JP4658475B2 - 骨疾患治療用の抗原アレイ - Google Patents

骨疾患治療用の抗原アレイ Download PDF

Info

Publication number
JP4658475B2
JP4658475B2 JP2003541333A JP2003541333A JP4658475B2 JP 4658475 B2 JP4658475 B2 JP 4658475B2 JP 2003541333 A JP2003541333 A JP 2003541333A JP 2003541333 A JP2003541333 A JP 2003541333A JP 4658475 B2 JP4658475 B2 JP 4658475B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rankl
protein
virus
antigen
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2003541333A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2005512987A (ja
JP2005512987A5 (ja
Inventor
バッハマン，マルチン
マオラー，パトリック
ギュンター シュポーン，
Original Assignee
サイトス バイオテクノロジー アーゲー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US10/050,902 external-priority patent/US7264810B2/en
Application filed by サイトス バイオテクノロジー アーゲー filed Critical サイトス バイオテクノロジー アーゲー
Priority claimed from PCT/EP2002/012449 external-priority patent/WO2003039225A2/en
Publication of JP2005512987A publication Critical patent/JP2005512987A/ja
Publication of JP2005512987A5 publication Critical patent/JP2005512987A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4658475B2 publication Critical patent/JP4658475B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5409—IL-5
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5437—IL-13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

