JPH06509223A - キャプシド形成性システイン修飾ｍｓ２−コートキメラ蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はキメラ蛋白質に関し、特に外来性挿入物を含んでいるウィルス蛋白質、 その様な蛋白質の調製、および該蛋白質の、例えば、ワクチンとしての、または 標的部分のような分子種の存在を示す担体としての使用に関する。

出願中の関連英国特許出願Ｎｏ、９２０１３７２．１は、ウィルス蛋白質担体の ある同定されたクラスでは、キメラ蛋白質を宿主菌の中で発現させた後、外来性 の抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）がキャプシド蛋白質集合体の表面上に確実に存 在するように抗原決定基を特異的に挿入することができるという発見を記載して いる。

そのような成果が達成され得るとは全く予測出来なかった。すべてのウィルスが 自己集合するコート蛋白質を持っているわけではない。さらに、そのような自己 集合を予言することは不可能である。さらにまた、動物のウィルスと違い、細菌 のウィルスが免疫優性領域を持っているとは本来期待され得ないし、従って、妥 当な期待度をもって免疫反応を誘発できるように細菌のウィルスのコート蛋白質 の（たとえあるとしても）どの領域が修飾され得るかについても全く指標がない 。

したがって、出願中の関連出願Ｎｏ、９２０１３７２．１は、キャプシド集合体 の一部分を形成でき、ＭＳ　２フアージのコート蛋白質のアミノ酸配列若しくは その保存的に修飾された変異体、または、キャプシド集合体形成能を保持するの に十分なアミノ酸配列若しくはその変異体を含み、ファージ粒子全体のＸ線結晶 解析で決定されたように、該アミノ酸配列がＮ末端のβヘアピンに相当する領域 への外来性の抗原決定基の挿入によって修飾されている、キメラ蛋白質に関する 。

驚くべきことに、そのようなキメラ蛋白質を適当な宿主の細菌中で発現させ、フ ァージＲＮＡが入ってなく、且つ、他の核酸の混入もほとんどない空のキャプシ ドを得ることができる。

比較的短い、例えば、３０アミノ酸残基ぐらいまでの直鎖ポリペプチドの外来性 の抗原決定基の挿入は実行可能であると考えられるであろうが、βヘアピンへの 単純な挿入によって非直鎖型抗原決定基を存在させることは実行可能ではなさそ うだと感じられるかもしれない。すなわち、多くの抗原決定基はポリペプチドの 単純な直鎖断片からなっているのではなく、天然の抗原蛋白質の包括的な３次元 折り畳み構造によって空間的に配置されているい（つかのそのような断片で作ら れている、不連続な抗原決定基である。そのような抗原決定基をファージキャプ シドの表面に存在させることができるということは、明らかに望ましいことであ る。

ＭＳ−２のコート蛋白質は、一定範囲の抗原決定基または標的部分のような他の 分子種をキャプシドの表面に存在させる目的で利用できることが本発明によって 発見された。それは、Ｎ末端のβヘアピン中に含まれないいくつかの部分でシス ティン残基を取り除き、そして、そのβヘアピン領域にシスティン残基を導入し 、該システィン残基を適当なスペーサーを経て望ましい抗原または他の分子種と の結合に利用することによって行うことができる。

従って、本発明によって、キャプシド集合体の一部分を形成することができ、Ｍ Ｓ−２フアージのコート蛋白質のアミノ酸配列若しくはその保存的に修飾された 変異体、または、キャプシド集合体形成能を保持するのに十分なアミノ酸配列若 しくはその変異型を含むキメラ蛋白質が提供されるが、該アミノ酸配列は、Ｎ末 端隆起部βヘアピンの外側に存在するシスティン残基の除去およびＮ末端隆起部 βヘアピン内へのシスティン残基の挿入によって修飾されている。

