KR20080113223A - 호흡기세포 융합 바이러스 감염 치료용 재조합 폴리클로날 항체 - Google Patents

호흡기세포 융합 바이러스 감염 치료용 재조합 폴리클로날 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 호흡기세포 융합 바이러스(RSV)를 표적화하는 신규한 폴리클로날 항체, 및 RSV와 반응성인 신규한 고 친화력 항체 분자에 관한 것이다. 폴리클로날 항체는 RSV 단백질 F 및 RSV 단백질 G 둘 모두와 반응성인 항체 분자를 포함할 수 있고, 바람직하게는 폴리클로날 항체가 이러한 단백질 상의 다양한 에피토프를 표적화한다. 본 발명의 단일 항체 분자는 피코몰 범위로 낮은 해리 상수를 제공하는 친화력을 지니는 것으로 나타났다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체를 제공하는 방법 및 RSV 감염의 치료에서 이들의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

호흡기세포 융합 바이러스 감염 치료용 재조합 폴리클로날 항체{RECOMBINANT POLYCLONAL ANTIBODY FOR TREATMENT OF RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS INFECTIONS}
본 발명은 호흡기세포 융합 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 징후를 예방, 치료 또는 개선시키기 위한 재조합 폴리클로날 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체(항-RSV rpAb)를 생성하는 폴리클로날 발현 세포주에 관한 것이다. 추가로, 본 출원은 항-RSV rpAb를 포함하는 진단 및 약리학적 조성물 및 RSV 감염과 관련된 하나 이상의 징후를 예방, 치료 또는 개선시키기 위한 이의 용도를 기술한다.
호흡기세포 융합 바이러스(RSV)는 유아 및 소아에서 하기도(lower respiratory trat) 질병의 주요 원인이다. 미숙아 및 만성 폐병 또는 선천성 심장병과 같은 건강상의 문제가 있는 소아는 RSV 감염 이후에 세기관지염 및 폐렴과 같은 심각한 질병에 걸릴 위험이 가장 크다. 최근에, RSV는 면역약화된 성인, 특히 골수 이식 수용자, 만성 폐병에 걸린 중년 및 개인과 같은 특정 고-위험 성인에서 중요한 병원체인 것으로도 인식되었다.
사람 RSV는 파라믹소피리대(Paramyxoviridae) 과의 뉴모바이러스(Pneumovirus) 아과(subfamily)의 멤버이며, A 및 B 아형(subtype)으로서 존재한 다. RSV는 껍질을 보유하고(enveloped), 비-분절된(non-segmented) 네거티브-센스 RNA 바이러스이다. 바이러스 게놈은 적어도 11개의 단백질을 코딩하며 이들 중 3개는 외피 관련 단백질인 F(융합 당단백질), G(수용체-결합 당단백질) 및 SH(소형 소수성 단백질)이다. 외피 단백질은 바이러스 표면에 존재하며, 감염된 세포의 표면에도 약간의 정도로 존재한다. F 단백질은 바이러스 및 세포 막의 융합을 촉진시켜, 바이러스 RNA가 세포의 세포질로 침투하도록 한다. F 단백질은 574개 아미노산의 N-글리코실화된 불활성 전구체의 단백질분해 절단에 의해 생성된 2개의 디설파이드-결합된 서브유닛인 F1 및 F2로 구성된다. G 단백질은 289-299개 아미노산(바이러스 균주에 따라서)의 타입 II 트랜스막 당단백질이다. 전구체 형태는 32 kDa이고, N 및 O-결합된 올리고사카라이드 둘 모두의 첨가시 80-90 kDa의 단백질로 성숙된다. RSV G 단백질은 표적 세포로의 비리온의 부착을 책임진다. G 단백질의 막-결합된 형태 이외에, 트렁케이션된 가용성 형태도 생성된다. 바이러스 및 감염된 세포와 떨어진 면역 반응을 재유도하는 이의 기능이 제안되었다. 추가로, G 단백질은 케모킨의 개질 및 시토킨 발현 뿐만 아니라 백혈구 동원(recruitment)과 같은 다수의 전-염증 효과와 관련된 것으로 나타났다. SH 단백질은 정제된 RSV 입자의 표면에 매우 소량으로 존재하는 64-65개 아미노산의 단백질이나, RSV-감염된 세포의 표면에서 풍부하게 발현된다. SH 단백질의 기능은 정의되지 않았으나, 이것은 골지 복합체를 통해 바이러스 단백질의 운반을 도울 수 있다 (Rixon et al 2004, J. Gen. Virol. 85: 1153-1165). G 및 F 단백질의 기능을 차단하는 것이 RSV 감염의 예방과 관련될 것으로 여겨진다.
RSV 감염의 예방 및 치료는 지난 수십년간 상당한 주목을 받았으며, 이는 백신 개발, 항바이러스 화합물(치료에 승인된 리바비린), 안티센스 약물, RNA 간섭(RNAi) 기술 및 면역글로불린 및 모노클로날 항체와 같은 항체 생성물(모두 Maggon and Barik, 2004, Rev. med. Virol. 14: 149-168에서 검토됨)을 포함한다. 이러한 접근법 중에서, 정맥내 면역글로불린, RSV-IVIG 및 모로클로날 항체, 팔리비주맵이 고-위험 소아에서 RSV 예방을 위해 승인되었다.
그러나, RSV-IVIG (RespiGam)과 같은 면역글로불린 생성물은 낮은 특이적 활성과 같은 여러 가지 단점을 지녀서 많은 부피로 주사될 것이 요구되고, 이것은 사전의 강한 치료요법으로 인해 정맥 접근으로 제한된 소아에서 어렵다는 것이 공지되어 있다. 추가로, 혈청-유래된 면역글로불린 생성물로부터의 바이러스 질병의 전파 위험 뿐만 아니라 회분-대-회분 변이의 문제도 있다. 마지막으로, 보통 공여체의 약 8%만이 매우 충분한 RSV 중화 항체 역가를 지니기 때문에, 과다면역 RSV 면역글로불린 생성에 대한 요구를 충족하는 충분한 공여체를 얻기 어렵다.
F 단백질 또는 G 단백질에 대한 모노클로날 항체는 시험관내에서 중화 효과를 지니고 생체내에서 에방 효과를 지니는 것으로 나타났다 (예컨대, Beeler and Coelingh 1989. J. Virol. 63: 2941-50; Garcia-Barreno et al. 1989. J. Virol. 63:925-32; Taylor et al. 1984. Immunology 52: 137-142; Walsh et al. 1984, Infection and Immunity 43:756-758; US 5,842,307 and US 6,818,216). 오늘날 모노클로날 항체인 팔리비주맵이 RSV-IVIG의 사용을 거의 완전히 대신하였다. 중화 검정은, 팔리비주맵 및 RSV-IVIG가 RSV 아형 B에 대해 매우 동일하게 작동하는 한편, 아형 A에 대해서는 팔리비주맵이 더 양호하게 작동함을 나타낸다 (Johnson et al. 1997. J.Infect.Dis. 176: 1215-24.). 그러나, 팔리비주맵 및 누맥스와 같은 제품에 의해 예시된 대로 모노클로날 항체들의 양호한 중화 및 예방 효과에도 불구하고, 이들은 RSV 바이러스의 특성으로 인한 일정한 단점과도 관련될 수 있다.
RSV는 두 별개의 항원성 그룹 또는 아형인 A 및 B로 존재한다. RSV 단백질의 대부분은 두 서브그룹간에 고도로 보존되며, F 단백질은 91%의 아미노산 유사성을 나타낸다. 그러나, G 단백질은 넓은 서열 가변성을 나타내며 A 및 B 서브그룹간에 단지 53%의 아미노산 유사성을 지닌다 (Sullender 2000. Clin. Microbiol. Rev. 13: 1-15). G 단백질을 제외한 단백질의 대부분도 다소 제한된 서브그룹내 변화를 나타내며, 아미노산 수준에서 서브그룹 A내에서 20% 이하 및 서브그룹 B내에서 9%로 상이한다. A 및 B 바이러스 아형들은 다른 연도간에 변화되는 상대적인 빈도를 지니며 대부분의 RSV 전염병에서 함께-순환된다. 따라서, 모노클로날 항체는 둘 모두의 아형 뿐만 아니라 아형내 변화를 중화시킬 수 있도록 신중하게 선택되어야 한다.
두 RSV 아형 및 아형내 변화의 문제에 추가하여, 대부분의 RNA 바이러스와 같은 사람 RSV는 선택적인 압력하에 신속하게 돌연변이되는 능력을 지닌다. mAb를 이용한 시험관내 RSV 도피 돌연변이의 선택은 잘 문서화되어 있다 (예컨대, Garcia-Barreno et al. 1989. J.Virol. 63:925-32). 중요하게도, 팔리비주맵도 생체내 뿐만 아니라 시험관내에서 도피 돌연변이에 대해 선택되며, 단리된 돌연변이 중 일부는 코튼래트에서 팔리비주맵 에방에 완전하게 내성을 지님이 최근에 발견되었다 (Zhao and Sullender 2005. J.Virol. 79:3962-8 and Zhao et al. 2004. J.Infect.Dis. 190: 1941-6). 추가로, 팔리비주맵의 근원이 된 뮤린 항체가 한 임상적 단리물을 중화시키는데 실패한 것에 의해 입증된 대로, 팔리비주맵에 본질적으로 내성인 야생형 RSV 균주도 존재할 수 있다 (Beeler and Coelingh 1989. J.Virol. 63:2941-50). 더욱이, 하나의 겉보기 내성 바이러스가 면역수행 코튼 래트에서 팔리비주맵 예방 이후에 동정되었다 (Johnson et al. 1997. J.Infect.Dis. 176: 1215-24). 따라서, 특정 조건하에서, 도피 돌연변이가 존재하거나 치료의 결과로서 경시적으로 도피 돌연변이가 발생할 수 있으므로, 일특이적 단일 항체의 이용이 RSV 질병의 치료에 적당하거나 충분하지 않을 수 있다.
RSV-IVIG 및 팔리비주맵의 이용과 관련된 추가의 고찰은 효율적인 치료에 요구되는 용량에 있다. RSV 감염의 코튼 래트 모델에서 폐 RSV 복제를 100배까지 감소시키기 위해 30 ㎍/ml를 초과하는 혈청 농도가 필요한 것으로 나타났다. RSV-IVIG의 경우, 고-위험 소아에서 RSV 입원의 발생을 감소시키는데 정맥내로 투여되는 750 mg의 총 단백질/kg의 매달 용량이 효과적인 반면, 팔리비주맵의 경우 15 mg/kg의 매달 근내 용량이 효과적이었다. 그러나, 정맥내 또는 근내에 의한 다발 다용량의 투여는 환자에게 불편하며, RSV 감염 위험이 있는 많은 그룹의 성인을 예방 및 치료하는데 있어서 이들 생성물의 광범한 이용을 방해한다.
따라서, 공여체 이용가능성에 의존적이지 않고 아형 A 및 B를 포함하는 하나 이상의 RSV 항원에 면역특이적으로 결합될 뿐만 아니라, 고도로 유력한, 바이러스 돌연변이로 인해 발생하는 임의의 도피 돌연변이가 개선된 약물동력학적 프로필을 지녀서, 전체적으로 개선된 치료적 프로필을 제공하고, 따라서 덜 빈번한 투여 및/또는 저 용량의 투여를 요구하는 항체 생성물에 대한 요구가 존재한다.
따라서, 본 발명의 목적은 재조합에 의해 생성되고 호흡기세포 융합 바이러스의 아형 A 및 B에 대해 반응성을 나타낼 뿐만 아니라 주요 표면 항원의 하나 이상에 있는 다중 에피토프에 대해 도피 돌연변이의 가능성을 제한하는 고도로 유효한 대안적인 항-RSV 면역글로불린 생성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 신규한 사람 항-RSV 항체 분자 및 이의 유도체를 제공하는 것을 목적으로 하며, 여기서 항체 분자 또는 유도체는 현존하는 모노클로날 항-RSV 항체 및 항체 유도체에 비해 개선된 특성을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
RSV 상의 다중 에피토프를 표적화하는 폴리클로날 항체 조성물의 이용은 도피 돌연변이의 발생을 최소화하고 자연히 순환되는 다양한 바이러스에 대한 보호도 제공할 수 있을 것으로 여겨진다. 혈청-유래된 RSV-IVIG와 대조적으로, 본 발명의 폴리클로날 항체는 비-RSV 항원에 결합되는 항체 분자를 함유하지 않는다.
본 발명은 폴리클로날 항-RSV 항체를 제공한다. 바람직하게는, 폴리클로날 항-RSV 항체가 자연적으로 항체를 생성하지 않는 세포로부터 수득된다. 이러한 항체를 재조합 폴리클로날 항체(rpAb)라고 부른다. 본 발명의 항-RSV rpAb는 F 또는 G 단백질 상의 다중 에피토프에 대해 유도된다. 특히, G 및 F 단백질 둘 모두에 있는 다중 에피토프에 대해 유도된 항-RSV rpAb가 바람직하다. 바람직하게는, 보존된 그룹 및 또한 잠재적으로 아형-특이적인 그룹 및 균주-특이적 그룹에 속하는 G 단백질 에피토프가 항-RSV rpAb에 의해 덮힌다. 추가로, 제3 외피 단백질인 소형 소수성(SH) 단백질에 대해 반응성을 지니는 항체가 본 발명의 항-RSV rpAb의 요망되는 성분이다.
추가로, 본 발명은 활성 성분이 항-RSV 폴리클로날 항체인 약제학적 조성물, 및 RSV 감염을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 상기 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 챌린지된(challenged) 개체로부터 원래의 VH 및 VL 유전자 쌍을 단리하고, 이러한 원래 쌍을 유지하는 항체를 생성함에 의해, RSV에 감염될 때 일어나는 체액성 면역 반응을 반영하는(mirroring) 절차를 추가로 제공한다.
정의
"항체"라는 용어는 혈청의 기능 성분을 나타내며 종종 분자의 집합(항체들 또는 면역글로불린) 또는 하나의 분자(항체 분자 또는 면역글로불린 분자)로서 언급된다. 항체 분자는 특정 항원성 결정인자(항원 또는 항원성 에피토프)에 결합되거나 이와 반응하여 차례로 면역학적 이펙터 메커니즘을 유도할 수 있다. 개개 항체 분자는 일반적으로 일특이적인 것으로 간주되며, 항체 분자의 조성물은 모노클로날(즉, 동일한 항체 분자로 구성됨) 또는 폴리클로날(즉, 동일한 항원 또는 별개의 다른 항원 상에서 동일하거나 상이한 에피토프와 반응하는 상이한 항체 분자로 구성됨)일 수 있다. 각 항체 분자는 이것이 이의 상응하는 항원과 특이적으로 결합될 수 있게 하는 독특한 구조를 지니며, 모든 천연 항체 분자는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄의 동일한 전체 기본 구조를 지닌다. 항체는 총괄하여 면역글로불린으로서도 공지되어 있다. 본원에서 사용된 항체 또는 항체들이라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 본래의 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 완전한 사람 및 단쇄 항체 뿐만 아니라 항체의 결합 단편, 예컨대 Fab, Fv 단편 또는 scFv 단편, 및 다합체 형태, 예컨대 이합 IgA 분자 또는 5가 IgM을 포함한다. 일부 예에서, 본 출원은 "합성 또는 반-합성 항체 유사체"라는 용어를 사용하는데, 이것은 구체적으로 항체 특성(RSV 항원에 대한 특이적 결합을 나타냄에 의해)을 나타내며 천연 발생 항체로부터의 CDR을 포함하는 비-천연 발생 분자를 언급하고 -상기 유사체는 예컨대 scFv 단편, 디아보디 등에 의해 표시되나, 예를 들어 본원에 개시된 항-RSV 항체 분자로부터의 CDR을 포함하도록 공학처리된(예컨대, 당 분야에 공지된 이식 기술에 의해) 외관상 천연 발생 항체일 수도 있다- 예를 들어, 상기 항체 유사체는 또 다른 동물 종의 항체 분자로 또는 동일한 종으로부터의 상이한 항체 이소형 또는 클래스로 혼입된 본원에 개시된 CDR을 포함할 수 있었다.
"항-RSV 재조합 폴리클로날 항체" 또는 "항-RSV rpAb"라는 용어는 재조합에 의해 생성된 다양한 항체 분자의 조성물을 나타내며, 여기서 개개 멤버는 호흡기세포 융합 바이러스 상에 있는 하나 이상의 에피토프에 결합될 수 있고 폴리클로날 조성물은 전체로서 RSV를 중화시킬 수 있다. 바람직하게는, 항-RSV rpAb 조성물이 RSV 아형 A 및 B 둘 모두를 중화시킨다. 심지어 더욱 바람직한 항-RSV rpAb는 G 및 F 단백질에 대한 결합 반응성을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 조성물이 단일 폴리클로날 제조용 세포주로부터 생성된다.
"동족체(cognate) VH 및 VL 코딩 쌍"이라는 용어는 동일한 세포내에 함유되어 있거나 이로부터 유래된 VH 및 VL 코딩 서열의 본래 쌍을 나타낸다. 따라서, 동족체 VH 및 VL 쌍은 세포가 유래된 공여체에 원래 존재하는 VH 및 VL 페어링을 나타낸다. "VH 및 VL 코딩 쌍으로부터 발현된 항체"라는 용어는 항체 또는 항체 단편이 VH 및 VL 코딩 서열을 함유하는 벡터, 플라스미드 또는 유사한 것들로부터 생성되었음을 나타낸다. 동족체 VH 및 VL 코딩 쌍이 완전한 항체로서 또는 안정한 이의 단편으로서 발현될 때, 이들은 이들이 유래된 세포로부터 원래 발현되는 항체의 결합 친화력 및 특이성을 보존한다. 동족체 쌍의 라이브러리가 동족체 쌍의 레퍼토리 또는 집합으로도 불리며, 개별적으로 유지되거나 푸울링될 수 있다.
"재조합 폴리클로날 항체의 별개의 멤버"라는 용어는 폴리클로날 단백질의 다른 개개 멤버와 비교하여 아미노산 서열에 있는 차이를 특징으로 하는, 가변 영역내에 하나 이상의 스트레치를 포함하는 재조합 폴리클로날 항체 조성물의 개별적인 항체 분자를 언급한다. 이러한 스트레치는 특히 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에 위치한다.
"에피토프"라는 용어는 동물, 바람직하게는 포유동물, 및 가장 바람직하게는 사람에서 항원성 또는 면역원성 활성을 지니는 더 큰 분자의 부분 또는 더 큰 분자의 일부(예컨대, 항원 또는 항원성 부위)를 기술하는데 일반적으로 사용된다. 면역원성 활성을 지니는 에피토프는 동물에서 항체 반응을 일으키는 더 큰 분자의 부분이다. 항원성 활성을 지니는 에피토프는 당 분야에 널리 공지된 임의의 방법, 예를 들어 본원에 기술된 면역검정에 의해 결정되는 항체가 면역특이적으로 결합되는 더 큰 분자의 부분이다. 항원성 에피토프가 반드시 면역원성일 필요는 없다. 항원은 항체 또는 항체 단편이 면역특이적으로 결합되는 물질, 예컨대 톡신, 바이러스, 세균, 단백질 또는 DNA이다. 항원 또는 항원성 부위는 이들이 매우 소형이 아니라면 종종 하나를 초과하는 에피토프를 지니며, 종종 면역 반응을 자극할 수 있다. 동일한 항원상의 상이한 에피토프에 결합하는 항체는 에피토프의 위치에 따라서 이들이 결합되는 항원의 활성에 대해 다양한 효과를 지닐 수 있다. 항원의 활성 부위에서 에피토프에 결합되는 항체는 항원의 기능을 완전히 차단하는 한편, 상이한 에피토프에 결합되는 또 다른 항체는 다만 항원의 활성에 전혀 또는 거의 영향을 미칠 수 없다. 그러나 이러한 항체는 여전히 보체를 활성화시킬 수 있으므로 항원의 제거를 초래하고, 동일한 항원상의 상이한 에피토프에 결합되는 하나 이상의 항체와 조합시에 상승적인 효과를 야기할 수 있다. 본 발명에서, 에피토프가 RSV 폴리펩티드의 부분인 더 큰 분자는 바람직하게는 RSV 폴리펩티드의 부분이다. 본 발명의 항원은 항체 또는 항체 단편이 면역특이적으로 결합되는 RSV 관련 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 단편인 것이 바람직하다. RSV 관련 항원은 항체 또는 항체 단편이 면역특이적으로 결합되는 RSV 폴리펩티드 또는 이의 단편의 유사체 또는 유도체일 수도 있다.
예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질 서열과 관련하여 사용되는 "완전히 사람"이라는 용어는 98% 내지 100%가 사람인 서열을 나타낸다.
"면역글로불린"이라는 용어는 일반적으로 혈액 또는 혈청에서 발견되는 항체 혼합물의 집합적인 명칭으로서 사용되나, 다른 공급원으로부터 유래된 항체 혼합물을 명칭하기 위해서 사용될 수도 있다.
폴리클로날 항체과 관련하여 사용시 "체액성 면역 반응을 반영(mirror)한다"라는 용어는 개개의 항체 멤버를 엔코딩하는 핵산 서열이 항-RSV 특이적 항체를 생성하는 증가된 빈도의 혈장 세포를 지니는 공여체로부터 유래되는 항체 조성물을 언급한다. 이러한 공여체는 RSV 감염된 개체와 밀접하게 접촉되거나, RSV 백신화된 RSV 감염증으로부터 회수될 수 있다 (RSV 백신의 예는, 예를 들어 Maggon and Barik, 2004, Rev. med. Vriol. 14:149-168 참조). 감염 또는 챌린지시에 공여체에서 발생하는 항체의 친화력 및 특이성을 반영하기 위해, 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 엔코딩하는 서열이 이들이 단리된 공여체에 원래 존재하는 유전자 쌍 또는 조합에(동족체 쌍) 유지되어야 한다. 공여체에서 체액성 면역 반응의 다양성을 반영하기 위해, RSV에 결합되는 항체를 엔코딩하는 모든 서열이 스크리닝 절차에 기초하여 선택된다. 단리된 서열을 가변 영역, 특히 CDR 영역의 다양성에 대해 분석하나, VH 및 VL 과에 대해서도 분석한다. 이러한 분석에 기초하여, RSV 결합 항체의 전체적인 다양성을 나타내는 동족체 쌍의 군집(popultation)이 선택된다. 이러한 폴리클로날 항체는 통상적으로 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000 또는 104개의 별개의 멤버를 지닌다.
조성물은 수용하는 환자가 투여에 견딜 수 있다면 "약리학적으로 허용"되는 것으로 언급된다 - 동일한 방침이 조성물의 일부인 부형제, 비히클 담체 및 희석제에 적용된다.
"폴리클로날 항체"라는 용어는 동일하거나 상이한 항원상에서 수 개의 상이한 특이적 항원성 결정인자/에피토프에 결합되거나 이와 반응할 수 있는 상이한(다양한) 항체 분자의 조성물을 나타내며, 조성물 중 개개의 각 항체는 특정 에피토프와 반응할 수 있다. 일반적으로, 폴리클로날 항체의 가변성은 폴리클로날 항체의 소위 가변 영역, 특히 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에 있다. 본 발명에서, 폴리클로날 항체는 폴리클로날 세포주로부터의 한 포트(pot)에서 생성될 수 있거나, 상이한 폴리클로날 항체의 혼합물일 수 있다. 모노클로날 항체의 혼합물은 개개의 회분에서 생성되며 반드시 동일한 세포주로부터 올 필요가 없어서 예컨대 번역 후 개질 차이를 초래할 것이므로, 그 자체로 폴리클로날 항체로서 고려되지 않는다. 그러나, 모노클로날 항체의 혼합물이 본 발명의 폴리클로날 항체처럼 동일한 항원/에피토프 덮힘을 제공한다면, 폴리클로날 항체와 동등한 것으로 고려될 것이다. 폴리클로날 항체의 멤버가 특이적으로 결합되거나 항원/항원성 부위/에피토프에 대해 특이적 반응성을 지님을 언급할 때, 이것은 본원에서 결합 상수가 100 nM 미만, 바람직하게는 10 nM 미만, 심지어 더욱 바람직하게는 1 nM 미만인 것을 의미한다.
"재조합 항체"라는 용어는 천연적으로 세포와 관련이 없는 항체의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 세포 또는 세포주로부터 발현된 항체 분자 또는 수 개의 분자들을 언급하는데 이용된다. 재조합 항체 조성물 중의 항체 분자가 다양하거나 상이한 경우, 폴리클로날 항체의 정의에 따라서 "재조합 폴리클로날 항체" 또는 "rpAb"라는 용어가 적용된다.
"재조합 폴리클로날 세포주" 또는 "폴리클로날 세포주"라는 용어는 트랜스펙션된 세포와 천연적으로 관련이 없는 변이 핵산 서열의 레퍼토리(예컨대, 항체를 엔코딩하는 핵산 서열의 레퍼토피)로 트랜스펙션된 단백질 발현 세포의 혼합물/군집을 언급한다. 바람직하게는, 재조합 폴리클로날 세포주를 함께 구성하는 개개 세포가, 관심있는 재조합 폴리클로날 항체의 하나의 멤버를 엔코딩하는 관심있는 별개의 단일 핵산 서열의 전사적으로 활성인 복사(copy)를 각각 수행하도록 트랜스펙션이 수행된다. 더욱 바람직하게는, 별개의 핵산 서열의 단일 복사만이 게놈의 특정 부위에 통합된다. 재조합 폴리클로날 세포주를 구성하는 세포는, 예를 들어 항생물질 선택에 의해 관심있는 별개의 핵산 서열의 통합된 복사(복사체들)를 보유하는 이들의 능력에 대해 선택된다. 이러한 폴리클로날 세포주를 구성할 수 있는 세포로는, 예를 들어 세균, 진균, 진핵 세포, 예를 들어 효모, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포, 특히 무한증식되는 포유동물 세포주, 예컨대 CHO 세포, COS 세포, BHK 세포, 골수종 세포(예컨대 Sp2/0 세포, NS0), NIH, 3T3, YB2/0 및 무한증식되는 사람 세포, 예컨대 HeLa 세포, HEK 293 세포 또는 PER.C6이 있을 수 있다.
