CN112725320A

CN112725320A - 黄花蒿花粉果胶裂合酶及其应用

Info

Publication number: CN112725320A
Application number: CN202110010314.XA
Authority: CN
Inventors: 孙劲旅; 魏继福; 汤蕊; 潘晨; 李宏; 胡巧丽; 顾建青
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2021-01-06
Filing date: 2021-01-06
Publication date: 2021-04-30

Abstract

本发明公开了一种黄花蒿花粉果胶裂合酶、其氨基酸序列、编码所述裂合酶的核苷酸序列、所述裂合酶重组蛋白的制备方法，以及所述裂合酶在诊断或检测蒿属花粉过敏原中的应用。本发明的试剂盒检测灵敏度高，特异性好，可用于蒿属花粉过敏对象的快速检测。

Description

黄花蒿花粉果胶裂合酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术、免疫学和变态反应学领域，具体涉及一种黄花蒿花粉果胶裂合酶及其应用。

背景技术

过敏性疾病是一种常见的慢性炎症性疾病，主要由于存在于环境中的过敏原引起，已被世界卫生组织列入21世纪重点防治的三大疾病之一。蒿属花粉属于花粉类过敏原。通常易过敏人群因吸入蒿类植物的花粉而引起过敏。蒿类植物种类中常见的包括紫苑、苍术、款冬、草红花、小蓟、大蓟、蒲公英、苍耳、茵陈蒿、青蒿、艾、牛劳子、佩兰、野菊、菊花、蛔蒿、向日葵、莴苣、茼蒿、大理花等。

由蒿属花粉引发的过敏反应包括过敏性鼻炎、过敏性哮喘、皮炎、结膜炎、荨麻疹和血管性水肿等。然而，引起上述过敏症状或病症的过敏原有很多种，且各个组份引发的过敏强度不尽相同，因此明确蒿属花粉中主要过敏原和次要过敏原及各单一组份的过敏原性有利于高效地诊断和治疗蒿属花粉过敏症。近年来，随着分子克隆和DNA重组技术不断发展，通过克隆表达在生物、结构、免疫学方面与天然蛋白具有同等效力的重组过敏原蛋白，可得到纯度高、性质单一的过敏原组份。因此，开发一种针对蒿属花粉过敏原的检测试剂或方法，可为临床提供有效的针对性治疗方案。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种黄花蒿花粉果胶裂合酶及其在诊断和治疗中的应用。

第一方面，本发明提供一种黄花蒿花粉果胶裂合酶，所述裂合酶具有：(1)：SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；或(2)：在(1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有黄花蒿花粉果胶裂合酶活性的由(1)衍生的酶。

SEQ ID NO:1

MEIFYFVVILTLAFVIVGEAVRTDINNEFELAQLNSTRRDLHECQANNIIDKCWRCKPNWCENRQALANCAQGFAKGTTGGKGGEIYKVTNPSDDDAANPKEGTLRCGVTKNKPLWIIFEKDMVINLKHELVIQCDKTIDGRGAKVEITGAGLTLMNVKNVIIHGIHIHDIVAKGGGMIKNSDGPPGLRQKSDGDGICVTGSSKVWIDHCTLSNAFDGLIDVTLKSSFITISNCKFTHHQKVILFGADDSHTQDQDMLATVAFNLFTDGCDQRMPRCRHGFFQVVNNNYCGWGTYAIGGSAKPTILSCGNLFKAPNDPAKKKVLVRADAPESESMKWNWRTHKDKLENGAIFIPSGCDPQLTPAQKAGLIEAEPGENVPKLTSCAGVLSCKPGQPC。

第二方面，本发明提供一种编码所述黄花蒿花粉果胶裂合酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列具有：(1)：SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或(2)：与(1)的核苷酸序列互补的序列；或(3)：与(1)的核苷酸序列具有95％以上同源性的序列。