βヘアピンの外部のシスティン残基はコート蛋白質ｃＤＮＡの適当な部位に適当 な変異を入れることによって除去することができる。・挿入されたシスティンは 、存在させる抗原決定基などの望みの分子種、特に非直鎖型抗原蛋白質または存 在させる他の分子種、例えば標的部分に直接結合することができる。さらに、シ スティンと存在させる分子種との間にスペーサ部分を含ませて、存在し得る種の 範囲を広げることもできる。

適当なスペーサ一部分はシスティンの露出したチオール基と結合する、商業的に 入手可能な、ヘテロな二官能性の架橋剤の中から選ばれる。そのような架橋剤の 例は、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシースルフォスクシニミドエス テル、Ｎ−スクシニミジル−（４−ヨードアセチル）アミノ−ベンゾエートおよ びＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートである。

架橋剤は存在させるべき分子種とそのサイズによって選択される。即ち、大きい 分子種は立体障害を最小にするために長い架橋部分を必要とするであろう。架橋 剤はまずシスティン残基または存在させるべき分子と結合させることができる。

キメラコート蛋白質はＭＳ−２フアージ由来のものが好ましいが、Ｅ、ｃｏｌｌ の中で複製可能な関連するＲＮＡファージ、例えば、Ｒ１７、ｆ　ｒＳＧＡＳＱ βおよびＳＰに由来するものでもよい。そのような、ＭＳ−２の物理的構造に似 た物理的構造のＲＮＡファージは、コート蛋白質のアミノ酸残基の中にいくつか の化学的異体を含み、従って、ＭＳ−２コート蛋白質の保存的に修飾された改変 型である。現在は実質的に完全なコート蛋白質がキャプシドの組立に必要である と信じられているが、キャプシド形成能を依然として保持しつつ、比較的本質的 ではない欠失、および／あるいは挿入を有することも可能である。そのような修 飾された配列を持っている蛋白質は本発明の範囲に含まれる。

上述したように、外来性部位は組み立てられたキャプシドの中で蛋白質のＮ末端 のβヘアピンに相当する領域に挿入されている。ＭＳ−２フア一ジ粒子の三次元 構造はＶａｌｅｇａｒｄによって発表された（Ｎａｔｕｒｅ１１９９０．３４５ ．３６−４１）。その発表されたデータによれば、第一に、コート蛋白質の構造 には、他の現在構造が知られている全ての球状のＲＮＡウィルスサブユニットに 見られるようなβバレルの８回の繰り返し構造はない。第二に、コート蛋白質は ある程度間等な、サブユニット間での接触を示しているが、各蛋白質コンフォマ ー（Ｃｏｎｆｏｍ６ｒ）を保持するための伸びたポリペプチドのアームのような 装置はない。そのコート蛋白質の構造は三つの独立した領域として考えることが できる。

それらは通常の意味のドメインではなく、独立な畳み込みの単位（ｆｏｌｄｉｎ ｇ　ｕｎｉｔ）を形成する。これらの領域は１から２０番目の残基で、ファージ の表面から突き出て、最末端の放射状の形をつくるβヘアピン構造を形成する。

この領域の後には、２１から９４番目の残基からなる領域が続き、ある程度間等 なコンフナマー間で唯一の大きな構造の変化が起きているＦＧ−１ｏｏｐという 部位を含む５つのβ−５ｔｒａｎｄを形成している。これらのβ−ｓ　ｔ　ｒａ ｎｄの後には９５−１２５番目の残基が二つのα−へリックスを形成して続き、 これらが互いにかみ合って、コート蛋白質サブユニットの二量体（ダイマー）を 安定化させる。Ｖａｌｅｇａｒｄらの論文はＭＳ−２ウイルスの物理的構造に関 することだけであって、ウィルスの活動の仕方を解明しようとはしていない。