"VH 및 VL 쌍을 엔코딩하는 서열" 또는 "VH 및 VL를 엔코딩하는 서열 쌍"이라는 용어는, 분자가 각각 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 발현을 코딩하는 서열을 포함하여, 적합한 프로모터 및/또는 IRES 영역이 존재하고 서열에 작동가능하게 연결되는 경우 핵산 분자로부터 쌍으로서 이들이 발현될 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 핵산 분자는 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역의 일부 또는 완전한 불변 영역을 코딩할 수도 있어서, 적합한 프로모터 및/또는 IRES 영역이 존재하고 서열에 작동가능하게 연결되는 경우 Fab 단편, 전장 항체 또는 다른 항체 단편을 발현시킬 수 있다.
재조합 폴리클로날 항체는, 투여된 양이 생리적으로 유의적인 경우, 예컨대 동물 또는 사람에서 RSV 감염을 예방하거나 약화시키는 경우 "치료적 유효량"으로 투여된 것으로 언급된다.
도면의 설명
도 1: (A) 원형(prototype) 균주, Long(아형 A) 및 18537(아형 B)로부터의 전체 G 단백질의 아미노산 서열의 정렬. 시그널/트랜스막 영역은 점선으로 된 박스로 표시한다. 문헌[Cane et al. 1991 J. Gen. Virol. 72:2091-2096]에서 동정된 아미노산 101-133 및 208-299 사이에 있는 두 가변 도메인이 밑줄로 표시된다. G 단백질의 중심 단편이 대장균(E.coli)에서 융합 단백질로서 발현되었고 검정색 박스로 표시한다. 2개의 아미노산 서열이 서열번호 711(아형 A) 및 712(아형 B)로서 기술된다. (B) (A)에 표시된 중심 단편의 정렬. 13-aa 보존 영역 (a.a. 잔사 164-176) 및 G 단백질 시스테인-부화 영역(GCRR)의 위치가 괄호로 표시된다. GCRR에서의 디설파이드 브릿지(두 아형 모두에서 동일함)가 꺾쇠 괄호로 표시된다. 2개의 아미노산 서열이 서열번호 713(아형 A) 및 714(아형 B)로서 기술된다.
도 2: 다중 중복-연장 RT-PCR (A) 및 클로닝 단계 (B)의 개요. (A) VH 및 Vκ 유전자 과에 각각 특이적인 2 세트의 프라이머, CH + VH 1-8 및 VK1-6 + CKl을 첫 번째 PCR 단계에 이용하였다. VH 또는 Vκ 프라이머 사이의 상동 영역이 중복 PCR 생성물의 발생을 초래한다. 두 번째 단계에서, 이 생성물을 네스티드(nested) PCR로 증폭시킨다. 프라이머는 클로닝을 촉진시키는 제한 효소를 위한 인식 부위도 포함한다. (B) 생성된 동족체 결합된 VH 및 Vκ 코딩 쌍을 푸울링하고 포유동물 IgG 발현 벡터로 플랭킹 XhoI 및 NotI 제한 부위를 사용하여 삽입한다(예컨대, 도 3). 후속하여, 2-방향성 프로모터를 결합된 VH 및 Vκ 코딩 서열 사이에 있는 AscI-NheI 제한 부위로 삽입하여 전장 항체의 발현을 촉진한다. 이용된 PCR 프라이머를 수평 화살표로 표시한다. CHl : 중쇄 불변 도메인 1, CL: 불변 도메인, LC: 경쇄; Ab: 항체; P1-P2: 2-방향성 프로모터.
도 3: 포유동물 전장 항체 발현 벡터 00-VP-530의 개략도. 벡터는 하기 엘리먼트를 포함한다: Amp 및 Amp pro = 암피실린 내성 유전자 및 이의 프로모터. pUC 오리진 = 복제의 pUC 기원. Pl = 경쇄의 발현을 수행하는 포유동물 프로모터. P2 = 중쇄의 발현을 유도하는 포유동물 프로모터. 리더 IGHV = 게놈 사람 중쇄 리더. VH = 중쇄 가변 영역을 엔코딩하는 서열. IgGl = 게놈 면역글로불린 이소형 G1 중쇄 불변 영역을 엔코딩하는 서열. 토끼 B-글로빈 A = 토끼 베타-글로빈 폴리A 서열. 카파 리더 = 뮤린 카파 리더를 엔코딩하는 서열. LC = 경쇄을 엔코딩하는 서열. SV40 term = 원숭이 바이러스 40 종결인자 서열. FRT = A Flp 인식 표적 부위. Neo = 네오마이신 내성 유전자. SV40 폴리 A = 원숭이 바이러스 40 폴리 A 시그널 서열.
도 4: 바이아코어(Biacore) 분석을 이용하여 클론 801(Ab8Ol)로부터 수득된 항체의 에피토프 특이성의 특성화. 항체 801 결합을, 항원성 부위 F1, C 및 II에 각각 결합되는 3개의 항체 9c5 (2), 133-h (3) 및 팔리비주맵 (4)을 이용하여 단백질 F와의 결합에 대해 쌍단위의(pair-wise) 경쟁으로 시험하였다. 참조 세포는 비경쟁하는 Ab801(1)의 단백질 F와의 결합을 기술한다. 4개 항체의 주사 시간을 화살표로 표시한다. 반응을 상대 공명 유닛(RU)으로 나타낸다. 양쪽에 화살 표시를 지니는 긴 화살표는 비경쟁된 반응의 크기를 나타내고 양쪽에 화살 표시를 지니는 짧은 화살표는 9c5 억제된 반응의 크기를 나타낸다.
도 5: RSV 아형 A 및 B 균주의 시험관내 중화로부터의 결과를 도시한다. 항-F 항체 혼합물의 희석액을 RSV Long(패널 A) 및 RSV B1(패널 B) 균주를 중화시키는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 클론 810, 818, 819, 825 및 827로부터 수득된 항체 혼합물, 항-F(I)를 세모(▲)로 도시하고 클론 735, 800, 810, 818, 819, 825, 827, 863, 880, 884 및 894로부터 수득된 항체 혼합물, 항-F(II)를 (■)로 도시한다. 팔리비주맵을 다이아몬드(◆)로 표시하고, 이소형-매칭된 네거티브 대조군(항-레수스 D) 항체를 동그라미(●)로 표시한다. 흡광도는 490 nm에서 측정되었고 RSV 복제와 관련이 있다.
도 6: 시험관내 RSV 융합 억제 검정으로부터의 결과를 도시한다. 항체 혼합물의 희석액을 RSV B1 균주를 중화시키는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 클론 810, 818, 819, 825, 827, 793, 796, 838, 841, 856 및 888로부터 수득된 항체 혼합물, 항-F(I)G를 빈 네모(□)로 도시하고 클론 735, 800, 810, 818, 819, 825, 827, 863, 880, 884, 894, 793, 796, 838, 841, 856 및 888로부터 수득된 항체 혼합물, 항-F(II)G를 빈 세모(△)로 도시한다. 팔리비주맵을 다이아몬드(◆)로 표시한다. 흡광도는 490 nm에서 측정되었고 RSV 복제와 관련이 있다.
도 7: 활성 보체의 존재하에 PRNT에 의해 측정된 항-G 항체 클론의 조합에 의한 RSV의 시험관내 중화로부터의 결과를 도시한다. 개개 항체 조성물(표 8에 기술됨)의 희석액을 토끼 보체의 존재하에 RSV 균주 Long과 함께 인큐베이션한 다음 HEp-2 세포로 감염시켰다. 24시간의 인큐베이션 후에, 감염 정도를 RSV-특이적 플라크의 면역검출을 이용하여 검출하였다. 항-RSV rpAb 13을 빈 세모(△)로 도시하고, 항-RSV rpAb 35를 세모(▲)로, 항-RSV rpAb 36을 네모(■)로, 항-RSV rpAb 41을 동그라미(●)로 및 항-RSV rpAb 45를 빈 네모(□)로 표시한다. 데이터는 대조군±SD에 대한 감염%로 표시된다.
표적 항원 및 폴리클로날 항체 조성물
본 발명의 폴리클로날 항체는 동일한 조성물에서 다수의 별개의 항체 분자로 이루어진다. 각 분자는 RSV 관련 항원에 결합되는 이의 능력에 기초하여 선택된다. 본 발명의 폴리클로날 항체는 폴리클로날 항체 조성물을 구성하는 별개의 항체 분자의 수집된 결합 반응성에 상응하는 결합 반응성을 포함한다.
본 발명의 항-RSV 폴리클로날 항체는 바람직하게는 G 및 F 단백질 둘 모두에 대하여 그리고 더욱 바람직하게는 다중 에피토프에 대하여 수집된 결합 반응성을 포함하여 도피 돌연변이의 발생 위험을 최소화하고 가능한 가장 높은 중화 용량을 달성한다. 중화 항체에 의해 인식된 적어도 5개의 주요 항원성 부위가 F 단백질 상에서 동정되었다 (Lopez et al, 1998. J.Virol. 72:6922-8). 모든 항원성 부위가 F1 사슬로 맵핑되었고, 부위 I, II, IV, V 및 VI를 포함하며, 여기서 부위 I과 II는 각각 B 및 A로도 불릴 수 있다. 부위 II는 N-말단 분절의 프로테아제-내성 영역에 위치하고, 부위 IV, V 및 VI는 단백질의 시스테인-부화 영역의 C-말단에 위치한다. 부위 I는 이 시스테인 클러스터의 중간에 위치한다. F 단백질상의 추가의 항원성 부위가 부위 C인데, 여기에 아미노산 위치 241 및 242를 포함하는 에피토프 F2가 위치한다. 추가로, F1으로 불리는 항원성 부위에 결합되는 모노클로날 항체가 있고, F1a, F1b 및 F1c로 불리는 에피토프를 포함한다. 현재 이 항원성 부위는 F 단백질의 특정 부위로 맵핑되지 않았다. 이러한 부위/에피토프의 대부분이 넓게 중화 항체를 일으키나, 항원성 부위 I에 특이적인 일부 항체가 아형 A-특이적인 것으로 나타났다. 부위 I에 결합되는 항체도 바이러스 중화에 있어서 약간의 효과를 지닌다. 팔리비주맵에 의해 인식된 에피토프는 아미노산 위치 272에서 선택된 도피 돌연변이의 국소화에 의해 판단된 대로 항원성 부위 II에 위치한다 (Zhao et al. 2004. J.Infect.Dis. 190:1941-6). 더욱이, 에피토프의 3 유형이 G 단백질상에서 동정되었다: i) 모든 RSV 균주에 존재하는 보존된 에피토프, ii) 동일한 아형에 속하는 모든 바이러스에 존재하는 그룹-특이적인 에피토프, 및 iii) 동일한 아형에 속하는 균주의 서브세트에만 존재하는 균주-특이적 또는 가변 에피토프. 보존된 에피토프 및 그룹-특이적인 에피토프가 4개 시스테인의 클러스터(아미노산 잔기 173, 176, 182 및 186) 및 모든 사람 RSV 단리물 중에서 동일한 서열의 짧은 아미노산 분절(잔기 164-176)을 함유하는 G 단백질의 중심 부분으로 맵핑되었다. 시스테인 클러스터는 위치 173-183 및 176-182 사이에서 디설파이드 결합에 의해 유지되고 아미노산 잔기 171-187의 범위에 있는 G 단백질 시스테인-부화 영역(GCRR)의 중심 부분을 구성하므로, GCRR은 13개 아미노산의 보존된 영역과 중복된다. G 당단백질은 보호 면역의 유도 및 질병 병인의 둘 모두에서 역할을 하는 것처럼 보인다. 예를 들어, 마우스에서의 연구는, Th2 CD4+ T 세포 반응에 대한 G 당단백질 프라이머가 IL-4, IL-5, IL-13의 생성 및 폐 호산구증가증을 특징으로 함을 나타내었다. 호산구 동원 및 활성화는 IL-4 및 IL-5와 같은 여러 인자에 의해 촉진된다. 추가로, 마우스의 급성 감염 동안 RSV G 단백질의 발현이 감소된 Th1 시토킨 발현(예컨대, IL-2 및 감마 인터페론), 변경된 케모킨 mRNA 발현(예컨대, MIP-1 알파, MIP-1 베타, MIP-2, IP-10, MCP-1) 및 감염된 폐에 대한 감소된 NK 세포 트래피킹(trafficking)을 특징으로 하는 개질된 선천적인 면역 반응과 관련되었다. 특히 GCRR은 선천적인 염증 반응을 조절하는 중요한 역할을 함으로써 RSV 청소를 가능하게 지연시키는 것으로 나타났다 (Polack et al. 2005. PNAS 102:8996-9001). GCRR은 아미노산 위치 182 내지 186에 CX3C 모티프를 포함한다. RSV 감염된 마우스에서 호흡수의 감소는 CX3C 모티프와 관련된 것으로 나타났는데, 그 이유는 이 모티프에 대한 항체가 호흡수의 감소를 파괴하기 때문이다 (Tripp et al. 2003. J. Virol. 77:6580-6584 and US 2004/0009177 (appl. no. 10/420,387)). 균주-특이적인 에피토프는, 균주-특이적인 에피토프가 G 단백질 엑토도메인에서 시스테인 클러스터에 대해 가변 영역 N-말단으로 맵핑되었으나, G 폴리펩티드의 가변 C-말단 3에 우선적으로 국소화된다 (Martinez et al. 1997. J. Gen. Virol. 78:2419-29). 도 1은 다양한 영역의 G 단백질을 나타내는, Long 균주(아형 A) 및 18537 균주(아형 B)로부터의 G 단백질의 정렬을 도시한다. 일반적으로, 모노클로날 항-G 단백질 항체는 RSV 중화에 대해 약간의 효과를 나타낸다. 그러나, 모노클로날 항-G 항체의 혼합물이 생체내에서 뿐만 아니라 시험관내에서 RSV의 중화를 개선시킴이 보고되었다 (Walsh et al. 1989. J.Gen.Virol. 70:2953-61 and Martinez and Melero 1998 J.Gen.Virol. 79:2215-20). 모노클로날 항-G 항체를 조합시킨 가장 큰 효과는, 바이러스의 분획이 여전이 중화에 대한 내성을 유지하더라도, 항체가 상이한 에피토프에 결합될 때 명백하게 달성된다. 추가로, 두 상이한 항-F 항체와 상이한 에피토프 특이성과의 조합 뿐만 아니라 하나의 항-F 및 하나의 항-G 특이적 항체의 조합이 RSV에 대하여 개선된 시험관내 중화 효과를 나타내었다 (Anderson et al. 1988. J. Virol. 62: 4232-4238). 모노클로날 항체를 혼합시킴에 의해 수득된 이점 중 일부는, 예컨대 활성 부위의 차단에 의한 길항 효과와 같은 모노클로날 항체의 개별적인 특성들 때문인 것 같다. 다른 효과는 현재로서는 이해되지 않는 이유에 의해 상승된 것으로 여겨진다.
RSV 중화 메커니즘은 복잡하며 완전히 이해되지 않았다. F 및 G 단백질 단독에서 동정된 많은 수의 상이한 에피토프, 보존되고, 아형 특이적이며 균주 특이적인 에피토프들 뿐만 아니라 도피 돌연변이의 잠재적인 발생은, RSV 감염의 예방에 활용될 수 있는 모든 중화 메커니즘을 다루는데 광범위한 항체 특이성이 요구됨을 시사한다. 따라서, 이론적으로, 아형 A 및 B 둘 모두의 RSV 균주 뿐만 아니라 도피 돌연변이 및 오늘날 공지된 RSV 균주로부터 발생하는 신규한 균주에 의한 RSV 감염을 에방할 수 있는 모노클로날 항체의 혼합물을 선택하는 것은 매우 어려울 것이다.
본 발명의 측면은 상당한 다양성 및 넓은 항-RSV 특이성을 지니는 폴리클로날 항-RSV 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체는 생성시에 공여체 이용가능성에 의존적이지 않고 회분 대 회분 변화가 공여체-유래된 항-RSV 면역글로불린 생성물(예컨대, RSV IVIG)에 대해 관찰된 것 보다 현저히 낮다. 본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체에서, 모든 개개 항체 멤버는 RSV 관련 항원에 결합할 수 있고 폴리클로날 항체는 RSV 아형 A 및 B를 중화시킬 수 있다. 폴리클로날 항체의 각기 별개의 항체는 폴리클로날 항체 중의 임의의 다른 멤버에 의해 결합되지 않은 에피토프에 결합되는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체는 다가(multivalent) 방식으로 RSV 항원에 결합될 것이며, 이것은 일반적으로 상승적인 중화, 매크로파지에 의한 감염된 세포의 개선된 포식 및 감염된 세포에 대한 개선된 항체-의존적인 세포의 세포독성(ADCC) 뿐만 아니라 증가된 보체 활성화를 초래한다. 추가로, 본 발명의 폴리클로날 항체는 RSV IVIG인 경우에 비-결합 단백질에 의해 "희석"되지 않으며, 750 mg의 총 단백질/kg의 용량이 효과적으로 요구된다. 750 mg의 총 단백질 내에서 RSV-특이적인 항체의 비율은 알려져 있지 않으나, 최대 1%를 초과하여 구성할 것 같지 않으며, 대부분 그 미만일 것이다. 따라서, 팔리비주맵의 시험관내 효능이 RSV IVIG의 25-30배를 초과하는 것으로 산정될 때 (Johnson et al. 1997. J. Infect. Dis. 176: 1215-24), 이것은 RSV IVIG의 감소된 특이적 활성에 의해 상쇄된다. 따라서, RSV-IVIG에 함유된 면역글로불린 분자의 1%만이 RSV에 특이적이라면, RSV-IVIG 폴리클로날 항체의 활성 용량은 모노클로날 항체 팔리비주맵 보다 낮은 단지 7.5 mg/kg이다.
이러한 이유로, 본 발명의 재조합 폴리클로날 RSV-특이적 항체는 모노클로날 항체 보다 현저하게 보다 유력할 것으로 예상되며, 따라서 팔리비주맵 및 RSV IVIG의 유효 용량에 비해 낮은 본 발명의 폴리클로날 항체의 용량을 투여할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체도 고-위험 성인, 특히 골수 이식 수용자, 만성 폐병에 걸린 중년 및 개인의 예방 및 치료에 적합하게 고려된다. 본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체의 추가의 이점은, 개개 항체 멤버의 농도가 모노클로날 항체의 농도에 비해 현저하게 낮으므로 (사용된 용량이 동일한 경우에도), 개개 항체가 치료 중에 있는 개체의 면역 시스템에 의해 외래로서 인식될 가능성이 감소되고, 하나의 개개 항체가 환자의 면역 반응에 의해 제거된 경우조차도, 남아있는 항체 멤버가 완전하게 유지되므로 폴리클로날 항-RSV 항체의 중화 용량 또는 청소율에 영향을 미치지 않을 것이다.
본 발명의 구체예는 RSV 아형 A 및 B를 중화시킬 수 있는 재조합 폴리클로날 항-RSV 항체이고, 상기 폴리클로날 항체는 하나 이상의 RSV 외피 단백질 상에 있는 셋 이상의 상이한 에피토프에 공동으로 특이적으로 결합되는 별개의 항체 멤버를 포함한다. 바람직하게는, F 단백질이 셋 이상의 별개의 항체 멤버에 의해 특이적으로 결합되며 상기 에피토프는 상이한 항원성 부위에 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 추가의 구체예는 RSV 아형 A 및 B를 중화시킬 수 있는 재조합 폴리클로날 항-RSV 항체이고, 상기 폴리클로날 항체는 둘 이상의 RSV 외피 단백질에 대해 공동으로 특이적 반응성을 제공하는 별개의 항체 멤버를 포함한다. 2개의 외피 단백질은 RSV G 단백질, RSV F 단백질 및 RSV SH 단백질로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체가 항-G 및 항-F 반응성을 포함한다. 이러한 폴리클로날 항체의 항-G 및 항-F 반응성은 둘 이상의 별개의 항-G 항체 및 하나 이상의 별개의 항-F 항체로 이루어지는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 3개 이상의 별개의 항체가 상이한 에피토프에 결합되어 적어도 3개의 상이한 에피토프를 덮고, 항체들이 함께 RSV 아형 A 및 아형 B 균주를 동등하게 잘 중화시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체의 항-G 및 항-F 반응성이 하기 개시된 항-G 및 항-F 반응성의 임의의 조합으로 이루어진다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체가 하기 언급된 모든 항원성 부위/에피토프에 대한 항-G 및 항-F 반응성으로 이루어진다. 가능한 가장 넓은 특이성의 본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체를 수득하기 위해, 하나 이상, 바람직하게는 모든 항원성 부위가 하나를 초과하는 별개의 항체에 의해 덮히는 것이 요망된다. 결과적으로, 동일한 항원 또는 항원성 부위상의 여러 에피토프가 본 발명의 폴리클로날 항체의 별개의 멤버에 의해 결합되는 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체의 항-G 반응성과 관련하여, 이 반응성은 바람직하게 보존된 에피토프에 대하여 유도된다. 더욱 바람직하게는 항-G 반응성이 G-단백질 상의 보존된 에피토프에 특이적으로 결합될 수 있는 첫 번째 항-G 항체 및 G 단백질 시스테인-부화 영역(GCRR)에 특이적으로 결합될 수 있는 두 번째 항-G 항체로 이루어진다. 폴리클로날 항-RSV 항체는 바람직하게는 둘 이상의 별개의 항-G 항체를 포함하는데, 여기서 하나 이상의 첫 번째 항체가 G-단백질 상의 보존된 에피토프에 특이적으로 결합될 수 있고, 하나 이상의 두 번째 항체가 상이한 보존된 에피토프 또는 아형 A 또는 아형 B로 인식되는 그룹-특이적 에피토프에 특이적으로 결합될 수 있다. 바람직하게는, 폴리클로날 항체가 셋 이상의 별개의 항-G 항체를 포함하며, 여기서 첫 번째 항체는 G-단백질 상의 보존된 에피토프에 특이적으로 결합될 수 있고, 두 번째 항체는 아형 A의 G 단백질에 특이적으로 결합될 수 있으며, 세 번째 항체는 아형 B의 G 단백질에 특이적으로 결합될 수 있다. G 단백질 시스테인-부화 영역(GCRR)은 보존된 에피토프가 위치한 업스트립 13개 아미노산 영역 및 그룹 특이적인 에피토프가 위치한 영역과 부분적으로 중복된다. 따라서, 보존된 에피토프에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 및 그룹 특이적인 항체는 이들이 인식하는 에피토프가 GCRR에 존재하는 경우 GCRR에 결합될 수 있다. 바람직하게는, 보존된 에피토프 또는 균주 특이적인 에피토프에 대한 결합을 특징으로 하는 별개의 항체들 중 하나 이상이 GCRR을 인식한다. GCRR의 CX3C 모티프에 결합되는 항체는 바이러스 중화의 관점에서 특히 바람직하다. 그러나, CX3C 모티프에 결합되는 항체가 프랙트알킨(fractalkine) 및 다른 사람 CX3C 케모킨과 같은 다수의 다른 비관련 사람 항원에도 결합하여 요망되지 않는 부작용을 야기할 수도 있는데, 이것은 교차-반응성에 대해 상기 항체를 시험하고(예컨대, 실시예에서 특정 항체의 경우에 입증된 대로) 이후에 적합한 모델 시스템에서 동일한 항체를 시험하는 것이 온당한 접근법이 될 것임을 의미한다. 하여튼, 본 발명의 항체와 같은 주어진 약제를 부작용의 부재, 미비한 정도이거나 적어도 허용되는 정도인지의 확실성을 확립할 수 있도록 임상 시험에서 시험해 보는 것이 항상 필요할 것이다. 보존되고 그룹-특이적인 항-G 반응성에 추가하여, 균주 특이적인 에피토프에 대해 유도된 추가의 항-G 반응성도 본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체에 포함될 수 있다. 지난 5년내에 RSV 감염을 초래한 바이러스 균주상에 존재하는 가장 풍부한 균주-특이적인 에피토프에 대하여 유도된 균주-특이적인 항-G 반응성이 바람직하다. 본 발명에서, 균주-특이적인 에피토프는 제한된 수의 RSV 균주에만 존재하는 에피토프인 것으로 이해된다. 그룹-특이적인 및/또는 균주 특이적인 항-G 항체의 첨가는 본 발명의 항-RSV 항체에 추가의 다양성을 제공할 수 있고, G 단백질의 보존된 영역에 대해 반응성을 지니는 항체와 조합시에 상승효과를 유도할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항-G 항체가 직접 RSV를 중화시키고, 세포로의 바이러스의 유입을 차단하고, 세포 이동을 막고, 염증 반응을 억제하고/거나 융합체의 형성을 막는다.
본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체의 항-F 반응성과 관련하여, 반응성은 항원성 부위 I, II, IV, V, VI, C 또는 F1 중 하나 이상에 존재하는 하나 이상의 에피토프에 대해 유도되는 것이 바람직하다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 모든 이러한 항원성 부위/에피토프가 본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체의 별개의 항체에 의해 덮힌다. 바람직하게는, 본 발명의 항-F 항체가 RSV를 직접 중화시키고/거나 세포로의 바이러스의 유입을 차단하고/거나 융합체의 형성을 막는다.