SEQ ID NO:2

ATGGAAATTTTTTATTTCGTTGTGATTTTAACCTTAGCTTTTGTTATTGTGGGGGAAGCTGTTCGTACTGACATAAACAATGAATTCGAACTGGCTCAACTGAATTCAACAAGGCGGGACTTACACGAATGTCAAGCAAACAACATAATAGACAAGTGTTGGAGGTGTAAACCCAATTGGTGTGAAAACCGACAAGCATTAGCTAACTGTGCACAAGGTTTCGCAAAGGGAACCACAGGTGGCAAAGGTGGAGAAATCTATAAGGTGACCAATCCTTCAGATGATGATGCTGCAAATCCAAAGGAAGGGACACTCCGATGTGGTGTCACCAAAAATAAACCATTGTGGATCATCTTTGAAAAAGATATGGTCATCAATTTGAAACATGAGCTTGTTATACAATGTGACAAAACAATTGATGGTAGAGGTGCGAAAGTTGAGATCACAGGTGCAGGTCTCACCCTCATGAATGTTAAAAATGTGATCATTCATGGGATACATATTCATGACATTGTTGCAAAGGGGGGTGGAATGATTAAGAACTCCGACGGTCCACCAGGATTGAGACAAAAGAGTGACGGTGATGGTATATGCGTCACTGGTTCATCCAAGGTATGGATCGATCATTGCACACTTAGCAACGCCTTTGATGGGCTCATTGACGTCACCTTGAAAAGCTCATTCATTACCATTTCCAATTGCAAATTCACCCATCACCAAAAGGTCATATTGTTTGGGGCAGACGATTCACACACTCAAGATCAAGATATGCTAGCAACTGTCGCATTCAACCTGTTTACTGATGGATGTGACCAAAGAATGCCAAGGTGTCGACATGGGTTCTTCCAAGTTGTTAACAACAATTATTGCGGATGGGGGACGTACGCCATTGGTGGTAGTGCCAAACCTACGATCCTCAGCTGTGGCAACCTATTTAAGGCTCCTAATGACCCTGCCAAGAAAAAGGTGTTGGTGAGGGCTGATGCACCAGAATCAGAGTCGATGAAGTGGAATTGGAGAACTCATAAAGACAAACTTGAAAATGGAGCTATTTTCATACCATCTGGGTGTGATCCGCAGTTAACCCCTGCTCAAAAGGCCGGCTTGATTGAAGCGGAACCAGGAGAGAATGTTCCAAAACTAACCAGTTGTGCTGGTGTACTCTCATGCAAACCCGGACAACCTTGTTAA。

第三方面，本发明提供一种制备所述黄花蒿花粉果胶裂合酶的重组蛋白的方法，包括以下步骤：

根据本发明所述的核苷酸序列设计特异性引物，PCR扩增得到所述裂合酶的基因并克隆到大肠杆菌pET28a表达载体上，再将获得的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21；经IPTG诱导胞内表达，收集菌体经超声破碎后采用亲和层析纯化得到所述裂合酶的重组蛋白。

作为一个优选的实施方案，本发明的所述黄花蒿花粉果胶裂合酶重组蛋白的制备方法包括以下步骤：

植物RNA提取试剂盒提取黄花蒿花粉RNA逆转录合成cDNA；通过二代测序筛选得到可作为潜在过敏原的核苷酸序列；

根据潜在过敏原的核苷酸序列设计特异性引物，全长引物如SEQ ID No.3和SEQID No.4所示，重组引物如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

利用PCR扩增及TA克隆成功扩增得到目的基因，暂命名为Art an pl；

根据所鉴定的黄花蒿花粉中的果胶裂合酶(Art an pl)的氨基酸序列，利用clustal X2与其他花粉中的果胶裂解酶(pectatelyase)进行多重序列比对，Art an pl的氨基酸序列保守性。