」＝記で説明された様に、本発明は、コート蛋白質の隆起部（ｐｒｏｔｕｂｅｒ ａｎｔ）ヘアピンに相当する領域へのシスティン残基の挿入によってコート蛋白 質のアミノ酸配列を修飾することを含んでいる。本発明のキメラ蛋白質は、それ ゆえに、１−２０番目のアミノ酸残基で修飾を受けている。この番号付けはＮａ ｔｕｒｅ、１９７６、λ６０．５００−５０７、でＦｉｅｒｓによって発表され たＭＳ−２のコート蛋白質の完全配列を参照している。システィン残基の挿入に よる修飾はヘアピン領域の真ん中付近または真ん中で起こすのが好ましい。シス ティン残基はコート蛋白質の１３．１４番目のグリシンの領域に挿入されるのが 好ましい。βヘアピンの外部にある取り除かれることになるシスティン残基は４ ６番目と１０１番目に位置する。システィンは部位特異的突然変異導入等が適し ているが、通常の任意の遺伝子工学技術によって取り除くことができる。

要らないシスティン残基を取り除くための好ましい方法として、まず、２つのＭ Ｓ−２コート蛋白質の変異体、一方は４６番目のシスティン残基を、もう一方は １０１番目のシスティン残基だけをそれぞれ変異させたものを標準的な商業的に 利用可能な部位特異的突然変異法によって得る。次に、標準的な発現ベクターに 対応するｃＤＮＡ断片を挿入してこれを制限酵素で消化し、４６番目のシスティ ン残基に変異が導入されているＤＮＡ断片と１０１番目のシスティン残基に変異 が導入されているＤＮＡ断片を別個に得て、次に両断片をライゲートさせ二重変 異のコート蛋白質のｃＤＮＡを得る。次いで、二重変異ｃＤＮＡのβヘアピン領 域にシスティン残基を標準的な方法で部位特異的に挿入することができる。

さらに、挿入されたシスティン残基にスペーサ一部分の介在下または非介在下に おいて任意の存在すべき分子種を結合させることができる。その様な分子種の例 として、出願中の関連出願Ｎｏ、９２０１３７２．１中に記載されている抗原決 定基、例えば、ヒトの病原体であるインフルエンザウィルスの血球凝集素（また は抗原決定基を含む血球凝集素の部分）から得られた、９アミノ酸残基からなる ペプチド配列、または、上記関連出願中に記載されているＩｇＥのデカペプチド （国際特許出願公開Ｎｏ、ＷＯ９０／１５８７８の中にも記載され特許請求され ている）が挙げられる。さらに、システィン残基に結合する可能性のあるその他 の分子種としては、口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）ＶＰＩ、黄体形成ホルモン放出 ホルモン（ＬＨＲＨ）並びにＨＩｖｇｐ１６０および１２０蛋白質、そして、ホ ースラディツシュ・ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉ ｄａｓｅ）のような酵素もある。

従って、本発明は、また、外来性分子種および、所望によりスペーサーがコート 蛋白質のβヘアピン領域の７ステイン残基に結合したものからなるキメラ蛋白質 をも含む。外来性分子種および所望成分スペーサーはキャプシドが組み立てられ る前または後に、システィン残基に結合させ得るだろうということは理解される だろう。本発明は、さらに、本発明のキメラ蛋白質のキャプシド集合体をも含む 。その様なキャプシドが、Ｅ、ｃｏｌｉの中で、生きたウィルスのＲＮＡを持た ない“空ファージ（ｐｈａｇｅ　ｅｍｐｔｙ）″として発現されるということが 本発明により見つけられた。例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏで組み立てられた試料をあ らかじめ分解しておいて、その後に混合体を再度組み立てることによって混合キ ャプシド集合体の生産を行うことも考えられる。その様なキャプシド集合体は、 例えば、混合免疫応答を上昇させ、そして、集団中のウィルスの抗原決定基の天 然スペクトラムに対する免疫処理用のワクチンとしての応用の途を開くものと期 待できる。本発明は、それ故に、上で定義された一つ又はそれ以上のキメラ蛋白 質を含むワクチンをも含む。