조성물이 F 단백질 상의 모든 항원성 부위에 대해 유도된 결합 반응성을 포함하지 않는 본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체 조성물에서, 항원성 부위 II의 에피토프에 특이적으로 결합되는 하나 이상의 별개의 항-F 항체가 존재하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 부위 II-특이적 항-F 항체가 항체 팔리비주맵과 동일한 에피토프 또는 항원성 부위에 결합된다. 부위 II-특이적인 항체에 추가하여, 하나 이상의 별개의 부위 IV-특이적인 항-F 항체가 요망되며, 그러한 항체가 RSVF2-5와 동일한 에피토프에 결합되는 것이 바람직하다.
아형-특이적인 항-F 항체도 당 분야에 공지되어 있다. 그러나, F 단백질이 두 서브그룹 A 및 B간에 91%의 아미노산 유사성을 나타내므로, 아형-특이적인 항-F 항체는 항-G 항체에 비해 덜 풍부하다. 그러나, 이러한 균주-특이적인 항-F 항체는 가능한 넓은 특이성을 수득하는데 기여할 것이며 따라서 본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체의 요망되는 성분이다.
상기 언급된 RSV G 및 F 단백질 항원에 추가하여, RS 바이러스는 소형 소수성(SH) 단백질인 세 번째 외피 단백질을 발현시킨다. SH 단백질로부터의 펩티드에 대해 생성된 과다면역 혈청은 시험관내에서 RSV를 중화할 수 없는 것으로 나타났다 (Akerlind-Stopner et al. 1993 J. Med. Virol. 40: 112-120). 그러나, 단백질이 주로 감염된 세포상에서 발현되기 때문에, 본 발명자들은 SH 단백질에 대한 항체가 융합 억제에 효과를 지니고 RSV 감염에 대한 생체내 보호에 잠재적으로 관련될 것으로 여긴다. 이것은, SH 유전자가 없는 RSV 균주가 상기도에서 10배 덜 효과적으로 복제되는 사실에 의해 뒷받침된다 (Bukreyev et al. 1997 J. Virol. 71 :8973- 82).
본 발명의 추가의 구체예는 RSV 아형 A 및 B를 중화시킬 수 있고 항-SH 반응성, 및 항-G 및 항-F 반응성을 포함할 수 있는 폴리클로날 항-RSV 항체이다. SH 단백질의 아미노산 41 내지 64/65 (아형 A/B)의 범위에 있는 C-말단은 세포 표면에 노출된다. 따라서, 이 부분에 있는 에피토프에 대한 항-SH 반응성이 요망된다. SH 단백질의 C-말단은 아형 A 및 B로부터 변화되며, 따라서 본 발명의 폴리클로날 항체에서 아형 A 및 B 둘 모두에 대해 항-SH 반응성을 포함하는 것이 바람직하다. 이 SH 반응성은 둘 이상의 별개의 항-SH 항체에 의해 제공될 수 있으며, 첫 번째 항체는 SH 아형 A에 특이적으로 결합될 수 있고, 두 번째 항체는 SH 아형 B에 특이적으로 결합될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 폴리클로날 항-RSV 항체는 SH 아형 A 및/또는 B에 대한 특이적 반응성은 물론 G 단백질에 대한 특이적 반응성도 포함한다. G 단백질에 대한 반응성은 상기 언급된 임의의 반응성으로 이루어질 수 있다.
대안적인 구체예에서, SH 아형 A 및/또는 B에 대한 특이적 반응성은 상기 개시된 임의의 항-F 반응성과 조합되어 폴리클로날 항-RSV 항체를 구성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 폴리클로날 항-RSV 항체는 3개의 외피 단백질, F, G 및 SH 모두에 대한 반응성을 포함한다.
본 발명의 폴리클로날 항-RSV 항체를 구성하는 반응성은, 조합이 RSV 아형 A 및 B를 중화시킬 수 있는 한, 표 1에 요약된 항원/항원성 부위 및/또는 에피토프에 대한 특이적 결합 반응성을 지니는 별개의 항체의 임의의 가능한 조합을 구성할 수 있다. 바람직하게는, 사익 조합이 둘 이상의 RSV 외피 단백질에 대한 반응성을 함유한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리클로날 항체의 각기 개별의 항체 멤버가 그들 자신만의 중화 및/또는 항-염증 특성을 지닌다. 그러나 이러한 개개 특성이 없는 항체도 예를 들어 보체 활성화를 통해 RSV 청소에서 역할을 할 수 있다.
표 1: RSV 관련 항원, 항원성 부위 및 에피토프의 요약
Figure 112008069716179-PCT00001
Figure 112008069716179-PCT00002
바람직하게는, 본 발명의 폴리클로날 항체가 천연적으로 항체 분자를 발현시키지 않는 폴리클로날 세포주로부터의 단일 회분 또는 소수 회분으로서 생성된다 (재조합 폴리클로날 항체 발현이라고도 불림). 모노클로날 항체를 혼합시키는 것에 비해 재조합 폴리클로날 항체를 생성하는 이점 중 하나는 제한되지 않은 수의 별개 항체 분자를 동시에 생성하는 능력이다 (단일 모노클로날 항체를 제조하는 것과 유사한 비용으로). 따라서, 최종 생성물의 비용을 현저하게 증가시키지 않으며, 많은 수의 RSV 관련 항원에 대해 반응성을 지니는 항체를 포함할 수 있다. 특히 RSV처럼 복잡한 표적에 있어서, 생물학이 완전히 이해되지 않을 때, RSV에 대한 것만을 중화시키거나 보호하는 것으로 보여지지 않는 개개 항체들을 별개의 항체와 조합시켜 상승적인 효과를 유도할 수 있다. 따라서, 개개 항체가 RSV 관련 항원에 결합되는 것만이 기준이 되는 경우에(예컨대, RSV 감염된 세포에 결합됨에 의해 평가됨), 폴리클로날 항체 조성물에 상기 개시된 것들에 추가하여 별개의 항체를 포함시키는 것이 이로울 수 있다. 바람직하게는 상기 개시된 모든 폴리클로날 항-RSV 항체 조성물이 재조합 폴리클로날 항-RSV 항체(항-RSV rpAb) 조성물이다.
관련 항원으로 입증되지 않았으나 그럼에도 불구하고 가능성이 있는 RSV 표적 항원에 결합되는 잠재적으로 적당한 항체를 획득하는 한 가지 방법은 RSV에 감염된 공여체의 면역 반응에 의해 생성된 개개 항체들로 이루어진 폴리클로날 항체 조성물을 제공하는 것이다(충분한 면역 반응). RSV에 대해 충분한 면역 반응을 나타내는 항체를 수득하는 것에 추가하여, RSV 감염의 보호, 중화 및/또는 제거에 특히 관련될 것 같은 항원에 결합되는 항체의 포지티브 선택이 수행될 수 있다. 추가로, RSV의 보호, 중화 및/또는 제거에 관련될 것으로 여겨지는 특정 항원, 항원성 부위 또는 에피토프에 대한 항체가 공여체의 완전한 면역 반응에서 동정되지 않는 경우, 이러한 항체는 특정 항원을 이용한 공여체의 면역화/백신화에 의해 생성될 수 있다(선택된 면역 반응). 일반적으로, 중화는 플라크 감소, 미세중화 또는 융합 억제 검정과 같은 시험관내 중화 검정에 의해 평가된다 (예컨대, Johnson et al. 1997. 3. Infect. Dis. 176: 1215-24). 따라서, 이러한 검정 중 하나에서 현저한 효과를 지니는 항체 또는 항체 조성물은 네거티브 대조군에 비해 중화성인 것으로 고려된다. 보호는 일반적으로 예컨대 코튼 래트 모델 (예컨대, Johnson et al. 1997. J.Infect.Dis. 176: 1215-24) 또는 뮤린 모델 (예컨대, Taylor et al. 1984. Immunology 52, 137-142 and Mejias, et al. 2005. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 4700-4707)에서 생체내 챌린지 실험에 의해 평가된다. 생체내 챌린지 실험은 예방 형식으로 수행될 수 있으며, 이 때 항체는 바이러스 챌린지 전에 또는 치료제로서 투여되고, 항체는 바이러스 챌린지 후에 또는 둘의 조합으로서 투여된다.
본 발명의 폴리클로날 항체 조성물은 반드시 공지된 것은 아니거나 반드시 외피 단백질은 아닌 (항체가 감염된 세포에는 결합되나 선택된 항원 또는 항원성 부위에는 결합되지 않음) RSV 항원에 결합될 수 있는 항체들로 구성될 수 있으나, 여기서 항체는 예컨대 RSV에 감염된 하나 이상의 공여체로부터의 별개의 항체를 엔코딩하거나 RSV 감염증으로부터 회수되는 핵산 서열을 수득함에 의해 RSV 감염 이후에 완전한 면역 반응으로부터 얻어진다. 둘째로, 특정 항원, 항원성 부위 및/또는 에피토프에 결합되는 능력에 기초하여 선택된 동일한 충분한 면역 반응으로부터의 항체가 본 발명의 폴리클로날 항체에 포함될 수 있다. 셋째로, 특정 RSV 관련 항원으로 면역화/백신화된 하나 이상의 공여체로부터 수득된 VH 및 VL 쌍으로부터 엔코딩되어 이러한 공여체에서 "선택된" 면역 반응을 일으키는 별개의 항체들이 본 발명의 폴리클로날 항체 조성물에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명에 언급된 임의의 기술에 의해 유래된 항체가 단일 폴리클로날 항체로 조합될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 엔코딩하는 핵산이 사람 공여체로부터 얻어지고 생성된 항체는 완전히 사람 항체이다.
본 발명의 폴리클로날 항체 조성물 배후의 동기 부여는, 공여체가 RSV로 감염되는 경우, 항원에 대한 체액성 면역 반응이 일어나고, 이러한 항체는 적어도 일정 한도로 바이러스 청소에 기여하며, 이에 따라 폴리클로날 항체 생성물에 포함될 자격을 지닐 것이라는 점이다.
본 발명의 추가의 측면은 항-RSV rpAb를 제공하는 것이고, 여기서 별개의 항체 멤버의 조성물은 RSV 외피 항원에 대한 다양성, 친화력 및 특이성과 관련하여 체액성 면역 반응을 반영한다. 바람직하게는, 체액성 반응의 반영은 하기 중 하나 이상의 완수되는지를 확인함에 의해 입증된다 i) 상기 항-RSV rpAb에서 개개 항체 멤버의 VH 및 VL을 코딩하는 핵산 서열이 예를 들어 RSV 감염 이후에 RSV에 대한 체액성 면역 반응을 일으킨 공여체(들)로부터 유래된다; ii) 공여체(들)에 존재하는 VH 및 VL 코딩 서열의 본래 페어링이 유지되도록 VH 및 VL 코딩 서열이 공여체(들)로부터 단리된다; iii) CDR 영역이 가능한 한 다양하도록, rpAb의 개개 멤버를 코딩하는 VH 및 VL 쌍이 선택된다; 또는 iv) 항체 조성물이 포유동물에서 현저한 항체 반응을 유도하는 항원에 총괄적으로 결합되도록 항-RSV rpAb의 개개 멤버의 특이성이 선택된다. 바람직하게는, 항체 조성물이 상기 공여체(들)로부터의 혈청 샘플에서 현저한 항체 역가를 제공하는 항원, 항원성 부위 및/또는 에피토프에 총괄적으로 결합된다. 이러한 항원, 항원성 부위 및/또는 에피토프가 상기 표 1에 요약되어 있으나, 상기 개시된 대로, 비-외피 항원 뿐만 아니라 공지되지 않은 항원, 항원성 부위 및/또는 에피토프도 구성 요소가 될 수 있다. 바람직하게는, 공여체가 사람이고, 폴리클로날 항체는 완전한 사람 항체이다.
본 발명은 RSV 관련 항원에 결합 특이성을 지니는 전장 항체, Fab 단편 또는 다른 항체 단편으로서 발현될 수 있는 일련의 VH 및 VL 쌍을 동정하였다. 실시예 2의 표 5에 개시된 클론 번호에 의해 특정 VH 및 VL 쌍이 동정되었다. 표 5에서 동정된 VH 및 VL 쌍을 함유하는 항체는 완전한 사람 항체인 것이 바람직하다. 그러나, 요망되는 경우, 키메라 항체도 생성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체는 표 5에 나열된 VH 및 VL 쌍의 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 별개의 멤버로 이루어진다. 바람직하게는 CDR 영역이 표 5에 지적된 페어링으로 유지되고 요망되는 프레임워크로 삽입된다. 대안적으로, 첫 번째 클론의 중쇄로부터의 CDR 영역(CDRH)이 두 번째 클론(VH 및 VL 쌍의 스크램블링)의 경쇄로부터의 CDR 영역(CDRL)과 조합된다. CDR 영역도, 예를 들어 첫 번째 클론으로부터의 CDRL1 영역을 두 번째 클론으로부터의 CDRL2 및 CDRL3 영역과 조합시킴에 의해, 경쇄 또는 중쇄내에서 스크램블링될 수 있다. 이러한 스크램블링은 동일한 항원에 결합되는 클론 중에서 수행되는 것이 바람직하다. 본 발명의 CDR 영역은 예컨대 점 돌연변이에 의해 친화력 성숙될 수도 있다.
가변 중쇄 및 가변 경쇄 코딩 쌍의 단리 및 선택
항-RSV 재조합 폴리클로날 항체 조성물을 생성하는 공정은 적합한 공급원으로부터 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 코딩하는 서열을 단리시켜, VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리를 생성하는 것을 포함한다. 일반적으로, VH 및 VL 코딩 서열을 수득하기에 적합한 공급원은 RSV에 감염된 동물 또는 사람으로부터의 혈액, 비장, 또는 골수 샘플과 같은 세포 분획을 함유하거나 RSV 감염증으로부터 또는 RSV 균주 또는 이러한 균주로부터 유래된 단백질 또는 DNA로 면역화/백신화된 동물 또는 사람으로부터 회수된 림프구이다. 바람직하게는, 분획을 함유하는 림프구가 사람 또는 사람 면역글로불린 유전자를 지니는 유전자이식 동물로부터 수집된다. 세포 분획을 함유하는 수집된 분획은 특정 림프구 군집, 예컨대 B 림프구 계통으로부터의 세포를 수득하기 위해 추가로 부화될 수 있다. 바람직하게는, 부화가 자기 비드 세포 분류(MACS) 및/또는 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 이용하여 수행되며, 이것은 예를 들어 B 세포, 혈장 모세포 및/또는 혈장 세포의 경우에 계통-특이적인 세포 표면 마커 단백질의 이점을 지닌다. 바람직하게는, 세포 분획을 함유하는 림프구가 B 세포, 혈장 모세포 및/또는 혈장 세포에 대해 부화된다. 더욱 바람직하게는, 높은 CD38 발현 및 중간체 CD19 및/또는 CD45 발현을 지니는 세포가 혈액으로부터 단리된다. 이러한 세포는 종종 순환 혈장 세포, 조기 혈장 세포 또는 혈장 모세포라고 불린다. 다른 용어가 상호교환적으로 사용될 수 있으나, 용이하게 하기 위해 본 발명에서는 이들을 단지 혈장 세포라고 부른다.
VH 및 VL 코딩 서열의 단리는 전통적인 방식으로 수행될 수 있고, 여기서 VH 및 VL 코딩 서열은 임의로 벡터에 조합되어 VH 및 VL 코딩 서열 쌍의 조합적인 라이브러리를 생성한다. 그러나, 본 발명에서, RSV 감염시에 체액성 면역 반응에서 제공되는 항체의 다양성, 친화력 및 특이성을 반영하는 것이 바람직하다. 이것은 공여체에 원래 존재하는 VH 및 VL 페어링의 유지를 수반함으로써 각 쌍이 서열이 단리된 공여체에 의해 생성된 항체에 원래 존재하는 VH 및 VL 쌍에 상응하는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 엔코딩하는 서열 쌍의 레퍼토리를 제공한다. 이것은 VH 및 VL 엔코딩 서열의 동족체 쌍으로도 불리며 항체는 동족체 항체라고 불린다. 바람직하게는 조합이거나 동족체인 본 발명의 VH 및 VL 코딩 쌍이 사람 공여체로부터 수득되며, 따라서 서열이 완전히 사람이다.
VH 및 VL 엔코딩 서열의 동족체 쌍을 생성하기 위한 여러 상이한 접근법이 있으며, 한 접근법은 림프구-함유 세포 분획으로부터 분류된 단일 세포로부터 VH 및 VL 엔코딩 서열을 증폭시키고 단리하는 것을 포함한다. VH 및 VL 엔코딩 서열은 따로 증폭되고 다음 단계에서 페어링될 수 있거나 증폭 동안 페어링될 수 있다 (Coronella et al. 2000. Nucleic Acids Res. 28: E85; Babcook et al 1996. PNAS 93: 7843-7848 and WO 05/042774). 두 번째 접근법은 VH 및 VL 엔코딩 서열을 세포내(in-cell) 증폭하고 페어링하는 것을 포함한다 (Embleton et al. 1992. Nucleic Acids Res. 20: 3831-3837; Chapal et al. 1997. BioTechniques 23: 518-524). 세 번째 접근법은 용혈성 플라크 검정을 VH 및 VL cDNA의 클로닝과 조합시킨 선택된 림프구 항체 방법(SLAM)이다 (Babcook et al. 1996. PNAS 93 :7843-7848). 공여체에서의 VH 및 VL 서열 쌍의 다양성과 닮은 VH 및 VL 엔코딩 서열 쌍의 레퍼토리를 수득하기 위해, VH 및 VL 쌍을 가능한 한 거의 스크램블링하지 않은 고-처리량 방법이 바람직하며, 예컨대 WO 05/042774호에 개시되어 있다 (본원에 참조로서 포함됨).
본 발명의 바람직한 구체예에서, 멤버 쌍이 RSV 감염으로부터 초래된 체액성 면역 반응의 원인이 되는 유전자 쌍을 반영하는 VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리가 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 생성된다: i) 림프구-함유 세포 분획을 RSV에 감염된 공여체로부터 제공하거나 RSV 감염증으로부터 회수하는 단계; ii) 상기 세포 분획으로부터 B 세포 또는 혈장 세포를 임의로 분화시키는 단계; iii) 상기 세포 분획으로부터의 세포를 개별적으로 다수의 용기로 분배시키는 것을 포함하여, 단리된 단일 세포의 군집을 수득하는 단계; iv) VH 및 VL 코딩 쌍의 결합을 다중 중복 연장 RT-PCR 절차로 상기 단리된 단일 세포로부터 유래된 주형을 이용하여 증폭하고 실행시키는 단계 및 v) 결합된 VH 및 VL 코딩 쌍의 네스티드 PCR을 임의로 수행하는 단계. 바람직하게는, 단리된 동족체 VH 및 VL 코딩 쌍을 하기 개시된 스크리닝 절차로 처리한다.
일단 VH 및 VL 서열 쌍이 생성되면, VH 및 VL 쌍을 엔코딩하는 서열을 RSV 관련 항원에 대한 결합 반응성으로 스크리닝하는 절차가 수행된다. 바람직하게는 RSV 관련 항원이 RSV 외피 단백질이고, 특히 RSV G 단백질, RSV F 단백질 및 RSV SH 단백질이다. VH 및 VL 서열 쌍이 조합인 경우, 스크리닝 이전에 RSV에 결합되는 항체 단편을 코딩하는 VH 및 VL 쌍을 부화시키기 위해 파지 디스플레이 절차를 적용시킬 수 있다.
RSV에 감염시 체액성 면역 반응에서 생성된 항체의 다양성, 친화력 및 특이성을 반영하기 위해, 본 발명은 가능한 가장 넓은 다양성을 수득하기 위해 동족체 쌍에 대한 스크리닝 절차를 개발하였다. 스크리닝 목적으로, 동족체 VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리를 적합한 숙주 세포로 트랜스펙션된 세균 또는 포유동물 스크리닝 벡터를 이용하여 항체 단편(예컨대, scFv 또는 Fab) 또는 전장 항체로서 개별적으로 발현시킨다. Fab/항체의 레퍼토리가 하나 이상의 RSV 균주의 바이러스 입자에 대한 반응성에 대하여 스크리닝된다. 바람직하게는, 적어도 2개의 균주, 아형 A 중 하나 및 아형 B 중 하나를 이용한다. 아형 A 균주는 예를 들어 Long (ATCC VR-26), A2(ATCC VR-1540) 또는 보다 최근의 Long-유사 아형 A 단리물이다. 아형 B 균주는 예를 들어 18537 (ATCC VR-1580), B1 (ATCC VR-1400), 9320 (ATCC VR-955) 또는 보다 최근의 18537-유사 단리물이다. 동시에, Fab/항체의 레퍼토리가 RSV 항원으로부터 유래된 재조합 G 단백질, 재조합 F 단백질 및 펩티드와 같은 선택된 항원에 대해 스크리닝된다. 항원성 펩티드는 예를 들어 G 단백질의 보존된 영역 (아미노산 164-176) 및 G 단백질의 시스테인 코어 영역 (아형 A 및 아형 B 균주의 아미노산 171-187), 및 SH-단백질의 세포외 영역 (아형 A의 아미노산 42-64 및 아형 B의 아미노산 42-65)으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 펩티드가 스크리닝 동안 비즈 또는 플레이트 상으로의 고정을 촉진하기 위해 비오티닐화된다. 대안적인 고정 수단이 또한 이용될 수 있다. 항원은 RSV 생물학의 지식에 기초하여 선택되고 이러한 항원에 결합될 수 있는 항체의 예상되는 중화 및/또는 보호 효과가 잠재적으로 제공될 수 있다. 이러한 스크리닝 절차는 조합 파지 디스플레이 라이브러리에 똑같이 적용될 수 있다. 스크리닝에 이용된 재조합 G 및/또는 F 단백질은 세균, 곤충 세포, 포유동물 세포 또는 다른 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있다. G 및/또는 F 단백질은 가용성 단백질로서 발현될 수 있거나 (트랜스막 영역 없이) 안정성을 증가시키기 위해 제3의 단백질로 융합될 수 있다. G 및/또는 F 단백질이 융합 태그(tag)로 발현되는 경우에, 융합 파트너는 스크리닝 전에 절단될 수 있다. 바람직하게는, 아형 A 및 아형 B 둘 모두의 대표적인 G 및/또는 F 단백질이 스크리닝을 위해 발현되고 이용된다. 추가로, 균주-특이적인 G 단백질이 스크리닝을 위해 발현되고 이용될 수 있다. 상기 개시된 일차 스크리닝에 추가하여, 선택된 서열 중 어느 것도 잘못된 포지티브를 엔코딩하지 않음을 확인하기 위해, 이차 스크리닝이 수행될 수 있다. 두 번째 스크리닝에서, 첫 번째 스크리닝에서 동정된 모든 RSV/항원 결합 VH 및 VL 쌍이 바이러스 균주 및 선택된 항원 둘 모두에 대해 다시 스크리닝된다. 일반적으로, 면역학적 검정이 본 발명에서 수행되는 스크리닝에 적합하다. 이러한 검정은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 ELISPOTS, ELISA, RLISA, 막 검정(예컨대, 웨스턴 블롯), 필터상에서의 어레이 및 FACS로 구성된다. 검정은 임의의 사전 부화 단계 없이 수행될 수 있고, VH 및 VL 쌍을 엔코딩하는 서열로부터 생성된 폴리펩티드를 이용한다. VH 및 VL 코딩 상의 레퍼토리가 동족체 쌍인 경우에, 스크리닝에 앞서, 예컨대 파지 디스플레이에 의한 어떠한 부화도 요구되지 않는다. 그러나, 조합 라이브러리의 스크리닝에서, 면역검정이 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 세균 표면 디스플레이, 효모 디스플레이, 진핵 바이러스 디스플레이, RNA 디스플레이 또는 공유 디스플레이와 같은 부화 방법과 함께 또는 그 이후에 수행되는 것이 바람직하다 (FitzGerald, K., 2000. Drug Discov. Today 5, 253-258에서 검토됨).
스크리닝에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 엔코딩하는 서열은 일반적으로 서열화되고, 가변 영역의 다양성에 대해 분석된다. 특히, CDR 영역의 다양성이 흥미로부나, VH 및 VL 과(family) 표시도 흥미롭다. 이러한 분석에 기초하여, 하나 이상의 공여체로부터 단리된 RSV 결합 항체의 전체적인 다양성을 나타내는 VH 및 VL 쌍을 엔코딩하는 서열이 선택된다. 바람직하게는, 모든 CDR 영역(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)에서 차이를 지니는 서열이 선택된다. 상이한 VH 및 VL 과에 속하는 하나 이상의 동일하거나 또는 매우 유사한 CDR 영역을 지니는 서열이 존재하는 경우, 이들도 선택된다. 바람직하게는, 가변 중쇄의 적어도 CDR3 영역(CDRH3)이 선택된 서열 쌍 사이에서 상이하다. 가능하게는, VH 및 VL 서열 쌍의 선택이 CDRH3 영역의 가변성만을 근거로 할 수 있다. 서열의 프라이밍 및 증폭 동안, 가변 영역의 프레임워크 영역, 특히 첫 번째 프레임워크 영역에서 돌연변이가 발생할 수 있다. 바람직하게는, 첫 번째 프레임워크 영역에서 발생한 에러가 수정되어, 서열이 공여체의 서열과 완전히 일치하거나 적어도 98% 일치할 것이 보장되며, 예컨대 서열이 완전한 사람이 된다.
