ES2444695T3 - Polinucleótidos y polipéptidos implicados en el cáncer - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para identificar una célula de cáncer ovárico, comprendiendo el método poner en contacto unacélula de ensayo, una muestra celular de ensayo, un fluido corporal de ensayo o un tejido de ensayo con un reactivocapaz de unirse específicamente a al menos una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que comprende SEQ ID NO.:24; y b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polinucleótido de a) y detectar un complejo formado por el reactivo y el polinucleótido, con lo que la presencia de un complejo esindicativa de una célula de cáncer ovárico

Description

Polinucleótidos y polipéptidos implicados en el cáncer

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas que están expresadas diferentemente en cáncer en comparación con células normales. La presente invención se refiere más particularmente al uso de estas secuencias en el diagnóstico, pronóstico o tratamiento de cáncer, y en la detección de células cancerosas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Entre las neoplasias ginecológicas, el cáncer ovárico da cuenta de la mortalidad relacionada con tumores más elevada en mujeres en los Estados Unidos de América (Jemal et al., 2005). Es la cuarta causa principal de muerte relacionada con cáncer en mujeres en los Estados Unidos de América (Menon et al., 2005). La American Cancer Society estimó un total de 22.220 nuevos casos en el año 2005, y atribuyó 16.210 muertes a la enfermedad (Bonome et al., 2005). Durante los últimos 30 años, la estadística ha seguido siendo en gran medida la misma – la mayoría de mujeres que desarrollaron cáncer ovárico morirán de esta enfermedad (Chambers y Vanderhyden, 2006). La enfermedad tiene un riesgo de tiempo de vida de 1:70, y una tasa de mortalidad de >60% (Chambers y Vanderhyden, 2006). La elevada tasa de mortalidad es debida a las dificultades con la detección temprana del cáncer ovárico cuando el tumor ya se ha extendido más allá del ovario. De hecho, el >80% de los pacientes se les diagnosticó con enfermedad de etapa avanzada (etapa III o IV) (Bonome et al., 2005). Esas pacientes tienen un mal pronóstico, que se refleja en una tasa de supervivencia a 5 años de <45%, aunque el 80% a 90% responderá inicialmente a la quimioterapia (Berek et al., 2000). Este éxito incrementado en comparación con la tasa de supervivencia a 5 años del 20% años atrás es, al menos en parte, debido a la capacidad para citorreducir óptimamente el tejido tumoral cuando está confinado en los ovarios, que es un factor de pronóstico significativo para cáncer ovárico (Bristow R. E., 2000 y Brown et al., 2004). En pacientes diagnosticadas con enfermedad temprana (etapa I), la supervivencia a 5 años oscila a partir de >90 (Chambers y Vanderhyden, 2006).

El cáncer ovárico comprende un grupo heterogéneo de tumores que derivan del epitelio superficial del ovario, o de inclusiones superficiales. Se clasifican en tipos seroso, mucinoso, endometrioide, célula clara, y de Brenner (transicional), que corresponden a los diferentes tipos de epitelios en los órganos del aparato reproductor femenino (Shih y Kurman, 2005). De estos, los tumores serosos dan cuenta del !60% de los casos de cáncer ovárico diagnosticados. Cada subcategoría histológica se divide además en tres grupos: benigno, intermedio (tumor fronterizo o bajo potencial maligno (LMP)), y maligno, que reflejan su comportamiento clínico (Seidman et al., 2002). LMP representa el 10% a 15% de los tumores diagnosticados como serosos, y es enigmático, puesto que presentan estructura nuclear atípica y comportamiento metastásico, aunque son considerablemente menos agresivos que los tumores serosos de grado elevado. La supervivencia a 5 años para pacientes con tumores LMP es 95%, en contraste con una supervivencia de <45% para enfermedad de grado elevado avanzada a lo largo del mismo período (Berek et al., 2000).

A pesar del conocimiento mejorado de la etiología de la enfermedad, cirugía citorreductora agresiva, y quimioterapia de combinación moderna, sólo ha habido un pequeño cambio en la mortalidad. Los malos resultados se han atribuido a (1) falta de ensayos de identificación adecuados para la detección de la enfermedad temprana, en combinación con una presentación sólo sutil de los síntomas en esta etapa – el diagnóstico se hace frecuentemente sólo después de la progresión hacia etapas más tardías, momento en el cual la diseminación peritoneal del cáncer limita el tratamiento eficaz, y (2) el desarrollo frecuente de resistencia a estrategias quimioterapéuticas estándar, que limitan la mejora en la tasa de supervivencia a 5 años de las pacientes. El régimen quimioterapéutico inicial para cáncer de ovario incluye la combinación de carboplatino (Paraplatin) y paclitaxel (taxol). Años de ensayos clínicos han demostrado que esta combinación es muy eficaz tras cirugía eficaz – reduce el volumen tumoral en alrededor de 80% de las mujeres con cáncer ovárico recientemente diagnosticado, y 40 a 50% tendrán una regresión completa – pero los estudios continúan buscando cómo mejorarla. La infusión abdominal reciente de agentes quimioterapéuticos a células diana difíciles de alcanzar, en combinación con el suministro intravenoso, ha aumentado la eficacia. Sin embargo, los efectos secundarios graves conducen a menudo a un curso de tratamiento incompleto. Algunos otros agentes quimioterapéuticos incluyen doxorrubicina, cisplatino, ciclofosfamida, bleomicina, etopósido, vinblastina, hidrocloruro de topotecán, ifosfamida, 5-fluorouracilo y melfalano. Las excelentes tasas de supervivencia para mujeres con enfermedad de etapa temprana que reciben quimioterapia proporcionan un fundamento potente en busca de esfuerzos de investigación para desarrollar estrategias para mejorar la detección de cáncer ovárico. Además, el descubrimiento de nuevos biomarcadores relacionados con el cáncer ovárico conducirá al desarrollo de estrategias terapéuticas más eficaces con efectos secundarios mínimos para el tratamiento futuro de cáncer ovárico.

Actualmente, el diagnóstico de cáncer ovárico se logra, en parte, mediante análisis habitual de la historia médica de las pacientes, y llevando a cabo exámenes físicos, con ultrasonidos y mediante rayos X, e identificación hematológica. Se han dado a conocer dos estrategias alternativas para la detección hematológica temprana de biomarcadores séricos. Un enfoque es el análisis de muestras de suero mediante espectrometría de masas, para

encontrar proteínas o fragmentos proteicos de identidad desconocida que detectan la presencia o ausencia de cáncer (Mor et al., 2005 y Kozak et al., 2003). Sin embargo, esta estrategia es cara y no está disponible ampliamente. Como alternativa, la presencia o ausencia de proteínas/péptidos conocidos en el suero está siendo detectada usando micromatrices de anticuerpos, ELISA, u otros enfoques similares. El ensayo sérico en busca de un biomarcador proteico denominado CA-125 (antígeno del cáncer 125) se ha llevado a cabo ampliamente desde hace tiempo como un marcador para el cáncer ovárico. Sin embargo, aunque las células de cáncer ovárico pueden producir un exceso de estas moléculas proteicas, hay algunos otros cánceres, incluyendo cáncer de la y trompa de Falopio o cáncer endometrial (cáncer del forro del útero), 60% de personas con cáncer pancreático, y 20%-25% de personas con otras neoplasias con niveles elevados de CA-125. El ensayo de CA-125 sólo devuelve un resultado positivo verdadero para alrededor del 50% de las pacientes con cáncer ovárico de etapa I, y tiene una probabilidad del 80% de devolver resultados positivos verdaderos de pacientes con cáncer ovárico de etapa II, III y IV. El otro 20% de las pacientes con cáncer ovárico no muestra ningún incremento en las concentraciones de CA-125. Además, un ensayo de CA-125 elevado puede indicar otra actividad benigna no asociada con cáncer, tal como menstruación, embarazo, o endometriosis. En consecuencia, este ensayo tiene aplicación clínica muy limitada para la detección de la enfermedad de etapa temprana cuando todavía es tratable, mostrando un valor predictivo positivo (PPV) de <10%. E, incluso con la adición de la identificación mediante ultrasonidos a CA-125, el PPV sólo mejora en alrededor de 20% (Kozak et al., 2003). De este modo, este ensayo no es un ensayo de identificación eficaz.

Otros estudios han producido un número de combinaciones de biomarcadores con mayor especificidad y sensibilidad por cáncer ovárico con respecto a CA-125 solo (McIntosh et al., 2004, Woolas et al., 1993, Schorge et., 2004). Los biomarcadores séricos que están a menudo elevados en mujeres con cáncer ovárico epitelial, pero no exclusivamente, incluyen antígeno carcinoembriónico, antígeno de cistadenocarcinoma ovárico, ácido siálico asociado a lípidos, NB/70, TAG72.3, CA-15.3, y CA-125. Desafortunadamente, aunque este enfoque ha incrementado la sensibilidad y especificidad de la detección temprana, las combinaciones de biomarcadores publicadas todavía no detectan un porcentaje significativo de cáncer ovárico epitelial de etapa I/II. Otro estudio (Elieser et al., 2005) midió las concentraciones séricas de 46 biomarcadores, incluyendo CA-125, y, entre estos, 20 proteínas en combinación reconocieron correctamente más del 98% de muestras séricas de mujeres con cáncer ovárico comparado con otra enfermedad pélvica benigna. Aunque no se incluyeron en este estudio otras neoplasias, este ensayo de panel de múltiples marcadores proporcionó el poder de diagnóstico más elevado para la detección temprana de cáncer ovárico hasta ahora.

Adicionalmente, con el advenimiento de tecnologías de análisis de expresión génica diferencial, por ejemplo micromatrices de ADN y métodos de sustracción, muchos grupos han dado a conocer ahora grandes colecciones de genes que están aumentados en cáncer ovárico epitelial (Solicitud de Patente de los Estados Unidos publicada con los números: 20030124579, 20030087250, 20060014686, 20060078941, 20050095592, 20050214831, 20030219760, 20060078941, 20050214826). Sin embargo, los estudios clínicos con respecto a cáncer ovárico de uno o combinaciones de estos genes no están todavía totalmente determinados.

Existe la necesidad de nuevos biomarcadores tumorales para mejorar el diagnóstico y/o pronóstico de cáncer. Además, debido a la diversidad genética de los tumores, y al desarrollo de quimiorresistencia por muchas pacientes, existe además la necesidad de mejores enfoques terapéuticos y más universales para el tratamiento del cáncer. Las dianas moleculares para el desarrollo de tales terapias pueden mostrar preferiblemente un grado elevado de especificidad por los tejidos tumorales en comparación con otros tejidos somáticos, lo que servirá para minimizar o eliminar efectos secundarios indeseados, e incrementar la eficacia de los candidatos terapéuticos.

Esta invención intenta abordar estas necesidades y otras necesidades.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método in vitro para identificar una célula de cáncer ovárico, comprendiendo el método poner en contacto una célula de ensayo, una muestra de células de ensayo, un fluido corporal de ensayo o un tejido de ensayo con un reactivo capaz de unirse específicamente a al menos una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en:

a) un polinucleótido que comprende SEQ ID NO:24; y

b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polinucleótido de a),

y detectar un complejo formado por el reactivo y el polinucleótido, con lo que la presencia de un complejo es indicativa de una célula de cáncer ovárico.

En ciertas realizaciones, la presencia de un complejo es indicativa de cáncer ovárico.

En ciertas realizaciones, el método comprende además una etapa de a) comparar cualitativa o cuantitativamente el nivel de al menos un complejo presente en la célula de ensayo, la muestra de ensayo, el fluido de ensayo o el tejido de ensayo con el nivel de complejo en una célula normal, una muestra de células normales, un fluido corporal normal, un tejido normal o un valor de referencia, o b) comparar cualitativa o cuantitativamente el nivel de al menos un complejo presente en la célula de ensayo, la muestra de ensayo, el fluido de ensayo o el tejido de ensayo con el

nivel de complejo en una célula, una muestra de células, un fluido corporal o un tejido de un cáncer de ovario con bajo potencial maligno, o con un valor de referencia atribuido a un cáncer ovárico de bajo potencial maligno, y en tales ciertas realizaciones la célula normal, muestra de células o tejido es una célula ovárica normal, una muestra de células ováricas normales o un tejido ovárico normal, y en el que un fluido corporal normal es de un individuo que no

5 tiene una condición cancerosa.

En ciertas realizaciones, la célula, muestra de células, fluido corporal o tejido procede de un individuo que tiene o se sospecha que tiene un cáncer ovárico, preferiblemente el cáncer ovárico es un cáncer ovárico de bajo potencial maligno, o es un cáncer ovárico maligno.

La presente invención también se refiere a un polipéptido aislado para uso in vivo en la identificación o detección de 10 una célula de cáncer ovárico, seleccionándose dicho polipéptido del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende SEQ ID NO.:70,

b) un polipéptido codificado por una secuencia polinucleotídica que comprende SEQ ID NO:24 o un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con ella,

c) un fragmento que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO.:70,

15 d) un derivado de a), en el que dicho derivado tiene al menos 80% de similitud de secuencia con el polipéptido de a), y

e) un análogo de a), en el que dicho análogo tiene al menos 80% de similitud de secuencia con el polinucleótido de a).

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido descrito

20 anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para uso in vivo en la identificación o detección de una célula de cáncer ovárico.

La presente invención también se refiere a un polipéptido como se describe anteriormente para uso in vivo en el pronóstico o diagnóstico de cáncer ovárico, preferiblemente el cáncer ovárico es un cáncer ovárico maligno, o un cáncer ovárico con bajo potencial maligno. En ciertas realizaciones, la detección del polipéptido en una célula, tejido,

25 muestra o fluido corporal procedente de un individuo es a) preferentemente indicativa de un diagnóstico de cáncer de ovario maligno con respecto a un diagnóstico de cáncer de ovario de potencial maligno bajo, o b) preferentemente indicativa de un cáncer ovárico maligno con respecto a un cáncer ovárico de potencial maligno bajo, o c) es preferentemente indicativa de un cáncer ovárico maligno de etapa tardía.

La presente invención también se refiere a un método in vitro para el diagnóstico o pronóstico de cáncer ovárico,

30 comprendiendo el método determinar la presencia o ausencia de al menos un polipéptido descrito anteriormente, con lo que la presencia del polipéptido es indicativa de la presencia de una célula de cáncer ovárico.

La presente invención también se refiere a un método in vitro para el diagnóstico o pronóstico de cáncer ovárico, comprendiendo el método determinar el nivel de expresión de al menos un polipéptido descrito anteriormente, que comprende opcionalmente además comparar el nivel obtenido con al menos un nivel o valor de referencia.

35 La presente invención también se refiere a un anticuerpo aislado o purificado, o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende o consiste en SEQ ID NO.:70, y

b) un polipéptido que comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que comprende SEQ ID NO:24 o un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con

40 ella, o un fragmento de al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO.:70,

para uso in vivo en la identificación o detección de una célula de cáncer ovárico que expresa un polipéptido descrito anteriormente.

La presente invención también se refiere a una composición que comprende el anticuerpo descrito anteriormente para uso in vivo en la identificación o detección de una célula de cáncer ovárico que expresa un polipéptido descrito

45 anteriormente.

La presente invención también se refiere a un método in vitro para identificar un compuesto que inhibe la actividad o función de un polipéptido que comprende SEQ ID NO.:70, o un polipéptido que comprende una secuencia polipeptídica codificada por SEQ ID NO.:24, comprendiendo el método poner en contacto una célula que expresa el polipéptido con un compuesto putativo y aislar o identificar un compuesto que es capaz de unirse específicamente al

50 polipéptido, y determinar el efecto del compuesto putativo sobre el crecimiento de una célula de cáncer ovárico.

La presente invención también se refiere a un método in vitro para identificar un compuesto que inhibe la expresión

de un polinucleótido que comprende SEQ ID NO.:24, comprendiendo el método poner en contacto una célula capaz de expresar dicho polinucleótido con un compuesto putativo, y cuantificar el nivel de expresión del polinucleótido en presencia de dicho compuesto putativo, en el que dicha célula es una célula de cáncer ovárico que expresa de forma endógena dicho polinucleótido.

La presente invención también se refiere a un anticuerpo o a su fragmento de unión a antígeno, capaz de unirse específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que consiste en SEQ ID NO.:70;

b) un polipéptido codificado por SEQ ID NO.:24,

c) un fragmento que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO.:70,

d) un derivado de uno cualquiera de a) o b), en el que dicho derivado tiene al menos 80% de similitud de secuencia con el polipéptido de a) o b);y

e) un análogo de uno cualquiera de a) o b), en el que dicho análogo tiene al menos 80% de similitud de secuencia con el polipéptido de a) o b),

para uso in vivo en la identificación, detección o tratamiento de cáncer ovárico, preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y/o preferiblemente el fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2 o un fragmento Fv.

La presente invención también se refiere al uso de un anticuerpo aislado o purificado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende o consiste en SEQ ID NO.:70, y

b) un polipéptido que comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que comprende SEQ ID NO:24, o un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con ella, o un fragmento de al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO.:70, en la identificación o detección in vitro de una célula de cáncer ovárico que expresa un polipéptido descrito anteriormente.

La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado para uso en la reducción, disminución o inhibición del crecimiento de una célula de cáncer ovárico in vivo, siendo dicho polinucleótido un polinucleótido que comprende una secuencia que es al menos 80% complementaria a SEQ ID NO.:24.

Se proporcionan aquí nuevas secuencias polinucleotídicas y nuevas secuencias polipeptídicas, así como composiciones, anticuerpos específicos para estas secuencias, vectores y células que comprenden una forma recombinante de estas nuevas secuencias.

La presente descripción describe métodos para detectar células cancerosas usando polinucleótidos individuales o múltiples y/o secuencias polipeptídicas que son específicas para estas células tumorales. Algunos de los polinucleótidos y/o secuencias polipeptídicas proporcionados aquí se expresan diferentemente en cáncer ovárico en comparación con células normales, y también se pueden usar para distinguir entre cáncer ovárico maligno y un cáncer ovárico de un potencial maligno bajo y/o un estado normal (individuo libre de cáncer ovárico).

También se describen aquí métodos de diagnóstico, métodos de pronóstico, métodos de detección, kits, matrices, librerías y ensayos que comprenden uno o más polipéptidos y/o secuencias polinucleotídicas o anticuerpos descritos aquí, así como nuevas rutas terapéuticas para el tratamiento del cáncer.

El solicitante ha llegado al sorprendente descubrimiento de que el polinucleótido y/o las secuencias polipeptídicas descritos aquí están preferentemente aumentados en cáncer ovárico maligno en comparación con cáncer ovárico de bajo potencial maligno y/o en comparación con células normales. De forma más interesante, algunas de estas secuencias parecen estar sobreexpresadas en cáncer ovárico de etapa tardía.

El solicitante también ha llegado al sorprendente descubrimiento de que algunas de las secuencias descritas aquí no sólo se expresan en células de cáncer ovárico, sino en otras células cancerosas tales como células de cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer pulmonar, melanoma, leucemia, y de cáncer del sistema nervioso central. Como tal, varias de estas secuencias, ya sea solas o en combinación, pueden representar marcadores tumorales universales. Por lo tanto, algunas NSEQs y PSEQs descritas aquí no sólo encuentran utilidad en el campo de la detección y tratamiento del cáncer ovárico sino también en la detección y tratamiento de otros tipos de tumores.

Por lo tanto, usando NSEQs o PSEQs descritas aquí, se puede identificar fácilmente una célula como cancerosa. Como tales, las NSEQs o PSEQs se pueden usar para identificar una célula como una célula de cáncer ovárico, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer pulmonar, una célula de cáncer

de colon, una célula de cáncer renal, una célula de un melanoma, una célula de leucemia o una célula procedente de un cáncer del sistema nervioso central.

Incluso más particularmente, las NSEQs o PSEQs descritas aquí se pueden usar para identificar una célula como un cáncer ovárico maligno o un cáncer ovárico de bajo potencial maligno.

La presencia de algunas NSEQs o PSEQs en una célula de cáncer ovárico puede ser preferentemente indicativa de que el cáncer ovárico es del tipo maligno. Algunas NSEQs o PSEQs de la presente invención también pueden indicar más particularmente que el cáncer es un cáncer ovárico maligno de etapa tardía.

Las NSEQs o PSEQs se pueden usar además para tratar cáncer o para identificar compuestos útiles en el tratamiento de cáncer, incluyendo cáncer ovárico (es decir, cáncer ovárico LMP y/o maligno), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer pulmonar, cáncer de colon, cáncer renal, melanoma, leucemia o cáncer del sistema nervioso central.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “NSEQ” se refiere de forma general a secuencias polinucleotídicas que comprenden o consisten en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 49, y 169 (por ejemplo, una forma aislada), o comprenden o consisten en un fragmento de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 49, y 169. El término “NSEQ” se refiere más en concreto a una secuencia polinucleotídica que comprende o consiste en una porción transcrita de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 49, y 169, que puede estar, por ejemplo, libre de porción o porciones no traducidas o no traducibles (es decir, una porción codificante de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 49, y 169). El término “NSEQ” se refiere adicionalmente a una secuencia sustancialmente idéntica a una cualquiera de las anteriores, y más en concreto, sustancialmente idéntica a la secuencia polinucleotídica que comprende o consiste en una porción transcrita de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 49, y 169, que puede estar, por ejemplo, libre de porción o porciones no traducidas o no traducibles. El término “NSEQ” se refiere adicionalmente a una región de la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 49, y 169 que codifica o que es capaz de codificar un polipéptido. El término “NSEQ” también se refiere a una secuencia polinucleotídica capaz de codificar uno cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria o un fragmento polipeptídico de uno cualquiera de los anteriores. Finalmente, el término “NSEQ” también comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una cualquiera de las anteriores.

En otros ejemplos descritos aquí, tales como aquellos que se refieren a la detección y/o tratamiento de cánceres distintos de cáncer ovárico, la NSEQ también se puede referir a SEQ ID NO.: 50, incluyendo cualquier polinucleótido que comprende o consiste en SEQ ID NO: 50 (por ejemplo, una forma aislada) o que comprende o consiste en un fragmento de una cualquiera de SEQ ID NO: 50, tal como una secuencia polinucleotídica que comprende o consiste en una porción transcrita de una cualquiera de SEQ ID NO: 50, que puede estar, por ejemplo, libre de porción o porciones no traducidas o no traducibles (es decir, una porción codificante de SEQ ID NO: 50). El término “NSEQ” se refiere adicionalmente a una secuencia sustancialmente idéntica a una cualquiera de las anteriores, y más particularmente sustancialmente idéntica a la secuencia polinucleotídica que comprende o consiste en una porción transcrita de SEQ ID NO: 50, que puede estar, por ejemplo, libre de porción o porciones no traducidas o no traducibles. El término “NSEQ” se refiere adicionalmente a una región de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 50 que codifica o es capaz de codificar un polipéptido. Finalmente, el término “NSEQ” se refiere a una secuencia sustancialmente complementaria a una cualquiera de las anteriores.

Como tal, la NSEQ engloba, por ejemplo, las SEQ ID NOs: 1 a 49, 50 y 169, y también engloba secuencias polinucleotídicas que comprenden, se diseñan o derivan de SEQ ID NOs: 1 a 49, 50 ó 169. Los ejemplos no limitantes de tales secuencias incluyen, por ejemplo, SEQ ID NOs: 103-150 ó 151-152.

El término “NSEQ inhibidora” se refiere por lo general a una secuencia sustancialmente complementaria a una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 49, 50 ó 169, sustancialmente complementaria a un fragmento de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 49, 50 ó 169, sustancialmente complementaria a una secuencia sustancialmente idéntica a las SEQ ID NOs: 1 a 49, 50 ó 169, y más en concreto, sustancialmente complementaria a una porción transcrita de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 49, 50 ó 169 (por ejemplo, que puede estar libre de porción no traducida o no traducible) y que puede tener una acción atenuadora o incluso inhibidora frente a la transcripción de un mRNA o frente a la expresión de un polipéptido codificado por las SEQ ID NOs: 1 a 49, 50 ó 169 correspondientes. La “NSEQ inhibidora” idónea puede tener, por ejemplo, y sin limitación, de alrededor de 10 a alrededor de 30 nucleótidos, de alrededor de 10 a alrededor de 25 nucleótidos, o de alrededor de 15 a alrededor de 20 nucleótidos.

Como se usa aquí, el término “PSEQ” se refiere generalmente a todas y a cada una de las secuencias polipeptídicas mencionadas aquí, tales como, por ejemplo, cualesquiera secuencias polipeptídicas codificadas (codificadas putativamente) por una cualquiera de NSEQ descrita aquí (por ejemplo, una cualquiera de SEQ. ID. NOs:1 a 49 ó 169), incluyendo su forma aislada o sustancialmente purificada. Por lo tanto, un polipéptido que comprende o que consiste en una cualquiera de SEQ. ID. NOs:51 a 88 ó 170, incluyendo variantes (por ejemplo, una variante proteínica natural aislada), análogos, derivados y sus fragmentos, se denominan colectivamente aquí como “PSEQ”. En otros ejemplos descritos aquí, tales como los referidos a la detección y/o tratamiento de cánceres distintos del cáncer ovárico, PSEQ también se refiere a polipéptido que comprende o consiste en SEQ ID NO.:89, incluyendo variantes (por ejemplo, una variante proteínica natural aislada), análogos, derivados y fragmentos.

Algunas de las NSEQs o PSEQs descritas aquí se han caracterizado previamente con fines distintos de los descritos aquí. Como tal, ahora se pueden aplicar agentes de diagnóstico y agentes terapéuticos que se sabe que seleccionan como dianas a esas NSEQs o PSEQs (por ejemplo, anticuerpos y/o inhibidores) para la inhibición de estas NSEQs o PSEQs en el contexto del tratamiento de cáncer ovárico, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de pulmón, melanoma, leucemia, o cáncer del sistema nervioso central. El uso de estos agentes terapéuticos y agentes de diagnóstico conocidos para la utilidad no descrita previamente, tales como los descritos aquí, está englobado por la presente invención.

Por ejemplo, los anticuerpos capaces de unirse al receptor 1 de folato se pueden usar así para la unión específica de células tumorales distintas de células de cáncer ovárico, tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de pulmón, melanoma, leucemia, y de cáncer del sistema nervioso central. Como tal, se contempla aquí el uso de anticuerpos y/o inhibidores del receptor 1 de folato (por ejemplo, CB300638, CB300945, que son inhibidores de timidilato sintasa basados en ciclopenta[g]quinazolina, los descritos en los documentos US20040242606, US20050009851, etc.) en el uso de tratamiento de cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de pulmón, melanoma, leucemia, y cáncer del sistema nervioso central.

REALIZACIONES EJEMPLARES NO LIMITATIVAS DE LA INVENCIÓN

Uso de NSEQ como una herramienta de identificación

La NSEQ descrita aquí se puede usar directamente o en el desarrollo de herramientas para la detección y aislamiento de productos de expresión (mRNA, precursor de mRNA, hnRNA, etc.), de DNA genómico, o de productos sintéticos (cDNA, fragmentos de PCR, vectores que comprenden NSEQ etc.). Las NSEQs también se pueden usar para preparar herramientas adecuadas para detectar un polipéptido o proteína codificados. NSEQ se puede usar así para proporcionar un polipéptido codificado, y para generar un anticuerpo específico para el polipéptido.

Los expertos en la técnica también reconocerán que se pueden preparar secuencias oligonucleotídicas cortas basándose en las secuencias polinucleotídicas descritas aquí. Por ejemplo, se pueden preparar oligonucleótidos que tienen 10 a 20 nucleótidos para hibridarse específicamente a una NSEQ que tiene una secuencia sustancialmente complementaria y permitir la detección, identificación y aislamiento de secuencias nucleicas mediante hibridación. Las secuencias sonda de, por ejemplo, al menos 10-20 nucleótidos se pueden preparar basándose en una secuencia encontrada en una cualquiera de SEQ ID NO.:1 a 49, 50 ó 169, y más particularmente seleccionada de regiones que carecen de homología con secuencias indeseables. Las secuencias sonda de 20 o más nucleótidos que carecen de tal homología pueden mostrar una mayor especificidad hacia la secuencia diana. Las condiciones de hibridación útiles para sondas y cebadores son fácilmente determinables por el experto en la técnica. Las condiciones de hibridación restrictivas englobadas aquí son aquellas que pueden permitir la hibridación de ácidos nucleicos que tienen una homología mayor que 90% pero que pueden prevenir la hibridación de ácidos nucleicos que tienen una homología menor que 70%. La especificidad de una sonda se puede determinar por el hecho de si está hecha de una región única, una región reguladora, o de un motivo conservado. Tanto la especificidad de las sondas como la restricción de las reacciones de hibridación o amplificación de diagnóstico (máxima, elevada, intermedia, o baja) dependen de si la sonda identifica o no secuencias exactamente complementarias, variantes alélicas, o secuencias relacionadas. Las sondas diseñadas para detectar secuencias relacionadas pueden tener, por ejemplo, al menos 50% de identidad de secuencia con cualquiera de los polinucleótidos seleccionados.

Además, una sonda se puede marcar mediante cualquier procedimiento conocido de la técnica, por ejemplo mediante incorporación de nucleótidos enlazados a una “molécula informadora”. Una “molécula informadora”, como se usa aquí, puede ser una molécula que proporciona una señal analíticamente identificable que permite la detección de una sonda hibridada. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa. Las moléculas informadoras usadas normalmente incluyen fluoróforos, enzimas, biotina, moléculas quimioluminiscentes, moléculas bioluminiscentes, digoxigenina, avidina, estreptavidina o radioisótopos. Las enzimas usadas normalmente incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y ∀-galactosidasa, entre otras. Las enzimas se pueden conjugar a avidina o estreptavidina para uso con una sonda biotinilada. De forma similar, las sondas se pueden conjugar a avidina o estreptavidina para uso con una enzima biotinilada. La incorporación de la molécula informadora en una sonda de DNA se puede efectuar mediante cualquier método conocido por el experto, por ejemplo mediante traducción por muescas, extensión del cebador, cebado de oligos al azar, mediante marcaje de los extremos 3’ o 5’, o por otros medios. Además, las sondas de hibridación incluyen la clonación de secuencias de ácidos nucleicos en vectores para la producción de sondas de mRNA. Tales vectores son conocidos en la técnica, están comercialmente disponibles, y se pueden usar para sintetizar sondas de RNA in vitro. Las secuencias polinucleotídicas marcadas se pueden usar en análisis Southern o Northern, transferencia de punto, u otras tecnologías a base de membrana; en tecnologías de PCR; y en micromatrices que utilizan muestras de sujetos para detectar la expresión alterada. Los oligonucleótidos útiles como sondas para la identificación de muestras mediante ensayos de hibridación, o como sondas para la amplificación, se pueden envasar en kits. Tales kits pueden contener las sondas o cebadores en una cantidad medida previamente o predeterminada, así como otros reactivos y materiales adecuadamente envasados necesarios para el protocolo de hibridación o amplificación particular.

La expresión de mRNAs idénticos o sustancialmente idénticos a las NSEQs de la presente invención se puede detectar y/o aislar así usando métodos que son conocidos en la técnica. La realización ejemplar de tales métodos incluye, por ejemplo, y sin limitación, análisis de hibridación usando sondas oligonucleotídicas, transcripción inversa y métodos de amplificación de ácidos nucleicos in vitro.

Por lo tanto, tales procedimientos pueden permitir la detección de mRNAs en células ováricas (por ejemplo, células de cáncer ovárico) o en cualesquiera otras células que expresan tales mRNAs. La expresión de mRNA de manera específica de tejidos o de manera específica de la enfermedad puede ser útil para definir los tejidos y/o el estado de la enfermedad particular. El experto en la técnica puede adaptar fácilmente las NSEQs para estos fines.

Se entiende aquí que las NSEQs se pueden hibridar a una secuencia sustancialmente complementaria encontrada en una muestra de ensayo (por ejemplo, célula, tejido, etc.). Adicionalmente, una secuencia sustancialmente complementaria a NSEQ (incluyendo fragmentos) se puede unir a NSEQ y a secuencias sustancialmente idénticas encontradas en una muestra de ensayo (por ejemplo, célula, tejido, etc.).

También están englobados aquí los polipéptidos codificados por una NSEQ aislada, variantes polipeptídicas, análogos polipeptídicos o fragmentos polipeptídicos de los mismos. Los polipéptidos, ya sea en forma premadura, madura o fusionada, se pueden aislar a partir de células lisadas, o a partir del medio de cultivo, y se pueden purificar hasta el grado necesario para el uso pretendido. Un experto en la técnica puede purificar fácilmente estas proteínas, polipéptidos y péptidos mediante cualquier procedimiento disponible. Por ejemplo, la purificación se puede lograr mediante fraccionamiento salino, cromatografía de exclusión de tamaños, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad, y similar. Como alternativa, PSEQ se puede obtener mediante síntesis química.

Las variantes naturales se pueden identificar a través de la identificación por hibridación de una librería de ácidos nucleicos o una librería polipeptídica de diferente tejido, tipo celular, población, especie, etc., usando la NSEQ y las herramientas derivadas.

Uso de NSEQ para el desarrollo de un sistema de expresión

A fin de expresar un polipéptido, se puede expresar una NSEQ capaz de codificar una cualquiera de una PSEQ descrita aquí en un vector de expresión, es decir, un vector que contiene los elementos para el control transcripcional y traduccional de la secuencia codificante insertada en un hospedante particular. Estos elementos pueden incluir secuencias reguladoras, tales como potenciadores, promotores constitutivos e inducibles, y regiones no traducidas de 5’ y 3’. Los métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica se pueden usar para construir tales vectores de expresión. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo.

Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión/células hospedantes conocidos por los expertos para expresar un polipéptido o RNA a partir de NSEQ. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de DNA cosmídico, plasmídico o de bacteriófago recombinante; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insectos infectados con vectores baculovíricos; sistemas de células vegetales transformados con vectores de expresión víricos o bacterianos; o sistemas de células animales. Para la producción a largo plazo de proteínas recombinantes en sistemas de mamíferos, se puede efectuar la expresión estable en líneas celulares. Por ejemplo, NSEQ se puede transformar en líneas celulares que usan vectores de expresión que pueden contener orígenes víricos de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable o visible en el mismo vector o en un vector distinto. La invención no está limitada por el vector o célula hospedante empleada.

Como alternativa, RNA y/o polipéptido se puede expresar a partir de un vector que comprende NSEQ usando un sistema de transcripción in vitro o un sistema de transcripción/traducción in vitro acoplado, respectivamente.

En general, las células hospedantes que contienen la NSEQ y/o que expresan un polipéptido codificado por la NSEQ, o una porción del mismo, se pueden identificar mediante muchos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitarse a, hibridaciones de DNA/DNA o DNA/RNA, amplificación por PCR, y bioensayo de proteínas o técnicas de inmunoensayo que incluyen tecnologías basadas en membranas, en disoluciones o en chips, para detectar y/o cuantificar secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos. Se conocen bien en la técnica los métodos inmunológicos para detectar y medir la expresión de los polipéptidos usando anticuerpos monoclonales o policlonales específicos. Ejemplos de tales técnicas incluyen inmunoensayos enzimáticos (ELISA), radioinmunoensayos (RIA) y clasificación de células activadas con fluorescencia (FACS). Los expertos en la técnica pueden adaptar con facilidad estas metodologías a la presente invención.