本発明のキメラ蛋白質およびキャプシド集合体は、例えば、出願中の関連出願Ｎ ｏ、９２０１３７２．１に記載されているようなりチンとして使用することが考 えられる。

さらに、それらは、例えば、キャプシドを特異的な細胞表面受容体に相互作用さ せる働きを持つガラクトース残基を付加することによって、標的として利用する ことが考えられている。そのような標的化のための技術は、特定の細胞や細胞内 に向けて外来性部分を運搬するのに役に立つだろう。本出願と同時に出願された 我々の関連出願ＮＯ・・・・・・に記載されている様に、外来性部分は初めはコ ート蛋白質のキャプシドに包み込まれているだろう。その様な外来性部分には遺 伝子、リボザイム、アンチセンスメツセージまたは細胞毒性剤が含まれるであろ う。

ＭＳ−２および関連したファージを表示システム（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｙｓｔｅｍ）として使うことがいくつかの点で有利なことは明かである。このよ うにして、空のコート蛋白質キャプシドをＥ、ｃｏｌｉ中で容易に比較的多量に 発現させることが出来て、その産物は、容易に精製され、ある範囲の温度、ｐＨ １イオン強度では比較的安定であることがわかった。いかなる特定の理論に結び 付けられることも望まないが、本発明はまた、抗体分子の多座配位の性質によっ て免疫認識を最大化するようなあらかじめ決められた配置で、運搬体キャプシド の表面上で規定通りに整然と並んだものの中にある抗原決定基の様な分子種を提 供出来ると考えられる。抗原決定基または他の分子種の三次元構造が保たれると いう可能性もある。

ＭＳ−２システムは、球状バクテリオファージの表面上に外来性分子種を存在さ せるためのものとしてかなり有用である可能性があると召じられている。このシ ステムは別の繊維状ウィルスに対し多くの利点がある。ＭＳ−２のコート蛋白質 は、核酸がなくても自律的に速やかに組み立てられるが、これは、核酸のキャプ シドへの取り込みとキャプシドの組立が同時進行する繊維状ウィルスとは異なっ ている。さらに、ＭＳ−２蛋白質はプロセシングを受けないが、繊維状蛋白質で は、組立が起こる前に転写後のプロセシングおよび膜挿入を必要とする。ＭＳ− ２システムは、また、外来性ペプチド挿入の効果をモデル化できるコート蛋白質 の詳細な分子モデルとなる利点がある。

下記の具体的な記載は、本発明を例を用いて説明している。

Ａ）ＭＳ−２コート蛋白質遺伝子の単突然変異体の単離部位特異的突然変異導入 および標準的な技術を用いて、コート蛋白質の４６と１０１番目のアミノ酸の突 然変異体を作成した。

突然変異体は４６番目または１０１番目のシスティンがセリンになったものを選 んだ。

自己集合力を示すために、各車突然変異のＤＮＡをＥ、ｃａｌｆ中で発現させた 。

Ｂ）二重突然変異ｃＤＮＡの調製 ステップＡ）で得られた５ｅｒ４６の単突然変異体のＤＮＡを標準的なコート蛋 白質の発現ベクター、ｐＴＡＣ−ＣＰに組み込み、制限酵素Ｓａｃ　ｌ５Ｘｂａ ■で消化し、得られた長い方の断片は、ｃａｌｆ　１ｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｈ 。

５ｐｈａｔａｓｅで処理し、電気抽出および沈降の前にアガロースゲルまたはポ リアクリルアミドゲルで精製した。

ステップＡ）で得られた５ｅｒｌｏ１の突然変異体はフォスファターゼ処理は行 わず、後は同じように扱った。コート蛋白質遺伝子のＣ末端を含む小さい断片を ゲル電気泳動で精製した。

ｃｙｓ４６変異を含む大きい断片とｃｙｓｌｏ１変異を含む小さい断片を標準的 な方法で結合させた。得られた組換え体分子を用いてＥ、ｃｏｌｉＴＧｌをアン ピシリン耐性に形質転換させ、ポジティブコロニーについてＤＮＡシークエンス によって二重突然変異をチェックした。