VH 및 VL 쌍을 엔코딩하는 선택된 서열의 집합의 전체적인 다양성이 RSV 감염에 대한 체액성 반응에서의 유전자 수준에서 보여진 다양성을 고도로 대표하는 것이 확인될 때, 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍의 집합으로부터 발현된 항체의 전체적인 특이성도 RSV 감염된 공여체에서 생성된 항체의 특이성을 대표할 것으로 예상된다. 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍의 집합으로부터 발현된 항체의 특이성이 감염된 공여체에 의해 생성된 항체의 특이성을 대표하는지의 표시는, 바이러스 균주 및 공여체 혈액의 선택된 항원에 대한 항체 역가를 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍의 집합으로부터 발현된 항체의 특이성과 비교함에 의해 수득될 수 있다. 추가로, 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍의 집합으로부터 발현된 항체의 특이성을 추가로 분석할 수 있다. 특이성의 정도는 결합 반응성이 검출될 수 있는 상이한 항원의 수와 관련된다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 선택된 VH 및 VL 쌍의 집합으로부터 발현된 개별적인 항체의 특이성은 에피토프 맵핑에 의해 분석된다.
에피토프 맵핑은 서로 반드시 배타적이지 않은 수많은 방법에 의해 수행될 수 있다. 항체 클론의 에피토프-특이성을 맵핑하는 한 가지 방법은 표적 항원의 일차 구조로부터 유래된 다양한 길이의 펩티드와의 결합을 평가하는 것이다. 이러한 펩티드는 선형 및 형태적일 수 있고 ELISA, FLISA 및 표면 플라스몬 공명(SPR, Biacore)을 포함하는 다수의 검정 포맷에 이용될 수 있다. 게다가, 펩티드는 표적 항원의 예컨대 세포외 영역 또는 보존된 영역을 나타내는 이용가능한 서열 및 구조 데이터를 이용하여 이론적으로 선택될 수 있거나, 선택된 부분 또는 모든 항원을 표시하는 중복 펩티드의 패널로서 설계될 수 있다 (Meloen RH, Puijk WC, Schaaper WMM. Epitope mapping by PEPSCAN. In: Immunology Methods Manual. Ed Iwan Lefkovits 1997, Academic Press, pp 982-988). 하나 이상의 상기 펩티드를 지니는 항체 클론의 특이적 반응성은 일반적으로 에피토프 특이성을 나타낼 것이다. 그러나, 펩티드는 많은 경우에 단백질성(proteinaceous) 항원에 대해 생성된 항체에 의해 인식되는 에피토프의 불충분한 모사체(mimic)인데, 그 이유는 형태의 결여 및 항체 및 펩티드에 비해 항체 및 단백질 항원간에 일반적으로 더 큰 묻혀 있는(buried) 상호작용 표면적 때문이다. 단백질 항원에 대한 특이성을 직접 정의할 수 있는 에피토프 맵핑을 위한 두 번째 방법은 존재하는 잘 규정된 항체를 이용한 선택적인 에피토프 차폐에 의한 것이다. 차단 이후 항원에 대한 두 번째 프로빙 항체의 감소된 결합은 일반적으로 공유되거나 중복된 에피토프를 나타낸다. 선택적인 차폐에 의한 에피토프 맵핑은 당 분야에 널리 공지된 ELISA 및 Biacore를 포함하나 이로 제한되지 않는 다수의 면역검정에 의해 수행될 수 있다 (예컨대, Ditzel et al. 1997. J. MoI. Biol. 267:684-695; Aldaz-Carroll et al. 2005. J. Virol. 79: 6260-6271). 항-바이러스 항체의 에피토프 특이성을 결정하는 또 다른 가능한 방법은 항체의 존재하에 바이러스 도피 돌연변이의 선택이다. 상기 도피 돌연변이로부터 관심있는 유전자(들)를 서열화시켜 항원(들)에 있는 어떤 아미노산이 항체에 의한 인식에 중요한지를 일반적으로 밝히고, 이에 따라 에피토프(의 일부)를 구성할 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 항-RSV rpAb에 포함되는 개개 멤버가, 항체 조성물의 특이성이 총괄하여 RSV 아형 A 및 B 뿐만 아니라 RSV 관련 항원 단백질 F 및 G, 및 바람직하게는 SH도 덮도록 선택된다.
선택된 V H 및 V L 코딩 쌍으로부터 재조합 폴리클로날 항체의 제조
본 발명의 폴리클로날 항체는 하나 또는 소수의 바이오반응기 또는 이의 등가물에서 폴리클로날 발현 세포주로부터 생성된다. 이러한 접근법 이후에, 항-RSV rpAb가 반응기로부터 공정 동안 항-RSV rpAb를 구성하는 개개 멤버를 분리시킬 필요 없이 단일 제조물로서 정제될 수 있다. 폴리클로날 항체가 하나를 초과하는 바이오반응기에서 제조되는 경우, 각 바이오반응기로부터의 상청액은 정제 전에 푸울링될 수 있거나, 정제된 항-RSV rpAb가 각 바이오반응기로부터의 개별적으로 정제된 상청액으로부터 수득된 항체를 푸울링함에 의해 수득될 수 있다.
재조합 폴리클로날 항체를 제조한 한 방법이 WO 2004/061104호 및 WO 2006/007850호 (PCT/DK2005/000501)에 개시되어 있다 (이들 참조문헌은 본원에 참조로서 포함된다). 여기에 개시된 방법은 항체 코딩 서열의 개개 숙주 세포의 게놈으로의 부위-특이적인 통합에 기초하며, VH 및 VL 단백질 사슬이 제조 동안 이들의 원래 페어링으로 유지되는 것을 확인한다. 더욱이, 부위-특이적인 통합은 위치 효과를 최소화하므로 폴리클로날 세포주에서 개개 세포의 성장 및 발현 특성은 거의 유사할 것으로 예상된다. 일반적으로, 상기 방법은 하기를 포함한다: i) 하나 이상의 리콤비나아제(recombinase) 인식 부위를 지니는 숙주 세포; ii) 숙주 세포에 적합한 하나 이상의 리콤비나아제 인식 부위를 지니는 발현 벡터; iii) 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍을 스크리닝 벡터에서 발현 벡터로 이동시켜 발현 벡터의 집합을 생성함으로써 전장 항체 또는 항체 단편이 벡터로부터 발현되도록 함 (이러한 이동은 스크리닝 벡터가 발현 벡터와 동일한 경우에는 필요하지 않을 수 있다); iv) 숙주 세포를 발현 벡터의 집합 및 숙주 세포의 게놈에 있는 리콤비나아제 인식 부위를 벡터에 있는 것과 조합시킬 수 있는 리콤비나아제를 코딩하는 벡터로 트랜스펙션; v) 트랜스펙션된 숙주 세포로부터 폴리클로날 세포주 수득/생성 및 vi) 폴리클로날 세포주로부터 폴리클로날 항체 발현 및 수집.
바람직하게는 CHO 세포, COS 세포, BHK 세포, 골수종 세포(예컨대, Sp2/0 또는 NS0 세포)와 같은 포유동물 세포, NIH 3T3와 같은 섬유모세포, 및 HeLa 세포, HEK 293 TPVH 또는 PER.C6과 같은 무한증식되는 사람 세포가 이용된다. 그러나, 비-포유동물 진핵 또는 원핵 세포, 예컨대 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 진균, 대장균(E.coli) 등도 적용될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 이의 게놈에 하나 이상의 적합한 리콤비나아제 인식 부위를 포함한다. 숙주 세포는 인터그란트(integrant)에 대한 선택이 가능하도록 통합 부위에 작동가능하게 결합된 선택 모드도 함유하여야 한다 (즉, 통합 부위에 항-RSV Ab 발현 벡터 또는 발현 벡터 단편의 통합된 복사체를 지니는 세포). 게놈의 미리 결정된 위치에 FRT 부위를 지니는 세포의 제조물이 예컨대 US 5,677,177호에 개시되어 있다. 바람직하게는, 숙주 세포가 인터그란트의 높은 발현을 가능하게 하는 부위에 있는 단일 통합 부위만을 지닌다 (소위 핫-스팟(hot-spot)).
적합한 발현 벡터는 숙주 세포의 리콤비나아제 인식 부위(들)와 매칭되는 재조합 인식 부위를 포함한다. 바람직하게는 리콤비나아제 인식 부위가 숙주 세포의 구축에 이용된 선택 유전자와 상이한 적합한 선택 유전자에 결합된다. 선택 유전자는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 글루타민 합성효소 유전자(GS), 디히드로폴레이트 환원효소 유전자(DHFR), 및 네오마이신을 포함하고, 여기서 GS 및 DHFR은 삽입된 VH 및 VL 서열의 유전자 증폭에 이용될 수 있다. 벡터는 두 상이한 리콤비나아제 인식 부위도 함유할 수 있어서 벡터의 완전한 통합 대신에 항체 코딩 서열의 리콤비나아제-매개된 카세트 교환(RMCE)를 가능하게 한다. RMCE는 문헌[Langer et al 2002. Nucleic Acids Res. 30, 3067-3077; Schlake and Bode 1994. Biochemistry 33, 12746-12751 and Belteki et al 2003. Nat. biotech. 21, 321- 324]에 개시되어 있다. 적합한 리콤비나아제 인식 분위는 당 분야에 널리 공지되어 있고, FRT, lox 및 attP/attB 부위를 포함한다. 바람직하게는 통합 벡터가 이소형-엔코딩 벡터이고, 여기서 불변 영역(바람직하게는 인트론 포함)은 VH 및 VL 코딩 쌍이 스크리닝 벡터로부터 이동하기 전에 벡터에 존재한다 (또는 스크리닝이 전장 항체 상에서 수행된 경우 불변 영역이 이미 스크리닝 벡터에 존재한다). 벡터에 존재하는 불변 영역은 전체 중쇄 불변 영역(CH1에서 CH3 또는 CH4로)이거나 항체의 Fc 부분을 엔코딩하는 불변 영역(CH2에서 CH3 또는 CH4로)일 수 있다. 경쇄 카파 및 람다 불변 영역도 이동 전에 존재할 수 있다. 존재하는 경우, 존재하는 불변 영역의 수의 선택은 이용되는 스크리닝 및 이동 시스템에 의존적이다. 중쇄 불변 영역은 이소형 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgM, IgD 및 IgE로부터 선택될 수 있다. 바람직한 이소형은 IgGl 및/또는 IgG3이다. 추가로, 항-RSV 항체-엔코딩 핵산의 부위-특이적인 통합을 위한 발현 벡터는 VH 및 VL 사슬 각각의 높은 발현 수준을 지시하는 적합한 프로모터 또는 등가 서열을 함유한다. 도 3은 수많은 다른 설계가 가능하나, 발현 벡터를 설계하는 가능한 한 가지 방법을 설명한다.
스크리닝 벡터로부터 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍의 이동은 통상적인 제한 효소 절단 및 라이게이션에 의해 수행될 수 있어서, 각 발현 벡터 분자가 하나의 VH 및 VL 코딩 쌍을 함유한다. 바람직하게는 VH 및 VL 코딩 쌍이 개별적으로 이동하나, 이들은 요망되는 경우 한 덩어리로(in-mass) 이동할 수 있다. 모든 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍이 발현 벡터로 이동하면, 발현 벡터의 집합 또는 라이브러리가 수득된다. 대안적인 이동 방법도 필요한 경우 이용될 수 있다. 스트리닝 벡터가 발현 벡터와 동일한 경우, 발현 벡터의 라이브러리는 스크리닝/발현 벡터에 놓여진, 스크리닝 동안 선택된 VH 및 VL 서열 쌍으로 구성된다.
핵산 서열을 숙주 세포로 트랜스펙션하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 부위-특이적인 통합을 확인하기 위해, 적합한 리콤비나아제가 역시 숙주 세포에 제공되어야 한다. 이것은 바람직하게 리콤비나아제를 엔코딩하는 플라스미드의 공-트랜스펙션에 의해 확립된다. 적합한 리콤비나아제는 예를 들어 상응하는 리콤비나아제 인식 부위를 지니는 숙주 세포/벡터 시스템과 함께 이용되는, Flp, Cre 또는 파지 ΦC31 인터그라아제이다. 숙주 세포는 벌크(bulk)로 트랜스펙션될 수 있으며, 이것은 발현 벡터의 라이브러리가 하나의 단일 반응에서 세포주로 트랜스펙션됨으로써 폴리클로날 세포주를 수득함을 의미한다. 대안적으로, 발현 벡터의 집합은 숙주 세포로 개별적으로 트랜스펙션될 수 있어서 개개 세포주의 집합을 생성한다 (각 세포주가 특유의 특이성을 지니는 항체를 생성한다). 트랜스펙션시에 생성된 세포주(개개 또는 폴리클로날)를 이후에 부위 특이적 인터그란트에 대해 선택하고, 이들이 트랜스펙션 이전에 현탁액 및 무혈청 배지에서 성장하는 특성을 이미 지니고 있지 않았다면, 현탁액 및 무혈청 배지에서 성장하도록 적응시킨다. 트랜스펙션이 개별적으로 수행되는 경우, 개개 세포주를 이들의 성장 특성 및 항체 생성에 대해 추가로 분석한다. 바람직하게는, 유사한 증식율 및 항체 발현 수준을 지니는 세포주를 폴리클로날 세포주의 생성을 위해 선택한다. 이후 개개 세포주를 미리 결정된 비율로 혼합시킴에 의해 폴리클로날 세포주를 생성한다. 일반적으로, 폴리클로날 마스터 세포 뱅크(pMCB), 폴리클로날 리서치 세포 뱅크(pRCB) 및/또는 폴리클로날 워킹 세포 뱅크(pWCB)가 폴리클로날 세포주로부터 구축된다. 폴리클로날 세포주는 개개 세포주를 미리 결정된 비율로 혼합시킴에 의해 생성된다. 폴리클로날 세포주를 앰플로 분배시켜 폴리클로날 리서치 세포 뱅크(pRCB) 또는 마스터 세포 뱅크(pMCB)를 생성하고, 이로부터 폴리클로날 워킹 세포 뱅크(pWCB)가, 리서치 또는 마스터 세포 뱅크로부터의 세포를 확장시킴에 의해 생성될 수 있다. 리서치 세포 뱅크가 주로 개념 연구의 증거가 되는데, 여기서 폴리클로날 세포주는 마스터 세포 뱅크의 폴리클로날 세포주 만큼 많은 개개 항체를 포함하지 않을 수 있다. 일반적으로, pMCB는 생성 목적을 위해 pWCB를 구축하기 위해 추가로 확장된다. 일단 pWCB가 고갈되면, pMCB로부터의 새로운 앰플이 새로운 pWCB를 구축하기 위해 확장될 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 본 발명의 재조합 폴리클로날 항-RSV 항체를 발현시킬 수 있는 폴리클로날 세포주이다.
본 발명의 추가의 구체예는 각 개개 세포가 단일 VH 및 VL 코딩 쌍을 발현시킬 수 있는 폴리클로날 세포주이고, 폴리클로날 세포주는 전체로서 VH 및 VL 엔코딩 쌍의 집합을 발현시킬 수 있으며, 여기서 각 VH 및 VL 쌍은 항-RSV 항체를 엔코딩한다. 바람직하게는 VH 및 VL 코딩 쌍의 집합이 본 발명의 방법에 따라 생성된 동족체 쌍이다.
본 발명의 재조합 폴리클로날 항체는, pWCB로부터의 하나의 앰플을 적합한 배지에서 항체의 충분한 발현을 허용하는 기간 동안 배양시킴에 의해 발현되고, 여기서 폴리클로날 세포주는 안정하게 유지된다 (윈도우는 약 15일 내지 50일이다). 유가식(feed) 회분 또는 관류와 같은 배양 방법이 이용될 수 있다. 재조합 폴리클로날 항체를 배양 배지로부터 수득하고 통상적인 정제 기술로 정제한다. 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 및 겔 여과와 같은 후속적인 정제 단계와 조합된 친화력 크로마토그래피가 종종 IgG의 정제를 위해 이용되었다. 정제 이후에, 폴리클로날 항체 조성물 중 모든 개개 멤버의 존재를, 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피에 의해 평가한다. 폴리클로날 항체 조성물의 특성화는 WO 2006/007853호 (PCT/DK2005/000504)에 상세하게 개시되어 있다 (본원에서 참조로서 포함됨).
재조합 숙주에서 항체의 혼합물을 발현시키는 대안적인 방법이 WO 04/009618호에 개시되어 있다. 이 방법은 단일 세포주로부터 동일한 경쇄와 연합된 상이한 중쇄를 지니는 항체를 생성한다. 이러한 접근법은 항-RSV rpAb가 조합 라이브러리로부터 생성되는 경우에 적용될 수 있다.
치료 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 활성 성분으로서 항-RSV rpAb 또는 항-RSV 재조합 폴리클로날 Fab 또는 또 다른 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물이다. 바람직하게는, 이러한 조성물의 활성 성분이 본 발명에 개시된 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체이다. 이러한 조성물은 RSV 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 것이다. 바람직하게는 약제학적 조성물이 사람, 집 동물 또는 애완 동물에게 투여된다.
약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
항-RSV rpAb 또는 이의 폴리클로달 단편이 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 또는 부형제 내에서 단위 용량 형태로 투여될 수 있다. RSV에 감염된 환자 또는 RSV에 감염될 경우 매우 위험할 수 있는 환자에게 투여되는 적합한 제형 또는 조성물을 제공하기 위해 통상적인 조제 실무가 적용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 투여는 예방용이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 투여는 치료용이며, 이것은 RSV 감염과 관련된 징후의 발병 이후에 이것이 투여됨을 의미한다. 임의의 적합한 투여 경로가 적용될 수 있고, 예를 들어 투여는 비경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 근내, 복막내, 비내, 에어로솔, 좌제, 또는 경구 투여일 수 있다. 예를 들어, 약제학적 제형은 액체, 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있고; 경구 투여를 위해, 제형은 정제, 캡슐, 츄잉 검 또는 파스타의 형태일 수 있으며, 비내 제형의 경우에, 분말, 점비제 또는 에어로솔의 형태일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본질적으로 공지된 방식으로 제조되며, 예를 들어 통상적인 용해, 냉동건조, 혼합, 과립화 또는 당제(confectioning) 공정에 의해 제조된다. 약제학적 조성물은 통상적인 조제 실무에 따라 제형화될 수 있다 (참조, 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York, NY).
바람직하게는 활성 성분의 용액 또는 현탁액, 및 바람직하게는 등장성 수용액 또는 현탁액을 이용하여 본 발명의 약제학적 조성물을 제조한다. 활성성분만을 포함하거나 만니톨과 같은 담체와 함께 포함하는 냉동건조된 조성물의 경우, 이러한 용액 또는 현탁액은 가능하다면 사용 전에 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 살균될 수 있고/거나 부형제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 및/또는 에멀젼화제, 용해제, 삼투압을 조절하기 위한 염 및/또는 완충액을 포함할 수 있고, 예를 들어 통상적인 용해 또는 냉동건조 공정에 의해 그 자체로 공지되어 있는 방식으로 제조된다. 상기 용액 또는 현탁액은 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴과 같은 점도-증가 물질을 포함할 수 있다.
살균 조건하에 통상적인 방식으로 주사 조성물을 제조한다: 조성물을 앰플 또는 바이알에 도입하고 컨테이너를 밀봉하기 위해서도 동일하게 적용된다.
활성 성분을 고체 담체와 조합하고, 요망되는 경우 생성된 혼합물을 과립화하고, 요망되거나 필요한 경우 적합한 부형제를 첨가한 후에 혼합물을 셸락, 당 또는 둘 모두로 코팅될 수 있는 정제, 알약 또는 캡슐로 가공함에 의해 경구 투여용 약제학적 조성물을 수득할 수 있다. 활성 성분이 결정된 양으로 확산되거나 방출될 수 있도록 이들을 플라스틱 캐리어에 혼입시키는 것도 가능하다.
약제학적 조성물은 약 1% 내지 약 95%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 90%의 활성 성분을 포함한다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 예를 들어 단위 용량 형태, 예컨대 앰플, 바이알, 좌제, 정제, 알약 또는 캡슐의 형태일 수 있다. 제형은 사람 개체에게 치료적 또는 예방 유효량으로 투여되어 (예컨대, 병리 상태를 예방, 제거 또는 감소시키는 양) 질병 또는 질환에 대한 치료를 제공한다. 투여되는 치료제의 바람직한 용량은 RSV 감염의 심한 정도, 특정 환자의 전체적인 건강 상태, 화합물 부형제의 제형 및 이의 투여 경로와 같은 변수에 의존적일 것이다.
본 발명에 따른 조성물의 치료 용도
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 포유동물에서 질병의 치료, 경감 또는 예방에 이용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물로 치료 또는 예방될 수 있는 상태로는 RSV에 감염되었거나, RSV에 감염될 위험이 있는 환자, 특히 RSV에 감염될 경우 매우 위험할 수 있는 환자의 예방 및 치료가 있다. 고-위험 환자는 예를 들어, 유아 및 소아이다. 특히 미숙아 및 만성 폐병 또는 선천성 심장병과 같은 건강상의 문제가 있는 소아는 RSV 감염 이후에 세기관지염 및 폐렴과 같은 심각한 질병에 걸릴 위험이 가장 크다. 또한 면역약화된 성인, 특히 골수 이식 수용자, 만성 폐병에 걸린 중년 및 개인과 같은 고-위험 성인이 본 발명에 따른 약제학적 조성물로 바람직하게 예방 또는 치료적 처치를 받을 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 유효량의 본 발명의 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에서 RSV 감염과 관련된 하나 이상의 징후를 예방, 치료 또는 경감시키는 방법이다.
본 발명의 추가의 구체예는 포유동물에서 RSV 감염과 관련된 하나 이상의 징후를 치료, 경감 또는 예방하기 위한 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체의 용도이다.
바람직하게는, 상기 구체예에서 포유동물이, 사람, 집 동물 또는 애완 동물이다. 추가의 구체예에서, RSV 감염과 관련된 하나 이상의 징후를 예방, 치료 또는 경감시키는 방법으로 처치되는 포유동물의 체중이 40 kg을 초과하는 것이 바람직하다.
피검체가 사람인 구체예에서, 미숙아, 만성 폐병 또는 선천성 심장병에 걸린 소아인 것이 바람직하다. 대안적인 구체예에서, 사람은 면역약화된 성인이고, 특히 골수 이식 수용자, 만성 폐병에 걸린 중년 또는 개인이다.
진단 용도
본 발명의 또 다른 구체예는 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키트는 단백질이 검출가능한 표지로 표지되거나 비-표지 검출을 위해 비-표지될 수 있는 본 발명에 따라 제조된 항-RSV rpAb를 포함한다. 키트는 RSV에 감염된 개체를 확인하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 항체 분자 및 이의 관련 측면
본원에 개시된 신규한 항체 분자가 당연히 당 분야의 현실에 기여함이 주목되어야 한다. 따라서, 본 발명은 본원에 개시된 항체 분자 중 임의의 하나에 관한 것일 뿐 아니라 이러한 항체의 단편 및 유사체에 관한 것이며, 상기 단편 또는 유사체는 적어도 본원에 개시된 항체의 CDR을 포함한다.
예를 들어, 본 발명자들은 사람 공여체로부터 단리된 완전한 사람 항체 분자의 일부가 공지된 종래 기술의 모노클로날 항체에 비해 항원 결합을 하게 될 때 매우 개선된 높은 동력적 프로필을 나타내는 결합 부위를 포함한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 설명에서 폴리클로날 항체 조성물에 많은 초점이 맞추어 졌음에도 불구하고, 본원에 개시된 폴리클로날 항체의 이용과 관련된 모든 요지가 또한 본원에 개시된 단일 항체 분자 중 임의의 하나에 대해 타당하다 - 즉, 본 발명의 폴리클로날 항체 조성물에 대한 제형화, 용량, 투여 등과 관련된 모든 설명이 본원에 개시된 개개 항체 분자, 항체 단편 및 항체 유사체, 바람직하게는 프레임워크 서열에도 준용된다.
따라서, 본 발명은 본원 표 5에 개시된 항체 분자로부터 선택된 단리된 사람 항 RSV-항체 분자, 또는 상기 항체 분자의 특이적 결합 단편 또는 합성 또는 반-합성 유사체에 관한 것이고, 상기 결합 단편 또는 유사체는 상기 단리된 항체 분자의 적어도 상보성-결정 영역(CDR)을 포함한다. 항체의 항원 특이성이 CDR 및 프레임워크 영역의 3D 체제(organisation)에 의존적인 것으로 공지되어 있으므로, 종종, 원시 사람 항체의 가변 영역으로부터의 프레임워크 영역이 단편 또는 유사체에 추가로 포함될 것이다.
"단리된 항체 분자"라는 표현은 천연 오염물질로부터 단리되고, 동일한 아미노산 서열을 나타내는 (즉, 동일한 가변 및 불변 영역) 별개 항체의 집합을 나타내기 위한 것이다.
통상적으로, 항체 분자, 단편 또는 유사체는 표 8에 나열된 항체로부터 유래되거나, 서열번호 1-44 중 하나에 포함된 중쇄 CDR 아미노산 서열 및 서열번호 144로부터 선택된 아미노산 서열 보다 88개 더 높은 서열번호를 지니는 경쇄 CDR 아미노산 서열을 수반한다. 이것은, 항체 분자, 단편 또는 유사체가 상기 논의된 44개 클론 중에서 동일하게 발견되는 가변 영역의 동족체 쌍을 포함할 것임을 의미한다.