本発明は、分子生物学、ウイルス学、免疫学、および医学の分野に関する。本発明は、規則的で繰り返し並べられた抗原または抗原決定基のアレイ、特にＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬＥ断片、またはＲＡＮＫＬＥペプチドのアレイを含む組成物を提供する。より具体的には本発明は、ウイルス様粒子と、そこに結合した少なくとも１つのＲＡＮＫＬＥタンパク質、ＲＡＮＫＬＥ断片、ＲＡＮＫＬＥペプチドとを含む組成物を提供する。また本発明は、結合体と、規則的な反復アレイをそれぞれ生成するためのプロセスも提供する。本発明の組成物は、骨疾患を治療するためのワクチンの製造に有用であり、また骨疾患を予防しまたは治療しかつ免疫応答、特に抗体応答を効率的に誘導する治療用ワクチン（ｐｈａｒｍａｃｃｉｎｅ）として有用である。さらに本発明の組成物は、指示される状況で自己特異的免疫応答を効率的に引き起こすのに特に有用である。
生きている骨は、バランスがとれかつ協調的な再建プロセスによって、永久に代謝回転する。この再建には、主に２つの細胞型が寄与しており、骨芽細胞は骨の形成に必ず必要なものであるが、破骨細胞は、骨基質の溶解およびヒドロキシアパタイトの可溶化を促進させるものである。骨が成長している若年者の場合、骨形成の速度は骨吸収の速度を超えるが、高齢者の場合、骨吸収速度が骨形成速度を超える可能性があり、その結果、最終的に骨無機質密度及び／又は骨質量に損失が生じる。後者の場合、骨強度が弱まって骨折のリスクが高まると共に、破壊された骨の修復が遅くなりまたは不完全になる。ヒトにおける数多くの状態は、骨の再建がアンバランスであることに関連することがわかっている。
最近では、造血前駆体細胞からの破骨細胞の形成と骨再建の調節に決定的に関与する、３種のタンパク質について記述されている。ＴＮＦＳＦ１１（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１１）、ＴＲＡＮＣＥ（ＴＮＦ関連活性誘導サイトカイン）、ＯＤＦ（破骨細胞分化因子）、またはＯＰＧＬ（破骨細胞形成阻害因子（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）リガンド）とも呼ばれるＲＡＮＫＬ（ＮＦｋＢリガンドのレセプター活性化因子）は、ホモ三量体を形成するアミノ酸２４５個の膜貫通タンパク質である。ＲＡＮＫＬの細胞外領域の一部は、ＴＡＣＥ様プロテアーゼによって切り離すことができる。さらに、膜貫通領域が欠けているスプライス変種についても記述されている。ＲＡＮＫＬの切り離された部分は、ＴＮＦ−αに非常に類似しているドメインを含んでいる（Ｌｕｍ，Ｌ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１３６１３〜１３６１８（２０００））。
ＲＡＮＫＬタンパク質およびＲＡＮＫＬ断片をどのように生成するかというプロセスは、ＷＯ９８４６７５１、米国特許第５，８４３，６７８号、ＷＯ９８２５９９５８、米国特許第６，２４２，５８６号、ＷＯ９８２８４２６、米国特許第６，２４２，２１３号、ＷＯ９９２９８６５、ＪＰ２０００１０２３９０、およびＷＯ００１５８０７に開示されている。
ＲＡＮＫＬは、ＲＡＮＫ（ＮＦｋＢのレセプター活性化因子）と呼ばれる破骨細胞上で膜貫通分子と相互に作用する。この相互作用により、破骨細胞前駆体が活性化し、活発に骨吸収する破骨細胞の形成が停止する。生体内で、破骨細胞形成阻害因子と呼ばれる可溶性デコイレセプターは、ＲＡＮＫＬに結合することができかつＲＡＮＫＬとそのレセプターＲＡＮＫとの相互作用を阻害することができるので、破骨細胞形成の調節に関与する。この阻害によって破骨細胞形成が抑制され、したがって過剰な骨吸収を停止させる手段が提供される。ＲＡＮＫＬとそのレセプターＲＡＮＫとの相互作用は、組換え破骨細胞形成阻害因子によって、また可溶性ＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質によって、抑制することができる。これらの知見によれば、ＲＡＮＫＬおよびＲＡＮＫ欠損マウスは大理石骨病を発症するが、ＲＡＮＫＬ過発現トランスジェニックマウスならびに破骨細胞形成阻害因子欠損マウスは骨粗しょう症を発症する（Ｋｏｎｇ ＹＹ．他、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３９７：３１５〜３２２（１９９９）、Ｋｉｍ，Ｎ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１０９０５〜１０９１０（２０００）、Ｄｏｕｇａｌｌ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１５６６〜１５７１（１９９９）、Ｂｕｃａｙ，Ｎ．他、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：１２６０〜１２６８（１９９８））。
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ−破骨細胞形成阻害因子系の重要性は、エストロゲン欠損によって引き起こされた骨粗しょう症のげっ歯類モデルでさらに確認される。組換え破骨細胞形成阻害因子は、卵巣摘出によって引き起こされる骨損失を完全消失させた（Ｓｉｍｏｎｅｔ，Ｗ．Ｓ．他、細胞（Ｃｅｌｌ）８９：３０９〜３１９（１９９７））。
アジュバント誘導型関節炎モデルでは、破骨細胞形成阻害因子を注射することによって骨損失および軟骨破壊を予防することができるが、炎症を抑えることができなかった（足の腫脹）。間質細胞上での発現の他、ＲＡＮＫＬはＴ細胞上にも発現し、ＲＡＮＫは抗原提示細胞にも見出される。間接炎性の反応中、ＲＡＮＫＬ発現が高められた活性化Ｔ細胞は、破骨細胞形成およびその後の骨損失の増大を仲介することが想定される。ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫとの相互作用によって、樹状細胞の寿命およびアジュバント特性も高められる（Ｋｏｎｇ Ｙ．Ｙ．他、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４０２：３０４〜３０９（１９９９））。
歯周感染では、歯槽骨破壊とその後の歯の損失が観察される。破骨細胞形成阻害因子によるＲＡＮＫＬ作用の生体内での阻害によって、歯槽骨破壊が低減し、微生物感染後の歯周破骨細胞の数が減少した（Ｔｅｎｇ，Ｙ．Ｔ．Ａ．他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：Ｒ５９〜Ｒ６７（２０００））。
骨腫瘍およびある特定の腫瘍転移は、破骨細胞形成の増大に起因して骨吸収が増大することを特徴とする（Ｈｏｆｂａｕｅｒ，Ｌ．Ｃ．およびＨｅｕｆｅｌｄｅｒ Ａ．Ｅ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔ．８５：２３５５〜２３６３（２０００））。破骨細胞形成阻害因子は、マウスの骨において、前立腺癌によって引き起こされる破骨細胞形成を阻止し、前立腺腫瘍の増殖を予防することを示した（Ｚｈａｎｇ Ｙ．他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７：１２１９〜１２２０（２００１））。また、マウスの進行骨癌の痛みも軽減した（Ｌｕｇｅｒ Ｎ．Ｍ．他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：４０３８〜４０４７（２００１））。多発性骨髄腫は、骨髄でのプラズマ細胞の蓄積と溶骨性骨疾患の発症を特徴とするＢ細胞悪性腫瘍である。多発性骨髄腫のマウスモデルでは、破骨細胞形成阻害因子またはＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質を注射することによって、溶解性骨病変の発症が予防され、骨髄腫の進行が妨げられた（Ｐｅａｒｓｅ ＲＮ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ９８：１１５８１〜１１５８６（２００１））。
無菌状態で補綴インプラントが緩む主な原因は、骨−インプラント界面での補綴周囲の骨溶解にあり、この骨溶解は、摩耗−破砕によって引き起こされる炎症によって生じる。破骨細胞形成阻害因子を形質移入した線維芽細胞様滑膜細胞により、マウスモデルでは、摩耗細片によって引き起こされる破骨細胞形成を予防することができた（Ｇｏｕｔｅｒ Ｊ．Ｊ．他、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２０２：１６９〜１７３（２００２））。
血管石灰化は、骨粗しょう症の患者集団で、臨床的に高い発生率で見られる。ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ−破骨細胞形成阻害因子系が関与していることは、破骨細胞形成阻害因子欠損マウスが動脈石灰化を示し、これは組換え破骨細胞形成阻害因子によって逆に作用するものであるという発見により実証されている（Ｍｉｎ，Ｈ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：４６３〜４７４（２０００））。
これらすべての発見は、様々な病態で骨吸収を調節する際、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ−破骨細胞形成阻害因子系が極めて重要であることを示している。これまで骨損失の阻止は、主に組換え破骨細胞形成阻害因子またはＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質の注入によるものであることが示されてきた。概念上は、ＲＡＮＫＬで動物を免疫化することにより、ＲＡＮＫ結合部位との結合または立体障害によって破骨細胞形成を妨げるべきＲＡＮＫＬ特異的抗体の生成を可能にすべきである。
しかしこれまで、ＲＡＮＫＬタンパク質またはペプチドによるワクチン接種は報告されていない。さらに、特に従来のワクチン接種によって抗体応答を自己分子に誘導することは通常困難であるので、骨疾患の予防にワクチンが有効であるという何の証拠もない。
ワクチン接種の効率を改善する１つの方法は、加えられる抗原の反復度を高めることである。単離されたタンパク質とは異なり、ウイルスは、Ｔ細胞の助けによりまたはＴ細胞の助けなしで、いかなるアジュバントも存在しない状態で、即座にかつ効率的に免疫応答を引き起こす（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ：１５：２３５〜２７０（１９９１））。ウイルスはしばしばごく少ないタンパク質からなるが、単離された成分よりも非常に強い免疫応答を引き起こすことができる。Ｂ細胞応答では、ウイルスの免疫原性に関する１つの極めて重要なファクターが、表面エピトープの反復性および順序正しさであることがわかっている。多くのウイルスは、エピトープに特異的な免疫グロブリンをＢ細胞に効率的に架橋するエピトープの規則正しいアレイを示す、準結晶質表面を示す（ＢａｃｈｍａｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：５５３〜５５８（１９９６））。この免疫グロブリンのＢ細胞への架橋は、細胞周期の進行およびＩｇＭ抗体の産生を直接誘発させる強力な活性化シグナルである。さらに、そのようなトリガーＢ細胞はＴヘルパー細胞を活性化することができ、それによってＢ細胞内でＩｇＭからＩｇＧ抗体産生への切換えを誘発させ、長命Ｂ細胞記憶を生成する−すなわちこれがすべてのワクチン接種の目標である（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５〜２７０（１９９７））。ウイルス構造は、自己免疫疾患での抗抗体の生成にも関係し、病原に対する自然な応答の一部としても関係する（Ｆｅｈｒ，Ｔ．他、Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１７８５〜１７９２（１９９７）参照）。したがって高度に組織化されたウイルス表面に存在する抗体は、強力な抗抗体応答を引き起こすことができる。
しかし上述のように、免疫系は通常、自己由来の構造に対する抗体を産生することができない。低濃度で存在する可溶性抗原の場合、これはＴｈ細胞レベルでの寛容に起因する。これらの条件下、Ｔヘルプを送達することができる担体に自己抗原を連結することによって、寛容性が破壊される可能性がある。高濃度で存在する可溶性タンパク質または低濃度の膜タンパク質では、ＢおよびＴｈ細胞が寛容になり得る。しかしＢ細胞寛容は可逆的であり（アネルギー）、高度に組織化された手法で外来の担体に連結した抗原の投与によって破壊される可能性がある（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５〜２７０（１９９７））。
本発明者等はついに、固有の反復性組織を有する構造のコア粒子、すなわち本明細書では特にウイルス様粒子（ＶＬＰ）およびＶＬＰのサブユニットにそれぞれ結合して高度に規則的で反復性の結合体になった、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドが、ＲＡＮＫＬに特異的な抗体を誘発させるための潜在的な免疫原になることを見出した。抗体は、ＲＡＮＫＬとそのレセプターＲＡＮＫと相互作用をそれぞれ阻止し中和することができる。したがって本発明は、規則的で反復性のＲＡＮＫＬ−コア粒子アレイ、特にＶＬＰ−ＲＡＮＫＬの結合体およびアレイをそれぞれ基にした、骨疾患を治療するための治療手段を提供する。この療法は、ワクチン接種した動物で、抗ＲＡＮＫＬ抗体の高い力価を引き出すことができる。
したがって本発明は、（ａ）少なくとも１つの第１の結着部位を有するコア粒子と、（ｂ）少なくとも１つの第２の結着部位を有する少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含む組成物を提供し、前記抗原または抗原決定基は、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドであり、前記第２の結着部位は、（ｉ）前記抗原または抗原決定基との天然でない結着部位、（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基との天然の結着部位からなる群から選択され、前記第２の結着部位は前記第１の結着部位と会合可能であり、前記抗原または抗原決定基と前記コア粒子とは、前記会合により相互に作用して、規則的で反復性の抗原アレイを形成する。本発明での使用に適するコア粒子の好ましい実施形態は、ウイルス、ウイルス様粒子、バクテリオファージ、細菌線毛またはべん毛、あるいは本発明による規則的で反復性の抗原アレイを形成することが可能な固有の繰返し構造を有する任意のその他のコア粒子である。
より詳細には、本発明は、規則的で反復性の抗原または抗原決定基アレイを含む組成物、したがって本明細書では特にＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドとＶＬＰとの結合体を含む組成物を提供する。より詳細には本発明は、ウイルス様粒子と、そこに結合した少なくとも１つのＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドとを含む、組成物を提供する。また本発明は、結合体と、規則的で反復性のアレイとをそれぞれ生成するためのプロセスも提供する。本発明の組成物は、骨疾患を治療するためのワクチンの製造に有用であり、また、骨疾患を予防しまたは治療し、免疫応答、特に抗体応答を効率的に引き起こすための治療用ワクチンとしても有用である。さらに本発明の組成物は、指示される状況で自己特異的な免疫応答を効率的に引き起こすのに特に有用である。
本発明では、典型的な場合は方向が示された手法で、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドが、コア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合し、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドの規則的で反復性の抗原アレイが得られる。さらに、コア粒子およびＶＬＰの高度に反復的かつ組織化された構造はそれぞれ、高度に規則的で反復的に、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドの表示を媒介し、それが高度に組織化され反復的な抗原アレイにつながる。さらに、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドとコア粒子およびＶＬＰとの結合により、それぞれＴヘルパー細胞エピトープが得られるが、これは、コア粒子とＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドとのアレイ、さらにはＶＬＰとＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドとのアレイでそれぞれ免疫化した宿主に対して、コア粒子およびＶＬＰが外来のものだからである。これらのアレイは、高度に組織化された構造であり、寸法であり、またアレイ表面に抗原が繰り返し存在する点で、従来技術の結合体とは異なる。
本発明の一態様では、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドが、ＲＡＮＫＬタンパク質またはＲＡＮＫＬ断片の適正な折畳みに適合した安定な発現宿主に発現し、あるいは合成され、一方コア粒子およびＶＬＰはそれぞれ、コア粒子およびＶＬＰの折畳みおよびアセンブリにそれぞれ適した発現宿主で発現し、精製される。ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドは、化学的に合成することができる。次いでＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドを、コア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合することによって、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドのアレイを組織化する。
別の態様で、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子と、（ｂ）少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含む組成物を提供し、前記抗原または前記抗原決定基は、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドであり、前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基はウイルス様粒子に結合されている。
別の態様では、本発明は、（ａ）請求項１または請求項２２に記載の組成物と、（ｂ）許容可能な医薬品担体とを含む医薬品組成物を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）少なくとも１つの第１の結着部位を有するコア粒子と、（ｂ）少なくとも１つの第２の結着部位を有する少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含んだ組成物を含む、ワクチン組成物を提供し、前記抗原または抗原決定基は、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドであり、前記第２の結着部位は、（ｉ）前記抗原または抗原決定基との天然でない結着部位、（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基との天然の結着部位からなる群から選択され、前記抗原または抗原決定基と前記コア粒子とは、前記会合により相互に作用して、規則的で反復性の抗原アレイを形成する。
別の態様では、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子と、（ｂ）少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含んだ組成物を含む、ワクチン組成物を提供し、前記抗原または前記抗原決定基は、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドであり、前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基は、前記ウイルス様粒子に結合する。
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子を提供する工程と、（ｂ）ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドである少なくとも１つの抗原または抗原決定基を提供する工程と、（ｃ）前記ウイルス様粒子と前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基を結合して、前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が前記ウイルス様粒子に結合するようにする工程とを含む、請求項１に記載の組成物を生成するためのプロセスを提供する。
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）少なくとも１つの第１の結着部位を有するコア粒子を提供する工程と、（ｂ）少なくとも１つの第２の結着部位を有する少なくとも１つの抗原または抗原決定基を提供する工程であって、前記抗原または抗原決定基が、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドであり、前記第２の結着部位が、（ｉ）前記抗原または抗原決定基との天然でない結着部位、（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基との天然の結着部位からなる群から選択され、前記第２の結着部位が、前記第１の結着部位に会合可能なものである工程と、（ｃ）前記コア粒子と、前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを結合する工程であって、前記抗原または抗原決定基と前記コア粒子とが前記会合によって相互に作用して、規則的で反復性の抗原アレイを形成する工程とを含む、請求項２２に記載の組成物を生成するためのプロセスを提供する。
別の態様では、本発明は、請求項１または請求項２２に記載の組成物を動物またはヒトに投与する工程を含む、免疫化の方法を提供する。
別の態様では、本発明は、骨疾患を治療する薬品を製造するための、請求項１または請求項２２に記載の組成物の使用を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、骨疾患、好ましくは哺乳動物の脳症を治療しまたは予防する薬品を調製するための、請求項１または請求項２２に記載の組成物の使用を提供する。さらに別の態様では、本発明は、骨疾患、特に哺乳動物の脳症を治療しまたは予防しかつ／または哺乳動物の免疫系を刺激する組成物、ワクチン、薬物、または薬品を製造するために、請求項１または請求項２２に記載の組成物を、単独でまたは他の薬剤と併せて使用することを提供する。
さらに本発明は、特に、骨疾患またはそれに関連した状態を予防しかつ／または軽減させるのに適したワクチン組成物を提供する。本発明はさらに、動物、特に雌ウシ、ヒツジ、ウシ、ならびにヒトにおける、骨疾患またはそれに関連した状態を予防しかつ／または軽減させるための、免疫化およびワクチン接種の方法をそれぞれ提供する。本発明の組成物は、予防的にまたは治療的に使用することができる。
特定の実施形態では、本発明は、「自己」遺伝子産物、すなわち本明細書で使用する「自己抗原」によって引き起こされまたは悪化する、骨疾患またはそれに関連した状態を、予防しかつ／または軽減させる方法を提供する。関係する実施形態では、本発明は、「自己」遺伝子産物によって引き起こされまたは悪化する骨疾患またはそれに関連した状態を予防しかつ／または軽減させる抗体の産生をもたらす免疫応答を、動物および個体においてそれぞれ誘発させる方法を提供する。
当業者に理解されるように、本発明の組成物を動物またはヒトに投与する場合、その組成物は、塩、緩衝液、アジュバント、またはこの組成物の効能を改善するのに望ましいその他の物質を含有する組成物でよい。医薬品組成物の調製に適した物質の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｏｓｏｌ，Ａ．編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０））を含めた非常に数多くの出典に示されている。
本発明の組成物は、その投与が受容者個人によって許容可能である場合、「薬理学的に許容可能」といえる。さらに本発明の組成物は、「治療上有効な量」（すなわち、所望の生理学的効果をもたらす量）で投与される。
本発明の組成物は、当技術分野で知られている様々な方法で投与することができるが、通常は注射、輸液、吸入、経口投与、またはその他の適切な物理的方法によって投与される。あるいは組成物は、筋肉内、静脈内、または皮下から投与することができる。投与される組成物の成分には、滅菌水溶液（例えば生理食塩水）、または滅菌非水性溶液または懸濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。担体または密封包帯法を使用して、皮膚の浸透を増すことができ、抗原吸収を高めることができる。
本発明のその他の実施形態は、当技術分野で知られている事項、下記の本発明の図面および記述、特許請求の範囲に照らし、当業者に明らかにされよう。
発明の詳細な説明
他に特に示さない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明を実施しまたは試験するにあたり、本明細書に記述するものと同様のまたは均等な任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料について以下に記述する。
１．定義
アミノ酸リンカー：本明細書で使用されるように、本明細書内の「アミノ酸リンカー」は、単なる「リンカー」という用語も同様に、抗原または抗原決定基を第２の結着部位に会合させ、またはより好ましくは第２の結着部位をすでに含みまたは含有し、典型的な場合は、必ずしも必要ではないが、１つのアミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として含みまたは含有する。しかし本明細書で使用する「アミノ酸リンカー」という用語は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施形態であったとしても、そのようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみからなることを示唆するものではない。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、天然に生ずるアミノ酸または当技術分野で知られている非天然のアミノ酸、全Ｌ型または全Ｄ型、あるいはこれらの混合物からなることが好ましい。しかし、スルフヒドリル基またはシステイン残基を有する分子を含むアミノ酸リンカーも、本発明に包含される。そのような分子は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール、またはヘテロアリール部分を含むことが好ましい。しかしアミノ酸リンカーの他、好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキル、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール、またはヘテロアリール部分を含んで任意のアミノ酸に欠けるリンカーも、本発明の範囲内に包含すべきである。抗原または抗原決定基あるいは任意選択の第２の結着部位とアミノ酸リンカーとの会合は、少なくとも１つの共有結合によることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によることがより好ましい。
動物：本明細書で使用する「動物」という用語は、例えばヒト、ヒツジ、オオシカ、シカ、ミンク、哺乳類、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、トリ、ニワトリ、爬虫類、魚、昆虫、およびクモを含むものとする。
抗体：本明細書で使用する「抗体」という用語は、エピトープまたは抗原決定基に結合することが可能な分子を指す。この用語は、抗体全体と、その抗原結合断片であって、１本鎖抗体を含めたものを含むものとする。抗体は、ヒト抗原結合抗体断片であり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、およびＶＬまたはＶＨドメインを含んだ断片を含むがこれらに限定するものではないことが、最も好ましい。抗体は、トリおよび哺乳類を含めた任意の動物由来のものから形成することができる。抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリであることが好ましい。本明細書で使用する「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、あるいは１つまたは複数のヒト免疫グロブリンに関して遺伝子導入された動物から単離した抗体、および内因性免疫グロブリンを発現しない抗体を含み、例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他による米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるものである。
抗原：本明細書で使用する「抗原」という用語は、抗体に、あるいはＭＨＣ分子によって提示される場合にはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）に結合可能な分子を指す。本明細書で使用する「抗原」という用語は、Ｔ細胞エピトープも包含する。抗原はさらに、免疫系によって認識することができ、かつ／または体液性免疫応答及び／又は細胞免疫応答を引き起こして、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化をもたらすことができる。しかしこれは、少なくともある特定の場合には、抗原がＴｈ細胞エピトープを含有しまたは結合し、アジュバントに与えられることを必要とする。抗原は、１つまたは複数のエピトープ（ＢおよびＴエピトープ）を有することができる。上述の特定の反応は、抗原が、典型的な場合には非常に選択的な手法で、好ましくはその対応する抗体またはＴＣＲと反応し、他の抗原によって引き起こされる可能性のある数多くのその他の抗体またはＴＣＲとは反応しないことを示すものとする。本明細書で使用する抗体は、いくつかの個別の抗原の混合物でもよい。
抗原決定基：本明細書で使用する「抗原決定基」という用語は、ＢまたはＴリンパ球によって特異的に認識される抗原のタンパク質を指すものとする。抗原決定基に応答するＢリンパ球は抗体を産生し、一方Ｔリンパ球は、細胞及び／又は体液性免疫の媒介に極めて重要なエフェクター機能の増大および確立によって、抗原決定基に応答する。
会合：本明細書で使用する「会合」という用語は、第１および第２の結着部位に適用されるように、少なくとも１つの非ペプチド結合によることが好ましい第１および第２の結着部位の結合を指す。会合の性質は、共有結合、イオン結合、疎水結合、極性結合、またはこれらの任意の組合せでよく、この会合の性質は共有結合であることが好ましい。
第１の結着部位：本明細書で使用する「第１の結着部位」という文言は、抗原または抗原決定基上に位置する第２の結着部位が会合し得る、非天然または天然由来の要素を指す。第１の結着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成のポリマー、二次代謝産物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、またはこれらの組合せ、あるいはその化学反応基でよい。第１の結着部位は、典型的な場合かつ好ましくは、好ましくはウイルス様粒子などのコア粒子の表面に位置する。複数の第１の結着部位は、コアおよびウイルス様粒子の表面にそれぞれ存在し、典型的な場合は繰返し構成体内にある。
第２の結着部位：本明細書で使用する「第２の結着部位」という文言は、コア粒子およびウイルス様粒子の表面にそれぞれ位置付けられた第１の結着部位が会合し得る、抗原または抗原決定基に会合する要素を指す。抗原または抗原決定基の第２の結着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成のポリマー、二次代謝産物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、またはこれらの組合せ、あるいはその化学反応基でよい。少なくとも１つの第２の結着部位は、抗原または抗原決定基上に存在する。したがって「少なくとも１つの第２の結着部位を有する抗原または抗原決定基」という用語は、抗原または抗原構造であって、少なくとも抗原または抗原決定基と第２の結着部位を含むものを指す。しかし特に、非天然由来の第２の結着部位、すなわち抗原または抗原決定基内に自然に生じないものに関しては、これらの抗原または抗原構造が、「アミノ酸リンカー」を含む。
骨疾患：本明細書で使用する「骨疾患」という用語は、特に、骨吸収の増加を特徴とする状態を包含する。「骨疾患」という用語は、原発性骨粗しょう症（特発性、閉経後、退行性、老人性）や続発性骨粗しょう症など種々の形態の骨粗しょう症を含むが、これらに限定されない。後者には、グルココルチコイド過剰、上皮小体機能亢進症、甲状腺機能亢進症、性機能亢進症、過プロラクチン血症、糖尿病、グルココルチコステロイドやエタノール、ジランチン、タバコ、バルビツレート、ヘパリンなどによって引き起こされるような薬物誘発性骨粗しょう症、不使用により誘発される骨粗しょう症、慢性腎不全や肝臓疾患、吸収不良症候群、慢性閉塞性肺疾患、サルコイドーシスなどの骨吸収の増加に関連した種々雑多な状態によって引き起こされる骨粗しょう症が含まれる。骨吸収を伴うその他の状態には、パジェット病、家族性膨張性骨溶解、自発性骨溶解、リウマチ様関節炎に伴う骨損失、骨吸収、および歯周疾患中の歯の損失、骨髄炎、悪性疾患による高カルシウム血症、骨腫瘍、骨転移に伴う癌、宇宙飛行で見られるような無重力感によって引き起こされる骨損失が含まれる。当業者なら、骨吸収の増加を特徴とするその他の状態も理解されよう。
結合：本明細書で使用する「結合」という用語は、例えば化学的な連結による共有結合、または例えばイオン的相互作用や疎水的相互作用、水素結合などの非供給結合などの、結合または結着を指す。共有結合は、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などでよい。「結合」という用語は、「連結」や「融合」、「結着」などの用語よりも広く、これらを含むものである。
コートタンパク質：本明細書で使用する「コートタンパク質」という用語は、バクテリオファージまたはＲＮＡファージのカプシド組織体内に組み込むことが可能なバクテリオファージまたはＲＮＡファージのタンパク質を指す。しかし、ＲＮＡファージのコートタンパク質遺伝子の特定の遺伝子産物を指す場合は、「ＣＰ」という用語を使用する。例えば、ＲＮＡファージＱβのコートタンパク質遺伝子の特定の遺伝子産物を「Ｑβ ＣＰ」と呼び、一方バクテリオファージＱβの「コートタンパク質」は、「Ｑβ ＣＰ」ならびにＡ１タンパク質を含む。バクテリオファージＱβのカプシドは、主にＱβ ＣＰからなり、さらに少量のＡｌタンパク質を含有する。同様にＶＬＰ Ｑβコートタンパク質は、主にＱβ ＣＰを含有し、さらに少量のＡｌタンパク質を含有する。
コア粒子：本明細書で使用する「コア粒子」という用語は、固有の反復性組織を有する硬質構造を指す。本明細書で使用するコア粒子は、合成プロセスの生成物または生物学的プロセスの産物でよい。
連結：本明細書で使用する「連結」という用語は、共有結合または強力な非共有相互作用による結着を指し、典型的な場合かつ好ましくは、共有結合による結着を指す。本発明では、生物学的に活性な物質を連結させるために当業者によって通常使用される任意の方法を、使用することができる。
有効な量：本明細書で使用する「有効な量」という用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要なまたは十分な量を指す。組成物の有効な量は、この選択された結果を実現する量であると考えられ、そのような量は、当業者により日常的な業務として決定することができる。例えば、免疫系障害を治療するのに有効な量とは、免疫系の活性化を引き起こし、それよって、抗原に曝されたときに抗原特異的免疫応答を誘発させるのに必要な量である。この用語は、「十分な量」とも同義である。
任意の特定の適用例での有効な量は、治療する疾患や状態、投与される特定の組成物、被験者のサイズ、及び／又は疾患または状態の重症度などのファクターに応じて様々に変えることができる。当業者なら、必要以上の実験を行うことなく、本発明の特定の組成物の有効な量を経験的に決定することができる。
エピトープ：本明細書で使用する「エピトープ」という用語は、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトにおいて、抗原性または免疫原性活性を有するポリペプチドの連続または不連続な部分を指す。エピトープは、抗体によって、またはＭＨＣ分子の場合にはＴ細胞レセプターを介してＴ細胞によって認識される。本明細書で使用する「免疫原性エピトープ」は、当技術分野で知られている任意の方法によって決定されるように、動物の抗体応答を引き出しまたはＴ細胞応答を誘発させるポリペプチドの一部と定義される（例えばＧｅｙｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３９９８〜４００２（１９８３）参照）。本明細書で使用する「抗原性エピトープ」という用語は、当技術分野で周知の任意の方法によって決定されるように、抗体がその抗原を免疫特異的に結合させることができるタンパク質の一部と定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合を除外するものであるが、必ずしも他の抗原との交差反応性を除外するものではない。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。抗原性エピトープはＴ細胞エピトープでもよく、その場合、ＭＨＣ分子の場合にはＴ細胞に免疫特異的に結合することができる。
エピトープは、空間構造内に３個のアミノ酸を含むことができるが、これはこのエピトープに独特なものである。一般にエピトープは、少なくとも約５個のそのようなアミノ酸からなり、より一般的には少なくとも約８〜１０個のそのようなアミノ酸からなる。エピトープが有機分子である場合、ニトロフェニル程度に小さくなる。
融合：本明細書で使用する「融合」という用語は、コードヌクレオチド配列のフレーム内の組合せによる、１つのポリペプチド鎖での異なる由来のアミノ酸配列の組合せを指す。「融合」という用語は、末端の一方への付加の他、内部融合、すなわちポリペプチド鎖内への異なる由来の配列の挿入を明らかに包含する。
免疫応答：本明細書で使用する「免疫応答」という用語は、Ｂ及び／又はＴリンパ球及び／又は抗原提示細胞の活性化または増殖に繋がる体液免疫応答及び／又は細胞免疫応答を指す。しかし、ある場合には、この免疫応答の強度が低くなる可能性があり、本発明による少なくとも１つの物質を使用した場合にしか検出することができなくなる。「免疫原性」は、生きている生物の免疫系を刺激するのに使用される薬剤を指し、したがって免疫系の１つまたは複数の機能が増大し、免疫原性薬剤へと向かう。「免疫原性ポリペプチド」は、アジュバントの存在下でまたは存在しない状態で、単独であってもまたは担体に結合した状態であっても細胞及び／又は体液免疫応答を引き出すポリペプチドである。抗原提示細胞は、活性化できることが好ましい。
免疫応答を「高める」物質とは、その物質を添加せずに測定した同じ免疫応答と比べた場合、その物質を添加することによって多少なりとも大きくなりまたは強くなりまたは偏向した免疫応答が観察される物質を指す。例えば細胞障害性Ｔ細胞の溶解活性は、例えば免疫化中にその物質を使用してまたは使用せずに得られたサンプルで、５１Ｃｒ放出アッセイを使用して測定することができる。この物質がない場合のＣＴＬ溶解活性に比べてＣＴＬ溶解活性が高められた物質の量は、抗原に対する動物の免疫応答を高めるのに十分な量と言える。好ましい実施形態では、免疫応答が少なくとも約２倍、より好ましくは約３倍以上、高められる。分泌されたサイトカインの量またはタイプは変えてもよい。あるいは、誘発された抗体またはそのサブクラスの量を変えることができる。
免疫化：本明細書で使用する、「免疫化する」または「免疫化」という用語あるいはこれに関連する用語は、標的抗原またはエピトープに対して実質的な免疫応答を引き起こす能力を与えることを指す（抗体及び／又は細胞免疫性であってエフェクターＣＴＬなど）。これらの用語は、完全な免疫性をもたらすことを必要とせず、むしろベースラインよりも実質的に大きい免疫応答を生成することを指す。例えば哺乳類は、本発明の方法を適用した後に標的抗原に対する細胞及び／又は体液免疫応答が生じた場合、標的抗原に対して免疫化されたと考えられる。
天然由来：本明細書で使用する「天然由来」という用語は、その全体または一部が合成ではなく、自然に存在しまたは産生されることを意味する。
非天然：本明細書で使用されるこの用語は、一般に、天然からのものではないことを意味し、より具体的にはこの用語は、人の手によるものであることを意味する。
非天然由来：本明細書で使用する「非天然由来」という用語は、一般に、合成したものまたは天然からのものではないことを意味し、より具体的には、この用語は人の手によるものであることを意味する。
規則的で反復性の抗原または抗原決定基アレイ：本明細書で使用する「規則的で反復性の抗原または抗原決定基アレイ」いう用語は、一般に、抗原または抗原決定基の反復パターンを指し、典型的な場合かつ好ましくは、コア粒子およびウイルス様粒子に対してそれぞれ抗原または抗原決定基が均一な空間配置であることを特徴とする。本発明の一実施形態で、反復パターンは幾何学的パターンでよい。適切な規則的で反復性の抗原または抗原決定基アレイの典型的かつ好ましい例は、厳密に繰り返される準結晶の配列の抗原または抗原決定基を所有するものであり、好ましくは１〜３０ナノメートルの間隔があり、好ましくは５〜１５ナノメートルの間隔があるものである。
線毛（ｐｉｌｉ）：本明細書で使用する「線毛」（単数形は「ｐｉｌｕｓ」）は、規則的で反復性のパターンに組織化されたタンパク質モノマー（例えばピリンモノマー）からなる細菌細胞の細胞外構造を指す。さらに線毛は、細菌細胞と宿主細胞表面レセプターとの結着や、細胞間での遺伝子交換、および細胞−細胞認識などのプロセスに関与する構造である。線毛の例には、１型線毛、Ｐ線毛、Ｆ１Ｃ線毛、Ｓ線毛、および９８７Ｐ線毛が含まれる。線毛の追加の例を、以下に示す。
線毛様構造：本明細書で使用する「線毛様構造」という文言は、線毛の構造およびタンパク質モノマーからなる構造と同様の特徴を有する構造を指す。「線毛様構造」の一例は、天然の線毛と同一の規則的で反復性のアレイを形成しない修飾ピリンタンパク質を発現する細菌細胞によって形成された構造である。
ポリペプチド：本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合とも呼ばれる）によって線形に結合したモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、生成物の特定の長さを指すものではない。したがってペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化なども指すものとする。組換えまたは誘導ポリペプチドは、必ずしも指定された核酸配列から翻訳される必要はない。化学合成を含めた任意の手法で生成してもよい。
ＲＡＮＫＬタンパク質：本明細書で使用する「ＲＡＮＫＬタンパク質」という用語は、ＲＡＮＫＬ遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。ＲＡＮＫＬタンパク質の種々の変種は、ヌクレオチド点変異および多形性によってそれぞれ誘導することができ、同様に１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、及び／又は置換によって誘導することができ、本発明の範囲内に明らかに包含されるべきである。その他の変種は、ＲＡＮＫＬを差次的にグリコシル化した形態、ならびにＲＡＮＫＬをタンパク質分解により切断した形態など、翻訳後修飾によって引き起こすことができる（Ｌｕｍ，Ｌ．他、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１３６１３〜１３６２８（２０００））。現在、ヒトＲＡＮＫＬ遺伝子およびその他の種のＲＡＮＫＬ遺伝子のいくつかの知られているスプライス変種があり、これらも上述の可能な変種と共に、本発明の範囲内にあるものである。したがって本明細書で使用する「ＲＡＮＫＬ」タンパク質という用語は、上述の好ましい例を含むがそれらに限定されないＲＡＮＫＬタンパク質変種も包含すべきである。
本明細書で使用する「ＲＡＮＫＬ断片」という用語は、ＲＡＮＫＬタンパク質の一部を表す少なくとも５０アミノ酸の長さの任意のポリペプチドとして広く定義され、最も好ましくはＲＡＮＫＬの折畳み部分、最も好ましくはＲＡＮＫＬの細胞外部分、さらに好ましくはＴＮＦ−αと同様の領域である。ＲＡＮＫＬ断片という用語は、ＲＡＮＫＬのスプライシング形およびタンパク質分解切断形と、その上記すべての変種に対応する、組換えにより生成されたタンパク質およびポリペプチドのそれぞれも包含する。
本明細書で使用する「ＲＡＮＫＬペプチド」という用語は、ＲＡＮＫＬタンパク質またはＲＡＮＫＬ断片の一部を表す任意のペプチドとして広く定義され、当初のＲＡＮＫＬタンパク質またはＲＡＮＫＬ断片、最も好ましくはＲＡＮＫＬの細胞外部分の、少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも６個の連続したアミノ酸を含有するものである。さらに、「ＲＡＮＫＬペプチド」という用語は、前記ＲＡＮＫＬペプチドの任意の部分、すなわち好ましくはＮ及び／又はＣ末端で１つまたは複数のアミノ酸の欠失によって得ることができる任意の部分を包含すべきことが好ましい。ＲＡＮＫＬペプチドは、例えばＲＡＮＫＬペプチドの折畳み、発現、または溶解が容易になるように、あるいはＲＡＮＫＬペプチドの精製が容易になるように、ＲＡＮＫＬペプチド単独としてあるいはその他のアミノ酸またはタンパク質との融合体として、真核または原核発現系での組換え発現によって得ることができる。ＲＡＮＫＬペプチドとＶＬＰまたはカプシドのサブユニットタンパク質の連結を可能にするため、少なくとも１つの第２の結着部位をＲＡＮＫＬペプチドに付加することができる。あるいはＲＡＮＫＬペプチドは、当技術分野で知られている方法を使用して合成することができる。本明細書で使用されるＲＡＮＫＬペプチドという用語は、好ましくは、ＲＡＮＫＬの３次元表面構造をシミュレートするペプチドも包含すべきである。そのようなＲＡＮＫＬペプチドは、必ずしもＲＡＮＫＬの連続アミノ酸配列から得る必要はなく、ＲＡＮＫＬからの不連続なアミノ酸残基によって形成することができる。そのようなペプチドは、対応するＲＡＮＫＬタンパク質中に存在しないアミノ酸も含有することができる。
残基：本明細書で使用する「残基」という用語は、ポリペプチドの主鎖または側鎖における特定のアミノ酸を意味するものとする。
自己抗原：本明細書で使用する「自己抗原」という用語は、宿主のＤＮＡでコードされたタンパク質を指し、宿主のＤＮＡでコードされたタンパク質またはＲＮＡにより生成された生成物は、自己と定義される。さらに、２個またはいくつかの自己分子の組合せから得られ、あるいは自己分子の一部であるタンパク質と、上述の相同性の高い２個の自己分子（＞９５％、好ましくは＞９７％、より好ましくは＞９９％）を有するタンパク質は、自己と見なしてもよい。
治療：本明細書で使用する「治療」、「治療する」、「治療した」、または「治療している」という用語は、予防及び／又は療法を指す。例えば感染症に対して使用する場合、この用語は、病原体で感染に対する被験者の耐性を増大させ、すなわち言い換えれば被験者が病原体に感染しまたは感染に起因する病気の徴候を示す可能性を低下させる予防的治療を指し、同様に、被験者が感染した後にその感染と闘うための治療、例えば感染を軽減しまたはなくし、あるいは悪化するのを防止する治療を指す。骨疾患に関して使用する場合、「治療」という用語は、骨疾患に関連する骨吸収の増加を阻害しまたは低減させる予防的治療または療法を指す。
ワクチン：本明細書で使用する「ワクチン」という用語は、本発明の組成物を含有しかつ動物に投与可能な形態の製剤を指す。典型的な場合、ワクチンは、本発明の組成物を懸濁させまたは溶解させた、従来の生理食塩水または緩衝水溶液媒体を含む。この形態では、本発明の組成物を都合よく使用して、状態を予防し、改善し、またはその他の方法で治療することができる。宿主に導入することにより、ワクチンは、抗体及び／又はサイトカインの産生、及び／又は細胞障害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化、およびまたはその他の細胞応答も含むがこれらに限定することのない免疫応答を引き起こすことができる。
任意選択で、本発明のワクチンはさらに、本発明の化合物に対して少量または多量の割合で存在可能なアジュバントを含む。本明細書で使用する「アジュバント」という用語は、免疫応答の非特異的刺激物質、または本発明のワクチンと組み合わせたときに免疫応答をさらに高めるデポー剤を宿主内で生成することが可能な物質を指す。様々なアジュバントを使用することができる。例として、完全および不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、および変性ムラミールジペプチドが含まれる。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用する「ウイルス様粒子」は、ウイルス粒子に似ている構造を指す。さらに本発明によるウイルス様粒子は、ウイルスゲノムのすべてまたは一部、特にウイルスゲノムの複製的で感染性の成分が欠けているので、非複製的であり非感染性である。本発明によるウイルス様粒子は、そのゲノムとは異なる核酸を含有してよい。本発明によるウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施形態は、対応するウイルス、バクテリオファージ、またはＲＮＡファージのウイルスカプシドなどのウイルスカプシドである。本明細書で同義として使用される「ウイルスカプシド」または「カプシド」という用語は、ウイルスタンパク質サブユニットからなる高分子組織体を指す。典型的な場合かつ好ましくは、ウイルスタンパク質サブユニットは、固有の反復性組織を備えた構造を有するウイルスカプシドおよびカプシドにそれぞれ組織化され、前記構造は、典型的な場合、球状または管状である。例えばＲＮＡファージまたはＨＢｃＡｇのカプシドは、対称な正二重面体の球形である。本明細書で使用する「カプシド様構造」という用語は、上記定義した意味でカプシドの形態に似ているが、典型的な対称組織体から逸脱すると共に十分な程度の規則性と反復性を維持する、ウイルスタンパク質サブユニットからなる高分子組織体を指す。
バクテリオファージのウイルス様粒子：本明細書で使用する「バクテリオファージのウイルス様粒子」という用語は、バクテリオファージの構造に似ており、非複製的で非感染性であり、さらに少なくともバクテリオファージの複製機構をコードする遺伝子に欠けているウイルス様粒子、典型的な場合はウイルスの宿主への結着またはウイルスの宿主への進入の原因となるタンパク質をコードする遺伝子にも欠けているウイルス様粒子を指す。しかしこの定義は、前述の遺伝子が依然として存在するが不活性であり、したがってバクテリオファージの非複製的で非感染性のウイルス様粒子が得られる、バクテリオファージのウイルス様粒子も包含すべきである。
ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ：ＲＮＡファージコートタンパク質の１８０個のサブユニットの自己組織化から形成され、任意選択で宿主ＲＮＡを含有するカプシド構造は、「ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ」と呼ばれる。特定の例は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰである。この特定の場合では、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰがＱβ ＣＰサブユニットのみから組織化され（例えば抑制によってより長いＡ１タンパク質のすべての発現を除外するＴＡＡ停止コドンを含有したＱβ ＣＰ遺伝子の発現によって生成、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ３９：９〜１５（１９９６））、または追加としてカプシド組織体中にＡ１タンパク質サブユニットを含有してよい。
ウイルス粒子：本明細書で使用する「ウイルス粒子」という用語は、ウイルスの形態学的形状を指す。いくつかのウイルスのタイプでは、タンパク質カプシドで取り囲まれたゲノムを含み、その他のタイプでは、追加の構造（例えば外被や末端部など）を含む。
１つ：この開示で「１つ」という用語を使用する場合は、他に特に指示しない限り、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味する。
当業者に明らかにされるように、本発明のある特定の実施形態は、クローニングやポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡおよびＲＮＡの精製、原核細胞および真核細胞での組換えタンパク質の発現などの、組換え核酸技術の使用を含む。そのような方法は当業者に周知であり、出版された実験方法マニュアルに都合よく見出すことができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他編、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、実験室マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．他編、分子生物学における現代のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７））。組織培養細胞系を用いた基本的な実験室技法（Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、細胞生物学（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９９８））、および抗体をベースにした技術（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）：実験室マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８）；Ｄｅｕｔｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．、「タンパク質精製の手引き（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．、タンパク質精製の原理および実践（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４））も、文献に十分に記載されており、そのすべてを参照により本明細書に援用する。
２．免疫応答を高めるための組成物および方法
開示される発明は、動物の、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドに対する免疫応答を高めるための、組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、（ａ）少なくとも１つの第１の結着部位を有するコア粒子と、（ｂ）少なくとも１つの第２の結着部位を有する少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含み、あるいはこれらからなり、前記抗原または抗原決定基は、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドであり、前記第２の結着部位は、（ｉ）前記抗原または抗原決定基との天然でない結着部位、（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基との天然の結着部位からなる群から選択され、前記第２の結着部位は前記第１の結着部位と会合可能であり、前記抗原または抗原決定基と前記コア粒子とは、前記会合により相互に作用して、規則的で反復性の抗原アレイを形成する。より詳細には、本発明の組成物は、ウイルス様粒子と少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含みあるいはこれらからなり、抗原または抗原決定基は、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドであり、少なくとも１つの抗原または抗原決定基は、規則的で反復性の抗原ＶＬＰアレイが形成されるようにウイルス様粒子に結合する。さらに本発明によれば、とりわけ、骨吸収を特徴とする骨疾患を治療しかつ／または予防的に阻止するために、そのような組成物を医者が都合よく構成することが可能である。