Las células hospedantes transformadas con la NSEQ se pueden cultivar de este modo en condiciones que permitan la transcripción del RNA correspondiente (mRNA, siRNA, shRNA, etc.) y/o la expresión del polipéptido a partir del cultivo celular. El polipéptido producido por una célula puede ser segregado por la célula o quedar retenido dentro de ella según la secuencia y/o el vector utilizados. Como conocerán los expertos en la técnica, los vectores de expresión que contienen la NSEQ pueden diseñarse para que contengan secuencias señal que dirigen la secreción

directa del polipéptido a través de una membrana de una célula procariota o eucariota. Debido a la degeneración inherente del código genético, otras secuencias de DNA que codifican la misma secuencia de aminoácidos, sustancialmente la misma, o una funcionalmente equivalente, pueden ser producidas y utilizadas, por ejemplo, para expresar un polipéptido codificado por la NSEQ. Las secuencias nucleotídicas de la presente invención se pueden 5 modificar genéticamente con los métodos conocidos de forma general en la técnica para alterar las secuencias nucleotídicas para numerosos fines, incluyendo, pero sin limitarse a, la modificación de la clonación, procesamiento y/o expresión del producto génico. El barajado del DNA mediante fragmentación aleatoria y el reensamblaje por PCR de los fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos puede utilizarse para construir secuencias nucleotídicas. Por ejemplo, la mutagénesis específica de sitio mediada por nucleótidos se puede utilizar para introducir mutaciones que 10 crean nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glucosilación, cambiar la preferencia de los codones, producir variantes de ayuste, etcétera. Además, se puede elegir una cepa de célula hospedante por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar el polipéptido expresado en la forma deseada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero sin limitarse a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraduccional, que escinde una forma “prepro” del

15 polipéptido, también puede utilizarse para especificar la destinación, el plegamiento y/o la actividad de las proteínas. Existen comercialmente y en la American Type Culture Collection (ATCC) diferentes células hospedantes (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y W138) que tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para actividades postraduccionales, y se pueden elegir para asegurar la modificación y el procesamiento correctos del polipéptido expresado.

20 Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que las secuencias de ácidos nucleicos naturales, modificadas o recombinantes pueden ligarse a una secuencia heteróloga, dando como resultado la traducción de un polipéptido de fusión que contiene restos polipeptídicos heterólogos en cualquiera de los sistemas hospedantes antes mencionados. Tales restos polipeptídicos heterólogos pueden facilitar la purificación de polipéptidos de fusión con las matrices de afinidad comercialmente disponibles. Tales restos incluyen, pero sin limitarse a, glutationa S

25 transferasa (GST), proteína de unión a maltosa, tiorredoxina, péptido de unión a calmodulina, 6-His (His), FLAG, cmyc, hemaglutinina (HA) y epítopos de anticuerpos tales como epítopos de anticuerpos monoclonales.

En todavía un ejemplo adicional, se describe en la presente memoria un polinucleótido que puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de fusión, la proteína de fusión puede comprender una pareja de fusión fusionada a un fragmento peptídico de una proteína codificada por, o un polipéptido de una variante alélica de

30 origen natural codificado por, la secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria.

Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que las secuencias de ácidos nucleicos y polipeptídicas pueden sintetizarse, por completo o en parte, mediante métodos químicos o enzimáticos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la síntesis peptídica puede realizarse con diversas técnicas en fase sólida y máquinas tales como el sintetizador de péptidos ABI 431A (PE Biosystems), que puede utilizarse para automatizar la síntesis. Si se desea, la

35 secuencia de aminoácidos puede alterarse durante la síntesis y/o puede combinarse con secuencias de otras proteínas para producir una proteína variante.

También se describe aquí un bioensayo para evaluar compuestos que sean antagonistas en potencia del polipéptido descrito en la presente memoria, pudiendo comprender el bioensayo:

a) cultivar células de ensayo en un medio de cultivo que contiene concentraciones crecientes de al menos un

40 compuesto cuya capacidad para inhibir la acción de un polipéptido descrito en la presente memoria se pretende determinar, en el que las células de ensayo pueden contener una secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria (por ejemplo, en una forma que tiene actividad de transcripción por transactivación mejorada con respecto al polinucleótido de tipo salvaje, y que comprende un elemento de respuesta enlazado operativamente a un gen informador); y después

45 b) monitorizar en las células el nivel de expresión del producto del gen informador (que codifica una molécula informadora) como una función de la concentración del posible compuesto antagonista en el medio de cultivo, indicando de ese modo la capacidad del posible compuesto antagonista para inhibir la activación del polipéptido codificado por la secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria.

También se describe en la presente memoria un bioensayo para evaluar compuestos que sean posibles agonistas

50 para un polipéptido codificado por la secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria, pudiendo comprender el bioensayo:

a) cultivar células de ensayo en un medio de cultivo que contiene concentraciones crecientes de al menos un compuesto cuya capacidad para promover la acción del polipéptido codificado por la secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria se pretende determinar, en el que las células de ensayo

55 pueden contener una secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria (por ejemplo, en una forma que tiene actividad de transcripción por transactivación mejorada, con respecto al polinucleótido de tipo salvaje, y que comprende un elemento de respuesta enlazado operativamente a un gen informador); y después

b) monitorizar en las células el nivel de expresión del producto del gen informador como una función de la concentración del posible compuesto agonista en el medio de cultivo, indicando de ese modo la capacidad del posible compuesto agonista para promover la activación de un polipéptido codificado por la secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria.

Uso de la NSEQ como una herramienta de identificación o como una herramienta de escrutinio para diagnóstico

El experto en la técnica reconocerá con facilidad que la NSEQ puede utilizarse para identificar una célula, tipo celular, tejido, enfermedad particular, y de este modo puede utilizarse para fines de diagnóstico en la determinación de la ausencia, presencia o expresión alterada (a saber, incrementada o disminuida en comparación con lo normal) del producto de expresión de un gen. La NSEQ adecuada puede tener, por ejemplo, entre 10 y 20 o más, es decir, al menos 10 nucleótidos de longitud o al menos 12 nucleótidos de longitud, o una longitud de al menos 15 nucleótidos hasta cualquier longitud deseada, y puede comprender, por ejemplo, RNA, DNA, ácidos nucleicos ramificados, y/o ácidos peptidonucleicos (PNAs). En una alternativa, los polinucleótidos pueden utilizarse para detectar y cuantificar la expresión génica en muestras en las cuales la expresión de NSEQ se correlaciona con la enfermedad. En otra alternativa, la NSEQ puede utilizarse para detectar polimorfismos genéticos asociados a una enfermedad. Estos polimorfismos pueden detectarse, por ejemplo, en el cDNA transcrito o DNA genómico.

En la presente memoria se describe el uso de al menos una de la NSEQ descrita en la presente memoria en una matriz y para uso de tal matriz en un método de detección de una célula particular, tipo celular, enfermedad para el pronóstico o diagnóstico de cáncer. El método puede comprender hibridar la matriz con una muestra del paciente (que comprende puptativamente o que comprende una secuencia polinucleotídica diana sustancialmente complementaria de una NSEQ) en condiciones que permiten la formación de complejos (entre NSEQ y el polinucleótido diana), detectar la formación de complejos, en el que la formación del complejo es indicativa de la presencia del polinucleótido, y en el que la ausencia de formación del complejo es indicativa de la ausencia del polinucleótido en la muestra del paciente. La presencia o ausencia del polinucleótido puede ser indicativa de cáncer, tal como, por ejemplo, cáncer ovárico u otro cáncer como se indica en la presente memoria.

El método también puede comprender la etapa de comparar cuantitativa o cualitativamente (por ejemplo, con un sistema de ordenador, aparato) el nivel de formación de complejo en la muestra del paciente con aquel de los patrones para células normales o individuo u otro tipo, origen o grado de cáncer.

También se da a conocer en la presente memoria uno o más kits compartimentados para la detección de un polinucleótido y/o polipéptido para el diagnóstico o pronóstico de cáncer ovárico. Un primer kit puede tener un receptáculo que contiene al menos una NSEQ aislada o una sonda que comprende NSEQ. Tal sonda puede unirse a un fragmento de ácido nucleico que está presente/ausente en las células normales, pero que está ausente/presente en células afectadas o enfermas. Tal sonda puede ser específica de un sitio de ácido nucleico que está normalmente activo/inactivo, pero que puede estar inactivo/activo en determinados tipos de células. De igual forma, tal sonda puede ser específica para un sitio de ácido nucleico que puede expresarse anormalmente en determinados tipos de células. Finalmente, tal sonda puede identificar una mutación específica. La sonda puede ser capaz de hibridarse a la secuencia de ácido nucleico que está mutada (no idéntica a la secuencia de ácido nucleico normal), o puede ser capaz de hibridarse a secuencias de ácidos nucleicos adyacentes a las secuencias de ácidos nucleicos mutadas. Las sondas proporcionadas en los presentes kits pueden tener una molécula informadora unida covalentemente. Los expertos en la técnica serán capaces de preparar con facilidad las sondas y moléculas informadoras, tal y como está descrito más arriba.

También se describen en la presente memoria anticuerpos (por ejemplo, anticuerpo aislado), que pueden unirse específicamente a una proteína o polipéptido descrito en la presente memoria (una PSEQ), así como ácidos nucleicos que codifican tales anticuerpos.

Como se usa aquí, el término “anticuerpo” significa un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo desinmunizado, un fragmento de unión a antígeno, un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2, y un fragmento Fv; CDSs, o un anticuerpo monocatenario que comprende un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, un Fv monocatenario).

El anticuerpo se puede originar, por ejemplo, de ratón, de rata o de cualquier otro mamífero, o de otras fuentes, tales como mediante tecnologías de DNA recombinante.

El anticuerpo también puede ser un anticuerpo humano que se puede obtener, por ejemplo, de un mamífero no humano transgénico capaz de expresar genes de Ig humana. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo humanizado que puede comprender, por ejemplo, una o más regiones determinantes de complementariedad de origen no humano. También puede comprender un resto de superficie de un anticuerpo humano y/o regiones marco de un anticuerpo humano. El anticuerpo puede ser también un anticuerpo quimérico que puede comprender, por ejemplo, dominios variables de un anticuerpo no humano y dominios constantes de un anticuerpo humano.

El anticuerpo de la presente invención puede mutarse y seleccionarse basándose en una mayor afinidad, solubilidad, estabilidad, especificidad y/o para uno de un polipéptido descrito en la presente memoria, y/o basado en una inmunogenicidad reducida en un hospedante deseado, o para otras características deseables.

Los anticuerpos adecuados pueden unirse a regiones antigénicas o epítopos únicos en los polipéptidos, o una porción de los mismos. Los epítopos y las regiones antigénicas útiles para generar anticuerpos se pueden hallar en las proteínas, polipéptidos o péptidos mediante los procedimientos disponibles para el experto en la técnica. Por ejemplo, se pueden identificar secuencias peptídicas únicas y cortas en las proteínas y polipéptidos que tienen poca

o ninguna homología con secuencias de aminoácidos conocidas. Preferiblemente, la región de una proteína seleccionada para que actúe como un epítopo o antígeno peptídico no es completamente hidrófoba; las regiones hidrófilas son preferibles porque estas regiones probablemente constituyen epítopos de superficie en vez de regiones internas de las proteínas y polipéptidos. Estos epítopos de superficie se detectan más fácilmente en las muestras en las que se analizó la presencia de las proteínas y polipéptidos. Tales anticuerpos pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos y monocatenarios, fragmentos Fab, y fragmentos producidos mediante una librería de expresión de Fab. La producción de anticuerpos la conoce bien el experto en la técnica, y no se pretende limitarla aquí.

Los péptidos pueden fabricarse mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la técnica, por ejemplo con el uso de los procedimientos de síntesis química o de traducción in Vitro, o introduciendo un vector de expresión adecuado en las células. Los péptidos cortos que proporcionan un epítopo antigénico, pero que por sí mismos son demasiado pequeños para inducir una respuesta inmunitaria, pueden conjugarse a un vehículo adecuado. Los vehículos adecuados y los métodos de enlazamiento son bien conocidos en la técnica. Los vehículos adecuados son típicamente macromoléculas grandes tales como proteínas, polisacáridos y aminoácidos poliméricos. Los ejemplos incluyen seroalbúminas, hemocianina de lapa californiana, ovoalbúmina, polilisina y similares. El experto en la técnica puede utilizar procedimientos disponibles y reactivos de acoplamiento para enlazar el epítopo peptídico deseado a tal vehículo. Por ejemplo, se pueden utilizar reactivos de acoplamiento para formar enlaces de disulfuro o enlaces de tioéter desde el vehículo al péptido de interés. Si el péptido carece de un grupo disulfuro, se puede proporcionar uno mediante la adición de un resto de cisteína. Alternativamente, el acoplamiento se puede llevar a cabo mediante la activación de grupos carboxilo.

El tamaño mínimo de los péptidos útiles para obtener anticuerpos específicos de antígenos puede variar ampliamente. El tamaño mínimo debe ser suficiente para proporcionar un epítopo antigénico que es específico de la proteína o del polipéptido. El tamaño máximo no es crítico, a menos que se desee obtener anticuerpos contra un epítopo concreto. Por ejemplo, un polipéptido grande puede comprender varios epítopos, un epítopo que es particularmente útil y un segundo epítopo que es inmunodominante, etc. Típicamente, los péptidos antigénicos seleccionados de las presentes proteínas y polipéptidos oscilarán sin limitación de 5 a alrededor de 100 aminoácidos de longitud. Sin embargo, más típicamente, tal péptido antigénico tendrá un máximo de alrededor de 50 aminoácidos de longitud, y preferiblemente un máximo de alrededor de 30 aminoácidos. Normalmente suele ser deseable seleccionar una secuencia de alrededor de 6, 8, 10, 12 o 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 o 25 aminoácidos (y cualquier número entremedias).

Las secuencias de aminoácidos que comprenden epítopos útiles pueden identificarse de una serie de maneras. Por ejemplo, la preparación de una serie de péptidos cortos que en conjunto extienden la secuencia proteica completa se puede utilizar para identificar la secuencia proteica completa. El experto en la técnica puede analizar sistemáticamente en unos pocos polipéptidos grandes la presencia de un epítopo que muestra una reactividad deseada, y también analizar progresivamente los fragmentos que se solapan y más pequeños para identificar un epítopo preferido con la especificidad y la reactividad deseadas.

Como se menciona aquí, los polipéptidos y péptidos antigénicos son útiles para producir anticuerpos monoclonales y policlonales. Se pueden generar anticuerpos contra un polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, análogos polipeptídicos o porciones de los mismos, mediante los métodos que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante el cultivo continuo de líneas celulares. Estas incluyen, pero sin limitarse a ellas, técnicas de hibridoma, el hibridoma de linfocitos B humanos, y el EBV-hibridoma. Además, se pueden utilizar técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos quiméricos. Alternativamente, se pueden emplear las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios. También se pueden generar Fab que pueden contener sitios de unión específicos para un polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, o una porción de la misma. Se pueden utilizar diversos inmunoensayos para identificar anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Se conocen bien en la técnica muchos protocolos para ensayos inmunorradiométricos o de unión competitiva que utilizan bien anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidades establecidas.

Para obtener anticuerpos policlonales, un animal determinado se puede inmunizar con una proteína o con un polipéptido. El suero del animal se puede recoger y tratar de acuerdo con procedimientos conocidos. Luego, los anticuerpos policlonales contra la proteína o contra el polipéptido de interés se pueden purificar mediante cromatografía de afinidad. Las técnicas para producir antisueros policlonales son bien conocidas en la técnica.

Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se pueden generar mediante uno de los muchos procedimientos disponibles para el experto en la técnica, por ejemplo fusionando células productoras del anticuerpo con células inmortalizadas, y obteniendo de ese modo un hibridoma. La metodología general para la fusión de los linfocitos B productores de anticuerpo a una línea celular inmortal se encuentra bien dentro del campo de acción de un experto en la técnica.

Otro ejemplo es la generación de mAbs a partir del mRNA extraído de la médula ósea y de los esplenocitos de animales inmunizados usando tecnología de librerías combinatorias de anticuerpos.

Un inconveniente de los mAbs procedentes de animales o de líneas celulares derivadas es que, aunque se pueden administrar a un paciente para fines de diagnóstico o terapéutico, a menudo son reconocidos como antígenos extraños por el sistema inmunitario, y resultan inapropiados para el uso continuado. Los anticuerpos que no son reconocidos como antígenos extraños por el sistema inmunitario humano tienen un mayor potencial para el diagnóstico y tratamiento. Los procedimientos para generar anticuerpos humanos y humanizados son bien conocidos ahora en la técnica.

Se pueden construir anticuerpos quiméricos en los cuales las regiones de un mAb no humano están reemplazadas por sus homólogos humanos. Un anticuerpo quimérico preferido es uno que tiene secuencias de aminoácidos que comprenden una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de un mAb no humano que se une a un polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, o una porción de los mismos, injertada en regiones marco (FW) humanas. Los métodos para producir tales anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Los restos de aminoácidos que corresponden a las CDRs y las FWs los conoce el experto en la técnica.

Se han desarrollado multitud de métodos para preservar o potenciar la afinidad por el antígeno de anticuerpos que comprenden las CDR injertadas. Una manera es incluir en el anticuerpo quimérico los restos del marco foráneo que influyen en la conformación de las regiones CDR. Una segunda manera es injertar las CDR foráneas en los dominios variables humanos con la homología más próxima a la región variable foránea. Así pues, el injerto de una o más CDR humanas en un anticuerpo humano también puede implicar la sustitución de los restos de aminoácidos que son adyacentes a una secuencia de CDR particular o que no son contiguos a la secuencia de la CDR, sino que están empaquetados contra la CDR en la estructura global del dominio variable del anticuerpo y que afectan la conformación de la CDR. Por lo tanto, los anticuerpos humanizados de la invención incluyen anticuerpos humanos que comprenden una o más CDR no humanas, así como tales anticuerpos en los que se han realizado otras sustituciones o reemplazos para conservar o mejorar las características de unión.

Los anticuerpos quiméricos de la invención también incluyen anticuerpos que se han humanizado mediante el reemplazo de los restos expuestos en la superficie que hacen que el mAb parezca humano. Dado que el empaquetamiento interno de los restos de aminoácidos en la vecindad del sitio de unión al antígeno permanece inalterado, se conserva la afinidad. La sustitución de los restos expuestos en la superficie de un polipéptido codificado por los polinucleótidos del anticuerpo contra la NSEQ (o una porción de la misma) de acuerdo con la invención con el fin de humanización no significa la sustitución de los restos de la CDR o de los restos adyacentes que influyen en la afinidad por un polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, o una porción de la misma.

Los anticuerpos quiméricos también pueden incluir anticuerpos en los que algunos o todos los dominios constantes no humanos han sido reemplazados por los equivalentes humanos. Este enfoque tiene la ventaja de que el sitio de unión al antígeno permanece intacto. Sin embargo, pueden estar presentes cantidades significativas de secuencias no humanas cuando los dominios variables proceden completamente de anticuerpos no humanos.

Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos humanos que son anticuerpos que consisten esencialmente en secuencias humanas. Los anticuerpos humanos se pueden obtener de librerías de presentación de fagos, en el que las combinaciones de los dominios variables humanos de las cadenas ligera y pesada se presentan sobre la superficie de fagos filamentosos. Las combinaciones de los dominios variables se presentan típicamente en el fago filamentoso en forma de Fab o de scFv. La librería se puede escrutar para detectar las combinaciones que poseen fagos de dominios variables que tienen las características de unión al antígeno deseadas. Las combinaciones de dominios variables preferidas se caracterizan por una elevada afinidad por un polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, o una porción de la misma. Las combinaciones de dominios variables preferidas también se pueden caracterizar por una elevada especificidad por un polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ,

o una porción de la misma, y por una escasa reactividad cruzada con otros antígenos relacionados. Al escrutar con repertorios muy grandes de fragmentos de anticuerpos, (2 a 10 x 1010) se puede aislar una buena diversidad de mAbs de elevada afinidad, y se espera que muchos tengan afinidades de orden subnanomolar por un polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, o una porción de la misma.

Alternativamente, se pueden obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos en los que se han introducido segmentos del gen de Ig humana sin reorganizar y en los que se han inactivado los genes de Ig de ratón endógenos. Los animales transgénicos preferibles contienen fragmentos del gen de Ig contiguos muy grandes que tienen un tamaño de alrededor de 1 Mb, pero los mAbs específicos contra el polipéptido humano de moderada afinidad se pueden generar de animales transgénicos que contienen locus génicos más pequeños. Animales transgénicos capaces de expresar sólo los genes de Ig humana se pueden utilizar también para generar anticuerpos policlonales que comprenden antisuero sólo de origen animal.

Los anticuerpos de la invención pueden incluir aquéllos para los cuales se han mejorado las características de unión mediante mutación directa o mediante métodos de maduración de la afinidad. La afinidad y la especificidad se pueden modificar o mejorar mediante la mutación de las CDR y mediante el escrutinio de los sitios de unión al antígeno que tienen las características deseadas. Las CDR se pueden mutar de muchos modos. Una manera es

aleatorizar cada restos individuales o combinaciones de restos de tal forma que en una población de sitios de unión a antígeno, por lo demás idénticos, los veinte aminoácidos se pueden encontrar en posiciones concretas. Alternativamente, se pueden inducir mutaciones a lo largo de un intervalo de restos de CDR mediante métodos de PCR propensa a error. Los vectores de presentación de fagos que contienen el gen de la región variable de las cadenas ligera y pesada se pueden propagar en cepas mutadoras de E. coli. Estos métodos de mutagénesis son ilustrativos de los muchos métodos conocidos por el experto en la técnica.

El anticuerpo puede comprender adicionalmente un marcador detectable (molécula informadora) unido a éste. En la presente memoria se proporcionan métodos para producir anticuerpos capaces de unirse específicamente a uno de un polipéptido, fragmentos polipeptídicos, o análogos polipeptídicos descritos en la presente memoria, pudiendo comprender el método: a) inmunizar un mamífero (por ejemplo, ratón, un mamífero transgénico capaz de producir Ig humana, etc.) con una cantidad adecuada de una PSEQ descrita en la presente memoria, que incluye, por ejemplo, un

fragmento polipeptídico que comprende al menos 6 (por ejemplo, 8, 10, 12, etc.) aminoácidos consecutivos de una PSEQ; b) recoger el suero del mamífero; y c) aislar los anticuerpos específicos contra el polipéptido que hay en el suero del mamífero.

El método puede además comprender la etapa de administrar una segunda dosis al mamífero (por ejemplo, animal).

También se engloban en la presente memoria y se conocen en la técnica métodos para producir un hibridoma que segrega un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido. El método puede comprender:

a) inmunizar un mamífero (por ejemplo, ratón, un mamífero transgénico capaz de producir Ig humana, etc.) con una cantidad adecuada de una PSEQ del mismo; b) obtener linfocitos del animal inmunizado obtenido de (a);

c) fusionar los linfocitos con una célula inmortalizada para producir células híbridas; y d) seleccionar las células híbridas que producen anticuerpos que se unen específicamente a una PSEQ del mismo.

También se describe en la presente memoria un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a uno del polipéptido descrito en la presente memoria, pudiendo comprender el método:

a) sintetizar una librería de anticuerpos (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno) en fagos o ribosomas; b) escrutar repetidamente la librería frente a una muestra poniendo en contacto el fago o los ribosomas con una composición que comprende un polipéptido o fragmento polipeptídico descrito en la presente memoria;

c) aislar el fago que se une al polipéptido o fragmento polipeptídico; y d) obtener un anticuerpo del fago o de los ribosomas. El anticuerpo puede obtenerse así, por ejemplo, a partir de una librería (por ejemplo, librería de bacteriófagos) que se puede preparar, por ejemplo, mediante

a) extracción de las células que son responsables de la producción de anticuerpos en un mamífero hospedante; b) aislamiento del RNA de las células de (a); c) retrotranscripción del mRNA para producir cDNA; d) amplificación del cDNA con un cebador (específico del anticuerpo); y e) inserción del cDNA de (d) en un vector de presentación de fagos o casete de presentación de ribosomas,

de tal forma que los anticuerpos se expresen en el fago o en los ribosomas. A fin de generar anticuerpos, el animal hospedante se puede inmunizar con el polipéptido y/o un fragmento polipeptídico y/o análogo descrito en la presente memoria para inducir una respuesta inmunitaria antes de extraer las células que son responsables de la producción de los anticuerpos.

Los anticuerpos obtenidos por los medios descritos en la presente memoria pueden ser útiles para detectar proteínas, polipéptidos variantes y derivados en los tejidos específicos o en los fluidos corporales. Además, la detección de fragmentos proteicos o proteínas expresados de forma aberrante es una prueba de un estado patológico. Por ejemplo, la expresión de los polipéptidos presentes codificados por los polinucleótidos de la NSEQ, o una porción de la misma, puede indicar que la proteína se está expresando a un ritmo inadecuado o en una etapa del desarrollo inadecuada. Por consiguiente, los presentes anticuerpos pueden ser útiles para detectar enfermedades asociadas con la expresión de la proteína de las NSEQ descritas en la presente memoria.

Para los fines de detección in vivo, los anticuerpos pueden ser aquellos que reconocen preferiblemente un epítopo presente en la superficie de una célula tumoral.

Se conocen bien en la técnica una serie de protocolos para medir los polipéptidos, entre ellos ELISA, RIA y FACS, y proporcionan una base para diagnosticar niveles de expresión anómalos o alterados. Los valores estándares para la expresión polipeptídica se establecen mediante la combinación de muestras tomadas de sujetos sanos, preferiblemente humanos, con anticuerpos contra el polipéptido en condiciones para la formación de complejos. La cantidad de complejo formado se puede cuantificar mediante distintos métodos, tales como medios fotométricos. Las cantidades de polipéptido expresado en las muestras de la enfermedad se pueden comparar con los valores estándar. La desviación entre los valores estándar y el problema puede establecer los parámetros para diagnosticar

o monitorizar una enfermedad.

El diseño de los inmunoensayos está sujeto a una gran cantidad de variaciones y se conocen muchos de ellos en la técnica. Los inmunoensayos pueden utilizar un reactivo de anticuerpo monoclonal o policlonal que se dirige contra un epítopo del antígeno a ensayar. Alternativamente, puede utilizarse una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales que se dirigen contra más de un epítopo. Los protocolos se pueden basar, por ejemplo, en la competición, donde se pueden utilizar ensayos competitivos de escrutinio de fármacos en los que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse al polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, o una porción de la misma, compiten específicamente con un compuesto de ensayo por la unión al polipéptido. Alternativamente, se pueden utilizar reacciones directas entre el anticuerpo y el antígeno o ensayos de tipo sándwich, y los protocolos pueden, por ejemplo, hacer uso de soportes sólidos o de inmunoprecipitación. Además, por facilidad de detección, los anticuerpos pueden estar marcados con una molécula informadora. También se conocen ensayos que amplifican la señal de un reactivo unido. Los ejemplos incluyen inmunoensayos que utilizan avidina y biotina, o que utilizan conjugados de antígenos o anticuerpos marcados con enzimas, tal como los ensayos ELISA.

Los kits adecuados para el inmunodiagnóstico y que contienen los reactivos marcados apropiados incluyen los anticuerpos dirigidos contra los epítopos proteicos o regiones antigénicas de polipéptidos, envasados apropiadamente con los reactivos restantes y los materiales necesarios para la realización del ensayo, así como un conjunto adecuado de instrucciones para el ensayo.

Se da a conocer en la presente memoria un kit para detectar específicamente un polipéptido descrito en la presente memoria, en el que el kit puede comprender, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse específicamente al polipéptido descrito en la presente memoria.

El kit puede ser un kit de diagnóstico, que puede comprender:

a) uno o más anticuerpos descritos en la presente memoria; y

b) un reactivo de detección que puede comprender un grupo informador.

Los anticuerpos pueden estar inmovilizados sobre un soporte sólido. El reactivo de detección puede comprender, por ejemplo, una antiinmunoglobulina, proteína G, proteína A o lectina, etc. El grupo informador se puede seleccionar, sin limitación, del grupo que consiste en radioisótopos, grupos fluorescentes, grupos luminiscentes, enzimas, biotina y partículas colorantes.

Uso de NSEQ, PSEQ como diana terapéuticas

El experto en la técnica apreciará fácilmente que las NSEQ, PSEQ, sistemas de expresión, ensayos, kits y matrices explicados más arriba también pueden utilizarse para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico determinado, en estudios con animales, en ensayos clínicos, o para monitorizar el tratamiento de un paciente. Una vez que se establece la presencia de la enfermedad y se inicia un protocolo de tratamiento, se pueden repetir los ensayos de hibridación o amplificación con regularidad para determinar si el nivel de mRNA o de proteína en el paciente (sangre, tejido, célula, etc., del paciente) comienza a aproximarse al nivel observado en un sujeto sano. Los resultados obtenidos de ensayos sucesivos pueden utilizarse para mostrar la eficacia del tratamiento a lo largo de un tiempo que oscila de varios días a muchos años.

NSEQ se puede utilizar terapéuticamente con el objeto de expresar mRNA y polipéptido, o por el contrario, para bloquear la transcripción y/o traducción del mRNA. Los vectores de expresión se pueden construir con elementos de retrovirus, adenovirus, virus del herpes o virus de la vacuna, o plásmidos bacterianos, y similares. Estos vectores pueden utilizarse para suministrar secuencias nucleotídicas a un órgano, tejido o población celular diana

particulares. Los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica pueden utilizarse para construir vectores para expresar las secuencias de ácidos nucleicos o sus complementos.

Alternativamente, la NSEQ puede utilizarse para la genoterapia con células somáticas o con células madre. Los vectores pueden introducirse in vivo, in vitro y ex vivo. Para el tratamiento ex vivo, los vectores se introducen en células madre tomadas del sujeto, y las células transgénicas resultantes se propagan clonalmente para el trasplante autólogo nuevamente en el mismo sujeto. El suministro de la NSEQ mediante transfección, inyecciones de liposomas o aminopolímeros policatiónicos se puede conseguir mediante métodos que son bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, la expresión endógena de NSEQ se puede inactivar mediante métodos de recombinación homóloga que insertan una secuencia génica inactiva en la región codificante u otra región diana de la NSEQ.

Según el objetivo específico a conseguir, los vectores que contienen la NSEQ pueden introducirse en una célula o tejido para expresar un polipéptido ausente, o para reemplazar un polipéptido no funcional. Por supuesto, cuando se desea expresar la PSEQ en una célula o tejido, se puede utilizar una NSEQ capaz de codificar tal PSEQ para ese fin, o se puede administrar directamente la PSEQ a dicha célula o tejido.

Por otra parte, cuando se desea atenuar o inhibir la expresión de la PSEQ, se puede utilizar una NSEQ (por ejemplo, una NSEQ inhibidora) que es sustancialmente complementaria a al menos una porción de una NSEQ capaz de codificar tal PSEQ.

La expresión de una NSEQ inhibidora se puede realizar clonando la NSEQ inhibidora en un vector e introduciendo el vector en una célula para disminuir la expresión de un polipéptido codificado por la NSEQ diana. Las secuencias antisentido o complementarias también pueden comprender un oligonucleótido procedente del sitio de inicio de la transcripción; se pueden usar nucleótidos entre las posiciones de alrededor de - 10 y +10 desde el ATG. Por lo tanto, la NSEQ inhibidora puede englobar una porción que es sustancialmente complementaria a una molécula de ácido nucleico deseada a inhibir y una porción (secuencia) que se une a una porción no traducida del ácido nucleico.

De igual forma, la inhibición puede conseguirse con la metodología de apareamiento de bases de triple hélice. El apareamiento de la triple hélice es útil porque provoca la inhibición de la capacidad de la doble hélice para abrirse lo suficiente para que se unan las polimerasas, los factores de transcripción o las moléculas reguladoras. Se han escrito en la bibliografía avances terapéuticos recientes que utilizan el DNA triple (véase, por ejemplo, Gee et al., 1994).

Las ribozimas, moléculas de RNA con actividad enzimática, también pueden utilizarse para catalizar la escisión del mRNA y disminuir la cantidad de determinados mRNA, tales como los que comprenden las secuencias polinucleotídicas descritas en la presente memoria. Las ribozimas pueden escindir el mRNA en sitios de escisión específicos. Alternativamente, las ribozimas pueden escindir los mRNA en posiciones dictadas por las regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarias con el mRNA diana. La construcción y la producción de las ribozimas son bien conocidas en la técnica.

Las moléculas de RNA se pueden modificar para incrementar la estabilidad intracelular y la semivida. Las modificaciones posibles incluyen, pero sin limitarse a, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos en 5’ y/o 3’ de la molécula, o el uso de fosforotioato o 2’ O-metilo en vez de enlaces de fosfodiéster dentro del esqueleto de la molécula. Alternativamente, se pueden añadir bases no tradicionales tales como inosina, queosina y wibutosina, así como acetil-, metil-, tio- y formas modificadas de forma similar, de adenina, citidina, guanina, timina y uridina que las endonucleasas endógenas no reconocen con facilidad.

El uso de composiciones farmacéuticas también está englobado por la presente invención. La composición farmacéutica puede comprender al menos una NSEQ o PSEQ y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se apreciará por los expertos en la técnica, la especificidad de expresión de NSEQ y/o PSEQ en células tumorales se puede usar ventajosamente para inducir una respuesta inmunitaria (a través de su administración) en un individuo que tiene, o se sospecha que tiene un tumor que expresa tal secuencia. La administración de NSEQ y/o PSEQ en individuos con riesgo de desarrollar un tumor que expresa tal secuencia también está englobada aquí.

Además de los ingredientes activos, una composición farmacéutica puede contener vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente.

Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente tanto mediante ensayos de cultivo de células como mediante modelos de animales tales como ratones, ratas, conejos, perros o cerdos. Un modelo de animal también puede utilizarse para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración. A continuación, tal información puede utilizarse para determinar las dosis útiles y las vías para la administración en los seres humanos. Estas técnicas las conoce bien el experto en la técnica, y una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de ingrediente activo que mejora los síntomas o la afección. La eficacia y la toxicidad terapéuticas se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células o con animales experimentales, tales como mediante el cálculo y la comparación estadística de la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población). Cualquiera

de las composiciones terapéuticas descritas más arriba se pueden aplicar a cualquier sujeto que necesite tal tratamiento, incluyendo, pero sin limitarse a, mamíferos tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos y, lo más preferiblemente, seres humanos.

Las composiciones farmacéuticas utilizadas en esta invención se pueden administrar por muchas vías, incluyendo, pero sin limitarse a, oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual o rectal.

El término “tratamiento”, para los fines de esta descripción, se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en el que el objetivo es prevenir o retrasar (aliviar) el trastorno o la afección patológica de interés. Los que necesitan tratamiento incluyen a quienes ya padecen el trastorno, así como a los propensos a padecer el trastorno, o a los que hay que prevenir del trastorno.