상기 언급된 대로, 다수의 본 발명의 항체 분자는 매우 높은 친화력을 나타내므로, 본 발명은 사람 항체로부터 유래된 Fab의 CDR과 동일한 CDR을 포함하는 단리된 항체 분자, 항체 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체 유사체에 관한 것이고, 상기 Fab는, 질량 전달에서의 제한을 회피하기 위해 매우 저 밀도에서 센서 표면상에 고정된 재조합 RSV G 단백질을 이용하여 Biacore 3000상에서 표면 플라스몬 공명 분석을 수행하여 측정시, RSV G 단백질에 대해 500 nM 이하의 해리 상수(KD)를 지닌다. 단리된 항체 분자, 항체 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체는 통상적으로 400 nM 이하의 낮은 KD를 나타내고, 예컨대 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 1 nM 이하, 900 pM 이하, 800 pM 이하, 700 pM 이하, 600 pM 이하, 500 pM 이하, 400 pM 이하, 300 pM 이하, 200 pM 이하, 100 pM 이하, 90 pM 이하, 및 80 pM 이하이다. Biacore 측정과 관련된 상세한 설명은 실시예에서 제공된다.
본 발명의 또 다른 구체예는 사람 항체로부터 유래된 Fab의 항원 결합 부위와 동일한 항원 결합 부위를 포함하는 단리된 항체 분자, 항체 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체에 관한 것이고, 상기 Fab는, 질량 전달에서의 제한을 회피하기 위해 매우 저 밀도에서 센서 표면상에 고정된 재조합 RSV F 단백질을 이용하여 Biacore 3000상에서 표면 플라스몬 공명 분석을 수행하여 측정시, RSV F 단백질에 대해 500 nM 이하의 해리 상수(KD)를 지닌다. 단리된 항체, 항체 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체는 통상적으로 400 nM 이하의 KD를 나타내고, 예컨대 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 1 nM 이하, 900 pM 이하, 800 pM 이하, 700 pM 이하, 600 pM 이하, 500 pM 이하, 400 pM 이하, 300 pM 이하, 200 pM 이하, 100 pM 이하, 90 pM 이하, 80 pM 이하, 70 pM 이하, 60 pM 이하, 50 pM 이하, 40 pM 이하, 30 pM 이하, 25 pM 이하, 20 pM 이하, 15 pM 이하, 10 pM 이하, 9 pM 이하, 8 pM 이하, 7 pM 이하, 6 pM 이하, 및 5 pM 이하이다.
특히 유용한 항체 분자 또는 특이적으로 결합되는 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체 유사체는 클론 번호 810, 818, 819, 824, 825, 827, 858 또는 894에서 생성된 사람 항체의 CDR을 포함한다.
상기 언급된 대로, 이렇게 유용한 본 발명의 항체 분자는 본 발명의 폴리클로날 제형과 동일한 방식으로 동일한 적용을 위해 제형화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 비히클 또는 희석제와 혼합하여 상기 섹션에서 논의된 항체 분자, 특이적으로 결합되는 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체 유사체를 포함하는 항체 조성물에 관한 것이다. 조성물은 하나를 초과하는 결합 특이성을 포함할 수 있고, 예컨대 본 발명의 별개의 두 항체 분자 및/또는 본 발명의 특이적으로 결합되는 단편 및/또는 합성 또는 반-합성 항체 유사체를 포함할 수 있다. 조성물은 심지어 적어도 3개의 별개의 항체 분자 및/또는 항체 단편 및/또는 합성 또는 반합성 항체 유사체, 특히 본 발명의 결합 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체 유사체를 포함할 수 있고, 따라서 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 별개의 항체 분자 및/또는 단편 및/또는 합성 또는 반-합성 항체 유사체를 포함하는 조성물을 구성할 수 있다.
특히 관심있는 조성물은 RSV F 단백질에 결합되는 본 발명의 하나 이상의 항체 분자, 단편 또는 유사체 및 RSV G 단백질에 결합되는 본 발명의 하나 이상의 항체, 단편 또는 유사체를 포함한다.
또한 본 발명의 일부는 적어도 표 5에 나열된 클론 중 하나에 의해 생성된 항체의 CDR을 엔코딩하는 핵산 단편과 같은, 본 발명의 항체 분자로 정의된 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열을 엔코딩하는 단리된 핵산 단편이다. 핵산 단편은 통상적으로 DNA이나, RNA일 수도 있다.
또 다른 구체예는 서열번호 1-44 중 임의의 하나에 기술된 중쇄 아미노산 서열의 CDR 서열을 엔코딩하는 단리된 핵산 단편, 또는 서열번호 89-132 중 임의의 하나에 기술된 경쇄 아미노산 서열의 CDR 서열을 엔코딩하는 단리된 핵산 단편이다. 본 발명의 바람직한 핵산 단편은 서열번호 1-44 중 임의의 하나에 기술된 중쇄 아미노산 서열의 CDR 서열 및 서열번호 144로부터 선택된 아미노산 서열 보다 88개 더 높은 서열번호를 지니는 수반하는 경쇄 CDR 아미노산 서열을 엔코딩한다. 이것은 물론, 핵산 단편이 상기 논의된 44개 클론 중에서 동일하게 발견된 가변 영역의 동족체 쌍을 엔코딩할 것임을 의미한다. 따라서, 핵산 단편은 서열번호 45-88 및/또는 133-176에 포함된 코딩 서열을 포함할 수 있다.
편리하게 핵산 단편이 벡터로 도입되며, 이것도 본 발명의 일부이다. 이러한 벡터는 자가 복제할 수 있고, 통상적으로 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니-염색체 및 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 벡터가 발현 벡터인 경우에, 하기 개요를 지니는 것이 바람직할 것이다 (cf. 도 3에 개시된 예시적인 벡터):
- 5'→3' 방향으로 작동가능한 결합에서 임의의 필요한 프레임워크 영역과 함께 하나 이상의 경쇄 CDR을 엔코딩하는, 상기 논의된 첫 번째 핵산 단편의 발현을 수행하기 위한 하나 이상의 프로모터, 임의로 리더 펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열, 상기 첫 번째 핵산 단편, 임의로 항체의 불변 영역을 엔코딩하는 핵산 서열, 및 임의로 첫 번째 종결인자를 엔코딩하는 핵산 서열, 및/또는
- 5'→3' 방향으로 작동가능한 결합에서 임의의 필요한 프레임워크 영역과 함께 하나 이상의 중쇄 CDR을 엔코딩하는, 본 발명의 두 번째 핵산 단편의 발현을 수행하기 위한 하나 이상의 프로모터, 임의로 리더 펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열, 상기 두 번째 핵산 단편, 임의로 불변 영역을 엔코딩하는 핵산 서열, 및 임의로 두 번째 종결인자를 엔코딩하는 핵산 서열.
이러한 벡터는 이것이 재조합 발현 생성물을 수득하기 위해 후속하여 배양될 수 있는 숙주 세포에서 안정하게 형질변환에 사용될 수 있는 경우에 특이 유용하다. 따라서, 바람직한 벡터는 숙주 세포로 도입시에 숙주 세포 게놈에 통합되는 것이다.
따라서, 본 발명은 상기 섹션에서 논의된 본 발명의 벡터를 지니는 형질변환된 세포 및 상기 섹션에서 논의된 본 발명의 핵산 단편을 발현시키는 이러한 벡터랜드(vectorand)를 지니는 안정한 세포주에 관한 것이다. 형질변환된 세포 및 세포주 둘 모두는 임의로 그 표면에 이의 재조합 발현 생성물 (즉, 본 발명의 항체 분자, 항체 단편 또는 유사체)을 지니거나 발현시킨다.
실시예 1
본 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 적용된 방법의 집합이다.
a. 공여체 혈액으로부터 람다-네거티브 혈장 모세포의 분류
말초혈 단핵세포(PBMC)를 제조자의 지시에 따라 림포프렙(Axis Shield) 및 구배 원심분리를 이용하여 공여체로부터 뽑은 혈액으로부터 단리하였다. 단리된 PBMC를 FCS; 10% DMSO에서 -150℃로 저온보존하거나 직접 이용하였다. B 세포 분획을 항-CD19 항체로 표지하고 자기 세포분류(MACS)를 이용하여 PBMC 분획으로부터 단리시켰다. PBMC(1x106 세포)를 항-CD19-FITC 컨주게이션된 항체(BD Pharmingen)와 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 MACS 완충액(Miltenyi Biotec)으로 2회 세척하고 여기에 재현탁시켰다. 항-FITC 마이크로비즈(Miltenyi Biotec)를 표지된 세포와 혼합하고 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 세척 절차를 반복한 후에 세포-비드 현탁액을 LS MACS 컬럼(Miltenyi Biotec)에 적용하였다. CD19 포지티브 세포 분획을 제조자의 지시에 따라 컬럼으로부터 용리시키고 FCS-10% DMSO에서 분류하거나 직접 단일-세포 분류시켰다.
혈장 모세포를 CD19, CD38 및 CD45 세포 표면 단백질의 발현 프로필에 기초한 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 CD19+ B 세포 분획으로부터 선택하였다. CD19는 혈장 세포 전구체에서도 발현되는 B-세포 마커인 반면, CD38은 혈장 모세포 및 혈장 세포 상에서 고도로 발현된다. 혈장 모세포는 CD19+ 세포의 나머지 보다 명백하게 다소 낮은 CD19 및 CD45의 발현을 지니며, 이것은 별개 군집의 분리를 가능하게 한다. 세포를 FACS 완충액(PBS; 1% BSA)에서 세척하고 항-CD19-FITC, 항-CD38-APC, 항-람다-PE (BD Pharmingen)로 20분 동안 염색하였다. 주형으로서 기능할 수 없는 세포를 제외시키기 위해 람다-경쇄 염색이 포함되었다 (섹션 c 참조). 염색된 세포를 FACS 완충액으로 세척하고 재현탁시켰다.
FACS 동안 세포의 유속을 약 200 이벤트/초로 설정하였고 세포 농도는 높은 혈장 세포 구조(rescue)를 수득하기 위해 5x105/ml였다. 하기의 게이트(gate) 세트를 이용하였다. 각 게이트는 전자(former)의 딸(daughter)이다.
게이트 1: FSC/SSC 게이트. 가장 높은 FSC를 지니는 림프구 군집을 선택함으로써 살아있는 세포의 분류를 확인한다.
게이트 2: SSCh/SSCw. 본 게이트는 단일 세포의 분류를 확인한다 (이중 판별).
게이트 3: 혈장 모세포를 나타내는 이벤트가 CD38/CD19 도트 플롯에서 CD38 하이(High)/CD19 중간체로서 게이팅되었다.
게이트 4: 섹션 c에 개시된 PCR 공정만이 카파 경쇄를 증폭시켰기 때문에, 람다-네거티브 이벤트가 람다/CD19 도트 플롯에서 게이팅되었다.
게이트 3에 대안적으로 또는 이에 추가하여, 혈장 모세포가 CD45/CD38 도트 플롯에서 CD38하이 및 CD45중간체로서 동정될 수 있었다. 이것은 세포를 항 -CD45-PerCP로 염색할 것을 요구할 것이다.
이러한 네 가지 조건을 만족하는 생성된 군집을 분류 완충액을 함유하는 96-웰 PCR 플레이트로 단일-세포 분류시켰다 (섹션 c 참조). 세포를 함유하는 플레이트를 -80℃에 저장하였다.
b. 엘리스폿 (ELISpot)
수득된 세포 샘플, 즉 PBMC, MACS-정제된 CD19+ 세포, 또는 FACS 분류된 혈장 모세포의 군집에서 항-RSV 항체를 발현시키는 혈장 모세포의 비율을 산정하기 위해 엘리스폿을 이용하였다. 니트로셀룰로오스 표면(Millipore)을 지니는 96-웰 플레이트를 25 ㎍/ml의 불활성화된 RSV Long 입자 용액(HyTest)으로 코팅하였다. RPMI, 2% 유(milk) 분말과 인큐베이션시켜 웰을 차단하고 약 5시간 동안 4℃에서 정치시킨 후 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 세포 샘플을 RPMI 배양 배지에서 각 웰로 첨가시킨 다음 표준 조직 배양 조건에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 분비된 RSV-특이적 항체가 항체 생성 세포를 둘러싼 고정된 바이러스 입자에 결합될 것이다. 세포를 PBS; 0.01% 트윈20에서 3회 세척 하고 PBS에서 3회 세척함에 의해 제거하였다. HRP-컨주게이션된 항-사람 IgG (H+L) (CalTag) 및 HRP-컨주게이션된 항-사람 IgA (Serotec)를 첨가하고 고정된 항체와 37℃에서 1시간 동안 반응하게 하였다. 세척 절차를 반복하고 크로모겐 기질 (N,N-DMF (디-메틸 포름아미드)에 용해된 3-아미노-9-에틸카르바졸)을 첨가하였다. 4분 후에 H2O를 첨가시켜 컬러 발생을 종료시켰다. 레드 스폿을 항원-특이적 항체-분비 세포가 위치하는 부위로 동정하였다.
c. 동족체 V H 및 V L 쌍의 결합
섹션 a에 개시된 대로 수득된 단일 세포 상에서 VH 및 VL 코딩 서열의 결합을 수행하여 VH 및 VL 코딩 서열의 동족체 페어링을 촉진하였다. 절차는 일-단계 다중 중복-연장 RT-PCT에 이은 네스티드 PCR에 기초한 2단계 PCR 절차를 이용하였다. 본 발명에서 이용된 프라이머 믹스는 카파 경쇄만을 증폭시킨다. 그러나 람다 경쇄를 증폭시킬 수 있는 프라이머가 요망되는 경우 다중 프라이머 믹스 및 네스티드 PCR 프라이머에 첨가될 수 있었다. 람다 프라이머가 첨가되면, 섹션 a의 분류 절차가 람다 포지티브 세포를 제외시키지 않도록 조정되어야 한다. 동족체 VH 및 VL 서열의 결합 원리는 도 2에 개시되어 있다.
섹션 a에서 생성된 96-웰 PCT 플레이트를 해동시켰고 분류된 세포는 다중 중복-연장 RT-PCR에 대한 주형으로 기능하였다. 단일-세포 분류가 반응 완충액 (OneStep RT-PCR 완충액; Qiagen), RT-PCR에 대한 프라이머 (표 2 참조) 및 RNase 억제제 (RNasin, Promega)를 함유하기 전에, 분류 완충액을 각 웰에 첨가하였다. 여기에 원스텝 RT-PCR 효소 믹스 (25배 희석; Qiagen) 및 dNTP 믹스 (각 200 μM)를 보충하여 20 ㎕의 반응 부피에서 주어진 최종 농도를 수득하였다.
플레이트를 55℃에서 30분 동안 인큐베이션시켜 각 세포로부터 RNA의 역전사를 가능하게 하였다. RT 이후에, 플레이트를 하기 PCR 사이클로 처리하였다: 94℃에서 10분, 35x(94℃에서 40초, 60℃에서 40초, 72℃에서 5분), 72℃에서 10분.
PCR 반응을 필 실 바스킷(Peel Seal Basket)이 구비된 H20BIT 써멀 사이클러에서 24 96-웰 플레이트(ABgene) 동안 수행하여 고-처리량을 촉진하였다. PCR 플레이트를 사이클링 후 -20℃에서 저장하였다.
표 2: RT-PCR 다중 중복-연장 프라이머 믹스
Figure 112008069716179-PCT00003
네스티드 PCR 단계를 위하여, 96-웰 PCR 플레이트를 각 웰에서 (20 ㎕ 반응물) 하기 혼합물을 이용하여 주어진 최종 농도를 수득하도록 제조하였다: 1x FastStart 완충액 (Roche), dNTP 믹스 (각 200 μM), 네스티드 프라이머 믹스 (표 3 참조), Phusion DNA 폴리머라아제 (0.08 U; Finnzymes) 및 FastStart High Fidelity 효소 블렌드 (0.8 U; Roche). 네스티드 PCR에 대한 주형으로서, 1 ㎕를 다중 중복-연장 PCR 반응으로부터 옮겼다. 네스테스 PCR 플레이트를 하기 PCR 사이클로 처리하였다: 35x(95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 90초), 72℃에서 10분.
임의로 선택된 반응물을 1% 아가로스 겔 상에서 분석하여 약 1070 bp의 중복-연장 단편의 존재를 입증하였다.
PCR 단편의 추가 가공까지 플레이트를 -20℃에서 저장하였다.
표 3: 네스티드 프라이머 세트
Figure 112008069716179-PCT00004
d. 동족체 V H 및 V L 코딩 쌍의 스크리닝 벡터로의 삽입
RSV 입자 또는 항원에 대한 결합 특이성을 지니는 항체를 동정하기 위해, 섹션 c에 개시된 대로 수득된 VH 및 VL 코딩 서열을 전장 항체로서 발현시켰다. 이것은 VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리를 발현 벡터로 삽입하고 숙주 세포로 형질변환시키는 것을 포함한다.
결합된 VH 및 VL 코딩 쌍을 함유하는 발현 벡터의 레퍼토리를 생성하기 위해 2-단계 클로닝 절차를 적용시켰다. 통계적으로, 발현 벡터의 레퍼토리가 스크리닝 레퍼토리의 생성을 위해 사용된 동족체 페어링된 VH 및 VL PCR 생성물의 수 보다 10배 많은 재조합 플라스미드를 함유하는 경우, 모든 유일한 유전자 쌍이 제시될 가능성이 99%이다. 따라서, 400개의 중복-연장 V-유전자 단편이 섹션 c에서 수득되는 경우, 적어도 4000개 클론의 레퍼토리가 스크리닝을 위해 생성되었다.
간단히 말해, 섹션 c의 네스티드 PCR로부터의 결합된 VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리를 푸울링하였다 (상이한 공여체로부터 쌍을 혼합시키지 않고). PCR 단편을 PCR 생성물의 말단에 도입된 제한 부위에서 XhoI 및 NotI DNA 엔도누클레아제로 절단하였다. 절단되고 정제된 단편을 표준 라이게이션(ligation) 절차에 의해 XhoI/NotI 소화된 포유동물 IgG 발현 벡터로 라이게이션하였다(도 3). 라이게이션 믹스를 대장균(E.coli)으로부터 일렉트로포레이션시키고 적합한 항생제를 함유하는 2xYT 플레이트에 첨가하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 증폭된 벡터의 레퍼토리를 플레이트로부터 회수된 세포로부터 표준 DNA 정제 방법(Qiagen)을 이용하여 정제시켰다. 플라스미드를 AscI 및 NheI 엔도누클레아제를 이용한 절단에 의해 프로모터-리더 단편의 삽입을 위해 제조하였다. 상기 효소의 제한 부위는 VH 및 VL 코딩 유전자 쌍 사이에 위치한다. 벡터의 정제에 이어서, AscI-NheI 소화된 2-방향 포유동물 프로모터-리더 단편을 표준 라이게이션 절차에 의해 AscI 및 NheI 제한 부위에 삽입하였다. 라이게이션된 벡터를 대장균(E.coli)에서 증폭시키고 플라스미드를 표준 방법을 이용하여 정제하였다. 스크리닝 벡터의 생성된 레퍼토리를 통상적인 절차에 의해 대장균(E.coli)으로 형질변환시켰다. 수득된 콜로니를 384- 웰 마스터 플레이트에 통합시키고 저장하였다. 정렬된 콜로니의 수는 투입 PCR 생성물의 수를 3배 이상까지 초과하였으므로, 섹션 c에서 수득된 모든 유일한 V-유전자 쌍이 존재할 가능성은 95%이다.
e. 스크리닝
섹션 d에 정렬된 세균 콜로니를 유사한 384-웰 플레이트에서 배양 배지로 접종하고 밤새 성장시켰다. 트랜스펙션을 위한 DNA를 세포 배양 플레이트의 각 웰로부터 제조하였다. 트랜스펙션 전날, 384-웰 플레이트를 CHO Flp-In 세포(Invitrogen)로 20 ㎕의 배양 배지에서 3000 세포/웰로 시딩하였다. 세포를 Fugene6 (Roche)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 DNA로 트랜스펙션하였다. 2-3일 인큐베이션 후에, 전장 항체-함유 상청액을 회수하고 스크리닝을 목적으로 저장하였다.
어플라이드 바이오시스템즈 8200 FMAT(TM) 시스템, 동종 비드-기재 가용성 포획 FLISA(형광성 결합된 면역흡수 검정)를 이용하여 스크리닝을 수행하였다 (Swartzman et al. 1999, Anal. Biochem. 271 : 143-151). RSV 항원으로부터 유래된 바이러스 입자, 재조합 G 단백질 및 비오티닐화된 펩티드를 포함하는 다수의 항원을 스크리닝에 이용하였다. 펩티드가 G 단백질의 보존된 영역 (아미노산 164-176) 및 시스테인 코어 영역 (아미노산 171-187, 균주 Long 18537) 및 SH-단백질의 세포외 영역 (A2 균주의 아미노산 42-64 및 18537 균주의 42-65)으로부터 유래되었다. 300 ㎕의 5% w/v 비즈 (6.79 ㎛ 직경, Spherotech Inc.)를 300 ㎕의 바이러스 스톡 (단백질 농도: 200 ㎍/ml)과 함께 인큐베이션시킴에 의해 RSV 균주 Long의 불활성화된 바이러스 입자(HyTest)를 폴리스티렌 비즈 상에 고정시켰다. 가용성 재조합 G 단백질 (18537 균주 서열의 아미노산 66-292)를 유사하게 폴리스티렌 비즈 상에 직접 고정시킨 반면, 비오티닐화된 펩티드를 포화 농도에서 미리 코팅된 스트렙타비딘 폴리스티렌 비즈 (6.0-8.0 ㎛ 직경, Gerlinde Kisker) 상에 포획하였다. 코팅 혼합물을 밤새 인큐베이션하고 PBS로 2회 세척하였다. 비즈를 1% 소 혈청 알부민 및 5 ㎕의 염소-항-사람 IgG Alexa 647 컨주게이트 (Molecular probes)를 함유하는 50 ml의 PBS에 재현탁하였다 (PBS/BSA). 10 ㎕의 재현탁된 코팅 혼합물을 FMAT-양립성 384-웰 플레이트에서 20 ㎕의 항체-함유 상청액에 첨가하고, 약 12시간 동안 인큐베이션하였으며, 이후 개개 웰의 비드 표면에서 형광성을 측정하였다. 형광성 이벤트는, 이의 강도가 배경 기준 위로 적어도 6 표준 편차인 경우 포지티브로 인식되었다.
일차적인 히트(hit)에서 생성된 클론을 원래 마스터 플레이트로부터 회수하고 새로운 플레이트에서 수집하였다. DNA를 상기 클론으로부터 단리시키고 V-유전자의 DNA 서열화를 위해 제공하였다. 서열을 정렬하고 모든 유일한 클론을 선택하였다.
선택된 클론을 추가로 확인하였다. 간단히, 2x106 프리스타일 293 세포(Invitrogen)를 2 ml의 프리스타일 배지(Invitrogen) 중에서 선택된 클론으로부터의 1.7 ㎍의 DNA 및 0.3 ㎍의 pAdVAntage 플라스미드(Promega)로 제조자의 지시 에 따라 트랜스펙션시켰다. 2일 후, 상청액을 IgG 발현 및 일차 스크리닝에 사용된 상이한 항원 뿐만 아니라 정제된 재조합 F 단백질 및 G 단백질의 대장균(E.coli) 생성 단편(18357 균주 서열의 아미노산 127-203)과의 반응성에 대해 FLISA 및/또는 ELISA에 의해 시험하였다. 항체 상청액을, 항원 반응성에 대한 클론의 등급 매기기가 가능하도록 일련의 희석액에서 시험하였다.
f. 클론 수복(repair)
섹션 c에 개시된 다중 PCR 접근법을 이용할 때, 높은 상동성 정도로 인해 일정한 정도의 V-유전자 과내(intra) 및 과간(inter) 교차-프라이밍이 예상된다. 교차-프라이밍은 여러 잠재적인 영향력, 예컨대 구조적 변화 및 증가된 면역원성을 지니는 면역글로불린 프레임워크에서 자연적으로 발생하지 않는 아미노산을 도입시키며, 모두는 감소된 치료 활성을 초래한다.
이러한 단점을 제거하고 선택된 클론이 천연 체액성 면역 반응을 반영함을 확실히 하기 위해, 이러한 교차-프라이밍 돌연변이를 소위 클론 수복이라 불리는 공정으로 바로잡았다.
클론 수복 절차의 첫 번째 단계에서, VH 서열을 관심있는 클론이 유래된 VH-유전자에 상응하는 서열을 함유하는 프라이머 세트로 PCR 증폭시킴으로써, 교차-프라이밍에 의해 도입된 임의의 돌연변이를 바로잡았다. PCR 단편을 XhoI 및 AscI로 소화시키고 XhoI/AscI 소화된 포유동물 발현 벡터(도 3)로 통상적인 라이게이션 절차를 이용하여 다시 라이게이션하였다. 라이게이션된 벡터를 대장균(E.coli)에서 증폭시키고, 플라스미드를 표준 방법에 의해 정제하였다. VH 서열을, 교정을 입증하기 위해 서열화하고 벡터를 NheI/NotI로 소화시켜 경쇄의 삽입을 위해 제조하였다.
두 번째 단계에서, 완전한 경쇄를 관심있는 클론이 유래된 VL-유전자에 상응하는 서열을 함유하는 프라이머 세트로 PCR 증폭시킴으로써, 교차-프라이밍에 의해 도입된 임의의 돌연변이를 바로잡았다. PCR 단편을 NheI/NotI로 소화시키고 상기 제조된 VH 함유 벡터로 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물을 대장균(E.coli)에서 증폭시키고, 플라스미드를 표준 방법에 의해 정제하였다. 후속하여, 경쇄를 서열화하여 교정을 입증하였다.