一実施形態では、コア粒子には、ウイルス、細菌線毛、細菌性ピリンから形成された構造、バクテリオファージ、ウイルス様粒子、ウイルスカプシド粒子、またはこれらの組換え形態が含まれる。規則的で反復性の被覆及び／又はコアタンパク質構造を有する当技術分野で知られている任意のウイルスが、本発明のコア粒子として選択することができ、適切なウイルスの例には、シンドビスおよびその他のアルファウイルス、ラブドウイルス（例えば水疱性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（例えばヒトライノウイルス、アイチウイルス）、トガウイルス（例えば風疹ウイルス）、オルトミクソウイルス（例えばトゴトウイルス、バトケンウイルス、家禽ペストウイルス）、ポリオーマウイルス（例えばポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、トリポリオーマウイルスＢＦＤＶ）、パルボウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、タバコモザイクウイルス、フロックハウスウイルス、およびヒトパピローマウイルスが含まれ、好ましくはＲＮＡファージ、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージＭ１１、バクテリオファージＭＸ１、バクテリオファージＮＬ９５、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＭＳ２、バクテリオファージｆ２、バクテリオファージＰＰ７である（例えばＢａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．およびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ｒ．Ｍ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：５５３〜５５８（１９９６）の表１参照）。
別の実施形態では、本発明は、ウイルスの遺伝子工学を利用して、規則的で反復性のウイルス外被タンパク質と、選択された異種タンパク質、ペプチド、抗原決定基、または反応性アミノ酸残基を含む第１の結着部位との融合を生成する。本発明の組成物を構成するには、当技術分野で知られるその他の遺伝子操作を含めることができ、例えば遺伝子の変異により組換えウイルスの複製能力を制限することが望ましい。さらに本発明で使用されるウイルスは、化学的または物理的不活性が原因となって、または示されるように複製適格ゲノムが欠けていることから、複製不可能である。第１の結着部位に融合するよう選択されたウイルスタンパク質は、組織化された繰返し構造を有するべきである。そのような組織化繰返し構造は、ウイルスの表面に、間隔が５〜３０ナノメートル、好ましくは５〜１５ｎｍの準結晶質組織を含む。このタイプの融合タンパク質の生成によって、ウイルス表面に、複数の規則的で反復性の第１の結着部位が得られ、天然のウイルスタンパク質の通常の組織化を反映することになる。当業者に理解されるように、第１の結着部位は、任意の適切なタンパク質、ポリペプチド、糖、ポリヌクレオチド、ペプチド（アミノ酸）、天然または合成ポリマー、二次代謝産物、またはこれらの組合せでよく、あるいはこれらの一部でよく、すなわちこれらは抗原または抗原決定基に特異的に結着するよう役立てることができ、それによって規則的で反復性の抗原アレイが得られる。
本発明の別の実施形態で、コア粒子は組換えアルファウイルスであり、より詳細には組換えシンビスウイルスである。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で、ＤＮＡの中間体なしで、そのゲノムＲＮＡ全体を複製するプラス鎖ＲＮＡウイルスである（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｅ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１〜５６２（１９９４））。アルファウイルス科のいくつかのメンバー、シンドビス（Ｘｉｏｎｇ，Ｃ．他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４３：１１８８〜１１９１（１９８９）；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１：１８〜２２（１９９３））、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｐ．＆ Ｇａｒｏｆｆ，Ｈ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３５６〜１３６１（１９９１））、およびその他のもの（Ｄａｖｉｓ，Ｎ．Ｌ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７１：１８９〜２０４（１９８９））は、様々な異なるタンパク質に関するウイルスベースの発現ベクターとして（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５７８〜５８２（１９９７）；Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｐ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４９５〜５００（１９９４））、さらにワクチン開発の候補物質として使用することを目的に、かなりの注目を集めている。最近、異種タンパク質の発現およびワクチンの開発のためにアルファウイルスを使用することを対象としたいくつかの特許が発行されている（米国特許第５，７６６，６０２号；第５，７９２，４６２号；第５，７３９，０２６号；第５，７８９，２４５号、および第５，８１４，４８２号参照）。本発明のアルファウイルスコア粒子の構成体は、参照により本明細書に援用する前述の論文に記載されている、組換えＤＮＡ技術の分野で一般に知られている手段によって行うことができる。
抗原または抗原決定基結着用のウイルスベースのコア粒子を生成するには、様々な異なる組換え宿主細胞を利用することができる。例えばアルファウイルスは、広い宿主範囲を有することが知られており、シンドビスウイルスは、培養した哺乳動物、爬虫類、両性類細胞、ならびにいくつかの昆虫細胞に感染する（Ｃｌａｒｋ，Ｈ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、５１：６４５（１９７３）；Ｌｅａｋｅ，Ｃ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３５：３３５（１９７７）；Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｖ．、ＴＨＥ ＴＯＧＡＶＩＲＵＳＥＳ、Ｒ．Ｗ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８０）、第５８３〜６２１頁）。したがって本発明の実施に際して数多くの組換え宿主細胞を使用することができる。ＢＨＫ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が、異種タンパク質の生成に特に適しているが、その理由は、これらの細胞がヒト細胞と同様の手法で異種タンパク質をグリコシル化することができ（Ｗａｔｓｏｎ，Ｅ．他、糖鎖生物学（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）４：２２７（１９９４））、選択することができ（Ｚａｎｇ，Ｍ．他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３８９（１９９５））、または遺伝子工学によって合成することができ（Ｒｅｎｎｅｒ，Ｗ．他、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．４：４７６（１９９５）；Ｌｅｅ，Ｋ．他、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．５０：３３６（１９９６））、それによって血清を含まない培地ならびに懸濁液中で成長させることができるからである。
宿主細胞内へのポリヌクレオチドベクターの導入は、標準的な実験室マニュアルに記載されている方法により行うことができ（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他編、分子クローニング（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ）、実験室マニュアル（Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、第９章；Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．他編、分子生物学における現代のプロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）、Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）、第１６章参照）、電気穿孔法やＤＥＡＥデキストラン媒介型トランスフェクション、トランスフェクション、微量注入、陽イオン脂質媒介型トランスフェクション、形質導入、スクレープローディング、弾丸導入、および感染などの方法が含まれる。宿主細胞に外因性ＤＮＡ配列を導入する方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．他の米国特許第５，５８０，８５９号で論じられている。
宿主細胞に感染させるには、パッケージのＲＮＡ配列を使用することもできる。このようなパッケージＲＮＡ配列は、培地に添加することによって宿主細胞に導入することができる。例えば非感染性のアルファウイルス粒子の調製について、「シンドビス発現系（Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）」バージョンＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｋ７５０−１）を含めたいくつかの出典に記載されている。
ウイルスベースのコア粒子を生成するために組換え宿主細胞として哺乳動物細胞を使用する場合、この細胞は一般に、組織培養によって増殖させることになる。培養によって細胞を増殖させる方法は、当技術分野では周知である（例えば、Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、細胞生物学（ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ第２版（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他編、分子クローニング（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ）、実験室マニュアル（Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．他編、分子生物学における現代のプロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）、Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．、動物細胞の培養（ＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬＳ）、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８３）参照）。
本発明のコア粒子としての使用に適しているＲＮＡウイルスの別の例には、下記のものが含まれるが、これらに限定するものではない：すなわちオルトレオウイルス属（哺乳動物とトリレトロウイルスの両方の複数の血清型）、オルビウイルス属（ブルータングウイルス、オイゲナンギーウイルス、ケメロボウイルス、アフリカウマウイルス、およびコロラドダニ熱ウイルス）、ロタウイルス属（ヒトロタウイルス、ネブラスカ子ウシ下痢ウイルス、マウスロタウイルス、サルロタウイルス、ウシまたはヒツジロタウイルス、トリロタウイルス）を含むレオウイルス科；エンテロウイルス属（ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡおよびＢ、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＧ型肝炎ウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎（ＭＥ）ウイルス、ポリオウイルスムリス（ｍｕｒｉｓ）、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス）、カルジオウイルス属（脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、メンゴウイルス）、ライノウイルス属（少なくとも１１３のサブタイプを含むヒトライノウイルス；その他のライノウイルス）、アプトウイルス属（口蹄疫（ＦＭＤＶ））を含むピコルナウイルス科；ブタ小水疱性発疹ウイルス、サンミゲルアシカウイルス、ネコピコルナウイルス、およびノーウォークウイルスを含むカリシウイルス科；アルファウイルス属（東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラビウイルス属（蚊媒介黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中欧ダニ媒介ウイルス、極東ダニ媒介ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、跳躍病ウイルス、ポワッサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス）、ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス）を含むトガウイルス科；ブンヤウイルス属（ブンヤムウェラおよび関連するウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス属（シシリアサシチョウバエウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミア−コンゴ出血性熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、およびウークウイルス属（ウークニエミおよび関連するウイルス）を含むブンヤウイルス科；インフルエンザウイルス属（インフルエンザウイルスＡ型、多くのヒトサブタイプ）を含むオルソミクソウイルス科；ブタインフルエンザウイルス、トリおよびウマインフルエンザウイルス；インフルエンザＢ型（多くのヒトサブタイプ）、およびインフルエンザＣ型（可能な別の属）；パラミクソウイルス属（パラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、ＨＡウイルス、パラインフルエンザウイルス２〜５型、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス）、麻疹ウイルス属（はしかウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、ニューモウイルス属（呼吸器合法胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、およびマウス肺炎ウイルス）を含むパラミクソウイルス科；森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラビウイルス属（蚊媒介黄熱病ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中欧ダニ媒介ウイルス、極東ダニ媒介ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、跳躍病ウイルス、ポワッサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス）、ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス）；ブンヤウイルス属（ブンヤムウェラおよび関連するウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス属（シシリアサシチョウバエウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミアン−コンゴ出血性熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、およびウークウイルス属（ウークニエミおよび関連するウイルス）を含むブンヤウイルス科；インフルエンザウイルス属（インフルエンザウイルスＡ型、多くのヒトサブタイプ）を含むオルソミクソウイルス科；ブタインフルエンザウイルス、トリおよびウマインフルエンザウイルス；インフルエンザＢ型（多くのヒトサブタイプ）、およびインフルエンザＣ型（可能な別の属）；パラミクソウイルス属（パラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、ＨＡウイルス、パラインフルエンザウイルス２〜５型、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス）、麻疹ウイルス属（はしかウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、ニューモウイルス属（呼吸器合法胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、およびマウス肺炎ウイルス）を含むパラミクソウイルス科；ベシクロウイルス属（ＶＳＶ）（チャンディプラウイルス、フランダース−ハートパークウイルス）、リッサウイルス属（狂犬病ウイルス）、フィッシュラブドウイルス、およびフィロウイルス（マーブルグウイルスおよびエボラウイルス）を含むラブドウイルス科；リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、タカリベウイルス複合体、およびラッサウイルスを含むアレナウイルス科；伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス、ヒト腸炎コロナウイルス、およびネコ伝染性腸炎ウイルスを含むコロナウイルス科のメンバーである。
コア粒子として使用することができる例示的なＤＮＡウイルスには下記のものが含まれるが、これらに限定されない。すなわち、オルソポックスウイルス属（大痘瘡、小痘瘡、サル痘ワクシニア、牛痘、バッファロー痘ウイルス、家兎痘、エクトロメリア）、レポリポックスウイルス属（粘液腫、線維腫）、アビポックスウイルス属（鶏痘、その他のトリポックスウイルス）、カプリポップスウイルス属（ヒツジ痘、ヤギ痘）、スイポックスウイルス属（豚痘）、パラポックスウイルス（伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス）を含むポックスウイルス科；イリドウイルス科（アフリカブタ熱ウイルス、カエルウイルス２および３型、魚のリンホシスチウイルス）；αヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１および２型、水痘帯状疱疹、ウマ流産ウイルス、ウマヘルペスウイルス２および３型、仮性狂犬病ウイルス、伝染性ウシ角結膜炎ウイルス、伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス）、βヘルペスウイルス（ヒトサイトメガロウイルス、ブタ、サル、およびげっ歯類のサイトメガロウイルス）を含むヘルペスウイルス科；γヘルペスウイルス（エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、マレック病ウイルス、ヘルペスｓａｉｍｉｒｉ、ヘルペスウイルスａｔｅｌｅｔｅｓ、ヘルペスウイルスｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ、モルモットヘルペスウイルス、リュッケ腫瘍ウイルス）；マストアデノウイルス属（ヒトサブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥと、分類されていないもの）、サルアデノウイルス（少なくとも２３の血清型）、伝染性イヌ肝炎、ウシ、ブタ、ヒツジ、カエル、および多くのその他の種のアデノウイルス、アビアデノウイルス属（トリアデノウイルス）を含むアデノウイルス科；非培養性アデノウイルス；パピローマウイルス属（ヒトパピローマウイルス、ウシパピローマウイルス、ショープウサギパピローマウイルス、その他の種の様々な病原性パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス属（ポリオーマウイルス、サル空胞剤（ＳＶ−４０）、ウサギ空胞剤（ＲＫＶ）、Ｋウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、およびリンパ増殖性パピローマウイルスなどのその他の霊長類のポリオーマウイルス）を含むパポウイルス科；アデノ随伴ウイルス属、パルボウイルス属（ネコ汎白血球減少症ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、アリューシャンミンク病ウイルスなど）を含むパルボウイルス科である。最後に、ＤＮＡウイルスには、慢性伝染性神経障害剤（ＣＨＩＮＡウイルス）などのウイルスを含めることができる。
その他の実施形態では、細菌性ピリン、細菌性ピリンの小部分、あるいは細菌性ピリンまたはその小部分を含有する融合タンパク質を使用して、本発明の組成物およびワクチン組成物をそれぞれ調製することができる。ピリンタンパク質の例には、大腸菌、インフルエンザ菌、ナイセリアメニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌、カウロバクタークレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、シュードモナス−スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、および緑膿菌によって生成されたピリンが含まれる。本発明と共に使用するのに適したピリンタンパク質のアミノ酸配列には、ＧｅｎＢａｎｋレポートＡＪ０００６３６（配列番号１）、ＡＪ１３２３６４（配列番号２）、ＡＦ２２９６４６（配列番号３）、ＡＦ０５１８１４（配列番号４）、ＡＦ０５１８１５（配列番号５）、およびＸ００９８１（配列番号６）に記載されたものが含まれ、その開示の全体を参照により本明細書に援用する。
細菌性ピリンタンパク質は、一般に、タンパク質を細菌性ペリプラズムへと移出する前に、Ｎ末端リーダー配列が除去されるようにプロセッシングされる。さらに当業者に理解されるように、本発明の組成物およびワクチン組成物をそれぞれ調製するのに使用される細菌性ピリンタンパク質は、一般に、天然に存在するリーダー配列を持たない。
本発明での使用に適するピリンタンパク質の１つの特定の例は、Ｅ．ｃｏｌｉのＰピリンである（ＧｅｎＢａｎｋレポートＡＦ２３７４８２（配列番号７））。本発明と共に使用するのに適した１型Ｅ．ｃｏｌｉピリンの例は、ＧｅｎＢａｎｋレポートＰ０４１２８に記載されたアミノ酸配列（配列番号８）を有するピリンであり、これは、ＧｅｎＢａｎｋレポートＭ２７６０３に記載されたヌクレオチド配列（配列番号９）を有する核酸でコードされたものである。これらＧｅｎＢａｎｋレポートの開示全体を、参照により本明細書に援用する。同様に、一般に上記タンパク質の成熟形態を使用して、本発明の組成物およびワクチン組成物をそれぞれ調製することができる。
本発明を実施する際、使用に適する細菌性ピリンまたはピリン小部分は、一般に規則的で反復性の抗原アレイが形成されるよう会合することができる。
ピリンおよび線毛様構造を生体外で調製する方法は、当技術分野で知られている。例えばＢｕｌｌｉｔｔ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１２８９０〜１２８９５（１９９６）は、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｐ線毛サブユニットのｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成体について述べている。さらにＥｓｈｄａｔ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４８：３０８〜３１４（１９８１）は、Ｅ．ｃｏｌｉの１型線毛の解離および線毛の再構成体に適した方法について述べている。簡単に言えば、これらの方法は以下の通りである。すなわち線毛を、飽和塩酸グアニジン中、３７℃でインキュベートすることによって解離させる。次いでピリンタンパク質をクロマトグラフィーで精製し、その後、５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．０）に対して透析することにより、ピリンダイマーを形成する。Ｅｓｈｄａｔ他は、５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．０）に対して透析することにより、ピリンダイマーが再会合して線毛を形成することも見出した。
さらに、例えば従来の遺伝子工学およびタンパク質変性方法を使用して、抗原または抗原決定基が第２の結着部位を介して結合される第１の結着部位が含まれるように、ピリンタンパク質を変性させることができる。あるいは抗原または抗原決定基は、第２の結着部位を介して、これらのタンパク質中に自然に存在するアミノ酸残基に直接結合することができる。次いでこれらの変性ピリンタンパク質を、本発明のワクチン組成物に使用することができる。
本発明の組成物およびワクシン組成物をそれぞれ調製するのに使用される細菌性ピリンタンパク質は、ＨＢｃＡｇに関して本明細書で述べた場合と同様の手法で変性させることができる。例えばシステインおよびリジン残基は、欠失させることができ、または他のアミノ酸残基で置換することができ、第１の結着部位をこれらのタンパク質に付加することができる。さらにピリンタンパク質を、変性した形で発現させることができ、または発現後に化学的に変性させることができる。同様に、無傷の線毛を細菌から収集し、次いで化学的に変性させることができる。
別の実施形態では、線毛または線毛様構造を細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）から収集し、これを使用して本発明の組成物およびワクチン組成物を形成する。組成物およびワクチン組成物の調製に適した線毛の一例は、配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するピリンモノマーから形成された、Ｅ．ｃｏｌｉの１型線毛である。
細菌線毛を収集する方法のいくつかは、当技術分野で知られている。例えばＢｕｌｌｉｔｔおよびＭａｋｏｗｓｋｉ（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７４：６２３〜６３２（１９９８））は、Ｅ．ｃｏｌｉからＰ線毛を収集するための線毛精製方法について述べている。この方法によれば、線毛は、Ｐ線毛プラスミドを含有する過度に線毛化したＥ．ｃｏｌｉから剪断され、溶解およびＭｇＣｌ２（１．０Ｍ）沈殿のサイクルによって精製される。
収集した後、線毛または線毛様構造を様々な方法で変性させることができる。例えば第１の結着部位は、第２の結着部位を介して抗原または抗原決定基を結着させることができる線毛に付加することができる。言い換えれば、細菌線毛または線毛様構造を収集して変性させることにより、規則的で反復性の抗原アレイを得ることができる。
抗原または抗原決定基は、線毛または線毛様構造内に存在する、天然に生ずるシステイン残基またはリジン残基に結合することができる。そのような場合、天然に生ずるアミノ酸残基が高度に配列され繰り返されることにより、抗原または抗原決定基と線毛または線毛様構造とが連結するようになる。例えば線毛または線毛様構造は、異種２官能性架橋剤を使用して、抗原または抗原決定基の第２の結着部位に結合することができる。
生物体によって自然に合成される構造（例えば線毛）を使用して本発明の組成物およびワクチン組成物を調製する場合、所望の特徴を有する構造が生成されるように、これらの生物体を遺伝子工学を使用して合成することがしばしば有利になる。例えばＥ．ｃｏｌｉの１型線毛を使用する場合、この線毛が収集されるＥ．ｃｏｌｉは、特定の特徴を備えた構造が生成されるように、変性させることができる。ピリンタンパク質の可能な変性例には、１つまたは複数のリジン残基の挿入、１つまたは複数の天然に存在するリジン残基の欠失または置換、１つまたは複数の天然に存在するシステイン残基の欠失または置換が含まれる（例えば、配列番号８の位置４４および８４のシステイン残基）。
さらに、追加の変性をピリン遺伝子に行うことができ、その結果、リジン残基以外の第１の結着部位を含有する発現生成物が得られる（例えばＦＯＳまたはＪＵＮドメイン）。当然ながら一般に、適切な第１の結着部位は、本発明のワクチン組成物での使用に適する線毛または線毛様構造をピリンタンパク質が形成するのを妨げないものに限定される。
細菌細胞内に自然に存在するピリン遺伝子は、生体内で変性させることができ（例えば同種組換えによって）、または特定の特徴を備えたピリン遺伝子を、これらの細胞に挿入することができる。例えばピリン遺伝子は、複製可能なクローニングベクターまたは細菌染色体に挿入されるベクターの成分として、細菌細胞に導入することができる。挿入されたピリン遺伝子は、発現調節制御配列（例えばｌａｃオペレーター）に結合してもよい。
ほとんどの場合、本発明の組成物およびワクチン組成物でそれぞれ使用される線毛または線毛様構造は、単一タイプのピリンサブユニットからなる。同一サブユニットからなる線毛または線毛様構造は、高度に配列されかつ繰り返された抗原アレイを提示する構造を形成することが予想されるので、一般的に使用される。
しかし本発明の組成物は、異質なピリンサブユニットから形成された線毛または線毛様構造を含んだ組成物およびワクチンも含む。これらの線毛または線毛様構造を形成するピリンサブユニットは、細菌細胞内に自然に存在する遺伝子から発現させることができ、または細菌細胞に導入することができる。天然に存在するピリン遺伝子と導入した遺伝子は共に、線毛または線毛様構造を形成する細胞内で発現し、その結果、一般にこれらのピリンタンパク質の混合物から形成された構造になる。さらに、２個以上のピリン遺伝子が細菌細胞内で発現した場合、各ピリン遺伝子の相対的な発現は典型的な場合、線毛または線毛様構造における異なるピリンサブユニットの比を決定するファクターになる。
混合型ピリンサブユニットの特定の組成物を有する線毛または線毛様構造が望まれる場合、ピリン遺伝子の少なくとも１つの発現は、異種誘発性プロモーターによって調節することができる。他の遺伝要素と同様にそのようなプロモーターを使用して、細菌細胞内で産生される異なるピリンサブユニットの相対的な量を調節することができ、したがって線毛または線毛様構造の組成を調節することができる。
さらに、抗原または抗原決定基は、ペプチド結合ではない結合によって細菌線毛または線毛様構造に結合することができ、本発明の組成物に使用される線毛または線毛様構造を産生する細菌細胞を遺伝子工学により合成して、抗原または抗原決定基と融合するピリンタンパク質を生成することができる。線毛または線毛様構造を形成するそのような融合タンパク質は、本発明のワクチン組成物で使用するのに適している。
本願におけるウイルス様粒子は、ウイルス粒子に似ているが病原体ではない構造を指す。一般にウイルス様粒子はウイルスゲノムに欠けており、したがって非感染性である。またウイルス様粒子は、異種発現によって大量に生成することもでき、容易に精製することもできる。
好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は組換えウイルス様粒子である。当業者なら、組換えＤＮＡ技術と一般に公開されているウイルスコード配列とを使用して、ＶＬＰを生成することができる。例えばウイルス外被またはコアタンパク質のコード配列は、ウイルスプロモーターの調節制御の下、市販のバキュロウイルスベクターを使用するバキュロウイルス発現ベクターにおける発現を目的として設計製作することができるが、この場合、配列の適切な変更によってコード配列と調節配列との機能的連鎖が可能になる。ウイルス外被またはコアタンパク質のコード配列は、例えば細菌発現ベクターでの発現を目的として設計製作することもできる。
ＶＬＰの例には、Ｂ型肝炎ウイルスのカプシドタンパク質（Ｕｌｒｉｃｈ他、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．５０：１４１〜１８２（１９９８））、はしかウイルス（Ｗａｒｎｅｓ他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１６０：１７３〜１７８（１９９５））、シンドビスウイルス、ロタウイルス（米国特許第５，０７１，６５１号および米国特許第５，３７４，４２６号）、口蹄疫ウイルス（Ｔｗｏｍｅｙ他、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）１３：１６０３〜１６１０（１９９５））、ノーウォークウイルス（Ｊｉａｎｇ，Ｘ．他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５０：１５８０〜１５８３（１９９０）；Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．Ｍ．他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１４５６〜１４６１（１９９１））、レトロウイルスＧＡＧタンパク質（ＷＯ９６／３０５２３）、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１、Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質（ＷＯ９２／１１２９１）、ヒトパピローマウイルス（ＷＯ９８／１５６３１）、ＲＮＡファージ、Ｔｙ、ｆｒファージ、ＧＡファージ、およびＱβファージが含まれるが、これらに限定されない。
当業者に容易に明らかにされるように、本発明のＶＬＰは、いかなる特定の形態にも限定するものではない。粒子は、化学的に合成することができ、あるいは自然のまたは非自然の生物学的プロセスを経て合成することができる。例として、このタイプの実施形態は、ウイルス様粒子またはその組換え形態を含む。
より特定の実施形態では、ＶＬＰは、ロタウイルスの組換えポリペプチド、ノーウォークウイルスの組換えポリペプチド、アルファウイルスの組換えポリペプチド、口蹄疫ウイルスの組換えポリペプチド、はしかウイルスの組換えポリペプチド、シンドビスウイルスの組換えポリペプチド、ポリオーマウイルスの組換えポリペプチド、レトロウイルスの組換えポリペプチド、Ｂ型肝炎ウイルスの組換えポリペプチド（例えばＨＢｃＡｇ）、タバコモザイクウイルスの組換えポリペプチド、フロックハウスウイルスの組換えポリペプチド、ヒトパピローマウイルスの組換えポリペプチド、バクテリオファージの組換えポリペプチド、ＲＮＡファージの組換えポリペプチド、Ｔｙの組換えポリペプチド、ｆｒファージの組換えポリペプチド、ＧＡファージの組換えポリペプチド、およびＱβファージの組換えポリペプチドから選択された、組換えポリペプチドまたはその断片を含むことができ、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。ウイルス様粒子はさらに、そのようなポリペプチドの１つまたは複数の断片、ならびにそのようなポリペプチドの変種を含むことができ、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。ポリペプチドの変種は、例えばこれに対応する野生型との同一性が、アミノ酸レベルで少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％である。
好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。ＲＮＡファージは、ａ）バクテリオファージＱβ、ｂ）バクテリオファージＲ１７、ｃ）バクテリオファージｆｒ、ｄ）バクテリオファージＧＡ、ｅ）バクテリオファージＳＰ、ｆ）バクテリオファージＭＳ２、ｇ）バクテリオファージＭ１１、ｈ）バクテリオファージＭＸ１、ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、ｋ）バクテリオファージｆ２、およびｌ）バクテリオファージＰＰ７からなる群から選択されることが好ましい。
本発明の別の好ましい実施形態では、ウイルス様粒子が、ＲＮＡバクテリオファージＱβまたはＲＮＡバクテリオファージｆｒの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
本発明の別の好ましい実施形態で、組換えタンパク質は、ＲＮＡファージのコートタンパク質を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
したがって、ＶＬＰのカプシドを形成するＲＮＡファージコートタンパク質、あるいはカプシドまたはＶＬＰへの自己組織体に適合したバクテリオファージコートタンパク質の断片は、本発明のさらに好ましい実施形態である。例えばバクテリオファージＱβコートタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で組換えによって発現することができる。さらにそのような発現の後、これらのタンパク質は自然発生的にカプシドを形成する。さらにこれらのカプシドは、固有の繰返し編成を持つ構造を形成する。
本発明の組成物を調製するのに使用可能なバクテリオファージコートタンパク質の特定の好ましい例には、バクテリオファージＱβ（配列番号１０；ＰＩＲデータベース、受入番号ＶＣＢＰＱβ、Ｑβ ＣＰを指す。配列番号１１；受入番号ＡＡＡ１６６６３、Ｑβ Ａ１タンパク質を指す。）、バクテリオファージＲ１７（配列番号１２；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＲ７）、バクテリオファージｆｒ（配列番号１３；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＦＲ）、バクテリオファージＧＡ（配列番号１４；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ−０４０７５４）、バクテリオファージＳＰ（配列番号１５；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ３０３７４、ＳＰ ＣＰを指す。配列番号１６；受入番号、ＳＰ Ａｌタンパク質を指す。）、バクテリオファージＭＳ２（配列番号１７；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＭ２）、バクテリオファージＭ１１（配列番号１８；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ０６２５０）、バクテリオファージＭＸ１（配列番号１９；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ１４６９９）、バクテリオファージＮＬ９５（配列番号２０；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ１４７０４）、バクテリオファージｆ２（配列番号２１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ０３６１１）、バクテリオファージＰＰ７（配列番号２２）などの、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質が含まれる。さらに、バクテリオファージＱβのＡ１タンパク質、あるいはそのＣ末端から１００、１５０、または１８０のアミノ酸を失ったＣ末端切断型を、Ｑβコートタンパク質のカプシド組織体に組み込むことができる。一般に、カプシド組織体におけるＱβ ＣＰに対するＱβ Ａ１タンパク質のパーセンテージは、カプシドの形成を確実にするために、限定されている。
Ｑβコートタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現した場合、カプシドに自己組織化することも見出されている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ ＴＭ．他、遺伝子（ＧＥＮＥ）１３７：１３３〜１３７（１９９３））。得られたカプシドまたはウイルス様粒子は、直径２５ｎｍ、Ｔ＝３の、準対称的な正二十面体のファージ様カプシド構造を示した。さらに、ファージＱβの結晶構造も解析された。カプシドは、コートタンパク質の１８０のコピーを含有するが、これらのコピーは、ジスルフィド架橋によって共有５量体または６量体に結合しており（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）４：５４３〜５５５４（１９９６））、Ｑβコートタンパク質のカプシドは極めて安定した状態になる。しかし、組換えＱβコートタンパク質から作製されたＶＬＰのカプシドは、ジスルフィド結合を介してカプシド内の他のサブユニットに結合していないかまたは不完全に結合しているサブユニットを含有する可能性がある。したがって組換えＱβカプシドを非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに導入することによって、モノマーＱβコートタンパク質に対応するバンドならびにＱβコートタンパク質の６量体または５量体に対応するバンドが目に見えるようになる。不完全なジスルフィド結合サブユニットは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、２量体、３量体、または４量体のバンドとしても現れる。Ｑβカプシドタンパク質は、有機溶媒および編成剤に対しても異常な耐性を示す。意外なことに本発明者等は、ＤＭＳＯおよびアセトニトリルの濃度が３０％程度でありグアニジン濃度が１Ｍ程度であると、カプシドの安定性に影響が生じないことを観察した。Ｑβコートタンパク質のカプシドの安定性が高いことは、本発明による哺乳類およびヒトの免疫化およびワクチン接種で使用する場合に、特に有利な特徴である。
Ｅ．ｃｏｌｉでの発現後、Ｑβコートタンパク質のＮ末端メチオニンは、Ｓｔｏｌｌ，Ｅ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：９９０〜９９３（１９７７）に記載されているＮ末端Ｅｄｍａｎ配列決定によって本発明者等が観察したように、通常は除去される。Ｎ末端メチオニンが除去されていないＱβコートタンパク質から構成されたＶＬＰ、あるいはＮ末端メチオニンが切断されまたは存在するＱβコートタンパク質の混合物を含むＶＬＰも、本発明の範囲内にある。
別のＲＮＡファージコートタンパク質も、細菌宿主内で発現した後に自己組織化することが示されている（Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ，ＲＡ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）２３：２４５〜２５４（１９８３）、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ，ＴＭ．他、Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ ＳＳＳＲ ２８７：４５２〜４５５（１９８６）、Ａｄｈｉｎ，ＭＲ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：２３８〜２４２（１９８９）、Ｎｉ，ＣＺ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．５：２４８５〜２４９３（１９９６）、Ｐｒｉａｎｏ，Ｃ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２８３〜２９７（１９９５））。Ｑβファージカプシドは、コートタンパク質の他に、いわゆる読抜けタンパク質Ａ１および成熟タンパク質Ａ２を含有する。Ａ１はＵＧＡ停止コドンで抑制によって生成され、その長さは３２９ａａである。本発明で使用されるファージＱβ組換えコートタンパク質のカプシドは、Ａ２溶解タンパク質に欠けており、宿主からのＲＮＡを含有する。ＲＮＡファージのコートタンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質であり、ウイルスのライフサイクル中に翻訳抑制因子として働くレプリカーゼ遺伝子のリボソーム結合部位のステムループと相互に作用する。この相互作用の配列および構造要素は知られている（Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ，ＧＷ．＆Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，ＯＣ．、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２８：７１〜７６（１９８６）；Ｌｉｍ，Ｆ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１８３９〜３１８４５（１９９６））。ステムループおよびＲＮＡは一般に、ウイルス組織体に関与することが知られている（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）４：５４３〜５５５４（１９９６））。
本発明の別の好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、この組換えタンパク質は、ＲＮＡファージの変異コートタンパク質、好ましくは上述のＲＮＡファージの変異コートタンパク質を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。別の好ましい実施形態では、置換によって少なくとも１つのリジン残基を除去することにより、または置換によって少なくとも１つのリジン残基を付加することにより、ＲＮＡファージの変異コートタンパク質を変性させ、あるいは、少なくとも１つのリジン残基の欠失により、または挿入によって少なくとも１つのリジン残基を付加することにより、ＲＮＡファージの変異コートタンパク質を変性させた。
別の好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、この組換えタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するコートタンパク質、あるいは配列番号１０と配列番号１１のアミノ酸配列を有するコートタンパク質の混合物、あるいは配列番号１１の変異体を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、Ｎ末端メチオニンは切断されていることが好ましい。
本発明のさらに好ましい実施形態で、ウイルス様粒子はＱβの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、この組換えタンパク質は、変異Ｑβコートタンパク質を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。別の好ましい実施形態では、置換による少なくとも１つのリジン残基の除去によって、または置換による少なくとも１つのリジン残基の付加によって、これらの変異コートタンパク質を変性させた。あるいは、少なくとも１つのリジン残基の欠失によって、または挿入による少なくとも１つのリジン残基の付加によって、これらの変異コートタンパク質を変性させた。
Ｑβタンパク質のカプシド表面には４個のリジン残基が露出する。露出したリジン残基に代わってアルギニンが配置されたＱβ変異体も、本発明で使用することができる。したがって本発明を実施する際には、下記のＱβコートタンパク質変異体および変異Ｑβ ＶＬＰを使用することができる：「Ｑβ−２４０」（Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２３）、「Ｑβ−２４３」（Ａｓｎ １０−Ｌｙｓ；配列番号２４）、「Ｑβ−２５０」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２５）、「Ｑβ−２５１」（配列番号２６）および「Ｑβ−２５９」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号２７）。したがって本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ａ）配列番号２３のアミノ酸配列、ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列、ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列、ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列、およびｅ）配列番号２７のアミノ酸配列の群から選択されたアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、変異Ｑβコートタンパク質の組換えタンパク質を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。上述のＱβコートタンパク質、変異Ｑβコートタンパク質ＶＬＰおよびカプシドの構成体、発現、および精製のそれぞれは、２００２年１月１８日に本願の譲受人によって出願された係属中の米国出願第１０／０５０，９０２号に開示されている。特に本明細書では、上述の出願の実施例１８を参照する。
本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、Ｑβの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、この組換えタンパク質は、前述のＱβ変異体のいずれか１つと対応するＡ１タンパク質との混合物を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
本発明のさらに好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
ＡＰ２０５ゲノムは、成熟タンパク質、コートタンパク質、レプリカーゼ、および関連するファージに存在しない２つのオープンリーディングフレームからなり；溶解遺伝子およびオープンリーディングフレームは、成熟遺伝子の翻訳で役割を果たす（Ｋｌｏｖｉｎｓ，Ｊ．、他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３：１５２３〜３３（２００２））。ＡＰ２０５コートタンパク質は、プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号１１１）から発現することができるが、これはｐＱｂ１０の誘導体であり（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３７：１３３〜３７（１９９３））、ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含むものである。あるいはＡＰ２０５コートタンパク質は、ベクターに存在するリボソーム結合部位の下流でｐＱｂ１８５にクローニングすることができる。いずれの手法も、その全体を参照により援用する２００２年７月１６日に本願譲受人によって出願された「分子抗原アレイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｒｒａｙｓ）」という名称の同時係属の米国仮特許出願に記載されているように、タンパク質を発現させ、カプシドを形成する。ベクターｐＱｂ１０およびｐＱｂ１８５は、ｐＧＥＭベクターから得られたベクターであり、これらのベクターでクローニングされた遺伝子の発現は、ｔｒｐプロモーターによって制御される（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３７：１３３〜３７（１９９７））。プラスミドｐＡＰ２８３〜５８（配列番号１１１）は、ＸｂａＩ部位の下流でありかつＡＰ２０５コートタンパク質のＡＴＧ開示コドンのすぐ上流に、以下の配列の推定ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含む：ｔｃｔａｇａＡＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＡＣａｔｇ。ベクターｐＱｂ１８５は、ＸｂａＩ部位の下流でありかつ開始コドンの上流に、シャイン−ダルガーノ配列を含む（ｔｃｔａｇａＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣａｔｇ、下線はシャイン−ダルガーノ配列）。
本発明のさらに好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
したがって本発明のこの好ましい実施形態は、カプシドを形成するＡＰ２０５コートタンパク質を含む。そのようなタンパク質は、組換えによって発現させ、または自然源から調製する。細菌内で生成されたＡＰ２０５コートタンパク質は、電子顕微鏡（ＥＭ）および免疫拡散法によって明らかにされるように、自発的にカプシドを形成する。ＡＰ２０５コートタンパク質（配列番号１１２）によって形成されたカプシドおよびＡＰ２０５ ＲＮＡファージのコートタンパク質によって形成されたカプシドの構造的特性は、ＥＭで見た場合にほとんど見分けがつかない。ＡＰ２０５ ＶＬＰは免疫原性が高く、抗原及び／又は抗原決定基に結合して、繰り返し向きが定められた抗原及び／又は抗原決定基を示すワクチン構成体を生成することができる。そのように示された抗原に対して高い力価が引き出され、結合した抗原及び／又は抗原決定基は抗体分子と相互に作用し易く、免疫原性であることが示される。
本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換え変異コートタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
本発明を実施する際、アミノ酸５でプロリンがトレオニンに置換されたＡＰ２０５コートタンパク質（配列番号１１３）を含む、組織体−ＡＰ２０５ ＶＬＰのコンピテント変異形態を使用してもよく、さらに好ましい本発明の実施形態になる。これらのＶＬＰ、自然源から得られたＡＰ２０５ ＶＬＰ、またはＡＰ２０５ウイルス粒子を抗原に結合して、本発明による抗原の規則的で反復性のアレイを生成することができる。
ＡＰ２０５ Ｐ５−Ｔ変異コートタンパク質は、プラスミドｐＡＰ２８１−３２（配列番号１１４）から発現することができるが、これはｐＱｂ１８５から直接誘導されたものであり、またＱβコートタンパク質遺伝子の代わりに変異ＡＰ２０５被覆タンパク質遺伝子を含有するものである。ＡＰ２０５コートタンパク質の発現用ベクターは、ＡＰ２０５コートタンパク質の発現を目的としてＥ．ｃｏｌｉに形質移入される。
ＶＬＰへの自己組織体に繋がるコートタンパク質および変異コートタンパク質をそれぞれ発現させるための方法は、「分子抗原アレイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｒｒａｙｓ）」という名称の、２００２年７月１７日に本願譲受人により出願された、同時係属の米国仮特許出願に記載されており、その全体を参照により援用する。適切なＥ．ｃｏｌｉ株には、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ８０２、ＪＭ１０９、ＲＲ１が含まれるが、これらに限定されない。適切なベクターおよび株およびそれらの組合せは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、コートタンパク質および変異コートタンパク質の発現をそれぞれ試験することにより確認でき、また、カプシドの形成および組織体は、任意選択でまずゲルろ過によりカプシドを精製し、その後、免疫拡散アッセイ（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ試験）または電子顕微鏡でそれらを試験することによって、確認できる（Ｋｏｚｌａｖｓｋａ、Ｔ．Ｍ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３７：１３３〜３７（１９９３））。
ベクターｐＡＰ２８３−５８およびｐＡＰ２８１−３２から発現したＡＰ２０５コートタンパク質は、Ｅ．Ｃｏｌｉの細胞質内でのプロセッシングが原因で、初期メチオンニンアミノ酸に欠けている可能性がある。ＡＰ２０５ ＶＬＰの切断形態、非切断形態、またはその混合物は、本発明のさらに好ましい実施形態である。
本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質またはその断片と、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換え変異コートタンパク質またはその断片との混合物を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質または組換え変異コートタンパク質の断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
