 into two tubes, add 500 ⁇ g of DNA to one tube, and 500 ⁇ L of Freestyle Max And the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and then replaced with a new Freestyle CHO expression medium (Thermo Fisher, cat. No. 12651014).
  • the cells were incubated at 37, 5%
  • the culture supernatant was recovered by centrifugation and the in vitro test enzyme activity was measured in the supernatant in order to measure the enzyme activity change due to the production of alpha-galactosidase-Fc.
  • the ⁇ -galactosidase-Fc fusion protein was digested with pNP-Gal (p-nitrophenyl-aD-galactopyranoside), known as an enzyme substrate, at 37 ° C. for 30 min at 37 ° C. to confirm the in vitro enzyme activity of ⁇ - Minute temperature equilibrium. Subsequently, the in vitro enzyme activity of alpha-galactosidase-Fc was measured by reacting the substrate solution and alpha-galactosidase-Fc at 37 DEG C for 30 minutes and measuring its absorbance.
  • pNP-Gal p-nitrophenyl-aD-galactopyranoside
  • alpha-galactosidase-Fc and agalcidase beta were allowed to undergo temperature equilibrium with pNP-Gal (p-nitrophenyl-aD-galactopyranoside), an enzyme substrate, at 37 DEG C for 30 minutes, Shidaje-Fc fusion protein was reacted at 37 DEG C for 20 minutes.
  • the enzymatic activities of alpha-galactosidase-Fc and agalcidase beta were measured and compared by measuring the absorbance of 4-Nitrophenol finally produced.
  • Alpha galactosidase is known to act after being absorbed into cells via the mannose-6-phosphate receptor (M6PR).
  • M6PR mannose-6-phosphate receptor
  • the present inventors confirmed the cell-absorbing activity of the fusion protein of alpha-galactosidase-Fc as follows.
  • CCD986SK cells human dermal fibroblasts known to express M6PR were treated with agalcidase beta and alpha-galactosidase-Fc fusion proteins, respectively, and then induced intracellular absorption at 37 ° C. After 24 hours, intracellular agalcidase beta and alpha-galactosidase-Fc fusion proteins were identified by enzyme activity assay.
  • the blood stability and pharmacokinetic coefficient (BSA) of the agaraseptase beta (control) and the alpha-galactosidase-Fc fusion protein (test group) prepared in the above-mentioned Example were measured in three ICR mice per each blood sampling point of each group Were compared.
  • control group and the test group were intravenously and subcutaneously injected at 1.0 mg / kg each on an agar agar basis.
  • the control intravenous injection group was collected after 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2 and 4 hours after injection.
  • blood samples were collected after 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, Blood samples were collected after 0, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192 and 216 hours.
  • the amount of protein in serum was quantitated by measuring in vitro vitro enzyme activity.
  • the alpha-galactosidase-Fc fusion protein As a result, in the case of the alpha-galactosidase-Fc fusion protein, the half-life (T 1/2 ), the maximum drug concentration (C max ) and the area under curve (AUC) Respectively.
  • the AUC represents the degree of the body's exposure to the drug molecule. (Fig. 4, Table 3). From this, it was confirmed that the alpha-galactosidase-Fc fusion protein of the present invention exhibited a high blood half-life, a maximum drug concentration in blood (C max ), and a bioavailability (AUC) Respectively.
  • novel fusion protein of the present invention which increased the half-life and bioavailability of alpha-galactosidase, which is an example of therapeutic enzymes known to have therapeutic effects on lysosomal accumulation diseases, Suggesting that it can be used as a therapeutic agent for an accumulation disorder.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 이량체의 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역의 융합단백질, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 구조를 갖는 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도
본 발명은 이량체의 치료학적 효소를 포함하는 효소 융합단백질, 이의 제조 방법과 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
리소좀은 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 다당류 및 지질과 같은 거대분자를 분해하는 기능을 하는 세포질 소기관이다. 리소좀의 내부는 산성 환경이며 생물학적 거대분자들의 가수분해를 촉진하는 가수분해 효소(hydrolase enzymes)를 함유한다. 리소좀은 또한 세포 내 이입(endocytosis)을 통한 분자의 흡수에 있어서 어떠한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다.
리소좀 축적 질환 (Lysosomal Storage Disorders, LSDs)은 유전적 대사 질환의 일종으로 리소좀의 기능이 상실되어 나타난다. 리소좀 축적 질환은 지질, 단백질, 다당류 등의 물질을 분해하는 효소의 결핍으로 인해 나타나는데, 보통 100,000명중 1명꼴로 나타나며 열성 질환으로 유전된다. 리소좀 축적 질환은 이렇게 분해 작용을 하는 특정 효소가 결핍되었거나 그 양이 매우 적을 때 나타나며, 이렇게 분해 효소가 결핍되었을 때 과량의 물질이 분해되지 않고 축적되어 결국 세포의 기능에도 문제를 일으키게 되는 것이다. 다른 많은 유전 질환들과 마찬가지로 리소좀 축적 질환은 부모로부터 유전된다. 또한 각각의 질환은 각기 다른 효소를 번역하는 서로 다른 유전자의 변이에 의해 발생한다. 이러한 질병의 원인이 되는 효소들은 대개 비슷한 생화학적 특성을 가지며, 모든 리소좀 축적 질환들은 리소좀 내 비정상적인 물질 축적에 의해 발생한다. 현재 알려져 있는 대표적인 리소좀 축적 질환으로는 니만-피크병 (Niemann-Pick disease), 파브리병 (Fabry's disease), 고셰병 (Gaucher disease), 헌터증후군 (Hunter syndrome), 마로토 라미 증후군 (Maroteaux-Lamy syndrome) 등과 같은 약 50여종의 질환이 알려져 있다
리소좀 축적 질환 중 하나로 알려진 파브리병(Fabry's disease)은 리소좀에 존재하는 가수분해 효소인 알파 갈락토시다제 A(alpha-galactosidase A)의 효소 활성 결핍 또는 부족에 의한 결과로 나타나는 당지질(glycosphingolipid)의 선천성 대사이상의 일종이다.
알파 갈락토시다제 A는 Gb3 (globotriaosylceramide)를 락토실세라마이드(lactosylceramide)로 분해하는 효소로서, 상기 효소의 이상에 의해 혈관벽과 신체의 다양한 부위에 Gb3가 비정상적으로 축적됨으로써, 파브리병이 발병되는 것으로 알려져 있다.
리소좀 축적 질환을 치료하기 위한 방법으로 대표적으로는 효소-대체 요법 (ERT: enzyme-replacement therapy)이 있으며 관련된 많은 연구가 진행되고 있다 (Frances M. Platt et al., J Cell Biol. 2012 Nov 26;199(5):723-34). 특히 리소좀 축적 질환은 특정 효소의 유전적 결함으로 인해 생기는 병이므로, 결함이 있는 효소의 보충치료가 필수적이다. 효소 보충 치료는 리소좀 축적 질환에서 표준이 되는 치료로서, 부족한 효소를 보충하는 것을 통해 기존의 증상이 완화되거나 질환의 진행을 늦추는 효과를 볼 수 있다.
그러나, 이러한 치료 효과를 나타내는 단백질은 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고, 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되므로, 혈중 농도 및 활성을 유지하기 위해서는 환자에게 자주 투여해야 한다.
그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 치료학적 효소 류의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 치료학적 효소 류의 지속성 제제는 치료학적 효소 류의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 활성이 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
목적하는 질병에 대한 치료 효과를 가지는 치료제로서, 생체 내에서 안정하게 지속성이 증가되면서 융합된 단백질의 활성이 유지되는 치료제의 개발이 필요하다.
본 발명의 하나의 목적은 하기 화학식 1으로 표시되는, 효소 융합단백질을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018016487-appb-I000001
여기서, X 및 X'은 치료학적 효소로 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 효소이고,
L 및 L'은 링커로, 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 링커이며;
F는 면역글로불린 Fc 영역이며;
|은 공유 결합이고;
:는 공유 또는 비공유 결합임.
본 발명의 다른 목적은 상기 효소 융합 단백질을 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disorder, LSD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 효소 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 상기 배양물로부터 효소 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 효소 융합단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 이량체의 치료학적 효소를 포함하는 융합단백질에 관한 것으로, 상기 치료학적 효소에 면역글로불린 Fc 영역이 융합되어 치료학적 효소의 안정성이 높아지고, 신장에 의한 효소 제거 메커니즘이 감소된, 효소 융합단백질에 관한 것이다. 본 발명의 효소 융합단백질은 증가된 지속시간에 의해 환자에게 유용하게 이용될 수 있으며, 이량체의 치료학적 효소를 포함함으로써, 제조 단계를 감소시킬 수 있어 생산 비용의 절감을 꾀할 수 있다.
도 1은 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질의 활성을 측정한 도이다.
도 2는 아갈시다제 베타 및 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질의 in vitro 효소 활성을 비교한 도이다.
도 3은 아갈시다제 베타 및 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질의 in vitro 세포내 흡수 활성을 비교한 도이다.
도 4는 아갈시다제 베타 및 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질의 약물 동태를 비교한 도이다.
본 발명을 구현하는 하나의 양태는 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역이 융합된 효소 융합단백질이다.
하나의 구체예에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 효소 융합단백질은 하기 화학식 1으로 표시되는, 효소 융합단백질인 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018016487-appb-I000002
여기서, X 및 X'은 치료학적 효소로 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 효소이고,