Ｃ）システィン残基の導入 ステップＢ）で得られたコート蛋白質の５ｅｒ４６／１０に重度異体のｃＤＮＡ を、標準的なサブクローニング法によってＭ１３シークエンスベクターに組み込 み、部位特異的突然変異を起こさせるための標準的な一本鎖の鋳型を作り、ヌク レオチドホスホチオエートに基づく商業的に入手可能な部位特異的変異導入プロ トコールを用いて、システィン残基をｇｌｙ１４のところに導入した。このよう にして、変異ｃｙｓ１４ｓｅｒ４６／ＩＯＩ：＋−ト蛋白質ｃＤＮＡを得た。

Ｄ）蛋白質の生産と精製。

単離された突然変異体のｃＤＮＡを、Ｅ、ｃａｌｆ中で組換え体蛋白質のキャプ シド形成能を確かめるために発現させた。上述のＣ）のｃｙｓｌ１４ｓｅｒ４特 表平６−５０９２２３　（４） ６／１０１コート蛋白質ｃＤＮＡを発現ベクターｐＴＡＣ−ＣＰに組み込み、得 られたプラスミドを用いてＥ、ｃｏｌｊ　ＴＧＩをアンピシリン耐性に形質転換 した。下記の手順に従ってキメラ蛋白質を発現させた。

形質転換体のプレートからひろったシングルコロニーの培養液（１００μｇ／ｍ ｌアンピシリンを加えた２７Ｙ培地）５Ｘ５ｍｌを３７℃で約４時間培養し、そ れを、５Ｘ５００ｍｌのアンピシリン入り２７Ｙのフラスコに接種し、３０℃ｆ ｆ導した。−晩培ｔｔ、り菌を、４℃テ３　ｋｒｐｍ、３０分、Ｂｅｃｋｍａｎ のＪＡ１４０−ターで遠心分離した。

生じた沈澱を５ＱｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭジチ オスレイトール（ＤＴＴ）　、５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１ｍＭフェニルメチルス ルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）に再度懸濁し、細胞は音波処理によって両 分（２から５まで）を抗ＭＳ−２コート蛋白質免疫親和カラムに加え、試料は１ ００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７で洗浄した。試料を２０ｍＭ酢酸／２００ｍＭ塩 化ナトリウム約ｐＨ２，７２０ｍ１で溶出し、初めの４ｍｌを集めた。

システィン１４で修飾された均一なキャプシドが得られ、活性化ガラクトース試 薬と以下Ｅ）に記載したような反応をする能力が試された。

免疫親和性により精製されたシスティン１４で修飾されたキャプシド産物の５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥは基本的には望まれた分子量をもつ単一成分であることを示した。

この結果は図１に示され、レーンａ）にはシスティン１４で修飾されたキャプシ ド、レーンｂ）およびＣ）には各々免疫親和性によって精製された野生型キャプ シドとショ糖密度勾配にて精製された野生型キャプシドが示してあり、レーンｄ ）は分子量マーカーである。

図２には免疫親和的に精製されたシスティン１４修飾キヤプシドの電子顕微鏡写 真が示してあり、野生型コート蛋白質によってつくられる粒子と同じ様な集合粒 子の存在がみられる。

Ｅ）システィン１４修飾蛋白質と活性化ガラクトースとの反応システィン１４で 修飾されたＭＳ−２キヤプシドの活性を調べるためにハロゲンで活性化されたガ ラクトース反応液を次のようにＴＪＲ製した。

水（４ｍｌ）とエタノール（６ｍｌ）にバラアミノフェニル　β−Ｄ−ガラクト ピラノシド（０，５４ｇ　：　２ｍｍｏｌｅ）を含む撹拌している溶液にヨウ化 無水酢酸（０，９ｇ　：　２．　５ａ＋１ｏｌｅ）を室温で加えた。２時間後、 反応液を濃縮して乾燥させ、残留物をエーテル（２Ｘ１０ｍｌ）で洗浄した。エ タノールから晶出すると針状結晶として生成物が得られた（０．７ｇ；８０％、 融点１５８−１６０℃）。