Uso de NSEQ en la investigación general

En la presente memoria se dan a conocer productos, composiciones, procedimientos y métodos que utilizan una NSEQ, un polipéptido codificado por una NSEQ descrita aquí, una PSEQ descrita aquí, para propósitos de investigación, biológicos, clínicos y terapéuticos. Por ejemplo, para identificar variantes de ayuste, mutaciones y polimorfismos, y para generar herramientas de diagnóstico o de pronóstico.

La NSEQ se puede extender utilizando una secuencia nucleotídica parcial y empleando diferentes métodos basados en la PCR conocidos en la técnica para detectar secuencias en dirección 5’, tal como promotores y otros elementos reguladores. Adicionalmente, se puede utilizar un kit XL-PCR (PE Bioystems, Foster City, Calif.), cebadores anidados, y librerías de cDNA disponibles en el mercado (Life Technologies, Rokville Md.) o librerías genómicas (Clontech, Palo Alto, Calif.) para extender la secuencia.

Los polinucleótidos (NSEQ) también pueden utilizarse como dianas en una micromatriz. La micromatriz se puede utilizar para monitorizar los patrones de expresión de una gran cantidad de genes simultáneamente, y para identificar las variantes de ayuste, las mutaciones y los polimorfismos. La información procedente de los análisis de los patrones de expresión se puede utilizar para determinar la función génica, para identificar una célula, tipo celular

o tejido particular, para entender la base genética de una enfermedad, para diagnosticar una enfermedad, y para desarrollar y monitorizar las actividades de los fármacos terapéuticos utilizados para tratar la enfermedad. Las micromatrices también pueden utilizarse para detectar la diversidad genética, polimorfismos de un sólo nucleótido que pueden caracterizar una población concreta, a nivel genómico.

Los polinucleótidos (NSEQ) se pueden utilizar para generar sondas de hibridación útiles para cartografiar la secuencia genómica de origen natural. La hibridación fluorescente in situ (FISH) se puede correlacionar con otras técnicas de cartografiado físico del cromosoma y datos del cartografiado genético.

Se ha de entender aquí que una secuencia que está aumentada en una célula de cáncer ovárico (por ejemplo, célula de cáncer ovárico maligno) puede representar una secuencia que está implicada en o es responsable del crecimiento, desarrollo, malignidad, etc., de la célula cancerosa (denominada aquí como un regulador positivo de cáncer ovárico). También se ha de entender que una secuencia que está disminuida (no expresada, o expresada en niveles bajos) en una célula de cáncer ovárico maligno puede representar una secuencia que es responsable del mantenimiento del estado normal (sin transformar) de una célula ovárica (denominada aquí como un regulador negativo de cáncer ovárico). Por lo tanto, tanto la presencia o ausencia de algunas secuencias puede ser indicativo de la enfermedad, o puede ser indicativo de la enfermedad, probabilidad de tener la enfermedad, grado de gravedad de la enfermedad (estadificación).

Por lo tanto, se describe aquí un polinucleótido aislado (por ejemplo, forma exógena de) que puede comprender un miembro seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polinucleótido que puede comprender o consistir en una cualquiera de SEQ ID NO.:1 a SEQ ID NO.49 y SEQ ID NO.169,

b) un polinucleótido que puede comprender el marco de lectura abierto de una cualquiera de SEQ ID NO.:1 a SEQ ID NO.49 y SEQ ID NO.169,

c) un polinucleótido que puede comprender una porción transcrita o transcribible de una cualquiera de SEQ. ID. NOs:1 a 49 y 169, que puede estar, por ejemplo, libre de porción o porciones no traducidas o no traducibles,

d) un polinucleótido que puede comprender una porción traducida o traducible de una cualquiera de SEQ. ID. NOs:1 a 49 y 169 (por ejemplo, porción codificante),

e) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, de alrededor de 50 a 100%, o alrededor de 60 a 100%, o alrededor de 70 a 100% o alrededor de 80 a 100% o

alrededor de 85, 90, 95 a 100% idéntica a lo largo de toda la secuencia o porción de secuencias) a a), b), c),

o d);

f) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente complementaria (por ejemplo, de alrededor de 50 a 100%, o alrededor de 60 a 100%, o alrededor de 70 a 100% o alrededor de 80 a 100% o alrededor de 85, 90, 95 a 100% complementaria a lo largo de toda la secuencia o porción de secuencias) a a), b), c), o d); y

g) un fragmento de uno cualquiera de a) a f)

incluyendo polinucleótidos que consisten en lo anterior.

Más específicamente, se describen aquí polinucleótidos expresados que se seleccionan del grupo que consiste en:

a) un polinucleótido que puede comprender o consistir en una cualquiera de SEQ ID NO.:1, SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:19, SEQ ID NO.:20, SEQ ID NO.:22, SEQ ID NO.:28, SEQ ID NO.:37, SEQ ID NO.:41, SEQ ID NO.:45, SEQ ID NO.:46, SEQ ID NO.:47 y SEQ ID NO.:49, e incluso más específicamente aquellas que se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.:19, SEQ ID NO.: 22, SEQ ID NO.:37, SEQ ID NO.:41, SEQ ID NO.:45, SEQ ID NO.:46 y SEQ ID NO.:49,

b) un polinucleótido que puede comprender el marco de lectura abierto de una cualquiera de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:19, SEQ ID NO.:20, SEQ ID NO.:22, SEQ ID NO.:28, SEQ ID NO.:37, SEQ ID NO.:41, SEQ ID NO.:45, SEQ ID NO.:46, SEQ ID NO.:47 y SEQ ID NO.:49, e incluso más específicamente aquellas que se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:19, SEQ ID NO.:22, SEQ ID NO.:37, SEQ ID NO.:41, SEQ ID NO.:45, SEQ ID NO.:46 y SEQ ID NO.:49,

c) un polinucleótido que puede comprender una porción transcrita o transcribible de una cualquiera de SEQ ID NO.:1, SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:19, SEQ ID NO.:20, SEQ ID NO.:22, SEQ ID NO.:28, SEQ ID NO.:37, SEQ ID NO.:41, SEQ ID NO.:45, SEQ ID NO.:46, SEQ ID NO.:47 y SEQ ID NO.:49, e incluso más específicamente aquellas que se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.:19, SEQ ID NO.:22, SEQ ID NO.:37, SEQ ID NO.:41, SEQ ID NO.:45, SEQ ID NO.:46 y SEQ ID NO.:49, que puede estar, por ejemplo, libre de porción o porciones no traducidas o no traducibles,

d) un polinucleótido que puede comprender una porción traducida o traducible de una cualquiera de SEQ ID NO.:1, SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:19, SEQ ID NO.:20, SEQ ID NO.:22, SEQ ID NO.:28, SEQ ID NO.:37, SEQ ID NO.:41, SEQ ID NO.:45, SEQ ID NO.:46, SEQ ID NO.:47 y SEQ ID NO.:49, e incluso más específicamente aquellas que se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:19, SEQ ID NO.:22, SEQ ID NO.:37, SEQ ID NO.:41, SEQ ID NO.:45, SEQ ID NO.:46 y SEQ ID NO.:49, (por ejemplo, porción codificante),

e) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, de alrededor de 50 a 100%, o alrededor de 60 a 100% o alrededor de 70 a 100% o alrededor de 80 a 100% o alrededor de 85, 90, 95 a 100% idéntica a lo largo de toda la secuencia o porción de secuencias) a a), b), c),

o d);

f) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente complementaria (por ejemplo, de alrededor de 50 a 100%, o alrededor de 60 a 100% o alrededor de 70 a 100% o alrededor de 80 a 100% o alrededor de 85, 90, 95 a 100% complementaria a lo largo de toda la secuencia o porción de secuencias) a a), b), c), o d); y

g) un fragmento de uno cualquiera de a) a f)

incluyendo polinucleótidos que consisten en lo anterior.

Los vectores (por ejemplo, un vector vírico, un vector de mamífero, un plásmido, un cósmido, etc.) pueden comprender los polinucleótidos descritos aquí. El vector puede ser, por ejemplo, un vector de expresión.

Se describe aquí una librería de polinucleótido que comprende al menos un polinucleótido (por ejemplo, al menos dos, etc.) descrito aquí (puede incluir SEQ ID NO.:50). La librería puede ser, por ejemplo, una librería de expresión. Algunos o todos los polinucleótidos descritos aquí pueden estar contenidos dentro de un vector de expresión. Una librería polipeptídica puede comprender al menos un (por ejemplo, al menos dos, etc.) polipéptido como se describe aquí.

Se describen aquí matrices que pueden comprender al menos un polinucleótido (por ejemplo, al menos dos, etc.) descrito aquí.

También se describe aquí una célula aislada (por ejemplo, una célula viva aislada, tal como una célula de mamífero aislada, una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, etc.) que puede comprender el polinucleótido, el vector o el polipéptido descrito aquí.

También se describe aquí una composición que comprende el polinucleótido y/o polipéptido descrito aquí.

Según la presente invención, la composición puede ser, por ejemplo, una composición farmacéutica que puede comprender un polinucleótido y/o un polipéptido descrito aquí, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Más específicamente, la composición farmacéutica se puede usar para el tratamiento de cáncer ovárico y/o para inhibir el crecimiento de una célula de cáncer ovárico.

Los fragmentos polinucleotídicos de los enunciados anteriormente incluyen polinucleótidos que comprenden al menos 10 ácidos nucleicos, que pueden ser idénticos a una porción correspondiente de uno cualquiera de a) a e), y más particularmente a una porción codificante de una cualquiera de SEQ ID NO.:1 a 49, 50 ó 169.

Otro ejemplo de fragmentos polinucleotídicos incluye polinucleótidos que comprenden al menos 10 ácidos nucleicos que pueden ser sustancialmente complementarios a una porción correspondiente de una porción codificante de una cualquiera de SEQ ID NO.:1 a 49, 50 ó 169, y engloban, por ejemplo, fragmentos seleccionados del grupo que consiste en una cualquiera de SEQ ID NO.:103 a 150.

Estas secuencias anteriores pueden representar marcadores poderosos de cáncer, y más particularmente de cáncer ovárico, cáncer de mama, cáncer de próstata, leucemia, melanoma, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer del sistema nervioso central, y cualquier combinación de los mismos.

Basándose en los resultados presentados aquí y al leer la presente descripción, una persona experta en la técnica entenderá que la aparición de una señal positiva con el ensayo (hibridación, amplificación mediante PCR, etc.) para la presencia de una secuencia dada entre aquellas expresadas en una célula cancerosa, indica que tal secuencia se expresa específicamente en ese tipo de célula cancerosa. Una persona experta en la técnica también entenderá que las secuencias que se expresan específicamente en ciertos tipos de células cancerosas se pueden usar para desarrollar herramientas para la detección de este tipo específico de célula cancerosa, y también se pueden usar como dianas en el desarrollo de fármacos contra el cáncer.

Una señal positiva puede estar en forma de una banda en un gel tras la electroforesis, transferencia Northern o transferencia Western, un fragmento de PCR detectado por emisión de fluorescencia, etc.

Como se entenderá, las secuencias que son particularmente útiles para el desarrollo de herramientas para la detección de célula cancerosa se pueden expresar preferiblemente a menores niveles en al menos algunas células normales (células no cancerosas).

Por ejemplo, en la Figura 57 y descripción relacionada, la aparición de una banda con la amplificación mediante RT-PCR de mRNAs obtenidos de células de cáncer ovárico, células de cáncer renal, células de cáncer pulmonar, células de cáncer de mama y células de melanoma indica que SEQ ID NO.:1 se expresa en tales células cancerosas, y que por lo tanto SEQ ID NO.:1 puede representar un marcador válido y una diana para estos tipos de células cancerosas. Se pueden derivar conclusiones similares de los resultados obtenidos de otras Figuras y descripción relacionada.

Las NSEQs escogidas entre aquellas que son sustancialmente complementarias a las enunciadas en la Tabla 2, o a fragmentos de aquellas de la Tabla 2, se pueden usar para el tratamiento del cáncer.

Se describe aquí un método para identificar una célula cancerosa. El método puede comprender poner en contacto una célula, una muestra de células (lisado celular), un fluido corporal (sangre, orina, plasma, saliva, etc.), o un tejido, con un reactivo que puede ser, por ejemplo, capaz de unirse específicamente a al menos una NSEQ o PSEQ descrita aquí. El método puede comprender más particularmente poner en contacto una secuencia aislada o derivada de tal célula, muestra, fluido o tejido. El complejo formado se puede detectar usando métodos conocidos en la técnica.

La presencia del complejo mencionado anteriormente puede ser indicativa (una indicación positiva de la presencia) de la presencia de una célula cancerosa.

También se describe aquí un método para el diagnóstico o pronóstico del cáncer. El método puede comprender, por ejemplo, detectar, en una célula, tejido, muestra, fluido corporal, etc., al menos una NSEQ o PSEQ descrita aquí.

La célula, muestra de células, fluido corporal o tejido puede originarse, por ejemplo, de un individuo que tiene o que se sospecha que tiene un cáncer, y más particularmente cáncer ovárico, cáncer de mama, cáncer de próstata, leucemia, melanoma, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de pulmón y/o cáncer del sistema nervioso central.

Cualquiera de los métodos mencionados anteriormente puede comprender además comparar el nivel obtenido con al menos un nivel o valor de referencia.

La detección de NSEQ puede requerir una etapa de amplificación (por ejemplo, PCR), a fin de tener suficiente material para los fines de detección.

Según la presente invención, el polinucleótido descrito aquí puede comprender, por ejemplo, una molécula de RNA, una molécula de DNA, incluyendo aquellas que son parciales o completas, monocatenarias o bicatenarias, híbridos, modificadas por un grupo, etc.

Se describe aquí el uso de al menos una NSEQ o PSEQ descrita aquí, y anticuerpos derivados, en la fabricación de una composición para la identificación o detección de una célula cancerosa (por ejemplo, una célula tumoral) o para inhibir o reducir el crecimiento de la célula cancerosa (por ejemplo, para el tratamiento de cáncer ovárico u otro cáncer).

Puesto que algunas NSEQ y PSEQ se expresan en mayores niveles en cáncer ovárico maligno que en la detección de LMP de tal NSEQ o PSEQ en una muestra procedente de un individuo (o in vivo), se puede descartar un cáncer ovárico de bajo potencial maligno, y se puede concluir por lo tanto en un diagnóstico de un cáncer ovárico maligno. Además, la detección de la NSEQ o PSEQ en una célula, tejido, muestra o fluido corporal procedente de un individuo también puede ser indicativa de un cáncer ovárico maligno de etapa tardía. Como tal, se pueden comenzar las terapias adaptadas para el tratamiento de un cáncer ovárico maligno o un cáncer ovárico maligno de etapa tardía.

Según una realización de la presente invención, el método también puede comprender una etapa de comparar cualitativa o cantitativamente el nivel (cantidad, presencia) de al menos un complejo presente en la célula de ensayo, muestra de ensayo, fluido de ensayo o tejido de ensayo, con el nivel de complejo en una célula normal, una muestra de células normales, un fluido corporal normal, un tejido normal o un valor de referencia (por ejemplo, para un estado no canceroso).

La célula normal puede ser cualquier célula que no exprese sustancialmente la secuencia deseada a detectar. Los ejemplos de tales células normales están incluidos, por ejemplo, en la descripción de la sección de dibujos. Una muestra de células o tejido normal incluye así, por ejemplo, una célula ovárica normal (no cancerosa), una célula de mama normal, una célula de próstata normal, un linfocito normal, una célula de piel normal, una célula renal normal, una célula de colon normal, una célula pulmonar normal y/o una célula normal del sistema nervioso central. Para fines comparativos, una célula normal se puede escoger de aquellas de tipo celular idéntico o similar.

Por supuesto, se puede llevar a cabo la presencia de más de un complejo, a fin de incrementar la precisión del método de diagnóstico. Como tal, se pueden detectar al menos dos complejos (por ejemplo, formados por un primer reactivo y un primer polinucleótido, y un segundo reactivo o un segundo polinucleótido) o múltiples complejos.

Una realización ejemplar de un reactivo que se puede usar para detectar una NSEQ descrita aquí es un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente complementaria a la NSEQ.

Un nivel o valor de referencia adecuado puede derivar, por ejemplo, del nivel de expresión de una secuencia especificada en un cáncer ovárico de bajo potencial maligno y/o de una célula normal.

Se entenderá aquí que un mayor nivel de expresión, medido en una célula, tejido o muestra cancerosa, en comparación con un valor o muestra de referencia, es indicativo de la presencia de cáncer en el individuo ensayado.

Por ejemplo, el mayor nivel medido en una célula ovárica, tejido ovárico o una muestra de origen ovárico, en comparación con un nivel o valor de referencia para una célula normal (célula ovárica normal o célula no ovárica normal), puede ser indicativo de un cáncer ovárico. Para fines de comparación, la presencia o nivel de expresión de una NSEQ o PSEQ deseada a detectar o identificar se puede comparar con la presencia, nivel de expresión, encontrada en una célula normal que se ha mostrado aquí que no expresa la secuencia deseada.

Los usos y métodos terapéuticos también están englobados aquí.

Por lo tanto, la invención proporciona polinucleótidos que pueden ser capaces de reducir o inhibir el crecimiento de una célula de cáncer ovárico (por ejemplo, en un mamífero o célula de mamífero del mismo).

Se describe aquí el uso de una secuencia polinucleotídica que se puede seleccionar del grupo que consiste en

a) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente complementaria a cualquiera de SEQ ID NO.:1 a SEQ ID NO.49, 50 ó 169,

b) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente complementaria a una porción transcrita o transcribible de una cualquiera de SEQ ID NO.:1 a SEQ ID NO.49, 50 ó 169,

c) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente complementaria a una porción traducida o traducible de una cualquiera de SEQ ID NO.:1 a SEQ ID NO.49, 50 ó 169, y

d) un fragmento de uno cualquiera de a) a c)

para reducir, disminuir o inhibir el crecimiento de una célula cancerosa.

El polinucleótido se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en polinucleótidos que pueden comprender una secuencia de al menos 10 nucleótidos que es complementaria a la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NO.:1 a SEQ ID NO.49, 50 ó 169 (a una porción traducida que puede estar libre, por ejemplo, de porciones no traducidas).

Se describe aquí la inmunización de un individuo al administrar una NSEQ (por ejemplo, en un vector de expresión)

o una PSEQ.

Se describe aquí un método para reducir o ralentizar el crecimiento de una célula de cáncer ovárico en un individuo que lo necesite. El método puede comprender administrar al individuo una secuencia polinucleotídica que se puede seleccionar del grupo que consiste en

a) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente complementaria (incluyendo también 100% complementaria a lo largo de una porción, por ejemplo un emparejamiento perfecto) a cualquiera de SEQ ID NO.:1 a SEQ ID NO.49 y 169 ó 50,

b) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente complementaria (incluyendo también 100% complementaria a lo largo de una porción, por ejemplo un emparejamiento perfecto) a una porción transcrita o transcribible de una cualquiera de SEQ ID NOs:1 a 49 y 169 ó 50,

c) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente complementaria (incluyendo también 100% complementaria a lo largo de una porción, por ejemplo un emparejamiento perfecto) a una porción traducida o traducible de una cualquiera de SEQ ID NOs:1 a 49 y 169 ó 50, y

d) un fragmento de uno cualquiera de a) a c).

También se describe aquí una molécula de siRNA o shRNA que es capaz de reducir la expresión de un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en

a) un polinucleótido que puede comprender una cualquiera de SEQ. ID NO.:1 a SEQ ID NO.:49 y SEQ ID NO.:169, o SEQ ID NO.:50,

b) un polinucleótido que puede comprender una porción transcrita o transcribible de una cualquiera de SEQ. ID. NOs:1 a 49 y 169, o SEQ ID NO.:50,

c) un polinucleótido que puede comprender una porción traducida o traducible de una cualquiera de SEQ. ID. NOs:1 a 49 y 169 o SEQ ID NO.:50, y;

d) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente idéntica a a), b), o c).

Los ejemplos de polinucleótidos son aquellos que, por ejemplo, pueden ser capaces de inhibir el crecimiento de una célula de cáncer ovárico, tal como, por ejemplo, un polinucleótido que tiene o que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una cualquiera de SEQ ID NO. 103 a 150. Estas secuencias específicas se proporcionan solamente como guía.

También se proporciona un kit para el diagnóstico de cáncer. El kit puede comprender al menos un polinucleótido como se describe aquí y/o un reactivo capaz de unirse específicamente a al menos un polinucleótido descrito aquí.

También se describe aquí un polipéptido aislado codificado por el polinucleótido descrito aquí.

Más particularmente, se proporciona un polipéptido aislado que se puede seleccionar del grupo que consiste en

a) un polipéptido que puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO.:51 a 88 y 170,

b) un polipéptido que puede estar codificado por uno cualquiera del polinucleótido descrito aquí,

c) un fragmento de uno cualquiera de a) o b),

d) un derivado de uno cualquiera de a) o b), y

e) un análogo de uno cualquiera de a) o b).

El análogo puede comprender, por ejemplo, al menos una sustitución, supresión o inserción de aminoácidos en su secuencia de aminoácidos.

La sustitución puede ser conservativa o no conservativa. El análogo polipeptídico puede ser un análogo biológicamente activo o un análogo inmunógeno que puede comprender, por ejemplo, al menos una sustitución de aminoácidos (conservativa o no conservativa), por ejemplo 1 a 5, 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 50, etc. (incluyendo cualquier número entremedias) en comparación con la secuencia original. Un análogo inmunógeno puede

comprender, por ejemplo, al menos una sustitución de aminoácido en comparación con la secuencia original, y todavía se puede unir por un anticuerpo específico contra la secuencia original.

Un fragmento polipeptídico puede comprender, por ejemplo, al menos 6 aminoácidos consecutivos, al menos 8 aminoácidos consecutivos o más de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en polipéptidos codificados por un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO.: 1 a 49 y 169 o una cualquiera de SEQ. ID. NOs:51 a 88 y 170, incluyendo sus variantes y análogos. El fragmento puede ser inmunogénico, y se puede usar con el fin de, por ejemplo, generar anticuerpos.

Los ejemplos de polipéptido son aquellos que se pueden codificar mediante una cualquiera de SEQ ID NO.: 1 a 49 y 169, más particularmente aquellos codificados por uno cualquiera de SEQ ID NO.:1, 14, 16, 19, 20, 22, 28, 37, 41, 45, 46, 47 ó 49, e incluso más particularmente aquellos codificados por una cualquiera de SEQ ID NO.: 14, 19, 22, 37, 41, 45, 46 ó 49.

Se describe aquí un polipéptido que puede ser codificado por la secuencia aislada expresada diferencialmente descrita aquí. También se describe aquí el polipéptido codificado por el polinucleótido ortólogo no humano, sus análogos, derivados y fragmentos.

Una persona experta en la técnica puede determinar fácilmente la posible secuencia peptídica codificada por una secuencia de ácido nucleico particular, ya que generalmente existe en una secuencia codificante particular un máximo de 6 marcos de lectura abiertos posibles. El primer marco de lectura abierto posible puede comenzar en el primer nucleótido (5’-3’) de la secuencia, usando por lo tanto, en una dirección desde 5’ a 3’, los nucleótidos nº 1 a 3 como el primer codón, usando los nucleótidos 4 a 6 como el segundo codón, etc. El segundo marco de lectura abierto posible puede comenzar en el segundo nucleótido (5’-3’) de la secuencia, usando por lo tanto, en una dirección de 5’ a 3’, los nucleótidos nº 2 a 4 como el primer codón, usando los nucleótidos 5 a 7 como el segundo codón, etc. Finalmente, el tercer marco de lectura abierto posible puede comenzar en el tercer nucleótido (5’-3’) de la secuencia, usando por lo tanto, en una dirección de 5’ a 3’, los nucleótidos nº 3 a 5 como el primer codón, usando los nucleótidos 6 a 8 como el segundo codón, etc. El cuarto marco de lectura abierto posible puede comenzar en el primer nucleótido de la secuencia en una dirección de 3’ a 5’, usando por lo tanto, en la dirección de 3’ a 5’, los nucleótidos nº 1 a 3 como el primer codón, usando los nucleótidos 4 a 6 como el segundo codón, etc. El quinto marco de lectura abierto posible puede comenzar en el segundo nucleótido de la secuencia en una dirección de 3’ a 5’, usando por lo tanto, en una dirección de 3’ a 5’, los nucleótidos nº 2 a 4 como el primer codón, usando los nucleótidos 5 a 7 como el segundo codón, etc. Finalmente, el sexto marco de lectura abierto posible puede comenzar en el tercer nucleótido de la secuencia en una dirección de 3’ a 5’, usando por lo tanto, en una dirección de 3’ a 5’, los nucleótidos nº 3 a 5 como el primer codón, usando los nucleótidos 6 a 8 como el segundo codón, etc.

Se describe aquí el uso de al menos un polipéptido en la fabricación de una composición para la identificación o detección de una célula cancerosa (célula tumoral). El polipéptido se puede usar, por ejemplo, como un patrón en un ensayo y/o para detectar anticuerpos específicos para el polipéptido particular, etc.

También se describe aquí el uso de al menos un polipéptido descrito aquí en la identificación o detección de una célula cancerosa, tal como, por ejemplo, una célula de cáncer ovárico o cualquier otra célula cancerosa como se describe aquí.

Se describe aquí el uso de al menos un polipéptido descrito aquí en el pronóstico o diagnóstico de cáncer, tal como, por ejemplo, un cáncer ovárico maligno o un cáncer ovárico de bajo potencial maligno.

Como tal y según la presente invención, la detección del polipéptido en una célula (por ejemplo, célula ovárica), tejido (por ejemplo, tejido ovárico), muestra o fluido corporal procedente de un individuo puede ser indicativa preferentemente de un diagnóstico de cáncer ovárico maligno con respecto a un diagnóstico de cáncer ovárico de bajo potencial maligno, y por lo tanto puede ser indicativa preferentemente de un cáncer ovárico maligno en vez de un cáncer ovárico de bajo potencial maligno.

Adicionalmente según la presente invención, la presencia del polipéptido en una célula, tejido, muestra o fluido corporal procedente de un individuo puede ser indicativa preferentemente de cáncer ovárico maligno de etapa tardía.

También se proporcionan aquí métodos para identificar una célula cancerosa, que puede comprender, por ejemplo, poner en contacto una célula de ensayo, una muestra de células de ensayo (lisado celular), un fluido corporal de ensayo (sangre, orina, plasma, saliva, etc.) o un tejido de ensayo con un reactivo que puede ser capaz de unirse específicamente al polipéptido descrito aquí, y detectar el complejo formado por el polipéptido y el reactivo. La presencia de un complejo puede ser indicativa (una indicación positiva de la presencia) de una célula cancerosa, tal como, por ejemplo, una célula de cáncer ovárico, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de próstata, leucemia, melanoma, una célula de cáncer renal, una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer pulmonar, una célula cancerosa del sistema nervioso central, y cualquier combinación de las mismas.

La presencia de un complejo formado por el polipéptido y el reactivo específico puede ser indicativa, por ejemplo, de cáncer ovárico, incluyendo, por ejemplo, un cáncer ovárico de bajo potencial maligno o un cáncer ovárico maligno.

Sin embargo, el método es más particularmente poderoso para la detección de cáncer ovárico del tipo maligno. Por lo tanto, la presencia de un complejo puede ser indicativa preferentemente de un cáncer ovárico maligno con respecto a (en vez de) un cáncer ovárico de bajo potencial maligno.

La detección del complejo también puede ser indicativa de un cáncer ovárico maligno de etapa tardía.

Según la presente invención, el método también puede comprender una etapa de comparar cualitativa o cuantitativamente el nivel (cantidad, presencia) de al menos un complejo presente en una célula de ensayo, una muestra de ensayo, un fluido de ensayo o un tejido de ensayo con el nivel de complejo en una célula normal, una muestra de células normales, un fluido corporal normal, un tejido normal o un valor de referencia (por ejemplo, para un estado no canceroso).

Por supuesto, se puede determinar la presencia de más de un polipéptido o complejo (dos complejos o más (múltiples complejos)), por ejemplo, se puede detectar uno formado por un primer reactivo específico y un primer polipéptido y otro formado por un segundo reactivo específico y un segundo polipéptido. La detección de más de un polipéptido o complejo puede ayudar a determinar la tumorigenicidad de la célula.

Una realización ejemplar de un reactivo, que se puede usar para la detección del polipéptido descrito aquí, es un anticuerpo o su fragmento de anticuerpo.

Se describe aquí un kit que puede comprender al menos uno del polipéptido descrito aquí y/o un reactivo capaz de unirse específicamente a al menos uno del polipéptido descrito aquí.

Como entenderá un experto en la técnica, se pueden usar composiciones que comprenden un polipéptido, por ejemplo, para generar anticuerpos frente al polipéptido particular, se pueden usar como una referencia para ensayos en kits, etc.

También se describen aquí anticuerpos aislados o purificados (incluyendo su fragmento de unión a antígeno), que pueden ser capaces de unirse específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende o que consiste en una cualquiera de SEQ ID NO.:51 a 89 ó 170, y

b) un polipéptido que comprende una secuencia polipeptídica codificada por una cualquiera de las secuencias polinucleotídicas descritas aquí (por ejemplo, un fragmento de al menos 6 aminoácidos del polipéptido).

Más particularmente, se describen aquí anticuerpos que pueden ser capaces de unirse específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia polipeptídica codificada por una cualquiera de SEQ ID NO.: 1, 14, 16, 19, 20, 22, 28, 37, 41, 45, 46, 47 ó 49, o un fragmento de al menos 6 aminoácidos del polipéptido.

Incluso más particularmente, se describen aquí anticuerpos que pueden ser capaces de unirse específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia polipeptídica codificada por una cualquiera de SEQ ID NO.: 14, 19, 22, 37, 41, 45, 46 ó 49, o un fragmento de al menos 6 aminoácidos del polipéptido.

También se describe aquí una célula de hibridoma que es capaz de producir un anticuerpo que se puede unir específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO.:51 a 88, 89 y 170, y

b) un polipéptido que puede comprender una secuencia polipeptídica codificada por una cualquiera de las secuencias polinucleotídicas descritas aquí, o un fragmento de al menos 6 aminoácidos del polipéptido.

Los hibridomas ejemplares son aquellos que pueden producir un anticuerpo que puede ser capaz de unirse específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia polipeptídica codificada por una cualquiera de SEQ ID NO.: 1, 14, 16, 19, 20, 22, 28, 37, 41, 45, 46, 47 ó 49, o un fragmento de al menos 6 aminoácidos del polipéptido.

Incluso más particularmente, los hibridomas ejemplares son aquellos que pueden producir un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia polipeptídica codificada por una cualquiera de SEQ ID NO.: 14, 19, 22, 37, 41, 45, 46 ó 49, o un fragmento de al menos 6 aminoácidos del polipéptido.

También se describe aquí una composición que puede comprender un anticuerpo descrito aquí.

Se proporciona aquí un método para obtener un anticuerpo, que puede comprender inmunizar un animal no humano con un fragmento inmunogénico (al menos 6 aminoácidos, al menos 8 aminoácidos, etc.) de un polipéptido que se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que puede comprender o consistir en una cualquiera de SEQ ID NO.:51 a 88, 89 y 170, o un fragmento del mismo, y

b) un polipéptido que puede comprender una secuencia polipeptídica codificada por una cualquiera de las secuencias polinucleotídicas descritas aquí, o una porción de la misma.

Los polipéptidos ejemplares que se pueden usar más particularmente para generar anticuerpos son aquellos que están codificados por una cualquiera de SEQ ID NO.: 1, 14, 16, 19, 20, 22, 28, 37, 41, 45, 46, 47 ó 49 (y polipéptido que comprende un fragmento polipeptídico de estas PSEQ particulares). Incluso más particularmente, los polipéptidos son aquellos que son codificados por una cualquiera de SEQ ID NO.: 14, 19, 22, 37, 41, 45, 46 ó 49.

Se proporciona aquí un método para identificar un compuesto que es capaz de inhibir la actividad o función de un polipéptido que se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en una cualquiera de SEQ ID NO.:51 a 88 y 170, o un polipéptido que comprende una secuencia polipeptídica codificada por una cualquiera de SEQ ID NO.:1 a 49 y 169 (por ejemplo, una porción transcrita, una porción traducida, un fragmento, secuencias sustancialmente idénticas e incluso sustancialmente complementarias).

El método puede comprender poner en contacto el polipéptido con un compuesto putativo y aislar o identificar un compuesto que es capaz de unirse específicamente a uno cualquiera del polipéptido mencionado anteriormente. El compuesto puede originarse a partir de una librería combinatoria.

El método también puede comprender además determinar si la actividad o función del polipéptido (por ejemplo, tal como una función indicada en la Tabla 2) se ve afectada por la unión del compuesto. Aquellos compuestos que son capaces de unirse al polipéptido y/o que son capaces de alterar la función o actividad del polipéptido representan un compuesto deseable para ser usado en terapia contra el cáncer.

El método también puede comprender además una etapa de determinar el efecto del compuesto putativo sobre el crecimiento de una célula cancerosa tal como una célula de cáncer ovárico.

Se describe aquí un ensayo y método para identificar una secuencia de ácido nucleico y/o proteína implicada en el crecimiento o desarrollo de cáncer ovárico. El ensayo y método puede comprender silenciar un gen endógeno de una célula cancerosa, tal como una célula de cáncer ovárico, y proporcionar a la célula con un ácido nucleico (o proteína) candidato. Un gen (o proteína) candidato implicado positivamente en la inducción de la muerte de la célula cancerosa (por ejemplo, apoptosis) (por ejemplo, célula de cáncer ovárico) se puede identificar por su capacidad para complementar el gen endógeno silenciado. Por ejemplo, un ácido nucleico candidato implicado en cáncer ovárico proporcionado a una célula para la que se ha silenciado un gen endógeno puede permitir a la célula sufrir apoptosis incluso más en presencia de un inductor de apoptosis.

Como alternativa, un ensayo o método puede comprender silenciar un gen (expresión génica) endógeno correspondiente a la secuencia de ácido nucleico o proteica candidata a evaluar, y determinar el efecto del ácido nucleico o proteína candidata sobre el crecimiento del cáncer (por ejemplo, crecimiento de células de cáncer ovárico). Una secuencia implicada en la promoción o inhibición del crecimiento, desarrollo o malignidad del cáncer puede cambiar la viabilidad del la célula, puede cambiar la capacidad de la célula para crecer o para formar colonias, etc. La actividad de un polipéptido se puede alterar al seleccionar tal polipéptido con una molécula de anticuerpo o con cualquier otro tipo de compuesto. Nuevamente, tal compuesto se puede identificar mediante identificación de librerías combinatorias, librerías de fagos, etc.

También se proporciona un método para identificar un compuesto inhibidor (inhibidor, antagonista) capaz de alterar la función (actividad) o expresión de un polipéptido descrito aquí. El método puede comprender, por ejemplo, poner en contacto el polipéptido (sustancialmente purificado o aislado), o una célula que expresa el polipéptido, con un compuesto candidato, y medir la función (actividad) o expresión del polipéptido. Una reducción en la función o actividad del polipéptido (en comparación con la ausencia del compuesto candidato) puede así identificar positivamente un compuesto inhibidor adecuado.