通过将Art an pl基因克隆到大肠杆菌pET28a表达载体上，获得组氨酸标记(His*Tag)的重组质粒并转化大肠杆菌表达菌株BL21；

经IPTG诱导胞内表达，收集菌体经超声破碎后采用镍亲和层析纯化，透析复性得到高纯度重组蛋白。

第四方面，本发明提供一种药物组合物，包括所述黄花蒿花粉果胶裂合酶。

第五方面，本发明提供所述药物组合物在制备用于治疗蒿属花粉过敏患者的制剂中的用途。优选地，所述制剂为疫苗。

本发明的黄花蒿花粉果胶裂合酶可以作为疫苗通过脱敏来治疗过敏。

第六方面，本发明提供一种用于检测蒿属花粉过敏原的试剂盒，其包括本发明所述的裂合酶或本发明所述的药物组合物。

第七方面，本发明提供所述试剂盒在检测蒿属花粉过敏原中的用途。

第八方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含编码所述黄花蒿花粉果胶裂合酶的核苷酸序列。

第九方面，本发明提供一种表达系统，所述表达系统包含所述的表达载体。

作为本发明的优选方案，所述表达系统为感受态细胞，优选大肠杆菌。

有益效果

本发明的试剂盒检测灵敏度高，特异性好，可用于对蒿属花粉过敏患者进行过敏原的检测。

根据本发明的技术方案，在不改变蛋白活性或功能的情况下，可以对氨基酸序列中的某些氨基酸进行保守取代，参见下面表1。

表1

残基	保守性替换	残基	保守性替换
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu；Val

此外，因为碱基的简并性，在不改变多核苷酸序列的活性或功能的情况下，可以对多核苷酸序列的碱基进行取代，参见下面表2。

表2

附图说明

图1为黄花蒿花粉裂合酶(Art an pl)基因PCR扩增结果。

图2为Art an pl的核苷酸序列及氨基酸序列。引物位置用斜体和下划线标记；起始子ATG和终止子TAA均用方框标出。

图3为黄花蒿花粉Art an pl的氨基酸序列与其他花粉的果胶裂解酶(pectatelyase)(艾蒿Art v 6、豚草Amb a 1、向日葵Hel a 6、雪松Jun a 1、东部红柏Jun v 1、日本柏Cha o 1、日本雪松Cry j 1、桂柏Cup a 1、普通柏Cup s 1)的氨基酸序列的相似性比较。

图4为黄花蒿花粉新过敏原Art an pl重组蛋白的诱导表达及纯化。(A)：重组Artan pl的诱导表达，其中，M表示预染蛋白Marker26616，1表示未诱导菌，2表示诱导菌，3表示诱导后的细菌裂解物上清，4表示诱导后的细菌裂解物沉淀(包涵体)。(B)：重组Art an pl的蛋白纯化，其中，M表示预染蛋白Marker26616，1表示10mM咪唑浓度的洗涤液，2表示30mM咪唑浓度的洗脱液，3表示100mM咪唑浓度的洗脱液，4表示200mM咪唑浓度的洗脱液，箭头表示重组Art an pl蛋白。

图5为Art an pl与蒿属过敏患者血清中IgE结合的ELISA分析和Western blot分析。(A)：Art an pl与200例蒿属过敏患者血清中IgE结合的ELISA分析，90例显示IgE对Artan pl呈阳性反应，13例蒿属未过敏患者血清作为阴性对照。(B)：Western blot分析50例血清中IgE与Art an pl的特异性结合活性。箭头表示目的条带位置，NC表示阴性血清。

图6为Art an pl竞争性抑制黄花蒿花粉粗提物与血清IgE结合的程度。

图7为Art an pl间接嗜碱性粒细胞激发试验，CD63和CCR3阳性细胞的比例作为Art an pl激发活性指标。HC：健康血清，P：患者血清。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1.临床样本收集

血清来自于北京协和医院变态反应门诊进行临床检查后采集的血液样本。入选标准：年龄不限；性别不限；完成血清蒿属提取物sIgE的检测；取得知情同意书。留取皮试阳性，且ImmunoCAP(Phadia，Uppsala，Sweden)测定血清sIgE水平≥0.35KU/L的患者血清样本，并置于-80℃冻存。

2.二代测序及潜在过敏原序列筛选

采集新鲜花粉，干冰运输，保存于-80℃。二代测序由北京奥维森基因科技有限公司负责。通过IUIS数据库对比，筛选出一个与已知过敏原序列相比，同一性(identity)>50％，相似长度>100bp，bit score>100的果胶裂合酶基因序列作为潜在的过敏原。

3.蒿属花粉RNA提取及逆转录

用植物RNA提取试剂盒提黄花蒿花粉RNA；将得到的RNA测浓度后立即逆转录为cDNA。PCR设置程序为：37℃15分钟，85℃5秒，4℃5分钟，得到cDNA，保存于-80℃。

4.蒿属花粉潜在过敏原序列的基因扩增及纯化

设计全长引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，在无酶EP管中，按表3配制25μlPCR反应体系，反应程序为：98℃15秒；(98℃10秒，55℃30秒，72℃1分钟)×30个循环；4℃，5分钟，扩增基因。琼脂糖凝聚电泳验证PCR扩增产物，并用切胶回收进行纯化。