ＶＬＰおよびカプシドにそれぞれ組織化可能な組換えＡＰ２０５コートタンパク質断片も、本発明の実施に有用である。これらの断片は、コートタンパク質および変異コートタンパク質それぞれの内部またはその末端における欠失によって生成することができる。コートタンパク質および変異コートタンパク質の配列への挿入、あるいはコートタンパク質および変異コートタンパク質の配列との抗原配列の融合、およびＶＬＰへの組織体との適合性は、本発明の別の実施形態であり、キメラＡＰ２０５コートタンパク質および粒子がそれぞれ得られる。コートタンパク質配列への挿入、欠失、および融合の結果と、これらがＶＬＰへの組織体に適合するか否かは、電子顕微鏡によって決定することができる。
上述のＡＰ２０５コートタンパク質、コートタンパク質断片、およびキメラコートタンパク質によって形成された粒子は、その全体を参照により援用する「分子抗原アレイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｒｒａｙｓ）」という名称の、２００２年７月１７日に本願譲受人により出願された同時係属の米国仮特許出願に記載されているように、沈殿による分画工程と、例えばセファロースＣＬ−４Ｂ、セファロースＣＬ−２Ｂ、セファロースＣＬ−６Ｂカラム、およびこれらの組合せを使用したゲルろ過による精製工程との組合せにより、純粋な形で単離することができる。ウイルス様粒子を単離するためのその他の方法が当技術分野で知られており、バクテリオファージＡＰ２０５のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を単離するのに使用することができる。例えば、その全体を本明細書に参照により援用する米国特許第４，９１８，１６６号には、酵母レトロトランスポゾンＴｙのＶＬＰを単離するために超遠心分離を使用することが記載されている。
いくつかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定されている（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）４：５４３〜５５４（１９９６））。そのような情報を使用して、表面が露出した残基を同定することができ、したがってＲＮＡファージコートタンパク質は、１つまたは複数の反応性アミノ酸残基を挿入または置換することによって挿入できるように、変性させることができる。その結果、バクテリオファージコートタンパク質が変性した形のものも、本発明で使用することができる。したがって、本発明の組成物を調製するにあたり、カプシドまたはカプシド様構造（例えばバクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、およびバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質）を形成するタンパク質の変種も使用することができる。
上記で論じた変種タンパク質の配列は、これに対応する野生型の配列とは異なるが、これらの変種タンパク質は一般に、カプシドまたはカプシド様構造を形成する能力を維持することになる。したがって本発明はさらに、カプシドまたはカプシド様構造を形成するタンパク質の変種をさらに含んだ組成物およびワクチン組成物をそれぞれ含み、同様に、そのような組成物およびワクチン組成物のそれぞれと、そのような組成物の調製に使用される個々のタンパク質サブユニットと、これらのタンパク質サブユニットをコードする核酸分子を調製する方法も含む。したがって本発明の範囲内には、カプシドまたはカプシド様構造を形成しかつカプシドまたはカプシド様構造を会合し形成する能力を維持する野生型タンパク質の変種形態が含まれる。
その結果、本発明はさらに、規則的なアレイを形成して固有の繰返し構造をそれぞれ有する、野生型タンパク質と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる組成物およびワクチン組成物をそれぞれ含む。
本発明の範囲内には、本発明の組成物を調製するのに使用されるタンパク質をコードする核酸分子がさらに含まれる。
その他の実施形態では、本発明はさらに、配列番号１０〜２７で示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなるタンパク質を含んだ組成物を含む。
本発明での使用に適するタンパク質は、カプシドまたはカプシド様構造あるいはＶＬＰを形成するタンパク質のＣ末端切断型変異体も含む。そのような切断型変異体の特定の例には、配列番号１０〜２７のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれ、この場合、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸はＣ末端から除去されている。典型的な場合、これらのＣ末端切断型変異体は、カプシドまたはカプシド用構造を形成する能力を維持することになる。
本発明での使用に適する別のタンパク質は、カプシドまたはカプシド様構造を形成するタンパク質のＮ末端切断型変異体も含む。そのような切断型変異体の特定の例には、配列番号１０〜２７のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれ、この場合、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸はＮ末端から除去されている。典型的な場合、これらのＮ末端切断型変異体は、カプシドまたはカプシド用構造を形成する能力を維持することになる。
本発明での使用に適する追加のタンパク質は、カプシドまたはカプシド様構造を形成するＮ末端およびＣ末端切断型変異体を含む。適切な切断型変異体は、配列番号１０〜２７のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、この場合、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸がＮ末端から除去されており、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸がＣ末端から除去されている。典型的な場合、これらのＮ末端およびＣ末端切断型変異体は、カプシドまたはカプシド用構造を形成する能力を維持することになる。
本発明はさらに、上述の切断型変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％が同一なアミノ酸配列を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなるタンパク質を含んだ組成物を含む。
したがって本発明は、カプシドまたはＶＬＰを形成するタンパク質から調製された組成物およびワクチン組成物と、個々のタンパク質サブユニットおよびＶＬＰまたはカプシドからこれらの組成物を調製する方法と、これらのタンパク質サブユニットおよびこれらのサブユニットをコードする核酸分子を調製する方法と、本発明のこれらの組成物を使用して、個体にワクチン接種しかつ／または個体に免疫応答を誘発させる方法を含む。
前述のように、本発明は、ウイルス様粒子またはその組換え形態を含む。１つのさらに好ましい実施形態では、本発明の組成物に使用される粒子は、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）またはＨＢｃＡｇの断片からなる。別の実施形態では、本発明の組成物に使用される粒子は、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）またはＨＢｃＡｇタンパク質の断片からなるが、これはいくつかの遊離システイン残基を排除しまたはその数が減少するように変性させたものである。Ｚｈｏｕ他（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５３９３〜５３９８（１９９２））は、天然に存在するシステイン残基が除去されるよう変性させたＨＢｃＡｇがカプシドを会合し形成する能力を維持することを実証した。したがって本発明の組成物での使用に適するＶＬＰは、天然に存在するシステイン残基の１つまたは複数が欠失しまたは別のアミノ酸残基（例えばセリン残基）で置換された変性ＨＢｃＡｇまたはその断片を含んだものを含む。
ＨＢｃＡｇは、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質をプロセッシングされることによって生成されたタンパク質である。ＨＢｃＡｇのいくつかのアイソタイプが同定され、それらのアミノ酸配列は、当業者が容易に入手可能である。ほとんどの場合、本発明の組成物およびワクチン組成物のそれぞれは、ＨＢｃＡｇをプロセッシングされた形のもの（すなわちＢ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列を除去したＨＢｃＡｇ）を使用して調製される。
さらに、プロセッシングが行われない条件下でＨＢｃＡｇを生成する場合、一般にＨＢｃＡｇは、「プロセッシングされた」形で発現させる。例えば、細胞質に向けてタンパク質を発現させるＥ．ｃｏｌｉ発現系を使用して、本発明のＨＢｃＡｇを生成する場合、一般にこれらのタンパク質は、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列が存在しないように発現することになる。
本発明で使用することができるＢ型肝炎ウイルス様粒子の調製は、例えばＷＯ００／３２２２７、本明細書では特に実施例１７〜１９および２１〜２４と、ＷＯ ０１／８５２０８、本明細書では特に実施例１７〜１９、２１〜２４、３１、および４１と、２００２年１月１８日に本願譲受人によって出願された係属中の米国出願第１０／０５０，９０２に開示されている。後者の出願では、特に実施例２３、２４、３１、および５１に記載されている。３つの文書のすべてを参照により本明細書に明らかに援用する。
また本発明は、１つまたは複数の追加のシステイン残基を欠失させまたは置換するように変性したＨＢｃＡｇ変種も含む。遊離システイン残基がいくつかの化学副反応に関与し得ることが、当技術分野で知られている。これらの副反応には、ジスルフィド交換、あるいは例えば他の物質と共に併用療法で注入されまたは形成された化学物質または代謝産物との反応、あるいはＵＶ光に曝露することによるヌクレオチドとの直接酸化および反応が含まれる。毒性付加物は、ＨＢｃＡｇが核酸に結合する傾向が強い点を特に考慮して、このように生成される。したがって毒性付加物は、それぞれが個々に低濃度で存在するが一緒になると毒性レベルに達する複数の種の間に分布する。
上記事項に鑑み、天然に存在するシステイン残基が除去されるよう変性させたワクチン組成物にＨＢｃＡｇを使用することの１つの利点とは、抗原または抗原決定基が結着したときに毒性種が結合可能な部位が、数のうえでは減少しまたはすべてなくなることである。
本発明の実施に際して使用に適した天然に生ずるＨＢｃＡｇ変種の数が確認されている。例えばＹｕａｎ他（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１０１２２〜１０１２８（１９９９））は、配列番号２８の位置９７に対応した位置のイソロイシン残基をロイシン残基またはフェニルアラニン残基で置換した変種について述べている。いくつかのＨＢｃＡｇ変種のアミノ酸配列が、いくつかのＢ型肝炎コア抗原前駆体変種と同様にＧｅｎＢａｎｈレポートＡＡＦ１２１２４０（配列番号２９）、ＡＦ１２１２３９（配列番号３０）、Ｘ８５２９７（配列番号３１）、Ｘ０２４９６（配列番号３２）、Ｘ８５３０５（配列番号３３）、Ｘ８５３０３（配列番号３４）、ＡＦ１５１７３５（配列番号３５）、Ｘ８５２５９（配列番号３６）、Ｘ８５２８６（配列番号３７）、Ｘ８５２６０（配列番号３８）、Ｘ８５３１７（配列番号３９）、Ｘ８５２９８（配列番号４０）、ＡＦ０４３５９３（配列番号４１）、Ｍ２０７０６（配列番号４２）、Ｘ８５２９５（配列番号４３）、Ｘ８０９２５（配列番号４４）、Ｘ８５２８４（配列番号４５）、Ｘ８５２７５（配列番号４６）、Ｘ７２７０２（配列番号４７）、Ｘ８５２９１（配列番号４８）、Ｘ６５２５８（配列番号４９）、Ｘ８５３０２（配列番号５０）、Ｍ３２１３８（配列番号５１）、Ｘ８５２９３（配列番号５２）、Ｘ８５３１５（配列番号５３）、Ｕ９５５５１（配列番号５４）、Ｘ８５２５６（配列番号５５）、Ｘ８５３１６（配列番号５６）、Ｘ８５２９６（配列番号５７）、ＡＢ０３３５５９（配列番号５８）、Ｘ５９７９５（配列番号５９）、Ｘ８５２９９（配列番号６０）、Ｘ８５３０７（配列番号６１）、Ｘ６５２５７（配列番号６２）、Ｘ８５３１１（配列番号６３）、Ｘ８５３０１（配列番号６４）、Ｘ８５３１４（配列番号６５）、Ｘ８５２８７（配列番号６６）、Ｘ８５２７２（配列番号６７）、Ｘ８５３１９（配列番号６８）、ＡＢ０１０２８９（配列番号６９）、Ｘ８５２８５（配列番号７０）、ＡＢ０１０２８９（配列番号７１）、ＡＦ１２１２４２（配列番号７２）、Ｍ９０５２０（配列番号７３）、Ｐ０３１５３（配列番号７４）、ＡＦ１１０９９９（配列番号７５）、およびＭ９５５８９（配列番号７６）に開示されており、そのそれぞれの開示を参照により本明細書に援用する。これらのＨＢｃＡｇ変種は、配列番号７７における位置１２、１３、２１、２２、２４、２９、３２、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４５、４９、５１、５７、５８、５９、６４、６６、６７、６９、７４、７７、８０、８１、８７、９２、９３、９７、９８、１００、１０３、１０５、１０６、１０９、１１３、１１６、１２１、１２６、１３０、１３３、１３５、１４１、１４７、１４９、１５７、１７６、１７８、１８２、および１８３に位置付けられたアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含めたいくつかの位置で、アミノ酸配列が異なっている。本発明の組成物での使用に適する他のＨＢｃＡｇ変種、および本明細書の開示に従ってさらに変性し得るものが、ＷＯ ００／１９８３３３、ＷＯ ００／１７７１５８、およびＷＯ ００／２１４４７８に記載されている。
上述のように、一般にプロセッシングされたＨＢｃＡｇ（すなわちリーダー配列にかけたもの）が、本発明の組成物およびワクチン組成物でそれぞれ使用される。本発明は、ワクチン組成物、ならびに上述の変種ＨＢｃＡｇを用いるこれらの組成物の使用方法を含む。
ポリペプチドのアミノ酸配列が、上記野生型アミノ酸配列の１つに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムなどの既知のコンピュータプログラムを従来通り使用して決定することができる。例えば特定の配列が参照アミノ酸配列と９５％同一であるか否かを決定するのに、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意のその他の配列アライメントプログラムを使用する場合、パラメータは、同一性のパーセンテージが完全長の参照アミノ酸配列全体にわたって計算されるように、かつ参照配列のアミノ酸残基の総数の５％までが相同なギャップが可能になるように設定する。
配列番号２９〜７２および７３〜７６に示されるアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇ変種および前駆体は、互いに相対的に類似している。したがって、配列番号７７の特定の位置に対応する位置に位置付けられたＨＢｃＡｇ変種のアミノ酸残基を言う場合は、配列番号７７で示されるアミノ酸配列のその位置に存在するアミノ酸残基を指す。ＨＢｃＡｇ変種同士の相同性は、哺乳類に感染するＢ型肝炎ウイルスのほとんどの部分で十分に高く、そのため当業者は、配列番号７７に示されるアミノ酸配列と特定のＨＢｃＡｇ変種のアミノ酸配列の両方について検討しかつ「対応する」アミノ酸残基を特定することがほとんど困難ではない。さらに、ウッドチャックに感染するウイルスから得られたＨＢｃＡｇのアミノ酸配列を示す、配列番号７３に示されるＨＢｃＡｇアミノ酸配列は、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇと十分に相同であり、配列番号７７のアミノ酸残基１５５と１５６の間の配列番号６４に３アミノ酸残基挿入断片が存在することが容易に明らかにされる。
また本発明は、トリに感染するＢ型肝炎ウイスルのＨＢｃＡｇ変種を含んだワクチン組成物、ならびにこれらのＨＢｃＡｇ変種の断片を含んだワクチン組成物も含む。これらのＨＢｃＡｇ変種では、これらのポリペプチドに自然に存在するシステイン残基の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上を、別のアミノ酸残基で置換しまたは欠失させ、その後、本発明のワクチン組成物に含めることができる。
上記で論じたように、遊離システイン残基をなくすことによって、毒性成分がＨＢｃＡｇに結合できる部位の数を減少させ、また、同じかまたは隣接するＨＢｃＡｇ分子のリジンおよびシステイン残基の架橋が生じ得る位置をなくす。したがって本発明の別の実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質の１つまたは複数のシステイン残基を欠失させ、または別のアミノ酸残基で置換した。
その他の実施形態で、本発明の組成物およびワクチン組成物のそれぞれは、Ｃ末端領域（例えば配列番号７７のアミノ酸残基１４５〜１８５または１５０〜１８５）を除去したＨＢｃＡｇを含有することになる。そのため、本発明を実施する際の使用に適した追加の変性ＨＢｃＡｇは、Ｃ末端切断型変異体を含む。適切な切断型変異体は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５アミノ酸がＣ末端から除去されたＨＢｃＡｇを含む。
本発明を実施する際の使用に適したＨＢｃＡｇは、Ｎ末端切断型変異体も含む。適切な切断型変異体は、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸がＮ末端から除去された変性ＨＢｃＡｇを含む。
本発明を実施する際の使用に適したＨＢｃＡｇは、ＮおよびＣ末端切断型変異体を含む。適切な切断型変異体は、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、および１７アミノ酸がＮ末端から除去され、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５アミノ酸がＣ末端から除去された、ＨＢｃＡｇを含む。
本発明はさらに、上述の切断型変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含んだ組成物およびワクチン組成物をそれぞれ含む。
本発明のある特定の実施形態では、ＨＢｃＡｇポリペプチドにリジン残基を導入して、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドとＨＢｃＡｇのＶＬＰとの結合を媒介するようにする。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、配列番号７７のアミノ酸１〜１４４、または１〜１４９、１〜１８５を含み、あるいはこれらからなるＨＢｃＡｇを使用して調製するが、これは、位置７９および８０に対応するアミノ酸がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを有するペプチドで置換されるように変性させたものである（配列番号７８）。さらに好ましい実施形態では、配列番号７７の位置４８および１０７のシステイン残基をセリンに変異させる。本発明はさらに、配列番号２９〜７４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する対応するポリペプチドを含んだ組成物を含むが、これは上述のアミノ酸の変化があるものである。本発明の範囲内には、カプシドまたはＶＬＰを形成するように会合すること可能でありかつ上述のアミノ酸変化を有する、追加のＨＢｃＡＧ変種がさらに含まれる。したがって本発明はさらに、野生型アミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み、あるいはこれらからなるＨＢｃＡｇポリペプチドと、適切な場合にはＮ末端リーダー配列を除去するようプロセッシングされて上述の変化によって変性されるこれらタンパク質のプロセッシングされた形とを含んだ組成物およびワクチン組成物をそれぞれ含む。
本発明の組成物またはワクチン組成物は、種々のＨＢｃＡｇの混合物を含んでよい。したがってこれらのワクチン組成物は、アミノ酸配列が異なるＨＢｃＡｇからなる。例えば、「野生型」ＨＢｃＡｇと、１つまたは複数のアミノ酸残基が変化した（例えば欠失し、挿入され、または置換された）変性ＨＢｃＡｇとを含む、ワクチン組成物を調製することができる。さらに、本発明の好ましいワクチン組成物は、高度に規則的で反復性の抗原アレイを提示するものであり、その抗原は、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドである。
本発明のさらに好ましい実施形態では、少なくとも１つのＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドが、少なくとも１つの共有結合によって、前記コア粒子およびウイルス様粒子にそれぞれ結合する。少なくとも１つのＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドは、少なくとも１つの共有結合によって、コア粒子およびウイウルス様粒子にそれぞれ結合し、前記共有結合は、コア粒子とＲＡＮＫＬの規則的で反復性のアレイと、ＲＡＮＫＬとＶＬＰのアレイまたは結合体をそれぞれもたらす非ペプチド結合であることが好ましい。このＲＡＮＫとＶＬＰのアレイおよび結合体のそれぞれは、少なくとも１つであり通常は複数のＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドが方向の定められた状態でＶＬＰに結合するので、典型的な場合かつ好ましくは反復性で規則性の構造を有する。１０、２０、４０、８０、１２０を超えるＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドがＶＬＰに結合することが好ましい。反復性で規則性のＲＡＮＫＬ−ＶＬＰアレイおよび結合体それぞれの形成は、下記の事項で明らかにされるように、少なくとも１つのＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドとＶＬＰとの、配向され向きが定められ、かつ画定された結合および結着のそれぞれによって、確実になる。さらに、ＶＬＰの典型的な固有の高度に繰り返され編成された構造は、高度に編成され繰り返されたＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドの表示に寄与し、それによって高度に組織化され反復性のＲＡＮＫＬ−ＶＬＰアレイおよび結合体がそれぞれ得られることが有利である。
したがって、好ましい本発明の結合体およびアレイのそれぞれは、高度に編成された構造、寸法であること、およびアレイ表面の抗原の反復性が、従来技術の結合体とは異なる。さらに本発明の好ましい実施形態によれば、発現宿主内で粒子と抗原の両方を発現させることが可能になり、抗原、すなわちＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドの少なくとも１つの適正な折畳みと、ＶＬＰの適正な折畳みおよび組織体が保証される。
本発明は、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合する方法を開示する。示すように、本発明の一態様では、化学的架橋によって、典型的な場合かつ好ましくは異種２官能性架橋剤を使用することによって、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドをそれぞれコア粒子およびＶＬＰに結合させる。いくつかの異種１官能性架橋剤は、当技術分野で知られている。好ましい実施形態で、異種２官能性架橋剤は、好ましい第１の結着部位、すなわちコア粒子およびＶＬＰまたは少なくとも１つのＶＬＰサブユニットそれぞれのリジン残基の側鎖アミノ基とそれぞれ反応することができる官能基と、好ましい第２の結着部位、すなわちＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチド上に天然に存在し、還元による反応に供され、または設計製作され、任意選択で還元による反応にも供される、システイン残基と反応することができる別の官能基を含有する。この手順の第１の工程は、典型的な場合は誘導体化と呼ばれ、コア粒子またはＶＬＰと架橋剤との反応である。この反応の生成物は、活性化コア粒子または活性化ＶＬＰであり、活性化担体とも呼ばれる。第２の工程では、ゲルろ過や透析などの通常の方法を使用して、未反応の架橋剤を除去する。第３の工程では、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを活性化担体と反応させるが、この工程は典型的な場合、連結工程と呼ばれる。未反応のＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドは、例えば透析によって、第４の工程で任意選択で除去することができる。いくつかの異種２官能性架橋剤が当技術分野で知られている。これらには、好ましい架橋剤ＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡと、例えばＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）から入手可能であって一方の官能基がアミノ基に対して反応性があり他方の官能基がシステイン残基に対して反応性があるその他の架橋剤が含まれる。上述の架橋剤はすべて、チオエーテル結合の形成をもたらす。本発明の実施に適した別のクラスの架橋剤は、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドとコア粒子またはＶＬＰとの間に、連結によってジスルフィド結合を導入することを特徴とする。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えばＳＰＤＰおよびＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）が含まれる。架橋剤によるコア粒子およびＶＬＰそれぞれの誘導体化の程度は、各反応相手の濃度、１つの試薬が他の試薬より過剰であること、ｐＨ、温度、およびイオン強度など、実験条件の変化によって影響を受ける可能性がある。連結の程度、すなわちコア粒子およびＶＬＰそれぞれのサブユニット当たりのＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドの量は、ワクチンの要件に一致するように上述の実験条件を変化させることによって調節できる。ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドの溶解度によって、各サブユニットに連結することができるＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、ＲＡＮＫＬペプチドの量に制限が課される可能性があり、得られるワクチンが不溶性になり得る場合は、サブユニット当たりのＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドの量を減少させることが有利である。
ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合する特に好ましい方法は、コア粒子およびＶＬＰの表面のリジン残基をそれぞれ、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチド上のシステイン残基に結合することである。したがって本発明の好ましい実施形態では、第１の結着部位がリジン残基であり、第２の結着部位がシステイン残基である。いくつかの実施形態では、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれに連結するため、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドに対し、第２の結着部位またはその一部として、システイン残基を含有するアミノ酸リンカーを設計製作することが求められている。あるいはＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチド内に挿入しまたは変異させることによってシステインを導入することができる。あるいは、システイン残基またはチオール基を、化学的連結によって導入することができる。
アミノ酸リンカーの選択は、抗原および自己抗原それぞれの性質、すなわちＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドの性質、ｐＩや電荷分布、グリコシル化などのその生化学的性質に応じてなされる。一般に、フレキシブルなアミノ酸リンカーが好ましい。アミノ酸リンカーの好ましい実施形態は、（ａ）ＣＧＧ、（ｂ）Ｎ末端γ１リンカー、（ｃ）Ｎ末端γ３リンカー、（ｄ）Ｉｇヒンジ領域、（ｅ）Ｎ末端グリシンリンカー、（ｆ）（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｎであってｎ＝０〜１２およびｋ＝０．５であるもの、（ｇ）Ｎ末端グリシン−セリンリンカー、（ｈ）（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｍ（Ｓ）ｌ（ＧＧＧＧＳ）ｎであってｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２であるもの、（ｉ）ＧＧＣ、（ｋ）ＧＧＣ−ＮＨ２、（ｌ）ｃ末端γ１リンカー、（ｍ）Ｃ末端γ３リンカー、（ｎ）Ｃ末端グリシンリンカー、（ｏ）（Ｇ）ｎＣ（Ｇ）ｋであってｎ＝０〜１２およびｋ＝０〜５であるもの、（ｐ）Ｃ末端グリシン−セリンリンカー、（ｑ）（Ｇ）ｍ（Ｓ）ｌ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（Ｇ）ｏＣ（Ｇ）ｋであってｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２、およびｏ＝０〜８であるものからなる群から選択される。
アミノ酸リンカーのさらに好ましい例は、免疫グロブリンのヒンジ領域、グリシンセリンリンカー（ＧＧＧＧＳ）ｎ、およびグリシンリンカー（Ｇ）ｎであって、すべてが第２の結着部位としてシステイン残基をさらに含有し、さらに任意選択でグリシン残基を含有するものである。典型的な場合、前記アミノ酸リンカーの好ましい例は、Ｎ末端γ１：ＣＧＤＫＴＨＴＳＰＰ；Ｃ末端γ１：ＤＫＴＨＴＳＰＰＣＧ；Ｎ末端γ３：ＣＧＧＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰ；Ｃ末端γ３；ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰＧＧＣＧ；Ｎ末端グリシンリンカー：ＧＣＧＧＧＧ；Ｃ末端グリシンリンカー：ＧＧＧＧＣＧ；Ｃ末端グリシン−リジンリンカー：ＧＧＫＫＧＣ；Ｎ末端グリシン−リジンリンカー：ＣＧＫＫＧＧである。
本発明のさらに好ましい実施形態では、特に抗原がＲＡＮＫＬペプチドである場合、ペプチドのＣ末端のＧＧＣＧ、ＧＧＣ、またはＧＧＣ−ＮＨ２（「ＮＨ２」はアミド化の略である）リンカーあるいはそのＮ末端のＣＧＧは、アミノ酸リンカーとして好ましい。一般にグリシン残基は、連結反応におけるバルク状アミノ酸の可能性ある立体障害が回避されるように、バルク状アミノ酸と第２の結着部位として使用されるシステインとの間に挿入される。
ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチド上に存在するシステイン残基は、活性化ＶＬＰ上の異種２官能性架橋剤と反応するように、その還元状態になければならず、すなわち遊離システインまたは遊離スルフィドリル基を有するシステイン残基が利用可能でなければならない。結合部位として機能するシステイン残基が酸化された形のものである場合、例えばそれがジスルフィド架橋を形成する場合は、例えばＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはβメルカプトエタノールとのこのジスルフィド架橋の還元が必要とされる。
上述の好ましい方法による異種２官能性架橋剤を使用することによる、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドとコア粒子およびＶＬＰとの結合のそれぞれは、向きが定められた手法によって、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドとコア粒子およびＶＬＰとの連結をそれぞれ可能にする。ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドとコア粒子およびＶＬＰとをそれぞれ結合するその他の方法には、カルボジイミドＥＤＣ、およびＮＨＳを使用して、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合させる方法が含まれる。ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドは、例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ、またはイミノチオタンとの反応によって最初にチオール化してもよい。次いでＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドは、必要に応じて脱保護を行った後、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれに以下のように連結することができる。過剰なチオール化試薬を分離した後、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを、システイン反応性部分を含む異種２官能性架橋剤で事前に活性化させたコア粒子およびＶＬＰのそれぞれと反応させ、したがって少なくとも１つまたはいくつかの官能基がシステイン残基に対して反応性があることが示されるが、これは上述のように、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドのチオール化タンパク質またはペプチドが反応することが可能なものである。任意選択で、少量の還元剤を反応混合物に含める。別の方法では、グルタルアルデヒドやＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３、（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）などの同種２官能性架橋剤、あるいは、コア粒子およびＶＬＰそれぞれのアミン基またはカルボキシル基に対して反応性を有する官能基を備えたその他の知られている同種２官能性架橋剤を使用して、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結着する。
別の実施形態では、グリコシル化したＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチド上に存在する炭水化物部分を変性させ、その後コア粒子およびＶＬＰのそれぞれと反応させることによって、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれに結合する。一実施形態では、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドのグリコシル化タンパク質またはペプチドを、炭水化物部分の緩慢な酸化反応で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させて、１つまたは複数のアルデヒド官能基を持つ活性化したＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを得る。このように活性化したＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを過剰な過ヨウ素酸ナトリウムから分離し、さらにコア粒子およびＶＬＰのそれぞれと反応させるが、この場合、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国に記載されているように、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれまたは少なくとも１つのＶＬＰサブユニットのリジン残基を、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチド上の事前形成されたアルデヒド官能基と反応させる。活性化したＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドの自己重合は、前述の文献に記載されているように、ｐＨを調節することによって制御することができる。形成されたシッフ塩基は、好ましくはシアノホウ水素化ナトリウムでさらに還元し、その後ゲルろ過または透析によって除去する。あるいは、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれを、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれまたは少なくとも１つのＶＬＰサブユニットのカルボキシル基でＥＤＣと反応させ、さらにアジピン酸ジヒドラジドなどのジヒドラジドと反応させて、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチド上に存在する１つまたは複数のアルデヒド官能基と反応することが可能なヒドラジド部分を得る。このように形成されたヒドラゾンは、シアノホウ水素化ナトリウムでさらに還元することができる。あるいは、１つまたは複数のアルデヒド官能基を持つ活性化したＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドをシステアミンと反応させて、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドにシステイン基を導入する。コア粒子およびＶＬＰのそれぞれに対するＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドに適した追加の架橋方法および架橋剤、ならびに連結反応の実施と化学架橋剤および化学架橋手順の使用に関する指針は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国に見出すことができる。
ＶＬＰをＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドに結合するその他の方法には、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれをビオチニル化し、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドをストレプタビジン融合タンパク質として発現させる方法、あるいは、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドとコア粒子およびＶＬＰのそれぞれとの両方を、例えはＷＯ ００／２３９５５に記載されているようにビオチニル化する方法が含まれる。この場合、自由な結合部位を、次の工程で添加されるコア粒子およびＶＬＰのそれぞれの結合にそのまま利用することができるように、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドとストレプタビジンとの比を調節することによって、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドをまずストレプタビジンまたはアビジンに結合させる。あるいは、すべての成分を「ワンポット（ｏｎｅ ｐｏｔ）」反応で混合することができる。その他のリガンド−レセプター対は、可溶形態にあるレセプターおよびリガンドを利用可能であり、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれと架橋可能であり、あるいは、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドとコア粒子およびＶＬＰのそれぞれとを結合させるための結合剤として使用することができる。あるいは、リガンドまたはレセプターをＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドと融合させ、それによって、このレセプターまたはリガンドにそれぞれ化学結合しまたは融合しているコア粒子およびＶＬＰのそれぞれへの結合を仲介することができる。融合は、挿入または置換によって行ってもよい。
既に述べたように、本発明の好ましい実施形態では、ＶＬＰはＲＮＡファージのＶＬＰであり、より好ましい実施形態では、ＶＬＰはＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰである。
１つまたはいくつかの抗原分子、すなわちＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドは、立体的に可能な場合、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰの露出したリジン残基によって、カプシドまたはＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰの１つのサブユニットに結着することができる。したがってＲＮＡファージのコートタンパク質のＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質ＶＬＰの特定の特徴とは、サブユニット当たりいくつかの抗原に連結できることである。このため、稠密な抗原アレイを生成することが可能になる。
本発明の好ましい実施形態で、少なくともＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドとコア粒子およびウイルス様粒子のそれぞれとの結合および結着は、それぞれ、ウイルス様粒子の少なくとも１つの第１の結着部位と、抗原または抗原決定基の少なくとも１つの第２の結着部位との相互作用および会合による。
Ｑβコートタンパク質のＶＬＰまたはカプシドは、その表面に、定められた数のリジン残基を示し、３個のリジン残基がカプシドの内部に向かってＲＮＡと相互に作用し、他の４個のリジン残基がカプシドの外部に露出しているという、定められたトポロジーを持つ。これらの定められた性質は、リジン残基がＲＮＡを相互に作用する粒子の内部よりも粒子の外部に抗原が結着するのに都合良い。その他のＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰも、その表面に定められた数のリジン残基を有し、これらのリジン残基は定められたトポロジーを持つ。
本発明の別の実施形態で、第１の結着部位はリジン残基であり、かつ／または第２の結着部位はスルフィドリル基またはシステイン残基を含む。本発明の非常に好ましい実施形態では、第１の結着部位がリジン残基であり、第２の結着部位がシステイン残基である。
本発明の非常に好ましい実施形態で、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドは、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチド上に天然に存在しまたは設計製作されたシステイン残基を介して、ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰリジン残基、特にＱβコートタンパク質のＶＬＰに結合する。
ＲＮＡファージから得られたＶＬＰの別の利点は、細菌内でのその発現収量が高いことであり、手ごろなコストで大量の物質の生成が可能になる。
述べたように、本発明の結合体およびアレイはそれぞれ、高度に編成された構造、寸法である点と、アレイ表面の抗原の反復性に関して、従来技術の結合体とは異なる。さらに、ＶＬＰを担体として使用することによって、抗原密度が様々な頑丈な抗原アレイおよび結合体がそれぞれ形成される。特にＲＮＡファージのＶＬＰを使用することによって、本明細書では特にＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰを使用することによって、非常に高いエピトープ密度を実現することが可能になる。エピトープ密度の高いＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ組成物の調製は、本願の教示を使用して行うことができる。
本明細書で定義する第２の結着部位は、抗原または抗原決定基に自然に存在するかまたは自然に存在しないものでよい。抗原または抗原決定上に、適切な天然の第２の結着部位が存在しない場合は、天然のものではない結着部位を抗原に対して設計製作しなければならない。
上述のように、４個のリジン残基がＱβコートタンパク質のＶＬＰ表面に露出している。典型的な場合、これらの残基は、架橋剤分子との反応によって誘導化される。露出したリジン残基のすべてが抗原に連結し得るとは限らない場合、誘導化工程の後に、架橋剤分子がεアミノ基に結着した状態で、架橋剤と反応したリジン残基が残る。これは、ＶＬＰの溶解性および安定性に有害な、１つまたはいくつかの正電荷の消失に繋がる。以下に開示するＱβコートタンパク質変異体と同様に、アルギニン残基は架橋剤と反応しないので、リジン残基のいくつかをアルギニンに代えることによって、本発明者等は正電荷が過剰に消失するのを防止する。さらに、リジン残基をアルギニンに代えることにより、抗原との反応に利用部位が少なくなるので、より明確に定められた抗原アレイを得ることができる。
したがって、本願で開示する以下のＱβコートタンパク質変異体および変異体Ｑβ ＶＬＰでは、露出したリジン残基をアルギニンに代えた：Ｑβ−２４０（Ｌｙｓ１３−Ａｌｇ；配列番号２３）、Ｑβ−２５０（Ｌｙｓ ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２５）、およびＱβ−２５９（Ｌｙｓ ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号２７）。これらの構造体をクローニングし、タンパク質を発現させ、ＶＬＰを精製して、ペプチドおよびタンパク質抗原との連結に使用した。Ｑβ−２５１；（配列番号２６）も構成し、Ｑβ−２５１コートタンパク質のＶＬＰをどのように発現させ、精製し、かつ連結させるかについての指針は、本願全体を通して見出すことができる。
他の実施形態では、本発明者等は、密度がさらに高い抗原アレイを得るのに適した、１つの追加のリジン残基を有するＱβ変異体コートタンパク質を開示する。この変異Ｑβコートタンパク質、Ｑβ−２４３（Ａｓｎ １０−Ｌｙｓ；配列番号２４）をクローニングし、タンパク質を発現させ、カプシドまたはＶＬＰを単離して精製したが、追加のリジン残基の導入が、サブユニットとカプシドまたはＶＬＰとの自己組織体に適合することを示した。したがって、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドアレイと結合体のそれぞれは、Ｑβコートタンパク質変異体のＶＬＰを使用して調製することができる。抗原とＶＬＰ、特にＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰとを結着させる特に好ましい方法は、ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ表面に存在するリジン残基と、抗原、すなわちＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチド上に自然に存在しまたは設計製作されたシステイン残基とを結合することである。システイン残基を第２の結着部位として有効なものにするため、スルフィドリル基を連結に利用しなければならない。したがって、システイン残基を還元状態にしなければならず、すなわち遊離したシステインまたは遊離したスルフィドリル基を持つシステイン残基を利用可能にしなければならない。第２の結着部位として機能するシステイン残基が酸化形態にある場合、例えばそれがジスルフィド架橋を形成する場合には、このジスルフィド架橋を、例えばＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはβメルカプトエタノールで還元することが必要である。還元剤の濃度、および抗原よりも過剰な還元剤のモル数は、各抗原ごとに調節しなければならない。１０μＭ程度またはそれ以下に低い濃度から始まり最高で１０〜２０ｍＭまたは必要に応じてそれ以上の濃度に至る還元剤の滴定範囲を試験し、抗原と担体との連結について評価する。２００２年１月１８日に本願譲受人により出願された係属中の米国出願第１０／０５０，９０２号に記載されるように、還元剤が低濃度であることは連結反応に適合することであるが、濃度がより高くなると、当業者に知られるようにこの連結反応が阻害され、その場合は還元剤を透析またはゲルろ過によって除去しなければならない。透析または平衡緩衝液のｐＨは７未満であり、好ましくは６である。ｐＨの低い緩衝液と抗原の活性または安定性との適合性について試験をしなければならない。
ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ上のエピトープ密度は、架橋剤またはその他の反応条件を選択することによって調節できる。例えば架橋剤Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳやＳＭＰＨでは、典型的な場合、高いエピトープ密度に達することが可能である。誘導化は、還元剤の濃度を高くすることによって、良い影響が得られ、反応条件の操作を行うことによって、ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質のＶＬＰに連結する抗原の数を制御することができる。
非天然の第２の結着部位を設計する前に、そこに融合し挿入されまたは一般に設計製作される位置を選択しなければならない。第２の結着部位の位置の選択は、例として、抗原の結晶構造に基づくものでよい。そのような抗原の結晶構造は、分子のＣまたはＮ末端の利用可能性（例えば溶媒に対するその接触可能性から決定される）に関する情報、またはシステイン残基など、第２の結着部位としての使用に適する残基の溶媒への曝露に関する情報を提供することができる。Ｆａｂ断片の場合のように、露出したジスルフィド架橋は、一般に緩慢な還元によって単一システイン残基に変換可能であるので、第２の結着部位の源であってもよい。ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドの免疫原性に影響を及ぼさない緩慢な還元条件が選択される。一般に、自己抗原による免疫化が、この自己抗原とその自然のリガンドとの相互作用を阻害する目的である場合、自然のリガンドとの相互作用の部位に対して抗体が生成されるように、第２の結着部位が付加されることになる。したがって第２の結着部位の位置は、第２の結着部位またはこれを含有する任意のアミノ酸リンカーからの立体障害が回避されるように、選択されることになる。他の実施形態では、自己抗原とその自然のリガンドとが相互に作用する部位とは別の部位を対象とした抗体応答が望まれる。そのような実施形態では、自己抗原とその自然のリガンドとの相互作用の部位に対する抗体の生成が妨げられるように、第２の結着部位を選択することができる。
第２の結着部位の位置を選択する際のその他の基準には、抗原のオリゴマー化状態、オリゴマー化の部位、補因子の存在、抗原の変性が自己抗原の機能または自己抗原を認識する抗体の生成に適合する抗原構造および配列内の部位を開示する実験的証拠の利用可能性が含まれる。
ほとんどの好ましい実施形態で、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドは、コア粒子およびＶＬＰまたはＶＬＰサブユニットとのそれぞれにある第１の結着部位と会合可能な単一の第２の結着部位または単一の反応性結着部位を含む。このため、少なくとも１つであるが典型的な場合は複数であり、好ましくは１０、２０、４０、８０、１２０個を超える抗原とコア粒子およびＶＬＰそれぞれとの画定されかつ均一な結合および会合のそれぞれが確実になる。したがって、抗原上に単一の第２の結着部位または単一の反応性結着部位を設けることによって、単一および均一なタイプの結合および会合のそれぞれが確実になり、その結果、非常に高度に規則的で反復性のアレイが得られる。例えば、結合および会合のそれぞれが、リジン（第１の結着部位として）およびシステイン（第２の結着部位として）の相互作用を介して行われる場合、本発明のこの好ましい実施形態によれば、このシステイン残基が抗原上に天然のものとして存在するかまたは非天然のものとして存在するかに関わらず、抗原当たりただ１つのシステイン残基と、ＶＬＰおよびコア粒子の第１の結着部位との結合および会合のそれぞれが確実になる。
いくつかの実施形態で、抗原上に第２の結着部位を設計製作することは、本発明の開示による第２の結着部位として適切なアミノ酸を含有するアミノ酸リンカーの融合を必要とする。したがって本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１つの共有結合によって、アミノ酸リンカーを抗原または抗原決定基に結合する。アミノ酸リンカーは、第２の結着部位を含み、あるいはこれからなることが好ましい。さらに好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーは、スルフィドリル基またはシステイン残基を含む。別の好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーがシステインである。アミノ酸リンカーを選択するいくつかの基準、ならびに本発明によるアミノ酸リンカーのさらに好ましい実施形態については既に述べた。
本発明のさらに好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗原または抗原決定基、すなわちＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドアレイを、コア粒子およびウイルス様粒子にそれぞれ融合させる。上述のように、ＶＬＰは、典型的な場合、ＶＬＰに組織化する少なくとも１つのサブユニットからなる。したがって、本発明のさらに好ましい実施形態でも同様に、抗原または抗原決定基、好ましくは少なくとも１つのＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを、ウイルス様粒子またはＶＬＰに組込み可能なタンパク質の少なくとも１つのサブユニットに融合させて、キメラのＶＬＰサブユニットとＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドとの融合体を生成する。
ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドの融合は、ＶＬＰサブユニット配列への挿入によって行うことができ、あるいは、ＶＬＰサブユニットのＮまたはＣ末端あるいはＶＬＰに組込み可能なタンパク質との融合によって、行うことができる。以下、タンパク質またはペプチドとＶＬＰサブユニットとの融合を指す場合、サブユニット配列の両端への融合またはサブユニット配列内部へのペプチドの内部挿入が包含される。
融合は、サブユニット配列の一部が欠失したＶＬＰサブユニットの変種にＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチド配列を挿入することによって行ってもよく、これは切断型変異体とも呼ばれるものである。切断型変異体は、ＮまたはＣ末端を有し、あるいはＶＬＰサブユニットの配列の一部に内部欠失を有する。例えば、アミノ酸残基７９〜８１の欠失を伴うような特定のＶＬＰ ＨＢｃＡｇは、内部欠失を有する切断型変異体である。ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドと、切断型変異体ＶＬＰサブユニットのＮまたはＣ末端との融合も、本発明の実施形態になる。同様に、ＶＬＰサブユニットの配列へのエピトープの融合は、置換によって行ってもよく、例えば特定のＶＬＰ ＨＢｃＡｇでは、アミノ酸７９〜８１を外来のエピトープに代える。したがって以下に述べる融合は、ＶＬＰサブユニットの配列にＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチド配列を挿入することによって、あるいはＶＬＰサブユニットの配列の一部をＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチド配列で置換することによって、あるいは欠失、置換、または挿入の組合せによって行うことができる。
キメラ体のＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドのサブユニットは、一般に、ＶＬＰに自己組織化することが可能である。そのサブユニットに融合したエピトープを示すＶＬＰも、本明細書ではキメラＶＬＰと呼ぶ。示されるように、ウイルス様粒子は、少なくとも１つのＶＬＰサブユニットを含み、あるいはこれからなる。本発明の別の実施形態で、ウイルス様粒子は、キメラＶＬＰサブユニットと非キメラＶＬＰサブユニット、すなわちそこに抗原が融合していないＶＬＰサブユニットとの混合物であり、いわゆるモザイク粒子と呼ばれる。これは、ＶＬＰの形成およびＶＬＰへの組織体を確実にするのに有利である。これらの実施形態で、キメラＶＬＰサブユニットの割合は、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％、またはそれ以上でよい。