L 및 L'은 링커로, 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 링커이며;
F는 면역글로불린 Fc 영역이며;
|은 공유 결합이고;
:는 공유 또는 비공유 결합임.
앞선 구체예에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 치료학적 효소는 비공유 결합을 통해 이량체를 형성하는 것인, 효소 융합단백질인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 치료학적 효소는 서로 반평행(anti-parallel)으로 이량체를 형성한 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 효소 융합단백질은 Fc 영역이 융합되지 않은 치료학적 효소에 비해 안정성이 증가되고, 리소좀 수용체에 대한 결합력이 감소된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 효소는 베타글루코시다제 (beta-glucosidase), 알파 갈락토시다제 (alpha-galactosidase), 베타 갈락토시다제 (beta-galactosidase), 이두로니다제 (iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제 (Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제 (acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제 (acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제 (acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제 (galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 (arylsulfatase) A, B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, B, 헤파린-N-설파타제 (heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제 (alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제 (beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 (N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제 (alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제 (butyrylcholinesterase), 키티나제 (Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 리파아제 (lipase), 우리카제 (Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제 (Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제 (neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 효소는 알파 갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 또는 베타 갈락토시다제 (beta-galactosidase)인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 천연형 면역글로불린 Fc 영역에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 Fc 영역의 2번째 아미노산이 프롤린으로 치환되거나; 71번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나; 또는 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 사슬 교환이 일어나지 않는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 (a) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인; (b) CH1 도메인 및 CH2 도메인; (c) CH1 도메인 및 CH3 도메인; (d) CH2 도메인 및 CH3 도메인; 및 (e) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역 또는 힌지 영역의 일부와의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 단량체(monomer) 형태인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 일부 아미노산이 제거되거나, 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가되거나, 보체결합부위가 제거되거나 또는 ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 면역글로불린 Fc 단편인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM으로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 면역글로불린 IgG4 Fc 영역의 힌지 영역이 IgG1 힌지 영역으로 치환된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 효소 융합단백질로서, 상기 효소 융합단백질은 서열번호 13로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 효소 융합단백질을 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disorder, LSD) 의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
하나의 구체예에 따른 조성물로서, 상기 리소좀 축적 질환은 뮤코다당체침작증 (mucopolysaccharidosis, MPS), 글리코겐 축적병(Glycogen storage disease), 스핑고지질증 (sphingolipidosis), 니만-피크병 (Niemann-Pick disease), 파브리병 (Fabry's disease), 고셰병 (Gaucher disease), 헌터증후군 (Hunter syndrome), 및 마로토 라미 증후군 (Maroteaux-Lamy syndrome)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 조성물로서, 상기 조성물은 효소의 리소좀 수용체에 대한 결합력을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 효소 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 효소 융합단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
하나의 구체예에 따른 효소 융합단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계, 및 상기 배양물로부터 효소 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-methylglycine) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.
알라닌 A 아르기닌 R
아스파라긴 N 아스파르트산 D
시스테인 C 글루탐산 E
글루타민 Q 글리신 G
히스티딘 H 이소류신 I
류신 L 리신 K
메티오닌 M 페닐알라닌 F
프롤린 P 세린 S
트레오닌 T 트립토판 W
티로신 Y 발린 V
본 발명을 구현하는 하나의 양태는 하기 화학식 1으로 표시되는, 효소 융합단백질을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018016487-appb-I000003
여기서, X 및 X'은 치료학적 효소로 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 효소이고,
L 및 L'은 링커로, 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 링커이며;
F는 면역글로불린 Fc 영역이며;
|은 공유 결합이고;
:는 공유 또는 비공유 결합임.
본 발명에서 용어, “효소 융합단백질”은 치료학적 효소에 면역글로불린 Fc 영역이 융합된 것으로, 면역글로불린 Fc 영역의 융합으로 인해, 면역글로불린 Fc 영역과 융합되지 않은 치료학적 효소에 비하여, 치료학적 효소의 활성은 유지되면서도 리소좀 수용체에 대한 결합력이 감소되어, 혈중 반감기가 증가되는 것일 수 있다. 본 발명의 효소 융합단백질은 효소 대체 요법 (enzymatic replacement therapy, ERT)의 약물로서 사용될 수 있다. 상기 효소 대체 요법은 질환의 원인이 되는 결핍 또는 부족 효소를 보충함으로써, 저하된 효소 기능의 회복을 통해 질병을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명자들은 치료학적 효소 류의 혈중 반감기를 증가시키기 위해 면역글로불린 Fc 영역과의 융합단백질을 제작하였다. 여기서 Fc 영역은 당화를 억제하기 위해 잠재적인 당화 서열을 치환시키고, 추가적으로 IgG4 Fc의 hinge 서열을 치환시켜 사슬 교환 (chain exchange)이 억제된 IgG4 Fc 유도체를 사용하였다.
또한, 본 발명의 효소 융합단백질을 제조하는 데 있어서, 면역글로불린 Fc 영역과 융합되는 치료학적 효소가 이량체, 특히 반평행(anti-parallel) 형태로 연결된 이량체를 형성할 경우, 효소의 활성을 유지하면서도 체내 지속성이 증가될 뿐만 아니라, 상기 효소 융합단백질의 제조 단계를 줄일 수 있어, 효율적인 생산이 가능한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 효소 융합단백질은 Fc 영역이 융합되지 않은 치료학적 효소에 비해 안정성이 증가되면서도 효소 활성을 유지할 수 있고, 생산 비용이 절감되는 장점을 갖는다.
본 발명의 용어, “치료학적 효소”는, 효소의 부족, 결핍, 기능 이상 등에 의해 발병되는 질병을 치료하기 위한 효소로서, 효소 대체 요법 (enzyme replacement therapy), 투여 등을 통해 상기 질병을 가진 개체를 치료할 수 있는 효소를 의미한다. 구체적으로, 리소좀 효소의 부족 또는 결핍 등으로 인해 발병하는 리소좀 축적 질환의 치료를 위한 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 효소 융합단백질에 포함될 수 있는 치료학적 효소는 특별히 제한되지 않으며, 융합되지 않은 형태의 치료학적 효소보다 생체 내 지속 시간을 늘려 이점을 얻을 수 있는 치료학적 효소이면 본 발명의 효소 융합단백질에 포함될 수 있다. 본 발명의 한 실시 형태에서 상기 효소 융합단백질은 치료학적 효소의 융합단백질이다.
본 발명의 효소 융합 단백질에 포함되는 치료학적 효소는 비공유 결합을 통해 이량체를 형성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 치료학적 효소는 융합단백질이 형질전환체에서 발현되어 면역글로불린 Fc영역이 이량체(dimer)를 형성할 때, 치료학적 효소도 이량체 (dimer)를 형성하는 것일 수 있다.
이러한 치료학적 효소의 이량체는 서로 동일한 2개의 효소가 이량체를 형성한 것일 수도 있고, 또는 서로 상이한 2개의 효소가 이량체를 형성한 것일 수도 있으며, 상기 이량체를 구성하는 효소는 체내에서 목적하는 활성을 갖는 이상, 구체적인 종류에 제한되지 않는다.
한편, 상기 이량체를 구성하는 치료학적 효소는 서로 연결되는 방향에 따라, 평행 이량체 (parallel dimer) 또는 반평행 이량체 (anti-parallel dimer)일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서는, 치료학적 효소인 알파 갈락토시다제가 면역글로불린 Fc 영역과 융합되어 발현된 융합단백질을 제조하였으며, 상기 융합단백질의 면역글로불린 Fc 영역이 이량체(dimer)를 형성하면서 알파 갈락토시다제가 비공유 결합을 통해 반평행 이량체를 형성하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 융합단백질이 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 형태에서도 효소의 활성을 유지하는 것을 확인하였다 (실시예 2).
또 다른 실시예에서는 알파 갈락토시다제가 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 융합 단백질과 Fc 영역이 융합되지 않은 아갈시다제 베타를 비교하여, Fc 영역과의 융합에도 불구하고 in vitro 효소 활성 및 세포내 흡수 활성을 유지하는 것을 확인하였으며(실시예 2 및 3), Fc 영역과의 융합에 의해 약물 동태가 우수한 것을 확인하였다 (실시예 4).
본 발명의 용어, “평행 이량체(parallel dimer)”는 각각의 단량체가 이량체를 형성할 때 각각의 단량체의 아미노산 서열의 N-말단과 C-말단이 같은 방향으로 이량체를 형성하는 것을 의미한다. 이때 이량체의 형성은 비공유결합 또는 공유결합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “반평행 이량체(anti-parallel dimer)”는 각각의 단량체가 이량체를 형성할 때, 각각의 단량체의 아미노산 서열의 N-말단과 C-말단이 서로 다른 방향으로 이량체를 형성하는 것을 의미한다. 이때 이량체의 형성은 비공유결합 또는 공유결합일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
다시 말해, 본 발명의 효소 융합단백질에서, (i) 하나의 치료학적 효소(X)의 N-말단과 다른 하나의 치료학적 효소(X')의 N-말단이 동일한 방향으로 이량체를 형성하거나, (ii) 하나의 치료학적 효소(X)의 C-말단과 다른 하나의 치료학적 효소(X')의 C-말단이 동일한 방향으로 이량체를 형성하거나, (iii) 하나의 치료학적 효소(X)의 N-말단과 다른 하나의 치료학적 효소(X')의 C-말단이 동일한 방향으로 이량체를 형성하거나, 또는 (iv) 하나의 치료학적 효소(X)의 C-말단과 다른 하나의 치료학적 효소(X')의 N-말단이 동일한 방향으로 이량체를 형성할 수 있다. 상기 (i) 및 (ii)의 경우를 평행 이량체, 상기 (iii) 및 (iv)의 경우를 반평행 이량체라고 하며, 상기 이량체의 형성은 공유 결합 (covalent bond) 또는 비공유 결합 (non-covalent bond)에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 이량체의 형성에 있어서, 평행 또는 반평행 이량체 형성은 면역글로불린 Fc 영역이 이량체를 형성함에 따라 이에 연결된 단량체의 알파 갈락토시다제 A가 공유 또는 비공유 결합을 통해 이량체를 형성하는 것일 수 있다
본 발명의 반평행 이량체 형태의 치료학적 효소를 포함하는 융합 단백질은 이를 제조하는 과정에 있어서, 제조 단계를 감소시켜 생산비용을 절감시킬 수 있고, 생체내에서 pH 변화에 의한 이량체 형태의 불안정성을 감소시키면서 효소 활성 유지할 수 있는 우수한 장점이 있다.