システィン１４修飾キヤプシドと活性化ガラクトースの反応は遊離−３Ｈ基と反 応してＯＤ　４１　ｇに特徴的な吸収を与えるＥｌ１ｍａｎ反応液（ジチオニト ロベンゾエート、ＤＴＮＢ）を用いて分析した。図３には遊離システィンとＤＴ ＮＢの反応の標準曲線が示しである。標準曲線は以下を用いて得られた。

１００μｍ　試料 １００μｌ　ＤＴＮＢ（４ｍｇ／ｍｌのＤＴＮＢを１００　ｍＭ　Ｎ　ａ　２Ｈ Ｐ○４ｐＨ８（緩衝液１）中に含む） ５ｍｌ　緩衝液１ 混合物はＤＴＮＢを加えた後１５分間室温に放置し、それからＯＤ　４１　ｔを 測定した。

図４にはシスティン（４ｍＭ）を１　１０ｍＭ活性化ガラクトースと混合し、室 温に１時間放置し、ＤＴＮＢを用いて上述したような１００μｌ溶液の分析を行 って得た曲線を示しである。

システィン１４で修飾されたコート蛋白質はＤＴＮＢと以下のように反応した精 製されたシスティン１４修飾蛋白質を最終濃度が４００μｇ／ｍ１となるように １ｍＭ　ＥＤＴＡを含む緩衝液１に溶解した。次の各実験を行った。

１）１００μｌ蛋白質試料、１００μｍ　５ｍＭ活性化ガラクトース２）１００ μ＋　蛋白質試料、９０μ１ｌＩｒ液１．１０μｍ　５ｍＭ活性化ガラクトース ３）１００８ｍ　蛋白質試料、１００μＩｌｌ衡液１各々室温で１時間撹拌して おき、それからエタノール中のＤＴＮＢ４ｍｇ／ｍ１２００μｌを、撹拌してい る溶液に加えた。１５分後にｏＩ）４Ｉｚを測定し、その結果が以下の表１に示 されている。遊離チオール基の数はガラクトース試薬の増大と共に減少し、シス ティン１４キヤプシドは確かにガラクトースと誘導体を形成したことが分かる。

表１ 試料　ＯＤ　４１２ 緩衝液のみ　０．０ １）１０ｈｌ　ＭＳ２−ｃｙｓ　；１０ｈｌ　ｇａ　Ｉ　０．０３１２）　１０ ｈｌ　ＭＳ　２−ｃ　ｙ　ｓ　：　９ｈｌ　！ｌｉｌ液：１０Ｊ１１　ｇａｌ　 ０．　０８０３）　１００μＩ　ＭＳ　２−ｃ　ｙ　ｓ　：　１０ｈｌ緩衝液　 ０．１１８Ｆ）システィン１４で修飾されているコート蛋白質の免疫原性ペプチ ドとの結合精製されたシスティン１４修飾キヤプシドを以下に述べるようにＨＡ ＩＯと結合させた。ＨＡＬＯはｌＱｍｅｒのペプチド配列でヒトの病原体である インフルエンザウィルスの血球凝集素由来の９アミノ酸からなるエピトープを含 み、加えてＮ末端システィン残基を持っている。９　ｖａｅｒ配列ＹＰＹＤＶＰ ＤＹＡはＷＮｓＯｎら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇ ｙ、　Ｍａｙ　１９８８．２１５９−２１６５とＣｅ１１．３７．１９８４D７ ６ ７−７７８）によって抗原決定基の一つを含むものとして同定された。その方法 には後で酸化されることになるジスルフィド結合の形成といった第一の架橋段階 が含まれる。

次の反応液を用いて４種の試験反応混合物を作成した。

２μｇシスティン１４修飾キャプシド（約３μｍ）（システィンの橋）１ｔｔＩ 　ＬＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、ＨＣｌ　ｐＨ８，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（緩衝液２）１ ７μｇ　ＨＡ９　ペプチド（約２μｍ）（ペプチド）１μｌ　２メルカプトエタ ノール（βＭＥ）次の４つの試験反応液混合物が準備され、各々水で１０μｌに した。

１）システィン橋＋緩衝液２＋βＭＥ ２）ンステイン橋＋緩衝液２ ３）ンステイン橋＋緩衝液２＋βＭＥ＋ペプチド４）システィン橋＋緩衝ＰＩ！ ２＋ペプチド混合物は室温で１時間保温した。次に０．３７Ｍ四チオン酸ナトリ ウムと１゜６Ｍ亜硫酸ナトリウム（ｌｌｏｒｅｈｅａｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　、　２３．１９８４．２５００の方法に従って新たに調製された もの）を混ぜ合わせたちの１μｍを加えた。混合物は室温で一晩放置された。

混合物をＰＡＧＥ　Ｓｃｈａｇｇｅｒシステム（Ｓｃｈａｇｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ 、　、　１９８７．　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１６６、３６１１１−３７９）を用い、バイオラッドのウ ェスタンプロティング装置を用いて３９ｍＭグリシン、４８ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ 、０．１％（ｗ／ｖ）　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および２０％メタノ ールの転移緩衝液による４５０ｍＡ、１時間のトランスファーでニトロセルロー ス紙上にプロットして分析した。

プロットをＴｗｅｅｎ２０　（ＰＢＳＩ　ｌにつきポリオキシエチレンソルビタ ンモノラウレート３ｍ１）を含む燐酸緩衝溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７，６で洗浄して 平衡化した。それから３７℃で１時間の間３５ｍ、Ｉ　ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに０ ．５％（Ｗ／Ｖ）ラン血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えたものでインキュベート し、６×５分２００ｍＩＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次に３５ｍＩ　ＰＢＳ− Ｔｗｅｅｎ＋０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中で１００μＩマウス抗ＨＡ９モノクロー ナル抗体（Ｂａｌｃｏｒｅ　Ｃｏ、　、　Ｂｅｒｋｌｅｙ、　ＵＳＡより入手） とともに４℃にて一晩インキュベートした。それからＰ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅ　ｅ− ｎ　（６Ｘ　５分２００ｍ１）で洗浄し、３５ｍＩＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ＋０．５ ％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで５０μｌヤギ抗マウスＩｇＧホースラディッンユベルオキ シダーゼ（ＨＲＰ）結合体と共に３０分間インキュベートした。さらに洗浄（６ ×６分、２００ｍＩＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）した後に。

ゲルをルミノールウェスタンブロッティング反応液（＾ｉｅｒｓｈａｍ）によっ て活性化し、可視化させた。

結果は、試料番号４に相当するレーンの一つのバンドのみが抗ＨＡ９抗体と反応 したことを示した。試料１−３は負のコントロールなのでこれは予期された結果 である。したがってこれらの方法を用いてシスティン１４修飾キヤプシドに線状 ペプチド断片を結合することが可能である。

Ｇ）システィン１４修飾蛋白質と酵素との共有結合上述のＥ）に記載された精製 システィン１４修飾キヤプシドを、マレイミド基を介して酵素ホースラディツシ ュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に以下のように共有結合させた。

ＨＲ，Ｐ−７レイミド結合体（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｅｕｒｏｐｅ　ＢＶ、Ｈｏ１ｌａ ｎｄ）　、システィン１４修飾キヤプシドおよびβＭＥを用いて以下の混合物を 作成し、各々を１００ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，２で１００μＩにした 。

１）２０μｇ　ＨＲＰ−マレイミド＋１μｍ　βＭＥ２）２０μｇシスティン１ ４修飾キャプシド＋１μｍ　βＭＥ３）２０μｇシスティン１４修飾キャプシド ＋２０μｇ　ＨＲＰ−マレイミド試料３は１時間室温に放置し、それからβＭＥ を加えて残っているチオールを除去した。それから試料１−３をＨＰＬＣゲル濾 過クロマトグラフィー　ＰＷ３０００．２ｘ３０ｃｍカラム、１００ｍＭ燐酸ナ トリウム緩衝液、ｐＨ７，２にて流速０．５ｍｌ／分で分画した。溶出物の画分 （１分−Ｑ、５ｍ１）について、市販されているキット（ＡＢＴＳ試薬、Ｐｉｅ ｒｃｅ）を用いてＨＲＰ活性を測定した。酵素活性は４１０ｎｍにおける溶液の 吸光度の上昇を観察することによって見積られた。測定結果は試料３のシステイ ン１４集合体のＯＤ、、。のビークに相当する両分において、バックグラウンド のレベルよりも優位の上昇をみせた。

Ｆｉｇ　、　１ 国際調査報告　。、７１、。。？／ｌ’１ｌｌｃ（１フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０ ２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　１５／３４ Ｃ１２Ｒ１：９２） （Ｃ１２Ｎ　１５／４４ Ｃ１２Ｒ１：９２） Ｉ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．キヤプシド集合体の一部分を形成することができ、ＭＳ−２ファージのコー ト蛋白質のアミノ酸配列若しくはその保存的に修飾された変異体、または、キヤ プシド集合体形成能を保持するのに十分なアミノ酸配列若しくはその変異体を含 み、該アミノ酸配列が、Ｎ末端隆起部βへアピンの外側に存在するシステイン残 基の除去およびＮ末端隆起部βヘアピン内へのシステイン残基の挿入によって修 飾されているキメラ蛋白質。
2. ２．コート蛋白質のグリシン１３と１４残基の領域中にシステイン残基が挿入さ れている請求項１に記載のキメラ蛋白質。
3. ３．システイン残基がグリシン１４と置換されて挿入されている請求項２に記載 のキメラ蛋白質。
4. ４．βヘアピンの外にあるシステインがセリンによって置換されている請求項１ ．２または３に記載のキメラ蛋白質。
5. ５．挿入されたシステイン残基が直接あるいは間接的に外来分子種と結合してい る請求項１，２，３または４に記載のキメラ蛋白質。
6. ６．挿入されたシステイン残基が外来分子種とスペーサー部分を介して結合して いる請求項５に記載のキメラ蛋白質。
7. ７．スペーサー部分がｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スルフォス クシニミドエステル、Ｎ−スクシニミジル−（４−ヨードアセチル）アミノーベ ンゾエートおよびＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ ートより選択された二官能性の試薬に由来する請求項６に記載のキメラ蛋白質。
8. ８．システイン残基が直接あるいは間接的に抗原蛋白質に結合している請求項１ から７までのいずれか１項に記載のキメラ蛋白質。
9. ９．システイン残基が直接あるいは間接的に標的部分に結合している請求項１か ら７までのいずれか１項に記載のキメラ蛋白質。
10. １０．標的部分がガラクトースを含む請求項９に記載のキメラ蛋白質。
11. １１．請求項１−１０のいずれか１項に記載のキメラ蛋白質またはそれらの蛋白 質の混合物を含むキヤプシド。
12. １２．ファージコート蛋白質の二つの単一突然変異体、即ち、一つはシステイン ４６残基の除去されたもの、もう一つはシステイン１０１残基の除去されたもの を調製し；対応するｃＤＮＡを切断して再び結合して二重変異の入っているコー ト蛋白質のｃＤＮＡを作成し；二重変異の入ったｃＤＮＡに位置特異的な突然変 異を導入してＮ末端隆起部βヘアピンに相当する領域内にシステイン残基を導入 し：そして、得られたｃＤＮＡを発現させてキメラ蛋白質を得る：ことからなる 請求項１−１１のいずれか１項に記載のキメラ蛋白質を調製する方法。
13. １３．発現がＥ．Ｃｏｌｉにおいて行われる請求項１２に記載の方法。
14. １４．請求項１から４のいずれか１項に記載のキメラ蛋白質をコードするＤＮＡ を含む発現ベクター。
15. １５．請求項８に記載の蛋白質あるいはそのような蛋白質を含むキヤプシドにか らなるワクチンの調製品。