ペプチドの配列の両端またはＶＬＰのサブユニットの配列の両端に融合されるエピトープには、フランキングアミノ酸残基を付加することができ、またはそのようなペプチド配列をＶＬＰのサブユニットの配列に内部挿入することができる。グリシンおよびセリン残基は、融合するＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドに付加されるフランキング配列に使用するのに特に好ましいアミノ酸である。グリシン残基は追加の柔軟性をもたらし、それによって、外来の配列をＶＬＰサブユニットの配列に融合する際に不安定な影響が出る可能性を減じることができる。
本発明の特定の実施形態で、ＶＬＰはＢ型肝炎コア抗原ＶＬＰである。ＨＢｃＡｇのＮ末端への融合タンパク質（Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：１１５７〜１１６３（１９９９））またはいわゆる主免疫優性領域（ＭＩＲ）への挿入が記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１）、ＷＯ ０１／９８３３３）、本発明の好ましい実施形態である。ＭＩＲ内の欠失を伴う天然に生ずるＨＢｃＡｇの変種も記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１）、その全体を参照により明確に援用する）、ＮまたはＣ末端への融合、ならびにｗｔＨＢｃＡｇと比較した場合の欠失部位に対応するＭＩＲの位置での挿入は、本発明の別の実施形態である。Ｃ末端への融合についても記載されている（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１））。当業者なら、古典的な分子生物学的技法を使用して融合タンパク質をどのように構成すべきかという方向性を容易に見出すであろう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他編、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、実験室マニュアル第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｈｏ他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、７７：５１（１９８９））。ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質をコードし、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質の発現に有用な、ベクターおよびプラスミドが記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１）、Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：１１５７〜１１６３（１９９９））、本発明を実施する際に使用することができる。また本発明者等は、例として（実施例６）、キメラ自己組織化ＨＢｃＡｇをもたらすＨＢｃＡｇのＭＩＲへのエピトープの挿入についても述べている。自己組織体の効率およびＨＢｃＡｇのＭＩＲに挿入するエピトープのディスプレイを最適化するための重要なファクターは、挿入部位の選択、ならびに挿入によってＭＩＲ内のＨＢｃＡｇ配列から欠失するアミノ酸の数（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１）；ＥＰ４２１’６３５；米国第６，２３１，８６４号）であり、言い換えればＨＢｃＡｇからのアミノ酸類を新しいエピトープで置換しなければならない。例えば、ＨＢｃＡｇアミノ酸７６〜８０、７９〜８１、７９〜８０、７５〜８５、または８０〜８１を、外来のエピトープで置換することが記載されている（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１）；ＥＰ０４２１６３５；米国第６，２３１，８６４号）。ＨＢｃＡｇは、カプシド組織体には重要ではなく核酸に結合可能な長いアルギニン末端部（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１））を含有する（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１））。このアルギニン末端部を含みまたは含まないＨＢｃＡｇは、いずれも本発明の実施形態である。
本発明のさらに好ましい実施形態で、ＶＬＰは、ＲＮＡファージのＶＬＰである。ＲＮＡファージの主なコートタンパク質は、細菌内、特にＥ．ｃｏｌｉ内での発現によって自発的にＶＬＰに組織化する。本発明の組成物を調製するのに使用可能なバクテリオファージコートタンパク質の特定の例には、バクテリオファージＱβ（配列番号１０；ＰＩＲデータベース、受入番号ＶＣＢＰＱβ、Ｑβ ＣＰを指すもの、および配列番号１１；受入番号ＡＡＡ１６６６３、Ｑβ Ａ１タンパク質を指すもの）やバクテリオファージｆｒ（配列番号４；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＦＲ）などのＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質が含まれる。
より好ましい実施形態では、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドの少なくとも１つを、Ｑβコートタンパク質に融合させる。切断型のＱβのＡ１タンパク質のＣ末端にエピトープを融合させ、またはＡ１タンパク質内にエピトープを挿入した融合タンパク質構成体が、記述されている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））。Ａ１タンパク質は、ＵＧＡ停止コドンで抑制することによって生成し、Ｎ末端メチオニンの切断を考慮した場合、その長さは３２９ａａまたは３２８ａａである。アラニン（Ｑβ ＣＰ遺伝子によってコードされた第２のアミノ酸）の前のＮ末端メチオニンの切断は、通常Ｅ．ｃｏｌｉで起こり、Ｑβコートタンパク質ＣＰのＮ末端ではそれが起こる。ＵＧＡアンバーコドンのＡ１遺伝子３’の部分は、長さが１９５アミノ酸であるＣＰ伸長部をコードする。ＣＰ伸長部の位置７２と７３の間に少なくとも１つのＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを挿入することも、本発明の実施形態になる（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））。Ｃ末端切断型のＱβ Ａ１タンパク質のＣ末端で、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを融合することも、本発明のさらに好ましい実施形態になる。例えばＫｏｚｌｏｖｓｋａ他は（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））、位置１９で切断されたＱβ ＣＰ伸長部のＣ末端でエピトープが融合した、Ｑβ Ａ１タンパク質融合について述べている。
Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））によって記述されるように、融合エピトープを示す粒子の組織体は、典型的な場合、Ａ１タンパク質とＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドとの融合体と、ｗｔＣＰとの両方を存在させて、モザイク粒子を形成する必要がある。しかし、ウイルス様粒子、本明細書では特にＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰであって、そこに融合した少なくとも１つのＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを有するＶＬＰサブユニットのみからなるものを含む実施形態も、本発明の範囲内である。
モザイク粒子の生成は、いくつかの方法で行うことができる。Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇ、３９：９〜１５（１９９６）は、２つの方法について述べており、これらはいずれも本発明を実施する際に使用することができる。第１の手法では、ＶＬＰ上での融合エピトープの効率的な提示が、クローニングされたＵＧＡサプレッサーｔＲＮＡをコードするプラスミドを収容したＥ．ｃｏｌｉ株のＣＰとＣＰ伸長部との間にＵＧＡ停止コドンを有するＱβ Ａ１タンパク質融合体をコードするプラスミドの発現によって仲介され、ＵＧＡコドンがＴｒｐに翻訳される（ｐＩＳＭ３００１プラスミド（Ｓｍｉｌｅｙ Ｂ．Ｋ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３４：３３〜４０（１９９３）））。別の手法では、ＣＰ遺伝子停止コドンをＵＡＡに変更し、Ａ１タンパク質とＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドとの融合体を発現する第２のプラスミドを同時形質転換する。第２のプラスミドは、異なる抗生物質耐性をコードし、複製源は第１のプラスミドに適合するものである（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｋ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））。第３の手法では、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６）の図１に記載されているように、ＣＰと、Ａ１タンパク質とＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドとの融合体を、２シストロン的手法でコードし、Ｔｒｐプロモーターなどのプロモーターに動作可能に結合する。
別の実施形態では、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを、ｆｒ ＣＰのアミノ酸２と３（切断ＣＰの付番、すなわちＮ末端メチオニンが切断される）の間に挿入し、したがってＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドとｆｒ ＣＰ融合タンパク質になる。ＶＬＰに自己組織化するｆｒ ＣＰ融合タンパク質を構成し発現するためのベクターおよび発現系であって、本発明の実施に有用なものが、記載されている（Ｐｕｓｈｋｏ Ｐ．他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．６：８８３〜８９１（１９９３））。特定の実施形態では、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチド配列を、アミノ酸２の後の、ｆｒ ＣＰの欠失変種、すなわちｆｒ ＣＰの残基３および４が欠失している部分に挿入する（Ｐｕｓｈｋｏ Ｐ．他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．６：８８３〜８９１（１９９３））。
ＲＮＡファージＭＳ−２のコートタンパク質のＮ末端隆起βヘアピンへのエピトープの融合と、その後の、ＲＮＡファージＭＳ−２の自己組織化ＶＬＰ上での融合エピトープの提示についても記述されており（ＷＯ９２／１３０８１）、ＭＳ−２ ＲＮＡファージのコートタンパク質への挿入または置換によるＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドの融合も、本発明の範囲内に含まれる。
本発明の別の実施形態では、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを、パピローマウイルスのカプシドタンパク質に融合する。より特定の実施形態では、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを、ウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ−１）の主要カプシドタンパク質Ｌ１に融合する。バキュロウイルス／昆虫細胞系内でＢＰＶ−１融合タンパク質を構成し発現させるためのベクターおよび発現系について、記述されている（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ ００／２３９５５）。ＢＰＶ−１ Ｌ１のアミノ酸１３０〜１３６を、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドで置換することによって、ＢＰＶ−１ Ｌ１と、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドとの融合タンパク質が得られるが、これは本発明の好ましい実施形態である。バキュロウイルスベクターでのクローニング、およびバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞での発現について記述されており、本発明を実施する際に使用することができる（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ ００／２３９５５）。融合したＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを示す組織化粒子の精製は、ゲルろ過やショ糖勾配超遠心分離などのいくつかの方法で行うことができる（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ ００／２３９５５）。
本発明の別の実施形態では、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを、Ｔｙ ＶＬＰに組込み可能なＴｙタンパク質に融合する。より特定の実施形態では、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを、ＴＹＡ遺伝子でコードしたｐ１またはカプシドタンパク質に融合する（Ｒｏｔｈ，Ｊ．Ｆ．、酵母（Ｙｅａｓｔ）、１６：７８５〜７９５（２０００））。酵母レトロトランスポゾンＴｙ１、２、３、および４は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅから単離し、一方、レトロトランスポゾンＴｆ１は、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｏｍｂａｅ）から単離した（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．およびＳａｎｄｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｂ．、「Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ」、Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｇｅｎｏｍｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ、第１９３頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１））。レトロトランスポゾンＴｙ１および２は、コピア種の植物および動物要素に関係し、一方Ｔｙ３は、植物および動物のレトロウイルスに関係するジプシー科のレトロトランスポゾンに属する。Ｔｙ１レトロトランスポゾンでは、Ｇａｇまたはカプシドタンパク質とも呼ばれるｐ１タンパク質の長さが４４０アミノ酸である。Ｐ１は、位置４０８でのＶＬＰの成熟中に切断され、その結果、ＶＬＰの本質的な成分であるｐ２タンパク質が得られる。
ｐ１との融合タンパク質と、酵母内で前記融合タンパク質を発現させるためのベクターが記述されている（Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｅ．他、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２９：６８〜７０（１９８７））。したがって例えば、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドをコードする配列をｐＭＡ５６２０プラスミドのＢａｍＨ１部位に挿入することによって、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドをｐ１に融合することができる（Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｅ．他、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２９：６８〜７０（１９８７））。ｐＭＡ５６２ベクターへの外来エピトープをコードする配列のクローニングによって、外来エピトープのＮ末端にＣ末端が融合したＴｙ１−１５のｐ１のアミノ酸１〜３８１を含む融合タンパク質が発現する。同様に、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドのＮ末端融合、あるいはｐ１配列への内部挿入、あるいはｐ１配列の一部の置換も、本発明の範囲内に含まれるものとする。特に、Ｔｙタンパク質ｐ１のアミノ酸３０〜３１と、６７〜６７と、１１３〜１１４と、１３２〜１３３との間のＴｙ配列に、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドを挿入することも（ＥＰ０６７７１１１）、本発明の好ましい実施形態になる。
ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドの融合に適する別のＶＬＰは、例えば、レトロウイルス様粒子（ＷＯ９６３０５２３）、ＨＩＶ２ Ｇａｇ（Ｋａｎｇ，Ｙ．Ｃ．他、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：３５３〜３６４（１９９９））、ササゲモザイクウイルス（Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．他、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：３８７〜３９２（１９９９））、パルボウイルスＶＰ２ ＶＬＰ（Ｒｕｅｄａ，Ｐ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６３：８９〜９９（１９９９））、ＨＢｓＡｇ（米国第４，７２２，８４０号、ＥＰ００２０４１６Ｂ１）である。
本発明の実施に適するキメラＶＬＰの例として、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ３９：１（１９９６）に記載されているものもある。本発明での使用が企図されるＶＬＰのその他の例は、ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−４５、ＣＲＰＶ、ＣＯＰＶ、ＨＩＶ ＧＡＧ、タバコモザイクウイルスである。ＳＶ−４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ロタウイルス、およびノーウォークウイルスのウイルス様粒子も作製され、これらＶＬＰのキメラＶＬＰも、本発明の範囲内にある。
本発明のさらに好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基が、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片またはＲＡＮＫＬペプチドである。
本発明のさらに非常に好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基がヒトＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドである。
本発明のさらに非常に好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基が、ａ）配列番号７９のアミノ酸配列、ｂ）配列番号７９の任意の断片のアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
本発明のさらに好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基が、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドの変種であり、例えば特に、アミノ酸置換基またはペプチド挿入または多形性を含有するものである。既に述べたように、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドの変種を含む組成物およびワクチン組成物のそれぞれは、本発明の範囲内に含まれる。
本発明のさらに好ましい実施形態で、抗原または抗原決定基はＲＡＮＫＬ断片である。好ましくは、抗原または抗原決定基は、ａ）ヒトＲＡＮＫＬの細胞外領域、ｂ）ヒトＲＡＮＫＬのスプライスアイソフォーム１、ｃ）分泌されたヒトＲＡＮＫＬをもたらすスプライスアイソフォーム２、ｄ）ヒトＲＡＮＫＬのタンパク質分解によって生成された可溶性領域、およびｅ）ＴＮＦ−α相同領域の群から選択されたヒトＲＡＮＫＬ断片である。
本発明のさらに非常に好ましい実施形態で、抗原または抗原決定基は、ａ）配列番号７９のアミノ酸配列、ｂ）配列番号８０のアミノ酸配列、ｃ）配列番号８１のアミノ酸配列、ｄ）配列番号８２のアミノ酸配列、ｅ）配列番号８３のアミノ酸配列、ｆ）配列番号８４のアミノ酸配列、ｇ）配列番号１００のアミノ酸配列、ｈ）配列番号１０１のアミノ酸配列、ｉ）配列番号７９〜８４、１００、１０１のいずれかの任意の断片のアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。
ＲＡＮＫＬタンパク質およびＲＡＮＫＬ断片は、原核または真核発現系でＲＡＮＫＬ ｃＤＮＡを発現させることによって生成することができる。これに関する様々な例が文献に記載されており、おそらくは変更を加えた後に使用して、任意の所望の種の任意のＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドを発現することができる。ＲＡＮＫＬタンパク質およびＲＡＮＫＬ断片は、哺乳動物細胞で（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．他、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３９０：１７５〜１７９（１９９７）、Ｌａｃｅｙ，Ｄ．Ｌ．他、細胞（Ｃｅｌｌ）９３：１６５〜１７６（１９９８）、Ｗｏｎｇ Ｂ．Ｒ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５１９０〜２５１９４（１９９７）、Ｌｕｍ，Ｌ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１３６１３〜１３６１８（２０００））、昆虫細胞で（Ｗｉｌｌａｒｄ，Ｄ．他、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．２０：４８〜５７（２０００））、原核細胞で（Ｘｕ，Ｊ．他、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ．１５：２１７８〜８６（２０００）、Ｙａｓｕｄａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：３５９７〜３６０２（１９９８））発現させた。ＲＡＮＫＬタンパク質および断片をどのように生成するかについての開示は、ＷＯ ９８４６７５１、米国第５，８４３，６７８号、ＷＯ ９８２５９９５８、米国第６，２４２，５８６号、ＷＯ ９８２８４２６、米国第６，２４２，２１３号、ＷＯ ９９２９８６５号、ＪＰ２０００１０２３９０およびＷＯ００１５８０７にも示されている。
本発明のさらに好ましい実施形態で、抗原または抗原決定基はＲＡＮＫＬペプチドである。そのようなＲＡＮＫＬペプチドまたはその断片は、問題となっている断片をコードするヌクレオチド配列をＰＣＲによって増幅し、ヒスチジンタグやＦｌａｇタグ、ｍｙｃタグなどのポリペプチドタグ、または抗体の定常部（Ｆｃ領域）との融合体としてクローニングする、標準的な分子生物学的技術を使用して生成することができる。ＲＡＮＫＬ断片とタグとの間にプロテアーゼ切断部位を導入することによって、対応するプロテアーゼによる消化で精製した後に、ＲＡＮＫＬ断片をタグから分離することができる。別の手法では、当業者に知られる標準的なペプチド合成反応を使用して、ＲＡＮＫＬ断片をｉｎ ｖｉｔｒｏ合成することができる。別の手法では、ＲＡＮＫＬペプチドまたはＲＡＮＫＬ断片を、完全長のＲＡＮＫＬタンパク質またはＲＡＮＫＬ断片をプロテアーゼ消化しまたは化学切断することよって生成することができ、どちらの方法も当業者に周知のものである。
本発明のさらに好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基が、ｉ）前記抗原または抗原決定基との天然でない結着部位、およびｉｉ）前記抗原または抗原決定基との天然の結着部位からなる群から選択された少なくとも１つの第２の結着部位をさらに含む。ウイルス様粒子に結合するためＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドをどのように修飾するかに関する指針は、この出願全体を通して示されている。好ましい第２の結着部位は、誘導体化ＶＬＰと結合するためのシステイン残基を含有し、その例が、上記事項においてさらに実施例１２および１３において示されている。
本発明者等は、ＴＮＦ−αに類似しているヒトＲＡＮＫＬ領域の３次元構造に関するモデルを構築した。本発明者等は、本発明によるＶＬＰ上の第１の結着部位と相互に作用するために、天然のシステインは折畳み構造内に接触できないことを見出した。本発明者等のモデルは、最近解析されたマウスＲＡＮＫＬのＸ線構造によって確認された（Ｌａｍ，Ｊ．他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０８：９７１〜９７９（２００２））。Ｎ末端は、実施例１２に示すように、アミノ酸リンカーを含む第２の結着部位を追加のシステイン残基に結着するのに好ましい。しかし、第２の結着部位としてシステイン残基を含有しかつＲＡＮＫＬ構造のＣ末端に融合するアミノ酸リンカーは、実施例１３に示すように本発明のさらに好ましい実施形態になる。ＲＡＮＫＬの細胞外領域に融合するシステイン残基を含有するＮ末端アミノ酸リンカーを持つヒトＲＡＮＫＬ構成体は、本発明の非常に好ましい実施形態である。
マウスＲＡＮＫＬ断片構成体（配列番号９６および配列番号９９）が開示されている、好ましいヒトＲＡＮＫＬ断片構成体を生成することができ、また例えば配列番号１００〜１０４の配列を有することもできる。さらに好ましい構成体は、ヒトＲＡＮＫＬタンパク質全体、ａ）ＲＡＮＫＬの細胞外領域（配列番号８２）、ｂ）ＲＡＮＫＬのスプライスアイソフォーム１（配列番号８０）、ｃ）分泌ＲＡＮＫＬをもたらすスプライスアイソフォーム２（配列番号８１）、ｄ）ＲＡＮＫＬのタンパク質分解によって生成された可溶性領域（配列番号８３）、およびｅ）ＴＮＦ−α相同領域（配列番号８４）の群から選択されたヒトＲＡＮＫＬ断片、またはヒトＲＡＮＫＬペプチドを含む。好ましくはＶＬＰに結合したヒトＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドを含む本発明の組成物を使用した、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドに対する免疫化は、骨疾患の治療または予防方法を提供することができる。
本発明のさらに好ましい実施形態で、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドは、ＲＡＮＫＬタンパク質の少なくとも１つの抗原性部位を含む。当業者なら、対応するペプチドおよびアミノ酸配列をそれぞれどのように識別するか、理解するであろう。
本発明のさらに好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基が、レセプターＲＡＮＫとの相互作用に極めて重要なＲＡＮＫＬペプチドである。ヒトＲＡＮＫＬ構造の本発明者等のモデルおよび公開されているマウスＲＡＮＫＬの結晶構造は、ＲＡＮＫＬモノマーが、２つの平らな逆並行βシートからなるβサンドイッチからなることを示していた。第１のシートは、β鎖Ａ"、Ａ、Ｈ、Ｃ、およびＦによって形成され、一方第２のシートはβ鎖Ｂ’、Ｂ、Ｇ、Ｄ、およびＥにより形成される。内部Ａ"ＡＨＣＦβシートはサブユニット間の会合に関与し、一方Ｂ’ＢＧＤＥβシートは外面に大きく寄与する。β鎖は、ＡＡ"ループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループを介して接続されている。ホモトリマーは、各ＲＡＮＫＬモノマーのβサンドイッチの１つの縁が、隣接するモノマーのＡＨＣＦβシートの内部疎水性面に突き当たるように組織化される。ＲＡＮＫ結合部位は、ホモトリマーの隣接するモノマーによって形成された裂溝を包含すると考えられる。マウスとヒトの配列の相同性に基づき、ＲＡＮＫ結合部位を包含するペプチドが選択される。好ましい実施形態で、ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫが相互に作用する部位からのペプチドは、ａ）アミノ酸１７１〜１９４を包含するＡＡ"ループ（配列番号８７）、ｂ）アミノ酸２４６〜２５３を包含するＤＥループ（配列番号８８）、ｃ）アミノ酸２３５〜２４５を包含するβ鎖Ｄ（配列番号８９）、ｄ）アミノ酸２２３〜２３４を包含するＣＤループ（配列番号９０）、ｅ）２６２〜２７２を包含するＥＦループ（配列番号９１）、ｆ）アミノ酸２００〜２０７を包含するβ鎖Ｂ’ループＢ’Ｂ（配列番号９２）、ｇ）アミノ酸３００〜３０５を包含するループＧＨ（配列番号９３）、ｈ）前記ペプチドａ〜ｇの任意の断片、ｉ）少なくとも１つのアミノ酸から最長２５のアミノ酸の、前記ペプチドａ〜ｇの任意のＮ及び／又はＣ末端伸長部、ｊ）ペプチドａ〜ｉ）の任意の融合体からなる群から選択される。本発明での使用に適する別のＲＡＮＫＬペプチドは、Ｔ細胞または抗体応答を誘導するその固有の性質によって、実験的に決定することができる。これは一般に、免疫学的に適切な製剤において選択されたペプチドとは別に、実験動物を免疫化することによって、また当業者に知られている方法を使用してＴ細胞およびＢ細胞、すなわち抗体応答を測定することによって実現される。抗原がタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである場合、この領域は、連続するアミノ酸配列によって形成することができる。あるいは抗体エピトープは、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの３次元折畳みの後、アミノ酸が空間的に互いに近付いた状態でかつエピトープを形成するように配列される、不連続なアミノ酸配列によって形成することができる。問題となっている連続ペプチド断片は、上述の免疫化実験によって識別することができる。
本発明での使用に適するその他の好ましいＲＡＮＫＬペプチドは、既存のまたは将来のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用することによって識別することができ、これに関連する手順は当業者に知られている。
本発明での使用に適するその他のＲＡＮＫＬペプチドは、ＲＡＮＫＬに特異的な抗体でファージディスプレイペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって識別することができ、その方法は当業者に周知のものである。
本発明のさらに好ましい実施形態で、抗原または抗原決定基は、任意の動物の単離されたＲＡＮＫＬであり、同様に任意の動物のＲＡＮＫＬの任意の抗原断片である。当業者なら、これらの単離されたＲＡＮＫＬタンパク質または断片からどのように断片およびペプチドを生成するのか理解されよう。
当業者なら、本明細書に記載する方法および適用例に対するその他の適切な変更例および適応例が、容易に明らかになり、本発明の範囲またはその任意の実施形態から逸脱することなく変更を加えかつ適応可能であることが理解されよう。本発明について詳細に述べてきたが、本発明は、本発明の単なる例示を目的とするものであり本発明を限定しようとするものではない以下の実施例を参照することによって、より明確に理解されよう。
変異Ｑβコートタンパク質の構成体および発現、変異Ｑβコートタンパク質ＶＬＰまたはカプシドの精製
プラスミドの構成体および変異コートタンパク質のクローニング
ｐＱβ―２４０の構成体
プラスミドｐＱβ１０（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，ＴＭ他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３７：１３３〜１３７）を、ｐＱβ−２４０の構成体用の初期プラスミドとして使用した。逆ＰＣＲによって、変異Ｌｙｓ１３→Ａｒｇを引き起こした。逆プライマーは、逆向き尾−尾結合方向：
５’−ＧＧＴＡＡＣＡＴＣＧＧＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＴＣＴＧＧＴＣＣ−３’、および
５’−ＧＧＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＧＡＣＣＧＡＴＧＴＴＡＣＣ−３’
に設計した。第１のＰＣＲの生成物を、第２のＰＣＲ反応用の鋳型として使用したが、その場合、上流プライマー
５’−ＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＡＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧ−３’
を使用した。第２のＰＣＲの生成物を、ＸｂａＩおよびＭｐｈ１１０３Ｉで消化し、ｐＱβ１０発現ベクターにクローニングし、これを同じ制限酵素によって切断した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。
直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２４０を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。
得られたアミノ酸配列（配列番号２３）：
ＡＫＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＲＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ
ｐＱβ−２４３の構成体：
プラスミドｐＱβ１０を、ｐＱβ−２４３の構成体用の初期プラスミドとして使用した。逆ＰＣＲによって、変異Ａｓｎ１０→Ｌｙｓを引き起こした。逆プライマーは、逆向き尾−尾結合方向：
５’−ＧＧＣＡＡＡＡＴＴＡＧＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＧＧＴＡＡＧＡＴＣＧＧ−３’、および
５’−ＣＣＧＡＴＣＴＴＡＣＣＴＡＡＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＡＴＴＴＴＧＣＣ−３’
で設計した。第１のＰＣＲの生成物を、第２のＰＣＲ反応用の鋳型として使用したが、その場合、上流プライマー
５’−ＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＡＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧ−３’
を使用した。第２のＰＣＲの生成物を、ＸｂａＩおよびＭｐｈ１１０３Ｉで消化し、ｐＱβ１０発現ベクターにクローニングし、これを同じ制限酵素によって切断した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。
直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２４３を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳＤ−ＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。
得られたアミノ酸配列（配列番号２４）：
ＡＫＬＥＴＶＴＬＧＫＩＧＫＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ
ｐＱβ−２５０の構成体：
プラスミドｐＱβ２４０を、ｐＱβ−２５０の構成体用の初期プラスミドとして使用した。部位特異的突然変異誘発によって、変異Ｌｙｓ２→Ａｒｇを引き起こした。変異ＰＣＲ断片を合成するために、上流プライマー
５’−ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＧＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’
を使用し、これを、独自の制限部位ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐＱβ−１８５発現ベクターに導入した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。
直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２５０を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。
得られたアミノ酸配列（配列番号２５）：
ＡＲＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＲＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ
ｐＱβ−２５１の構成体
プラスミドｐＱβ１０を、ｐＱβ−２５１の構成体用の初期プラスミドとして使用した。逆ＰＣＲによって、変異Ｌｙｓ１６→Ａｒｇを引き起こした。逆プライマーは、逆向き尾−尾結合方向：
５’−ＧＡＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡＡＣＴＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＡＴＣＣＧＣＧＴＧＧＧＧ−３’、および
５’−ＣＣＣＣＡＣＧＣＧＧＡＴＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＣＧＴＣＣＡＴＣ−３’
で設計した。第１のＰＣＲの生成物を、第２のＰＣＲ反応用の鋳型として使用したが、その場合、上流プライマー
５’−ＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＡＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧ−３’
を使用した。第２のＰＣＲの生成物を、ＸｂａＩおよびＭｐｈ１１０３Ｉで消化し、ｐＱβ１０発現ベクターにクローニングし、これを同じ制限酵素によって切断した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。
直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２５１を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。この構成体でコードされた、得られたアミノ酸配列を、配列番号２６に示す。
ｐＱβ−２５９の構成体
プラスミドｐＱβ−２５１を、ｐＱβ−２５９の構成体用の初期プラスミドとして使用した。部位特異的突然変異誘発によって、変異Ｌｙｓ２→Ａｒｇを引き起こした。上流プライマー
５’−ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＧＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’
を、変異ＰＣＲ断片の合成に使用し、これを、独自の制限部位ＮｃｏｌおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐＱβ−１８５発現ベクターに導入した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。
直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２５９を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。
得られたアミノ酸配列（配列番号２７）：
ＡＫＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＫＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ
ＱβおよびＱβ変異体を発現し精製するための一般的手順
発現
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を、Ｑβコートタンパク質発現プラスミドで形質転換した。２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地５ｍｌを、Ｑβコートタンパク質発現プラスミドで形質転換したクローンと共にインキュベートした。接種培養物を、振盪せずに、３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。調製された接種材料を、引き続き２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する新鮮なＬＢ培地１００〜３００ｍｌに入れて１：１００に希釈し、振盪せずに３７℃で一晩インキュベートした。得られた第２の接種材料を、フラスコ内で、１％カザミノ酸および０．２％グルコースを含有するＭ９培地に入れ、１：５０に希釈し、これを振盪せずに３７℃で一晩インキュベートした。
精製
精製手順用の溶液および緩衝液
１．Ｌｙｓｉｓ緩衝液ＬＢ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０
５ｍＭ ＥＤＴＡ ０．１％、トリトンＸ１００、および新たに調製したＰＭＳＦを、濃度ｍｌ当たり５マイクログラム含む。
リゾチームおよびＤＮＡｓｅなし。
２．ＳＡＳ
飽和硫酸アンモニウム水溶液
３．緩衝液ＮＥＴ
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８
５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む。
４．ＰＥＧ
ポリエチレングリコール６０００の４０％（ｗ／ｖ）ＮＥＴ溶液。
破壊および溶解
凍結細胞を、ＬＢに２ｍｌ／ｇ細胞で再懸濁した。溶液を氷上で冷却するために１分の間隔を空けて、混合物を１５分間２２ｋＨで５回超音波処理した。次いでＪａｎｅｃｋｉ Ｋ６０ローターを使用して、溶解産物を１時間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。下記の遠心分離工程は、他に特に示さない限り、すべて同じローターを使用して行った。上清を４℃で貯蔵し、細胞破壊片は、ＬＢで２回洗浄した。遠心分離後、溶解産物の上清と洗浄画分を溜めた。
分画
飽和硫酸アンモニウム溶液を１滴ずつ、撹拌しながら、上述の溜めた溶解産物に添加した。ＳＡＳの体積を、全体積の５分の１になるように調節して、飽和度が２０％になるようにした。溶液を一晩放置し、翌日１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを少量の２０％硫酸アンモニウムで洗浄し、再び遠心分離した。得られた上清を溜め、ＳＡＳを１滴ずつ添加して、飽和度４０％にした。溶液を一晩放置し、翌日１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。得られたペレットをＮＥＴ緩衝液に溶解した。
クロマトグラフィー
ＮＥＴ緩衝液に再度溶解したカプシドまたはＶＬＰタンパク質を、セファロースＣＬ−４Ｂカラムに導入した。クロマトグラフィー中、３つのピークが溶出された。最初の１つは主に、膜および膜断片を含有し、回収しなかった。カプシドは２番目のピークに含有され、３番目のピークはその他のＥ．ｃｏｌｉタンパク質を含有していた。
ピーク画分を溜め、ＮａＣｌ濃度を調節して、その最終濃度を０．６５Ｍにした。溜めたピーク画分の２分の１に相当する体積のＰＥＧ溶液を、撹拌しながら１滴ずつ添加した。溶液を、撹拌せずに一晩放置した。１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって、カプシドタンパク質を沈降させた。次いでこれを、最小体積のＮＥＴに溶解し、再びセファロースＣＬ−４Ｂカラムに導入した。ピーク画分を溜め、飽和度６０％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウムで沈殿させた。遠心分離してＮＥＴ緩衝液に再度溶解した後、カプシドタンパク質をセファロースＣＬ−６Ｂカラムに導入して、再びクロマトグラフィーを行った。
透析および乾燥
上記得られたピーク画分を溜め、滅菌水に対して広範にわたり透析し、凍結乾燥して貯蔵した。
発現および精製 Ｑβ−２４０
細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ １０９、プラスミドｐＱβ−２４０で形質転換された）をＬＢに再懸濁し、１５分間、５回超音波処理し、１３０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。上清を、さらにプロセッシングされるまで４℃で貯蔵し、細胞破壊片は、ＬＢ ９ｍｌで２回洗浄し、最後に、ＬＢに溶かした０．７Ｍ尿素９ｍｌで洗浄した。すべての上清を溜め、セファロースＣＬ−４Ｂカラムに導入した。溜めたピーク画分を、硫酸アンモニウムで沈殿させ、遠心分離した。次いで再溶解したタンパク質をセファロース２Ｂカラムでさらに精製し、最後にセファロース６Ｂカラムで精製した。最後にカプシドのピークを、水に対して広範にわたり透析し、上述のように凍結乾燥した。コートタンパク質とカプシドとの組織体を、電子顕微鏡によって確認した。
発現および精製 Ｑβ−２４３
細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１）をＬＢに再懸濁し、一般的手順で述べたように処理した。セファロースＣＬ−４Ｂカラムで、タンパク質を、連続した２回のゲルろ過工程により精製し、最後にセファロースＣＬ−２Ｂカラムで精製した。ピーク画分を溜め、上述のように凍結乾燥した。コートタンパク質がカプシドに組み込まれた組織体を、電子顕微鏡によって確認した。
発現および精製 Ｑβ−２５０
細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、ｐＱβ−２５０で形質転換した）をＬＢに再懸濁し、上述のように処理した。タンパク質を、セファロースＣＬ−４Ｂカラムでゲルろ過により精製し、最後にセファロースＣＬ−２Ｂカラムで精製し、上述のように凍結乾燥した。コートタンパク質がカプシドに組み込まれた組織体を、電子顕微鏡によって確認した。
発現および精製 Ｑβ−２５９
細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、ｐＱβ−２５９で形質転換した）をＬＢに再懸濁し、超音波処理した。細胞破壊片をＬＢ １０ｍｌで１回洗浄し、２回目は、ＬＢに溶かした０．７Ｍ尿素１０ｍｌで洗浄した。タンパク質を、セファロースＣＬ−４Ｂカラムで、２回のゲルろ過クロマトグラフィー工程により精製した。タンパク質を、上述のように透析し凍結乾燥した。コートタンパク質がカプシドに組み込まれた組織体を、電子顕微鏡によって確認した。
リジン残基を含有するペプチドの、ＨＢｃＡｇ（１〜１４９）ｃ／ｅ１エピトープへの挿入
ＨＢｃＡｇのｃ／ｅ１エピトープ（残基７２〜８８）を、Ｂ型肝炎ウイルスカプシド（ＨＢｃＡｇ）の表面の先端領域に位置付けた。この領域の一部（プロリン７９およびアラニン８０）を、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ構成体）で遺伝的に置き換えた。導入されたリジン残基は、その側鎖に反応性アミノ基を含有するが、これは、ＨＢｃＡｇ粒子と遊離システイン基を含有する任意の抗原との分子間化学架橋に使用することができる。
配列番号７８で示されるアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ ＤＮＡを、ＰＣＲで生成した。ＨＢｃＡｇ断片（アミノ酸残基１〜７８および８１〜１４９）をコードする２つの断片をＰＣＲにより別々に増幅した。これらのＰＣＲに使用されるプライマーも、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＧｌｙペプチドをコードするＤＮＡ配列を導入した。ＨＢｃＡｇ（１〜７８）断片は、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）を使用してｐＥｃｏ６３から増幅した。ＨＢｃＡｇ（８１〜１４９）断片は、プライマーＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を使用してｐＥｃｏ６３から増幅した。プライマーＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）およびＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）は、２つのＰＣＲ生成物の両端で相補的ＤＮＡ配列を導入し、したがって２つのＰＣＲ生成物の融合が後続の組織体ＰＣＲで可能になった。組織化された断片は、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨｂｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。
ＰＣＲでは、各オリゴ１００ｐｍｏｌと鋳型ＤＮＡ ５０ｎｇを、Ｐｗｏポリメラーゼ２単位、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、および２ｍＭ ＭｇＳＯ４の５０ｍｌ反応混合物中で使用した。両方の反応で、温度サイクルは以下のように実施した：９４℃、２分間；９４℃（１分）、５０℃（１分）、７２℃（２分）３０サイクル。
プライマー配列：
ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）：
（５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧ−３’）；
Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）：
（５’−ＣＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＴＡＧＴＡＣＣＣＡＣＣＣＡＧＧＴＡＧＣ−３’）；
Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）：
（５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＴＡＧＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣ−３’）；
ＨＢｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）：
（５’−ＣＧＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＣＡＡＣＡＧＴＡＧＴＣＴＣＣＧＧＡＡＧ−３’）
ＰＣＲによる２つのＰＣＲ断片の融合では、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）１００ｐｍｏｌを、Ｐｗｏポリメラーゼ２単位、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、および２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０ｍｌ反応混合物に溶かした２つの精製済みＰＣＲ断片１００ｎｇと共に使用した。ＰＣＲサイクル条件は：９４℃、２分間；９４℃（１分）、５０℃（１分）、７２℃（２分）３０サイクルであった。組織化したＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、精製し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を含む適切な緩衝液に入れて１９時間消化した。消化されたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＫＫベクターにライゲートして、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現ベクターを生成した。ＰＣＲ生成物のベクターへの挿入を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析および挿入物のＤＮＡ配列決定によって分析した。
ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｋ８０２またはＪＭ１０９を、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓで形質転換した。一晩培養した細菌１ｍｌを使用して、１００μｇ／ｍｌアンピリシンＬＢ培地１００ｍｌに接種した。この培養物を、６００ｎｍでＯＤが約０．８に達するまで、３７度で４時間成長増殖させた。ＩＰＴＧを添加することにより、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの合成の誘発を行って、最終濃度を１ｍＭにした。誘発後、細菌をさらに、３７℃で４時間振盪した。細菌を、５０００×ｇで１５分間遠心分離することにより収集した。ペレットを−８０℃で凍結した。ペレットを解凍し、２００μｇ／ｍｌリゾチームおよび１０μｌのベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）が補われた細菌溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。細胞を室温で３０分間インキュベートし、超音波によって破壊した。ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現プラスミドまたは対照プラスミドを収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用して、ＩＰＴＧでＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現を誘発させた。ＩＰＴＧを添加する前に、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓプラスミドを持つ細菌培養物と、対照プラスミドを持つ培養物からサンプルを取り出した。ＩＰＴＧを添加してから４時間後、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを含有する培養物と対照培養物からサンプルを再び取り出した。タンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターした後、クーマシー染色を行った。
次いで不溶性細胞破壊片を除去するため、溶解産物を、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。ＨＢｃＡｇに対するモノクローナル抗体（ＹＶＳ１８４１、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、米国から購入）を使用して、上清とペレットをウェスタンブロット法によって分析したが、かなりの量のＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質が可溶性であることが示された。簡単に、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを発現するＥ．ｃｏｌｉと対照細胞からの溶解産物を、１４，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清（＝可溶性画分）とペレット（＝不溶性画分）を分離し、ＳＤＳサンプル緩衝液で希釈して等体積にした。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、その後、抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体ＹＶＳ１８４１でウェスタンブロット法を行った。