본 발명의 상기 치료학적 효소는 베타글루코시다제 (beta-glucosidase), 알파 갈락토시다제 (alpha-galactosidase), 베타 갈락토시다제 (beta-galactosidase), 이두로니다제 (iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제 (Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제 (acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제 (acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제 (acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제 (galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 (arylsulfatase) A, B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, B, 헤파린-N-설파타제 (heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제 (alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제 (beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 (N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제 (alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제 (butyrylcholinesterase), 키티나제 (Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 리파아제 (lipase), 우리카제 (Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제 (Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제 (neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료학적 효소일 수 있고, 사람 유래의 효소일 수 있으나, 리소좀 축적 질환에 대한 치료 효과를 가지는 치료학적 효소라면, 효소의 유래나 종류의 제한 없이 본 발명에 포함될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 효소는 알파 갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 또는 베타 갈락토시다제 (beta-galactosidase)일 수 있다.
본 발명의 용어, “알파 갈락토시다제 (alpha galactosidase) A"는 비장, 뇌, 간 등의 리소좀에 존재하는 효소로서, 당지질과 당단백에서 끝 알파 갈락토실 (galactosyl) 모이어티를 가수분해하는 효소로서, 호모다이머릭 (homodimeric) 당단백이다. 구체적으로, 상기 알파 갈락토시다제 A는 세라마이드 trihexoside를 가수분해하고, 갈락토스와 포도당으로 melibiose의 가수분해를 촉매하는 것으로 알려져 있으며, 특히, 리소좀 축적 질환인 파브리병(Fabry's disease)와 연관된 것으로 알려져 있다.
본 발명에서, 상기 알파 갈락토시다제 A는 재조합 형태인 아갈시다제 알파 (agalidase alpha) 또는 아갈시다제 베타 (agalsidae beta)와 혼용되어 사용될 수 있으며, 이와 동등한 활성을 갖고 리소좀 축적 질환에 치료 효과를 나타내는 효소인 한 서열이나 유래, 제법 등에 제한 없이 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 알파 갈락토시다제는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있고, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 치료학적 효소는 천연형 효소일 수 있으며, 상기 천연형 효소의 일부로 구성된 단편, 혹은 일부 아미노산의 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난, 치료학적 효소의 아날로그 (analog) 역시 천연형 치료학적 효소와 동등한 활성을 갖는 한, 본 발명에 제한 없이 포함된다.
또한, 상기 치료학적 효소의 아날로그는 천연형 치료학적 효소의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가된 것을 모두 포함한다.
상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "단편"은 천연형 치료학적 효소 또는 천연형 치료학적 효소의 아날로그의 아미노 말단 혹은 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 제거된 형태를 말한다. 치료학적 효소의 활성을 갖는 한, 단편의 크기나 제거되는 아미노산의 종류에 관계없이 본 발명의 범주에 포함된다.
상기 치료학적 효소 아날로그는 해당 치료학적 효소의 바이오시밀러와 바이오베터 형태를 포함하는데, 바이오시밀러의 예를 들자면 공지 치료학적 효소와 발현 숙주의 차이, 당화의 양상과 정도의 차이, 특정 위치의 잔기가 해당 효소의 기준 서열에 비추어 볼 때 100% 치환이 아닌 경우, 그 치환 정도의 차이도 본 발명의 효소 융합단백질에서 사용할 수 있는 바이오시밀러 효소에 해당한다. 상기 치료학적 효소는 당업계에서 알려진 방법으로 준비 또는 제조할 수 있으며, 구체적으로, 유전자 재조합을 통해 동물세포, 대장균, 효모, 곤충세포, 식물세포, 살아있는 동물 등에서 생산할 수 있으며 생산 방법은 이에 한정되지 않으며, 상업적으로 이용 가능한 치료학적 효소를 구입하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 치료학적 효소 또는 이의 아날로그와 60%, 70%, 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 치료학적 효소는 재조합 기술에 의해 미생물로부터 수득하거나, 상업적으로 이용가능 한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "상동성"이란 야생형(wild type) 아미노산 서열 및 야생형 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행한다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다. 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
상기 치료학적 효소 또는 이의 유도체의 서열 및 이를 코딩하는 염기서열의 정보는 NCBI 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다.
상기 치료학적 효소는 당업계에서 알려진 방법으로 준비 또는 제조할 수 있으며, 구체적으로, 동물세포 발현 벡터를 삽입한 동물세포를 배양하여, 배양물로부터 정제할 수 있고, 또는 상업적으로 이용 가능한 효소를 구입하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 효소 융합단백질은 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역이 펩타이드 링커를 통해 융합된 것일 수 있다. 즉, 상기 화학식 1의 L 또는 L'은 펩타이드 링커일 수 있으나, 면역글로불린 Fc 영역과 치료학적 효소를 융합할 수 있는 한, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 펩타이드 링커는 1개 이상의 아미노산을 포함할 수 있으며, 예컨대 1개부터 1000개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 당업계에 알려진 임의의 펩타이드 링커, 그 예로 [GS]x 링커, [GGGS]x 링커 및 [GGGGS]x 링커 등을 포함하며, 여기서 x는 1 이상의 자연수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 펩타이드 링커는 10 내지 50개, 보다 구체적으로, 20 내지 40개 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 목적상 치료학적 효소의 활성을 유지하면서 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역을 연결할 수 있는 한, 펩타이드 링커가 치료학적 효소 및 면역글로불린 Fc에 융합되는 위치는 제한되지 않는다. 구체적으로, 치료학적 효소 및 면역글로불린 Fc 영역의 양 말단, 보다 구체적으로, 치료학적 효소의 C-말단, 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, “N-말단” 또는 “C-말단”은, 각각 단백질의 아미노 말단 및 카르복실 말단을 의미하는 것으로, 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, N-말단 또는 C-말단의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 N-말단 또는 C-말단 주위의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20 번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 치료학적 효소인 알파 갈락토시다제와 링커-IgG4를 유전자 수준에서 융합되도록 합성하여, 치료학적 효소의 C-말단에 IgG4의 N-말단이 융합된 융합단백질 (서열번호 13)을 제조하고, 상기 융합단백질이 형질도입된 형질전환체에서 발현되는 것을 확인하였다 (실시예 2).
본 발명에서, 상기 펩타이드 링커는 단량체의 면역글로불린 Fc 영역이 형성하는 이량체 면역글로불린 Fc 영역에 각각 연결되는 것일 수 있으며, 각 면역글로불린 Fc 영역에 연결되는 링커는 서로 동일하거나, 다른 종류일 수 있다.
본 발명의 효소 융합단백질의 일 구성 요소(moiety)인 면역글로불린 Fc 영역은 단량체의 면역글로불린 Fc 영역이 이량체를 형성한 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및/또는 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 포함하는 부위를 의미한다. 본 발명의 목적상 이와 같은 Fc 영역은 변이된 힌지영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 천연형 면역글로불린 Fc 영역에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
면역글로불린 Fc 영역은 약물을 제조하는데 있어서 캐리어로 이용되는 물질로, 단백질을 안정화하고 신장에서 제거되는 것을 방지하기 위하여, 최근에는 면역글로불린 Fc 영역을 이용한 융합단백질 연구가 활발히 진행되고 있다. 면역글로불린은 혈액의 주요 구성성분으로 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE와 같이 5가지 종류가 있는데 융합단백질 연구에 자주 사용되는 종류는 IgG로 이는 IgG1~4의 4가지 subtype으로 분류된다. 면역글로불린 Fc 영역을 이용한 융합단백질은 단백질의 크기를 증가시켜 신장에서 제거되는 것을 방지하고, FcRn 수용체와 결합하여 세포 내로 endocytosis 및 recycling을 통해 혈중 반감기를 증가시키는 역할을 하게 된다.
이러한 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 영역을 포함할 수 있으며, 상기 힌지 영역으로 인하여 단량체인 면역글로불린 Fc 영역이 이량체를 형성할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
구체적으로, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 및 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 예로, 상기 힌지 영역은 하기의 아미노산 서열을 갖는 힌지 서열 중 일부가 결실 또는 변이된 것일 수 있다.
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro (서열번호 14)
구체적으로, 상기 힌지 영역의 일부가 결실되어, 하나의 시스테인 (Cys) 잔기만을 포함하도록 변이된 것일 수 있고, 사슬 교환 (chain exchange)에 관여하는 세린 (Ser) 잔기를 프롤린 (Pro) 잔기로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 힌지 서열의 2번째 세린 잔기가 프롤린 잔기로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 힌지 영역 또는 변이된 힌지 영역을 포함함으로써, Fc 영역에서의 사슬 교환 및 단량체 형성이 일어나지 않을 뿐만 아니라, 융합된 치료학적 효소의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 단량체(monomer)의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 화학식 1에서 F인 면역글로불린 Fc 영역은 단량체의 형태로 펩타이드 링커를 통해 단량체의 치료학적 효소와 융합 발현되는 것일 수 있다. 상기 단량체의 면역글로불린 Fc 영역이 이량체를 형성함에 따라 상기 면역글로불린 Fc 영역에 융합된 치료학적 효소 역시 비공유 결합에 의해 이량체를 형성할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
약물의 캐리어로서 이용되는 면역글로불린 Fc 영역은 의도하지 않은 면역반응을 일으킬 수 있는 단점이 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 항체 의존적 세포 독성 (ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 또는 보체-의존적 세포 독성 (CDC, complement-dependent cytotoxicity)과 같은 효력 기능 (effector function)을 갖게 된다. 이러한 기능은 면역글로불린 Fc 영역의 Fc 수용체와의 결합, 보체 결합, 또는 Fc 영역의 당화 (glycosylation)을 통하여 일어나게 된다. 또한, Fc 그 자체의 생체 내 불안정성이 발생하기 쉽다.
본 발명자들은 면역글로불린 Fc 영역 내 힌지 영역의 서열을 치환함으로써, 이러한 문제점을 해결하고자 하였다. 구체적으로, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 당화를 조절하기 위해 잠재적 당화 서열이 치환된 것이거나, 또는, 사슬 교환에 관여하는 서열이 치환된 것일 수 있고, 또는, 두 경우 모두에 해당할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 효소 융합단백질의 면역글로불린 Fc 영역은 사슬 교환이 일어나지 않는 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은, 사슬 교환 및 N-글리코실화를 방지하기 위해, 서열번호 8의 면역글로불린 Fc 영역의 2번째 아미노산 및/또는 71번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 서열번호 8의 면역글로불린 Fc 영역의 1) 2번째 아미노산 (세린)이 프롤린으로 치환되거나, 2) 71번째 아미노산 (아스파라긴)이 글루타민으로 치환되거나, 또는 3) 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환된 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 9의 아미노산 서열로 표현되는 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 언급된 변이 외에도 치료학적 효소의 안정성을 증대키시는, 약물의 캐리어로서 적합한 변이를 함유할 수 있다.
구체적으로, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 면역글로불린 IgG4 Fc의 힌지 영역이 IgG1 힌지 영역으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 면역글로불린 Fc의 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환하여, 사슬 교환 및 N-글리코실화가 감소되도록 하였다 (실시예 1).
본 발명의 용어, “사슬 교환 (chain exchange)”은 IgG4 Fc를 단백질 융합체의 캐리어로 사용시, 생체내에 존재하는 IgG4와 하이브리드를 형성하거나 단량체로 존재하여 원래의 구조를 변경시켜 치료학적으로 낮은 활성을 갖는 구조를 갖게 되는 문제를 의미하는 것으로, 단백질이 융합된 융합단백질인, 단백질 융합체를 치료용 목적으로 사용시 큰 어려움이 있는 것으로 보고되었다 (van der Neut Kolfschoten, et at., Science, 317:1554-1557. 2007).
또한, 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변이가 일어난 것을 의미한다.
예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황산화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
또한, 상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 것일 수 있다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거, 또는 비당쇄화된 된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명의 용어, "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 더 구체적인 실시 형태에서는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 더 구체적인 실시 형태에서는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 보다 더 구체적인 실시 형태에서는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 더욱 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역이며, 더욱 더 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이며, 가장 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9이고, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 7일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
또한, 본 발명의 치료학적 효소 또는 효소 융합단백질은 N-말단 및/또는 C-말단이 변형되지 않은 것일 수 있으나, 생체 내의 단백질 절단 치료학적 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 및/또는 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태 역시 본 발명에 따른 치료학적 효소 또는 효소 융합단백질의 범주에 포함된다. C-말단이 변형되지 않은 경우, 본 발명에 따른 치료학적 효소 또는 효소 융합단백질의 말단은 카르복실기를 가지나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
특히, 화학적으로 합성한 단백질의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화 (acetylation) 및/또는 C-말단을 아미드화 (amidation)할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 따로 가리키는 바가 없으면, 본 발명에 따른 "효소" 또는 “융합단백질”에 대한 명세서 상세한 설명이나 청구 범위의 기술은 해당 효소 또는 융합단백질은 물론이고, 해당 효소 또는 융합단백질의 염(예컨대, 상기 융합단백질의 약학적으로 허용 가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함하는 범주에도 적용된다. 따라서 명세서에 "효소" 또는 "융합단백질" 이라고만 기재되어 있더라도 해당 기재 내용은 그 특정 염, 그 특정 용매화물, 그 특정 염의 특정 용매화물에도 마찬가지로 적용된다. 이러한 염 형태는 예를 들어 약학적으로 허용되는 임의의 염을 사용한 형태일 수 있다. 상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서，과도한 독성，자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.
본 발명의 용어, "약학적으로 허용되는 염" 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산， 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 용어, "용매화물"은 본 발명에 따른 효소, 융합단백질 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.
본 발명의 효소 융합단백질은 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 치료학적 효소인 알파 갈락토시다제 (alpha-galactosidase)를 펩타이드 링커-면역글로불린 Fc와 융합된 형태로 발현하는 재조합 벡터를 제조하여, 이를 CHO 세포주에서 발현시켜 제조하였다 (실시예 1 내지 2).
그러나, 본 발명의 효소 융합단백질은 상기 실시예에서 기술된 방법 외에도, 공지된 다른 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 효소 융합단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 효소 융합단백질은 리소좀 축적 질환에 대한 치료 효과를 나타내는 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역을 융합시켜, 치료학적 효소의 활성을 유지하면서, 체내 안정성을 높임으로써 치료학적 효소의 반감기를 증가시킬 수 있다. 특히, 변이된 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 치료학적 효소는, 사슬 교환 및 당화가 약화되어, Fc 영역과 융합되지 않은 치료학적 효소에 비해 리소좀 수용체에 대한 결합력이 낮아, 높은 지속성을 가질 수 있고, 이는 리소좀 축적 질환의 치료에 있어, 유용한 효과를 나타내는 것이다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 효소 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disorder, LSD) 의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 치료학적 효소의 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물의 효소 융합단백질은 알파 갈락토시다제 A(alpha-galactosidase)와 면역글로불린 Fc 영역이 융합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 융합단백질은 면역글로불린 Fc 영역이 이량체를 형성할 때 융합단백질 내의 치료학적 효소인 알파 갈락토시다제 A 역시 이량체를 형성하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 알파 갈락토시다제 A의 이량체는 상호 비공유 결합에 의한 이량체 형성이며, 특히, 서로 반평행의 방향으로 이량체를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 용어, “리소좀 (lysosome)은 세포질에 존재하는 소기관 중 하나로서, 가수 분해 효소를 많이 포함하고 있어서, 체내에서 거대 분자, 세균 등의 이물질을 분해하여, 상기 분해된 산물이 세포의 다른 부분에서 재활용되도록 돕는 소기관이다. 상기 리소좀의 기능은 다수의 효소에 의해 수행되는데, 변이나 부족 등으로 인하여 특정 효소가 기능을 상실하게 되면, 리소좀의 분해 기능이 상실되는 결과를 낳게 되어, 결국 분해되어야 할 거대 분자 등이 세포 내에 축적되어 세포의 손상 등을 유발하며, 이로 인하여 질병이 발병하게 된다.
본 발명의 용어, “리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD)”은, 상기와 같은 리소좀 기능의 상실로 인한 희귀 유전병을 의미하며, 결함이 있는 효소를 이용한 효소 대체 요법 (enzymatic replacement therapy)가 필수적이다. 상기 리소좀 축적 질환은 뮤코다당체침작증 (mucopolysaccharidosis, MPS), 글리코겐 축적병(Glycogen storage disease), 스핑고지질증 (sphingolipidosis), 니만-피크병 (Niemann-Pick disease), 파브리병 (Fabry's disease), 고셰병 (Gaucher disease), 헌터증후군 (Hunter syndrome), 및 마로토 라미 증후군 (Maroteaux-Lamy syndrome) 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 용어, "파브리병(Fabry's disease)"은 리소좀 축적 질환 중 하나이며, 성염색체 열성으로 유전하며, X염색체가 불활성화되어 발생한다. 리소좀에 존재하는 가수분해 효소인 알파 갈락토시다제 A(alpha-galactosidase A)의 활성이 결핍되거나, 부족하여 나타나는 당지질(glycosphingolipid)의 선천성 대사이상이다. 상기 알파 갈락토시다제 A의 이상에 의해 혈관벽과 신체의 다양한 부위, 예를 들어, 피부, 신장, 심장, 신경계에 Gb3 (globotriaosylceramide)가 비정상적으로 축적되며, 혈류와 영양 공급 감소에 영향을 준다고 알려져 있다. 땀감소증, 선단지각이상증, 심한 통증, 혈관각화종, 각막혼탁, 심장허혈, 심근경색증, 신장이상 등의 증상이 나타나며, 결국 신장이 제 기능을 못하게 되어 사망하기에 이른다.
본 발명에서 용어 "예방"은 상기 효소 융합단백질 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 목적하는 질환, 리소좀 축적 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 효소 융합단백질 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 목적하는 질환, 예컨대 리소좀 축적 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 조성물이 생체 내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있다. 그러나 경구 투여 시 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 융합단백질의 바람직한 전체 용량은 하루에 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 mg 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 결합체의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 조성물의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 효소 융합단백질의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성 성분인 치료학적 효소의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 효소 융합단백질은 혈중 지속성과 생체 내 활성이 매우 우수하므로, 본 발명의 효소 융합단백질을 포함하는 약학적 조성물의 투여 량, 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 담체는 비자연적으로 존재하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 그 외에도 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 효소 융합단백질은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타티온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트제, 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers) 등이 약제로 사용될 수 있다.
이에 제한되지 않으나, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 상기 성분 (유효성분)을 0.01 내지 99% 중량 대 부피로 함유할 수 있다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 본 발명에 따른 효소 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 효소 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이에 제한되는 것은 아니나, 치료학적 효소를 코딩하는 부분과 펩타이드 링커-면역글로불린 Fc 영역을 코딩하는 부분이　연결된 형태의 폴리뉴클레오티드가 될 수 있고, 구체적으로, 치료학적 효소의 C-말단에 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단이 GGGGS 링커를 통해 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.　보다 구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 서열을 포함할 수 있으나, 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역의 융합단백질을 코딩할 수 있는 이상, 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어 "재조합 벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 펩티드, 가령 효소 융합단백질을 발현시킬 수 있도록 목적 펩티드, 가령 효소 융합단백질이 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 제조물을 의미한다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 하여 구축될 수 있다.
상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 재조합 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 재조합 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용하여 제작될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 본 발명의 효소 융합단백질을 생산하기 위해 숙주세포를 형질전환시키는데 사용된다. 또한 본 발명의 일부인, 이러한 형질전환 세포는 본 발명의 핵산 단편 및 벡터의 증식에 사용되거나, 본 발명의 효소 융합단백질의 재조합 생산에 사용된 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다.
본 발명의 용어, "형질전환"은 표적 단백질 (예를 들어, 치료학적 효소, 효소 융합단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명에서 목적하는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 발명에 적합한 숙주는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(Sf9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 본 발명의 목적상, 효소 융합단백질을 발현 및 생산할 수 있는 한, 제한되지 않으나, 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포일 수 있다.
본 발명을 구현하는 다른 양태는 본 발명에 따른 효소 융합단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 제조방법은 (a)형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 배양물로부터 효소 융합단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 형질전환체의 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 숙주세포 배양의 요건을 충족해야 한다. 숙주세포의 생장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다.
사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 사카로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.
마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양 도중에 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예: 공기)를 주입한다.
본 발명에 따른 형질전환체의 배양은 보통 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 또한 배양은 원하는 치료학적 효소 또는 효소 융합단백질의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 지속되는데, 이러한 목적으로 배양은 보통 10 내지 160시간 동안 지속될 수 있다.
전술한 바와 같이 숙주세포에 따라 적절한 배양 조건을 조성해주면 본 발명에 따른 형질전환체는 인슐린 아날로그를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주세포의 특징에 따라 생산된 치료학적 효소 또는 효소 융합단백질은 숙주세포의 세포질 내, 원형질막 공간(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다.
숙주세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예: 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(예: 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 적용할 수 있다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 효소 융합단백질 또는 이를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 효소 융합단백질은 리소좀 축적 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 치료학적 효소를 포함하므로, 이를 포함하는 효소 융합단백질, 또는 상기 효소 융합단백질을 함유하는 약학적 조성물의 투여로, 리소좀 축적 질환이 의심되는 개체에서 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 용어, “개체”는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disorder, LSD)이 의심되는 개체로서, 상기 리소좀 축적 질환 의심 개체는 해당 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나, 본 발명의 효소 융합단백질 또는 이를 포함하는 상기 조성물로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명의 방법은 효소 융합단백질을 포함하는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
한편, 이에 제한되지 않으나, 상기 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 방법은 하나 이상의 리소좀 축적 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 화합물 또는 물질을 투여하는 것을 더 포함하는 병용요법일 수 있다.
본 발명의 용어, "병용"은 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다.
상기 리소좀 축적 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 효소 융합단백질의 투여 용량은 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 μg 내지 500 mg일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하는 또 다른 양태는 상기 효소 융합단백질, 또는 이를 포함하는 조성물을 리소좀 축적 질환에 대한 예방 또는 치료용 약제 (혹은 약학적 조성물)의 제조에 사용하는 용도를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 효소 융합단백질의 제작
본 발명자들은 반평행(anti-parallel) 이량체의 치료학적 효소를 포함하는 효소 융합단백질을 생산하기 위해, 천연형 알파-갈락토시다제 (alpha-galactosidase) 와 링커 (서열번호 10), Fc 면역글로불린 영역(서열번호 7)을 유전자 수준에서 융합하고 발현 벡터에 합성하였다.
구축된 융합단백질의 서열 중 Fc 영역에서 사슬 교환 (chain exchange)과 N-글리코실화 부위 (N-glycosylation site)를 제거하기 위하여 부위 특이적 변이 (site-directed mutagenesis) PCR기법을 이용하였다.
구체적으로, 서열번호 1,2 의 프라이머를 이용하여 사슬 교환에 관여하는 Fc 영역 (서열번호 8)의 2번째 아미노산인 세린 (Serine)을 프롤린 (Proline)으로 대체하였고, 서열번호 3, 4의 프라이머를 이용하여 N-글리코실화가 이 이루어지는 Fc 영역의 71번째 아미노산인 아스파라긴 (Asparagine)을 글루타민 (Glutamine)으로 치환하였다.
Figure PCTKR2018016487-appb-T000001
합성된 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현벡터인 XOGC벡터에 제한효소를 이용하여 삽입하였다. BamHI과 XhoI의 제한효소는 알파 갈락토시다제와 Fc 면역글로불린 영역을 모두 자르지 않는 제한효소이다. 상기 제한효소로 잘려진 알파 갈락토시다제-Fc를 동일한 제한효소로 잘려진 X0GC벡터에 삽입하여 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질을 발현하는 벡터를 완성하였다. 알파 갈락토시다제는 면역글로불린 Fc영역이 이량체를 형성할 때 반평행 이량체를 형성하게 된다.
알파 갈락토시다제-Fc의 DNA 및 단백질 서열은 하기 표 2와 같다. 하기 표 2의 단백질 서열에서 밑줄은 신호서열을, 볼드는 아미노산이 치환된 부분을, 그리고 이탤릭체는 링커를 나타낸다.
Figure PCTKR2018016487-appb-T000002
Figure PCTKR2018016487-appb-I000004
상기 실시예에서 제조된 효소 융합단백질 발현 벡터를 알파 갈락토시다제 -Fc로 명명하였다.
실시예 2: 효소 융합단백질의 in vitro 효소 활성 확인
실시예 2-1: 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질의 제조
상기 실시예에서 제조한 알파 갈락토시다제 -Fc 발현 벡터(pX0GC-alpha galactosidase-Fc)를 CHO-S 세포주에 형질도입하여 알파 갈락토시다제 -Fc 융합 단백질을 대량 생산할 수 있는 세포주를 제조하였다.
구체적으로, 무혈청 배지(FreeStyle CHO Expression Medium, Thermo Fisher사, cat. No. 12651014)를 이용하여 CHO-S 세포를 1L 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask; Corning사, cat. No. 431147)에서 부유배양하며, 배양 용기 내의 세포가 5 × 108 개까지 증식하였을 때, 프리스타일 맥스 (Thermo Fisher사, cat. No. 16447-100)를 이용하여 형질전환시켰다. 즉, 두 개의 튜브에 각각 10mL의 OptiPro SFM(Thermo Fisher사, cat. No. 12309-019)을 넣고, 하나의 튜브에는 500 νg의 DNA를 넣고, 또 하나의 튜브에는 500 νL의 프리스타일 맥스를 넣고 두 용액을 섞어 상온에서 10분간 정치한 후, 미리 새로운 프리스타일 CHO 발현 배지(Thermo Fisher사, cat. No. 12651014)로 교체하여준 세포에 넣어주었다. 상기 세포를 37, 5% CO2, 125 rpm 조건으로 배양기에서 약 96시간 동안 배양하였다.
이 후, 배양 4일 째에 원심분리를 통해 배양 상등액을 회수 한 후, 알파 갈락토시다제-Fc 생산에 따른 효소 활성 변화를 측정하고자, 상기 상등액에서 in vitro 시험관 효소 활성 측정을 진행하였다.
실시예 2-2: 알파 갈락토시다제-Fc의 in vitro 효소 활성 확인
알파 갈락토시다제-Fc의 in vitro 효소 활성을 확인하고자, 상기 생산된 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질을 효소 기질로 알려진 pNP-Gal(p-nitrophenyl-a-D-galactopyranoside)과 37℃에서 30분간 온도 평형을 이루도록 하였다. 이 후 기질 용액과 알파 갈락토시다제-Fc를 37℃에서 30분 동안 반응시키고, 이의 흡광도를 측정함으로써 알파 갈락토시다제-Fc의 in vitro 효소 활성을 측정하였다.
그 결과, in vitro 효소 활성 측정으로부터, 알파 갈락토시다제-Fc의 발현량이 1,649 ng/mL임을 확인하였다(도 1). 이와 같은 결과는 본 발명의 효소 융합단백질의 알파 갈락토시다제가 반평행 이량체를 형성하며, 상기 반평행 이량체의 알파 갈락토시다제가 이의 효소 활성을 유의미한 수준으로 유지함을 시사하는 것이다.
실시예 2-3: 알파 갈락토시다제 및 알파 갈락토시다제-Fc의 in vitro 효소 활성 비교
한편, 상기 실시예에서 제조된 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질을 Fc 영역이 결합하지 않은 아갈시다제 베타(Agalsidase beta)와 in vitro 효소 활성을 비교하고자 하였다.
구체적으로, 알파 갈락토시다제-Fc 및 아갈시다제 베타를 효소 기질인 pNP-Gal(p-nitrophenyl-a-D-galactopyranoside)과 37℃에서 30분간 온도 평형을 이루도록 한 후, 기질 용액과 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질을 37℃에서 20분 동안 반응시켰다. 이 후 최종적으로 생성되는 4-Nitrophenol에 대한 흡광도를 측정함으로써 알파 갈락토시다제-Fc 및 아갈시다제 베타의 효소활성을 측정 비교 하였다.
그 결과, 알파 갈락토시다제-Fc 및 아갈시다제 베타의 효소 활성 (specific activity)이 각각 70.9, 67.6 μmol/min/mg 임을 확인하였다(도 2). 이와 같은 결과로부터 알파 갈락토시다제-Fc 융합 단백질이 Fc 영역이 결합하지 않은 효소와 비교하여 95.4 %로 유사한 활성을 갖는 것을 확인하였다. 이는 Fc 영역의 결합에도 본 발명의 알파 갈락토시다제-Fc 융합 단백질은 효소 활성을 상실하지 않는 것을 의미한다.
실시예 3: 알파 갈락토시다제-Fc의 in vitro 세포내 흡수 활성 확인
알파 갈락토시다제는 만노스-6-인산 수용체 (M6PR, mannose-6-phosphate receptor)를 통해 세포에 흡수된 후 작용하는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명자들은 알파 갈락토시다제-Fc의 융합 단백질이 나타내는 세포 흡수 활성을 다음과 같이 확인하였다.
구체적으로, M6PR를 발현하는 것으로 알려진 CCD986SK 세포 (인간 피부 섬유아세포)에 아갈시다제 베타 및 알파 갈락토시다제-Fc 융합 단백질을 각각 처리한 후, 37 ℃에서 세포 내 흡수를 유도하였다. 24시간 후, 세포 내 존재하는 아갈시다제 베타 및 알파갈락토시다제-Fc 융합 단백질을 효소 활성 측정법을 통해 확인하였다.
알파 갈락토시다제-Fc 융합 단백질의 농도와 세포 내 흡수 양간의 관계를 분석한 결과, 최고의 흡수 속도 절반을 나타내는 미하엘리스-멘텐 (Michaelis-Menten) 상수인 Km값은 11.55 nM로 아갈시다제 베타와 (Km =10.92 nM) 유사한 세포 내 흡수활성을 보였다(도 3). 이로부터, Fc 영역의 결합에도 본 발명의 알파 갈락토시다제-Fc 융합 단백질은 세포내 흡수 활성을 상실하지 않는 것을 확인하였다.
실시예 5: 알파갈락토시다제-Fc 융합단백질의 ICR 마우스에서 약물동태 확인
각 군 별 채혈시점당 3 마리의 ICR 마우스 (mouse)에 아갈시다제 베타 (대조군)와 상기 실시예에서 제조한 알파 갈락토시다제-Fc 융합단백질(시험군)의 혈액 내 안정성 및 약물 동력학 계수를 비교하였다.
구체적으로, 대조군과 시험군을 아갈시다제 기준으로 각 1.0 mg/kg씩 정맥 내 및 피하 주사하였다. 대조군 정맥 내 주사 투여군은 주사 후 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2 및 4 시간 후에 채혈하였다. 시험군 정맥 내 주사 군은 주사 후 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216 시간 후에 채혈 하였고, 피하 주사 투여군은 주사 후 0, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192 및 216시간 후에 채혈하였다. 혈청 내 단백질 양은 in vitro 시험관 효소 활성 측정을 통해 정량화하였다.
그 결과, 알파 갈락토시다제-Fc 융합 단백질의 경우 Fc 영역이 결합하지 않은 대조군에 대비하여 혈중 반감기(T1/2), 혈중 최고 약물 농도 (Cmax), AUC(area under curve) 모두 증가하였다. 상기 AUC는 약물 분자에 대한 체내 노출 정도를 나타낸다. (도 4, 표 3). 이로부터, Fc 영역의 결합에 의해 본 발명의 알파 갈락토시다제-Fc 융합 단백질이 투여 경로와 무관하게 높은 혈중 반감기, 혈중 최고 약물 농도 (Cmax), 생체 내 이용률 (AUC)을 나타내는 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2018016487-appb-T000003
같은 결과들은 리소좀 축적 질환에 치료 효과를 갖는 것으로 알려져 있는 치료학적 효소의 한 예인 알파 갈락토시다제의 반감기 증가 및 생체 내 이용률을 증가시킨 본 발명의 새로운 형태의 융합 단백질이 효소 활성을 유지하면서 리소좀 축적 질환의 치료제로서 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (26)

  1. 하기 화학식 1으로 표시되는, 효소 융합단백질:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018016487-appb-I000005
    여기서, X 및 X'은 치료학적 효소로 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 효소이고,
    L 및 L'은 링커로, 각각 독립적으로 동일하거나 다른 종류의 링커이며;
    F는 면역글로불린 Fc 영역이며;
    |은 공유 결합이고;
    :는 공유 또는 비공유 결합임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 치료학적 효소는 비공유 결합을 통해 이량체를 형성하는 것인, 효소 융합단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 치료학적 효소는 서로 반평행(anti-parallel)으로 이량체를 형성한 것인, 효소 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 효소 융합단백질은 Fc 영역이 융합되지 않은 치료학적 효소에 비해 안정성이 증가되고, 리소좀 수용체에 대한 결합력이 감소된 것인, 효소 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 효소는 베타글루코시다제 (beta-glucosidase), 알파 갈락토시다제 (alpha-galactosidase), 베타 갈락토시다제 (beta-galactosidase), 이두로니다제 (iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제 (Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제 (acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제 (acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제 (acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제 (galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 (arylsulfatase) A, B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, B, 헤파린-N-설파타제 (heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제 (alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제 (beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 (N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제 (alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제 (butyrylcholinesterase), 키티나제 (Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 리파아제 (lipase), 우리카제 (Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제 (Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제 (neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase) 로 이루어진 군으로부터 선택되는, 효소 융합단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 효소는 알파 갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 또는 베타 갈락토시다제 (beta-galactosidase)인 것인, 효소 융합단백질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 천연형 면역글로불린 Fc 영역에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 것인, 효소 융합단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 Fc 영역의 2번째 아미노산이 프롤린으로 치환되거나; 71번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나; 또는 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환된 것인, 효소 융합단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 사슬 교환이 일어나지 않는 것인, 효소 융합단백질.
  10. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 (a) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인; (b) CH1 도메인 및 CH2 도메인; (c) CH1 도메인 및 CH3 도메인; (d) CH2 도메인 및 CH3 도메인; 및 (e) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역 또는 힌지 영역의 일부와의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 효소 융합단백질.
  11. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 단량체(monomer) 형태인 것인, 효소 융합 단백질.
  12. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 이루어진 것인, 효소 융합 단백질.
  13. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 일부 아미노산이 제거되거나, 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가되거나, 보체결합부위가 제거되거나 또는 ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거된 것인, 효소 융합단백질.
  14. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것인, 효소 융합단백질.
  15. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 면역글로불린 Fc 단편인 것인, 효소 융합단백질.
  16. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM으로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 것인, 효소 융합단백질.
  17. 제16항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인 것인, 효소 융합단백질.
  18. 제17항에 있어서, 상기 면역글로불린 IgG4 Fc 영역의 힌지 영역이 IgG1 힌지 영역으로 치환된 효소 융합단백질.
  19. 제1항에 있어서, 상기 효소 융합단백질은 서열번호 6으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 것인, 효소 융합단백질.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 효소 융합단백질을 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disorder, LSD) 의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 리소좀 축적 질환은 뮤코다당체침작증 (mucopolysaccharidosis, MPS), 글리코겐 축적병(Glycogen storage disease), 스핑고지질증 (sphingolipidosis), 니만-피크병 (Niemann-Pick disease), 파브리병 (Fabry's disease), 고셰병 (Gaucher disease), 헌터증후군 (Hunter syndrome), 및 마로토 라미 증후군 (Maroteaux-Lamy syndrome)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 조성물은 효소의 리소좀 수용체에 대한 결합력을 감소시키는 것인, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 효소 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 제21항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  25. 제22항의 발현 벡터가 도입된 형질전환체.
  26. (a) 제25항의 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 배양물로부터 효소 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 효소 융합단백질을 제조하는 방법.
PCT/KR2018/016487 2017-12-22 2018-12-21 신규한 구조를 갖는 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도 WO2019125059A1 (ko)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2018388331A AU2018388331A1 (en) 2017-12-22 2018-12-21 Therapeutic enzyme fusion protein having a novel structure and use thereof
EP18891205.9A EP3708661A4 (en) 2017-12-22 2018-12-21 NEW STRUCTURED THERAPEUTIC ENZYME FUSION PROTEIN AND ITS USE
CN201880083193.8A CN111511910A (zh) 2017-12-22 2018-12-21 具有新颖结构的治疗酶融合蛋白及其用途
BR112020012346-3A BR112020012346A2 (pt) 2017-12-22 2018-12-21 proteína de fusão enzimática terapêutica tendo uma nova estrutura e uso da mesma
CA3086474A CA3086474A1 (en) 2017-12-22 2018-12-21 Therapeutic enzyme fusion protein having a novel structure and use thereof
JP2020534256A JP7403455B2 (ja) 2017-12-22 2018-12-21 新規な構造を有する治療学的酵素融合タンパク質及びその用途
NZ765453A NZ765453B2 (en) 2018-12-21 Therapeutic enzyme fusion protein having novel structure and use thereof
EA202091239A EA202091239A1 (ru) 2017-12-22 2018-12-21 Слитый белок на основе терапевтического фермента, имеющий новую структуру, и его применение
SG11202005510SA SG11202005510SA (en) 2017-12-22 2018-12-21 Therapeutic enzyme fusion protein having a novel structure and use thereof
US16/955,525 US20210009984A1 (en) 2017-12-22 2018-12-21 Therapeutic enzyme fusion protein having a novel structure and use thereof
MX2020006635A MX2020006635A (es) 2017-12-22 2018-12-21 Proteína de fusión enzimática terapéutica que tiene una nueva estructura y uso de la misma.
IL275248A IL275248A (en) 2017-12-22 2020-06-09 Fusion protein of a therapeutic enzyme with a new structure and its use
PH12020550927A PH12020550927A1 (en) 2017-12-22 2020-06-17 Therapeutic enzyme fusion protein having novel structure and use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20170178378 2017-12-22
KR10-2017-0178378 2017-12-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019125059A1 true WO2019125059A1 (ko) 2019-06-27