선택된 클론의 카파 불변 영역이 섹션 c에 개시된 대로 유전자의 증폭 동안 도입된 돌연변이를 함유하는 경우, 이것은 둘연변이되지 않은 불변 영역으로 교체되었다. 이것은, 수복된 VL-유전자(불변 영역 없이 증폭됨)가 교정 서열(별개의 PCR에서 수득됨)로 불변 영역에 융합되는 중복 PCR에서 수행된다. 전체 서열을 증폭시키고 상기 개시된 벡터를 함유하는 VH로 클로닝하였으며, 수복된 경쇄를 서열화하여 교정을 입증하였다.
g. 폴리클로날 세포주의 생성
재조합 폴리클로날 항체를 생성하는 폴리클로날 발현 세포주의 생성은 각각 단일 VH 및 VL 유전자 서열로부터의 유일한 항체를 발현시키는 개개 발현 세포주의 생성을 수반하는 다중-단계 절차이다. 폴리클로날 세포주는, 개개 세포주를 혼합하고 혼합물을 앰플로 분배시켜 폴리클로날 리서치 세포 뱅크(pRCB) 또는 마스터 세포 뱅크(pMCB)를 생성함에 의해 수득되고, 이로부터 폴리클로날 워킹 세포 뱅크(pWCB)가 세포를 리서치 또는 마스터 세포 뱅크로부터 확장시킴에 의해 생성될 수 있다. 일반적으로, pRCB로부터의 폴리클로날 세포주는 pWCB를 생성하지 않고 직접 이용한다.
폴리클로날 세포주는 생성하는 공정의 개별적인 단계가 하기에 기술된다.
g-1 포유동물 세포주의 트랜스펙션 및 선택
Flp-In CHO 세포주(Invitrogen)를 출발 세포주로 이용하였다. 더욱 동종인 세포주를 얻기 위해, 부모 Flp-In CHO 세포주를 제한된 희석에 의해 서브클로닝시키고 여러 개의 클론을 선택하고 확장시켰다. 성장 거동에 기초하여, 하나의 클론, CHO-Flp-In (019)을 출발 세포주로서 선택하였다. CHO-Flp-In (019) 세포를 10% 소 태아 혈청(FCS)을 지니는 HAM-F12에서 부착 세포로서 배양하였다.
섹션 f에서 수득된 선택되고 수복된 VH 및 VL 코딩 쌍을 각각 함유하는 개별적인 플라스미드 제조물을 플라스미드를 엔코딩하는 Flp 리콤비나아제를 이용하여 T175 플라스크에서 Fugene6 (Roche)를 이용하여 ~19xlO6 CHO-Flp-In (019) 세포 (추가의 설명을 위해, WO 04/061104 참조)로 공-트랜스펙션시켰다. 세포를 24시간 후에 트립시신화하였고 2-층 (1260 cm2) 세포 팩토리(Nunc)로 옮겼다. 트랜스펙션 48시간 후에 첨가되는 500 ㎍/ml의 제네티신의 존재하에 배양시킴에 의해 재조합 세 포주를 선택하였다. 대략 2주 후에 클론이 나타났다. 클론을 계수하고 세포를 트립신화한 후 RSV-특이적인 항체 중 하나를 발현시키는 클론의 푸울로서 배양하였다.
g-2 무혈청 현탁 배지로 조정
개별적인 부착 항-RSV 항체를 발현시키는 세포 배양액을 트립신화하고, 원심분리하고, 분리된 진탕 플라스크(250 ml)로 적합한 무혈청 배지 (Excell302, JRH Biosciences; 500 ㎍/ml 제네티신, 항-응고제 (1:250) 및 4 mM L-글루타민)에서 1.15x106 세포/ml로 이동시켰다. 성장 및 세포 형태학이 수 주에 걸쳐 이어진다. 4-6주 후에, 세포주는 일반적으로 30시간 미만의 배가 시간을 지니는 양호하고 안정한 성장 거동을 나타내었고 조정된 개별적인 세포주는 다중 앰플에 저온보존되었다.
조정 동안 발현된 개별적인 항체를 섹션 i)에 개시된 방법을 이용하여 상청액으로부터 정제하였다. 정제된 항체를 하기 개시된 항원 특이성 및 생화학적 특성의 규명에 이용하였다.
g-3 세포주의 특성화
모든 개개 세포주를 항체 생성 및 증식에 대해 특성화하였다. 이것은 하기 검정으로 수행되었다:
생성:
개별적인 발현 세포주의 재조합 항체의 생성은 카파 특이적인 ELISA에 의한 조정 동안 이어진다. ELISA 플레이트를 카르보네이트 완충액 (pH 9.6)에서 염소-항-사람 Fc 정제된 항체(Serotec)로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 세척 완충액 (PBS; 0.05% 트윈 20)으로 6회 세척하고 1시간 동안 2% 스킴유를 함유하는 세척 완충액에서 인큐베이션시킴에 의해 차단하였다. 세포 배양 배지 상청액을 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션 확장시켰다. 플레이트를 세척 완충액에서 6회 세척하고 이차 항체 (염소-항-사람 카파 HRP, Serotec)를 첨가하고 인큐베이션을 반복하였다. 격렬한 세척 후에, ELISA를 TMB 기질을 이용하여 전개하고 H2SO4를 첨가시켜 반응을 종료시켰다. 플레이트를 450 nm에서 판독하였다.
추가로, 세포내 염색을 이용하여 일반적인 발현 수준과 재조합 항체의 발현과 관련하여 세포 군집의 동종성을 측정하였다. 5x105 세포를 찬 FACS 완충액 (PBS; 2% FCS)에서 세척한 후 CellFix (BD-Biosciences)에서 20분 동안 인큐베이션시킴에 의해 고정시켰다. 세포를 펠릿으로 만들고 빙냉 메탄올에서 10분 동안 투과시키고 FACS 완충액에서 2회 세척하였다. 현탁액을 형광성 태깅하고 항체 (염소 F(ab')2 단편, 항-사람 IgG(H+L)-PE, Beckman Coulter)를 첨가하였다. 얼음 상에서 20분 후에, 세포를 세척하고 FACS 완충액에 재현탁시킨 다음 FACS 분석하였다.
증식:
세포 현탁액의 분취량을 2배 내지 3배 약하게 하여 세포 수, 세포 크기 및 생육성을 Vi-Cell XR (세포 생육성 분석기, Beckman Coulter) 분석에 의해 측정하였다. 세포 배양액의 배가 시간을 Vi-Cell 측정으로부터 얻은 세포 수를 이용하여 산출하였다.
g-4 개개 항체의 항원 특이성의 특성화
개개 발현된 항체의 항원 및 에피토프 특이성을 평가하여 잘-특성화된 특이성을 지니는 항-RSV rpAb의 생성을 가능하게 하였다. 섹션 e에서 이미 기술된 대로, 스크리닝 동안 동정된 항체를, FLISA, ELISA 및 표면 플라스몬 공명(SPR; Biacore)에 의해 단일 RSV 항원 (재조합 G 단백질, 재조합 또는 정제된 F 단백질) 또는 이의 펩티드 단편 (단백질 G, 아형 A 및 B의 보존된 영역 및 시스테인-코어 모티프, 및 SH 단백질, 아형 A 및 B의 세포외 도메인)에 대한 이들의 결합 특이성을 평가함에 의해 확인하였다. 표 4에 도시된 것들 중 일부인 잘-특성화된 시판 항체와의 경쟁에 의해 ELISA에서 에피토프 특이성을 결정하였다. 표 4에 도시된 모든 항체가 본 발명의 각기 개별적인 항체의 특성화에 반드시 이용될 필요는 없며, 이들이 또한 결합되는 항원, 항원성 부위 및/또는 에피토프에 대해 특성화된 가능한 다른 항체 또는 항체 단편이 이용될 수도 있다. 간단히 말해, 에피토프 차단에 이용된 항체 또는 항체 단편을 매우 과량의, 즉 실험에 의해 측정된 (Ditzel et al., 3. MoI. Biol. 1997, 267:684-695) 75% 최대 결합을 제공하는 것들의 10배 농도로 고정된 항원과 함께 인큐베이션하였다 (RSV Long 입자, HyTest). 세척 이후, 개별적인 항체 클론을 차단된 항원과 다양한 농도에서 인큐베이션하고 임의의 결합된 사람 IgG를 염소-항-사람 HRP 컨주게이트 (Serotec)를 이용하여 표준 ELISA 프로토콜에 따라 검출하였다. 차단 및 프로빙 항체 둘 모두의 포화 농도 (실험에 의해 결정됨)를 이용하여 Biacore에서 상이한 항체 클론간의 쌍단위 경쟁에 의해 에피토프 특이성을 추가로 특성화하였다. 직접 아민 커플링에 의해 고정된 정제된 F 또는 G 단백질 (Biacore)을 항원으로서 이용하였다. ELISA- 및 Biacore-기재 에피토프 맵핑 둘 모두에서, 비경쟁된 결합에 비해 에피토프 차단 이후에 결합이 감소되었다.
표 4: 항-F 및 항-G 항체의 에피토프 맵핑을 위한 모노클로날 항체
Figure 112008069716179-PCT00005
Figure 112008069716179-PCT00006
"항원" 열은 Mab/Fab에 의해 결합된 RSV 관련 항원을 나타내며, 아형 특이성이 공지된 경우, 이것을 ()로 표시한다. "에피토프(aa)" 열은 MAb/Fab에 의해 인식된 에피토프의 명칭을 나타내고, 추가로 ()에 RSV 도피 돌연변이를 생성하는 아미노산 위치, 또는 이에 대한 결합을 나타내는 펩티드/단백질 단편을 표시한다. 표 4에 숫자로 표시된 참조는 하기와 같다:
Figure 112008069716179-PCT00007
더욱이, 항체 클론은 FACS에 의한 상이한 RSV 균주(Long 및 B1)에 감염된 사람 후두 상피 HEp-2 세포 (ATCC CLL-23)에 대한 결합도 특징으로 한다. 간단히 말해, HEp-2 세포를 무혈청 배지에서 0.1 pfu/세포의 속도로 24시간 (Long 균주) 또는 48시간 (B1 균주) 동안 RSV Long (ATCC 번호 VR-26) 균주 또는 RSV B1 (ATCC 번호 VR-1400) 균주로 감염시켰다. 탈착 및 세척 이후에 세포를 96-웰 플레이트에 분배하고 개개의 항-RSV 항체의 희석액(4 pM-200 μM)과 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1% 포름알데히드에 고정시키고, 세포 표면-결합된 항체를, 염소 F(ab)2 항-사람 IgG-PE 컨주게이트 (Beckman Coulter)와 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시킴에 의해 검출하였다. 가상(mock)-감염된 HEp-2 세포와의 결합을 유사하게 분석하였다. 단백질 G-특이적인 것으로 동정된 선택된 클론도 재조합 사람 프랙트알킨(CX3CL1; R&D systems)과의 교차-반응성에 대해 ELISA에 의해 시험하였다. 항-사람 CX3CL1/프랙트알킨 모노클로날 항체 (R&D systems)를 포지티브 대조군으로서 이용하였다.
g-5 개개 항체의 결합 동력학의 특성화
질량 전달에서의 제한을 회피하기 위해 매우 저 밀도에서 센서 표면상에 고정된 재조합 항원을 이용하여 Biacore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)상에서 표면 플라스몬 공명 분석을 이용하여, 본 발명의 항체의 동력학적 분석을 수행하였다. 이뮤노퓨어(ImmunoPure) Fab 제조 키트(Pierce)를 이용하여 개개 항체 클론으로부터 제조된 Fab 단편으로 분석을 수행하였다. 간단히 말해, 총 200 공명 유닛(RU)의 재조합 단백질 F 또는 총 50 RU의 재조합 단백질 G를 아민 커플링 키트(Biacore)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 CM5 칩 표면으로 컨주게이션시켰다. Fab 단편을 칩 표면 위에 연속 희석액으로 주입하는데, 고정된 단백질을 지니는 칩 상에서 시험시 25를 초과하는 RU 최대 값을 초래하지 않는 최적화된 농도에서 시작하였다. 연합 속도 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를, BIAevalutation 4.1 소프트웨어(BIAcore)에서 소정의 1:1 (랭뮤어) 연합 및 해리 모델을 이용하여 전체적으로 평가하였다.
Fab 단편에 대한 동력학적 분석을 수행함에 의해, 수득된 데이터가 진정으로 RSV 단백질에 대한 결합 친화력을 반영함을 확인한다. 완전한 항체를 이용하는 경우, 데이터는 결합의 항원항체결합력(avidity)을 반영할 것이며, 이것은 항원에 대한 항체의 결합 특징의 정확한 특성의 의미있는 측정치로 용이하게 해석될 수 없 다.
g-6 개개 항체의 생화학적 성질의 특성화
이종성은 항체 및 재조합 단백질에서 공통적인 현상이다. 항체 개질은 통상적으로 발현 동안 일어나며, 예컨대 N-글리코실화와 같은 번역후 개질, 단백질 분해 단편화, 및 크기 또는 전하 이종성을 초래하는 N- 및 C-말단 이종성이 있다. 또한, 메티오닌 산화 및 탈아미드화와 같은 개질이 후속하는 단기 또는 장기 저장 동안 발생할 수 있다. 이러한 파라미터가 치료적 항체에 대해 잘-정의될 필요가 있기 때문에, 폴리클로날 세포주의 생성 이전에 이들을 분석하였다.
정제된 개개 항체(섹션 i 참조)의 특성화에 이용되는 방법으로는 SDS-PAGE (환원 및 비환원 조건), 약 양이온 교환 크로마토그래피(IEX), 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 및 RP-HPLC (환원 및 비환원 조건)가 있다. 환원 및 비환원 조건하에서의 SDS-PAGE 분석 및 SEC는, 정제된 항체가 미소량의 단편화되고 응집된 형태를 지니며 실제로 완전함을 나타내었다. 정제된 항체의 IEX 프로필 분석은 단일 피크를 지니는 프로필 또는 다중 피크를 지니는 크로마토그램을 생성하였으며, 이것은 상기 특정 항체에서의 전하 이종성을 나타낸다. IEX 분석에서 다중 피크를 나타내고/거나 SDS 겔에서 경쇄 또는 중쇄의 비정상적인 이동을 나타내는 항체 제조물, 또는 생소한 RP-HPLC 프로필을 N-말단 서열화에 의해 완전한 N-말단에 대해 및 올리고사카라이드 프로필에서의 차이에 의해 야기된 이종성에 대해 상세하게 분석하였다. 또한, 선택된 항체를, 효소처리 및 후속하는 SDS-PAGE 분석을 이용하여 가변 사슬에서 추가의 N-글리코실화 부위의 존재에 대하여 분석하였다.
g-7 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체 생성을 위한 폴리클로날 세포주의 확립
확립된 발현 세포주의 집합으로부터, 폴리클로날 세포주 및 폴리클로날 리서치/마스터 세포 뱅크(pRCB/pMCB)의 생성을 위해 혼합되는 서브세트를 선택하였다. 선택 파라미터를 폴리클로날 세포주로부터 생성된 폴리클로날 항체의 이용 및 개개 세포주의 성능에 따라 정의할 수 있다. 일반적으로, 하기 파라미터가 고려된다:
· 세포주 특징; 폴리클로날 세포주의 안정성을 최적화하기 위해, 배가 시간이 21 내지 30시간이고 항체 생산성이 1 pg/세포/일을 초과하는 개개 세포주가 바람직하다.
· 반응성; 항-RSV rpAb가 반응성을 발휘하는 항원/항원성 부위 및 에피토프가 신중하게 고려된다.
· 단백질 화학; 바람직하게는 잘-정의된 생화학적 특성을 지니는 항체가 최종 항-RSV rpAb에 포함된다.
재조합 항-RSV 항체를 각각 발현시키는 선택된 개개 세포주를 해동시키고 무혈청 배지에서 진탕 플라스크에서 37℃에서 확장시켜 21-34시간의 군집 배가 시간을 지니는 적어도 4x108개 세포의 각 클론에 도달하였다. 생육성은 바람직하게 93% 내지 96%의 범위이다. 폴리클로날 세포주를, 각 세포주로부터의 2x106개의 세포를 혼합시킴에 의해 제조하였다. 폴리클로날 세포주를 5.6x107개 세포를 함유하는 동결 앰플로 분배시키고 저온보존하였다. 폴리클로날 세포주를 지니는 바이알의 이러한 집합을 폴리클로날 리서치/마스터 세포 뱅크(pRCB/pMCB)라고 부르며, pRCB/pMCB로부터의 한 앰플을 확장시켜 폴리클로날 워킹 세포 뱅크(pWCB)를 생성시킴으로써 pRCB/pMCB의 앰플과 동일한 세포 밀도를 지니는 약 200개 앰플의 폴리클로날 워킹 세포 뱅크(pWCB)를 구축하기에 충분한 세포 수에 도달한다. 세포 뱅크로부터의 샘플을 미코플라스마 및 살균성에 대해 시험하였다.
h. 재조합 폴리클로날 항-RSV 항체의 발현
재조합 폴리클로날 항-RSV 항체 회분을 5 리터의 바이오반응기에서 생성한다 (B.Braun Biotech International, Melsungen, Germany). 간단히 말해, pRCB 또는 pWCB로부터의 바이알을 해동하고 진탕 플라스크(Corning)에서 확장시켰다. 시드 트레인의 세포를 G418 및 항-응고제를 지니는 ExCell 302 배지에서 37℃; 5% CO2에서 배양하였다. 바이오반응기를 G418 및 항응고제 없이 3 L의 ExCell 302 배지에 현탁된 0.6x106개 세포/ml로 접종하였다. 세포 수/살아있는 세포를 CASY 및 ViCell 계수에 의해 매일 모니터링하였다. 50h에, 2000 ml의 ExCell 302 배지를 보충하고 92h 이후에, 37℃에서 32℃로 저온전환시켰다. 세포 배양 상청액을 164h 이후에 회수하고 섹션 i)에 개시된 대로 정제시켰다.
i. 개개 항-RSV 항체 및 폴리클로날 항-RSV 항체의 정제
모두 IgG1 이소형인 섹션 g.g-2 및 h에 개시된 대로 발현된 항체를 MabSelect SuRe 컬럼 (단백질-A)를 이용하여 친화력 정제시켰다. 개개 항체가 pH 7.4에서 고정된 단백질 A와 상호작용하는 한편, 오염성 단백질은 컬럼으로부터 세척되었다. pH를 2.7롤 낮춤에 의해 결합된 항체를 후속하여 컬럼으로부터 용리시 켰다. 280 nm에서의 흡광도 측정으로부터 결정된 항체를 함유하는 분획을 푸울링하고, 완충액을 G-25 컬럼을 이용하여 5 mM 나트륨 아세테이트, 150 mM NaCl, pH 5로 변화시키고, -20℃에서 저장하였다.
j. 시험관내 중화 검정
j-1 시험관내 이용을 위한 생 RSV의 제조
사람 후두 상피 HEp-2 세포(ATCC CLL-23)를 175 cm2의 플라스크에서 1x1O7 세포/플라스크로 시딩하였다. 세포를 3 ml의 무혈청 배지에서 0.1 pfu/세포의 속도로 RSV Long (ATCC 번호 VR-26), RSV B1 (ATCC 번호 VR-1400) 또는 RSV B Wash/18537 (Advanced Biotechnologies Inc.) 균주로 감염시켰다. 세포를 37℃; 5% CO2에서 2시간 동안 감염시킨 후 37 ml의 완전 MEM 배지를 첨가하였다. 세포변성 효과가 보일 때까지 세포를 인큐베이션하였다. 찰과표본에 의해 세포를 박리시키고 배지 및 세포를 20초 동인 초음파처리하고, 부분표본을 위하여 액체 질소에서 스냅 동결시키고 -80℃에서 저장하였다.
j-2 플라크 감소 중화 시험 (PRNT)
HEp-2 세포를 2xlO4개 세포/웰로 96-웰 배양 플레이트에 시딩하고, 37℃; 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 시험 물질을 무혈청 MEM에서 희석시키고 보체의 부재 또는 존재하에 (토끼로부터의 보체 혈청, Sigma) 30분 동안 37℃에서 RSV와 사전-인큐베이션되게 하였다. 이 혼합물을 HEp-2 세포의 단층에 도포하고 24시간 동안 37℃; 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 세포를 80% 아세톤; 20% PBS로 20분 동안 고정하였다. 세척 후, 비오티닐화된 염소 항-RSV 항체 (AbD Serotec)를 1% BSA를 지니는 PBS 중에서 첨가하고(1:200) 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후에, HRP-아비딘을 첨가하고 30분 동안 인큐베이션되게 하였다. 3-아미노-9-에틸카르바졸 (AEC) 기질과 25분 (RSV Long) 또는 45분 (RSV Bl) 인큐베이션시켜 플라크가 생성되었다. 바이오리더(Bio-Sys GmbH)에서 플라크를 계수하였다. 효능을 비교하기 위해 적용될 수 있는 EC50 값 (플라크의 수가 50% 감소하는데 요구되는 유효 농도)을 산출하였다.
j-3 융합 억제 검정
RSV가 시험 물질 첨가 전에 감염되도록 하는 것을 제외하고 융합 억제 검정을 본질적으로 플라크 감소 중화 검정 대로 수행하였다. 실제로, 바이러스를 무혈청 배지 중에서 HEp-2 세포의 단층에 1.5 h 동안 첨가하였다. 상청액을 제거하고 시험 물질을 보체가 있거나 없는 (토끼로부터의 보체 혈청, Sigma) 완전한 MEM 배지에서 첨가하였다. 플레이트를 밤새 인큐베이션하고 플라크 감소 중화 검정에 대해 상기 기술된 대로 프로세싱하였다.
j-4 미세중화 검정
섹션 j-2 및 j-3에 개시된 PRNT 및 융합 억제 검정에 추가하여, RSV 단백질의 검출에 기초한 미세중화 검정을 RSV 중화 및 융합 억제를 측정하기 위해 적용시켰다.
중화 시험의 경우, 시험 물질을 무혈청 MEM에서 희석시키고 보체의 부재 또는 존재하에 (토끼로부터의 보체 혈청, Sigma) 96-웰 배양 플레이트에서 30분 동안 실온에서 RSV와 사전-인큐베이션되게 하였다. 트립신화된 HEp-2 세포를 1.5xlO4개 세포/웰로 첨가하고, 2-3일 동안 37℃; 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 80% 아세톤; 20% PBS로 15분 동안 4℃에서 고정하고 건조시켯다. 이후 플레이트를 0.5% 젤라틴을 지니는 PBS로 실온에서 30분 동안 차단하고 0.5% 젤라틴을 지니는 PBS 및 0.5% 트윈-20에서 1:200 희석된, RSV 단백질 (NCL-RSV3, Novocastra)에 대한 뮤린 모노클로날 항체의 푸울로 실온에서 2시간 동안 염색하였다. 세척 후에, 0.5% 젤라틴을 지니는 PBS 및 0.5% 트윈-20에서 1:1000 희석된, 폴리클로날 토끼 항-마우스 면역글로불린 HRP-컨주게이트 (P0260; DakoCytomation)를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션되게 하였다. 플레이트를 세척하고, 오르토-페닐렌디아민의 첨가에 의해 진행시켰다. H2SO4를 첨가시켜 반응을 종료시키고, 플레이트를 ELISA 플레이트 리더에서 490 nm에서 판독하였다.
융합 억제 검정을, 바이러스를 세포에 첨가하고, 완전 MEM에 희석된 시험 물질을 첨가하기 전에 1.5시간 동안 37℃; 5% CO2에서 인큐베이션시키는 것을 제외하고, 본질적으로 미세중화 시험대로 수행하였다. 플레이트를 37℃; 5% CO2에서 2-3일 동안 인큐베이션하고 상기 기술된 대로 진행시켰다.
k. 생체내 보호 검정
k-1 마우스 챌린지 모델
7-8-주령 암컷 BALB/c 마우스를 연구 -1일에 0.2 ml의 항체 제조물로 복막내 접종하였다. 플라세보 처리된 마우스를 유사하게 0.1 ml의 PBS 완충액으로 i.p. 접종하였다. 연구 0일에, 마우스를 흡입되는 이소플루오란을 이용하여 마취시키고 50 ㎕의 10-6-10-7 pfu의 RSV 균주 A2 또는 세포 용해물 (가상 접종물)로 비내 접종하였다. 동물이 마취로부터 완전히 회복될 때까지 직립을 유지하면서 30초 동안 접종물을 흡입하도록 하였다.
챌린지 5일 후에, 마우스를 과량의 나트륨 펜토바르비톤을 이용하여 치사시켰다. 사후에, 혈청 제조를 위해 겨드랑이 혈관으로부터의 실혈에 의해 혈액을 수득하였다. 폐를 제거하고 2.5ml의 완충액에서 살균 모래와 균질화하였다. 폐 균질화액을 원심분리시켜 모래를 침전시키고 세포 데브리스 및 상청액을 등분하여 -70℃에서 저장하였다.
바이러스 로드를, 폐 샘플 중 RSV RNA 복사체의 수를 역전사효소(RT-) PCR을 이용하여 정량함에 의해 결정하였다. RNA를 MagNA Pure LC 총 핵산 키트 (Roche Diagnostics) 자동화된 추출 시스템을 이용하여 제조자의 지시에 따라 폐 균질화액 샘플로부터 추출하였다. 단일-튜브 실시간 RT-PCR에 의해 RSV 아형 A의 N 유전자에 특이적인 프라이머 및 플루오로포어-표지된 프로브가 구비된 LightCycler 기구 및 시약 (Roche Diagnostics)을 이용하여 문헌[Whiley et al. (J. Clinical Microbiol. 2002, 40: 4418-22)]에 기술된 대로 RSV RNA의 검출을 수행하였다. 공 지된 RSV RNA 복사체 수를 지니는 샘플을 유사하게 분석하여 표준 곡선을 획득하였다.