４ｍｌの６５％ショ糖溶液上に３ｍｌの１５％ショ糖溶液があり、その次に細菌溶解産物４ｍｌがある、ショ糖ステップ勾配を使用したステップ勾配遠心分離に、清浄にした細胞溶解産物を使用した。サンプルを、１００，０００×ｇ、４℃で３時間遠心分離した。遠心分離後、勾配最上部から１ｍｌ画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その後、クーマシー染色を行った。ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質は、クーマシー染色によって検出した。
１５％と６５％のショ糖の間ではＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質が濃縮され、カプシド粒子を形成することが示された。細菌タンパク質のほとんどは、ショ糖を含まない勾配上層で維持され、したがってＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ粒子のステップ勾配遠心分離により、粒子が濃縮されかつ部分的に精製された。
ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの大規模な発現および精製は、以下のように行った。１００ｍｌ ＬＢ、１００μｇ／ｍｌアンピシリンに単コロニーを接種し、培養物を３７℃で一晩増殖させることによって、一晩培養物を調製した。翌日、予備培養物２５ｍｌを、８００ｍｌのＬＢアンピシリン培地で希釈し、その培養物を増殖させて光学密度ＯＤ６００を０．６〜０．８にした。次いで１ｍＭのＩＰＴＧで培養を誘発させ、さらに４時間増殖させた。細胞を、本質的に上述のように収集し溶解した。
次いでＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを、まず清浄にした細胞溶解産物から硫酸アンモニウム（３０％飽和）でタンパク質を沈殿させ、次いで再溶解したペレットをゲルろ過カラム（セファクリルＳ−４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に導入することによって、精製した。溜まった画分を硫酸アンモニウムで再び沈殿させ、ペレットを再溶解して同じゲルろ過カラムに２回目の導入を行った。最後に、画分を溜め、濃縮し、その濃度をブラッドフォード試験を使用して評価した（ＢｉｏＲａｄ）。
遊離システイン残基に欠けており挿入したリジン残基を含有する、ＨＢｃＡｇの構成体
配列番号７７の４８および１０７に対応する位置でシステイン残基に欠けておりかつ挿入されたリジン残基を含有する、本明細書ではＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔと呼ぶ肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を、以下の方法を使用して構成した。
以下のＰＣＲプライマーの組合せを用い、実施例２で述べたように調製したＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ遺伝子の３つの断片を最初に別々に増幅することによって、２つの変異体を導入した。ＰＣＲ法および従来のクローニング技法を使用して、ＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔ遺伝子を調製した。
簡単に言うと、下記のプライマーを使用して断片１を調製した。
プライマー１：ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）
ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧ
プライマー２：４８ａｓ
ＧＴＧＣＡＧＴＡＴＧＧＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＡＡＴＧＣＴＣＡＧＧＡＧＡＣＴＣ
以下のプライマーを使用して、断片２を調製した。
プライマー３：４８ｓ
ＧＳＧＴＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＴＣＣＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧＣＡＣ
プライマー４：１０７ａｓ
ＣＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＧＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＣＣＡＣ
以下のプライマーを使用して断片３を調製した。
プライマー５：ＨＢｃＡｇ１４９ｈｉｎｄ−ａｓ
ＣＧＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＣＡＡＣＡＧＴＡＧＴＣＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＴＴＧＡＴＡＧ
プライマー６：１０７ｓ
ＧＴＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＧ
次いで断片１および２をＰＣＲプライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）および１０７ａｓと組み合わせて、断片４を得た。次いで断片４および断片３をプライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ１４９ｈｉｎｄ−ａｓと組み合わせて、完全長の遺伝子を生成した。次いで完全長の遺伝子を、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）酵素で消化してｐＫＫベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングし、同じ制限部位で切断した。ＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔの発現および精製は、実施例３で述べたように行った。
ＨＢｃＡｇ１−１８５−Ｌｙｓの構成体
実施例２で述べたように、肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）１−１８５を変性させた。ｃ／ｅ１エピトープ（残基７２〜８８）領域の一部（プロリン７９およびアラニン８０）を、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙで遺伝的に置き換えた（ＨＢｃＡｇ１−１８５−Ｌｙｓ構成体）。導入されたリジン残基は、その側鎖に反応性アミノ基を含有し、これをＨＢｃＡｇ粒子と遊離システイン基を含有する任意の抗原との分子間化学架橋に使用することができる。ＰＣＲ法および従来のクローニング技法を使用して、ＨＢｃＡｇ１−１８５−Ｌｙｓ遺伝子を調製した。
実施例２で述べたように、ｐＥｃｏ６３からのＨＢｃＡｇ遺伝子の２つ別個の断片を増幅し、その後これら２つの断片をＰＣＲにより融合してＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列を挿入し、それによって完全長の遺伝子を組織化した。以下のＰＣＲプライマーの組合せを使用した。
断片１：
プライマー１：ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）（実施例２参照）
プライマー２：Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）（実施例２参照）
断片２：
プライマー３：Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）（実施例２参照）
プライマー４：ＨＢｃＡｇｗｔＨｉｎｄＩＩＩ
ＣＧＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡＴＴＧ
組織体：
プライマー１：ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）（実施例２参照）
プライマー２：ＨＢｃＡｇｗｔＨｉｎｄＩＩＩＩ
次いで組織化した完全長遺伝子を、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）酵素で消化し、ｐＫＫベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングし、同じ制限部位で切断した。
ＨｂｃＡｇのＭＩＲ領域でのペプチドエピトープの融合
ＨＢｃＡｇ１−１８５の残基７９よび８０を、配列ＶＮＬＴＷＳＲＡＳＧのエピトープＣεＨ３で置換した。ＣεＨ３配列は、ヒトＩｇＥのＨ鎖の第３定常ドメインの配列から得られる。組織体ＰＣＲ法を使用して、エピトープをＨＢｃＡｇ１−１８５配列に挿入した。最初のＰＣＲ工程では、ＡＴＣＣクローンｐＥｃｏ６３由来のＨＢｃＡｇ１−１８５遺伝子であってプライマーＨＢｃＡｇ−ｗｔ ＥｃｏＲＩ ｆｗｄおよびＨＢｃＡｇ−ｗｔ ＨｉｎｄＩＩＩ ｒｅｖで増幅したものを、２つの個別の反応で鋳型として使用して、ＣεＨ３配列をコードする配列要素を含有した２つの断片を増幅した。次いでこれら２つの断片を、第２のＰＣＲ工程で、組織体ＰＣＲ反応により組織化した。
第１のＰＣＲ工程でのプライマーの組合せ：ＨＢｃＡｇ−ｗｔ ＨｉｎｄＩＩＩ ｒｅｖを持つＣεＨ３ｆｗｔ、およびＣεＨ３ｒｅｖを持つＨＢｃＡｇ−ｗｔ ＥｃｏＲＩ ｆｗｄ。組織体ＰＣＲ反応では、まず第１のＰＣＲ工程で単離した２つの断片を、３回のＰＣＲサイクル中は外部プライマーなしで組織化し、その後、次の２５回のサイクルでは外部プライマーを反応混合物に添加した。外部プライマー：ＨＢｃＡｇ−ｗｔ ＥｃｏＲＩ ｆｗｔおよびＨＢｃＡｇ−ｗｔ ＨｉｎｄＩＩＩ ｒｅｖ。
Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のため、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用して、ＰＣＲ産物をｐＫＫ２２３．３にクローニングした（実施例２参照）。キメラＶＬＰをＥ．ｃｏｌｉで発現させ、実施例２で述べたように精製した。ＨＢｃＡｇ１−１８５−ＣεＨ３がゲルろ過から溶出した溶出体積は、融合タンパク質とキメラＶＬＰとの組織体を示していた。
プライマー配列：
ＣεＨ３ｆｗｄ：
５’ＧＴＴ ＡＡＣ ＴＴＧ ＡＣＣ ＴＧＧ ＴＣＴ ＣＧＴ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＴ ＧＣＡ ＴＣＣ ＡＧＧ ＧＡＴ ＣＴＡ ＧＴＡ ＧＴＣ ３’
Ｖ Ｎ Ｌ Ｔ Ｗ Ｓ Ｒ Ａ Ｓ Ｇ Ａ８０ Ｓ Ｒ Ｄ Ｌ Ｖ Ｖ８６
ＣεＨ３ｒｅｖ：
５’ＡＣＣ ＡＧＡ ＡＧＣ ＡＣＧ ＡＧＡ ＣＣＡ ＧＧＴ ＣＡＡ ＧＴＴ ＡＡＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＣＡＡ ＡＴＴ ＡＴＴ ＡＣＣ ＣＡＣ ３’
Ｄ７８ Ｅ Ｌ Ｎ Ｎ Ｇ Ｖ７２
ＨＢｃＡｇ−ｗｔ ＥｃｏＲＩ ｆｗｄ：
５’ＣＣＧｇａａｔｔｃＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧ
ＨＢｃＡｇ−ｗｔ ＨｉｎｄＩＩＩｒｅｖ：
５’ＣＧＣＧＴＣＣＣａａｇｃｔｔＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡＴＴＧ
ＨｂｃＡｇのＭＩＲ領域におけるＲＡＮＫＬペプチドエピトープの融合
ＨＢｃＡｇ１〜１８５の残基７９および８０を、配列ＳＩＫＩＰＳＳＨのＲＡＮＫＬペプチドエピトープで置換する。実施例６と同じ手法を使用して、２つの重なるプライマーを設計し、組織体ＰＣＲで融合タンパク質を構成する。ＰＣＲ産物をｐＫＫ２２３．３ベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ８０２で発現させる。実施例３で述べたようにキメラＶＬＰを発現させ精製する。
ＣＰ伸長部の位置１９で切断されたＱβＡ１タンパク質のＣ末端へのＲＡＮＫＬペプチドエピトープの融合
ＱβＡ１遺伝子の５’末端にアニールしているプライマーと、Ａ１遺伝子の３’末端にアニールしており配列ＳＩＫＩＰＳＳＨのＲＡＮＫＬペプチドエピトープをコードする配列要素をさらに含んでいるプライマーとを、ｐＱβ１０とのＰＣＲ反応で鋳型として使用する。ＰＣＲ産物をｐＱβ１０にクローニングし（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ Ｔ．Ｍ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３７：１３３〜３７（１９９３））、実施例１で述べたようにキメラＶＬＰを発現させ精製する。
ｆｒコートタンパク質の位置２と３の間へのＲＡＮＫＬペプチドエピトープの挿入
配列ＳＩＫＩＰＳＳＨのＲＡＮＫＬペプチドエピトープの配列をコードし、Ｂｓｐ１１９Ｉ適合末端およびインフレーム挿入を可能にする追加のヌクレオチドを含有する相補的プライマーを、標準的な分子生物学的技法によって、ｐＦｒｄ８ベクターのＢｓｐ１１９Ｉ部位に挿入する（Ｐｕｓｈｋｏ，Ｐ．他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．６：８８３〜９１（１９９３））。あるいは、Ｂｓｐ１１９Ｉで消化した後にｐＦｒｄ８ベクターのオーバーハングをクレノウで埋め込み、ＲＡＮＫＬタンパク質、ＲＡＮＫＬ断片、またはＲＡＮＫＬペプチドの配列をコードするオリゴヌクレオチドとインフレームクローニング用の追加のヌクレオチドとを、クレノウ処理の後にｐＦｒｄ８にライゲートする。正しい配向での挿入物によるクローンは、配列決定により分析する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ８０２におけるキメラ融合タンパク質の発現および精製は、セファロースＣＬ−４ＢまたはセファクリルＳ−４００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して行うクロマトグラフィーの工程以外、Ｐｕｓｈｋｏ，Ｐ．他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．６：８８３〜９１（１９９３）に記載されているように行う。実施例１のＱβに関して述べた手順と同様に、細胞溶解産物を硫酸アンモニウムで沈殿させ、連続２段階のゲルろ過精製工程で精製する。
ベクターｐＯＧＳ８１１１におけるＴｙ１タンパク質ｐ１の位置６７と６８の間でのＲＡＮＫＬペプチドエピトープの挿入
ｐＯＧＳ８１１１のＮｈｅＩ部位に適合する末端を持つ、配列ＳＩＫＩＰＳＳＨのＲＡＮＫＬペプチドエピトープをコードする２つの相補的なオリゴヌクレオチドを合成する。追加のヌクレオチドを加え、ＥＰ０６７７７１１１の記述に従いＲＡＮＫＬエピトープをコードする配列のインフレーム挿入を可能にする。挿入されたエピトープの両側に接するアミノ酸ＡＳおよびＳＳを、ｐＯＧＳ８１１１のＴｙＡ（ｄ）遺伝子でのオリゴヌクレオチドの挿入から得られた変性ＮｈｅＩ部位によりコードする。
ＰＯＧＳ８１１１をＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ株ＭＣ２に形質転換して、ＥＰ０６７７１１１およびその参考文献に記載されるように、キメラＴｙ ＶＬＰを発現させる。キメラＴｙ ＶＬＰを、ＥＰ０６７７１１１に記載されるように、ショ糖勾配超遠心分離により精製する。
パピローマウイルス１型（ＢＰＶ−１）の主要カプシドタンパク質Ｌ１へのＲＡＮＫＬペプチドエピトープの挿入
配列ＳＩＫＩＰＳＳＨのＲＡＮＫＬペプチドエピトープをコードする配列を、記載されているように（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ９６：２３７３〜２３７８（１９９９））、ｐＦａｓｔＢａｃ１（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）ベクターにクローニングされたＢＰＶ−１ Ｌ１遺伝子のアミノ酸１３０〜１３６をコードする配列に置換する。この構成体の配列は、ヌクレオチド配列分析によって確認する。製造業者により記述されるＧＩＢＣＯ／ＢＲＬバキュロウイルス系を使用して、組換えバキュロウイルスを生成する。Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ，Ｒ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：１２１８０〜８４（１９９２）およびＧｒｅｅｎｓｔｏｎｅ，Ｈ．Ｌ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１８００〜０５（１９９８）に記載されるように、キメラＶＬＰをバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞から精製する。
Ｎ末端ｃｙｓ含有リンカーの導入と、ＲＡＮＫＬの発現および精製
ＶＬＰに連結するための１つのシステインを含有するＮ末端リンカーを持つ、ＲＡＮＫＬの断片を、組換えにより発現させた。
発現プラスミドの構成体
ＲＡＮＫＬ遺伝子のＣ末端コード領域を、オリゴＲＡＮＫＬ−ＵＰおよびＲＡＮＫＬ−ＤＯＷＮを用いてＰＣＲにより増幅した（オリゴ：ＲＡＮＫＬ−ＵＰ：５’ＣＴＧＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＡＧ−３’；ＲＡＮＫＬ−ＤＯＷＮ：５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＴＣＴＡＴＧＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＧ−３’）。ＲＡＮＫＬ−ＵＰは内部ＡｐａＩ部位を有しており、ＲＡＮＫＬ−ＤＯＷＮは内部ＸｈｏＩ部位を有していた。ＰＣＲ産物をＡｐａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＧＥＸ−６ｐ１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にライゲートした。得られたプラスミドをｐＧＥＸ−ＲＡＮＫＬと名付けた。すべての工程を、標準的な分子生物学プロトコルによって実施し、配列を確認した。プラスミドｐＧＥＸ−ＲＡＮＫＬは、グルタチオンＳトランスフェラーゼＰｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎ切断部位−システイン含有アミノ酸リンカー−ＲＡＮＫＬ（ＧＳＴ−ＰＳ−Ｃ−ＲＡＮＫＬ）の融合タンパク質をコードする。システイン含有アミノ酸リンカーは、配列ＧＰＧＣＧＧＧを有する。この構成体は、システイン含有アミノ酸リンカーとＲＡＮＫＬ配列の間にヘキサヒスチジンタグも含有する。得られるｃＤＮＡおよびタンパク質構成体の配列は、配列番号９４および配列番号９５として与えられる。
Ｃ−ＲＡＮＫＬの発現および精製
コンピテントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ ｐＬｙｓ細胞を、プラスミドｐＧＥＸ−ＲＡＮＫＬで形質転換した。アンピシリン含有寒天平板からの単一コロニーを液体培養（ＬＢ培地、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で拡大し、２２０ｒｐｍで一晩振盪させながら３０℃でインキュベートした。次いでＬＢ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）１リットルに、一晩培養したものを１：１００ｖ／ｖで接種し、２４℃でＯＤ６００＝１になるまで増殖させた。０．４ｍＭのＩＰＴＧで発現を誘導した。細胞を１６時間後に収集し、５０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを、溶解緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０；２５％スクロース；１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮａＮ３；１０ｍＭ ＤＴＴ；５ｍＭ ＭｇＣｌ２；１ｍｇ／ｍｌリゾチーム；０．４Ｕ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ）中に３０分間懸濁させた。次いで緩衝液Ａ（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０；１％トリトンＸ１００；１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ ＮａＮ３；１０ｍＭ ＤＴＴ；１ｍＭ ＰＭＳＦ）２．５容を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。細胞を超音波処理し、９０００ｒｐｍで１５分間ペレット形成した。上清をすぐにＧＳＴアフィニティークロマトグラフィーに使用した。
ＧＳＴ−Ｔｒａｐ ＦＦカラム５ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＰＢＳ、ｐＨ７．３（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で平衡にした。上清を５ｍｌのＧＳＴ−Ｔｒａｐ ＦＦカラムに導入し、その後カラムをＰＢＳ ５カラム容で濯いだ。タンパク質ＧＳＴ−ＰＳ−Ｃ−ＲＡＮＫＬを、１０ｍＭの還元グルタチオンを含有する５０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０で溶出した。
精製したＧＳＴ−ＰＳ−Ｃ−ＲＡＮＫＬタンパク質を、プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して消化した。この消化は、モル比５００／１のＧＳＴ−ＰＳ−Ｃ−ＲＡＮＫＬとＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎを使用して３７℃で１時間行った。
さらにプロテアーゼ消化の反応を、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して緩衝液交換し、タンパク質を含有する画分を溜め、すぐに、以前に報告されたものと同じ条件を使用して、別のＧＳＴアフィニティークロマトグラフィー工程に使用した。図１に示すように、Ｃ−ＲＡＮＫＬの精製について、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。切断されたＣ−ＲＡＮＫＬは流れ（非結合画分）の中に存在するが、切断されていないＧＳＴ−ＰＳ−Ｃ−ＲＡＮＫＬ、切断されたＧＳＴ−ＰＳ、およびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎは、カラムに結合したままである。予想サイズが２２ｋＤａであるＣ−ＲＡＮＫＬタンパク質（配列番号９６）が、高純度で得られた。
Ｃ末端ｃｙｓ含有リンカーの導入、ＲＡＮＫＬの発現および精製
ＶＬＰに連結するための１つのシステインを含有するＣ末端リンカーを持つ、ＲＡＮＫＬの断片を、組換えにより発現させた。
発現プラスミドの構成体
当初の配列のＮｄｅＩ部位からＸｈｏＩ部位までをアニールされたオリゴプライマーＭＣＳ−１ＦおよびプライマーＭＣＳ−１Ｒ（１５ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８緩衝液中でアニーリング）で置換することにより、ｐＥＴ２２ｂ（＋）のＭＣＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）をＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＡＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＡＣＣに変化させた。得られたプラスミドをｐＭｏｄ００としたが、これはＭＣＳ中にＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＰｍｅＩ、およびＮｏｔＩ制限部位を有するものであった。アニールしたオリゴＢａｍｈｉｓ６−ＥＫ−Ｎｈｅ−ＦとＢａｍｈｉｓ６−ＥＫＮｈｅ−Ｒの対と、アニールしたオリゴ１Ｆ−Ｃ−グリシン−リンカーとオリゴ１Ｒ−Ｃ−グリシン−リンカーの対を、一緒にＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ消化ｐＭｏｄ００プラスミドにライゲートしてｐＭｏｄＥＣ１を得たが、これはＮ末端ヘキサヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位、および１つのシステイン残基を含有するＣ末端アミノ酸グリシンリンカーを有するものであった。
Ｃ末端エンテロキナーゼ切断部位を持つグルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ＳＰ−ＧＳＴ−ＥＫ−ｐＣＥＰ−ＰｕからオリゴヌクレオチドＧＳＴ−ＵＰおよびＧＳＴ−ＥＫでＰＣＲにより増幅し（Ｗｕｔｔｋｅ，Ｍ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：３６８３９〜３６８４８）、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＭｏｄＥＣ１ベクターにクローニングした。
得られたプラスミドｐＭｏｄ−ＧＳＴ−ＥＫ−Ｃ１は、エンテロキナーゼ切断部位およびＣ末端ｃｙｓ含有リンカーに融合したグルタチオンＳトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む。次いでＲＡＮＫＬのＣ末端コード配列を、オリゴヌクレオチドｍＲＡＮＫＬ−１およびｍＲＡＮＫＬ−２でＰＣＲによって増幅し、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、プラスミドｐＭｏｄ−ＧＳＴ−ＥＫ−Ｃ１にクローニングした。得られたプラスミドｐＭｏｄ−ＧＳＴ−ＥＫ−ｍＲＡＮＫＬ−Ｃ１は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、エンテロキナーゼ切断部位、ＲＡＮＫＬ断片、およびシステイン含有アミノ酸リンカーからなる融合タンパク質（ＧＳＴ−ＥＫ−ＲＡＮＫＬ−Ｃ）をコードする。得られたｃＤＮＡおよびタンパク質構成体の配列は、配列番号９７および配列番号９８として与えられる。
オリゴヌクレオチドの配列：
ＧＳＴ−ＵＰ：５’−ＡＴＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴ−３’；
ＧＳＴ−ＥＫ：５’−ＡＴＡＴＡＴＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧ−３’；
ｍＲＡＮＫＬ−１：５’−ＡＴＡＴＡＴＧＣＴＡＧＣＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＧＣＣＣＡＧＣＣＡＴＴＴＧ３’；
ｍＲＡＮＫＬ−２：５’−ＡＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＴＣＴＡＴＧＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＧ３’
ＲＡＮＫＬ−Ｃの発現および精製
コンピテントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ ｐＬｙｓ細胞を、プラスミドｐＭｏｄ−ＧＳＴ−ＥＫ−ｍＲＡＮＫＬ−Ｃ１で形質転換した。アンピシリン含有寒天平板からの単一コロニーを１００ｍｌ液体培養（ＬＢ培地、２００μｇ／ｍｌアンピシリン）で増殖し、２２０ｒｐｍで一晩振盪させながら３０℃でインキュベートした。次いで培地（１５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、２００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＳＢ）１リットルに、一晩培養したものを１：１００ｖ／ｖで接種し、３０℃でＯＤ６００＝２．５になるまで振盪させながら増殖させた。次いで培養物を１８℃に変化させ、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって３０分後にタンパク質発現を誘導した。細菌を１８℃で一晩おいた後に遠心分離によって収集し（ＳＬＡ−３０００、１５分、４℃、６０００ｒｐｍ）、４０ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．２５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）に再懸濁し、氷上で３０分間、０．８ｍｇ／ｍｌのリゾチームと共にインキュベートした。次いで細菌を超音波プロセッシングされることによって溶解し、０．２Ｍ ＭｇＣｌ２および８μｌのベンゾナーゼと共に室温で３０分間インキュベートした。遠心分離によって不溶性物質から溶解産物を取り出し（ＳＳ−３４、３０分、４℃、２００００ｒｐｍ）、これをすぐにグルタチオンセファロースアフィニティークロマトグラフィーに使用した。
したがって５ｍｌのＧＳＴ−Ｔｒａｐ ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．２５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）と平衡にし、取り出された溶解産物を、０．５ｍｌ／分の一定流量で導入した。次いでカラムを、溶解緩衝液５カラム容で３回洗浄し、タンパク質ＧＳＴ−ＥＫ−ＲＡＮＫＬ−Ｃを、溶出緩衝液（５０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ還元グルタチオン）１ｍｌずつ９画分で溶出した。図２Ａに示す精製により、ＧＳＴ−ＥＫの割合が少ない約４５ｋＤａのＧＳＴ−ＥＫ−ＲＡＮＫＬ−Ｃ融合タンパク質が得られた。
溶出画分を溜め、ＥｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、精製されたＧＳＴ−ＥＫ−ＲＡＮＫＬ−Ｃタンパク質を消化した。この消化は、精製済みＧＳＴ−ＥＫ−ＲＡＮＫＬ−Ｃ １ｍｇ当たり１０単位のＥｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅＭａｘを使用して、４℃で１６時間行った。図２Ｂは、切断反応によって、見掛けの分子量が約１６ｋＤａであるＲＡＮＫＬ−Ｃが得られることを示す。
切断後、タンパク質溶液を、ＰＢＳ ｐＨ７．２（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）に対して透析し、グルタチオンＳトランスフェラーゼを第２のグルタチオンセファロースアフィニティークロマトグラフィーによって除去した。したがって５ｍｌのＧＳＴ−Ｔｒａｐ ＦＦカラムをＰＢＳ ｐＨ７．２と平衡にし、タンパク質溶液を０．５ｍｌ／分の一定流量でカラムに導入した。タンパク質画分を、ＳＤＳゲル上でのグルタチオンセファロースクロマトグラフィーの前後に関して分析した。図２Ｃに示すように、切断されたＲＡＮＫＬ−Ｃタンパク質（配列番号９９）は、流れの中に高純度で含有されていたが、ＧＳＴ−ＥＫタンパク質はカラムに結合したままであった。
Ｃ−ＲＡＮＫＬのＱβカプシドタンパク質との連結
６ｍｇ／ｍｌのＱβカプシドタンパク質を、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に溶かした１．４８ｍｌの溶液を、２５℃で、ＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）（ＤＭＳＯに溶解した１００ｍＭ保存溶液から）１４．８μｌと３０分間反応させた。その後、この反応溶液を、２ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して４℃で３時間にわたり、２回透析した。９．８ｍｇ／ｍｌのＣ−ＲＡＮＫＬタンパク質を２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に溶かした２３０μｌの溶液を、２５℃で、ＴＣＥＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）の１００ｍＭ溶液１．７μｌと３０分間反応させた。次いで連結させるため、誘導体化し透析したＱβ ８０μｌを、還元Ｃ−ＲＡＮＫＬ ２４μｌおよび９６μｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に溶かしたものと混合し、２５℃で一晩インキュベートした。
連結生成物を、還元条件下、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。ゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色し、またはニトロセルロース膜上にブロットした。後者の場合、ポリクローナルウサギ抗Ｑβ抗血清（希釈率１：２０００）の後にホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（希釈率１：５０００）で、あるいはモノクローナルマウス抗ＲＡＮＫＬ抗体（希釈率１：２０００）の後にホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体（希釈率１：５０００）で、膜をブロックしかつインキュベートした。次いでブロットを、ＥＣＬ（商標）ウェスタンブロット検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で発色させた。結果を図３Ａおよび図３Ｂに示す。連結生成物は、クーマシー染色ゲル（図３Ａ）で、抗Ｑβ抗血清および抗ＲＡＮＫＬ抗体（図３Ｂ）により検出することができ、Ｃ−ＲＡＮＫＬとＱβカプシドタンパク質とが共有結合していることを明らかに示していた。
Ｑβカプシドタンパク質に連結されたＣ−ＲＡＮＫＬによるマウスの免疫化
合計８匹のメスのＢａｌｂ／ｃマウスに、Ｑβカプシドタンパク質に連結されたＣ−ＲＡＮＫＬをワクチン接種した。各サンプルの全タンパク質２５μｇをＰＢＳに希釈して２００μｌにし、これを第０日、第１６日、および第６４日目に皮下注射した（両腹側部に１００μｌ）。４匹のマウスに対してはアジュバントを添加することなくワクチン接種したが、他の４匹に対しては、ミョウバンを添加した状態でワクチン接種した。第０日、第１６日、第２３日、第６４日、および第７８日目にマウスの眼窩後方から出血させ、それらの血清を、ＲＡＮＫＬ特異的ＥＬＩＳＡを使用して分析した。
ＥＬＩＳＡでのＲＡＮＫＬ特異的抗体の検出
ＥＬＩＳＡプレートを、１０μｇ／ｍｌの濃度でＣ−ＲＡＮＫＬで被覆した。プレートをブロックし、次いで連続希釈した第１６、２３、６４、および７８日目のマウス血清と共にインキュベートした。結合抗体を、酵素標識した抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。対照として、同じマウスの免疫前血清についても試験した。図４は、ミョウバンが存在し、または存在しない状態でＱβ−Ｃ−ＲＡＮＫＬで免疫化したマウスの血清中に検出することができたＲＡＮＫＬ特異的抗体の平均力価を示す。ＥＬＩＳＡ力価は、ＥＬＩＳＡアッセイで最大半減ＯＤをもたらす血清希釈率として表す。ミョウバンなしで免疫化したマウスでは平均力価が２８０００に達したが、ミョウバンを添加した状態で免疫化したマウスでの平均力価は１６００００であった。免疫前血清は、Ｃ−ＲＡＮＫＬとの反応性を全く示さなかった。これは、ＲＡＮＫＬ−ＶＬＰ結合体が、自己タンパク質に対して高い抗体力価を誘導できることを、明らかに示している。
Ｑｂ−Ｃ−ＲＡＮＫＬで免疫化したマウスの血清によるＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ相互作用の阻害
Ｑβ−Ｃ−ＲＡＮＫＬでワクチン接種したマウスで生成された抗体が中和活性を有するか否か試験するために、ＲＡＮＫＬおよびその同族レセプターＲＡＮＫに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイを確立した。したがってＥＬＩＳＡプレートを、１０μｇ／ｍｌの濃度のＣ−ＲＡＮＫＬタンパク質で被覆し、連続希釈した精製済みＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質または陰性対照として無関係のＦｃ−融合タンパク質と共にインキュベートした。結合タンパク質を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗Ｆｃ抗体で検出した。図５Ａは、この分析の結果を示す。精製したＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質は、高い親和性（最大半減結合１〜３ｎＭ）でそのリガンドＲＡＮＫＬに結合することがわかったが、無関係のＦｃ−融合タンパク質を使用した場合には結合が事実上観察されなかった。
次いでＱβに連結されたＣ−ＲＡＮＫＬをワクチン接種したマウスの血清について、ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫ−Ｆｃとの結合を阻止し得るかどうかについて試験した。したがってＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌの濃度のＣ−ＲＡＮＫＬタンパク質で被覆し、連続希釈した第７８日目のマウス血清と１ｎＭ ＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質を混合したものと共にインキュベートした。ＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質とＣ−ＲＡＮＫＬとの結合を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗Ｆｃ抗体で検出した。図５Ｂは、ワクチン接種した８匹のマウスすべてが、ＲＡＮＫ−ＦｃとＣ−ＲＡＮＫＬとの結合を特異的に阻害する抗体を生成したことを示す。概して、最大半減阻害は、血清希釈率１：９０を使用したときに実現した。これは、ＲＡＮＫＬ−ＶＬＰ結合体を用いた免疫化によって、ＲＡＮＫＬとそのレセプターＲＡＮＫとの相互作用を阻害することができる高い力価の抗体を誘発することを、明らかに示している。したがって、本発明の特定の実施形態を注射してＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬ相互作用を阻害することにより、骨吸収の増加を特徴とする骨疾患を後退させまたは予防することができる。
組換えＡＰ２０５ ＶＬＰの発現および精製
Ａ．組換えＡＰ２０５ ＶＬＰの発現
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９をプラスミドｐＡＰ２８３〜５８で形質転換した。２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地５ｍｌに単一コロニーを接種し、振盪せずに３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。
調製した接種材料を、２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地１００〜３００ｍｌで１：１００に希釈し、振盪せずに３７℃で一晩インキュベートした。得られた第２の接種材料を、０．２％のグルコースおよびリン酸緩衝液を含有する２ＴＹ培地で１：５０に希釈し、シェーカーで一晩、３７℃でインキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、−８０℃で凍結した。
Ｂ．組換えＡＰ２０５ ＶＬＰの精製
溶液および緩衝液：
１．溶解緩衝液
１ｍｌ当たり５マイクログラムで、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ１００、およびＰＭＳＦを含む、５０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８．０
２．ＳＡＳ
飽和硫酸アンモニウム水溶液
３．緩衝ＮＥＴ
５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．８
４．ＰＥＧ
４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００をＮＥＴに溶かしたもの
溶解：
凍結細胞を、２ｍｌ／ｇ細胞で溶解緩衝液に再懸濁した。混合物を、１分おきに１５秒間、５回にわたり２２ｋＨで超音波処理し、氷上で溶液を冷却した。次いでＦ３４−６−３８ローター（Ｅｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、溶解産物を１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。以下に述べる遠心分離工程は、他に特に示さない限り、すべて同じローターを使用して実施した。上清を４℃で貯蔵し、一方、細胞片を溶解緩衝液で２回洗浄した。遠心分離後、溶解産物の上清および洗浄画分を溜めた。
分画：
硫酸アンモニウム沈殿をさらに使用して、ＡＰ２０５ ＶＬＰを精製することができる。第１の工程では、ＡＰ２０５ ＶＬＰが沈殿しない硫酸アンモニウムの濃度を選択する。得られたペレットを廃棄する。次の工程では、ＡＰ２０５ ＶＬＰが定量的に沈殿する硫酸アンモニウム濃度を選択し、この沈殿工程のペレットから、遠心分離（１４０００ｒｐｍ、２０分間）によってＡＰ２０５ ＶＬＰを単離する。得られたペレットを、ＮＥＴ緩衝液に溶解させる。
クロマトグラフィー：
溜めた上清からのカプシドタンパク質を、セファロース４Ｂカラム（２．８×７０ｃｍ）に導入し、４ｍｌ／時／分画でＮＥＴ緩衝液で溶出した。画分２８〜４０を回収し、６０％飽和の硫酸アンモニウムで沈殿させた。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより分析したが、このとき、沈殿前にＡＰ２０５に特異的な抗血清を用いた（図６Ａおよび図６Ｂ）。遠心分離によって単離されたペレットをＮＥＴ緩衝液に再度溶解し、セファロース２Ｂカラム（２．３×６５ｃｍ）に導入し、３ｍｌ／時／分画で溶出した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、画分４４〜５０を回収し、溜めて、６０％飽和の硫酸アンモニウムで沈殿させた。遠心分離によって単離されたペレットをＮＥＴ緩衝液に再度溶解し、セファロース６Ｂカラム（２．５×４７ｃｍ）で精製し、３ｍｌ／時／分画で溶出した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。画分２３〜２７を回収し、塩濃度を０．５Ｍに調節し、ＰＥＧ６０００で沈殿させ、４０％ストックから水中に添加して、最終濃度を１３．３％にした。遠心分離によって単離されたペレットをＮＥＴ緩衝液に再度溶解し、上述の同じセファロース２Ｂカラムに導入し、同じ手法で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる画分の分析を図６Ｃに示す。画分４３〜５３を回収し、６０％飽和の硫酸アンモニウムで沈殿させた。遠心分離によって単離されたペレットを水に再度溶解し、得られたタンパク質溶液を水に対して大規模に透析した。細胞１グラム当たり約１０ｍｇの精製タンパク質を単離することができた。
電子顕微鏡法でのウイルス様粒子の検査は、それらがファージ粒子と同一であることを示していた（図７Ａおよび７Ｂ）。
図６Ａは、上部パネルにおいて、第１のセファロース４Ｂクロマトグラフィー工程の分画の還元条件下で実行した銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。レーン１〜１３には、画分２０から４４までの中、１つおきの画分を導入した。画分５０はレーン１４に導入した。第２のゲルには同じ画分を導入し、ＡＰ２０５に特異的な抗血清を用いたウェスタンブロット法によって分析したが、これを下部パネルに示す（図６Ｂ）。
図６Ｃは、最後のセファロース２Ｂクロマトグラフィー工程の分画の還元条件下で実行した銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。画分３８〜５４をレーン１〜１６に導入する。
図７Ａは、ＡＰ２０５ファージ粒子のＥＭ写真を示し、図７Ｂには、組換えＡＰ２０５ ＶＬＰの自己組織化粒子のＥＭ写真を示す。
Ｑβ−Ｃ−ＲＡＮＫＬで免疫化したマウスの血清による、ＲＡＮＫＬ誘導破骨細胞形成の阻害
Ｑβ−Ｃ−ＲＡＮＫＬで免疫化したマウスで生成された抗体が、ＲＡＮＫＬの生物活性を阻害できるか否かを試験するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ破骨細胞分化アッセイを確立した。したがって骨髄細胞をＢａｌｂ／ｃマウス（４週齢）から単離し、α−ＭＥＭ／１０％ＦＣＳに溶かした組換えマウスＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）と共に密度１０６／ｍｌで１６時間インキュベートした。次いで浮遊している細胞を回収し、Ｍ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＧＥ２（１μＭ）、および異なる濃度のＣ−ＲＡＮＫＬでさらに培養した。４日目に、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）に対して陽性に染色した多核細胞の数によって、破骨細胞形成を評価した。Ｃ−ＲＡＮＫＬは、かなりの数のＴＲＡＰ陽性多核細胞を１００〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で誘発することがわかった。
次いでＱβ−Ｃ−ＲＡＮＫＬをワクチン接種したマウスの血清について、Ｃ−ＲＡＮＫＬ処理した骨髄細胞からの破骨細胞の形成を阻害し得るかどうか試験した。したがって破骨前駆体細胞をＢａｌｂ／ｃマウスから単離し、Ｍ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＧＥ２（１μＭ）、Ｃ−ＲＡＮＫＬ（１０００ｎｇ／ｍｌ）、および免疫化マウスから得られた連続希釈血清であってα−ＭＥＭ／１０％ＦＣＳに溶かしたものと共に、４日間インキュベートした。次いでＴＲＡＰ陽性多核細胞の数をカウントし、Ｃ−ＲＡＮＫＬのみと共に、またＣ−ＲＡＮＫＬおよび免疫前血清と共にインキュベートした対照と比較することによって、破骨細胞形成のアッセイを行った。
マウス卵巣摘出モデルでのＱβ−Ｃ−ＲＡＮＫＬワクチン接種による骨損失の阻害
Ｑβ−Ｃ−ＲＡＮＫＬワクチン接種が、エストロゲン欠損によって誘発される骨損失からマウスを保護するか否かを試験するため、卵巣摘出（ｏｖｘ）モデルを確立する。したがって１２週齢の合計４０匹のＣ５７／ＢＬ６マウスをランダムに４群に分け、以下のように処理した：第１群は免疫化せずに擬似手術を行い、第２群は免疫化せずにｏｖｘを行い、第３群は、ミョウバンなしでＱβ−Ｃ−ＲＡＮＫＬ ２５μｇで免疫化してｏｖｘを行い、第４群は、ミョウバンと共にＱβ−Ｃ−ＲＡＮＫＬ ２５μｇで免疫化して、同様にｏｖｘを行った。第３群および第４群からの動物を、第０日、１４日、２１日、および４２日目に免疫化し、すべての動物について第２８日目に手術を行って（擬似またはｏｖｘ）、第６３日目に屠殺する。体重を、第０日、２８日、および６３日に測定し、血液サンプルを第０日、１４日、２１日、２８日、４２日、および６３日目に採取する。抗体力価ならびに骨形成および骨分解マーカーを連続的にモニターし、動物を屠殺した後に、切除した脊柱のＤＸＡスキャンおよび一遠位部位および一中央部位で切除した大腿骨のｐＱＣＴスキャンによって骨無機密度を評価する。
明確な理解のため、例としていくらか詳細に本発明について十分に述べてきたが、当業者なら、本発明またはその任意の特定の実施形態に影響を及ぼすことなく、条件、配合物、およびその他のパラメータの広くかつ均等な範囲内で本発明を修正しまたは変更を加えることによって同様の事項を実施することができ、またそのような修正または変更が、添付の特許請求の範囲内に包含されることが、明らかであろう。
本明細書で述べたすべての刊行物、特許、および特許出願は、本発明が関係する当業者のレベルを示すものであり、個々の刊行物、特許、または特許出願のそれぞれが参照により援用されるよう具体的にかつ個々に示されるかのように同様の程度まで参照により本明細書に援用する。
Ｃ−ＲＡＮＫＬの発現および精製を示す図である。 Ｃ−ＲＡＮＫＬの精製について、還元条件下、ＳＤＳゲル上で分析した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。マーカータンパク質の分子量を左側余白に示す。レーン１：低分子量マーカー。レーン２および３：ＩＰＴＧ ０．４ｍＭで誘導してから１６時間後、空のベクターｐＧＥＸ６ｐ１およびｐＧＥＸ−ＲＡＮＫＬでそれぞれ形質転換されたＢＬ２１／ＤＥ３細胞の細胞溶解産物の上清。レーン４：ＧＳＴ−Ｔｒａｐ ＦＦカラムの後の、精製済みのＧＳＴ−ＰＳ−Ｃ−ＲＡＮＫＬタンパク質。レーン５：ＧＳＴ−Ｔｒａｐ ＦＦカラムに結合していない画分。レーン６：ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼで切断した後の、精製済みのＧＳＴ−ＰＳ−Ｃ−ＲＡＮＫＬタンパク質。レーン７：精製済みのＣ−ＲＡＮＫＬを含有する、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ分解物を導入した、ＧＳＴ−Ｔｒａｐ ＦＦカラムの非結合画分。レーン８：ＧＳＴ−ＰＳ−Ｃ−ＲＡＮＫＬ分解物を導入し、ＧＳＨで溶出した、ＧＳＴ−Ｔｒｐ ＦＦカラムの結合画分。 ＲＡＮＫＬ−Ｃの発現および精製を示す図であり、ＧＳＴ−ＥＫ−ＲＡＮＫＬ−Ｃの精製を示す図である。タンパク質サンプルを、還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。マーカータンパク質の分子量を左側余白に示す。レーン１：着色タンパク質マーカー、ブロードレンジ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。レーン２：０．１ｍＭ ＩＰＴＧで一晩導入した後の、ｐＭｏｄ−ＧＳＴ−ＥＫ−ｍＲＡＮＫＬ−Ｃｌプラスミドで形質転換されたＢＬ２１／ＤＥ３細胞の清浄化した細胞溶解産物。レーン３：レーン２の清浄化した溶解産物を導入したＧＳＴ−Ｔｒａｐ ＦＦカラムからの流出液。レーン４：ＧＳＴ−Ｔｒａｐ ＦＦカラムの第１洗浄液。レーン５：ＧＳＴ−Ｔｒａｐ ＦＦカラムの第２洗浄液。レーン６：ＧＳＴ−Ｔｒａｐ ＦＦカラムの第３洗浄液。レーン７〜１５：精製済みＧＳＴ−ＥＫ−ＲＡＮＫＬ−Ｃ融合タンパク質および少量のＧＳＴ−ＥＫ−タンパク質を含有する、ＧＳＴ−Ｔｒａｐ ＦＦカラムの溶出画分１〜９。 ＲＡＮＫＬ−Ｃの発現および精製を示す図であり、ＥｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅＭａｘ（商品名）によるＧＳＴ−ＥＫ−ＲＡＮＫＬ−Ｃの切断を示す図である。 ＧＳＴ−ＥＫ−ＲＡＮＫＬ−Ｃの消化について、還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。マーカータンパク質の分子量を左側余白に示す。レーン１：着色タンパク質マーカー、ブロードレンジ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。レーン２：精製済みＧＳＴ−ＥＫ−ＲＡＮＫＬ−Ｃ融合タンパク質。レーン３：ＥｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅＭａｘ（商品名）と共に４℃でインキュベートしてから１６時間後の切断生成物。 ＲＡＮＫＬ−Ｃの発現および精製を示す図であり、ＲＡＮＫＬ−Ｃの精製を示す図である。 グルタチオンセファロースでのアフィニティークロマトグラフィーによりＧＳＴ−ＥＫを除去した後のＲＡＮＫＬ−Ｃの精製について、還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。マーカータンパク質の分子量を左側余白に示す。レーン１：着色タンパク質マーカー、ブロードレンジ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。レーン２および３：ＥｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅＭａｘ（商品名）と共に４℃でＧＳＴ−ＥＫ−ＲＡＮＫＬ−Ｃを１６時間インキュベートした後の切断生成物ＧＳＴ−ＥＫおよびＲＡＮＫＬ−Ｃ。レーン４および５：高純度でＲＡＮＫＬ−Ｃを含有する、ＧＳＴ−Ｔｒａｐ ＦＦカラムの異なる量の非結合画分。 Ｃ−ＲＡＮＫＬとＱβカプシドタンパク質との連結を示す図であり、連結生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。タンパク質を、還元条件下で１６％ＳＤＳゲルで分析した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。マーカータンパク質の分子量を左側余白に示す。タンパク質のバンドの識別名を右側余白に示す。レーン１：着色タンパク質マーカー、ブロードレンジ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。レーン２：誘導体化Ｑβカプシドタンパク質。レーン３：精製済みＣ−ＲＡＮＫＬタンパク質。レーン４：Ｃ−ＲＡＮＫＬ／Ｑβ連結反応。 Ｃ−ＲＡＮＫＬとＱβカプシドタンパク質との連結を示す図であり、連結生成物のウェスタンブロット分析を示す図である。 タンパク質を、還元条件下で１６％ＳＤＳゲルに流し、ニトロセルロース膜にブロットし、抗Ｑβ抗血清で（図３Ｂ）または抗ＲＡＮＫＬ抗体で（図３Ｃ）検出した。マーカータンパク質の分子量を左側余白に示す。タンパク質のバンドの識別名を右側余白に示す。レーン１：着色タンパク質マーカー、ブロードレンジ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。レーン２：誘導体化Ｑβカプシドタンパク質。レーン３：精製済みＣ−ＲＡＮＫＬタンパク質。レーン４：Ｃ−ＲＡＮＫＬ／Ｑβ連結反応。 Ｃ−ＲＡＮＫＬとＱβカプシドタンパク質との連結を示す図であり、連結生成物のウェスタンブロット分析を示す図である。 タンパク質を、還元条件下で１６％ＳＤＳゲルに流し、ニトロセルロース膜にブロットし、抗Ｑβ抗血清で（図３Ｂ）または抗ＲＡＮＫＬ抗体で（図３Ｃ）検出した。マーカータンパク質の分子量を左側余白に示す。タンパク質のバンドの識別名を右側余白に示す。レーン１：着色タンパク質マーカー、ブロードレンジ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。レーン２：誘導体化Ｑβカプシドタンパク質。レーン３：精製済みＣ−ＲＡＮＫＬタンパク質。レーン４：Ｃ−ＲＡＮＫＬ／Ｑβ連結反応。 Ｑβに連結させたＣ−ＲＡＮＫＬで免疫化したマウスの、ＲＡＮＫＬ特異的ＩｇＧに関するＥＬＩＳＡを示す図である。 メスＢａｌｂ／ｃマウスに対し、Ｑβに連結したＣ−ＲＡＮＫＬをＰＢＳに溶かしたもの２５μｇを、ミョウバンを添加しまたは添加しない状態で、第０日、第１６日、および第６４日目にその皮下にワクチン接種した。第０日、第１６日、第２３日、第６４日、および第７８日目の血清について、ＲＡＮＫＬに特異的な抗体の分析をした。ＥＬＩＳＡ力価は、ＥＬＩＳＡアッセイで最大半減ＯＤ４２０に達するこれら血清の希釈率の平均として表す。 Ｑβ連結Ｃ−ＲＡＮＫＬで免疫化したマウスにおいて誘導された抗体の、中和活性について示した図であり、Ｃ−ＲＡＮＫとそのコグネイトリガンドＲＡＮＫとの結合アッセイを示す図である。ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌのＣ−ＲＡＮＫＬで被覆し、連続希釈したＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質または無関係のＦｃ−融合タンパク質と共にインキュベートした。結合したＲＡＮＫの検出を、ＨＲＰ結合抗Ｆｃ抗体で行った。 Ｑβ連結Ｃ−ＲＡＮＫＬで免疫化したマウスにおいて誘導された抗体の、中和活性について示した図であり、Ｑβ連結Ｃ−ＲＡＮＫＬをワクチン接種したマウスの血清抗体によるＣ−ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫ−Ｆｃ結合の阻害を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌのＣ−ＲＡＮＫＬで被覆し、連続希釈した第７８日目のマウス血清と１ｎＭのＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質と共に同時にインキュベートした。融合タンパク質とＣ−ＲＡＮＫＬとの結合を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗Ｆｃ抗体で検出した。 ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法により分析した、ＶＬＰで使用されるＡＰ２０５タンパク質の精製を示す図である。 ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法により分析した、ＶＬＰで使用されるＡＰ２０５タンパク質の精製を示す図である。 ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法により分析した、ＶＬＰで使用されるＡＰ２０５タンパク質の精製を示す図である。 図７Ａ−ＣはＥ．ｃｏｌｉで発現し精製された組換えタンパク質から自然に組織化されたＡＰ２０５ウイルス様粒子とＡＰ２０５ファージ粒子を比較した、電子顕微鏡写真である。