Family

ID=66993643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2018/016487 WO2019125059A1 (ko) 2017-12-22 2018-12-21 신규한 구조를 갖는 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20210009984A1 (ko)
EP (1) EP3708661A4 (ko)
JP (1) JP7403455B2 (ko)
KR (2) KR102588611B1 (ko)
CN (1) CN111511910A (ko)
AR (1) AR113430A1 (ko)
AU (1) AU2018388331A1 (ko)
BR (1) BR112020012346A2 (ko)
CA (1) CA3086474A1 (ko)
EA (1) EA202091239A1 (ko)
IL (1) IL275248A (ko)
MX (1) MX2020006635A (ko)
PH (1) PH12020550927A1 (ko)
SG (1) SG11202005510SA (ko)
TW (1) TW201934753A (ko)
WO (1) WO2019125059A1 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111511910A (zh) 2017-12-22 2020-08-07 韩美药品株式会社 具有新颖结构的治疗酶融合蛋白及其用途
EP3895708A3 (en) * 2019-08-07 2022-01-19 Amicus Therapeutics, Inc. Methods of treating fabry disease in patients having a mutation in the gla gene
EP4229192A1 (en) 2020-10-14 2023-08-23 Denali Therapeutics Inc. Fusion proteins comprising sulfoglucosamine sulfohydrolase enzymes and methods thereof
CN116419759A (zh) * 2020-11-13 2023-07-11 韩美药品株式会社 治疗酶融合蛋白在预防和治疗由法布里病引起或伴有法布里病的神经病中的用途
KR20220065719A (ko) * 2020-11-13 2022-05-20 한미약품 주식회사 치료학적 효소 융합단백질의 파브리병에 기인하거나 동반되는 신장질환 예방 및 치료 용도
KR20230134822A (ko) * 2022-03-15 2023-09-22 주식회사 녹십자 α-갈락토시다제 A의 융합단백질을 포함하는 액상 제제
KR20230134823A (ko) * 2022-03-15 2023-09-22 주식회사 녹십자 α-갈락토시다제 A의 융합단백질을 포함하는 동결 건조 제제