폐 조직 샘플 중 상이한 시토킨 및 케모킨의 수준을 Rules-Based Medicine (Austin, TX)의 시판되는 다중 면역검정에 의해 이들의 설치류 다중-분석 프로필(MAP)을 이용하여 결정하였다.
k-2 코튼 래트 챌리지 모델
6-8-주령 암컷 코튼 래트 (Sigmodon hispidus)를 연구 -1일에 0.5 ml의 항체 제조물 또는 플라세보(PBS)로 복막내 접종하였다. 24시간 후에, 동물을 이소플루오란으로 약하게 마취시키고 10-6-10-7 pfu RSV 균주 A2 또는 대조군 배지(가상 접종물)의 비내 챌린지를 제공하였다. 총 부피가 100 ㎕인 접종물을 투여하고 두 콧구멍에 균일하게 분배하였다. 비내 챌린지의 완료 후에, 각 동물을 최소 30초 동안 직립 상태로 유지시켜 접종물이 완전히 흡기되게 하였다. 챌린지 5일 후에, 동물을 치사량의 펜토바르비톤의 복막내 주사에 의해 치사시키고 심장 천자에 의해 방혈시켰다. 혈청 샘플을 수득하여 -80℃에서 동결시키고, 각 동물을 폐 및 코 조직을 제거하기 위해 무균 조건하에 해부하였다. 조직 샘플을 균질화하고 상청액을 -80℃에서 등분하여 저장하였다.
조직 샘플 중 바이러스 로드를 문헌[Van Elden et al. (J Clin Microbiol. 2003, 41(9):4378-4381)]의 방법에 기초한 Taq-Man 실시간 검정에 의해 RSV RNA 복사체의 수를 정량함에 의해 측정하였다. 간단히 말해, RNA를 폐 균질액 샘플로부 터 RNeasy (Qiagen) 방법을 이용하여 제조자의 지시에 따라 추출하였다. 추출된 RNA를 cDNA로 역전사시키고 후속하여 PCR에 의해 RSV 아형 A의 N 유전자에 특이적인 표지된 프로브 및 프라이머가 구비된 Superscript III 플래티넘 원 스텝 정량적 RT-PCR 시스템 (Invitrogen)을 이용하여 증폭시켰다. 공지된 RSV 농도를 지니는 샘플을 유사하게 분석하여 표준 곡선을 획득하였다.
실시예 2
본 실시예에서, 항-RSV 특이성을 지니는 전장 항체로서 발현된 동족체 VH 및 VL 쌍을 함유하는 클로의 단리, 스크리닝, 선택 및 뱅킹(banking)을 설명한다.
공여체
RSV 활동기 동안 비도브르 병원 (Denmark)의 소아과 병동에 입원해 있는 소아의 부모 및 고용인 중에서 총 89명의 공여체를 동원하였다. 18 ml의 초기 혈액 샘플을 뽑고, CD19+ B 세포를 정제하고 (실시예 1, 섹션 a) 엘리스폿을 이용하여 항-RSV 항체의 존재에 대해 스크리닝하고 (실시예 1, 섹션 b) 혈장 세포의 빈도를 FACS 분석에 의해 결정하였다.
초기 혈액 샘플의 스크리닝에서 11개의 공여체가 포지티브인 것으로 나타났고 450 ml의 두 번째 혈액 샘플을 이들 중 10명으로부터 수집하였다. 혈장 모세포를 실시예 1, 섹션 a에 따라 단일-세포 분류하였다. 엘리스폿을 CD19 포지티브 B 세포의 분획에 대해 수행하였다.
두 번째 혈액 공여에서, 총 혈장 세포 군집 중 0.2 내지 0.6%의 RSV 특이적 혈장 세포 (IgG+ 및 IgA+)의 엘리스폿 빈도를 지니는 4개의 공여체를 동정하였다. 이러한 빈도는 동족체 VH 및 VL 쌍의 레퍼토리의 결합을 계속하는데 충분히 높은 것으로 고려되었다.
동족체 V H 및 V L 코딩 쌍의 단리
항체 레퍼토리를 엔코딩하는 핵산을 5개의 공여체로부터의 단일 세포-분류된 혈장 세포로부터 다중 중복-연장 RT-PCR에 의해 단리시켰다 (실시예 1, 섹션 c). 다중 중복-연장 RT-PCR은 중쇄 가변 영역 유전자 단편(VH) 및 전장 경쇄(LC)간에 물리적 결합을 생성한다. 하나는 VH 증폭을 위한 것이고 하나는 LC 증폭을 위한 것인 두 프라이머 세트를 이용함에 의해, 모든 VH-유전자 과 및 카파 경쇄의 항체 유전자를 증폭시키기 위한 프로토콜을 설계하였다. 역전사 및 다중 중복-연장 PCR 이후에, 결합된 서열을 네스티드 프라이머 세트를 이용하여 두 번째 PCR 증폭시켰다.
각 공여체를 개별적으로 프로세싱하고, 1480 내지 2450 중복 생성물을 다중 중복-연장 RT-PCR에 의해 생성하였다. 각 공여체로부터의 동족체 결합된 VH 및 VL 코딩 쌍의 생성된 집합을 푸울링하고, 실시예 1, 섹션 d)에 기술된 대로 포유동물 IgG 발현 벡터 (도 3)로 삽입하였다. 생성된 레퍼토리를 대장균(E.coli)으로 형질변환시키고, 20개의 384-웰 마스터 플레이트로 통합시켜 저장하였다. 레퍼토리는 공여체 당 1x106 내지 3.6xlO6개 클론으로 구성되었다.
스크리닝
IgG 항체-함유 상청액을 마스터 플레이트로부터의 세균 클론으로 제조된 DNA로 일시 트랜스펙션된 CHO 세포로부터 수득하였다. 상청액을 실시예 1, 섹션 e에 개시된 대로 스크리닝하였다. 대략 600개의 일차 히트를 서열화하고 정렬하였다. 대부분 둘 이상의 멤버의 클러스터로 되었으나, 소위 한원소집합(singleton)인 한번만 단리된 클론도 있었다. 각 클러스터로부터의 대표적인 클론 및 한원소집합에 대해 실시예 1, 섹션 e)에 개시된 확인 연구를 수행하였다. 다수의 일차 히트가, 페어링되지 않은 시스테인, 가능한 PCR 에러인 비-보존적인 돌연변이, 다중 코돈의 삽입 및/또는 결실, 및 트렁케이션과 같은 원치 않은 서열 특성으로 인해 추가의 특성화로부터 제외되었다.
총 85개의 독특한 클론이 확인을 통과하였다. 이들을 표 5에 요약한다. 각 클론 번호는 특정 VH 및 VL 쌍을 명시한다. IGHV 및 IGKV 유전자 과가 각 클론에 대해 표시되고 선택된 클론의 프레임워크 영역(FR)을 명시한다. 각 클론으로부터 발현된 항체의 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열이 도시되며, 여기서 CDRHl, CDRH2, CDRH3은 중쇄의 CDR 영역 1, 2 및 3을 나타내고 CDRLl, CDRL2 및 CDRL3은 경쇄의 CDR 영역 1, 2 및 3을 나타낸다.
완전한 가변 중쇄 및 경쇄 서열이 표 5의 정보로부터 확립될 수 있다.
표 5의 각 열에 대한 추가의 상세가 하기에 제공된다.
IGHV 및 IGKV 유전자 과 명칭이 공인 HUGO/IMGT 명명법 (IMGT; Lefranc & Lefranc, 2001, The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press)에 따라 지정되었 다. 넘버링 및 정렬은 코티아(Chothia)(Al-Lazikani et al. 1997 J. Mol. Biol. 273:927-48)에 따른다. 클론 809는 5'에서 CDRH1으로 2개의 코돈 삽입을 지니고, 이것은 연장된 CDR 루프로 번역될 것이다. 클론 831은 CDRH1의 위치 31에 1개의 코돈 결실을 지닌다.
"Ag" 열은 ELISA, FLISA 및/또는 Biacore에 의해 결정된 대로, 명명된 클론으로부터 생성된 항체에 의해 인식된 RSV 관련 항원을 나타낸다. "+"는 클론이 RSV 입자 및/또는 RSV-감염된 세포에 결합되나, 항원이 동정될 수 없었음을 나타낸다.
"에피토프" 열은 명명된 클론으로부터 생성된 항체에 의해 인식되는 항원성 부위 또는 에피토프를 나타낸다 (표 4 및 하기 참조). "U"는 에피토프가 공지되어 있지 않음을 나타낸다. UCI 및 UCII는 알려져 있지 않은 클러스터 I 및 II를 언급한다. 이러한 클러스터에 속하는 항체들은 유사한 반응성 프로필을 지니나 현재 특정 에피토프에 할당되어 있지 않다. 일부 항체는 A&C와 같은 복합 에피토프를 인식한다. ()에 표시된 에피토프는 ELISA에서만 동정되었다.
표 5: 확인된 독특한 각 클론의 서열 및 특이성의 요약
Figure 112008069716179-PCT00008
Figure 112008069716179-PCT00009
CDRH1로 명명된 열에서 상부에서 맨 밑까지의 아미노산 서열은 서열번호 201-285에서 동일한 순서로 기술된다.
CDRH2로 명명된 열에서 상부에서 맨 밑까지의 아미노산 서열은 서열번호 286-370에서 동일한 순서로 기술된다.
CDRH3으로 명명된 열에서 상부에서 맨 밑까지의 아미노산 서열은 서열번호 371-455에서 동일한 순서로 기술된다.
CDRL1로 명명된 열에서 상부에서 맨 밑까지의 아미노산 서열은 서열번호 456-540에서 동일한 순서로 기술된다.
CDRL2로 명명된 열에서 상부에서 맨 밑까지의 아미노산 서열은 서열번호 541-625에서 동일한 순서로 기술된다.
CDRL3으로 명명된 열에서 상부에서 맨 밑까지의 아미노산 서열은 서열번호 626-710에서 동일한 순서로 기술된다.
항원 특이성의 특성화
확인 동안, 클론의 항원 특이성이 바이러스 입자, 가용성 G 및 F 단백질 뿐만 아니라 G 단백질의 단편에 결합됨에 의해 일정 한도로 측정되었다.
항-F 반응성을 지니는 클론의 경우, 클론으로부터 발현된 개개 항체의 특이성을 추가로 평가하여 항원성 부위 및, 가능하다면, 개개 클론에 의해 결합된 에피토프를 결정하였다 (실시예 1, 섹션 g-4 참조). 도 4는 Biacore 분석을 이용하여 클론 801로부터 수득된 항체의 에피토프 특이성의 특성화를 설명한다. 상기 분석은, 단백질 F가 항체 801을 Biacore 세포에 주입하기 전에 133-1h 또는 팔리비주맵(각각 항원성 부위 C 및 II)에 의해 차단될 때, 높은 정도의 항체 801 결합이 검출될 수 있음을 나타낸다. 경쟁된 801 항체의 결합은 경쟁되지 않은 801 항체의 결합에 비해 약간 감소된다. 그러나 이 감소는 매우 낮아서 결합 부위에 대한 직접 경쟁 보다 아마도 입체 방해로 인한 것일 듯하다. 항체 801을 Biacore 세포로 주입하기 전에 9c5 항체에 의한 단백질 F의 차단 (항원성 부위 F1)은 F 단백질에 대한 항체 801 결합의 거의 완전한 억제를 나타낸다. 따라서, 항체 801이 F1 부위나 이에 매우 근접하게 단백질 F에 결합된다고 결론 내려진다.
항-G 반응성을 갖는 클론의 경우, 클론으로부터 발현된 개개 항체의 특이성을 추가로 평가하여 개개 항체가 G 단백질의 중심 도메인, 보존된 영역, 또는 GCRR에 결합되는지, 또는 에피토프가 보존되거나 아형 특이적인지를 결정하였다. 이것은 하기 G 단백질 단편을 이용하여 ELISA 및/또는 FLISA에 의해 수행되었다:
G(B): RSV 균주 18537로부터의 잔기 66-292 (DG44 CHO 세포에서 발현됨)
G(B) 단편: RSV 균주 18537로부터의 잔기 127-203 (대장균(E.coli)에서 발현됨)
GCRR A: RSV 균주 Long으로부터의 잔기 171-187 (선택적으로 형성된 시스테인 브릿지로 합성됨)
GCRR B: RSV 균주 18537로부터의 잔기 171-187 (선택적으로 형성된 시스테인 브릿지로 합성됨)
G 보존됨: 잔기 164-176
항-G 반응성 클론에 대해 실시예 1, 섹션 g-4에 개시된 경쟁 검정에 의해 추가의 에피토프 분석도 수행하였다.
추가로, 실시예 1, 섹션 e에 개시된 스크리닝 절차에서 동정된 클론 중 하나가 SH 특이적인 항체를 생성하였다. 추가로, 다수의 클론이 시험된 RSV 균주 중 하나 이상에 결합되나, 항원은 결정되지 않았다.
모든 확인된 클론에 대하여 항원 특이성과 관련된 데이터를 표 5에 요약한다. 확인된 클론 중 어떤 것도 사람 후두 상피 세포에 결합되지 않았고, 시험된 G-특이적인 클론(793, 816, 835, 841, 853, 855, 856 및 888) 중 어떤 것도 사람 프랙트알킨(CX3CL1)에 결합되지 않았다.
결합 동력학의 특성화
재조합 RSV 항원에 대한 결합 친화력을 다수의 항체 클론에 대한 표면 플라스몬 공명에 의해 결정하였다. 전장 항체의 효소 절단에 의해 제조된 Fab 단편으로 분석을 수행하였다. 피코몰 내지 나노몰의 KD 값을 지니는 다수의 고-친화력 항체 클론에 대한 데이터를 표 6에 제시한다. 시판되는 팔리비주맵(Synagis)으로부터 유래된 Fab 단편을 참조에 대해 유사하게 분석하였다.
표 6: 선택된 클론의 동력학 결합 상수 및 친화력
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Figure 112008069716179-PCT00011
개개 항체를 발현시키는 클론의 세포 뱅크의 생성
표 5에 개시된 클론 번호 735, 736, 744, 793, 795, 796, 799, 800, 801, 804, 810, 811, 812, 814, 816, 817, 818, 819, 824, 825, 827, 828, 829, 830, 831, 835, 838, 841, 853, 855, 856, 857, 858, 859, 861, 863, 868, 870, 871, 880, 881, 884, 885, 886, 888, 894 및 955에 상응하는 47개의 독특한 동족체 VH 및 VL 코딩 쌍의 서브세트를, 각각 단일 VH 및 VL 유전자 서열로부터 독특한 항체를 발현시키는 안정한 개개 발현 세포주의 생성을 위해 선택하였다. 44개의 선택된 클론 (828, 885 및 955를 제외하고 상기-언급됨)의 완전한 서열(DNA 및 추론된 아미노산)을 서열번호 1-176으로 도시한다.
서열번호 1-44로 기술된, 하기 VH 서열을 생성함에 의해 44개 클론의 특성을 나타낸다:
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이러한 VH 아미노산 서열은 하기 핵산 서열에 의해 엔코딩된 클론에 있고, 이들을 또한 서열번호 45-88로 기술한다:
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동일한 클론에서, 경쇄(즉, 불변 및 가변 영역을 포함하는 경쇄)의 완전한 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 지니며, 이들을 또한 서열번호 89-132로 기술한다:
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상기 클론에서 핵산 단편을 엔코딩하는 경쇄는 하기 핵산 서열을 지니며, 이 들을 또한 서열번호 133-176으로 제공한다:
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Figure 112008069716179-PCT00043
Figure 112008069716179-PCT00044
상기 논의된 44개 클론 모두에서, 엔코딩된 항체는 동일한 불변 IgG 중쇄를 포함하며, 이것은 하기 아미노산 서열(서열번호 178)을 지닌다:
Figure 112008069716179-PCT00045
이 중쇄를 엔코딩하는 게놈 서열은 하기 핵산 서열(서열번호 177)을 지닌다:
Figure 112008069716179-PCT00046
상기 서열에서, 엑손은 이중 밑줄로 표시한다. 추가로, 최초 Ser-엔코딩 누클레오티드 agt (굵은 밑줄)가, IgG 발현 벡터에서 가변 중쇄 부위를 엔코딩하는 XhoI 소화된 PCR 생성물을 XhoI 소화된 발현 벡터에 도입시킨 결과로 생성된다.
상기-논의된 VH 및 VL 코딩 쌍이 ELISA 및/또는 FLISA, 에피토프 맵핑, 항원 다양성 및 서열 다양성에서 다양한 항원 및 펩티드에 대한 결합 특이성에 따라 선택되었다. 에러가 확인되는 경우, 선택된 동족체 V-유전자 쌍을 클론 수복시켰다 (실시예 1, 섹션 f). 개개 발현 구성물을 Flp-리콤비나아제 발현 플라스미드를 이용하여 CHO-FlpIn 수용체 세포주(Invitrogen)로 공-트랜스펙션시켰고, 인터그란트의 항생제 선택이 이어졌다. 트랜스펙션, 선택 및 무혈청 배양에 대한 조정이 실시예 1, 섹션 g-1 및 g-2에 기술된 대로 수행되었다.
안정하게 트랜스펙션된, 무혈청 현탁 배양 조정된 개개 발현 세포주를 다중 앰플에서 저온보존시켜 개개 항체를 생성하는 세포주의 세포 뱅크를 생성하였다.
실시예 3
단일 항체 클론 및 정제된 항체의 조합물 둘 모두를 이용하여 시험관내 중화 실험을 수행하였다. 하기 개시된 모든 항체 혼합물은 다수의 본 발명의 개개 항-RSV 항체로 구성되었고, 이것을 동일 량의 상이한 항체를 이용하여 혼합물로 조합시켰다.
단일 항체의 시험
초기에, 각 항체의 중화 활성을 실시예 1, 섹션 j-2에 상기 개시된 대로 RSV 아형 A 및 B 균주에 대한 보체의 존재하에 RPNT에서 측정하였다. 다수의 정제된 항체의 EC50 값을 표 7에 도시한다. 흥미롭게도, 대부분의 항-F 항체가 개별적으로 바이러스 중화 활성을 나타내었으나, 항-RSV 단백질 G 항체의 대부분에 대해서는 EC50 값이 결정될 수 없었고, 이는 이러한 항체가 개별적으로 비레오(vireo)를 중화시킬 수 없음을 나타낸다. 빈 칸은 분석이 아직 수행되지 않았음을 나타낸다. ND는 중화 활성이 매우 낮거나 없기 때문에 PRNT에서 EC50 값이 측정될 수 없었음을 나타낸다.
표 7: RSV 아형에 대한 정제된 항-RSV 단백질 F 및 단백질 G 항체의 EC50 값
Figure 112008069716179-PCT00047
Figure 112008069716179-PCT00048
항-F 항체의 혼합물
RSV 균주의 아형 A 및 B를 중화시키는 항-RSV 단백질 F 항체의 혼합물의 능력을 팔리비주맵 (또한 항-F 항체)을 이용하여 수득된 중화 효과와 비교하였다. 중화 용량을 실시예 1, 섹션 j에 기술된 미세중화 시험 또는 PRNT를 이용하여 평가하였다. 초기 실험에서, 5개 및 11개의 별개의 항-F 항체를 각각 함유하는 두 항체 혼합물, 항-F(I) 및 항-F(II)를 미세중화 시험을 이용하여 팔리비주맵에 대해 비교하였다. 항-F(I)는 클론 810, 818, 819, 825 및 827로부터 수득된 항체로 구성된다. 항체 810 및 819는 항원성 부위 A/II에 결합되고, 항체 818은 부위 B/I 또는 F1에 결합되며, 항체 825는 부위 A 및 C와 중복되는 복합 에피토프에 결합되 고, 항체 827은 또 다른 복합 에피토프에 결합된다 (표 5 참조). 항-F(II)는 클론 735, 800, 810, 818, 819, 825, 827, 863, 880, 884 및 894로부터 수득된 항체로 구성된다. 항-F(II)는 정의된 항원성 부위의 일부에 대한 다중 결합제를 함유한다: 항체 810, 819 및 863은 A/II에 결합되고, 항체 800 및 818은 F1(또는 B/I)에 결합되며, 항체 827 및 825는 상기 기술된 복합 에피토프에 결합되고, 항체 735 및 894는 알려지지 않은 클러스터 (UC)I, 항체 880은 UCII에 속하고, 항체 884는 현재 알려지지 않은 또 다른 에피토프에 결합된다 (표 5 참조). 도 5에 도시된 대로, 항-F(I) 및 항-F(II)의 두 조성물 모두는 RSV 균주의 두 아형 모두의 중화에 대하여 파리비주맵보다 유효하다.
도 5는 5개 항체의 조합물이 (항-F(I)) 11개 항체의 조합물 (항-F(II)) 보다 더 효과적인 것처럼 보임을 도시한다. 항-F(I) 혼합물은 지금까지 정의된 상이한 에피토프 특이성을 지니는 가장 유효한 개별적인 중화 항체의 일부를 함유한다. 항-F(II) 혼합물은 매우 유효한 5개의 동일한 항체를 함유하나, 정의된 에피토프의 일부에 대한 추가의 결합제도 함유하며, 포함된 항체는 그들 자신에 대해 더 넓은 범위의 중화 활성도 나타낸다. 따라서, 고도로 유효한 항체의 활성은 F 단백질 상의 중화 에피토프에 대한 결합의 경쟁으로 인해 항-F(II) 조합물에서 희석되어 질 수 있다. 그러나, 생체내에서 고려될 때, 증가된 포식작용, 증가된-항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC), 항-염증 효과, 보체 활성화 및 도피 돌연변의 생성 가능성의 감소와 같은, 각 개개 항체와 관련된 중화 항체와 다른 효과가 잠재적으로 있으므로, 이 결과는, 5개의 혼합물이 생체내에서 사용시 11개 항체의 혼합물 보다 양 호함을 나타내는 것으로 고려되어서는 안된다.
시험관내 검정 및 클론의 조합 둘 모두는, 이러한 초기 실험 및 보체의 존재하에 고도로 유효한 F-특이적인 항체 클론의 다수의 조합물이 동정되었기 때문에 세밀히 논의되어 왔다. EC50 값(플라크의 수를 50% 감소시키는데 요구되는 유효 농도)으로 표시되는 추가의 항-F 항체 조성물의 중화 효능이 표 8에 나열된다. 조성물의 클론의 정확한 번호와 무관하에, F-특이적인 항체의 시험된 조합물의 대부분은 RSV 균주 아형 A의 중화와 관련하여 팔라비주맵보다 더욱 효과적이다.
항-G 항체의 혼합물
RSV 균주의 아형 A를 중화시키는 항-G 항체의 혼합물의 능력을 실시예 1, 섹션 j-2에 개시된 대로 PRNT를 이용하여 시험하였다. 시험된 항-G 항체 조성물로부터의 EC50 값을 표 8에 나열한다. 두 항-G 항체의 조성물의 대부분은 개개 항-G 항체에 비해 바이러스를 중화시키는데 있어서 현저히 증가된 능력을 나타내지 않았다. 둘 또는 3개의 항-G 항체의 일부 조합물은 농도와 무관하게 바이러스의 100% 중화에 도달하지 못했다. 그러나, 추가의 항-G 항체가 조성물에 첨가되었을 때, 효능이 증가되었고, 이것은 아미도, 항-G 항체간의 상승적인 중화 효과를 나타낸다. 도 7은 다중 G-특이적인 클론을 조합시켰을 때 효능의 증가 예를 도시한다.
항-F 및 항-G 항체의 혼합물
RSV 아형 B 균주를 중화시키는 항-RSV 단백질 F 및 G 항체의 혼합물의 능력을 팔리비주맵을 이용하여 수득된 중화 효과와 비교하였다. 중화 용량을 실시예 1, 섹션 j-4에 개시된 미세중화 융합 억제 검정 또는 플라크 감소 중화 검정(실시예 1, 섹션 j-2)를 이용하여 평가하였다.
초기에, 두 항체 혼합물, 항-F(I)G 및 항-F(II)G의 중화 활성을 미세중화 융합 억제 검정으로 측정하였다. 이러한 혼합물 각각은 상기 개시된 조성물 항-F(I) 및 항-F(II)의 항-F 항체를 함유할 뿐만 아니라 클론 793, 796, 838, 841, 856 및 888로부터 수득된 항-G 항체를 함유하고, 여기서 항체 793, 796, 838은 G 단백질의 보존된 영역에 결합되고, 841, 856은 RSV 아형 A의 GCRR에 결합되며 888은 두 아형 모두의 GCRR에 결합된다 (표 5 참조). 도 6에 도시된 대로, 조성물 항-F(I)G 및 항-F(II)G 둘 모두는 RSV B1 균주의 중화와 관련하여 팔리비주맵 보다 더욱 효과적이다. 추가로, 두 혼합물의 중화 활성은 얼마간 동일하다. 따라서, 항-F 항체가 다수의 단백질 G-특이적인 클론과 조합될 때, 사전에 두 항-F 항체 혼합물에서 관찰된 효능 차이는 감소된다. 이것은, RSV 상에서 넓은 범위의 항원 및 에피토프를 인식하는 항체가 조합될 때 중화 활성이 일반적으로 증가됨을 나타낼 수 있다.
항-F 및 항-G 항체 둘 모두의 많은 수의 상이한 조합물이 그 이후에 보체의 존재 또는 부재하에 PRNT에서 시험되었다. 활성 보체의 존재하에 상기 검정에서 수득된 EC50 값을 표 8에 제시한다. 항-F 및 항-G 항체 둘 모두를 포함하는 시험된 조성물 모두는 RSV 아형 A를 중화시키며 이들 대다수는 팔리비주맵보다 효과적이다.
이 결과는 또한, 자연적인 고 친화력의 항체가 본 발명의 항체 클로닝 기술 을 이용하여 사람 공여체로부터 반복적으로 수득될 수 있었음을 나타낸다.