Claims (15)

  1. （ａ）ＲＮＡファージのウイルス様粒子であって、前記ウイルス様粒子がＲＮＡ−ファージＱβの組み換えタンパク質を含み、前記組み換えタンパク質が配列番号：１０のアミノ酸配列からなり、前記ウイルス様粒子が少なくとも１つの第１の結着部位を含み、前記第１の結着部位がリジン残基であるウイルス様粒子と、
    （ｂ）少なくとも１つの抗原又は抗原決定基であって、前記抗原又は前記抗原決定基がＲＡＮＫＬタンパク質又はＲＡＮＫＬ断片であり、前記抗原又は抗原決定基は少なくとも１つの第２の結着部位を含み、前記第２の結着部位はシステイン残基である抗原又は抗原決定基と、
    を含み、
    前記少なくとも１つの抗原又は抗原決定基が前記の少なくとも１つのペプチド結合でない共有結合によって前記ウイルス様粒子に結合しているワクチン組成物。
  2. 前記ウイルス様粒子が、組換えウイルス様粒子である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ウイルス様粒子が、配列番号：１０のＲＮＡファージＱβコートタンパク質のウイルス様粒子である、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記抗原又は抗原決定基がヒトＲＡＮＫＬタンパク質又はヒトＲＡＮＫＬ断片である、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記抗原又は抗原決定基が、
    （ａ）配列番号７９のアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号８０のアミノ酸配列、
    （ｃ）配列番号８１のアミノ酸配列、
    （ｄ）配列番号８２のアミノ酸配列、
    （ｅ）配列番号８３のアミノ酸配列、
    （ｆ）配列番号８４のアミノ酸配列、
    （ｇ）配列番号１００のアミノ酸配列、及び
    （ｈ）配列番号１０１のアミノ酸配列、
    からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記少なくとも１つの第２の結着部位は前記抗原又は抗原決定基では天然に存在しない、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記少なくとも第２の結着部位を備えた前記抗原又は抗原決定基が、
    （ａ）配列番号１０４のアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号１０５のアミノ酸配列、
    （ｃ）配列番号１０６のアミノ酸配列、
    （ｄ）配列番号１０７のアミノ酸配列、
    （ｅ）配列番号１０８のアミノ酸配列、
    （ｆ）配列番号１０９のアミノ酸配列、及び
    （ｇ）配列番号１１０のアミノ酸配列、
    からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  8. （ａ）請求項１に記載のワクチン組成物、及び
    （ｂ）製薬的に許容可能な担体、
    を含んでなる製薬的組成物。
  9. （ａ）ＲＮＡファージのウイルス様粒子であって、前記ウイルス様粒子がＲＮＡ−ファージＱβの組み換えタンパク質を含み、前記組み換えタンパク質が配列番号：１０のアミノ酸配列からなり、前記ウイルス様粒子が少なくとも１つの第１の結着部位を含み、前記第１の結着部位がリジン残基であるウイルス様粒子を提供すること、及び
    （ｂ）少なくとも１つの抗原又は抗原決定基であって、前記抗原又は前記抗原決定基がＲＡＮＫＬタンパク質又はＲＡＮＫＬ断片であり、前記抗原又は抗原決定基は少なくとも１つの第２の結着部位を含み、前記第２の結着部位はシステイン残基である抗原又は抗原決定基を提供すること、
    （ｃ）前記の少なくとも１つの抗原又は抗原決定基が少なくとも前記の１つのペプチド結合でない共有結合によって前記ウイルス様粒子と結合するように、前記ウイルス様粒子と前記の少なくとも１つの抗原又は抗原決定基を組み合わせることを含んでなる、請求項１に記載のワクチン組成物を製造する方法。
  10. 請求項１ないし９の何れか一項に記載のワクチン組成物を含んでなる、免疫化のための組成物であって、前記抗原又は抗原決定基が自己抗原である、組成物。
  11. 前記抗原又は抗原決定基がヒトＲＡＮＫＬタンパク質又はＲＡＮＫＬ断片である、請求項１０に記載の組成物。
  12. 薬剤として使用する請求項１ないし９の何れか一項に記載のワクチン組成物。
  13. 骨疾患の治療のための薬剤の製造のための請求項１ないし９の何れか一項に記載のワクチン組成物の使用。
  14. 動物又はヒトを免疫化する方法において使用するための請求項１ないし９の何れか一項に記載のワクチン組成物であって、前記組成物が前記動物又はヒトへ投与される、組成物。
  15. 前記抗原又は抗原決定基が自己抗原である、請求項１４の使用のためのワクチン組成物。
JP2003541333A 2001-11-07 2002-11-07 骨疾患治療用の抗原アレイ Expired - Fee Related JP4658475B2 (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33104501P 2001-11-07 2001-11-07
US60/331,045 2001-11-07
US10/050,902 US7264810B2 (en) 2001-01-19 2002-01-18 Molecular antigen array
US10/050,902 2002-01-18
US39663502P 2002-07-19 2002-07-19
US60/396,635 2002-07-19
PCT/EP2002/012449 WO2003039225A2 (en) 2001-11-07 2002-11-07 Antigen arrays comprising rankl for treatment of bone disease