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996032478A1 (en) 1995-04-14 1996-10-17 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
KR100254759B1 (ko) * 1992-01-23 2000-05-01 플레믹 크리스티안 단량체 및 이량체 항체-단편 융합 단백질
WO2006108586A2 (en) * 2005-04-11 2006-10-19 Sanofi Pasteur Polymyxin b analogs for lps detoxification
KR20170091056A (ko) * 2016-01-29 2017-08-08 한미약품 주식회사 치료학적 효소류의 결합체

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUP0500423A2 (hu) * 1999-09-17 2005-08-29 Gtc Biotherapeutics, Inc. Transzgenikus úton előállított fúziós fehérjék
US7629309B2 (en) 2002-05-29 2009-12-08 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
ATE509954T1 (de) * 2005-12-30 2011-06-15 Merck Patent Gmbh Anti-cd19-antikörper mit reduzierter immunogenität
CN101687933B (zh) * 2007-05-30 2015-11-25 浦项工科大学校产学协力团 免疫球蛋白融合蛋白
WO2015009052A1 (ko) * 2013-07-16 2015-01-22 일동제약 주식회사 하이브리드 면역글로불린 fc와 효소의 융합단백질
IL243690B (en) * 2013-07-31 2022-09-01 Amgen Inc Stabilization of polypeptides involving fc
EA035527B1 (ru) 2014-12-30 2020-06-30 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Производные глюкагона с улучшенной стабильностью
JP7320944B2 (ja) * 2015-10-08 2023-08-04 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｂ７‐ｈ３に特異的に結合する分子及びｐｄ‐１に特異的に結合する分子
DK3386534T3 (da) * 2015-12-08 2020-11-30 Regeneron Pharma Sammensætninger og fremgangsmåder til internalisering af enzymer
IL271837B2 (en) * 2017-07-07 2024-01-01 Hanmi Pharm Ind Co Ltd A new medical fusion protein with an enzyme and its uses
CN111511910A (zh) 2017-12-22 2020-08-07 韩美药品株式会社 具有新颖结构的治疗酶融合蛋白及其用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100254759B1 (ko) * 1992-01-23 2000-05-01 플레믹 크리스티안 단량체 및 이량체 항체-단편 융합 단백질
WO1996032478A1 (en) 1995-04-14 1996-10-17 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
WO2006108586A2 (en) * 2005-04-11 2006-10-19 Sanofi Pasteur Polymyxin b analogs for lps detoxification
KR20170091056A (ko) * 2016-01-29 2017-08-08 한미약품 주식회사 치료학적 효소류의 결합체

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BECK, MICHAEL: "New Therapeutic Options for Lysosomal Storage Disorders: Enzyme Replacement, Small Molecules and Gene Therapy", HUMAN GENETICS, vol. 212, 2007, pages 1 - 22, XP002575043, doi:10.1007/s00439-006-0280-4 *
DATABASE Protein 25 July 2016 (2016-07-25), "Homo Sapiens Galactosidase, Alpha, Partial [synthetic construct", XP055620937, retrieved from NCBI Database accession no. AAP36507.1 *
FRANCES M. PLATT ET AL., J CELL BIOL., vol. 199, no. 5, 26 November 2012 (2012-11-26), pages 723 - 34
H. NEURATHR. L. HILL: "The Proteins", 1979, ACADEMIC PRESS
LLORIS-GARCERA, PILAR ET AL.: "Antiparallel Dimers of the Small Multidrug Resistance Protein EmrE Are More Stable than Parallel Dimers", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 287, no. 31, 27 July 2012 (2012-07-27), pages 26052 - 26059, XP055620922 *
VAN DER NEUT KOLFSCHOTEN ET AL., SCIENCE, vol. 317, 2007, pages 1554 - 1557

Also Published As

Publication number Publication date
IL275248A (en) 2020-07-30
KR20190076909A (ko) 2019-07-02
CA3086474A1 (en) 2019-06-27
KR102588611B1 (ko) 2023-10-16
EA202091239A1 (ru) 2020-09-09
SG11202005510SA (en) 2020-07-29
PH12020550927A1 (en) 2021-05-10
NZ765453A (en) 2024-03-22
US20210009984A1 (en) 2021-01-14
KR20230143985A (ko) 2023-10-13
KR102712547B1 (ko) 2024-10-04
JP2021507705A (ja) 2021-02-25
BR112020012346A2 (pt) 2020-11-24
EP3708661A4 (en) 2021-12-01
AR113430A1 (es) 2020-04-29
EP3708661A1 (en) 2020-09-16
TW201934753A (zh) 2019-09-01
CN111511910A (zh) 2020-08-07
AU2018388331A1 (en) 2020-07-02
JP7403455B2 (ja) 2023-12-22
MX2020006635A (es) 2020-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019125059A1 (ko) 신규한 구조를 갖는 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도
WO2020022791A1 (ko) 신규 히알루론산 가수분해 효소 변이체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
AU2016346870B2 (en) Dual function proteins and pharmaceutical composition comprising same
WO2017116205A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체의 지속형 결합체
AU2016287209B2 (en) Glucagon derivative and a composition comprising a long acting conjugate of the same
WO2018004283A2 (ko) 글루카곤 유도체, 이의 결합체, 및 이를 포함하는 조성물, 및 이의 치료적 용도
WO2017131496A1 (ko) 치료학적 효소류의 결합체
WO2018117613A1 (ko) 뇌 표적 지속성 단백질 결합체
WO2010123290A2 (ko) 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체, 및 이를 이용하여 체내 반감기를 증가시키는 방법
WO2021150079A1 (ko) 안정성이 향상된 신규 히알루론산 가수분해 효소 변이체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
WO2012173422A9 (en) A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
WO2015108398A1 (ko) 지속형 인슐린 및 그 용도
WO2014017843A1 (en) Composition for treating hyperlipidemia comprising oxyntomodulin derivative
WO2019009684A2 (ko) 신규 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도
WO2017052329A1 (en) Protein complex by use of a specific site of an immunoglobulin fragment for linkage
WO2017116207A1 (ko) Fgf21 아날로그, fgf21 결합체, 및 이의 용도
WO2019066586A1 (ko) 글루카곤 유사 펩타이드-2(glp-2) 유도체의 지속형 결합체
WO2013051900A2 (en) Blood coagulation factor ⅶ and ⅶa derivatives, conjugates and complexes comprising the same, and use thereof
WO2019190293A1 (ko) 뇌 표적 지속성 단백질 결합체, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 조성물
WO2019066570A1 (ko) 지속형 단쇄 인슐린 아날로그 및 이의 결합체
WO2020130749A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체 및 인슐린을 포함하는 약학 조성물
WO2018174668A2 (ko) 인슐린 수용체와의 결합력이 감소된 인슐린 아날로그의 결합체 및 이의 용도
WO2019022563A2 (ko) 이두로네이트 2-설파타제 결합체
WO2020130751A1 (ko) 인슐린 및 글루카곤을 포함하는 약학 조성물
WO2021235907A1 (ko) 글루카곤 유도체의 지속형 결합체의 액상 제제

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18891205

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018891205

Country of ref document: EP

Effective date: 20200612

Ref document number: 3086474

Country of ref document: CA

Ref document number: 2020534256

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018388331

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20181221

Kind code of ref document: A

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112020012346

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112020012346

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20200618