표 8: RSV 아형 A 및 B에 대한 항-RSV 항체의 조합물의 EC50 값. 빈 칸은 분석이 아직 수행되지 않았음을 나타낸다. ND는 중화 활성이 매우 낮거나 없기 때문에 PRNT에서 EC50 값이 측정될 수 없었음을 나타낸다.
Figure 112008069716179-PCT00049
Figure 112008069716179-PCT00050
Figure 112008069716179-PCT00051
실시예 4
RSV-감염된 마우스의 폐에서 바이러스 로드의 감소
RSV 감염에 대한 본 발명의 정제된 항체의 조합물의 생체내 보호 용량을 실시예 1, 섹션 k-1에 기술된 대로 BALB/c 마우스 모델에서 입증하였다 (Taylor et al. 1984. Immunology 52, 137-142; Mejias, et al. 2005. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 4700-4707). 표 9에서, 동일 량의 본 발명의 상이한 항체 클론(표 8에 개시됨)으로 구성된 3개의 상이한 항-RSV rpAb를 이용한 실험으로부터의 데이터를 동일한 실험의 감염되지 않은 대조군 동물 및 플라세보(PBS) 처리된 동물로부터의 데이터와 비교하여 제시한다. 5마리의 마우스를 함유하는 각 처리 그룹 및 샘플을 감염후 5일째에 수득하였고, 이것은 상기 모델에서 대략 바이러스 복제의 피크에 있는 것이다. 표 9에 도시한 대로, rpAb 조합물은 예방적으로 제공시에 적어도 그 수치의 10배까지 바이러스 로드를 효과적으로 감소시켰다. 복사체 수를 평균±표준 오차로서 표시한다. 복사체 수는 처리 그룹 중 둘에 대하여 상기 검정의 검출 한계, 즉 3.8 log10 RNA 복사체/ml에 있거나 또는 그 미만이다.
표 9: 예방 조치 및 RSV 챌린지 이후 마우스의 폐에서 바이러스 로드
Figure 112008069716179-PCT00052
RSV 감염된 마우스로부터의 폐 샘플에서 시토킨 및 케모킨 수준
파일롯 마우스 예방 연구로부터 폐 샘플을 시판되는 다중 면역검정으로 분석하여 실시예 1, 섹션 k-1에 개시된 RSV 감염 및 rpAb 18(표 8)을 이용한 항체 예방 이후 상이한 시토킨 및 케모킨 수준을 결정하였다. 비감염되고 비처리된 동물로부터의 샘플도 분석하여 BALB/c 마우스에 대한 기준 데이터도 수득하였다. 모든 샘플을 감염 후 5일째에 수득하였다. 데이터를 평균±표준 오차로서 표시한다.
상기 분석은, 사람 및 마우스 둘 모두에서 RSV 감염 및 후속하는 염증 반응의 중요한 마커로서 지적되는, 인터페론(IFN)-γ, 인터루킨 (IL)-1β, IL-4, IL-6, IL-8(KC/GROα), IL-10, 매크로파지 염증 단백질(MIP)-1α, 정상적인 T 세포의 활성화시에 발현되고 분비되는 조절된 (RANTES, CCL5) 및 종양 괴사 인자(TNF-α)를 포함하는 다수의 시토킨 및 케모킨의 수준이 플라세보-처리된 동물의 폐에서 증가된 반면, 약 50 mg/kg의 rpAb로 처리된 동물의 폐는 감염되지 않은 대조군 동물과 동등한 다소의 수준을 지녔음을 나타낸다. 다른 항-RSV rpAb 조합물의 경우에도 유사한 결과가 수득되었다. 마우스는 IL-8에 대하여 상동인 클리어-컷(clear-cut)을 지니지 않았으나, 이들은 KC로 명명된 사람 GROα(IL-8과 유사한 기능)와 기능적 상동성을 지님을 주목해야 한다.
염증 반응의 동력학 및 항체 예방의 용량-반응 효과는 조사되지 않았다.
표 10: RSV 감염된 마우스로부터의 폐 조직에서 시토킨 및 케모킨의 수준
Figure 112008069716179-PCT00053
SEQUENCE LISTING <110> Symphogen A/S <120> Recombinant Polyclonal Antibody for Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infections <130> 16823PCT00 <160> 714 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asn Gly Ala Ile Gly Asp Tyr 20 25 30 Asp Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Tyr Arg Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Met Ser Leu Arg Thr Ser Thr Met Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Ala Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Val Gly Tyr Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Met Asp Val Trp 100 105 110 Ser Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 129 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Thr Gln Asp Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Val Tyr 65 70 75 80 Val Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Met Asp Tyr Tyr Gly Ser Arg Ser Tyr Ser Val Thr Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 3 <211> 125 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala His 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Gly Thr Met Gly Thr Asn Ser Trp Tyr Gly Trp Phe 100 105 110 Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 127 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Gly Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Asn Arg Gly Gly Thr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Ile Leu Ala Leu Pro Thr Ala Thr Val Glu Leu Gly 100 105 110 Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 126 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Arg Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Phe His Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Ala Val Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Val Asp Asp Phe Pro Val Trp Gly Met Asn Arg Tyr 100 105 110 Leu Ala Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 6 <211> 124 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser His Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Val His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Asp Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Asp Val Ala Thr Asp Leu Ala Ala Tyr Tyr Tyr Phe Asp 100 105 110 Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 123 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Phe Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Thr Val Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Val Gln Val Trp Leu His Leu Gly Leu Phe Asp Asn 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 122 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp His Asp Gly Ser Asn Lys Asn Tyr Leu Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Pro Tyr Glu Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 116 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Tyr Tyr Glu Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Trp Leu Gly Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ser Ala Thr Ser Thr Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Thr Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Ser Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Phe Trp Gly Phe Gly Asn Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 122 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Gly Thr Phe Gly Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Val Phe Asp Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Asn Thr Ala Ile 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Pro Gln Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Leu Arg Gly Ser Thr Arg Gly Trp Asp 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Glu Trp Val 35 40 45 Gly Met Ile Leu Pro Ile Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Thr Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Ile Ile Ser Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val Phe Arg Glu Phe Ser Thr Ser Thr Leu Asp Pro Tyr Tyr 100 105 110 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 14 <211> 125 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Arg Leu Met Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ala Asn Glu Tyr Tyr Ala Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Gly Arg Ser Ser Met Asn Glu Glu Val Ile Met Tyr Phe 100 105 110 Asp Asn Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val 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ctgcaaatga acagcctgag agatgacgac acgggtgtgt attactgtgc gaaggacgac 300 gtggcgacag atttggctgc ctactactac ttcgatgtct ggggccgtgg caccctggtc 360 accgtctcga gt 372 <210> 51 <211> 369 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 51 caggtgcagc tggtggagtc tgggggcggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgaaactc 60 tcttgtgaag cctctggatt caacttcaat aattatggca tgcactgggt ccgccaggca 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttcatatg acggaagaaa taagtatttt 180 gctgactccg tgaagggccg attcatcatc tccagagacg attccaggaa cacagtgttt 240 ctgcaaatga acagcctgcg agttgaagat acggccgtct attactgtgc gagaggcagc 300 gtacaagtct ggctacattt gggacttttt gacaactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagt 369 <210> 52 <211> 366 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 52 caggtgcagc tggtggagtc tgggggagcc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgaag tgtctggatt cagtttcagt gactatggca tgaactgggt ccgccagggt 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggcatg acggaagtaa taaaaattat 180 ctagactccg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca attccaagaa cacattgttt 240 ctgcaaatga 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ctaggctacg gtggtaactc ttactcccac tcctactact acggtttgga cgtctggggc 360 cgagggacca cggtcaccgt ctcgagt 387 <210> 63 <211> 357 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 63 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcgga aattactact ggggctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gacttgagtg gattgggcat atctacttcg gtggcaacac caactacaac 180 ccttccctcc agagtcgagt caccatttca gtcgacacgt ccaggaacca gttctccctg 240 aagttgaact ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag ggatagcagc 300 aactggcccg caggctatga ggactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagt 357 <210> 64 <211> 369 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 64 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg tttctggtta cacctttacc agtaatggtc tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggtttgagtg gctgggatgg atcagcgcta gtagtggaaa caaaaagtat 180 gccccgaaat tccagggaag agtcaccttg accacagaca tttccacgag cacagcctac 240 atggaactga ggagtctgag atctgacgat acggccgtat attactgtgc gaaagatggg 300 ggcacctacg 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11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 684 Cys Gln His Phe Ala Asn Leu Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 685 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 685 Cys Gln Arg Tyr Asn Ser Ala Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 686 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 686 Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ile Phe Thr Phe 1 5 10 <210> 687 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 687 Cys Gln Gln Arg Ser Asp Trp Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 688 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 688 Cys Gln Gln Leu Asn Ile Tyr Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 689 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 689 Cys Gln His Phe Ala Asn Leu Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 690 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 690 Cys Gln Glu Tyr Asn Asn Trp Pro Leu Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 691 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 691 Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Thr Pro Ile Thr Phe 1 5 10 <210> 692 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 692 Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ile Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 693 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 693 Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Phe Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 694 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 694 Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 695 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 695 Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Gln Thr Phe 1 5 10 <210> 696 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 696 Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 697 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 697 Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Val Pro Arg Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 698 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 698 Cys Gln Glu Ser Phe Ser Ser Ser Thr Phe 1 5 10 <210> 699 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 699 Cys Gln His Arg Arg Ser Trp Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 700 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 700 Cys Gln Gln Tyr Asn Met Trp Pro Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 701 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 701 Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 702 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 702 Cys Met Gln Ser Leu Gln Thr Ser Ile Thr Phe 1 5 10 <210> 703 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 703 Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 704 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 704 Cys Gln Gln Gly His Ser Thr Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 705 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 705 Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Arg Thr Phe 1 5 10 <210> 706 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 706 Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 707 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 707 Cys Leu Gln Ala Thr Gln Phe Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 708 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 708 Cys Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Glu Thr Phe 1 5 10 <210> 709 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 709 Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Trp Leu Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 710 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 710 Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 711 <211> 298 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 711 Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Lys Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Gly Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Ile Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Thr Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr 65 70 75 80 Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asp Pro Gln 85 90 95 Leu Gly Ile Ser Phe Ser Asn Leu Ser Glu Ile Thr Ser Gln Thr Thr 100 105 110 Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Gly Val Lys Ser Asn Leu Gln Pro 115 120 125 Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser 130 135 140 Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn 145 150 155 160 Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys 165 170 175 Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys 180 185 190 Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe 195 200 205 Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu 210 215 220 Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Glu Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys 225 230 235 240 Thr Asn Ile Ile Thr Thr Leu Leu Thr Asn Asn Thr Thr Gly Asn Pro 245 250 255 Lys Leu Thr Ser Gln Met Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly 260 265 270 Asn Leu Ser Pro Ser Gln Val Ser Thr Thr Ser Glu His Pro Ser Gln 275 280 285 Pro Ser Ser Pro Pro Asn Thr Thr Arg Gln 290 295 <210> 712 <211> 292 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 712 Met Ser Lys His Lys Asn Gln Arg Thr Ala Arg Thr Leu Glu Lys Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Ile Val Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Arg 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Ile Ala Gln Ile Ala Leu Ser Val Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ile Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Val Thr Val Gln Thr Ile Lys 65 70 75 80 Asn His Thr Glu Lys Asn Ile Ser Thr Tyr Leu Thr Gln Val Pro Pro 85 90 95 Glu Arg Val Asn Ser Ser Lys Gln Pro Thr Thr Thr Ser Pro Ile His 100 105 110 Thr Asn Ser Ala Thr Ile Ser Pro Asn Thr Lys Ser Glu Thr His His 115 120 125 Thr Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gln Thr Asn 130 135 140 Lys Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys 145 150 155 160 Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys 165 170 175 Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn 180 185 190 Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr 195 200 205 Lys Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys 210 215 220 Lys Glu Ile Ile Thr Asn Pro Ala Lys Lys Pro Thr Leu Lys Thr Thr 225 230 235 240 Glu Arg Asp Thr Ser Ile Ser Gln Ser Thr Val Leu Asp Thr Ile Thr 245 250 255 Pro Lys Tyr Thr Ile Gln Gln Gln Ser Leu His Ser Thr Thr Ser Glu 260 265 270 Asn Thr Pro Ser Ser Thr Gln Ile Pro Thr Ala Ser Glu Pro Ser Thr 275 280 285 Leu Asn Pro Asn 290 <210> 713 <211> 77 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 713 Gln Pro Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln 1 5 10 15 Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys 20 25 30 Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser 35 40 45 Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro 50 55 60 Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr 65 70 75 <210> 714 <211> 77 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 714 His His Thr Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gln 1 5 10 15 Thr Asn Lys Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys 20 25 30 Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser 35 40 45 Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro 50 55 60 Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr 65 70 75

Claims (50)

  1. RSV 아형(subtype) A 및 B를 중화시킬 수 있는 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체로서, 하나 이상의 RSV 외피 단백질 상에서 셋 이상의 상이한 에피토프에 공동으로 특이적으로 결합되는 별개의 항체 멤버를 포함하는 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체.
  2. 제 1항에 있어서, 폴리클로날 항체가 둘 이상의 RSV 외피 단백질에 대한 결합 반응성을 함께 제공하는 별개의 항체 멤버를 포함하는 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, RSV 외피 단백질이, RSV G 단백질(수용체-결합 당단백질), RSV F 단백질(융합 당단백질) 및 RSV SH(소형 소수성) 단백질로부터 선택되는 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 항-외피 단백질 반응성이 항-G 및 항-F 반응성이고, 이 반응성이 둘 이상의 별개의 항-G 항체 및 하나 이상의 별개의 항-F 항체에 의해 제공되는 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체.
  5. 제 4항에 있어서, 첫 번째 항-G 항체가 G-단백질 상의 보존된 에피토프에 특 이적으로 결합될 수 있고, 두 번째 항-G 항체가 G 단백질 시스테인-부화 영역(GCRR)에 특이적으로 결합될 수 있으며, 항-F 반응성이 항원성 부위 I. II, IV, V, VI, C 또는 F1 중 하나 이상에 대해 유도되는 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 항-G 반응성의 적어도 일부가 CX3C 모티프에 대해 유도되는 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체.
  7. 제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 항-G 반응성이 하나 이상의 균주 특이적인 에피토프에 대해 유도되는 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체.
  8. 제 4항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서, 항-F 반응성이 적어도 항원성 부위 II 및 항원성 부위 IV에 대해 유도되는 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 항-외피 단백질 반응성이 SH 단백질에 대해 유도되거나, 제 4항 내지 제 8항 중의 어느 한 항과 관련하여 SH 단백질에 대해 추가로 유도되는 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 있어서, 별개의 항체 멤버들의 조성물이 RSV 외피 항원에 대한 다양성, 친화력 및 특이성과 관련하여 공여체에서 체액성 면역 반응을 반영(mirror)하는 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 있어서, 별개의 항체가 RSV에 대해 체액성 면역 반응을 일으키는 하나 이상의 사람 공여체로부터 수득된 핵산 서열에 의해 엔코딩되고, 폴리클로날 항체가 완전한 사람 항체인 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 별개의 항체 멤버가 공여체(들)에 본래 존재하는 VH 및 VL 쌍으로 구성되는 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 있어서, 별개의 각 멤버가 표 5에 제시된 VH 및 VL 쌍의 군으로부터 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체.
  14. 활성 성분으로서 제 1항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 따른 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 유효량의 제 1항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 따른 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체 또는 제 14항에 따른 약제학적 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에서 RSV 감염과 관련된 하나 이상의 징후를 예방, 치료 또는 개선시키는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 유효량이 체중 1 kg에 대하여 항체가 100 mg 이하, 예컨대 90 mg 이하, 80 mg 이하, 70 mg 이하, 60mg 이하, 50 mg 이하, 40 mg 이하, 30 mg 이하, 20 mg 이하, 10 mg 이하, 9 mg 이하, 8 mg 이하, 7 mg 이하, 6 mg 이하, 5 mg 이하, 4 mg 이하, 3 mg 이하, 2 mg 이하, 1 mg 이하, 0.9 mg 이하, 0.8 mg 이하, 0.7 mg 이하, 0.6 mg 이하, 0.5 mg 이하, 0.4 mg 이하, 0.3 mg 이하, 0.2 mg 이하, 및 0.1 mg 이하인 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 유효량이 체중 1 kg에 대하여 항체가 0.01 mg 이상, 예컨대, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 mg 이상인 방법.
  18. 제 15항에 있어서, 유효량이 체중 1 kg에 대하여 항체가 0.1 - 20 mg인 방법.
  19. 제 15항 내지 제 18항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 1년에 1회 이상 투여되며, 예컨대 1년에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19회 투여되는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 항체가, 1년 중 RSV 감염에 걸릴 위험이 증가되는 시기 동안 규칙적인 간격으로 투여되는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 규칙적인 간격이 매주, 격주, 매달, 또는 격월인 방법.
  22. 포유동물에서 RSV 감염과 관련된 하나 이상의 징후를 치료 개선 또는 예방하는 조성물을 제조하기 위한 제 1항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 따른 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체 또는 제 14항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  23. a. RSV 감염된 공여체 또는 RSV 감염증으로부터 회복된 공여체로부터 림프구-함유 세포 분획을 제공하고;
    b. 상기 세포 분획으로부터 임의로 B 세포 또는 혈장 세포를 분화시키고;
    c. 세포 분획으로부터의 세포를 개별적으로 다수의 용기로 분배시키는 것을 포함하여 단리된 단일 세포의 군집을 수득하고;
    d. 다중 중복 연장 RT-PCR 공정으로 상기 단리된 단일 세포로부터 유래된 주형을 이용하여 VH 및 VL 코딩 쌍의 결합을 증폭시키고 수행하며;
    e. 결합된 VH 및 VL 코딩 쌍의 네스티드 PCR을 임의로 수행하는 것을 포함하며, 멤버가 RSV 감염으로부터 초래된 체액성 면역 반응의 원인이 되는 유전자 쌍을 반영하는, VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리를 생성하는 방법.
  24. 제 1항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 따른 재조합 폴리클로날 항-RSV 항체를 발현시킬 수 있는 폴리클로날 세포주.
  25. 각 개개 세포가 단일 VH 및 VL 코딩 쌍을 발현시킬 수 있고 폴리클로날 세포주가 전체로서 항-RSV 항체를 각각 엔코딩하는 VH 및 VL 코딩 쌍의 집합을 발현시킬 수 있는 폴리클로날 세포주.
  26. 제 25항에 있어서, VH 및 VL 코딩 쌍의 집합이 제 23항의 방법에 따라 생성되는 폴리클로날 세포주.
  27. 표 5에 기술된 항체 분자로부터 선택된 단리된 사람 항 RSV-항체 분자, 또는 결합 단편 또는 유사체가 적어도 상기 단리된 항체 분자의 상보성-결정 영역(CDR)을 포함하는, 상기 항체 분자의 특이적인 결합 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체 유사체.
  28. 제 27항에 있어서, 표 8에 나열된 항체로부터 유래되거나, 서열번호 1-44 중 하나에 포함된 중쇄 CDR 아미노산 서열 및 서열번호 144로부터 선택된 아미노산 서열 보다 88개 더 높은 서열번호를 지니는 수반되는 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함 하는 항체 분자, 단편 또는 유사체.
  29. 사람 항체로부터 유래된 Fab의 CDR과 동일한 CDR을 포함하고, Fab는, 질량 전달에서의 제한을 회피하기 위해 매우 저 밀도에서 센서 표면상에 고정된 재조합 RSV G 단백질을 이용하여 Biacore 3000상에서 표면 플라스몬 공명 분석을 수행하여 측정시, RSV G 단백질에 대해 500 nM 이하의 해리 상수(KD)를 지니는 단리된 항체 분자, 항체 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체 유사체.
  30. 제 29항에 있어서, KD가 400 nM 이하, 예컨대 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 1 nM 이하, 900 pM 이하, 800 pM 이하, 700 pM 이하, 600 pM 이하, 500 pM 이하, 400 pM 이하, 300 pM 이하, 200 pM 이하, 100 pM 이하, 90 pM 이하, 및 80 pM 이하인 단리된 항체 분자, 항체 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체.
  31. 사람 항체로부터 유래된 Fab의 항원 결합 부위와 동일한 항원 결합 부위를 포함하고, 상기 Fab는, 질량 전달에서의 제한을 회피하기 위해 매우 저 밀도에서 센서 표면상에 고정된 재조합 RSV F 단백질을 이용하여 Biacore 3000상에서 표면 플라스몬 공명 분석을 수행하여 측정시, RSV F 단백질에 대해 500 nM 이하의 해리 상수(KD)를 지니는 단리된 항체 분자, 항체 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체.
  32. 제 31항에 있어서, KD가 400 nM 이하, 예컨대 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 1 nM 이하, 900 pM 이하, 800 pM 이하, 700 pM 이하, 600 pM 이하, 500 pM 이하, 400 pM 이하, 300 pM 이하, 200 pM 이하, 100 pM 이하, 90 pM 이하, 80 pM 이하, 70 pM 이하, 60 pM 이하, 50 pM 이하, 40 pM 이하, 30 pM 이하, 25 pM 이하, 20 pM 이하, 15 pM 이하, 10 pM 이하, 9 pM 이하, 8 pM 이하, 7 pM 이하, 6 pM 이하, 및 5 pM 이하인 단리된 항체, 항체 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체.
  33. 제 27항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 클론 번호 810, 818, 819, 824, 825, 827, 858 또는 894에서 생성된 사람 항체의 CDR을 포함하는 항체 분자 또는 특이적인 결합 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체 유사체.
  34. 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 비히클 또는 희석제와 혼합하여 제 27항 내지 제 33항 중의 어느 한 항에 따른 항체 분자, 특이적인 결합 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체 유사체를 포함하는 항체 조성물.
  35. 제 34항에 있어서, 제 27항 내지 제 33항 중의 어느 한 항에 따른 두 별개의 항체 분자 및/또는 특이적인 결합 단편 및/또는 합성 또는 반-합성 항체 유사체를 포함하는 조성물.
  36. 제 34항에 있어서, 제 27항 내지 제 33항 중의 어느 한 항에 따른 셋 이상의 별개의 항체 분자 및/또는 항체 단편 및/또는 합성 또는 반합성 항체 유사체, 특이적인 결합 단편 또는 합성 또는 반-합성 항체 유사체를 포함하고, 예컨대 조성물이 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 별개의 항체 분자 및/또는 단편 및/또는 합성 또는 반-합성 항체 유사체를 포함하는 조성물.
  37. 제 34항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, RSV F 단백질에 결합되는 하나 이상의 항체 분자, 단편 또는 유사체 및 RSV G 단백질에 결합되는 하나 이상의 항체, 단편 또는 유사체를 포함하는 조성물.
  38. 제 27항 내지 제 33항 중의 어느 한 항에 정의된 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열을 엔코딩하는 단리된 핵산 단편.
  39. 적어도 표 5에 나열된 클론 중 하나에 의해 생성된 항체의 CDR을 엔코딩하는 단리된 핵산 단편.
  40. 서열번호 1-44 중 임의의 하나에 기술된 중쇄 아미노산 서열의 CDR 서열을 엔코딩하는 단리된 핵산 단편.
  41. 서열번호 89-132 중 임의의 하나에 기술된 경쇄 아미노산 서열의 CDR 서열을 엔코딩하는 단리된 핵산 단편.
  42. 서열번호 1-44 중 임의의 하나에 기술된 중쇄 아미노산 서열의 CDR 서열 및 서열번호 144로부터 선택된 아미노산 서열 보다 88개 더 높은 서열번호를 지니는 수반되는 경쇄 CDR 아미노산 서열을 엔코딩하는 단리된 핵산 단편.
  43. 제 38항 내지 제 42항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열번호 45-88 및/또는 133-176에 포함된 코딩 서열을 포함하는 핵산 단편.
  44. 제 38항 내지 제 43항 중의 어느 한 항에 따른 핵산 단편을 포함하는 벡터.
  45. 제 44항에 있어서, 자가 복제될 수 있는 벡터.
  46. 제 44항 또는 제 45항에 있어서, 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니-염색체 및 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 벡터.
  47. 제 44항 내지 제 46항 중의 어느 한 항에 있어서,
    5'→3' 방향으로 작동가능한 결합에서 필요한 프레임워크 영역과 함께 하나 이상의 경쇄 CDR을 엔코딩하는, 제 38항 내지 제 43항 중의 어느 한 항에 따른 첫 번째 핵산 단편의 발현을 수행하기 위한 하나 이상의 프로모터, 임의로 리더 펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열, 상기 첫 번째 핵산 단편, 임의로 불변 영역을 엔코딩하는 핵산 서열, 및 임의로 첫 번째 종결인자를 엔코딩하는 핵산 서열, 및/또는
    5'→3' 방향으로 작동가능한 결합에서 필요한 프레임워크 영역과 함께 하나 이상의 중쇄 CDR을 엔코딩하는, 제 38항 내지 제 43항 중의 어느 한 항에 따른 두 번째 핵산 단편의 발현을 수행하기 위한 하나 이상의 프로모터, 임의로 리더 펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열, 상기 두 번째 핵산 단편, 임의로 불변 영역을 엔코딩하는 핵산 서열, 및 임의로 두 번째 종결인자를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  48. 제 44항 내지 제 47항 중의 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포로 도입될 때 숙주 세포 게놈에 통합되는 벡터.
  49. 제 44항 내지 제 48항 중 어느 한 항의 벡터를 지니는 형질변환된 세포.
  50. 제 44항 내지 제 48항 중의 어느 한 항에 따른 벡터를 지니고 제 38항 내지 제 43항 중의 어느 한 항에 따른 핵산 단편을 발현시키며, 표면에 재조합 발현 생성물을 임의로 분비하거나 지니고 있는 안정한 세포주.
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