La función o actividad alterada se puede asociar, por ejemplo, con una capacidad reducida del polipéptido para reducir el crecimiento de una célula de cáncer ovárico o una actividad o función enzimática reducida identificada por ejemplo en la Tabla 2.

La célula usada para llevar a cabo el ensayo de identificación puede no expresar de forma natural (de forma endógena) el polipéptido o análogos, o, como alternativa, se puede reprimir la expresión de un análogo polipeptídico expresado de forma natural.

Como se usa aquí, la expresión “identidad de secuencia” se refiere a nucleótidos (consecutivos) de una secuencia nucleotídica con referencia a una secuencia nucleotídica original que, cuando se comparan, son iguales o tienen un porcentaje específico de nucleótidos que son los mismos.

La identidad se puede comparar a lo largo de una región o a lo largo de la secuencia total de una secuencia de ácido nucleico. De este modo, la “identidad” se puede comparar, por ejemplo, a lo largo de una región de 10, 19, 20 nucleótidos o más (y cualquier número entremedias), y más preferiblemente a lo largo de una región más larga o a lo largo de toda la región de una secuencia polinucleotídica descrita en la Tabla 4 (por ejemplo, una cualquiera de SEQ ID NO.:1 a 49 y 169). Se ha de entender aquí que se pueden encontrar saltos de nucleótidos no idénticos entre

regiones de ácidos nucleicos idénticas (nucleótidos idénticos). Por ejemplo, un polinucleótido puede tener un 100% de identidad con otro polinucleótido a lo largo de una porción del mismo. Sin embargo, cuando se compara toda la secuencia de ambos polinucleótidos, los dos polinucleótidos pueden tener un 50% de su identidad de secuencia global (total) entre sí.

El porcentaje de identidad puede determinarse, por ejemplo, con un algoritmo GAP, BESTFIT o FASTA de la versión

7.0 del Wisconsin Genetics Software Package, con el uso de las ponderaciones de saltos por defecto.

Quedan abarcados por el presente documento los polinucleótidos o sus porciones que tienen una identidad de secuencia de alrededor del 50 a alrededor del 100 %, o de alrededor del 60 a alrededor del 100 %, o de alrededor del 70 a alrededor del 100 %, o de alrededor del 80 a alrededor del 100 %, o de alrededor del 85 %, alrededor del 90 %, alrededor del 95 % a alrededor del 100 %, con un polinucleótido original. Los expertos en la técnica saben que un polinucleótido que tiene una identidad de alrededor del 50 % a alrededor del 100% puede funcionar (por ejemplo, hibridarse a una secuencia sustancialmente complementaria) de una manera similar a un polinucleótido original y, por lo tanto, puede utilizarse en lugar de un polinucleótido original. Por ejemplo, un polinucleótido (una secuencia de ácido nucleico) puede comprender o tener de alrededor del 50 % al 100 % de identidad con un polinucleótido original a lo largo de una región definida y todavía puede funcionar con la misma eficacia o suficiencia.

La expresión “sustancialmente idénticos” usada para definir los polinucleótidos se refiere a polinucleótidos que tienen, por ejemplo, de 50% a 100% de identidad de secuencia y cualquier intervalo entremedias, pero preferiblemente al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% de identidad de secuencia, y también incluye 100% de identidad con aquella de una secuencia original (incluyendo secuencias 100% idénticas a lo largo de toda la longitud de la secuencia polinucleotídica).

Las secuencias polinucleotídicas “sustancialmente idénticas” se pueden identificar proporcionando una sonda de alrededor de 10 a alrededor de 25, o más, o alrededor de 10 a alrededor de 20 nucleótidos de longitud (o más larga) basado en la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NOs.:1 a 49 y 169 (más particularmente, una porción transcrita y/o traducida de una cualquiera de SEQ ID NOs.:1 a 49 y 169) y su secuencia complementaria, e hibridando una librería de polinucleótido (por ejemplo, cDNA o cualquier otro) que se origina de otra especie, tejido, célula, individuo, etc. Un polinucleótido que se hibrida en condiciones altamente restrictivas (por ejemplo, 6XSCC, 65ºC) a la sonda se puede aislar e identificar usando métodos conocidos en la técnica. Una secuencia “sustancialmente idéntica” incluye, por ejemplo, una variante alélica aislada, una variante de ayuste aislada, un ortólogo no humano aislado, una NSEQ modificada, etc.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la expresión “complementariedad de secuencia” se refiere a los nucleótidos (consecutivos) de una secuencia nucleotídica que son complementarios a una secuencia nucleotídica de referencia (original). La complementariedad se puede comparar a lo largo de una región o a lo largo de toda la secuencia de una secuencia de ácido nucleico.

Los polinucleótidos o una porción de los mismos que tienen una complementariedad de secuencia de alrededor del 50 a alrededor del 100 %, o de alrededor del 60 a alrededor del 100 %, o de alrededor del 70 a alrededor del 100 %,

o de alrededor del 80 % a alrededor del 100 %, o de alrededor del 85%, alrededor del 90 %, de alrededor del 95 % a alrededor del 100 % con un polinucleótido original están, por lo tanto, englobados por este documento. Los expertos en la técnica saben que un polinucleótido que tiene una complementariedad de alrededor del 50 % a 100 % con una secuencia original puede hibridarse lo suficiente a esa secuencia (por ejemplo, para inhibir la expresión del polinucleótido original).

La expresión “sustancialmente complementario” usada para definir los polinucleótidos se refiere a polinucleótidos que tienen, por ejemplo, de 50% a 100% de complementariedad de secuencias, y cualquier intervalo entremedias, pero preferiblemente al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% de complementariedad de secuencias, y también incluye 100% de complementariedad con aquella de una secuencia original (incluyendo secuencias con 100% de complementariedad a lo largo de toda la longitud de la secuencia polinucleotídica).

Como se usa aquí, “polinucleótido” se refiere de forma general a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser RNA o DNA sin modificar, o RNA o DNA modificado. Los “polinucleótidos” incluyen, sin limitación, DNA monocatenario y bicatenario, DNA que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, RNA monocatenario y bicatenario y RNA que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden DNA y RNA que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias, o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, “polinucleótido” se refiere a regiones tricatenarias que comprenden RNA o DNA, o tanto RNA como DNA. El término polinucleótido también incluye DNA o RNA que contienen una o más bases modificadas, y DNA o RNA con esqueletos modificados que les dan estabilidad o por otras razones. Las bases “modificadas” incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Se pueden efectuar numerosas modificaciones al DNA y al RNA; así pues, “polinucleótido” abarca formas modificadas química, enzimática o metabólicamente de polinucleótidos como se encuentran de forma típica en la naturaleza, así como las formas químicas de DNA y RNA características de virus y células. “Polinucleótido” incluye, pero sin limitarse a, moléculas lineales y cerradas por los extremos. “Polinucleótido” también engloba polinucleótidos relativamente cortos, a menudo denominados oligonucleótidos.

“Polipéptidos” se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados (a saber, isoésteres peptídicos). “Polipéptido” se refiere tanto a cadenas cortas, que se suelen denominar péptidos, oligopéptidos u oligómeros, como a cadenas más largas, que se suelen denominar proteínas. Tal y como se describe más arriba, los polipéptidos pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos proteinogénicos.

Como se usa aquí, la expresión “análogo polipeptídico” o “análogo” se refiere a mutantes, quimeras, fusiones, un polipéptido que comprende al menos una supresión de aminoácido, un polipéptido que comprende al menos una inserción o adición de aminoácido, un polipéptido que comprende al menos una sustitución de aminoácido, y cualquier otro tipo de modificaciones realizadas con respecto a un polipéptido dado.

De este modo, se debe entendender en la presente memoria que un “análogo” es una molécula que tiene una actividad biológica y/o una estructura química similares a la de un polipéptido descrito en la presente memoria. Un “análogo” puede tener una similitud de secuencia con la de una secuencia original o una porción de una secuencia original, y también puede tener una modificación de su estructura como las explicadas en la presente memoria. Por ejemplo, un “análogo” puede tener una similitud de secuencia de al menos 80% u 85% o 90 % con una secuencia original o una porción de una secuencia original. Un “análogo” también puede tener, por ejemplo; al menos 70 % o incluso 50 % de similitud de secuencia con una secuencia original o una porción de una secuencia original, y puede funcionar de manera adecuada.

Un “derivado” se ha de entender aquí como un polipéptido que se origina a partir de una secuencia original o de una porción de una secuencia original y que puede comprender una o más modificaciones; por ejemplo, una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una adición, supresión, inserción, sustitución, etc., de aminoácidos), una o más modificaciones en el esqueleto o cadena lateral de uno o más aminoácidos, o una adición de un grupo u otra molécula a uno o más aminoácidos (cadenas laterales o esqueleto). También, un “derivado” puede tener, por ejemplo, al menos 50%, 70%, 80%, 90% de similitud de secuencia con una secuencia original con una combinación de una o más modificaciones en un esqueleto o cadena lateral de un aminoácido, o una adición de un grupo u otra molécula, etc.

Como se usa en la presente memoria, la expresión “biológicamente activo” se refiere a un análogo que retiene algo

o toda la actividad biológica del polipéptido original, es decir, tiene algo de la actividad o función asociada con el polipéptido descrito en la Tabla 2, o es capaz de promover o inhibir el crecimiento de cáncer ovárico.

Por consiguiente, estará englobado por la presente memoria cualquier polipéptido que tenga una modificación en comparación con un polipéptido original que no destruya significativamente una actividad, función o inmunogenicidad deseada. Se sabe bien en la técnica que se puede efectuar una serie de modificaciones a los polipéptidos de la presente invención sin afectar perjudicialmente su actividad biológica. Estas modificaciones pueden, por otra parte, mantener o incrementar la actividad biológica del polipéptido original, o pueden optimizar una o más de las particularidades (por ejemplo, estabilidad, biodisponibilidad, etc.) de los polipéptidos de la presente invención que, en algún caso, podría ser deseable. Los polipéptidos de la presente invención pueden comprender, por ejemplo, los que contienen secuencias de aminoácidos modificadas bien mediante procedimientos naturales, tal como el procesamiento postraduccional, o bien mediante técnicas de modificación química que se conocen bien en la técnica. Las modificaciones se pueden producir en cualquier posición de un polipéptido, incluyendo el esqueleto del polipéptido, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino o carboxi. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en la misma o diferente magnitud en varios sitios del polipéptido dado. De igual forma, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Se debe entender en la presente memoria que más de una modificación de los polipéptidos descritos en la presente memoria estará englobada por la presente invención siempre que la actividad biológica sea similar a la del polipéptido original (progenitor).

Tal y como se explicó más arriba, la modificación del polipéptido puede comprender, por ejemplo, la inserción, supresión y sustitución (a saber, reemplazo) de aminoácidos, bien conservativa o no conservativa (por ejemplo, aminoácidos D, desaminoácidos) en la secuencia polipeptídica, en el que tales cambios no alteran sustancialmente la actividad biológica global del polipéptido.

Ejemplos de sustituciones pueden ser las que son conservativas (a saber, cuando un resto se reemplaza por otro del mismo tipo general o grupo) o, cuando se desee, no conservativas (a saber, cuando un resto se reemplaza por un aminoácido de otro tipo). Además, un aminoácido que no se produce de forma natural puede sustituir a un aminoácido de origen natural (a saber, sustitución conservativa de aminoácido que no se produce en la naturaleza, o una sustitución no conservativa de aminoácido que no se produce en la naturaleza).

Como se sabe, los aminoácidos de origen natural se pueden subclasificar en ácidos, básicos, neutros y polares, o neutros y no polares. Además, tres de los aminoácidos codificados son aromáticos. Puede resultar útil que los polipéptidos codificados que difieren del polipéptido determinado de la presente invención contengan sustituciones de codones para los aminoácidos, que son del mismo tipo o grupo que el aminoácido a reemplazar. Así pues, en algunos casos, los aminoácidos básicos Lys, Arg e His pueden ser intercambiables; los aminoácidos ácidos Asp y Glu puede ser intercambiables; los aminoácidos polares neutros Ser, Thr, Cys, Gln y Asn pueden ser intercambiables; los aminoácidos alifáticos no polares Gly, Ala, Val, Ile y Leu son intercambiables, pero debido a su

tamaño, Gly y Ala tienen una relación más cercana, y Val, Ile y Leu tienen otra relación cercana entre sí, y los aminoácidos aromáticos Phe, Trp y Tyr pueden ser intercambiables.

Se debe notar además que si los polipéptidos se obtienen sintéticamente, también se pueden realizar sustituciones mediante los aminoácidos que no están codificados de forma natural por el DNA (aminoácido que no se produce de forma natural o aminoácido no natural).

Un aminoácido que no se produce de forma natural se debe entender en la presente memoria que es un aminoácido que no se produce de forma natural o que no se encuentra en un mamífero. Un aminoácido que no se produce de forma natural comprende un aminoácido D, un aminoácido que tiene un grupo acetilaminometilo conectado a un átomo de azufre de una cisteína, un aminoácido pegilado, etc. La inclusión de un aminoácido que no se produce de forma natural en una secuencia polipeptídica definida generará, por lo tanto, un derivado del polipéptido original. Los aminoácidos (restos) que no se producen de forma natural incluyen también los omega aminoácidos de la fórmula NH2(CH2)nCOOH, en la que n es 2-6, aminoácidos no polares neutros, tales como sarcosina, t-butilalanina, tbutilglicina, N-metilisoleucina, norleucina, etc. La fenilglicina puede sustituir a Trp, Tyr o Phe; la citrulina y el sulfóxido de metionina son no polares neutros, el ácido cisteico es ácido, y la ornitina es básica. La prolina se puede sustituir por hidroxiprolina y conservar las propiedades que confiere la conformación.

Se sabe en la técnica que se pueden generar análogos mediante mutagénesis de sustitución y que conserven la misma actividad biológica de los polipéptidos de la presente invención. Estos análogos tienen al menos un resto de aminoácido en la molécula de la proteína eliminada, y un resto diferente insertado en su lugar. Por ejemplo, un sitio de interés para la mutagénesis de sustitución puede incluir, pero sin limitarse a, sitios identificados como el sitio o sitios activos, o sitio o sitios inmunológicos. Otros sitios de interés pueden ser aquellos en los que, por ejemplo, determinados restos obtenidos de diferentes especies son idénticos. Estas posiciones pueden ser importantes para la actividad biológica. En la Tabla A se muestran ejemplos de sustituciones identificadas como “sustituciones conservativas”. Si tales sustituciones dan lugar a un cambio no deseado, entonces se introducen otro tipo de sustituciones, denominadas “sustituciones ejemplares” en la Tabla A, o como se describe adicionalmente en la presente memoria en referencia a las clases de aminoácidos, y se escrutan los productos.

En algunos casos puede resultar interesante modificar la actividad biológica de un polipéptido mediante la sustitución, inserción o supresión de aminoácidos. Por ejemplo, la modificación de un polipéptido puede dar lugar a un incremento de la actividad biológica del polipéptido, puede modular su toxicidad, puede dar lugar a cambios de la biodisponibilidad o de la estabilidad, o puede modular su actividad inmunológica o identidad inmunológica. Las modificaciones sustanciales de la función o de la identidad inmunológica se llevan a cabo mediante la selección de sustituciones cuyo efecto difiere significativamente a la hora de mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o de hélice, (b) la carga o la hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena literal. Los restos que aparecen de forma natural se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral:

(1)

hidrófobos: norleucina, metionina (Met), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile)

(2)

hidrófilos neutros: cisteína (Cys), serina (Ser), treonina (Thr)

(3)

ácidos: ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu)

(4)

básicos: asparagina (Asn), glutamina (Gln), histidina (His), lisina (Lys), arginina (Arg)

(5)

restos que influyen en la orientación de la cadena: glicina (Gly), prolina (Pro); y aromáticos: triptófano (Trp), tirosina (Tyr), fenilalanina (Phe).

Las sustituciones no conservativas conllevarán el intercambio de un miembro de una estas clases por otro.

TABLA A. Sustitución ejemplar de aminoácidos 5

Resto original

Sustitución ejemplar Sustitución conservativa

Ala (A)

Val, Leu, Ile Val

Arg (R)

Lys, Gln, Asn Lys

Asn (N)

Gln, His, Lys, Arg Gln

Asp (D)

Glu Glu

Cys (C)

Ser Ser

Gln (Q)

Asn Asn

Resto original

Sustitución ejemplar Sustitución conservativa

Glu (E)

Asp Asp

Gly (G)

Pro Pro

His (H)

Asn, Gln, Lys, Arg Arg

Ile (I)

Leu, Val, Met, Ala, Phe, norleucina Leu

Leu (L)

Norleucina, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile

Lys (K)

Arg, Gln, Asn Arg

Met (M)

Leu, Phe, Ile Leu

Phe (F)

Leu, Val, Ile, Ala Leu

Pro (P)

Gly Gly

Ser (S)

Thr Thr

Thr (T)

Ser Ser

Trp (W)

Tyr Tyr

Tyr (Y)

Trp, Phe, Thr, Ser Phe

Val (V)

Ile, Leu, Met, Phe, Ala, norleucina Leu

Se tiene que entender en la presente memoria que si se menciona un “intervalo” o “grupo” de sustancias (por ejemplo, aminoácidos), “sustituyentes”, o similares, o si se mencionan otros tipos de una característica determinada (por ejemplo, temperatura, presión, estructura química, tiempo, etc.), la presente invención se refiere a todos y cada uno de los miembros específicos, y a cualquier combinación de subintervalos o subgrupos de ellos, y explícitamente los incorpora en la presente memoria. Así pues, cualquier intervalo o grupo especificado se debe entender como un modo abreviado de referirse a todos y cada uno de los miembros de un intervalo o grupo individualmente, así como a todos y cada uno de los posibles subintervalos o subgrupos englobados en estos; y de igual forma con respecto a cualquier subintervalo o subgrupos en estos. Así pues, por ejemplo, respecto a un porcentaje (%) de identidad de alrededor de 80 a 100 %, se debe entender que en la presente memoria se incorpora específicamente el % de todos y cada uno de los individuos, así como el subintervalo, tal como por ejemplo 80 %, 81 %, 84,78 %, 93 %, 99 %, etc.; con respecto a una longitud de “alrededor de 10 a alrededor de 25”, se ha de entender que incorpora específicamente todos y cada uno de los números individuales, tales como por ejemplo 10, 11, 12, 13, 14, 15, hasta e incluyendo 25; y de igual forma con respecto a otros parámetros tales como concentraciones, elementos, etc.

Otros objetos, características, ventajas y aspectos de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción que viene a continuación. Sin embargo, se debe entender que la descripción y los ejemplos específicos que vienen a continuación, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se ofrecen sólo con fines ilustrativos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

En los dibujos adjuntos:

Las Fig. 1 a Fig. 31, Fig. 33, Fig. 34, Fig. 36, Fig. 37, Fig. 39, Fig. 40, Fig. 42, Fig. 43, Fig. 46, Fig. 47, Fig. 49, Fig. 50 y Fig. 56 son imágenes de resultados de hibridación de micromatrices que muestran los datos de expresión diferencial para secuencias humanas relacionadas con cáncer ovárico seleccionadas mediante STAR. Las micromatrices se prepararon usando RNA amplificado mediante RAMP procedente de seis muestras de LMP humanas (A-F 1) y veinte muestras de tumor ovárico maligno (Tabla B) (A-F 2 y A-G 3-4), y 30 tejidos humanos normales diferentes (suprarrenal (A7), mama (B7), yeyuno (C7), tráquea (D7), hígado (E7), placenta (F7), aorta (G7), cerebro (H7), pulmón (A8), corteza suprarrenal (B8), esófago (C8), colon (D8), ovario (E8), riñón (F8), próstata (G8), timo (H8), músculo esquelético (A9), vena cava (B9), estómago (C9), intestino delgado (D9), corazón (E9), trompa de falopio (F9), bazo (G9), vejiga (H9), cuello uterino (A10), páncreas (B10), íleo (C10), duodeno (D10), tiroides (E10) y testículo (F10)). También se incluyeron en la matriz de RNA las líneas celulares de cáncer de mama (MDA (A5), MCF7 (B5) y MCF7 + estradiol (C5)) y epitelio normal de próstata microdisecado por LCM (A-C 6) y cáncer de próstata (D-F 6), línea celular de cáncer de próstata, LNCap (G6) y LNCap + andrógeno (H6). En estas figuras, la reacción de marcado con sonda también se enriqueció con una secuencia de dsDNA para Arabidopsis, que se

hibrida a la misma secuencia colocada en la macromatriz (M) a fin de servir como un control para la reacción de marcaje.

Las Fig. 32, Fig. 35, Fig. 38, Fig. 41, Fig. 44, Fig. 45 y Fig. 48 son imágenes de resultados de RT-PCR que muestran los datos de expresión diferencial para secuencias humanas relacionadas con cáncer ovárico seleccionadas mediante STAR. Se prepararon DNAs complementarios usando hexámeros aleatorios a partir de RNA amplificado mediante RAMP procedente de seis muestras de LMP humanas y al menos veinte muestras de tumor ovárico maligno (Tabla B) como se indica en las figuras. Los cDNAs se cuantificaron y se usaron como moldes para PCR con cebadores específicos de los genes usando métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica.

Las Fig. 57 a Fig. 105 son imágenes de resultados de RT-PCR que muestran los datos de expresión diferencial para secuencias humanas relacionadas con cáncer seleccionadas mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas celulares cancerosas. Estas 59 líneas celulares derivan de tumores que engloban 9 tipos de cánceres humanos que incluyen leucemia, el sistema nervioso central, mama, colon, pulmón, melanoma, ovario, próstata y renal. Se prepararon DNAs complementarios usando hexámeros al azar procedentes de RNA amplificado mediante RAMP a partir de 59 líneas celulares cancerosas humanas (Tabla C). Los cDNAs se cuantificaron y usaron como moldes para PCR con cebadores específicos de genes usando métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Para cada resultado de PCR representado en la Fig. 57 a Fig. 105, se confirmaron cantidades iguales de cDNA molde usado en cada reacción de PCR reamplificando GAPDH con un par de cebadores específicos, OGS 315 (TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT; SEQ. ID. NO. 167) y OGS 316 (CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC; SEQ. ID. NO. 168) para este gen de mantenimiento.

Más particularmente,

la Fig. 1 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 1 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 1 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión de esta secuencia sólo se observó en uno (placenta (F7)) de los 30 tejidos normales y la línea celular de cáncer de mama, MCF7 (B-C 5);

la Fig. 2 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 2 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 2 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión de esta secuencia también fue evidente en seis (mama (B7), placenta (F7), aorta (G7), colon (D8), ovario (E8) y timo (H8)) de los 30 tejidos normales;

la Fig. 3 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 3 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 3 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1) pero globalmente, sólo bajos niveles de expresión. No se observó expresión significativa en ninguno de los tejidos normales;

la Fig. 4 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 4 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 4 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión de esta secuencia también fue evidente en dos (esófago (C8) y trompa de Falopio (F9)) de los 30 tejidos normales;

la Fig. 5 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 5 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 5 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). También se observó en muchos de los tejidos normales una expresión débil de esta secuencia similar a los LMPs;

la Fig. 6 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 6 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 6 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión de esta secuencia también fue evidente en tres (hígado (E7), placenta (F7) y riñón (F8)) de los 30 tejidos normales;

la Fig. 7 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 7 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de

dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 7 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en varias muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión de esta secuencia fue sólo evidente en uno (testículo (F10)) de los 30 tejidos normales;

la Fig. 8 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 8 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 8 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión de esta secuencia fue sólo evidente en dos (esófago (C8) y estómago (C9)) de los 30 tejidos normales y las líneas celulares de cáncer de mama y de próstata, MDA (A5) y LNCap (G6 y H6), respectivamente;

la Fig. 9 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 9 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 9 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión de esta secuencia fue sólo evidente en uno (placenta (F7)) de los 30 tejidos normales, la línea celular de cáncer de mama, MCF7 (B-C 5) y muestras de cáncer de próstata microdisecadas por LCM (D6 y F6);

la Fig. 10 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 10 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 10 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión de esta secuencia fue sólo evidente en uno (testículo (F10)) de los 30 tejidos normales, las líneas de cáncer de mama, MDA (A5) y MCF7 (B-C 5) y la línea de cáncer de próstata, LNCap (G-H 6);

la Fig. 11 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 11 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 11 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia fue sólo evidente en las líneas de cáncer de mama, MDA (A5) y MCF7 (B-C 5);

la Fig. 12 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 12 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 12 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en la mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia fue sólo evidente en uno (testículo (F10)) de los 30 tejidos normales y la la línea de cáncer de próstata, LNCap (G-H 6). También se observó expresión más débil en ovario normal (E8);

la Fig. 13 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 13 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 13 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia fue sólo evidente en las líneas de cáncer de mama, MDA (A5) y MCF7 (B-C 5). También se observó expresión más débil en algunos tejidos normales y en la la línea de cáncer de próstata, LNCap (G-H 6);

la Fig. 14 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 14 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 14 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). Expresión más débil de esta secuencia sólo se observó en el tejido de riñón normal (F8);

la Fig. 15 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 15 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 15 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en la mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). Expresión más débil de esta secuencia similar a la de los LMPs se observó igualmente en muchos de los tejidos normales;

la Fig. 16 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 16 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 16 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en la mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en las líneas de cáncer de mama, MDA (A5) y MCF7 (B-C 5). Se observó expresión más débil, similar a la de los LMPs, en muestras de próstata y algunas muestras de tejido normal;

la Fig. 17 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 17 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 17 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en la mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia fue sólo evidente en dos (mama (B7) y vejiga (H9)) de los 30 tejidos normales;

la Fig. 18 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 18 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 18 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en las líneas de cáncer de mama, MDA (A5) y MCF7 (B-C 5), y en cierto modo menor expresión en la línea de cáncer de próstata, LNCap (G-H 6) y ocho tejidos normales (suprarrenal (A7), placenta (F7), pulmón (A8), corteza suprarrenal (B8), esófago (C8), colon (D8), ovario (E8) y testículo (F10));

la Fig. 19A es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 19 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 19 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en varias muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente sólo en la línea de cáncer de mama, MCF7 (B-C 5);

la Fig. 19B (paneles A y B) es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 19 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR y el gen KCNMB2 que pertenece al agrupamiento Unigene, Hs.478368. Se usaron pares de cebadores específicos para la secuencia del clon STAR para SEQ. ID. NO. 19 o el gen KCNMB2 para llevar a cabo la RT-PCR sobre tejido ovárico normal, y cáncer ovárico benigno y de diferentes etapas/grados. Como se indica mediante el producto de amplicón de PCR esperado (Fig. 19B, panel A), en comparación con muestras normales (Línea 1), benignas (Líneas 2-3) y LMPs (Líneas 4-7), fue evidente una mayor expresión de mRNA SEQ. ID. NO. 19 en carcinoma de células claras (Líneas 8-9), endometrioide de etapa tardía (Línea 12) y seroso maligno (Líneas 15-17). Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 19 en cáncer ovárico maligno. Sin embargo, la expresión de KCNMB2 fue notablemente diferente de la de SEQ. ID. NO. 19, no mostrando esencialmente ninguna diferencia en su expresión entre las diferentes muestras ováricas (Fig 19B, panel B);

la Fig. 20 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 20 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 20 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en varias muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en cuatro (yeyuno (C7), tráquea (D7), colon (D8) y timo (H8)) de los 30 tejidos normales;

la Fig. 21 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 21 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 21 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en tres (suprarrenal (A7), mama (B7) y aorta (G7)) de los 30 tejidos normales;

la Fig. 22 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 22 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 22 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en la línea de cáncer de mama, MCF7 (B-C 5). Se observó una epxresión más débil, similar a la de los LMPs, en una mayoría de los tejidos normales;

la Fig. 23 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 23 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon

de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 23 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en varias muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en las líneas de cáncer de mama, MDA (A5) y MCF7 (B-C 5), y la línea de cáncer de próstata, LNCap (G-H 6);

la Fig. 24 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 24 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 24 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en varias de las muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en la línea de cáncer de mama, MCF7 (B-C 5);

la Fig. 25 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 25 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 25 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en la línea de cáncer de próstata, LNCap (G-H 6);

la Fig. 26 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 26 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 26 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en las líneas de cáncer de mama, MDA (A5) y MCF7 (B-C 5), la línea de cáncer de próstata, LNCap (G-H 6) y un tejido normal, testículo (F10). Se observó igualmente una expresión más débil, similar a la de los LMPs, en algunos tejidos normales;

la Fig. 27 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 27 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 27 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en las líneas de cáncer de mama, MDA (A5) y MCF7 (B-C 5), la línea de cáncer de próstata, LNCap (G-H 6). Se observó igualmente una expresión más débil, similar a la de los LMPs, en siete (suprarrenal (A7), placenta (F7), pulmón (A8), esófago (C8), colon (D8), ovario (E8) y testículo (F10)) de los 30 tejidos normales;

la Fig. 28 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 28 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 28 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en las líneas de cáncer de mama, MDA (A5) y MCF7 (B-C 5). Se observó una expresión más débil, similar a la de los LMPs, para todos los otros tejidos;

la Fig. 29 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 29 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 29 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en la línea de cáncer de mama, MCF7 (B-C 5) y tres (mama (B7), esófago (C8) y trompa de Falopio (F9)) de los 30 tejidos normales;

la Fig. 30 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 30 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 30 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en la línea de cáncer de mama, MCF7 (B-C 5), muestras de cáncer de próstata (D-H 6). Se observó una expresión más débil, similar a la de los LMPs, en sólo muy pocos tejidos normales;

la Fig. 31 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 31 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 31 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico

maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en la línea de cáncer de mama, MCF7 (B-C 5), muestras de cáncer de próstata (D-H 6). Se observó una expresión más débil, similar a la de los LMPs, en sólo muy pocos tejidos normales;

la Fig. 32 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 32 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. Para este gen, no existen datos de macromatrices. Se usó un par de cebadores, OGS 1077 (GCGTCCGGGCCTGTCTTCAACCT; SEQ. ID. NO. 153) y OGS 1078 (GCCCCACCCTCTACCCCACCACTA; SEQ. ID. NO. 154) para SEQ. ID. NO. 32 para llevar a cabo RT-PCR sobre tejido ovárico normal, y cáncer ovárico benigno y de direferentes etapas/grados. Como se indica mediante el producto de amplicón de PCR esperado, en comparación con normal (Línea 1) y benigno (Líneas 2-3), fue evidente una mayor expresión de mRNA SEQ. ID. NO. 32 en LMPs (Líneas 4-7), carcinoma de células claras (Líneas 8-9), endometrioide de etapa tardía (Línea 12) y seroso maligno (Líneas 15-17). Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 32 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 33 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 33 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 33 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en las muestras de cáncer de próstata (B-F 6). Se observó expresión más débil en muchos tejidos normales, y se observó una fuerte expresión en tráquea (D7), colon (D8), intestino delgado (D9), timo (H8) y bazo (G9). Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 33 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 34 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 34 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 34 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en las muestras de cáncer de próstata (B-F 6). Se observó expresión más débil en muchos tejidos normales, y se observó fuerte expresión en tráquea (D7), colon (D8), intestino delgado (D9), timo (H8) y bazo (G9). Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 34 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 35 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 35 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. Para este gen, no existen datos de macromatrices. Se usó un par de cebadores, OGS 1141 (GAGATCCTGATCAAGGTGCAGG; SEQ. ID. NO. 155) y OGS 1142 (TGCACGCTCACAGCAGTCAGG; SEQ. ID. NO. 156) para SEQ. ID. NO. 35 para llevar a cabo RT-PCR en muestras de LMP, en muestras de diferentes etapas/grados de cáncer ovárico y muestras de tejido humano normal. Como se indica mediante el producto de amplicón de PCR esperado (indicado como AB-0201), fue evidente una mayor expresión de mRNA SEQ. ID. NO. 35 en algunas líneas de cáncer ovárico (Líneas 10, 11, 14, 18, 28 y 29), y el mRNA no se expresó en muestras de LMP. La expresión se observó en una sola muestra de tejido normal, íleo (Línea 27). Se confirmaron cantidad iguales de cDNA molde usado en cada reacción de PCR al reamplificar GAPDH con un par de cebodores específicos, OGS 315 (TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT; SEQ. ID. NO. 167) y OGS 316 (CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC; SEQ. ID. NO. 168) para este gen de mantenimiento. Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 35 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 36 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 36 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 36 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en unas pocas de las muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). No se observó expresión en otros tipos de cánceres ni en tejidos humanos normales. Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 36 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 37 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 37 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 37 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión débil de esta secuencia también fue evidente en las muestras de cáncer de próstata (B-F 6). Se observó expresión más débil en algunos tejidos normales. Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 37 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 38 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 38 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. Para este gen, no existen datos de

macromatrices. Se usó un par de cebadores, OGS 1202 (AACATGACTAAGATGCCCAACC; SEQ. ID. NO. 157) y OGS 1203 (AATCTCCTTCACCTCCACTACTG; SEQ. ID. NO. 158) para SEQ. ID. NO. 38 para llevar a cabo RT-PCR en muestras de LMP, en muestras de diferentes etapas/grados de cáncer ovárico y muestras de tejido humano normal. Como se indica mediante el producto de amplicón de PCR esperado (indicado como AB-0332), la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 38 fue evidente en aproxidamente la mitad de las líneas de cáncer ovárico, y se observó expresión más débil en muestras de LMP. Se observó expresión en muchas muestras de tejido normal. Se confirmaron cantidades iguales de cDNA molde usado en cada reacción de PCR reamplificando GAPDH con un par de cebadores específicos, OGS 315 (TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT; SEQ. ID. NO. 167) y OGS 316 (CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC; SEQ. ID. NO. 168) para este gen de mantenimiento. Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 38 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 39 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 39 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 39 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). También se observó fuerte expresión en muestras de cáncer de mama (A-C 5) y expresión débil en muestras de cáncer de próstata (A-H 6). Se observó expresión más débil en unos pocos tejidos normales, con fuerte expresión en los testículos (F 10). Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 39 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 40 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 40 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 40 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). Se observó expresión débil en unos pocos tejidos normales, con fuerte expresión en riñón (F 8). Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 40 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 41 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 41 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. Para este gen, no existen datos de macromatrices. Se usó un par de cebadores, OGS 1212 (AAGCATAGCCATAGGTGATTGG; SEQ. ID. NO. 159) y OGS 1213 (ACAGGTATCAGACAAGGGAGCAG; SEQ. ID. NO. 160) para SEQ. ID. NO. 41 para llevar a cabo RT-PCR en muestras de LMP, en muestras de diferentes etapas/grados de cáncer ovárico y muestras de tejido humano normal. Como se indica mediante el producto de amplicón de PCR esperado (indicado como AB-0532), la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 41 fue evidente en una gran mayoría de las líneas de cáncer ovárico, y se observó expresión más débil en muestras de LMP. Se observó expresión en unas pocas muestras de tejido normal tal como riñón, timo y bazo (Líneas 14, 16 y 23, respectivamente). Se confirmaron cantidades iguales de cDNA molde usado en cada reacción de PCR reamplificando GAPDH con un par de cebadores específicos, OGS 315 (TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT; SEQ. ID. NO. 167) y OGS 316 (CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC; SEQ. ID. NO. 168) para este gen de mantenimiento. Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 41 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 42 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 42 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 42 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos mostraron su expresión tanto en muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) como muestras de LMP (A-F 1). También se observó expresión débil en muestras de cáncer de mama (A-C 5). Se observó expresión débil en unos pocos tejidos normales, con expresión moderada en placenta (F 7). Estos resultados confirman la expresión para SEQ. ID. NO. 42 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 43 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 43 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 43 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). También se observó fuerte expresión en muestras de cáncer de mama (A-C 5) y expresión débil en muestras de cáncer de próstata (A-H 6). Se observó expresión más débil en tejidos normales con fuerte expresión en los testículos (F 10). Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 43 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 44 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 44 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. Para este gen, no existen datos de macromatrices. Se usó un par de cebadores, OGS 1171 (TTACGACCTATTTCTCCGTGG; SEQ. ID. NO. 161) y OGS 1172 (AATGCAATAATTGGCCACTGC; SEQ. ID. NO. 162) para SEQ. ID. NO. 44 para llevar a cabo RT-PCR en muestras de LMP, en muestras de diferentes etapas/grados de cáncer ovárico y muestras de tejido humano normal. Como se indica mediante el producto de amplicón de PCR esperado (indicado como AB-0795), la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 44 fue evidente en una gran mayoría de las líneas de cáncer

ovárico, y se observó expresión más débil en muestras de LMP. Se observó expresión en varias muestras de tejido normal tales como aorta, músculo esquelético, intestino delgado y bazo (Líneas 7, 17, 20 y 23, respectivamente). Se confirmaron cantidades iguales de cDNA molde usado en cada reacción de PCR reamplificando GAPDH con un par de cebadores específicos, OGS 315 (TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT; SEQ. ID. NO. 167) y OGS 316 (CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC; SEQ. ID. NO. 168) para este gen de mantenimiento. Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 44 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 45 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 45 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. Para este gen, no existen datos de macromatrices. Se usó un par de cebadores, OGS 1175 (ACACATCAAACTGCTTATCCAGG; SEQ. ID. NO. 163) y OGS 1176 (ACTGATGTGAAAATGCACATCC; SEQ. ID. NO. 164) para SEQ. ID. NO: 45 para llevar a cabo RT-PCR en muestras de LMP, en muestras de diferentes etapas/grados de cáncer ovárico y muestras de tejido humano normal. Como se indica mediante el producto de amplicón de PCR esperado (indicado como AB-0846), la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 45 fue evidente en la mitas de las líneas de cáncer ovárico, y se observó expresión más débil en muestras de LMP. Se observó expresión en sólo unas pocas muestras de tejido normal tal como riñón, trompa de Falopio y testículos (Líneas 14, 22 y 30, respectivamente). Se confirmaron cantidades iguales de cDNA molde usado en cada reacción de PCR reamplificando GAPDH con un par de cebadores específicos, OGS 315 (TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT; SEQ. ID. NO. 167) y OGS 316 (CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC; SEQ. ID. NO. 168) para este gen de mantenimiento. Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 45 en cáncer ovárico maligno;