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009255878A Division JP2010090127A (ja) 2001-11-07 2009-11-09 骨疾患治療用の抗原アレイ

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2005512987A JP2005512987A (ja) 2005-05-12
JP2005512987A5 JP2005512987A5 (ja) 2005-12-22
JP4658475B2 true JP4658475B2 (ja) 2011-03-23

Family

ID=31721335

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003541333A Expired - Fee Related JP4658475B2 (ja) 2001-11-07 2002-11-07 骨疾患治療用の抗原アレイ
JP2009255878A Pending JP2010090127A (ja) 2001-11-07 2009-11-09 骨疾患治療用の抗原アレイ

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009255878A Pending JP2010090127A (ja) 2001-11-07 2009-11-09 骨疾患治療用の抗原アレイ

Country Status (3)

Country Link
JP (2) JP4658475B2 (ja)
MX (1) MXPA04003900A (ja)
RU (1) RU2322258C2 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080047564A (ko) * 2005-09-28 2008-05-29 사이토스 바이오테크놀로지 아게 인터루킨-1 컨쥬게이트 및 그의 용도
BR112012030337B1 (pt) * 2010-05-28 2021-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc Vacina compreendendo um ou mais oligonucleotídeo(s) de cpg isolado(s) ou um agonista de tlr e colesterol, e uso da mesma
JP6409528B2 (ja) * 2014-11-27 2018-10-24 Jnc株式会社 アミノ基を含むイオン交換基とブチル基を含む疎水性基とを有する多孔性セルロース粒子及びそれを含むクロマトグラフィー担体ならびにｂ型肝炎ウィルスのウィルス様粒子の精製方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06509223A (ja) * 1991-06-28 1994-10-20 ビーティージー・インターナショナル・リミテッド キャプシド形成性システイン修飾ｍｓ２−コートキメラ蛋白質
JPH07508168A (ja) * 1992-06-26 1995-09-14 ビーティージー・インターナショナル・リミテッド タンパク質に基づく輸送系
WO2000023955A1 (en) * 1998-10-21 2000-04-27 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Virus-like particles for the induction of autoantibodies

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06509223A (ja) * 1991-06-28 1994-10-20 ビーティージー・インターナショナル・リミテッド キャプシド形成性システイン修飾ｍｓ２−コートキメラ蛋白質
JPH07508168A (ja) * 1992-06-26 1995-09-14 ビーティージー・インターナショナル・リミテッド タンパク質に基づく輸送系
WO2000023955A1 (en) * 1998-10-21 2000-04-27 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Virus-like particles for the induction of autoantibodies

Also Published As

Publication number Publication date
JP2005512987A (ja) 2005-05-12
RU2004117075A (ru) 2005-04-20
MXPA04003900A (es) 2004-07-08
RU2322258C2 (ru) 2008-04-20
JP2010090127A (ja) 2010-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7785873B2 (en) Antigen arrays for treatment of bone disease
US7094409B2 (en) Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
RU2325202C2 (ru) Конъюгаты грелин-носитель
AU2002363382B2 (en) Antigen arrays presenting IL-5, IL-3 or eotaxin for treatment of allergic eosinophilic diseases
EP1441764B1 (en) Antigen arrays comprising rankl for treatment of bone disease
US20070248617A1 (en) Medical Uses of Carrier Conjugates of Non-Human Tnf -Peptides
JP2007518762A (ja) グレリン−担体結合体
EP1751186A2 (en) Carrier conjugates of tnf-peptides
AU2002363382A1 (en) Antigen arrays presenting IL-5, IL-3 or eotaxin for treatment of allergic eosinophilic diseases
AU2002342891A1 (en) Antigen arrays comprising RANKL for treatment of bone disease
JP4533626B2 (ja) アレルギー性好酸球性疾患を治療するための抗原アレイ
JP2010090127A (ja) 骨疾患治療用の抗原アレイ
JP2005514347A5 (ja)
WO2003059386A2 (en) Prion protein carrier-conjugates
ZA200402015B (en) Antigen arrays comprising rankl for treatment of bone disease.
MXPA06008170A (en) Ghrelin-carrier conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050921

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090127

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090427

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090511

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090527

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090707

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20091109

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20091211

A911 Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20100309

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100706

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101006

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20101130

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20101224

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140107

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees