KR100222163B1 - 캡시드를 형성하고 시스테인 변형된 키메라 ms-2 코트 단백질 - Google Patents
캡시드를 형성하고 시스테인 변형된 키메라 ms-2 코트 단백질 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에서는 캡시드 어셈블리의 일부분을 형성할 수 있고, 파지 MS-2의 코트 단백질의 아미노산 서열, 또는 그것의 보존적으로 변형된 변이체, 또는 캡시드 어셈블리를 형성하는 능력을 보유하기에 충분한 상기 서열 또는 변이체를 포함할 수 있으며, 상기 아미노산 서열은 코트 단백질의 N-말단에 돌출되어 있는-헤어핀의 외부에 존재하는 시스테인 잔기의 제거 및 N-말단의 돌출된
Description
본 발명은 키메라 단백질에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 외래 삽입물을 함유하고 있는 바이러스 단백질, 그러한 단백질의 제조방법 및 용도, 에컨대 표적화 부분과 같은 분자종을 제시하기 위한 백신 또는 담체로서의 용도에 관한 것이다.
공동계류중인 GB 특허출원 제 9201372.1호는, 확인된 부류의 바이러스 단백질 담체내의 에피토프 삽입이, 박테리아 숙주에서 키메라 단백질이 발현된 후 외래 에피토프가 단백질 캡시드 어셈블리의 표면에 확실하게 제시되도록 특이적으로 유도될 수 있다는 발견에 대해 개시하고 있다.
그러한 결과가 달성될 수 있다는 것은 전혀 예측가능하지 않았다. 모든 바이러스가 자체 어셈블링되는 코트 단백질을 함유하고 있는 것은 아니며, 또한 그러한 자체 어셈블리를 예상하는 것도 가능하지 않다. 나아가, 동물 바이러스와는 달리, 박테리아 바이러스는 당연히 면역우성 영역을 함유하는 것으로 예상될 수 없으며, 따라서 박테리아 바이러스 코트 단백질의 어떤 영역(존재하는 경우)이 면역 반응을 유도한다는 합리적인 기대하에 변형 될 수도 있는지에 대한 어떠한 지시도 없다.
따라서, 공동계류중인 출원 제9201372.1호는 캡시드 어셈블리의 일부분을 형성할 수 있고 MS-2 파지의 코트 단백질의 아미노산 서열, 또는 그것의 보존적으로 변형된 변이체, 또는 갭시드-형성능을 보유하기에 충분한 상기 서열 또는 변이체로 구성된 키메라 단백질로서, 아미노산 서열이 전체 파지 입자의 X-선 결정학에 의해 측정하였을 때, N-말단-헤어핀에 상응하는 단백질 영역에 외래 에피토프를 삽입시킴으로써 변형된 키메라 단백질에 관한 것이다.
놀랍게도, 그러한 키메라 단백질은 적당한 박테리아 숙주에서 발현되어 파지 RNA 가 없고 다른 핵산 오염물이 거의 없는 캡시드를 제공한다는 것이 발견되었다.
비교적 짧은 길이, 예컨대 약 30개 이하의 아미노산 잔기로 구성된 선형 폴리펩티드인 외래 에피토프의 삽입은 이루어질 수 있는 것으로 예상되는 반면,-헤어핀내의 단순한 삽입에 의한 비-선형 에피토프의 제시는 이루어질 수 없는 것으로 인정될 것이다. 그러므로, 많은 에피토프들은 폴리펩티드의 단순한 선형 단편들로 구성되지 않고, 대신에 그것들은 천연 단백질 항원의 전체 3차원적 접힘에 의해 공간적으로 관련된 여러개의 그러한 단편들, 즉, 불연속 에피토프들로 구성된다. 그러한 에피토프들을 파지 캡시드의 표면에 제시할 수 있는 것이 분명히 바람직하다.
MS-2의 코트 단백질이 일정한 범위의 에피토프 또는 다른 분자종, 예컨대 표적화 부분을 캡시드 표면에 제시하기 위하여, N-말단-헤어핀 영역내에 포함되지 않은 부위에 존재하는 시스테인 잔기를 제거하고,-헤어핀 영역내에 시스테인 잔기를 도입시킴으로서 사용될 수 있고, 상기 시스테인 잔기는 적절하게는 적당한 스페이서를 경유하여 원하는 항원 또는 다른 분자종과의 결합에 이용될 수 있음이 발견되었다.
그러므로, 본 발명에 따르면 캡시드 어셈블리의 일부분을 형성할 수 있고, 파지 MS-2, 또는 물리적인 구조가 MS-2와 유사한 관련 대장균-복제성 RNA 파지의 변형된 코트 단백질로 구성된 키메라 단백질로서, 상기 코트 단백질이 어셈블링된 캡시드의 N-말단 돌출-헤어핀 영역에 상응하는 영역에 시스테인 잔기를 삽입시킴으로써 변형되고, 상기 토코트 단백질이 N-말단-헤어핀 영역의 외부에 시스테인 잔기를 함유하는 경우에는, 그 외부 시스테인 잔기를 비-시스테인 잔기로 치환시킴으로써 더욱 변형된 키메라 단백질이 제공된다.
-헤어핀의 외부에 있는 시스테인 잔기는 코트 단백질 cDNA 의 적절한 부위에서의 돌연변이에 의해 적절하게 제거된다.
삽입된 시스테인은 에피토프, 특히 비-선형 항원 단백질과 같은 제시될 목적하는 분자종, 또는 표적화 부분과 같은 제시될 다른 분자종과 직접 결합될 수 있다. 또는 달리, 스페이서 부분이 시스테인과 제시될 분자종 사이에 사용되어, 제시될 수 있는 종의 범위를 확대시킬 수 있다.
적당한 스페이서 부분은 노출되는 시스테인 티올기와 커플링되는 공지의 시판되는 헤테로 이작용기성 교차결합제로부터 선택된다. 그러한 교차결합제의 예로는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시술포숙신이미드 에스테르, N-숙신이미딜-(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 및 N-숙신이미딜-3(2-피리딜디티오)프로피오네이트가 있다. 교차결합제의 선택은 제시될 분자종 및 그것의 크기에 좌우될 것이다. 그러므로, 더 큰 크기의 분자종은 입체적 장애를 최소화하기 위해 더 긴 교차결합 부분을 필요로 할 수 있다. 교차결합제는 먼저 시스테인 잔기에 결합되거나, 먼저 제시될 분자종에 결합될 수 있다.
키메라 코트 단백질은 바람직하게는 파지 MS-2로부터 유도되지만, 또한 대장균에서 복제될 수 있는 관련 RNA-파지, 예컨대 파지 R17, fr, GAQ및 SP로부터도 유도될 수 있다. MS-2의 물리적 구조와 유사한 물리적 구조를 가지는 그런 RNA-파지들은 코트 단백질의 아미노산 잔기에 있어서 약간의 화학적 변이를 함유하고, 따라서 그것들은 MS-2 코트 단백질의 보존적으로 변형된 변이체이다. 현재, 실질적으로 완전한 코트 단백질이 캡시드 어셈블리에 필요할 것으로 여겨지지만, 상대적으로 중요하지 않은 성질의 결실 및/또는 삽입이 캡시드-형성능을 여전히 보유하면서 가능할 수 있다. 그러한 변형된 서열을 가지는 단백질은 본 발명의 범주내에 포함된다.
상기 설명된 대로, 외래 부분은 어셈블링된 캡시드에서 N-말단-헤어핀에 상응하는 단백질의 영역에 삽입된다. MS-2 파지 입자의 3차원 구조는 문헌[Valegard et al., Nature, 1990,345 : 36-41]에 공지되어 있다. 공지된 데이터는 첫째, 그 코트 단백질의 구조가 그것의 구조가 현시점에서 공지되어 있는 모든 다른 구형 RNA 바이러스 하위단위체들에서 발견되는 8-가닥-배럴(barrel)모티프와는 관련이 없음을 보여준다. 둘째, 코트 단백질이 거의 동등한 하위단위체간 접촉을 나타내지만, 각 단백질 이형태체(conformer)를 고정시킬 수 있는 다른 구조, 예컨대 폴리펩티드의 연장된 아암이 없음을 보여준다. 코트 단백질 구조는 3개의 별개의 영역의 견지에서 볼수 있다. 이것들은 통상적인 의미에서의 도메인이 아니지만, 독립적인 접힘 단위체를 나타낼 수 있다. 이 영역은 가장 말단의 방사상 모양을 형성하는 파지의 표면으로부터 돌출된-헤어핀 구조를 형성하는 잔기 1-20이다. 이 영역 다음에는, 거의 동등한 이형태체 사이에 유일한 주요 형태 변화가 일어나는 부위인 "FG-루프"를 포함하는 5개의-스트란드를 형성하는 잔기 21-94가 있다. 이들-스트란드 다음에는, 코트 단백질 하위단위체의 다이머(이량체)를 고정시키기 위해 서로 맞물린 2개의 α-헬릭스, 잔기 95-125가 있다. 베일가드 등(Valegard et al.)은 MS-2 바이러스의 물리적 구조에만 관심이 있었으며 바이러스의 작용 방식을 밝히려고 시도하지 않았다.
상기 설명된 바와같이, 본 발명은 돌출 헤어핀에 상응하는 영역에 시스테인 잔기를 도입시킴에 의한 코트 단백질 아미노산 서열의 변형을 포함한다. 그러므로, 본 발명의 키메라 단백질은 아미노산 잔기 1 내지 20의 영역에서 그렇게 변형되었으며, 그러한 넘버링은 문헌[Fiers, Nature, 1976, 260 : 500-507]에 공지된 MS-2 의 완전한 코트 단백질 서열을 참고로 한 것이다. 바람직하게는 시스테인 잔기를 도입시키는 변형은 헤어핀 영역의 중간쯤이나 중간에서 일어난다. 코트 단백질의 글리신 13과 14의 영역에 시스테인을 도입시키는 것이 바람직하다.-헤어핀의 외부에 있는 제거될 시스테인 잔기는 위치 46과 101에서 발견된다. 이 잔기들은 종래의 모든 편리한 유전공학적 기법, 적절하게는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 제거 될 수 있다.
원하지 않는 시스테인 잔기의 한 바람직한 제거방법에서는, 하나는 cys 46에서 단독으로 돌연변이되고, 다른 하나는 cys 101에서 단독으로 돌연변이된 MS-2 코트 단백질의 두 돌연변이체를 부위 특이적 돌연변이 유발에 관한 표준의 통상 사용되는 기법에 의해 수득하고, 상응하는 cDNA 서열을 표준 발현 벡터에 도입시킨 다음, 상기 벡터를 제한 효소로 절단시켜 돌연변이된 cys 46 부위를 함유하고 있는 DNA 단편 및 돌연변이된 cys 101 부위를 함유하고 있는 대응 단편을 개별적으로 수득한 다음, 단편들을 계속해서 연결시켜 이중으로 돌연변이된 코트 단백질 cDNA를 얻는다. 그런 다음, 이중으로 돌연변이된 cDNA를 표준 방법을 사용하여 부위 특정 돌연변이 유발시켜, 시스테인 잔기를-헤어핀 영역에 도입시킬 수 있다.
스페이서 부분의 삽입의 존재 또는 부재하에 도입된 시스테인 잔기에 제시될 원하는 분자종을 추가로 결합시킬 수 있다. 그러한 종들의 예는 공동계류중인 출원 제 9201372.1 호에 기재된 에피토프, 즉 사람 병원성 인플루엔자 바리어스의 혈구응집소(또는 에피토프를 함유하고 있는 혈구응집소 부분)으로부터 유도된 9-량체 펩티드 서열, 또는 상기 출원에 기재되어 있는 lgE 데카펩티드(이것은 또한 국제 특허출원 공개 제 WO90/15878호에도 개시되고 청구되어 있다)이다. 시스테인 잔기에 결합될 수 있는 또 다른 종으로는 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus: FMDV) VP1, 황체형성 호르몬 유리 호르몬(LHRH), 및 HIV gp160 및 120 단백질, 및 양고추냉이 과산화효소와 같은 효소들이 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 코트 단백질의-헤어핀 영역의 시스테인 잔기에 결합된, 그러한 외래 분자종, 및 임의로 스페이서를 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다. 외래 분자종 및 임의의 스페이서는 캡시드 어셈블리 전 또는 후에 시스테인 잔기에 결합될 수 있음이 인정될 것이다. 본 발명은 또한 본 발명은 키메라 단백질의 캡시드 어셈블리에 관한 것이기도 하다. 그러한 캡시드는 살아있는 바이러스의 RNA 없이 "파지 엠프티즈(phage empties)"로서 대장균에서 발현될 수 있음이 발견되었다. 혼합된 캡시드 어셈블리의 생성이 예컨대 생체내 어셈블링된 샘플의 우선하는 분해와 이어지는 혼합물의 재어셈블링에 의해 예상된다. 그러한 캡시드 어셈블리는 예컨대 혼합 면역반응을 일으킬 수 있고, 그로써 한 집단에서 바이러스 에피토프의 천연 스펙트럼에 대한 면역화를 위한 백신으로서 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 상기 규정된 바와 같은 키메라 단백질을 하나 이상 포함하는 백신에 관한 것이다.