Fig. 46 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 46 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 46 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). También se observó expresión débil en muestras de cáncer de próstata (A-H 6). Se observó expresión más débil en unos pocos tejidos normales con expresión moderada en mama (B 7) y ovario (E 8). Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 46 en cáncer ovárico maligno;

La Fig. 47 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 47 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 47 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en las muestras de cáncer de próstata (B-F 6). Se observó expresión más débil en muchos tejidos normales, y se observó fuerte expresión en tráquea (D7), colon (D8), intestino delgado (D9), timo (H8) y bazo (G9). Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 47 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 48 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 48 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. Para este gen, no existen datos de macromatrices. Se usó un par de cebadores, OGS 1282 (ATGGCTCATACAGCACTCAGG; SEQ. ID. NO. 165) y OGS 1283 (GAACTGTCACTCCGGAAAGCCT; SEQ. ID. NO. 166) para SEQ. ID. NO. 48 para llevar a cabo RT-PCR en muestras de LMP, en muestras de diferentes etapas/grados de cáncer ovárico y muestras de tejido humano normal. Como se indica mediante el producto de amplicón de PCR esperado (indicado como AB-1120), la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 48 fue evidente en una mayoría de las líneas de cáncer ovárico, y ººse observó expresión más débil en muestras de LMP. La expresión fue evidente en virtualmente todos los tejidos normales. Se confirmaron cantidades iguales de cDNA molde usado en cada reacción de PCR reamplificando GAPDH con un par de cebadores específicos, OGS 315 (TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT; SEQ. ID. NO. 167) y OGS 316 (CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC; SEQ. ID. NO. 168) para este gen de mantenimiento. Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 48 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 49 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 49 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 49 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). También se observó fuerte expresión en muestras de cáncer de mama (A-C 5) y expresión débil en muestras de cáncer de próstata (A-H 6). Se observó expresión más débil en tejidos normales. Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 49 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 50 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 50 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 50 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los

resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento en una mayoría de muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 3-4) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). La expresión significativa de esta secuencia también fue evidente en siete (suprarrenal (A7), mama (B7), tráquea (D7), placenta (F7), pulmón (A8), riñón (F8) y trompa de Falopio (F9)) de los 30 tejidos normales;

la Fig. 51 es una imagen que muestra un ejemplo de sustracción de STAR para las muestras de cáncer ovárico. Los genes de mantenimiento, GAPDH (Panel A) y ∀-actina (Panel B) se restaron tanto de LMP menos Maligno (SL133 a SL137) y Maligno menos LMP (SL123 a SL127), mientras que un gen aumentado expresado diferentemente conocido, CCNE1 (Panel C), en tumores ováricos malignos, no se restó en librerías STAR de Maligno menos LMP, sino que se enriqueció (Líneas SL123 a SL127 en comparación con las Líneas 6 a 10);

la Fig. 52 es una imagen que muestra el efecto de shRNAs sobre la expresión de genes endógenos codificados por SEQ. ID Nos. 1 y 3 en células TOV-21 G transfectadas. Se transfectaron dos shRNAs por SEQ. ID. en líneas celulares de cáncer ovárico TOV-21G, y se monitorizaron mediante RT-PCR usando cebadores específicos de los genes. En cada caso, ambos shRNAs atenuaron la expresión de los genes;

la Fig. 53 es una imagen que muestra el efecto de los shRNAs específicos de SEQ. ID. en la proliferación de células TOV-21G. La menor proliferación es indicativa de un gen que, cuando se atenúa, es necesario para el crecimiento normal de las células cancerosas. Las células se transfectaron de forma estable con dos vectores de expresión de shRNA distintos, y la proliferación de las células se midió en un ensayo de MTT. El plásmido de control positivo expresa un shRNA que tiene homología con un gen desconocido en seres humanos;

la Fig. 54 es una imagen que muestra shRNAs específicos de SEQ. ID. sobre la supervivencia de células TOV21G. Una menor tinción es indicativa de un gen que, cuando se atenúa, es necesario para la supervivencia de las células cancerosas en este ensayo. Las células se transfectaron de forma transitoria con dos vectores de expresión de shRNA distintos, y las colonias restantes se tiñeron con violeta de cristal y se fotografiaron. El plásmido de control positivo expresa un shRNA que tiene homología con un gen desconocido en seres humanos;

las Figs. 55A y 55B son imágenes de datos de RT-PCR que muestran los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NOs. 01, 09, 12, 15, 17, 19, 20 y 24 humanas relacionadas con cáncer ovárico seleccionadas mediante STAR. Para demostrar adicionalmente que las SEQ. ID. NOs. de STAR seleccionadas tras el análisis de macromatrices estaban aumentadas en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con LMPs y muestras de ovario normal, se llevó a cabo RT-PCR semicuantivativa para 25 ciclos usando HotStarTaq polimerasa según las instrucciones del proveedor (Qiagen). Además, estos resultados sirven para demostrar la utilidad de estas secuencias como marcadores potenciales de diagnóstico, pronóstico o teranóstico para cáncer ovárico. Para las SEQ. ID. NOs. 01, 09, 12, 15, 17, 19, 20 y 24, se usó un par de cebadores específicos para cada una. En la Figura 55A y 55B se muestran los resultados de expresión diferencial obtenidos para cada SEQ. ID. NO. ensayada. Como se indica mediante el producto de amplicón de PCR esperado para cada SEQ. ID. NO., hay una clara tendencia hacia una mayor expresión de los mRNAs que corresponden a SEQ. ID. NOs. 01, 09, 12, 15, 17, 19, 20 y 24 en carcinoma de células claras (Líneas 8-9), endometrioide de etapa tardía (Línea 12) y diferentes etapas de seroso maligno (Líneas 15-17) en comparación con muestras ováricas normales (Línea 1), benignas (Líneas 2-3) y LMPs (Líneas 4-7). Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NOs. 01, 09, 12, 15, 17, 19, 20 y 24 en las diferentes etapas de cáncer ovárico maligno como se observó usando las macromatrices;

la Fig. 56 es una imagen de los resultados de hibridación de macromatrices que muestra los datos de expresión diferencial para SEQ. ID. NO. 169 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR. El clon de dsDNA de STAR que representa SEQ. ID. NO. 169 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su aumento in muestras de cáncer ovárico maligno (A-F 2 y A-G 34) en comparación con muestras de LMP (A-F 1). Se observó expresión más débil en algunos tejidos normales, y se observó fuerte expresión hígado (E7) y aorta (G7). Estos resultados confirman el aumento de la expresión génica para SEQ. ID. NO. 169 en cáncer ovárico maligno;

la Fig. 57 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 1 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1136 (GCTTAAAAGAGTCCTCCTGTGGC; SEQ. ID. NO. 171) y OGS 1044 (TGGACATTGTTCTTAAAGTGTGG; SEQ. ID. NO. 172) para SEQ. ID. NO. 1 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 1 fue evidente en cánceres ovárico, renal, de pulmón, de colon, de mama, y se observó expresión más débil en muestras de melanoma;

la Fig. 58 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 2 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1250 (AGGTTTTATGGCCACCGTCAG; SEQ. ID. NO. 173) y OGS 1251 (ATCCTATACCGCTCGGTTATGC; SEQ. ID. NO. 174) para SEQ. ID. NO. 2 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR

esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 2 fue evidente en los nueve tipos de cáncer, pero se observó expresión más débil en muestras de melanoma y leucemia;

la Fig. 59 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 3 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1049 (GGGCGGCGGCTCTTTCCTCCTC; SEQ. ID. NO. 175) y OGS 1050 (GCTAGCGGCCCCATACTCG; SEQ. ID. NO. 176) para SEQ. ID. NO. 3 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 3 fue evidente en ocho tipos de cáncer, y está ausente en muestras de leucemia;

la Fig. 60 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 4 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1051 (ACACTGGATGCCCTGAATGACACA; SEQ. ID. NO. 177) y OGS 1052 (GCTTTGGCCCTTTTTGCTAA; SEQ. ID. NO. 178) para SEQ. ID. NO. 4 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 4 fue evidente en cánceres de melanoma, ovárico, del SNC, y de pulmón, y se expresó débilmente en las muestras de leucemia;

la Fig. 61 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 5 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1252 (CCCACTTCTGTCTTACTGCATC; SEQ. ID. NO. 179) y OGS 1253 (CATAGTACTCCAGGGCTTATTC; SEQ. ID. NO. 180) para SEQ. ID. NO. 4 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 5 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 62 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 6 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1083 (AACGATTGCCCGGATTGATGACA; SEQ. ID. NO. 181) y OGS 1084 (TACTTGAGGCTGGGGTGGGAGATG; SEQ. ID. NO. 182) para SEQ. ID. NO. 6 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 6 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 63 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 7 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1053 (CACTACGCCAGGCACCCCCAAAAC; SEQ. ID. NO. 183) y OGS 1054 (CGAGGCGCACGGCAGTCT; SEQ. ID. NO. 184) para SEQ. ID. NO. 7 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 7 fue evidente sólo en muestras de cáncer ovárico;

la Fig. 64 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 8 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1037 (ATCCGTTGCTGCAGCTCGTTCCTC; SEQ. ID. NO. 185) y OGS 1038 (ACCCTGCTGACCTTCTTCCATTCC; SEQ. ID. NO. 186) para SEQ. ID. NO. 8 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 8 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 65 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 9 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1045 (TCGGAGGAGGGCTGGCTGGTGTTT; SEQ. ID. NO. 187) y OGS 1046 (CTTGGGCGTCTTGGAGCGGTTCTG; SEQ. ID. NO. 188) para SEQ. ID. NO. 9 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, (banda inferior en el gel; la banda superior es un artefacto de la reacción de PCR) la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 9 fue evidente en cáncer ovárico, de pulmón, de colon, de mama, y melanoma, se expresó débilmente en leucemia y cáncer del SNC;

la Fig. 66 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 10 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1240 (AGAGCCTATTGAAGATGAACAG; SEQ. ID. NO. 189) y OGS 1241 (TGATTGCCCCGGATCCTCTTAGG; SEQ. ID. NO. 190) para SEQ. ID. NO. 10 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 10 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 67 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 11 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1304 (GGACAAATACGACGACGAGG; SEQ. ID. NO. 191) y OGS 1305 (GGTTTCTTGGGTAGTGGGC; SEQ. ID. NO.

192) para SEQ. ID. NO. 11 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 11 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 68 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 12 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1039 (CCCCGGAGAAGGAAGAGCAGTA; SEQ. ID. NO. 193) y OGS 1040 (CGAAAGCCGGCAGTTAGTTATTGA; SEQ. ID. NO. 194) para SEQ. ID. NO. 12 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 12 fue evidente en todos los tipos de cáncer, pero débilemente en cáncer del SNC y leucemia;

la Fig. 69 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 13 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1095 (GGCGGGCAACGAATTCCAGGTGTC; SEQ. ID. NO. 195) y OGS 1096 (TCAGAGGTTCGTCGCATTTGTCCA; SEQ. ID. NO. 196) para SEQ. ID. NO. 13 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 13 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 70 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 15 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1284 (CAACAGTCATGATGTGTGGATG; SEQ. ID. NO. 197) y OGS 1285 (ACTGCACCTTGTCCGTGTTGAC; SEQ. ID. NO. 198) para SEQ. ID. NO. 15 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 15 fue evidente en cáncer ovárico, de próstata, de pulmón, de colon, y de mama;

la Fig. 71 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 16 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1063 (CCGGCTGGCTGCTTTGTTTA; SEQ. ID. NO. 199) y OGS 1064 (ATGATCAGCAGGTTCGTTGGTAGG; SEQ. ID. NO. 200) para SEQ. ID. NO. 16 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 16 fue evidente en cáncer ovárico, de pulmón, de colon, y de mama;

la Fig. 72 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 17 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1031 (ATGCCGGAAGTGAATGTGG; SEQ. ID. NO. 201) y OGS 1032 (GGTGACTCCGCCTTTTGAT; SEQ. ID. NO. 202) para SEQ. ID. NO. 17 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 17 fue evidente en cáncer ovárico, renal, de pulmón, de colon, y de mama, pero débilmente en cáncer del SNC;

la Fig. 73 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 18 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1308 (ACATTCGCTTCTCCATCTGG; SEQ. ID. NO. 203) y OGS 1309 (TGTCACGGAAGGGAACCAGG; SEQ. ID. NO. 204) para SEQ. ID. NO. 18 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 18 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 74 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 19 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1069 (ACGCTGCCTCTGGGTCACTT; SEQ. ID. NO. 205) y OGS 1070 (TTGGCAAATCAATGGCTTGTAAT; SEQ. ID. NO. 206) para SEQ. ID. NO. 19 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 19 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 75 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 20 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1061 (ATGGCTTGGGTCATCAGGAC; SEQ. ID. NO. 207) y OGS 1062 (GTGTCACTGGGCGTAAGATACTG; SEQ. ID. NO 208) para SEQ. ID. NO. 20 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 20 fue evidente en todos los tipos de cáncer, pero débilmente en cáncer de mama y de colon;

la Fig. 76 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 21 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1097

(CACCAAATCAGCTGCTACTACTCC; SEQ. ID. NO. 209) y OGS 1098 (GATAAACCCCAAAGCAGAAAGATT; SEQ. ID. NO. 210) para SEQ. ID. NO. 21 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 21 fue evidente en todos los tipos de cáncer, pero débilmente en leucemia;

la Fig. 77 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 22 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1075 (CGAGATTCCGTGGGCGTAGG; SEQ. ID. NO. 211) y OGS 1076 (TGAGTGGGAGCTTCGTAGG; SEQ. ID. NO. 212) para SEQ. ID. NO. 22 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 22 fue evidente en cáncer ovárico, de pulmón, de mama, y cáncer del SNC. Otro transcrito diana se expresó débilmente en cáncer de colon y renal, además de melanoma;

la Fig. 78 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 23 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1232 (TCAGAGTGGACGTTGGATTAC; SEQ. ID. NO. 213) y OGS 1233 (TGCTTGAAATGTAGGAGAACA; SEQ. ID. NO. 214) para SEQ. ID. NO. 23 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 23 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 79 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 24 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1067 (GAGGGGCATCAATCACACCGAGAA; SEQ. ID. NO. 215) y OGS 1068 (CCCCACCGCCCACCCATTTAGG; SEQ. ID. NO. 216) para SEQ. ID. NO. 24 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 24 fue evidente en cáncer ovárico, renal, de pulmón, de colon, de mama, y melanoma, pero débilemetne en cáncer del SNC y leucemia;

la Fig. 80 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 25 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1099 (GGGGGCACCAGAGGCAGTAA; SEQ. ID. NO. 217) y OGS 1100 (GGTTGTGGCGGGGGCAGTTGTG; SEQ. ID. NO. 218) para SEQ. ID. NO. 25 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 25 fue evidente en todos los tipos de cáncer, pero débilmente en leucemia;

la Fig. 81 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 26 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1246 (ACAGACTCCTGTACTGCAAACC; SEQ. ID. NO. 219) y OGS 1247 (TACCGGTTCGTCCTCTTCCTC; SEQ. ID. NO. 220) para SEQ. ID. NO. 26 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 26 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 82 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 27 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1093 (GAAGTTCCTCACGCCCTGCTATC; SEQ. ID. NO. 221) y OGS 1094 (CTGGCTGGTGACCTGCTTTGAGTA; SEQ. ID. NO. 222) para SEQ. ID. NO. 27 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 27 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 83 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 28 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1332 (TAGGCGCGCCTGACATACAGCAATGCCAGTT; SEQ. ID. NO. 223) y OGS 1333 (TAAGAATGCGGCCGCGCCACATCTTGAACACTTTGC; SEQ. ID. NO. 224) para SEQ. ID. NO. 28 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 28 fue evidente en cáncer ovárico, de próstata, y renal, pero débilmente en todos los otros tipos;

la Fig. 84 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 29 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1101 (TGGGGAGGAGTTTGAGGAGCAGAC; SEQ. ID. NO. 225) y OGS 1102 (GTGGGACGGAGGGGGCAGTGAAG; SEQ. ID. NO. 226) para SEQ. ID. NO. 29 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 29 fue evidente en cáncer ovárico, renal, de pulmón, de colon, y de mama, pero débilmente en cáncer del SNC y melanoma;

la Fig. 85 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 30 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1300 (GCAACTATTCGGAGCGCGTG; SEQ. ID. NO. 227) y OGS 1301 (CCAGCAGCTTGTTGAGCTCC; SEQ. ID. NO. 228) para SEQ. ID. NO. 30 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 30 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 86 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 31 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1302 (GGAGGAGCTAAGCGTCATCGC; SEQ. ID. NO. 229) y OGS 1303 (TCGCTTCAGCGCGTAGACC; SEQ. ID. NO. 230) para SEQ. ID. NO. 31 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 31 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 87 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 32 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1077 (GCGTCCGGGCCTGTCTTCAACCT; SEQ. ID. NO. 153) y OGS 1078 (GCCCCACCCTCTACCCCACCACTA; SEQ. ID. NO. 154) para SEQ. ID. NO. 32 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 32 fue evidente en cáncer ovárico y melanoma, pero fue detectable una expresión más débil en cáncer del SNC, de mama, de colon, de pulmón, y renal;

la Fig. 88 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 33 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1292 (TATTAGTTGGGATGGTGGTAGCAC; SEQ. ID. NO. 231) y OGS 1294 (GAGAATTCGAGTCGACGATGAC; SEQ. ID. NO. 232) para SEQ. ID. NO. 33 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 33 fue evidente sólo en muestras de cáncer ovárico;

la Fig. 89 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 34 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1242 (GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC; SEQ. ID. NO. 233) y OGS 1243 (AGGCACACAACAGAGGCAGTTC; SEQ. ID. NO. 234) para SEQ. ID. NO. 34 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 34 fue evidente sólo en muestras de cáncer ovárico;

la Fig. 90 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 35 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1141 (GAGATCCTGATCAAGGTGCAGG; SEQ. ID. NO. 155) y OGS 1142 (TGCACGCTCACAGCAGTCAGG; SEQ. ID. NO. 156) para SEQ. ID. NO. 35 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 35 fue evidente en cáncer ovárico, de pulmón y de mama, pero débilmente en cáncer de colon y del SNC;

la Fig. 91 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 36 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1280 (GTACATCAACCTCCTGCTGTCC; SEQ. ID. NO. 235) y OGS 1281 (GACATCTCCAAGTCCCAGCATG; SEQ. ID. NO. 236) para SEQ. ID. NO. 36 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 36 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 92 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 37 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1159 (AGTCTCTCACTGTGCCTTATGCC; SEQ. ID. NO. 237) y OGS 1160 (AGTCCTAAGAACTGTAAACG; SEQ. ID. NO. 238) para SEQ. ID. NO. 37 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 37 fue evidente sólo en cáncer ovárico y renal;

la Fig. 93 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 38 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1202 (AACATGACTAAGATGCCCAACC; SEQ. ID. NO. 157) y OGS 1203 (AATCTCCTTCACCTCCACTACTG; SEQ. ID. NO. 158) para SEQ. ID. NO. 38 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 38 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 94 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 39 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1310 (CATCTATACGTGGATTGAGGA; SEQ. ID. NO. 239) y OGS 1311 (ATAGGTACCAGGTATGAGCTG; SEQ. ID. NO. 240) para SEQ. ID. NO. 39 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 39 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 95 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 40 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1155 (TGTCCACATCATCATCGTCATCC; SEQ. ID. NO. 241) y OGS 1156 (TGTCACTGGTCGGTCGCTGAGG; SEQ. ID. NO. 242) para SEQ. ID. NO. 39 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 39 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 96 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 41 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1212 (AAGCATAGCCATAGGTGATTGG; SEQ. ID. NO. 159) y OGS 1213 (ACAGGTATCAGACAAGGGAGCAG; SEQ. ID. NO. 160) para SEQ. ID. NO. 41 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 41 fue evidente sólo en cáncer ovárico y renal, y leucemia;

la Fig. 97 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 42 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1316 (CATGGGGCTTAAGATGTC; SEQ. ID. NO. 243) y OGS 1317 (GTCGATTTCTCCATCATCTG; SEQ. ID. NO. 244) para SEQ. ID. NO. 42 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 42 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 98 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 43 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1306 (AAGAGGCGCTCTACTAGCCG; SEQ. ID. NO. 245) y OGS 1307 (CTTTCCACATGGAACACAGG; SEQ. ID. NO. 246) para SEQ. ID. NO. 43 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 43 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 99 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 44 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1171 (TTACGACCTATTTCTCCGTGG; SEQ. ID. NO. 161) y OGS 1172 (AATGCAATAATTGGCCACTGC; SEQ. ID. NO. 162) para SEQ. ID. NO. 44 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 44 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 100 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 45 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1175 (ACACATCAAACTGCTTATCCAGG; SEQ. ID. NO. 163) y OGS 1176 (ACTGATGTGAAAATGCACATCC; SEQ. ID. NO. 164) para SEQ. ID. NO. 45 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 45 fue evidente sólo en muestras de cáncer ovárico;

la Fig. 101 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 46 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1286 (CATTTTCCTGGAATTTGATACAG; SEQ. ID. NO. 247) y OGS 1287 (GTAGAGAGTTTATTTGGGCCAAG; SEQ. ID. NO. 248) para SEQ. ID. NO. 46 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 46 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

la Fig. 102 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 47 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1244 (CATCTATGGTAACTACAATCG; SEQ. ID. NO. 249) y OGS 1245 (GTAGAAGTCACTGATCAGACAC; SEQ. ID. NO. 250) para SEQ. ID. NO. 47 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 47 fue evidente sólo en cáncer ovárico;

la Fig. 103 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 48 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas

del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1282 (ATGGCTCATACAGCACTCAGG; SEQ. ID. NO. 165) y OGS 1283 (GAACTGTCACTCCGGAAAGCCT; SEQ. ID. NO. 166) para SEQ. ID. NO. 48 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 48 fue evidente en todos los tipos de cáncer;

Fig. 104 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 50 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1035 (CTGCCTGCCAACCTTTCCATTTCT; SEQ. ID. NO. 251) y OGS 1036 (TGAGCAGCCACAGCAGCATTAGG; SEQ. ID. NO. 252) para SEQ. ID. NO. 50 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 50 fue evidente en todos los tipos de cáncer, pero débil en cáncer del SNC y leucemia, y

la Fig. 105 es una imagen de datos de RT-PCR que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ. ID. NO. 169 humana relacionada con cáncer ovárico seleccionada mediante STAR en muestras de RNA derivadas del panel NCI-60 de líneas de células cancerosas. Se usó un par de cebadores, OGS 1248 (CACCTGATCAGGTGGATAAGG; SEQ. ID. NO. 253) y OGS 1249 (TCCCAGGTAGAAGGTGGAATCC; SEQ. ID. NO. 254) para SEQ. ID. NO. 169 para llevar a cabo RT-PCR. Como se indica mediante el amplicón de PCR esperado, la expresión incrementada de mRNA SEQ. ID. NO. 169 fue evidente en cáncer ovárico, renal, y de pulmón, pero débil en cáncer del SNC.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

El solicitante empleó una estrategia cuidadosamente planificada para identificar y aislar secuencias genéticas implicadas en cáncer ovárico. El procedimiento implicó las siguientes etapas: 1) preparación de librerías de cDNA muy representativas a partir del mRNA aislado de LMPs y muestras de cáncer ovárico maligno de origen humano; 2) aislamiento de las secuencias aumentadasen las muestras de cáncer ovárico maligno; 3) identificación y caracterización de secuencias aumentadas; 4) selección de secuencias aumentadas en busca de la especificidad del tejido; 5) determinación de los efectos de reducción sobre la proliferación y migración de la línea celular de cáncer ovárico; y 6) determinación del patrón de expresión de cada secuencia aumentada en muestras derivadas de nueve tipos de cánceres diferentes. Los resultados explicados en esta descripción demuestran la ventaja de actuar selectivamente sobre genes relacionados con cáncer ovárico que son específicos de este tipo de células diferenciadas en comparación con tejidos normales, y proporcionan un método de escrutinio más eficaz para estudiar la base genética de enfermedades y trastornos. Las secuencias polinucleotídicas y/o polipeptídicas que se conocen, pero a las que no se les había asignado un papel hasta la presente descripción, también se han aislado, y presentan un papel crítico en la proliferación y migración de la línea celular de cáncer ovárico. Finalmente, se han identificado nuevas secuencias polinucleotídicas y/o polipeptídicas que desempeñan igualmente un papel.

La presente invención se ilustra con más detalle a continuación de una manera no limitante.

A -Material y métodos

Se utilizaron reactivos comercialmente disponibles, que se citan en la presente invención, de acuerdo con las instrucciones del proveedor, excepto que se indique de otro modo. A lo largo de la presente descripción, determinados materiales de partida se prepararon del siguiente modo:

B – Preparación de células de cáncer ovárico LMP y maligno

Las muestras de tumor ovárico LMP y maligno se seleccionaron basándose en la histopatología para identificar la etapa y grado respectivos (Tabla B). Se escogió LMP en lugar de tejido ovárico normal para evitar genes que están asociados con proliferación debido a ovulación. También, se habrían recuperado muy pocas células, y las células estrómicas habrían sido un contaminante importante. Los tumores ováricos LMP y seroso (más habitual) representan los extremos de tumorigenicidad, diferenciación e invasión. Una vez que se seleccionaron las muestras, se extrajo RNA total con Trizol™ (InVitrogen, Grand Island, NY) después de que los tejidos se homogeneizaron. La calidad del RNA se evaluó usando un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

Tabla B: muestra las patologías, incluyendo grado y etapa, de las diferentes muestras de cáncer ovárico usadas en las macromatrices.

Código MF nº

Patologías Símbolo Etapa Grado Posición en la macromatriz

15

Seroso fronterizo B 1b B A1

16

Seroso fronterizo B 2a B B1

17

Fronterizo/ Carcinoma seroso B/CS 3c 1 F1

Código MF nº

Patologías Símbolo Etapa Grado Posición en la macromatriz

18

Seroso fronterizo B 3c B C1

19

Seroso fronterizo B 1b B D1

20

Seroso fronterizo B 1a B E1

42

Carcinoma seroso de la superficie CSS 3a 3 A4

22

Carcinoma seroso CS 1b 3 A2

30

Carcinoma seroso CS 2c 3 E2

23

Carcinoma seroso CS 3c 3 F2

25

Carcinoma seroso CS 3c 3 B2

26

Carcinoma seroso CS 3c 3 A3

27

Carcinoma seroso CS 3c 3 C2

28

Carcinoma seroso CS 3c 3 D2

43

Carcinoma seroso CS 3c 3 B4

45

Carcinoma seroso CS 3c 3 D4

49

Carcinoma seroso CS 3c 2 F4

41

Carcinoma endometrioide CE 3b 3 G3

40

Carcinoma endometrioide CE 3c 3 F3

44

Carcinoma endometrioide CE 3c 3 C4

39

Carcinoma endometrioide CE 3c 2 E3

50

Carcinoma endometrioide CE 1c 1 G4

46

Carcinoma endometrioide CE 1a 2 E4

34

Carcinoma de células claras CCC 3c 2 B3

38

Carcinoma de células claras CCC 3c 3 D3

37

Carcinoma de células claras CCC 1c 2 C3

C -Método para aislar mRNA expresado diferencialmente

Algo clave para el descubrimiento de secuencias expresadas diferencialmente únicas para cáncer ovárico maligno es el uso de la tecnología STAR patentada por el solicitante (Substractive Transcription-based Amplification of 5 mRNA; patente U.S. nº 5.712.127, Malek et al., 1998). Basándonos en este procedimiento, el mRNA aislado de la muestra de tumor ovárico maligno se utiliza para preparar el “RNA probador” que se hibrida al “DNA conductor” monocatenario complementario preparado a partir de mRNA de muestra de LMP, y sólo se recupera el “RNA probador” sin hibridar, y se utiliza para crear librerías de cDNA clonado, denominadas “librerías sustraídas”. Por lo tanto, las “librerías sustraídas” están enriquecidas en secuencias expresadas diferencialmente que incluyen mRNAs

10 nuevos y raros que a menudo no se detectan en el análisis de hibridación de micromatrices. Se cree que estos mRNA nuevos y raros son representativos de importantes dianas génicas para el desarrollo de mejores estrategias diagnósticas y terapéuticas.

Los clones contenidos en las “librerías sustraídas” se identifican mediante el análisis de la secuencia del DNA, y su posible función se evalúa mediante la adquisición de la información disponible en las bases de datos públicas (NCBI 15 y GeneCard). Los clones no redundantes se utilizan luego para preparar micromatrices de DNA, que se utilizan para cuantificar sus patrones de expresión diferencial relativa mediante la hibridación a sondas de cDNA fluorescentes. Se pueden utilizar dos clases de sondas de cDNA: las que se generan de transcritos de RNA preparados de las mismas librerías sustraídas (sondas sustraídas), o bien de mRNA aislado de diferentes muestras LMP y malignas

ováricos (sondas estándar). El uso de las sondas sustraídas proporciona mayor sensibilidad para detectar las secuencias de mRNA poco abundantes que se preservan y enriquecen mediante STAR. Además, la especificidad de las secuencias expresadas diferencialmente por cáncer ovárico maligno se mide mediante la hibridación de sondas radiomarcadas, preparadas a partir de cada secuencia seleccionada, a macromatrices que contienen RNA de diferentes muestras de cáncer ovárico LMP y maligno, y diferentes tejidos humanos normales.

Un reto importante en la obtención del perfil de expresión génica es la poca cantidad de RNA disponible para el análisis molecular. La cantidad de RNA aislado procedente de muchas muestras humanas (aspiración con aguja, muestras de microdisección de captura con láser (LCM), y cultivos de células transfectadas) a menudo es insuficiente para preparar: 1) materiales conductores y probadores convencionales para STAR; 2) sondas de cDNA patrón para el análisis de micromatrices de DNA; 3) macromatrices de RNA para evaluar la especificidad de la expresión, 4) transferencia Northern, y 5) clones de cDNA completos para la posterior validación y caracterización biológicas, etc. Así pues, el solicitante ha desarrollado una tecnología patentada llamada RAMP (Procedimiento de amplificación del RNA) (solicitud de patente U.S. nº 11/000958, publicada con el nº US 2005/0153333A1 el 14 de julio de 2005 y titulada “Selective Terminal Tagging of Nucleic Acids”), que amplifica de forma lineal el mRNA contenido en muestras de RNA total, produciendo cantidades del orden de microgramos de RNA amplificado, suficiente para las diferentes aplicaciones analíticas. El RNA producido por RAMP son secuencias de tipo mRNA de longitud en gran medida completa como resultado del método patentado para añadir una etiqueta de secuencia terminal a los extremos 3’ de las moléculas de cDNA monocatenario, para uso en la amplificación lineal de la transcripción. Más del 99,5% de las secuencias amplificadas en las reacciones de RAMP muestran una variabilidad de < 2 veces y, por lo tanto, la RAMP proporciona muestras de RNA sin sesgo en cantidades suficientes para permitir el descubrimiento de secuencias de mRNA únicas implicadas en cáncer ovárico.

D – Preparación de librería sustraída de cáncer ovárico maligno humano

Se preparó RNA total a partir de cinco muestras de LMP ováricas (MF-15, -16, -18, -19 y -20) (Tabla B) y cinco muestras de cáncer ovárico maligno (MF-22, -25, -27, -28 y -30) (Tabla B) (CHUM, Montreal, QC), como se describe más arriba. Tras una ligera modificación de las enseñanzas de Malek et al., 1998 (patente U.S. nº 5.712.127), es decir, preparación de las librería de cDNA en las perlas paramagnéticas como se describe más abajo), se utilizó 1 #g de RNA total para preparar librerías de cDNA muy representativas sobre perlas paramagnéticas revestidas con estreptavidina (InVitrogen, Grand Island, NY), para preparar materiales del probador y del conductor. En cada caso, cDNA de primera cadena se sintetizó con un cebador de oligo dT11 con nucleótidos de cierre en 3’ (por ejemplo, A, G

o C), un resto de biotina en 5’ y que contiene un sitio de reconocimiento para NotI (OGS 364: SEQ. ID. NO. 90). A continuación, se llevó a cabo el cDNA de segunda cadena de acuerdo con el procedimiento del fabricante para la síntesis de cDNA bicatenario (Invitrogen, Burlington, ON), y el cDNA bicatenario resultante se ligó a los enlazadores que contenían un sitio de reconocimiento para AscI (New England Biolabs, Pickering, ON). Luego, los cDNA bicatenarios se digirieron con las enzimas de restricción AscI y NotI (New England Biolabs, Pickering, ON), se purificaron del exceso de enlazadores usando una columna de fraccionamiento del cDNA de Invitrogen (Burlington, ON), como especifica el fabricante. Cada muestra se dividió por igual y se ligó separadamente a marcadores promotores oligonucleotídicos especializados, TAG1 (OGS 594 y 595: SEQ. ID. NO: 91 y SEQ. ID. NO:92) y TAG2 (OGS458 y 459: SEQ. ID. NO:93 y SEQ. ID. NO:94) usados para preparar materiales probadores y conductores, respectivamente. Después, cada cDNA ligado se purificó capturando sobre las perlas de estreptavidina como se describe por el proveedor (InVitrogen, Grand Island, NY), y se transcribió in vitro con T7 RNA polimerasa (Ambion, Austin, TX).

Después, para preparar las librerías del probador y del conductor con representación del 3’, una alícuota de 10 #g de cada uno de los RNA sintetizados in vitro se convirtió en cDNA bicatenario mediante la síntesis del cDNA de primera cadena como se describe más arriba, seguido de la síntesis del DNA de segunda cadena dirigida por cebadores (cebador OGS 494 (SEQ. ID. NO:95) para TAG1 y cebador OGS 302 (SEQ. ID. NO: 96) para TAG2) mediante la Taq polimerasa Advantage-2 (BD Biosciences Clontech, Mississauga, ON). El cDNA bicatenario se purificó usando columnas Qiaquick, y se cuyantificó a A260nm. A continuación, se digirieron por separado 6 alícuotas de 1 #g de cada cDNA bicatenario con una de las siguientes enzimas de restricción que reconocen 4 bases RsaI, Sau3A1, MseI, MspI, HinPII y Bsh1236I (MBI Fermentas, Burlington, ON), lo que produce hasta seis posibles fragmentos en 3’ para cada una de las especies de RNA contenidas en la librería de cDNA. Después de la digestión, las enzimas de restricción se inactivaron con fenol, y se agrupó el conjunto de seis reacciones. Entonces, los sitios de las enzimas de restricción se hicieron romos con T4 DNA polimerasa y se ligaron a enlazadores que contenían un sitio de reconocimiento para AscI. Cada muestra de DNA agrupada adaptada con el enlazador se digirió con las enzimas de restricción AscI y NotI, se desalaron y se ligaron a marcadores promotores oligonucleotídicos especializados, TAG1 (OGS 594 y 595) para los materiales derivados de TAG1 originales para generar RNA probador, y OGS 621 y 622 relacionados con TAG2 (SEQ. ID. NO:97 y SEQ. ID. NO:98) con sólo la secuencia promotora para los materiales derivados de TAG2 para generar DNA conductor. Los materiales ligados al promotor se purificaron usando las perlas de estreptavidina, que entonces se transcribieron in vitro con T7 RNA polimerasa (Ambion, Austin, TX), se purificaron y se cuantificaron a A260nm. El RNA representado en 3’ de TAG1 resultante se utilizó directamente como “RNA probador”, mientras que el RNA representado en 3’ de TAG2 se utilizó para sintetizar cDNA de primera cadena, que entonces sirvió como “DNA conductor” monocatenario. Cada reacción de “DNA conductor” se trató con RNasa A y RNasa H para eliminar el RNA, se extrajo con fenol y se purificó antes del uso. Se reunieron cantidades

equivalentes de cada RNA conductor para las cinco muestras de LMP antes de la síntesis del DNA conductor monocatenario. Se prepararon las siguientes librerías representadas en 3’: Probador 1 (MF-22) - donante 1 de cáncer ovárico maligno humano Probador 2 (MF-25) - donante 2 de cáncer ovárico maligno humano Probador 3 (MF-27) - donante 3 de cáncer ovárico maligno humano Probador 4 (MF-28) - donante de 4 cáncer ovárico maligno humano Probador 5 (MF-30) - donante 5 de cáncer ovárico maligno humano Conductor 1 (MF-15) - donante 1 de LMP ovárico humano Conductor 2 (MF-16) - donante 2 de LMP ovárico humano Conductor 3 (MF-18) - donante 3 de LMP ovárico humano Conductor 4 (MF-19) - donante 4 de LMP ovárico humano

Conductor 5 (MF-20) donante 5 de LMP ovárico humano Cada muestra del RNA probador se sustrajo siguiendo las enseñanzas de la patente U.S. nº 5.712.127 con el DNA conductor reunido (MF-15, -16, -18, -19 y -20) en una relación de 1:100 para 2 rondas siguiendo las enseñanzas de Malek et al. 1998 (patente U.S. nº 5.712.127). Adicionalmente, se prepararon reacciones de control que contenían RNA probador y ningún DNA conductor, y RNA probador más DNA conductor sin RNasa H. El RNA probador restante en cada reacción después de la sustracción se convirtió en DNA bicatenario, y se eliminó un volumen de 5% y se amplificó en una reacción de PCR estándar durante 30 ciclos para propósitos analíticos. El restante 95% de sólo las muestras sustraídas de probador-conductor más RNasa H después de 2 rondas se amplificó durante 4 ciclos en PCR, se digirió con enzimas de restricción AscI y NotI, y se ligó una mitad en el vector plasmídico pCATRMAN (SEQ ID NO. 99), y la otra mitad en el vector plasmídico p20 (SEQ ID NO. 100). Los materiales ligados se transformaron en DH10B de E. coli, y los distintos clones contenidos en las librerías de pCATRMAN se recogieron para analizarlas adicionalmente (secuenciación e hibridación del DNA), mientras que los clones contenidos en cada librería de p20 se agruparon para su uso como sondas sustraídas. Cada librería sustraída clonada amplificada 4 ciclos contenía entre 15.000 y 25.000 colonias. Adicionalmente, a fin de preparar sondas de cDNA sustraído, se llevó a cabo una sustracción recíproca durante 2 rondas usando en su lugar el RNA conductor reunido como “probador” y cada uno del RNA probador maligno como “conductor”. Los materiales que quedan tras la sustracción para cada uno se amplificaron de forma similar durante 4 ciclos en PCR, se digirieron con enzimas de restricción Asc I y Not I, y una mitad se ligó en el vector plasmídico p20.

Se prepararon las siguientes librerías sustraídas clonadas: SL123 -Probador 1 (MF-22) menos Conductor Reunido (MF-15, -16, -18, -19 y -20) SL124 -Probador 2 (MF-25) menos Conductor Reunido (MF-15, -16, -18, -19 y -20) SL125 -Probador 3 (MF-27) menos Conductor Reunido (MF-15, -16, -18, -19 y -20) SL126 -Probador 4 (MF-28) menos Conductor Reunido (MF-15, -16, -18, -19 y -20) SL127 -Probador 5 (MF-30) menos Conductor Reunido (MF-15, -16, -18, -19 y -20) SL133 -Conductor Reunido (MF-15, -16, -18, -19 y -20) menos Probador 1 (MF-22) SL134 -Conductor Reunido (MF-15, -16, -18, -19 y -20) menos Probador 2 (MF-25) SL135 -Conductor Reunido (MF-15, -16, -18, -19 y -20) menos Probador 3 (MF-27) SL136 -Conductor Reunido (MF-15, -16, -18, -19 y -20) menos Probador 4 (MF-28) SL137 -Conductor Reunido (MF-15, -16, -18, -19 y -20) menos Probador 5 (MF-30) Una alícuota de 5 #l de los materiales sustraidos y no sustraidos amplificados por PCR de 30 ciclos se visualizaron

en un gel de agarosa al 1,5% que contenía bromuro de etidio, y luego se transfirieron a una membrana de nailon Hybond N+ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) para el análisis de transferencia Southern. Mediante el uso de sondas radiomarcadas específicas para GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; Acceso #M32599.1) y ∀actina (Acceso #X00351), que son típicamente genes de mantenimiento que no se expresan diferencialmente, fue

evidente que hubo sustracción tanto de la GAPDH como de la ∀-actina (Fig. 51, Paneles Ay B). Aunque, al mismo tiempo, una sonda específica para CCNE1 (Acceso # NM_001238, un gen que se sabe que está aumentado en cáncer ovárico maligno, indicó que no se sustrajo (Fig. 51, Panel C). Basándose en estos resultados, se anticipó que las librerías sustraídas estarían enriquecidas para secuencias aumentadas expresadas diferencialmente.

E - Identificación de las secuencias y anotación de los clones contenidos en las librerías sustraídas:

Se añadieron al azar aproximadamente !5300 colonias individuales contenidas en las librerías sustraídas pCATRMAN (SL123 a SL127) descritas anteriormente usando un Qbot (Genetix Inc., Boston, MA) en 60 #l de agua sometida a autoclave. Después, se usaron 42 #l de cada uno en una reacción de PCR estándar de 100 #l que contiene cebadores oligonucleotídicos, OGS 1 y OGS 142, y se amplificó durante 40 ciclos (94ºC durante 10 minutos, 40x (94ºC durante 40 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos) seguido de 72ºC durante 7 minutos) en placas de microtitulación de 96 pocillos usando HotStartTM Taq polimerasa (Qiagen, Mississauga, ON). Las reacciones de PCR terminadas se desalaron usando las placas de filtro de 96 pocillos (Corning), y los amplicones se recuperaron en 100 #l de Tris 10 mM (pH 8,0). Una alícuota de 5 #l de cada reacción de PCR se visualizó en un gel de agarosa al 1,5% que contiene bromuro de etidio, y sólo aquellas reacciones que contienen un único producto amplificado se seleccionaron para el análisis de secuencia de DNA usando secuenciación de DNA estándar realizada en un instrumento ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). A cada secuencia de DNA obtenida se dio un Número de Identificación de Secuencia y se introdujo en una base de datos para el seguimiento y anotación subsiguientes.

Cada secuencia se seleccionó para análisis BLAST de bases de datos públicas (por ejemplo NCBI). Estaban ausentes de estas secuencias los genes de mantenimiento estándar (GAPDH, actina, la mayoría de proteínas ribosómicas, etc.), lo que fue una buena indicación de que la librería sustraída no tenía al menos las secuencias no expresadas diferencialmente relativamente abundantes.

Una vez que se terminó la secuenciación y anotación de los clones seleccionados, la siguiente etapa implicó identificar esas secuencias que estaban realmente aumentadas en las muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con las muestras de LMP.

F – Análisis de hibridación para identificar secuencias aumentadas

Los amplicones de PCR que representan las secuencias anotadas de las librerías pCATRMAN descritas anteriormente se usaron para preparar micromatrices de DNA. Los amplicones de PCR purificados contenidos en 70 #l de las reacciones de PCR preparadas en la sección previa se liofilizaron, y cada uno se reconstituyó en 20 #l de disolución de manchado que comprende 3xSSC y sarcosil al 0,1%. Entonces se prepararon micromatrices de DNA de cada amplicón por triplicado usando portaobjetos CMT-GAP2 (Corning, Corning, NY) y el manchador GMS 417 (Affymetrix, Santa Clara, CA).

Las micromatrices de DNA se hibridaron entonces con sondas de cDNA marcadas con cy3 y cy5 estándar o sustraídas, como lo recomienda el proveedor (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Las sondas de cDNA estándar se sintetizaron usando RNA amplificado mediante RAMP preparado a partir de las diferentes muestras de LMP y cáncer maligno ováricas humanas. Es bien conocido por el experto que las sondas de cDNA estándar sólo proporcionan sensibilidad limitada de detección, y consecuentemente se pierden habitualmente secuencias de baja abundancia contenidas en las sondas de cDNA. De este modo, el análisis de hibridación también se llevó a cabo usando sondas de cDNA sustraídas marcadas con cy3 y cy5 preparadas a partir de RNA transcrito in vitro generado a partir de librerías sustraídas (SLP123 a SLP127 y SLP133 a SLP137) clonadas en el vector plasmídico p20, y representan los materiales probadores y conductores diferentes. Estas librerías sustraídas se pueden enriquecer en secuencias de baja abundancia como resultado de las siguientes enseñanzas de Malek et al., 1998 (patente U.S. nº 5.712.127), y por lo tanto pueden proporcionar una mayor sensibilidad de detección.

Todas las reacciones de hibridación se llevaron a cabo usando el procedimiento de permuta de colorante como se recomienda por el proveedor (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), y se seleccionaron para análisis posterior aproximadamente 750 secuencias aumentadas (>2 veces) putativa y diferencialmente expresadas.

G – Determinación de la especificidad por cáncer ovárico maligno de las secuencias identificadas expresadas diferencialmente:

Las secuencias expresadas diferencialmente, identificadas en la Sección F para las diferentes librerías sustraídas de cáncer ovárico maligno humano (SL123 a SL127), se ensayaron para determinar la especificidad mediante hibridación a macromatrices a base de membranas de nailon. Las macromatrices se prepararon usando RNA amplificado mediante RAMP a partir de 6 muestras ováricas humanas de LMP y 20 muestras ováricas humanas malignas, y 30 tejidos humanos normales (suprarrenal, hígado, pulmón, ovario, músculo esquelético, corazón, cuello uterino, tiroides, mama, placenta, corteza suprarrenal, riñón, vena cava, trompa de Falopio, páncreas, testículo, yeyuno, aorta, esófago, próstata, estómago, bazo, íleo, tráquea, cerebro, colon, timo, intestino delgado, vejiga y duodeno) adquiridos comercialmente (Ambion, Austin, TX). Además, RNA de RAMP preparado a partir de líneas celulares de cáncer de mama, MDA y MCF7, línea celular de cáncer de próstata, LNCap, y una muestra

microdisecada mediante LCM de cáncer de próstata y normal. Debido a las cantidades limitadas de mRNA disponibles para muchas de estas muestras, fue necesario amplificar en primer lugar el mRNA usando la metodología de RAMP. Cada muestra de RNA amplificada se reconstituyó hasta una concentración final de 250 ng/#l en 3xSSC y sarcosil al 0,1% en placa de microtitulación de 96 pocillos, y se colocó 1 #l como mancha sobre membranas de nailon Hybond N+ usando el aparato especializado MULTI-PRINT™ (VP Scientific, San Diego, CA), se secó por aire y se reticuló mediante radiación UV. De las !750 secuencias diferentes seleccionadas de SL123 a SL127 para el análisis de macromatrices, sólo 250 secuencias se radiomarcaron individualmente con ∃-32P-dCTP usando el procedimiento de cebado al azar recomendado por el proveedor (Amersham, Piscataway, NJ) y se usaron como sondas en las macromatrices hasta ahora. Las etapas de hibridación y lavado se llevaron a cabo siguiendo procedimientos estándar bien conocidos por los expertos en la técnica.

Ocasionalmente, los resultados obtenidos de la metodología de macromatrices fueron no concluyentes. Por ejemplo, el sondaje de las membranas con ciertos clones STAR dio como resultado patrones en los que todas las muestras de RNA parecían expresar niveles iguales del mensaje, o patrones en los que no había señal. Esto sugirió que no todos los clones STAR fueron herramientas útiles para verificar la expresión de sus genes respectivos. Para circunvalar este problema, se usó RT-PCR para determinar la especificidad de la expresión. Usando las mismas muestras de RNA de RAMP que se colocaron como manchas en las macromatrices, 500 #g de RNA se convirtieron en cDNA monocatenario con Thermoscript RT (Invitrogen, Burlington, ON) como se describe por el fabricante. La reacción de cDNA se diluyó de manera que se usó 1/200 de la reacción para cada experimento de PCR. Tras las reacciones de PCR de ensayo con cebadores específicos de genes diseñados contra cada una de las SEQ. ID NOs. a ensayar, se determinó el intervalo lineal de la reacción y se aplicó a todas las muestras, se llevó a cabo la PCR en placas de 96 pocillos usando Hot-Start Taq Polimerasa de Qiagen (Mississauga, ON) en un DNA Engine Tetrad de MJ Research. La mitad de la mezcla de reacción se cargó en gel de 1,2% de agarosa/bromuro de etidio, y los amplicones se visualizaron con luz UV.

De las 250 secuencias ensayadas, se encontró que aproximadamente el 55% estaban aumentadas en muchas de las muestras malignas, en comparación con las LMPs. Sin embargo, muchas de estas secuencias también se detectaron fácilmente en una mayoría de los tejidos humanos normales diferentes. Basándose en estos resultados, se eliminaron aquellas secuencias que se detectaron en muchos de los otros tejidos humanos en niveles significativamente elevados. En consecuencia, sólo se seleccionaron para estudios de validación biológica 49 secuencias, que parecieron estar aumentadas y ser específicas de cáncer ovárico muy maligno. Este subconjunto de 49 secuencias incluye algunos genes previamente dados a conocer en la bibliografía que están aumentados en cáncer ovárico pero sin demostración de su expresión relativa en tejidos normales. Se incluyen los datos de macromatrices para FOLR1 (SEQ. ID. NO.50) para ejemplificar el patrón de hibridación y la especificidad de un gen que ya es conocido porque está implicado en el desarrollo de cáncer ovárico.

Las Fig. 1-49 y 51 muestran los patrones de señales de hibridación de macromatrices y los datos de amplificación mediante RT-PCR para tejidos de cáncer ovárico maligno y tejidos humanos normales con respecto a los LMPs para las 50 secuencias aisladas y seleccionadas para la validación biológica. Entre las 50 secuencias seleccionadas, 27 estaban asociadas con genes que tienen anotación funcional, 15 estaban asociadas con genes sin anotación funcional, y 8 fueron nuevas secuencias (resultados genómicos). La identificación de productos génicos implicados en la regulación del desarrollo de cáncer ovárico ha conducido así al descubrimiento de dianas muy específicas, incluyendo nuevas dianas, para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el manejo de cáncer ovárico. Se representan más abajo secuencias representativas resumidas en la Tabla 2, y las secuencias correspondientes se ilustran en la Tabla 4.

Se describe aquí un método para identificar representativamente una secuencia expresada diferencialmente implicada en cáncer ovárico. La secuencia puede ser, por ejemplo, expresada diferencialmente en una célula de cáncer ovárico maligno en comparación con una célula de cáncer ovárico LMP o células ováricas normales. La secuencia se puede expresar diferencialmente, por ejemplo, en una célula de cáncer ovárico maligno y una célula de cáncer ovárico LMP en comparación con una célula ovárica normal.

El método puede comprender las siguientes etapas, o algunas de las siguientes etapas:

a) proporcionar de forma separada RNA mensajero total procedente de células de cáncer ovárico maligno y LMP, y células ováricas normales, pudiendo comprender el RNA mensajero total, por ejemplo, al menos una secuencia expresada endógena y diferencialmente,

b) generar (por ejemplo, una única copia) de a) cDNA monocatenario a partir de cada RNA mensajero de célula de cáncer ovárico maligno y etiquetar (por ejemplo, aleatoriamente) el extremo 3’ del cDNA monocatenario con una secuencia promotora de RNA polimerasa y una primera etiqueta de secuencia;

c) generar (por ejemplo, una sola copia) de a) cDNA monocatenario de cada RNA mensajero de células de cáncer ovárico LMP o célula ovárica normal, y etiquetar (por ejemplo aleatoriamente) el extremo 3’ del cDNA monocatenario con una secuencia promotora de RNA polimerasa y una segunda etiqueta de secuencia;

d) generar de forma separada DNA etiquetado en 5’ parcial o completamente bicatenario a partir de cada uno

de b) y c), pudiendo comprender así el DNA etiquetado en 5’ bicatenario, en una dirección 5’ a 3’, un promotor de RNA polimerasa bicatenario, una primera o segunda etiqueta de secuencia y una secuencia de ácido nucleico expresada,

e) amplificar de forma separada y linealmente un RNA sentido etiquetado con una primera y una segunda etiqueta procedente de cada uno de d) con una enzima RNA polimerasa (que se puede seleccionar basándose en el promotor usado para el etiquetaje),

f) generar DNA de primera o de segunda etiqueta complementario monocatenario a partir de uno de e),

g) hibridar el DNA de primera o segunda etiqueta complementario monocatenario de f) con el otro RNA sentido linealmente amplificado de e),

h) recuperar RNA no hibridado con la ayuda de la etiqueta de secuencia primera o segunda (por ejemplo mediante PCR o hibridación), e

i) identificar (determinar) la secuencia nucleotídica de RNA sin hibridar.

El método puede comprender además la etapa de determinar de forma comparativa la presencia de secuencia identificada expresada diferencialmente en una célula cancerosa con respecto a una célula normal (por ejemplo, una célula ovárica normal, una célula de próstata normal, una célula de mama normal, etc.), o con respecto a un valor estándar.

El método se puede usar para identificar preferentemente una secuencia que está aumentada en célula de cáncer ovárico maligno en comparación con una célula procedente de un cáncer ovárico de bajo potencial maligno y/o en comparación con una célula normal.

Una secuencia se puede seleccionar adicionalmente basándose en una expresión reducida, disminuida o sustancialmente ausente en un subconjunto de otra célula normal (por ejemplo, una célula ovárica normal) o tejido, representando por lo tanto una secuencia candidata específicamente implicada en cáncer ovárico.

El método puede comprender además también la etapa de determinar la secuencia completa de la secuencia nucleotídica, y también puede comprender determinar la secuencia codificante de la secuencia nucleotídica.

También se puede seleccionar una secuencia en busca de su especificidad por otros tipos de células tumorales, identificando así una secuencia que tiene una implicación más generalizada en el desarrollo de cáncer. Estos tipos de secuencia pueden representar por lo tanto candidatos deseables que tienen una utilidad más universal en el tratamiento y/o detección de cáncer.

Se describen aquí las secuencias aisladas expresadas diferencialmente (polinucleótidos y polipéptidos) identificadas mediante el método descrito aquí.

SEQ. ID. NO:1:

La secuencia STAR candidata para SEQ. ID. NO:1 se corresponde a un resultado genómico y resultados est según las bases de datos nr y est de NCBI (véase la Tabla 2). Aunque los ests de emparejamiento están agrupados en un nuevo número identificador de Unigene, Hs. 555871, la secuencia STAR no se corresponde con ninguna de las secuencias de mRNA conocidas enumeradas en este agrupamiento, que codifica la proteína de unión al nucleótido guanina (proteína G), polipéptido 1 de actividad transductora gamma (GNGT1). Se demostró que esta secuencia del clon STAR está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ováricas y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 1), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que el gen que comprende esta secuencia STAR, o un miembro génico relacionado como se perfila en el agrupamiento de Unigene, puede ser necesario para la tumorigénesis del cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:2:

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:2 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica un polipéptido predicho, proteína de tipo 44 inducida por interferón (IFI44L) con una función desconocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 2), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión de este gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:3:

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:3 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica un polipéptido conocido, HOX D1, que contiene un dominio de unión a DNA de homeocaja. Este gen es un miembro de la familia de la homeocaja Antp, y es un factor de transcripción específico de la secuencia nuclear que se sabe previamente que está implicado en la diferenciación y desarrollo de extremidades (véase la Tabla 2). Se

ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y los tejidos humanos normales (Figura 3), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, igualmente se cree que el gen puede ser necesario para, o puede estar implicado en la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:4:

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:4 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica un polipéptido hipotético, LOC92196, similar a la proteína asociada a la muerte con una función desconocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 4), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión de este gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:5

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:5 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica un polipéptido predicho, proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 (IFIT1), con función desconocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 5), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión de este gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:6:

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:6 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica una proteína conocida, glicina deshidrogenasa (GLDC) (decarboxilante; glicina descarboxilasa, proteína P de sistema de escisión de glicina), que es uyna enzima mitocondrial que cataliza la degradación de glicina (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 6), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión de este gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico. La actividad de GLDC se puede detectar, por ejemplo, midiendo la degradación de glicina en urea.

SEQ. ID. NO:7:

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:7 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica una proteína, dipeptidasa 3 (DPEP3), que tiene actividad (proteolisis y peptidolisis) de dipeptidasa de membrana (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 7), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión de este gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:8

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:8 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica una proteína, neuromedina U (NMU), que es un neuropéptido con potente actividad sobre el músculo liso (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 8), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:9

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:9 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica una proteína, proteína morfogenéticas ósea 7 (BMP7), que desempeña un papel en la regulación de calcio y homeostasia ósea (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 9), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:10

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:10 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica una proteína, inhibidor 3 de cinasa dependiente de ciclina (CDKN3) (fosfatasa de especificidad dual asociada a CDK2), que se expresa en la transición de G1 a S del ciclo celular (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 10), que no se han dado a

conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:11

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:11 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica una proteína, subunidad 1 B reguladora de proteína cinasa CDC28 (CKS1B), que tiene actividad de proteína cinasa dependiente de ciclina en la regulación del ciclo celular (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 11), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:12

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:12 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica una proteína, antígeno expresado preferentemente en melanoma (PRAME), que no tiene función conocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 12), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:13

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:13 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica una proteína, modificador de tipo ubiquitina ISG15 (ISG15), que está asociada con el catabolismo proteico dependiente de ubiquitina (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 13), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:14

La secuencia STAR candidata representada por la SEQ. ID. NO:14 aislada está asociada con una secuencia génica parcial previamente identificada relacionada con el Acceso # Al922121.1 (véase la Tabla 2), que codifica una proteína aún desconocida. Se ha demostrado que esta secuencia del clon STAR está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ováricas y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 14), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen que corresponde a esta secuencia STAR (y secuencias polinucleotídicas que comprenden la secuencia STAR) puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:15

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:15 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica una proteína hipotética, FLJ33790, que no tiene función conocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 15), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:16

La secuencia STAR representada por la SEQ. ID. NO:16 aislada se corresponde a un est previamente identificado, BG213598 que procede de un locus genómico transcrito contenido en el agrupamiento de Unigene, Hs.334302, que codifica una proteína aún desconocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que esta secuencia del clon STAR está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ováricas y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 16), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen que corresponde a esta secuencia STAR (y polinucleótidos que comprenden esta secuencia STAR), o un miembro génico relacionado como se perfila en el agrupamiento de Unigene, puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:17

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:17 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica una proteína, inhibidor 1 de la activación de células T que contiene el dominio del conjunto V (VTCN1), que no tiene función conocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de

tejidos humanos normales (Figura 17), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:18

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:18 aislada está asociada con un gen previamente identificado que codifica una proteína, miembro 20A de la familia de quinesina (KIF20A), que está implicada en división celular y en el tráfco membránico en el aparato de Golgi (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 18), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:19

La secuencia STAR representada por la SEQ. ID. NO:19 aislada corresponde al resultado genómico, Acceso #AY769439 y a un grupo de ests representado por Acceso # AA744939. Los ests están agrupados en el identificador de Unigene, Hs.478368, que representa la proteína, miembro 2 beta, subfamilia M, del canal activado por calcio de gran conductancia de potasio (KCNMB2). Sin embargo, la secuencia STAR no solapa con ninguna de las secuencias de mRNA enumeradas hasta ahora en el agrupamiento de Unigene Hs. 478368 (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que esta secuencia del clon STAR está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ováricas y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 19A), que no se han dado a conocer previamente. Además, al llevar a cabo la RT-PCR utilizando cebadores específicos para la secuencia del clon STAR para SEQ. ID. NO. 19 o la secuencia KCNMB2 representada por Acceso nº NM_005832, los perfiles de amplificación no fueron los mismos a lo largo de un número de muestras ováricas ensayadas (Figura 19B). Es obvio que KCNMB2 está expresada en esencialmente todas las muestras ováricas, incluyendo las normales, a niveles similares, mientras que no se observaron amplicones de PCR para SEQ. ID. NO. 19 a mayores niveles en las muestras de tumor ovárico maligno en comparación con las muestras ováricas de LMPs y normales (Figura 19B). De este modo, se cree que la expresión del gen que corresponde a esta secuencia STAR (y secuencias polinucleotídicas que comprenden la secuencia STAR), o un miembro génico relacionado, puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:20

La secuencia STAR representada por la SEQ. ID. NO:20 aislada corresponde a una est previamente identificada, BU595315 que pertenece a un grupo de ests que proceden de un locus genómico transcrito contenido en el agrupamiento de Unigene, Hs.603908, que codifica una proteína aún desconocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que esta secuencia del clon STAR está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ováricas y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 20), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen que corresponde a esta secuencia STAR (y secuencias polinucleotídicas que comprenden esta secuencia STAR), o un miembro génico relacionado como se perfila en el agrupamiento de Unigene, puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:21

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:21 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, ligando 10 de quimiocina (motivo C-X-C) (CXCL10), que tiene actividad de quimiocina (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 21), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:22

La secuencia STAR representada por la SEQ. ID. NO:22 aislada corresponde al cromosoma 14, y puede representar una porción de una secuencia génica desconcida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que esta secuencia del clon STAR está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ováricas y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 22), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen que corresponde a esta secuencia STAR (y polinucleótidos que comprenden esta secuencia STAR) puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:23

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:23 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, homólogo de glucosilación 8 enlazado a asparagina (levadura, alfa-1,3-glucosiltransferas) (ALG8), que cataliza la adición del segundo resto de glucosa al precursor de oligosacárido enlazado a lípidos para glucosilación

de las proteínas enlazada mediante N (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 23), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:24

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:24 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, antígeno 1 asociado a riñón (KAAG1), que no tiene función conocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 24), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:13

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:25 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, inhibidor 2A de cinasa dependiente de ciclina (CDKN2A), que está implicada en el control del ciclo celular, punto de comprobación G1/S (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 25), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:26

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:26 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, homólogo de proteína asociada a microtúbulos (Xenopus laevis) (TPX2), que está implicada en la proliferación celular desde la transición G1/S hasta el final de la citocinesis (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 26), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:27

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:27 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, enzima que se conjuga a ubiquitina E2C (UBE2C), que es necesaria para la destrucción de ciclinas mitóticas y para la progresión del ciclo celular (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 27), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:28

La secuencia STAR representada por la SEQ. ID. NO:28 aislada corresponde a cDNA FLJ35538 fis, clon SPLEN2002463 del agrupamiento de Unigene, Hs.590469, y puede representar una porción de una secuencia génica desconocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que esta secuencia del clon STAR está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ováricas y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 28), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen correspondong to this STAR sequence (y polinucleótidos que comprenden esta secuencia STAR), o un miembro génico relacionado como se perfila en el agrupamiento de Unigene, puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:29

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:29 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, proteína 2 de unión a ácido retinoici celular 2 (CRABP2), cuya función no se ha determinado de forma precisa pero esta isoforma es importante en la regulación mediada por el ácido retinoico del crecimiento y diferenciación de la piel humana (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 29), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:30

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:30 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, Histona 3, H2a (HIST3H2A), que está implicada en la formación del nucleosoma (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 30), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:31

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:31 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, Histona 1, H4h (HIST1H4H), que está implicada en la formación del nucleosoma (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 30), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:32

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:32 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína hipotética, homeocaja D3 (HOXD3), que es un factor de transcripción nuclear implicado en el desarrollo y diferenciación (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 32), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:33

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:33 aislada es un gen previamente identificado que codifica un miembro de la familia génica de inmunoglobulinas, inmunoglobulina constante gamma 1 (IGHG1), que desempeña probablemente un papel en la respuesta inmunitaria y la unión al antígeno (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 33), que no se han dado a conocer previamente. El patrón de expresión de este gen es similar a otros dos genes descritos aquí, SEQ. ID. NO. 34 y SEQ. ID. NO. 47, que también codifican inmunoglobulinas. Este tipo de expresión de inmunoglobulinas agrupadas en cáncer ovárico no se ha descrito previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:34

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:34 aislada es un gen previamente identificado que codifica un miembro de la familia génica de inmunoglobulinas, inmunoglobulina kappa constante (IGKC), que desempeña probablemente un papel en la respuesta inmunitaria y la unión al antígeno (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 34), que no se han dado a conocer previamente. El patrón de expresión de este gen es similar a otros dos genes descritos aquí, SEQ. ID. NO. 33 y SEQ. ID. NO. 47, que también codifican inmunoglobulinas. Este tipo de expresión de inmunoglobulinas agrupadas en cáncer ovárico no se ha descrito previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:35

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:35 aislada es un gen situado en el cromosoma 10 que codifica un marco abierto de lectura de función desconocida (véase la Tabla 2). El gen puede codificar una proteína, denominada astroprincina, que se encontró que estaba expresada en una región crítica en el síndrome de DiGeorge. Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 35), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:36

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:36 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, histocompatibilidad (menor) 13 (HM13), que no tiene función conocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 36), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:37

La secuencia STAR representada por la SEQ. ID. NO:37 aislada corresponde al cromosoma 13, y puede representar una porción de secuencia génica desconocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que esta secuencia del clon STAR está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ováricas y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 37), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen que corresponde a esta secuencia STAR (y polinucleótidos que comprenden esta secuencia STAR) puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:38

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:38 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, proteína relacionada con Frizzled (FRZB), que está asociada con osteoartritis sintomática, y puede desempeñar un papel en morfogénesis esquelética (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 38), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:39

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:39 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, caja de cabeza de tenedor M1 (FOXM1), que es un factor de transcripción que regula genes implicados en la proliferación celular (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 39), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:40

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:40 aislada es un gen situado en el cromosoma 20 que codifica un marco de lectura abierto de función desconocida (véase la Tabla 2). Se predice que el gen codifica una proteína membránica. Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 40), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:41

La secuencia STAR representada por la SEQ. ID. NO:41 aislada corresponde al cromosoma 1, y puede representar una porción de secuencia génica desconocida (véase la Tabla 2). Se ha encontrado homología débil entre SEQ. ID. NO. 41 y las proteínas de cubierta presentes en la superficie de los retrovirus endógenos humanos. Se ha demostrado que esta secuencia del clon STAR está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ováricas y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 41), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen que corresponde a esta secuencia STAR (y polinucleótidos que comprenden esta secuencia STAR) puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:42

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:42 aislada es un gen situado en el cromosoma 16 que codifica un marco de lectura abierto de función desconocida (véase la Tabla 2). Se predice que el gen codifica una proteína membránica. Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 42), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:43

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:43 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, proteína 1 activante de Rac GTPasa (RACGAP1), que es una GTPasa que interacciona con las Rho GTPasas para controlar muchos procesos celulares (véase la Tabla 2). Estos tipos de proteína son moléculas efectoras importantes para la señalización aguas debajo de Rho GTPasas. Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 43), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:44

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:44 aislada es un gen que codifica la proteína transmembránica 19 (TMEM19) que no tiene función conocida (véase la Tabla 2). Se predice que el gen codifica una proteína membránica. Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 44), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:45

La secuencia STAR representada por la SEQ. ID. NO:45 aislada corresponde al cromosoma 4, y puede representar una porción de secuencia génica desconocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que esta secuencia del clon STAR está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ováricas y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 45), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen que corresponde a esta secuencia STAR (y polinucleótidos que comprenden esta secuencia STAR) puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:46

La secuencia STAR representada por la SEQ. ID. NO:46 aislada corresponde al cromosoma 1, y puede representar una porción de secuencia génica desconocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que esta secuencia del clon STAR está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ováricas y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 46), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen que corresponde a esta secuencia STAR (y polinucleótidos que comprenden esta secuencia STAR) puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:47

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:47 aislada es un gen previamente identificado con el agrupamiento de Unigene, Hs.449585, y puede representar una porción del locus de inmunoglobulina lambda (IGLV@), que desempeña probablemente un papel en la respuesta inmunitaria y la unión al antígeno (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 47), que no se han dado a conocer previamente. El patrón de expresión de este gen es similar a otros dos genes descritos aquí, SEQ. ID. NO. 33 y SEQ. ID. NO. 34, que también codifican inmunoglobulinas. Este tipo de expresión de inmunoglobulinas agrupadas en cáncer ovárico no se ha descrito previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:48

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:48 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, proteína 3 de membrana portadora secretora (SCAMP3), que funciona como una proteína portadora de la superficie ceular durante el transporte vesicular (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que la expresión de este gen está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ovárico, pero también está expresada en una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 48), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:49

La secuencia STAR representada por la SEQ. ID. NO:49 aislada corresponde al cromosoma 2, y puede representar una porción de secuencia génica desconocida (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que esta secuencia del clon STAR está notablemente aumentada en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ováricas y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 49), que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen que corresponde a esta secuencia STAR (y polinucleótidos que comprenden esta secuencia STAR) puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:50

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:50 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, receptor 1 de folato (adulto) (FOLR1), teniendo los miembros de esta familia génica una elevada afinidad por ácido fólico y por varios derivados de ácido fólico reducido, y median el suministro de 5-metiltetrahidrofolato al interior de las células (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que este gen está notablemente aumentado en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ováricas y una mayoría de tejidos

humanos normales (Figura 50). El papel potencial de FOLR1 en la terapia contra el cáncer ovárico se ha documentado previamente (Leamon y Low, 2001 y Jhaveri et al., 2006, patente de los Estados Unidos 7.030.236). A título de ejemplo de la diana del gen FOLR1, los genes similares descritos aquí con aumento en tumores ováricos malignos y expresión limitada o sin expresión en una mayoría de tejidos normales también pueden servir como dianas terapéuticas potenciales para cáncer ovárico.

SEQ. ID. NO:169

La proteína candidata codificada por la SEQ. ID. NO:169 aislada es un gen previamente identificado que codifica una proteína, ceruloplasmina (CP), que se une a la mayoría del cobre en el plasma y está implicada en la peroxidación de transferrina Fe(II). La deficiencia de esta metaloproteína, denominada aceruloplasminemia, conduce a acumulación de hierro y a daño tisular, y está asociada con diabetes y enfermedades neurológicas (véase la Tabla 2). Se ha demostrado que este gen está notablemente aumentado en muestras de cáncer ovárico maligno en comparación con muestras de LMP ováricas y una mayoría de tejidos humanos normales (Figura 56) que no se han dado a conocer previamente. De este modo, se cree que la expresión del gen que corresponde a esta secuencia STAR (y polinucleótidos que comprenden esta secuencia STAR) puede ser necesaria para, o puede estar implicada en, la tumorigénesis de cáncer ovárico.

H -Estudios de interferencia por RNA

La interferencia por RNA es un mecanismo de regulación génica recientemente descubierto que implica la disminución, específica de secuencia, de la expresión de un gen al dianizar el mRNA para la degradación y, aunque se describió originalmente en las plantas, se ha descubierto en muchos reinos animales, desde los protozoos e invertebrados hasta los eucariotas superiores (revisado en Agrawal et al., 2003). En el contexto fisiológico, el mecanismo de interferencia por RNA está desencadenado por la presencia de moléculas de RNA bicatenario que se escinden mediante una proteína de tipo RNasa III activa en las células, denominada Dicer, que libera los siRNA de 21 a 23 pb. El siRNA, de una manera guiada por la homología, forma un complejo de una amalgama de proteína y RNA denominada RISC (complejo silenciador inducido por RNA) en presencia de mRNA para provocar la degradación, lo que da lugar a la atenuación de la expresión de este mRNA (Agrawal et al., 2003).

Las estrategias actuales para estudiar la función de los genes, tal como los ratones genosuprimidos y los negativos dominantes, a menudo son ineficaces, y generalmente caros, y necesitan mucho tiempo. La interferencia por RNA está resultando ser un método de elección para el análisis de un gran número de genes de una manera rápida y relativamente barata. Aunque la transfección de los siRNA sintéticos es un método eficaz, los efectos son a menudo transitorios en el mejor de los casos (Hannon G. J, 2002). El suministro de plásmidos que expresan RNA ahorquillados cortos mediante la transfección estable ha resultado satisfactoria al permitir el análisis mediante interferencia por RNA en los estudios a largo plazo (Brummelkamp et al., 2002; Elbashir et al., 2001).

I - Determinación de los efectos de disminución sobre la proliferación de líneas celular de cáncer ovárico

A fin de determinar qué genes específicos del cáncer ovárico participan en la proliferación de células de cáncer ovárico, se desarrolló un ensayo usando líneas celulares transfectadas de forma estable que contienen niveles atenuados (es decir, reducidos) del gen específico que se está investigando. Se utilizaron dos líneas celulares de cáncer ovárico humano, derivadas de pacientes no sometidos previamente a quimioterapia, que se habían caracterizado previamente en términos de su morfología, tumorigenicidad, y perfiles de expresión global. Además, estos análisis revelaron que estas líneas celulares fueron modelos excelentes para el comportamiento in vivo de tumores ováricos en seres humanos (Provencher et al., 2000 y Samouelian et al., 2004). Estas líneas celulares se denominaron TOV-21 G y TOV-112D.

El diseño y subclonación de los casetes de expresión de shRNA individuales, y el procedimiento utilizado para la caracterización de cada secuencia nucleotídica se describe más abajo. La selección de los polinucleótidos se escogió basándose en su aumento en tumores ováricos y la naturaleza selectiva de su expresión en estos tumores en comparación con otros tejidos como se describe anteriormente. El diseño de las secuencias de shRNA se realizó usando software a base de web que está libremente disponible para los expertos en la técnica (por ejemplo Qiagen). Estas secuencias escogidas, habitualmente 19-meros, se incluyeron en dos oligonucleótidos complementarios que forman el molde para los shRNAs, es decir, la secuencia sentido de 19 nt, una región enlazadora de 9-nt (bucle), la secuencia antisentido de 19-nt, seguido de un tramo de 5-6 poly-T para la terminación de la RNA polimerasa III. Se insertaron sitios de restricción apropiados en los extremos de estos oligonucleótidos para facilitar la colocación apropiada de los insertos, de manera que el punto de partida transcripcional esté en una localización precisa en dirección 3’ del promotor hU6. El plásmido utilizado en todos los estudios de interferencia de RNA, pSilencer 2.0 (SEQ. ID. NO. 101), se adquirió de un proveedor comercial (Ambion, Austin, TX). Para cada secuencia seleccionada, se construyeron al menos dos vectores de expresión de shRNA diferentes, para incrementar la oportunidad de observar la interferencia de RNA.

Se sembraron células TOV-21G o TOV-112D en placas de 6 pocillos en OSE (Samouelian et al., 2004) que contiene 10% de suero fetal bovino a una densidad de 600000 células/pocillo, se dejaron cultivar toda la noche, y se transfectaron con 1 #g de plásmido pSil-shRNA (Figura 53, sh-1 y sh-2) usando el reactivo Fugene 6 (Roche, Laval,

QC). Después de 16 h de incubación, se añadió medio reciente que contiene 2 #g/ml de puromicina (Sigma, St. Louis, Mo), para seleccionar transfectantes estables. Las células del control se transfectaron con un pSil de control (sh-scr (SEQ. ID. NO. 102)) que contiene una secuencia de shRNA revuelta que presenta homología con un gen humano no conocido. Después de aproximadamente 4-5 días, los conjuntos y/o los clones individuales de células se aislaron y se expandieron para análisis adicionales. La eficacia de la atenuación se verificó en todas las líneas celulares de shRNA. Se preparó RNA total por métodos estándar usando el reactivo Trizol™ a partir de células que crecieron en placas de 6 pocillos, y se determinó la expresión del gen diana mediante RT-PCR usando cebadores específicos del gen. Se generó cDNA de primera hebra usando Thermoscript (Invitrogen, Burlington, ON), y se llevó a cabo PCR semi-cuantitativa mediante métodos estándar (Qiagen, Mississauga, ON). Se asignaron niveles de expresión del 100% para un gen dado a aquellos encontrados en las líneas celulares transfectadas con el plásmido pSil de control (sh-scr). La Figura 52 muestra resultados representativos de la atenuación de dos genes candidatos, SEQ. ID. NO. 1 y SEQ. ID. NO. 3. Cuando se llevó a cabo la RT-PCR usando RNA total procedente de las líneas celulares de control (Figura 52, pSil-scr), se observó una única banda de tamaño esperado. Cuando el RNA total procedente de la línea celular que contiene los shRNAs para SEQ. ID. NO. 1 (0094) (sh-1: SEQ. ID. NO. 103 y sh-2: SEQ. ID. NO. 104) o SEQ. ID. NO. 3 (0671) (sh-1: SEQ. ID. NO. 107 y sh-2: SEQ. ID. NO. 108) se amplificó en condiciones idénticas, se observó una reducción significativa en los niveles de expresión de estos genes. Estos resultados indican que los shRNAs que se expresaron en los transfectantes estables de TOV-21 G tuvieron éxito a la hora de atenuar la expresión de sus genes diana. Como control para cantidades iguales de RNA en todas las reacciones, se monitorizó la expresión de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Figura 52, GAPDH), y se encontró que estaba expresada en niveles iguales en todas las muestras usadas.

La capacidad proliferativa de cada línea celular que expresa shRNA se determinó y comparó con células que expresan el shRNA mezclado (control). El número de células se determinó espectrofotométricamente mediante ensayo de MTT a 570 nm (Mosmann, 1983). Tras la selección de grupos que expresan de forma estable shRNA, y la expansión de las líneas, se colocaron 5000 células/pocillo de cada una de las líneas celulares en placas de 48 pocillos por triplicado y se incubaron durante 4 días en condiciones de crecimiento estándar. Se presentan datos representativos de 2 experimentos ± SEM, y los experimentos se repitieron típicamente al menos tres veces para confirmar los resultados observados. La Figura 53 muestra resultados representativos que se obtuvieron cuando se aplicó el ensayo de proliferación a líneas celulares TOV-21 G estables. El número de células después de 4 días en la línea celular de control que expresa el shRNA mezclado (Figura 53, sh scr) se ajustó arbitrariamente a 100%. Las líneas celulares TOV-21G que contienen shRNA contra SEQ. ID. NO. 1 (sh-1: SEQ. ID. NO. 103 y sh-2: SEQ. ID. NO. 104), SEQ. ID. NO. 3 (sh-1: SEQ. ID. NO. 107 y sh-2: SEQ. ID. NO. 108) y SEQ. ID. NO. 8 (0065) (sh-1: SEQ. ID. NO. 117 y sh-2: SEQ. ID. NO. 118) mostraron una proliferación menor del 50% para al menos un shRNA en comparación con la línea celular de control (Figura 53, sh-1 y sh-2 para cada uno). La proliferación de las líneas celulares TOV-21G que contienen shRNA contra SEQ. ID. NO. 2 (0478) (sh-1: SEQ. ID. NO. 105 y sh-2: SEQ. ID. NO. 106) y SEQ. ID. NO. 7 (1096) (sh-1: SEQ. ID. NO. 115 y sh-2: SEQ. ID. NO. 116) no se vio afectada en el mismo grado, pero no obstante todavía se observó inhibición significativa del crecimiento. Los resultados indican que la atenuación de estos genes provoca retraso en el desarrollo de esta línea celular de cáncer ovárico. Varios de estos vectores de expresión de shRNA también se transfectaron en la línea celular de TOV-112D, y se obtuvieron resultados similares (datos no mostrados). Esto sugiere que estos genes son importantes para la proliferación de células de cáncer ovárico.

El gen que codifica el receptor 1 de folato, SEQ. ID. NO. 50 (0967A) (Figura 53, 0967A), que se ha documentado que es un marcador importante para cáncer ovárico (Leamon y Low, 2001), también se atenuó en las células TOV21G, y se observó inhibición notable del crecimiento en presencia de los shRNAs (sh-1: SEQ. ID. NO. 151 y sh-2: SEQ. ID. NO. 152). Esto da credibilidad al enfoque usado para validar los genes presentados en esta patente, y sustancia su importancia funcional en la proliferación de células de cáncer ovárico.

La Tabla 1 a continuación enumera todos los genes ensayados y la inhibición media del crecimiento (n = 3-4) que se observó en células TOV-21G. Las diferencias de menos de 20% (véase Tabla 1, <20), en comparación con las líneas celulares de control, representan células en las que se midió una reducción estadísticamente significativa en la proliferación dentro de un intervalo de 5-20%.

Tabla 1 – Lista de genes ensayados en ensayo de proliferación celular y resultados

Gen SEQ ID nº

Código Génico de Alethia shRNA SEQ ID nº Inhibición media del crecimiento en células TOV-21G (%) (n=3-4)

Control

SEQ ID NO. 102 0

SEQ ID NO. 1

0094 SEQ ID nºs 103 y 104 47,9

SEQ ID NO. 2

0478 SEQ ID nºs 105 y 106 41,7

SEQ ID NO. 3

0671 SEQ ID nºs 107 y 108 65,7

Gen SEQ ID nº

Código Génico de Alethia shRNA SEQ ID nº Inhibición media del crecimiento en células TOV-21G (%) (n=3-4)

SEQ ID NO. 4

0851 SEQ ID nºs 109 y 110 21,5

SEQ ID NO. 5

0713 SEQ ID nºs 111 y 112 42,3

SEQ ID NO. 6

1064 SEQ ID nºs 113 y 114 28,9

SEQ ID NO. 7

1096 SEQ ID nºs 115 y 116 25,8

SEQ ID NO. 8

0065 SEQ ID nºs 117 y 118 32,5

SEQ ID NO. 9

1313 SEQ ID nºs 119 y 120 50,5

SEQ ID NO. 10

0059 SEQ ID nºs 121 y 122 52,4

SEQ ID NO. 11

0239 SEQ ID nºs 123 y 124 22,8

SEQ ID NO. 12

0291 SEQ ID nºs 125 y 126 <20

SEQ ID NO. 13

0972 SEQ ID nºs 127 y 128 <20

SEQ ID NO. 14

0875 SEQ ID nºs 129 y 130 <20

SEQ ID NO. 15

0420 SEQ ID nºs 131 y 132 <20

SEQ ID NO. 16

0125 SEQ ID nºs 133 y 134 <20

SEQ ID NO. 17

0531 SEQ ID nºs 135 y 136 0

SEQ ID NO. 18

0967B SEQ ID nºs 137 y 138 0

SEQ ID NO. 19

0889 SEQ ID nºs 139 y 140 <20

SEQ ID NO. 20

0313 SEQ ID nºs 141 y 142 <20

SEQ ID NO. 21

1134 SEQ ID nºs 143 y 144 <20

SEQ ID NO. 22

0488 SEQ ID nºs 145 y 146 0

SEQ ID NO. 23

0216 SEQ ID nºs 147 y 148 <20

SEQ ID NO. 24

0447 SEQ ID nºs 149 y 150 0

SEQ ID NO. 50

0967A SEQ ID nºs 151 y 152 47,4

J – Un método para determinar el requisito de genes específicos en la supervivencia de células de cáncer ovárico

Como medio para complementar los datos de inhibición del crecimiento que se generaron con las líneas celulares TOV-21 G estables, se usó un ensayo de supervivencia de colonias para determinar el requisito de los genes 5 seleccionados en la supervivencia de las células cancerosas. El “ensayo de formación de colonias” o “ensayo clonogénico” es un ensayo clásico para evaluar el crecimiento celular después de tratamiento. El ensayo está ampliamente extendido en áreas de investigación oncológica, en las que se usa para ensayar el poder proliferante de las líneas celulares del cáncer tras la radiación y/o tratamiento con agentes contra el cáncer. Se esperó que los resultados obtenidos cuando se analizan los genes que fueron funcionalmente importantes en cáncer ovárico se

10 correlacionasen entre el estudio de inhibición del crecimiento y el ensayo de supervivencia de colonias.

Se sembraron células TOV-21 G en placas de 12 pocillos a una densidad de 50000 células/pocillo y se transfectaron 24 h después con 1 #g de vector pSil-shRNA, los mismos plásmidos usados en el ensayo previo. Al día siguiente, se aplicó medio reciente que contiene 2 #g/ml de puromicina, y se llevó a cabo la selección de las células durante 3 días. Las células se lavaron, y se añadió medio reciente sin puromicina y se continuó el crecimiento durante otros 5

15 días. Para visualizar las colonias restantes, las células se lavaron en PBS y se fijaron y tiñeron simultáneamente en 1% de violeta de cristal/10% de etanol en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después del amplio lavado en PBS, las placas secas se barrieron para análisis fotográfico.

Como se muestra en la Figura 37, y como se ejemplifica mediante SEQ. ID. NO. 1(0094), SEQ. ID. NO. 3 (0671), y SEQ. ID. NO. 9 (1313), la cantidad de colonias derivadas de TOV-21G que sobrevivieron se correlaciona con los

datos de inhibición del crecimiento. Por ejemplo, la inhibición del crecimiento en el ensayo de proliferación (Figura 53) y la muerte celular en el ensayo de colonias (Figura 54) fue mayor en células TOV-21G que contienen shRNA-2 en comparación con shRNA-1 para SEQ. ID. NO. 1 (0094) (0094-sh2 más fuerte que 0094-sh1) y SEQ. ID. NO. 3 (0671) (0671-sh2 más fuerte que 0671-sh1), mientras que, para SEQ. ID. NO. 9 (1313), 1313-sh1 fue más fuerte que

5 1313-sh2. Se observó una convergencia similar con varios otros genes que se analizaron usando estos dos ensayos (datos no mostrados). Por lo tanto, estos resultados implicaron que una manifestación fenotípica en ambos ensayos fue indicativa de genes importantes que son funcionalmente necesarios en células de cáncer ovárico, y sugieren que la inhibición de las proteínas que codifican podría servir como dianas importantes para desarrollar nuevos fármacos contra el cáncer.

10 K. Un método para ampliar el alcance de la intervención a otras indicaciones oncológicas

El experto en la técnica reconocerá que las secuencias descritas aquí tienen utilidades no sólo en cáncer ovárico, sino que estas aplicaciones también se pueden expandir a otras indicaciones oncológicas en las que se expresan los genes. Para abordar esto, se adaptó un método a base de PCR para determinar el patrón de expresión de todas las secuencias descritas anteriormente en líneas celulares cancerosas aisladas de nueve tipos de cáncer. Los tipos 15 de cáncer representados por las líneas celulares son leucemia, cáncer del sistema nervioso central, de colon, de pulmón, melanoma, ovárico, de próstata, y renal (véase la Tabla C). Estas muestras de RNA se obtuvieron del Developmental Therapeutics Program en el NCI/NIH. Usando las mismas muestras de RNA de RAMP que se amplificaron a partir de las muestras de RNA total obtenidas del NCI, se convirtieron 500 #g de RNA en cDNA monocatenario con Thermoscript RT (Invitrogen, Burlington, ON) como se describe por el fabricante. La reacción de 20 cDNA se diluyó de manera que se usó 1/200 de la reacción para cada experimento de PCR. Después de las reacciones de PCR de ensayo con cebadores específicos de genes diseñados contra cada una de las SEQ. ID NOs. a ensayar, se determinó el intervalo lineal de la reacción y se aplicó a todas las muestras, se llevó a cabo la PCR en placas de 96 pocillos usando Hot-Start Taq Polimerasa de Qiagen (Mississauga, ON) en un DNA Engine Tetrad de MJ Research. La mitad de la mezcla de reacción se cargó en un gel de 1,2% de agarosa/bromuro de etidio, y los

25 amplicones se visualizaron con luz UV. Para verificar que se usaron cantidades iguales de RNA en cada reacción, se monitorizó el nivel de RNA con la expresión de GAPDH.

Tabla C – Lista de líneas celulares cancerosas procedentes del panel NCI-60

Línea celular

Tipo de cáncer

K-562

leucemia

MOLT-4

leucemia

CCRF-CEM

leucemia

RPMI-8226

leucemia

HL-60(TB)

leucemia

SR

leucemia

SF-268

SNC

SF-295

SNC

SF-539

SNC

SNB-19

SNC

SNB-75

SNC

U251

SNC

BT-549

mama

HS 578T

mama

MCF7

mama

NCI/ADR-RES

mama

MDA-MB-231

mama

MDA-MB-435

mama

Línea celular

Tipo de cáncer

T-47D

mama

COLO 205

colon

HCC-2998

colon

HCT-116

colon

HCT-15

colon

HT29

colon

KM12

colon

SW-620

colon

A549/ATCC

pulmón no microcítico

EKVX

pulmón no microcítico

HOP-62

pulmón no microcítico

HOP-92

pulmón no microcítico

NCI-H322M

pulmón no microcítico

NCl-H226

pulmón no microcítico

NCI-H23

pulmón no microcítico

NCI-H460

pulmón no microcítico

NCI-H522

pulmón no microcítico

LOX IMVI

melanoma

M14

melanoma

MALME-3M

melanoma

SK-MEL-2

melanoma

SK-MEL-28

melanoma

SK-MEL-5

melanoma

UACC-257

melanoma

UACC-62

melanoma

IGROV-1

ovárico

OVCAR-3

ovárico

OVCAR-4

ovárico

OVCAR-5

ovárico

OVCAR-8

ovárico

SK-OV-3

ovárico

DU-145

próstata

PC-3

próstata

786-O

renal

Línea celular

Tipo de cáncer

A498

renal

ACHN

renal

CAKI-1

renal

RXF-393

renal

SN-12C

renal

TK-10

renal

UO-31

renal

El experto en la técnica reconocerá fácilmente que los ortólogos para todos los mamíferos se pueden identificar y verificar con técnicas bien establecidas en la técnica, y que esta descripción no se limita de ningún modo a un mamífero. El término “mamífero(s)” para los fines de esta descripción se refiere a cualquier animal clasificado como

5 mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales en cautividad, para deporte o de compañía, tales como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano.

La descripción de los papeles de las NSEQ en la proliferación de células de cáncer ovárico satisface una necesidad en la técnica para conocer mejor la enfermedad del cáncer ovárico, proporcionando nuevas composiciones que son

10 útiles para el diagnóstico, pronóstico, tratamiento, prevención y evaluación de terapias para cáncer ovárico y asimismo otros cánceres en los que dichos genes están expresados.

El campo de la manipulación genética, de la biología molecular y del desarrollo de dianas farmacéuticas ha avanzado considerablemente en las últimas dos décadas. Resultará fácilmente evidente para los expertos en la técnica que las funciones recién identificadas para las secuencias genéticas y las correspondientes secuencias de

15 proteínas permiten que las secuencias, variantes y derivados se utilicen directa o indirectamente en aplicaciones del mundo real para el desarrollo de herramientas de investigación, herramientas para diagnóstico, terapias y tratamientos para trastornos o estados patológicos en los que intervienen las secuencias genéticas.

TABLA 2 – Secuencias expresadas diferencialmente encontradas en cáncer ovárico maligno

Nº de secuencia nucleotídica

Nº de Unigene NCBI / Símbolo del gen / ID del gen Número de acceso Posiciones nucleotídicas del ORF / Nº de secuencia polipeptídica Función

SEQ ID NO. 1

Clon STAR pero que pertenece posiblemente al agrupamiento Hs. 555871 BX094904 NM_021955 para Hs.555871 149-373 desconocidos para Hs.555871 que codifica SEQ ID NO. 51 proteína de unión a nucleótido guanina de locus transcrito (proteína G), polipéptido 1 de actividad transductora gamma

SEQ ID NO. 2

Hs.389724/ IFI44L / 10964 NM_006820 242-1483 que codifica SEQ ID NO. 52 proteína de tipo 44 inducida por interferón; función desconocida

SEQ ID NO. 3

Hs.83465 / HOXD1 / 3231 NM_024501 224-1210 que codifica SEQ ID NO. 53 homeocaja D1; factor transcripción, específico de la secuencia, que está implicado en la diferenciación y desarrollo de extremidades

SEQ ID NO. 4

Hs.59761 / LOC92196 / 92196 NM_0010179 20 45-368 que codifica SEQ ID NO. 54 proteína hipotética LOC92196; función desconocida

Nº de secuencia nucleotídica

Nº de Unigene NCBI / Símbolo del gen / ID del gen Número de acceso Posiciones nucleotídicas del ORF / Nº de secuencia polipeptídica Función

SEQ ID NO. 5

Hs.20315 / IFITI / 3434 NM 0010018 87 93-1529 que codifica SEQ ID NO. 55 proteína inducida por interferón con repeticiones I de tetratricopéptido; función desconocida

SEQ ID NO. 6

Hs.584238 / GLDC / 2731 NM_000170 151-3213 que codifica SEQ ID NO. 56 glicina deshidrogenasa (decarboxilante; glicina decarboxilasa, proteína P del sistema de escisión de glicina); el sistema de escisión de glicina mitocondrial cataliza la degradación de glicina

SEQ ID NO. 7

Hs.302028 / DPEP3 / 64180 NM_022357 9-1550 que codifica SEQ ID NO. 57 dipeptidasa 3; proteolisis y peptidolisis

SEQ ID NO. 8

Hs.418367 / NMU / 10874 NM_006681 106-630 que codifica SEQ ID NO. 58 neuromedina U (NMU); ruta de señalización neuropeptídica, regulación de la contracción del músculo liso

SEQ ID NO. 9

Hs.473163 / BMP7 / 655 NM_001719 123-1418 que codifica SEQ ID NO. 59 proteína 7 morfogenética ósea; crecimiento celular y/o mantenimiento, crecimiento, desarrollo esquelético, actividad de citosina, actividad de factor de crecimiento

SEQ ID NO. 10

Hs.84113 / CDKN3 / 1033 NM_005192 62-700 que codifica SEQ ID NO. 60 inhibidor 3 de cinasa dependiente de ciclina; un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina, así como también desfosforila CDK2 cinasa que evita la activación de CDK2 cinasa

SEQ ID NO. 11

Hs.374378 / CKS1B / 1163 NM_001826 10-249 que codifica SEQ ID NO. 61 subunidad 1B reguladora de proteína cinasa CDC28; ciclo celular, citocinesis, actividad de proteína cinasa dependiente de ciclina

SEQ ID NO. 12

Hs.30743 / PRAME / 23532 NM_006115 250-1779 que codifica SEQ ID NO. 62 antígeno expresado preferentemente en melanoma; función desconocida

SEQ ID NO. 13

Hs.458485 /ISG15 / 9636 NM_005101 76-573 que codifica SEQ ID NO. 63 modificador de tipo ubiquitina ISG15; unión a proteína

Nº de secuencia nucleotídica

Nº de Unigene NCBI / Símbolo del gen / ID del gen Número de acceso Posiciones nucleotídicas del ORF / Nº de secuencia polipeptídica Función

SEQ ID NO. 14

Clon STAR A1922121.1 Nuevo resultado genómico

SEQ ID NO. 15

Hs.292451 / FLJ33790 / 283212 NM_0010395 48 220-1311 que codifica SEQ ID NO. 64 proteína hipotética LOC283212 ; función desconocida

SEQ ID NO. 16

Hs.334302 BG213598 locus transcrito; función desconocida

SEQ ID NO. 17

Hs.546434 / VTCN1 / 79679 NM_024626 71-919 que codifica SEQ ID NO. 65 inhibidor I de activación de células T que contiene dominio del conjunto V; función desconocida

SEQ ID NO. 18

Hs.73625 / KIF20A / 10112 NM_005733 28-2700 que codifica SEQ ID NO. 66 miembro 20A de la familia de quinesina; familia de quinesina, interacciona con formas de RAB6A y RAB6B unidas a guanosina trifosfato (GTP)

SEQ ID NO. 19

Clon STAR pero posiblemente perteneciente al agrupamiento Hs.478368 según NCBI AC117457 NM_005832 for Hs. 478368 300-1007 que codifica SEQ ID NO. 67 Nuevo resultado genómico canal activado por calcio de gran conductancia de potasio, subfamilia M, miembro beta 2 para Hs.478368

SEQ ID NO. 20

Hs.603908 BU595315 locus transcrito; función desconocida

SEQ ID NO. 21

Hs.632586 / CXCL10 / 3627 NM_001565 67-363 que codifica SEQ ID NO. 68 ligando 10 de quimiocina (motivo C-X-C); quimiocina

SEQ ID NO. 22

Clon STAR AL583809 Nuevo resultado genómico

SEQ ID NO. 23

Hs.503368 / ALG8 / 79053 NM_0010070 27 66-1469 que codifica SEQ ID NO. 69 homólogo de glucosilación 8 enlazado a asparagina (S. cerevisiae, alfa-1,3glucosiltransferasa); cataliza la adición del segundo resto de glucosa al precursor de oligosacárido enlazado a lípidos para glucosilación de proteínas enlazada a N

SEQ ID NO. 24

Hs.591801 / KAAGI NM_181337 738-992 que codifica SEQ ID NO. 70 antígeno I asociado a riñón; función desconocida

SEQ ID NO. 25

Hs.512599 / CDKN2A / 1029 NM_000077 213-683 que codifica SEQ ID NO. 71 inhibidor 2A de cinasa dependiente de ciclina; control G I del ciclo celular

Nº de secuencia nucleotídica

Nº de Unigene NCBI / Símbolo del gen / ID del gen Número de acceso Posiciones nucleotídicas del ORF / Nº de secuencia polipeptídica Función

SEQ ID NO. 26

Hs.244580 / TPX2 / 22974 NM_012112 699-2942 que codifica SEQ ID NO. 72 TPX2, asociada a microtúbulos, homólogo (Xenopus laevis); implicado en la proliferación celular

SEQ ID NO. 27

Hs.93002 / UBE2C / 11065 NM_007019 81-620 que codifica SEQ ID NO. 73 enzima E2C que se conjuga a ubiquitina; necesaria para la destrucción de ciclinas mitóticas y para la progresión del ciclo celular

SEQ ID NO. 28

Hs.590469 AK092857 cDNA FLJ35538 fis, clon SPLEN2002463; función desconocida

SEQ ID NO. 29

Hs.405662 / CRABP2 / 1382 NM_001878 138-554 que codifica SEQ ID NO. 74 proteína 2 de unión a ácido retinoico celular; función desconocida, pero puede estar implicada en el crecimiento y diferenciación de la piel humana

SEQ ID NO. 30

Hs.26331 / HIST3H2A / 92815 NM_033445 43-435 que codifica SEQ ID NO. 75 histona 3, H2a ; formación de nucleosoma

SEQ ID NO. 31

Hs.591790 / HIST1H4H / 8365 NM_003543 1-312 que codifica SEQ ID NO. 76 histona 1, H4h ; formación de nucleosoma

SEQ ID NO. 32

Hs.93574 / HOXD3 / 3232 NM_006898 177-1475 que codifica SEQ ID NO. 77 homeocaja D3; puede desempeñar un papel en la regulación de procesos de adhesión celular

SEQ ID NO. 33

Hs.525641 /IGHG1 / 3500 BC092518 61-1470 que codifica SEQ ID NO. 78 Inmunoglobulina pesada constante gamma 1; puede desempeñar un papel en la respuesta inmunitaria y unión a antígeno

SEQ ID NO. 34

Hs.592988 / IGKC / 3514 BC073793 10-717 que codifica SEQ ID NO. 79 Inmunoglobulina kappa constante; puede desempeñar un papel en la respuesta inmunitaria y unión a antígeno

SEQ ID NO. 35

Hs.66762 AY683003 55-2727 que codifica SEQ ID NO. 80 ORF 38 del cromosoma 10; función desconocida

SEQ ID NO. 36

Hs.373741 / SPP / 81502 NM_178580 1115-1299 que codifica SEQ ID NO. 81 Histocompatibilidad (menor) 13; función desconocida

Nº de secuencia nucleotídica

Nº de Unigene NCBI / Símbolo del gen / ID del gen Número de acceso Posiciones nucleotídicas del ORF / Nº de secuencia polipeptídica Función

SEQ ID NO. 37

Clon STAR AL157931 Nuevo resultado genómico

SEQ ID NO. 38

Hs. 128453 / FRZB / 2487 NM_001463 219-1196 que codifica SEQ ID NO. 82 proteína relacionada con Frizzled; ruta de señalización del receptor Wnt, desarrollo, esquelético, actividad de receptor transmembránico

SEQ ID NO. 39

Hs.239 / FOXM1 / 2305 NM_202003 266-2512 que codifica SEQ ID NO. 83 caja de cabeza de tenedor MI; regulación transcripcional

SEQ ID NO. 40

Hs.46627 NM_152864 89-715 que codifica SEQ ID NO. 84 ORF 58 del cromosoma 20; función desconocida

SEQ ID NO. 41

Clon STAR AK092936 Nuevo resultado genómico

SEQ ID NO. 42

Gen ID 404550 BC009078 552-746 que codifica SEQ ID NO. 85 ORF 74 de cromosoma 16; función desconocida

SEQ ID NO. 43

Hs.645513 / RACGAPI / 29127 NM_013277 225-2123 que codifica SEQ ID NO. 86 proteína 1 activante de Rac GTPasa; transporte de electrones, cascada de señalización intracelular; unión de ion hierro

SEQ ID NO. 44

Hs.645522 / TMEM19 / 55266 NM_018279 584-1594 que codifica SEQ ID NO. 87 proteína transmembránica 19; función desconocida

SEQ ID NO. 45

Clon STAR AC109350 Nuevo resultado genómico

SEQ ID NO. 46

Clon STAR AC104837 Nuevo resultado genómico

SEQ ID NO. 47

Clon STAR AC002060 Grupo @ variable de inmunoglobulina lambda; puede desempeñar un papel en la unión a antígeno

SEQ ID NO. 48

Hs.200600 / SCAMP3 / 10067 NM_005698 254-1297 que codifica SEQ ID NO. 88 proteína 3 de membrana portadora secretora; transporte post-Golgi, transporte de proteína

SEQ ID NO. 49

Clon STAR AC068288

SEQ ID NO. 50

Hs.73769 / FOLR1 / 2348 NM_000802 26-799 que codifica SEQ ID NO. 89 receptor I de folato (adulto); media el suministro de 5metiltetrahidrofolato al interior de las células

Nº de secuencia nucleotídica

Nº de Unigene NCBI / Símbolo del gen / ID del gen Número de acceso Posiciones nucleotídicas del ORF / Nº de secuencia polipeptídica Función

SEQ ID NO. 169

Hs.558314 / CP / 1356 NM_000096 251-3448 que codifica SEQ ID NO. 170 ceruloplasmina; proteína segregada; unión o transporte de ion cobre

TABLA 3 -List de identificación de secuencias adicionales de plásmidos, oligonucleótidos y oligonucleótidos de shRNA

Identificación de secuencia

Nombre Descripción

SEQ ID NO. 90

OGS 364 Oligo dT11 +Not 1+biotina

SEQ ID NO. 91

OGS 594 Etiqueta 1 de promotor oligonucleotídico

SEQ ID NO. 92

OGS 595 Etiqueta 1 de promotor oligonucleotídico

SEQ ID NO. 93

OGS 458 Etiqueta 2 de promotor oligonucleotídico

SEQ ID NO. 94

OGS 459 Etiqueta 2 de promotor oligonucleotídico

SEQ ID NO. 95

OGS 494 Cebador para síntesis de segunda hebra a partir de etiqueta 1

SEQ ID NO. 96

OGS 302 Cebador para síntesis de segunda hebra a partir de etiqueta 2

SEQ ID NO. 97

OGS 621 Promotor oligonucleotídico

SEQ ID NO. 98

OGS 622 Promotor oligonucleotídico

SEQ ID NO. 99

pCATRMAN Vector para STAR

SEQ ID NO. 100

p20 Vector para STAR

SEQ ID NO. 101

Vector pSilencer2.0 Vector para shRNA

SEQ ID NO. 102

sh-scr shRNA de control (Ambion)

SEQ ID NO. 103

sh-1 0094 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 1

SEQ ID NO. 104

sh-2 0094 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 1

SEQ ID NO. 105

sh-1 0478 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 2

SEQ ID NO. 106

sh-2 0478 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 2

SEQ ID NO. 107

sh-1 0671 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 3

SEQ ID NO. 108

sh-2 0671 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 3

SEQ ID NO. 109

sh-1 0851 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 4

SEQ ID NO. 110

sh-2 0851 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 4

SEQ ID NO. 111

sh-1 0713 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 5

SEQ ID NO. 112

sh-2 0713 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 5

SEQ ID NO. 113

sh-1 1064 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 5

Identificación de secuencia

Nombre Descripción

SEQ ID NO. 114

sh-2 1064 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 6

SEQ ID NO. 115

sh-1 1096 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 7

SEQ ID NO. 116

sh-2 1096 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 7

SEQ ID NO. 117

sh-1 0065 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 8

SEQ ID NO. 118

sh-2 0065 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 8

SEQ ID NO. 119

sh-1 1313 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 9

SEQ ID NO. 120

sh-2 1313 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 9

SEQ ID NO. 121

sh-1 0059 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 10

SEQ ID NO. 122

sh-2 0059 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 10

SEQ ID NO. 123

sh-1 0239 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 11

SEQ ID NO. 124

sh-2 0239 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 11

SEQ ID NO. 125

sh-1 0291 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 12

SEQ ID NO. 126

sh-2 0291 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 12

SEQ ID NO. 127

sh-1 0972 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 13

SEQ ID NO. 128

sh-2 0972 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 13

SEQ ID NO. 129

sh-1 0875 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 14

SEQ ID NO. 130

sh-2 0875 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 14

SEQ ID NO. 131

sh-1 0420 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 15

SEQ ID NO. 132

sh-2 0420 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 15

SEQ ID NO. 133

sh-1 0125 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 16

SEQ ID NO. 134

sh-2 0125 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 16

SEQ ID NO. 135

sh-1 0531 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 17

SEQ ID NO. 136

sh-2 0531 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 17

SEQ ID NO. 137

sh-1 0967B secuencia shRNA para SEQ ID NO. 18

SEQ ID NO. 138

sh-2 0967B secuencia shRNA para SEQ ID NO. 18

SEQ ID NO. 139

sh-1 0889 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 19

SEQ ID NO. 140

sh-2 0889 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 19

SEQ ID NO. 141

sh-1 0313 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 20

SEQ ID NO. 142

sh-20313 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 20

SEQ ID NO. 143

sh-1 1134 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 21

SEQ ID NO. 144

sh-2 1134 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 21

SEQ ID NO. 145

sh-1 0488 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 22

SEQ ID NO. 146

sh-2 0488 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 22

SEQ ID NO. 147

sh-1 0216 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 23

Identificación de secuencia

Nombre Descripción

SEQ ID NO. 148

sh-2 0216 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 23

SEQ ID NO. 149

sh-1 0447 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 24

SEQ ID NO. 150

sh-2 0447 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 24

SEQ ID NO. 151

sh-1 0967 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 50

SEQ ID NO. 152

sh-2 0967 secuencia shRNA para SEQ ID NO. 50

SEQ ID NO. 153

OGS 1077 Cebador directo para SEQ ID NO. 32

SEQ ID NO. 154

OGS 1078 Cebador inverso para SEQ ID NO. 32

SEQ ID NO. 155

OGS 1141 Cebador directo para SEQ ID NO. 35

SEQ ID NO. 156

OGS 1142 Cebador inverso para SEQ ID NO. 35

SEQ ID NO. 157

OGS 1202 Cebador directo para SEQ ID NO. 38

SEQ ID NO. 158

OGS 1203 Cebador inverso para SEQ ID NO. 38

SEQ ID NO. 159

OGS 1212 Cebador directo para SEQ ID NO. 41

SEQ ID NO. 160

OGS 1213 Cebador inverso para SEQ ID NO. 41

SEQ ID NO. 161

OGS 1171 Cebador directo para SEQ ID NO. 44

SEQ ID NO. 162

OGS 1172 Cebador inverso para SEQ ID NO. 44

SEQ ID NO. 163

OGS 1175 Cebador directo para SEQ ID NO. 45

SEQ ID NO. 164

OGS 1176 Cebador inverso para SEQ ID NO. 45

SEQ ID NO. 165

OGS 1282 Cebador directo para SEQ ID NO. 48

SEQ ID NO. 166

OGS 1283 Cebador inverso para SEQ ID NO. 48

SEQ ID NO. 167

OGS 315 Cebador directo para GAPDH humana

SEQ ID NO. 168

OGS 316 Cebador inverso para GAPDH humana

SEQ ID NO. 171

OGS 1136 Cebador directo para SEQ ID NO. 1

SEQ ID NO. 172

OGS 1044 Cebador inverso para SEQ ID NO. 1

SEQ ID NO. 173

OGS 1250 Cebador directo para SEQ ID NO. 2

SEQ ID NO. 174

OGS 1251 Cebador inverso para SEQ ID NO. 2

SEQ ID NO. 175

OGS 1049 Cebador directo para SEQ ID NO. 3

SEQ ID NO. 176

OGS 1050 Cebador inverso para SEQ ID NO. 3

SEQ ID NO. 177

OGS 1051 Cebador directo para SEQ ID NO. 4

SEQ ID NO. 178

OGS 1052 Cebador inverso para SEQ ID NO. 4

SEQ ID NO. 179

OGS 1252 Cebador directo para SEQ ID NO. 5

SEQ ID NO. 180

OGS 1253 Cebador inverso para SEQ ID NO. 5

SEQ ID NO. 181

OGS 1.083 Cebador directo para SEQ ID NO. 6

SEQ ID NO. 182

OGS 1084 Cebador inverso para SEQ ID NO. 6

SEQ ID NO. 183

OGS 1053 Cebador directo para SEQ ID NO. 7

Identificación de secuencia

Nombre Descripción

SEQ ID NO. 184

OGS 1054 Cebador inverso para SEQ ID NO. 7

SEQ ID NO. 185

OGS 1037 Cebador directo para SEQ ID NO. 8

SEQ ID NO. 186

OGS 1038 Cebador inverso para SEQ ID NO. 8

SEQ ID NO. 187

OGS 1045 Cebador directo para SEQ ID NO. 9

SEQ ID NO. 188

OGS 1046 Cebador inverso para SEQ ID NO. 9

SEQ ID NO. 189

OGS 1240 Cebador directo para SEQ ID NO. 10

SEQ ID NO. 190

OGS 1241 Cebador inverso para SEQ ID NO. 10

SEQ ID NO. 191

OGS 1304 Cebador directo para SEQ ID NO. 11

SEQ ID NO. 192

OGS 1305 Cebador inverso para SEQ ID NO. 11

SEQ ID NO. 193

OGS 1039 Cebador directo para SEQ ID NO. 12

SEQ ID NO. 194

OGS 1040 Cebador inverso para SEQ ID NO. 12

SEQ ID NO. 195

OGS 1095 Cebador directo para SEQ ID NO. 13

SEQ ID NO. 196

OGS 1096 Cebador inverso para SEQ ID NO. 13

SEQ ID NO. 197

OGS 1284 Cebador directo para SEQ ID NO. 15

SEQ ID NO. 198

OGS 1285 Cebador inverso para SEQ ID NO. 15

SEQ ID NO. 199

OGS 1063 Cebador directo para SEQ ID NO. 16

SEQ ID NO. 200

OGS 1064 Cebador inverso para SEQ ID NO. 16

SEQ ID NO. 201

OGS 1031 Cebador directo para SEQ ID NO. 17

SEQ ID NO. 202

OGS 1032 Cebador inverso para SEQ ID NO. 17

SEQ ID NO. 203

OGS 1308 Cebador directo para SEQ ID NO. 18

SEQ ID NO. 204

OGS 1309 Cebador inverso para SEQ ID NO. 18

SEQ ID NO. 205

OGS 1069 Cebador directo para SEQ ID NO. 19

SEQ ID NO. 206

OGS 1070 Cebador inverso para SEQ ID NO. 19

SEQ ID NO. 207

OGS 1061 Cebador directo para SEQ ID NO. 20

SEQ ID NO. 208

OGS 1062 Cebador inverso para SEQ ID NO. 20

SEQ ID NO. 209

OGS 1097 Cebador directo para SEQ ID NO. 21

SEQ ID NO. 210

OGS 1098 Cebador inverso para SEQ ID NO. 21

SEQ ID NO. 211

OGS 1075 Cebador directo para SEQ ID NO. 22

SEQ ID NO. 212

OGS 1076 Cebador inverso para SEQ ID NO. 22

SEQ ID NO. 213

OGS 1232 Cebador directo para SEQ ID NO. 23

SEQ ID NO. 214

OGS 1233 Cebador inverso para SEQ ID NO. 23

SEQ ID NO. 215

OGS 1067 Cebador directo para SEQ ID NO. 24

SEQ ID NO. 216

OGS 1068 Cebador inverso para SEQ ID NO. 24

SEQ ID NO. 217

OGS 1099 Cebador directo para SEQ ID NO. 25

Identificación de secuencia

Nombre Descripción

SEQ ID NO. 218

OGS 1100 Cebador inverso para SEQ ID NO. 25

SEQ ID NO. 219

OGS 1246 Cebador directo para SEQ ID NO. 26

SEQ ID NO. 220

OGS 1247 Cebador inverso para SEQ ID NO. 26

SEQ ID NO. 221

OGS 1093 Cebador directo para SEQ ID NO. 27

SEQ ID NO. 222

OGS 1094 Cebador inverso para SEQ ID NO. 27

SEQ ID NO. 223

OGS 1332 Cebador directo para SEQ ID NO. 28

SEQ ID NO. 224

OGS 1333 Cebador inverso para SEQ ID NO. 28

SEQ ID NO. 225

OGS 1101 Cebador directo para SEQ ID NO. 29

SEQ ID NO. 226

OGS 1102 Cebador inverso para SEQ ID NO. 29

SEQ ID NO. 227

OGS 1300 Cebador directo para SEQ ID NO. 30

SEQ ID NO. 228

OGS 1301 Cebador inverso para SEQ ID NO. 30

SEQ ID NO. 229

OGS 1302 Cebador directo para SEQ ID NO. 31

SEQ ID NO. 230

OGS 1303 Cebador inverso para SEQ ID NO. 31

SEQ ID NO. 231

OGS 1292 Cebador directo para SEQ ID NO. 33

SEQ ID NO. 232

OGS 1294 Cebador inverso para SEQ ID NO. 33

SEQ ID NO. 233

OGS 1242 Cebador directo para SEQ ID NO. 34

SEQ ID NO. 234

OGS 1243 Cebador inverso para SEQ ID NO. 34

SEQ ID NO. 235

OGS 1280 Cebador directo para SEQ ID NO. 36

SEQ ID NO. 236

OGS 1281 Cebador inverso para SEQ ID NO. 36

SEQ ID NO. 237

OGS 1159 Cebador directo para SEQ ID NO. 37

SEQ ID NO. 238

OGS 1160 Cebador inverso para SEQ ID NO. 37

SEQ ID NO. 239

OGS 1310 Cebador directo para SEQ ID NO. 39

SEQ ID NO. 240

OGS 1311 Cebador inverso para SEQ ID NO. 39

SEQ ID NO. 241

OGS 1155 Cebador directo para SEQ ID NO. 40

SEQ ID NO. 242

OGS 1156 Cebador inverso para SEQ ID NO. 40

SEQ ID NO. 243

OGS 1316 Cebador directo para SEQ ID NO. 42

SEQ ID NO. 244

OGS 1317 Cebador inverso para SEQ ID NO. 42

SEQ ID NO. 245

OGS 1306 Cebador directo para SEQ ID NO. 43

SEQ ID NO. 246

OGS 1307 Cebador inverso para SEQ ID NO. 43

SEQ ID NO. 247

OGS 1286 Cebador directo para SEQ ID NO. 46

SEQ ID NO. 248

OGS 1287 Cebador inverso para SEQ ID NO. 46

SEQ ID NO. 249

OGS 1244 Cebador directo para SEQ ID NO. 47

SEQ ID NO. 250

OGS 1245 Cebador inverso para SEQ ID NO. 47

SEQ ID NO. 251

OGS 1035 Cebador directo para SEQ ID NO. 50

Identificación de secuencia

Nombre Descripción

SEQ ID NO. 252

OGS 1036 Cebador inverso para SEQ ID NO. 50

SEQ ID NO. 253

OGS 1248 Cebador directo para SEQ ID NO. 51

SEQ ID NO. 254

OGS 1249 Cebador inverso para SEQ ID NO. 51

TABLA 4 – Secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de la SEC ID NO.

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 51 Clon STAR

NM 021955:

SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 52

SEQ ID NO. 3 SEQ ID NO. 53

SEQ ID NO. 4 SEQ ID NO. 54 Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 5 SEQ ID NO. 55

SEQ ID NO. 6 SEQ ID NO. 56

SEQ ID NO. 7 SEQ ID NO. 57

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 8 SEQ ID NO. 58

SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 59

SEQ ID NO. 10 SEQ ID NO. 60

SEQ ID NO. 11 SEQ ID NO. 61

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 12 SEQ ID NO. 62

SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 63

SEQ ID NO. 14 Clon STAR

SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 64

SEQ ID NO. 16 Clon STAR

SEQ ID NO. 17 SEQ ID NO. 65

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 18 SEQ ID NO. 66

Clon STAR (SEQ ID NO. 19) SEQ ID NO. 67

NM_005832

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 20 Clon STAR

SEQ ID NO. 21 SEQ ID NO. 68

SEQ ID NO. 22 Clon STAR

SEQ ID NO. 23 SEQ ID NO. 69

SEQ ID NO. 24 SEQ ID NO. 70

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 25 SEQ ID NO. 71

SEQ ID NO. 26 SEQ ID NO. 72

SEQ ID NO. 27 SEQ ID NO. 73

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 28

SEQ ID NO. 29 SEQ ID NO. 74

SEQ ID NO. 30 SEQ ID NO. 75

SEQ ID NO. 31 SEQ ID NO. 76

SEQ ID NO. 32 SEQ ID NO. 77

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 33 SEQ ID NO. 78

SEQ ID NO. 34 SEQ ID NO. 79

SEQ ID NO. 35 SEQ ID NO. 80

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 36 SEQ ID NO. 81

SEQ ID NO. 37 Clon STAR

SEQ ID NO. 38 SEQ ID NO. 82

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 39 SEQ ID NO. 83

SEQ ID NO. 40 SEQ ID NO. 84

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 41 Clon STAR

SEQ ID NO. 42 SEQ ID NO. 85

SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 86

SEQ ID NO. 44 SEQ ID NO. 87

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 45

SEQ ID NO. 46 Clon STAR

SEQ ID NO. 47 Clon STAR

SEQ ID NO. 48 SEQ ID NO. 88

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 90 biotin-actgtactAACCCTGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV SEQ ID NO. 91

GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACGAAGACAGTAGACAGG SEQ ID NO. 92 CGCGCCTGTCTACTGTCTTCGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAATTC SEQ ID NO. 93

GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCCTGCACCAACAGTTAACAGG

SEQ ID NO. 94 CGCGCCTGTTAACTGTTGGTGCAGGCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAATTC SEQ ID NO. 95

GGGAGACGAAGACAGTAGA

SEQ ID NO. 96 GCCTGCACCAACAGTTAACA SEQ ID NO. 97

GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGA

SEQ ID NO. 98 CGCGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAATTC SEQ ID NO. 99

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 100

SEQ ID NO. 101

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 102

Información de secuencia no descrita por Ambion SEQ ID NO. 103 GTCAAGAAACCACACTTT A

SEQ ID NO. 104

GTGACATGGAACCCAGCGA SEQ ID NO. 105 ACCGTGGCTGCTCGATAAA

SEQ ID NO. 106

GCCAGAGAGCACAGAAATA SEQ ID NO. 107 GAGGAATGCCTCTAAGAAA

SEQ ID NO. 108 GGGAACGAGAAGGGCTTCT

SEQ ID NO. 109

AGCT GGAG G AAT GAGAATT SEQ ID NO. 110 AGGGCCAAAGCTTTCCATA

SEQ ID NO. 111

GGCAGGCTGTCCGCTTAAA SEQ ID NO. 112 GGTCCTTAGGCACCCAGAT

SEQ ID NO. 113

GCGGAGCCCAGGGAGAATA SEQ ID NO. 114 GCCCGGATTGATGACATAT

SEQ ID NO. 115

GTGGAGGCTGAGTTTCCAT SEQ ID NO. 116 GGATGTTAACCTGCGAAAT

SEQ ID NO. 117

GGTCAGCAGGGTTCATTTA SEQ ID NO. 118 GCCTCAGGAACAAGATGAA

SEQ ID NO. 119

GCGCGAGATCCTCTCCATT SEQ ID NO. 120 GCGCCAGAGGAGCGGGAAG

SEQ ID NO. 121

GCCG CCCAGTT CAAT ACAA SEQ ID NO. 122 GAGCTTACAACCTGCCTTA

SEQ ID NO. 123

GGCGCCCACTACCCAAGAA SEQ ID NO. 124 GAGTCAGGGATGGGTCCAT

SEQ ID NO. 125

GGGCCAGTCTGTACTCATT SEQ ID NO. 126 GGGAATTCCATCTCCATAT

SEQ ID NO. 127

GGCGCAGATCACCCAGAAG SEQ ID NO. 128 GAGCATCCTGGTGAGGAAT

SEQ ID NO. 129

GGTGCCACATGACTAGGAT SEQ ID NO. 130 GCTGCAGACGTGTATGCAT

SEQ ID NO. 131

GCGGAGGCACTGGGCTTAT SEQ ID NO. 132 GCCCGCTTACTTCCTGGAG

SEQ ID NO. 133

GCTCTGCTCAAGTTGGATA SEQ ID NO. 134 GCTGCTGCCTTGCAGTTTG

SEQ ID NO. 135

GCCCTTACCTGATGCTAAA SEQ ID NO. 136 GGCACCTACAAATGTTATA

SEQ ID NO. 137

GAGGCCTGGAAGCTCCTAA SEQ ID NO. 138 GCAGCTTCAGGAGGTTAAA

SEQ ID NO. 139

GCCGGACCTCTTCATCTTA SEQ ID NO. 140 GCGTCCATCACGGAAACAT

SEQ ID NO. 141

GTCATCAGGACGTCCATTA SEQ ID NO. 142 GACACGATCTACCCTCAAA

SEQ ID NO. 143

GGGCCATAGGGAAGCTTGA SEQ ID NO. 144 GCCCACGTGTTGAGATCAA

SEQ ID NO. 145

GCTCCCACT GATTCCACAT SEQ ID NO. 146 GCCAGAGAGTAAAAGGGAT

SEQ ID NO. 147

GGCATATGGAAGGAGCATT SEQ ID NO. 148 GTGGTTTGGTTCAGCAGTT

SEQ ID NO. 149

GGCCTCCAGCCACGTAATT SEQ ID NO. 150 GGCGCTGCTGCCGCTCATC

SEQ ID NO. 151

GGGCTGGAACTGGACTTCA SEQ ID NO. 152 GCCCATAAGGATGTTTCCT

SEQ ID NO. 153

GCGTCCGGGCCTGTCTTCAACCT SEQ ID NO. 154 GCCCCACCCTCTACCCCACCACTA

SEQ ID NO. 155

GAGATCCTGATCAAGGTGCAGG SEQ ID NO. 156 TG CACG CTCACAG CAG TCAG G

SEQ ID NO. 157

AACAT G ACT AAG ATGCCCAACC SEQ ID NO. 158 AATCTCCTTCACCTCCACTACTG

SEQ ID NO. 159

AAGCATAGCCATAGGTGATTGG SEQ ID NO. 160 ACAGGTATCAGACAAGGGAGCAG

SEQ ID NO. 161 TTACGACCTATTTCTCCGTGG

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 162

AATGCAATAATTGGCCACTGC SEQ ID NO. 163 ACACAT CAAACTGCTTAT CCAGG

SEQ ID NO. 164

ACT GAT GT GAAAAT GCACATCC SEQ ID NO. 165 ATGGCTCATACAGCACTCAGG

SEQ ID NO. 166

GAACTGTCACTCCGGAAAGCCT SEQ ID NO. 167 TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT

SEQ ID NO. 168 CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC SEQ ID NO. 169 SEQ ID NO. 170

SEQ ID NO. 171

GCTTAAAAGAGTCCTCCTGTGGC SEQ ID NO. 172 TGGACATTGTTCTTAAAGTGTGG

SEQ ID NO. 173

AGGTTTTATGGCCACCGTCAG SEQ ID NO. 174 ATCCTATACCGCTCGGTTATGC

SEQ ID NO. 175

GGGCGGCGGCTCTTTCCTCCTC SEQ ID NO. 176 GCTAGCGGCCCCATACTCG

SEQ ID NO. 177

ACACTGGAT GCCCTGAATGACACA SEQ ID NO. 178 GCTTTGGCCCTTTTTGCTAA

SEQ ID NO. 179

CCCACTTCTGTCTTACTGCATC SEQ ID NO. 180 CATAGTACTCCAGGGCTTATTC

SEQ ID NO. 181 AACGATTGCCCGGATTGATGACA

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 182

TACTTGAGGCTGGGGTGGGAGATG SEQ ID NO. 183 CACTACGCCAGGCACCCC CAAA

SEQ ID NO. 184

CGAGGCGCACGGCAGTCT SEQ ID NO. 185 ATCCGTTGCTGCAGCTCGTTCCTC

SEQ ID NO. 186

ACCCTGCT G ACCTTCTTCCATTCC SEQ ID NO. 187 TCGGAGGAGGGCTGGCTGGTGTTT

SEQ ID NO. 188

CTTGGGCGTCTTGGAGCGGTTCTG SEQ ID NO. 189 AGAGCCTATTGAAGATGAACAG

SEQ ID NO. 190

TGATTGCCCCGGATCCTCTTAGG SEQ ID NO. 191 GGACAAATACGACGACGAGG

SEQ ID NO. 192

GGTTTCTTGGGTAGTGGGC SEQ ID NO. 193 CCCCGGAGAAGGAAGAGCAGTA

SEQ ID NO. 194

CGAAAGCCGGCAGTTAGTTATTGA SEQ ID NO. 195 GGCGGGCAACGAATTCCAGGTGTC

SEQ ID NO. 196

TCAGAGGTTCGTCGCATTTGTCCA SEQ ID NO. 197 CAACAGTCATGATGTGTGGATG

SEQ ID NO. 198

ACTGCACCTTGTCCGTGTTGAC SEQ ID NO. 199 CCGGCTGGCTGCTTTGTTTA

SEQ ID NO. 200

ATGATCAGCAGGTTCGTTGGTAGG SEQ ID NO. 201 ATGCCGGAAGTGAATGTGG

SEQ ID NO. 202

GGTGACTCCGCCTTTTGAT SEQ ID NO. 203 ACATTCGCTTCTCCATCTGG

SEQ ID NO. 204

TGTCACGGAAGGGAACCAGG SEQ ID NO. 205 ACGCTGCCTCTGGGTCACTT

SEQ ID NO. 206

TTGGCAAATCAATGGCTTGTAAT SEQ ID NO. 207 ATGGCTTGGGTCATCAGGAC

SEQ ID NO. 208

GTGTCACTGGGCGTAAGATACTG SEQ ID NO. 209 CACCAAATCAGCTGCTACTACTCC

SEQ ID NO. 210

GATAAACCCCAAAGCAGAAAGATT SEQ ID NO. 211 CGAGATTCCGTGGGCGTAGG

SEQ ID NO. 212

TGAGTGGGAGCTTCGTAGG SEQ ID NO. 213 TCAGAGTGGACGTTGGATTAC

SEQ ID NO. 214

TGCTTGAAATGTAGGAGAACA SEQ ID NO. 215 GAGGGGCATCAATCACACCGAGAA

SEQ ID NO. 216

CCCCACCGCCCACCCATTTAGG SEQ ID NO. 217 GGGGGCACCAGAGGCAGTAA

SEQ ID NO. 218

GGTTGTGGCGGGGGCAGTTGTG SEQ ID NO. 219 ACAGACTCCTGTACTGCAAACC

SEQ ID NO. 220

TACCGGTTCGTCCTCTTCCTC SEQ ID NO. 221 GAAGTTCCTCACGCCCTGCTATC

SEQ ID NO. 222

CTGGCTGGTGACCTGCTTTGAGTA SEQ ID NO. 223 TAGGCGCGCCTGACATACAGCAATGCCAGTT

SEQ ID NO. 224 TAAGAATGCGGCCGCGCCACATCTTGAACACTTTGC

88 5

Secuencia nucleotídica (5’-3’) ORF

SEQ ID NO. 225

TGGGGAGGAGTTTGAGGAGCAGAC SEQ ID NO. 226 GTGGGACGGAGGGGGCAGTGAAG

SEQ ID NO. 227

GCAACTATTCGGAGCGCGTG SEQ ID NO. 228 CCAGCAGCTTGTTGAGCTCC

SEQ ID NO. 229

GGAGGAGCTAAGCGTCATCGC SEQ ID NO. 230 TCGCTTCAGCGCGTAGACC

SEQ ID NO. 231

TATTAGTTGGGATGGTGGTAGCAC SEQ ID NO. 232 GAGAATTCGAGTCGACGATGAC

SEQ ID NO. 234

AGGCACACAACAGAGGCAGTTC SEQ ID NO. 235 GTACATCAACCTCCTGCTGTCC

SEQ ID NO. 236

GACATCTCCAAGTCCCAGCATG SEQ ID NO. 237 AGTCTCTCACTGTGCCTTATGCC

SEQ ID NO. 238

AGTCCT AAGAACTGTAAACG SEQ ID NO. 239 CATCTATACGTGGATTGAGGA

SEQ ID NO. 240

ATAGGTACCAGGTATGAGCTG SEQ ID NO. 241 TGTCCACATCATCATCGTCATCC

SEQ ID NO. 242

TGTCACTGGTCGGTCGCTGAGG SEQ ID NO. 243 CATGGGGCTTAAGATGTC

SEQ ID NO. 244

GTCGATTTCTCCATCATCTG SEQ ID NO. 245 AAGAGGCGCTCTACTAGCCG

SEQ ID NO. 246

CTTTCCACATGGAACACAGG SEQ ID NO. 247 CATTTTCCTGGAATTTGATACAG

SEQ ID NO. 248

GTAGAGAGTTTATTTGGGCCAAG SEQ ID NO. 249 CATCTATGGTAACTACAATCG

SEQ ID NO. 250

GTAGAAGTCACTGATCAGACAC SEQ ID NO. 251 CTGCCTGCCAACCTTTCCATTT CT

SEQ ID NO. 252

TGAGCAGCCACAGCAGCATTAGG SEQ ID NO. 253 CACCTGATCAGGTGGATAAGG

SEQ ID NO. 254 TCCCAGGTAGAAGGTGGAATCC

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504.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método in vitro para identificar una célula de cáncer ovárico, comprendiendo el método poner en contacto una célula de ensayo, una muestra celular de ensayo, un fluido corporal de ensayo o un tejido de ensayo con un reactivo capaz de unirse específicamente a al menos una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en:

   a) un polinucleótido que comprende SEQ ID NO.:24; y

   b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polinucleótido de a)

   y detectar un complejo formado por el reactivo y el polinucleótido, con lo que la presencia de un complejo es indicativa de una célula de cáncer ovárico.

2. 2.

   El método como se define en la reivindicación 1, en el que la presencia de un complejo es indicativa de cáncer ovárico.

3. 3.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende además una etapa de a) comparar cualitativa o cuantitativamente el nivel de al menos un complejo presente en la célula de ensayo, la muestra de ensayo, el fluido de ensayo o el tejido de ensayo con el nivel de complejo en una célula normal, una muestra celular normal, un fluido corporal normal, un tejido normal o un valor de referencia, o b) comparar cualitativa o cuantitativamente el nivel de al menos un complejo presente en la célula de ensayo, la muestra de ensayo, el fluido de ensayo o el tejido de ensayo con el nivel de complejo en una célula, una muestra celular, un fluido corporal o un tejido de un cáncer ovárico de bajo potencial maligno o con un valor de referencia atribuido a un cáncer ovárico de bajo potencial maligno.

4. 4.

   El método de la reivindicación 3 a), en el que la célula normal, muestra celular o tejido es una célula ovárica normal, una muestra de células ováricas normales o un tejido ovárico normal, y en el que un fluido corporal normal procede de un individuo que no tiene una afección cancerosa.

5. 5.

   El método de la reivindicación 1, en el que dicha célula, muestra celular, fluido corporal o tejido se origina de un individuo que tiene o que se sospecha que tiene un cáncer ovárico.

6. 6.

   El método de la reivindicación 5, en el que dicho cáncer ovárico es un cáncer ovárico de bajo potencial maligno, o es un cáncer ovárico maligno.

7. 7.

   Un polipéptido aislado para uso in vivo en la identificación o detección de una célula de cáncer ovárico, seleccionándose dicho polipéptido del grupo que consiste en:

   a) un polipéptido que comprende SEQ ID NO.:70,

   b) un polipéptido codificado por una secuencia polinucleotídica que comprende SEQ ID NO: 24 o un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con ella,

   c) un fragmento que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO.:70,

   d) un derivado de a), en el que dicho derivado tiene al menos 80% de similitud de secuencia con el polipéptido de a), y

   e) un análogo de a), en el que dicho análogo tiene al menos 80% de similitud de secuencia con el polipéptido de a).

8. 8.

   Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la reivindicación 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable para uso in vivo en la identificación o detección de una célula de cáncer ovárico.

9. 9.

   Un polipéptido como se define en la reivindicación 7, para uso in vivo en el pronóstico o diagnóstico de cáncer ovárico.

10. 10.

    Un polipéptido como se define en la reivindicación 7, para uso in vivo en el pronóstico o diagnóstico de cáncer ovárico según la reivindicación 9, en el que dicho cáncer ovárico es un cáncer ovárico maligno, o un cáncer ovárico de bajo potencial maligno.

11. 11.

    Un polipéptido como se define en la reivindicación 7, para uso in vivo en el pronóstico o diagnóstico de cáncer ovárico según la reivindicación 10, en el que la detección de dicho polipéptido en una célula, tejido, muestra o fluido corporal procedente de un individuo es a) indicativa preferentemente de un diagnóstico de cáncer ovárico maligno con respecto a un diagnóstico de cáncer ovárico de bajo potencial maligno, o b) indicativa preferentemente de un cáncer ovárico maligno que de un cáncer ovárico de bajo potencial maligno, o c) es indicativa preferentemente de un cáncer ovárico maligno de etapa tardía.

12. 12.

    Un método in vitro para el diagnóstico o pronóstico de cáncer ovárico, comprendiendo el método determinar la presencia o ausencia de al menos un polipéptido de la reivindicación 7, con lo que la presencia del polipéptido es

    indicativa de la presencia de una célula de cáncer ovárico.

13. 13.

    Un método in vitro para el diagnóstico o pronóstico de cáncer ovárico, comprendiendo el método determinar el nivel de expresión de al menos un polipéptido de la reivindicación 7.

14. 14.

    El método in vitro de la reivindicación 13, que comprende además comparar el nivel obtenido con al menos un nivel o valor de referencia.

15. 15.

    Un anticuerpo aislado o purificado o un fragmento del mismo de unión a antígeno capaz de unirse específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

    a) un polipéptido que comprende o consiste en SEQ ID NO.:70, y

    b) un polipéptido que comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que comprende SEQ ID NO: 24 o un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con ella, o un fragmento de al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO.:70,

    para uso in vivo en la identificación o detección de una célula de cáncer ovárico que expresa el polipéptido de la reivindicación 7.

16. 16.

    Una composición que comprende el anticuerpo de la reivindicación 15, para uso in vivo en la identificación o detección de una célula de cáncer ovárico que expresa el polipéptido de la reivindicación 7.

17. 17.

    Un método in vitro para identificar un compuesto que inhibe la actividad o función de un polipéptido que comprende SEQ ID NO.:70, o un polipéptido que comprende una secuencia polipeptídica codificada por SEQ ID NO.:24, comprendiendo el método poner en contacto una célula que expresa el polipéptido con un compuesto putativo y aislar o identificar un compuesto que es capaz de unirse específicamente al polipéptido, y determinar el efecto del compuesto putativo sobre el crecimiento de una célula de cáncer ovárico.

18. 18.

    Un método in vitro para identificar un compuesto que inhibe la expresión de un polinucleótido que comprende SEQ ID NO.:24, comprendiendo el método poner en contacto una célula capaz de expresar dicho polinucleótido con un compuesto putativo, y cuantificar el nivel de expresión del polinucleótido en presencia de dicho compuesto putativo, en el que dicha célula es una célula de cáncer ovárico que expresa endógenamente dicho polinucleótido.

19. 19.

    Un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno capaz de unirse específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

    a) un polipéptido que consiste en SEQ ID NO.:70,

    b) un polipéptido codificado por SEQ ID NO.:24,

    c) un fragmento que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO.:70,

    d) un derivado de uno cualquiera de a) o b), en el que dicho derivado tiene al menos 80% de similitud de secuencia con el polipéptido de a) o b), y

    e) un análogo de uno cualquiera de a) o b), en el que dicho análogo tiene al menos 80% de similitud de secuencia con el polipéptido de a) o b),

    para uso in vivo en la identificación, detección o tratamiento de cáncer ovárico.

20. 20.

    Uso de un anticuerpo purificado o aislado o su fragmento de unión a antígeno como se define en la reivindicación 15, en la identificación o detección in vitro de una célula de cáncer ovárico que expresa el polipéptido de la reivindicación 7.

21. 21.

    Un polinucleótido aislado para uso en la reducción, disminución o inhibición del crecimiento de una célula de cáncer ovárico in vivo, siendo dicho polinucleótido un polinucleótido que comprende una secuencia que es al menos 80% complementaria a SEQ ID NO.:24.

22. 22.

    El anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno como se define en la reivindicación 19 para uso in vivo en la identificación, detección o tratamiento de cáncer ovárico según la reivindicación 19, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado, o un fragmento del mismo de unión a antígeno.

23. 23.

    El anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno como se define en la reivindicación 19 para uso in vivo en la identificación, detección o tratamiento de cáncer ovárico según la reivindicación 19, en el que dicho fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2 o un fragmento Fv.