본 발명의 키메라 단백질 및 어셈블링된 캡시드는 예컨대 공동계류중인 출원 제 9201372.1호에 기재된 바와 같은 백신으로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 키메라 단백질 및 어셈블링된 캡시드는 예를 들면 캡시드가 특이적인 세포 표면 수용체와 상호작용하도록 지시하는 갈락토오스 잔기의 첨가에 의해 표적화에 사용될 수 있다. 그러한 표적화 기법은 외래 부분을 특이적인 세포로 및 그 안으로 운반하는데 유용할 수 있다. 외래부분은 처음에는 본 출원과 동시에 출원되어 공동계류중인 영국 특허출원번호 제 9313186.0 호에 기재되어 있는 바와 같이 코트 단백질 캡시드내에 갭시드 내부화(encapsidation)에 의해 보유될 수 있다. 그러한 외래 부분으로는 유전자, 리보자임(ribozyme), 안티-센스(anti-sense) 메시지 또는 세포독성제가 있을 수 있다
MS-2 및 관련 파지를 제시 시스템으로서 사용하는데에는 여러 가지 장점이 있음이 명백할 것이다. 예를 들면, 공(empty) 코트 단백질 캡시드는 대장균에서 비교적 고수율로 쉽게 발현될 수 있으며, 그 생성물은 쉽게 정제되고, 어셈블링된 캡시드는 일정한 범위의 온도, pH 및 이온강도에서 상당히 큰 안정성을 나타낸다. 어떠한 특정 이론에 의해 한정되는 것을 원하지는 않지만, 본 발명은 또한 담체 캡시드의 표면상에서 규칙적인 배열로 에피토프와 같은 분자종을, 예정된 위치에 제시할 수 있도록 하며, 그것은 항체 분자의 다좌(multidentate)성에 좌우하여 면역 인식을 최대화할 것으로 여겨진다. 도입되는 에피토프 또는 다른 종의 3차원 구조를 유지할 수 있는 가능성도 또한 발생한다.
MS-2 시스템은 구형 박테리오파지의 표면에 외래 분자종을 제시하는데 상당히 가능성이 있는 유용성을 가지고 있는 것으로 생각된다. 그 시스템은 섬유상 박테리오파지에 비해 많은 장점을 가진다. MS-2 코트 단백질은 어셈블리가 핵산의 캡시드 내부화에 의해 수반되는 섬유상 파지와는 다르게 핵산의 부재시에도 용이하게 자체-어셈블링될 수 있다. 나아가, 섬유상 코트 단백질은 어셈블링전에 번역후 가공 및 막 삽입을 받아야 하나, MS-2 단백질은 가공되지 않는다. MS-2 시스템은 또한 외래 펩티드 삽입의 효과가 모델링되도록 하는 코트 단백질에 관한 상세한 분자 모델을 장점을 갖는다.
다음의 구체적인 설명은 본 발명을 실시예에 의해 예시한다.
A) 단일 돌연변이체 MS-2 코트 단백질 유전자의 분리.
부위 특정 돌연변이 유발 및 표준 기법을 사용하여 코트 단백질 위치 46 및 101에서의 아미노산 돌연변이체를 제조하였다.
위치 46의 시스테인이 세린에 의해 치환되거나 위치 101의 시스테인이 세린에 의해 치환된 돌연변이체를 선택하였다.
각각의 단일 돌연변이 DNA를 대장균에서 발현시켜 자체 어셈블링하는 능력을 입증하였다.
B) 이중으로 돌연변이된 cDNA의 제조
단계 A)로부터의 ser 46 단일 돌연변이체를 표준 코트 단백질 발현벡터 pTAC-CP에 도입시키고, Sac I 및 Xba I 제한 효소로 절단시킨 후, 수득한 더 긴 골격 단편을 송아지의 장에서 추출한 포스파타아제로 처리한 후, 아가로오스 또는 폴리아크릴아미드 겔상에서 정제한 다음 전기용출 및 침전시켰다.
단계 A)로부터의 Ser 101 돌연변이체를 마찬가지로 처리하되, 포스파타아제 처리는 생략하였다. 코트 단백질 유전자의 C-말단 부분을 함유하고 있는 더 작은 단편을 겔 전기영동에 의해 정제하였다.
돌연변이된 cys 46 부위를 함유하고 있는 큰 단편과 돌연변이된 101 부위를 함유하는 작은 단편을 표준 방법에 의해 연결시켰다. 그로써 얻어진 재조합 분자를 사용하여 대장균 TG1을 형질전환시켜서 암피실린-내성으로 만들고, DNA 서열화에 의해 이중 돌연변이에 대한 양성 콜로니들을 체크하였다.
C) 시스테인 잔기의 도입
단계 B)로부터의 이중-돌연변이체 ser 46/101 코트 단백질 cDNA를 표준 서브클로닝 방법에 의해 M13 서열화 벡터에 도입시켜, 부위 특정 돌연변이 유발을 위한 단일 스트란드 주형을 생성시키고, 누클레오티드 포스포티오에이트를 기초로 한 상업적으로 입수가능한 부위 특이적 돌연변이 유발프로토콜을 사용하여 gly 14에 시스테인 잔기를 도입시켰다. 그로써 돌연변이된 cys 14 Ser 46/101 코트 cDNA를 얻었다.
D) 단백질 제조 및 정제
재조합 단백질의 캡시트-형성능을 확인하기 위해 분리된 돌연변이 cDNA를 대장균에서 발현시켰다. 상기 C)의 cys 14 ser 46/101 코트 단백질 cDNA를 발현벡터 pTAC-CP에 도입시키고, 그 결과 생성된 플라스미드를 상용하여 대장균 균주 TG1을 암피실린 내성으로 형질전환시겼다. 다음 과정을 따라서 키메라 단백질을 발현시켰다.
형질전환 플레이트로부터 취한 단일 콜로니의 5(100㎛/의 암피실린이 첨가된 2TY 배지)배양물을 5개 취하여 대략 4시간 동안 37℃에서 성장시킨 후, 암피실린이 첨가된 2TY의 500플라스크를 5개 접종시킨 다음, 그 배양물을 30℃에서 성장시켰다. 배양물의 OD600이 약 0.45에 도달하였을 때, 1mM의 이소프로필--D-티오-갈락토시드(IPTG)를 첨가하여 단백질 생성을 유도하였다. 세포들을 밤새 성장시킨 후 벡크만(Beckman)JA14 로우터(rotor)를 이용하여 3K rpm에서 30분 동안 4℃에서 원심분리 하였다.
그 결과 수득한 펠릿을 50mM Hepes, 100mM NaCI, 10mM 디티오트레이톨(DTT), 5mM EDTA 및 1mM 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드(PMSF)중에 재현탁시키고, 세포를 초음파 처리에 의해 용해시켰다. 그런 다음, 이 세포 용해물을 Beckman JA20 로우터로 15K에서 2분 동안, 4℃에서 원심분리하고, 그 상층액을 NAP-25 칼럼(Pharmacia)에 통과시켜서 완충액을 20mM NaPi(인산나트륨-기초 완충액)pH 7.0으로 변경시켰다. NAP 컬럼으로부터 1분획들을 모아서 MS-2 코트 단백질 함유 분획(no. 2내지 5에 포함됨)을 항-MS-2 코트 단백질 면역친화성 컬럼에 가하고 1시간 동안 실온에서 서서히 교반함으로써 샘플이 결합되도록 하였다.
컬럼을 20mM NaPi pH 7로 세척한 후, 10mM NaPi/100mM NaCI pH 7로 세척하였다. 샘플을 pH가 대략 2.7인 20의 20mM 아세트산/200mM NaCI 로 용출시키고 처음 나오는 용츌액 4를 수집하였다.
1M의 트리스 HCIpH 9로 적정함으로서 pH를 즉시 pH 7-7.4로 조절하고, 혼합물을 Beckman SW.55Ti 로우터를 사용하여 30K rpm에서 4℃에서 밤새(약 15시간 동안) 원심분리하였다. 상층액을 따르고, MS-2 단백질 펠릿을 소량의 필요한 완충액에 재현탁시켰다.
균일 cys 14 변형 캡시드를 얻었고, 이것을 하기 E)에서 설명되는 바와 같이 활성화된 갈락토오스 시약과 반응하는 능력에 대해 시험하였다.
수득한 면역친화성 정제된 cys-14 변형 캡시드의 SDS-PAGE 결과는 예상 분자량을 가지는 단일한 성분을 본질적으로 나타냈다. 그결과는 제 1도에 도시되어 있는데, 도면에서 레인 a)는 cys-14 변형 캡시드를 나타내고, 레인 b)와 c)는 각각 면역친화성 정제되고 수크로오스 밀도 정제된 야생형 캡시드를 나타내며, 레인 d)는 분자량 표준을 나타낸다.
제2도는 야생형 코트 단백질에 의해 생성된 것과 유사한 어셈블링된 입자들의 존재를 보여주는 면역친화성 정제된 cys-14 변형 캡시드의 전자형미경 사진이다.
E) cys 14 변형 단백질과 활성화된 갈락토오스의 반응
cys 14 변형 MS-2 캡시드의 반응성을 시험하기 위하여, 할로겐-활성화된 갈락토오스 시약을 다음과 같이 제조하였다.
물(4)과 에탄올(6)중의 P-아미노페놀-D-갈락토피라노시드(0.54g; 2mmole)의 교반 용액에 요오도아세트산 무수물(0.9g;2.5mmole)을 실온에서 첨가하였다. 2시간 후에, 반응액을 건조 상태로 농축시키고, 잔류물을 에테르로 세척하였다(2×10). 에탄올로부터의 결정화에 의해 침상생성물(0.7g; 80%)을 얻었다(mp 158-160℃).
cys 14 변형 캡시드와 활성화된 갈락토오스의 반응을, 유리-SH 기와의 반응시에 OD412에서 특징적인 흡수를 제공하는 엘만 시약(디티오니트로벤조에이트, DTNB)을 사용하여 검정하였다. 제3도는 유리 시스테인과 DTNB의 반응에 관한 대조 곡선을 나타낸다. 대조 곡선은 100의 샘플, 100의 100Mm Na2HPO4pH8("완충액 1")중의 DTNB 4㎎/및 5의"완충액 1"을 사용하여 얻었다.
혼합물에 DTNB를 첨가하고 실온에서 15분 동안 방치한 후, OD412를 기록하였다.
제4도는 시스테인(4Mm)을 1 내지 10Mm의 활성화된 갈락토오스와 혼합하고 실온에서 1시간 동안 방치한 다음, DTNB를 사용하여 상술된 것과 같이 100의 분액을 검정하였을 때 얻어진 곡선을 나타낸다.
cys 14 변형 코트 단백질을 다음과 같이 DTNB 와 반응시켰다;
정제된 cys 14 변형 캡시드를 1mM EDTA 함유 완충액 1에, 최종 농도가 400/이 될 때까지 재현탁시켰다. 다음의 개별적인 실험을 수행하였다.
1) 100의 단백질 샘플, 100의 5mM 활성화된 갈락토오스.
2) 100의 단백질 샘플, 90의 완충액 1, 10의 5mM 활성화된 갈락토오스.
3) 100의 단백질 샘플, 100의 완충액 1.
각각을 실온에서 1시간 동안 교반한 후에, 에탄올중의 4㎎/의 DTNB 200를 교반 용액에 첨가하였다. 15분 후에 OD412를 기록하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타낸다. 유리 티올의 수는 갈락토오스 시약에의 노출이 증가함에 따라 감소하였고, 이것은 cys 14 캡시드가 갈락토오스로 유도되었음을 확증해준다.
F) cys 14 변형 코트 단백질과 면역원성 펩티드의 결합
정제된 cys 14 변형 캡시드를 하기와 같이, 사람 병원성 인플루엔자 바이러스의 혈구응집소로부터 유도된 노나펩티드 에피토프를 포함하고, N-말단에 시스테인 잔기가 연장되어 있는 10량체 펩티드 서열인 HA10에 결합시켰는데, 상기 9량체 서열 YPYDVPDYA는 윌슨 등에 의해 항원 결정기중 하나를 함유하고 있다고 확인되었다. [Wilson et al., Molecular and Cell Biology, May 1988, 2159-2165 및 Cell, 37, 1984, 767-778] 이 과정은 이황화 결합이 형성되는 초기 교차결합 단계를 포함하였고, 상기 이황화 결합은 이후에 산화되었다.
4개의 시험 반응 혼합물을 만들기 위하여 다음의 시약을 사용하였다.
2의 cys 14 변형 캡시드(약 3)("cys 다리")
1의 1M Tris HCI pH8, 10mM EDTA("완충액 2")
17의 HA9 펩티드(약 2)("펩티드")
1의 2-메르캅토에탄올("ME")
다음의 4가지 시험 혼합물을 제조하였고, 각 경우에 물을 사용하여 10로 만들었다 :
1) cys 다리+ 완충액 2+ME
2) cys 다리+ 완충액 2
3) cys 다리+ 완충액 2+ME + 펩티드
4) cys 다리 + 완충액 2 + 펩티드
혼합물을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 다음, 0.37M의 테트라티온산 나트퓸과 1.6M의 아황산 나트륨의 혼합물 1(Morehead et al., Biochem., 23, 1984, 2500에 기재된 방법에 따라 새로 제조하였음)를 첨가하였다. 이 혼합물을 밤새 실온에서 방치하였다.
PGAE Schaegger 시스템[Schaegger et al., 1987, Anal. Biochem., 166, 368-379]을 사용하여 혼합물을 분석하고, Bio-Rad 웨스턴 블롯팅 장치를 사용하여, 39mM 글리신, 48mM Tris, 0.1%(W/V) 도데실 황산 나트륨(SDS) 및 20% 메탄올의 전달 완충액으로, 전달 시간을 1시간으로 하여 450mA에서 니트로셀룰로오스 페이퍼 상에 블롯팅하였다.
블롯을 트윈 20(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 - 3/ℓ PBS)을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.6으로 세척하여 평형화시켰다. 그런 다음, 불롯을 1시간 동안 37℃에서 35의 PBS-트윈 + 0.5%(w/v) 우 혈청 알부민(BSA)과 함께 인큐베이션 하고, 200의 PBS-트윈으로 5분씩 6회 세척한 후, 계속해서 4℃에서 밤새 35의 PBS-트윈 + 0.5&(w/v) BAS 및 100의 마우스 항-HA9 단클론성 항체(Balcore Co., Berkley, USA로부터 얻음)와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음, PBS-트윈(5분씩 200로 6회)으로 세척하고, 35의 PBS-트윈 +0.5%(W/V) BAS 및 50의 염소 항-마우스 lgG 양고추냉이 과산화효소(HRP) 컨쥬게이트와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 추가의 세척(6분씩 200의 PBS-트윈으로 6회)후에, 겔을 루미놀 웨스턴블롯팅시약(Amersham)으로 여기시켜 가시화하였다.
그 결과는 샘플번호 4에 상응하는, 레인 중의 한 밴드만이 항-HA9 항체와 교차반응하는 것을 보여주었다. 이것은 예상된 결과이며, 샘플 1-3은 네가티브 대조구이다. 그러므로, 선형 펩티드 단편을 이 방법을 사용하여 cys 14 캡시드와 커플링시키는 것이 가능하다.
G) cys 14 변형 코트 단백질과 효소의 공유 교차결합
상기 E)에 기재되어 있는 정제된 cys 14 변형 캡시드를, 말레이미드기를 경유하여 효소 양고추냉이 과산화효소(HRP)에 다음과 같이 공유 결합시켰다.
HRP-말레이미드 컨쥬케이트(Pierce Europe BV, Holland), cys 14 변형 캡시드 및ME를 사용하여 다음 혼합물을 만들고, 그것의 각각을 100mM NaPi, pH 7.2 로 100로 만들었다:
1) 20의 HRP-말레이미드+1의ME
2) 20의 CYS 14 변형 캡시드 +1의ME
3) 20의 CYS 14변형 캡시드 + 20의 HRP-말레이미드.
샘플 3)을 1시간 동안 실온에서 방치한 후ME를 첨가하여 남아 있는 티올을 퀀칭시켰다. 그런 다음 샘플 1-3을 PW 3000,2×3㎝ 컬럼상에서, 100Mm Napi, pH 7.2 로 0.5/분의 유속으로 HPLC 겔 여과 크로마토그래피하여 분별하였다. 그런 다음, 용출액 분획(1분-0.5)을 상업적으로 입수가능한 키트(ABTS 시약, Pierce)를 사용하여 HRP 활성 분석하고, 효소활성을 410nm에서 용액의 증가된 흡광도를 관찰함으로써 평가하였다. 데이터는 샘플 3의 cys 14 어셈블링된 물질의 OD280피이크에 상응하는 분획에서 바탕 수준에 비해 현저한 증가를 나타냈다.
Claims (15)
- 캡시드 어셈블리의 일부분을 형성할 수 있고, 파지 MS-2, 또는 물리적인 구조가 MS-2와 유사한 관련 대장균-복제성 RNA 파지의 변형된 코트 단백질로 구성되며, 상기 코트 단백질이 어셈블링된 캡시드의 N-말단 돌출-헤어핀 영역에 상응하는 영역에 시스테인 잔기를 삽입시킴으로써 변형되고, 상기 코트 단백질이 N-말단-헤어핀 영역의 외부에 시스테인 잔기(들)을 함유하는 경우에는, 그 외부 시스테인 잔기(들)을 비-시스테인 잔기(들)로 치환시킴으로써 더욱 변형된 키메라 단백질.
- 제1항에 있어서, 파지가 MS-2, R17, fr, GA, Q또는 SP로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 제1항 또는 제 2항에 있어서, 코트 단백질이 글리신 13 및 14의 영역에 시스테인을 삽입시킴으로써 변형된 파지 MS-2의 코트 단백질인 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,-헤어핀 외부의 시스테인(들)이 세린에 의해 치환된 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 제1항 또는 제 2항에 있어서, 삽입된 시스테인 잔기가 외래 분자종에 직접적 또는 간접적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 제5항에 있어서, 삽입된 시스테인 잔기가 스페이서 부분을 경유하여 외래 분자종에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 제6항에 있어서, 스페이서 부분이 m-말레이미도벤조일-N-히드록시술포숙신이미드 에스테르, N-숙신이미딜-(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 또는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트로부터 선택된 이작 용기성 교차결합제로부터 유래된 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 제5항에 있어서, 삽입된 시스테인 잔기가 항원 단백질에 직접적 또는 간접적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 제5항에 있어서, 삽입된 시스테인 잔기가 표적화 부분에 직접적 또는 간접적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 제9항에 있어서, 표적화 부분이 갈락토오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 단백질.
- 제1항에 따르는 키메라 단백질 또는 그러한 단백질의 혼합물을 포함하는 캡시드.
- 하나는 시스테인 잔기 46을 제거하기 위하여 돌연변이되고, 하나는 시스테인 잔기 101을 제거하기 위하여 돌연변이된, 2개의 MS-2파지 코트 단백질의 단일 돌연변이체를 제조하는 단계; 상응하는 cDNA들을 절단시키고 재연결시켜서 이중 돌연변이된 코트 단백질 cDNA를 제공하는 단계; 이중 돌연변이된 cDNA 에 부위 특정 돌연변이 유발시켜 시스테인 잔기를 N-말단 돌출-헤어핀에 상응하는 영역내에 삽입시키는 단계; 및 수득한 cDNA를 발현시켜서 키메라 단백질을 얻는 단계를 포함하는 제 1항에 따른 키메라 단백질의 제조 방법.
- 제12항에 있어서, 발현이 대장균에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 따르는 키메라 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터.
- 제8항에 따르는 단백질 또는 그러한 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 백신 제제.
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