表3.PCR反应体系

5.蒿属花粉潜在过敏原TA克隆和序列验证

纯化后的PCR产物连接至T载体，得到T质粒。TA克隆反应体系如表4所示，16℃反应30分钟。随后，将所得T质粒转化至JM109感受态细胞中，轻柔混匀，冰上放置30分钟。42℃热激1分钟后，冰上放置5分钟，在超净台中加入890μl无抗LB液体培养基，37℃140rpm，1小时震摇复苏。取200μl菌液均匀涂抹于氨苄霉素抗性LB固体培养基上，37℃过夜培养。次日，挑选阳性菌落摇菌至浑浊后取1ml菌液，离心重悬，煮沸5-10分钟，离心，取上清作为模板，进行菌液PCR并通过琼脂糖凝胶电泳验证，交由公司测序。

表4.TA克隆反应体系

6.黄花蒿花粉新过敏原保守性分析

同样，根据所鉴定的黄花蒿花粉中的果胶裂合酶(Art an pl)的氨基酸序列，利用clustalX2与其他花粉中的果胶裂解酶(pectate lyase)进行多重序列比对，包含过敏原艾蒿Art v 6、豚草Amb a 1、向日葵Hel a 6、雪松Jun a 1、东部红柏Jun v 1、日本柏Cha o1、日本雪松Cry j 1、桂柏Cup a 1、普通柏Cup s 1(http://www.allergen.org/)。明确黄花蒿花粉果胶裂合酶Art an pl的氨基酸序列保守性。

7.黄花蒿果胶裂合酶Art an pl的重组克隆

7.1线性化克隆载体制备

将pET-28a保种菌加入5ml含卡那霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm，摇菌至浑浊，用质粒小提试剂盒提取高纯度pET28a载体质粒进行双酶切，按表5在冰上配制双酶切体系，37℃反应2小时，琼脂糖凝胶电泳验证并用切胶回收、纯化。

表5.双酶切反应体系

7.2目的基因重组PCR扩增

用质粒小提试剂盒提取TA质粒。根据目的基因编码区序列及pET28a的NcoI和XhoI酶切位点序列，设计重组引物，以提取的TA质粒为模板，进行重组PCR。琼脂糖凝胶电泳验证并用切胶回收、纯化得到纯化重组PCR产物。

7.3重组反应

按表6配制重组克隆反应体系(冰上操作)，用移液枪轻柔吹匀，避免产生气泡，37℃水浴反应30分钟，置于冰上冷却5分钟。

表6.重组克隆反应体系

7.4产物转化及涂板

重组产物于冰上转化JM109感受态细胞，通过抗卡那筛选，挑选含重组表达质粒的阳性菌落，经菌落PCR测序验证。

8.蒿属花粉潜在过敏原重组质粒在大肠杆菌表达系统诱导表达

将重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，挑选单克隆菌落接种于3ml含50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，次日按照1％的接种量接种于新鲜培养液中，37℃摇菌至OD600为0.5后加入终浓度为0.5mM IPTG，以37℃，180rpm诱导过夜。次日，离心收集菌体，重悬于8-10ml菌体裂解平衡液LE buffer(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH 8.0)中，在冰水浴中超声，设定超声频率为70％，每超声5秒暂停5秒，超声时间为30分钟。超声结束后取100μl超声后的菌液，12,000rpm离心1分钟，分离上清和沉淀，并通过SDS-PAGE凝胶电泳，确定蛋白表达在上清还是沉淀。将剩余的菌液15,000rpm，4℃，离心30分钟，分别收集沉淀和上清。

若蛋白在上清表达，直接用高亲和力的Ni-NTA树脂对上清进行纯化。若蛋白在沉淀表达，则先用含尿素的LE Buffer溶解沉淀后，离心取上清后用高亲和力的Ni-NTA树脂进行纯化，用含不同浓度咪唑的含尿素的LE Buffer分别进行洗涤和洗脱。利用SDS-PAGE凝胶电泳，验证纯化效果。合并目的蛋白浓度和纯度高的洗脱液，依次在含6M-4M-2M-0M尿素的透析液中进行梯度透析，最后用PBS作为透析液多透析几次，以彻底除去尿素和咪唑，进行蛋白复性。最终BCA试剂盒测定蛋白浓度。

9.Art an pl重组蛋白免疫原性验证

9.1酶联免疫吸附实验(ELISA)

①包被：将纯化的重组蛋白用PBS按10μg/ml，100μl/孔包被于酶标板上，4℃过夜；

②封闭：次日，用PBST洗涤3次后，以1mg/ml的BSA作为封闭液，每孔200μl，37℃封闭1小时；

③一抗：PBST洗板3次，加入在PBST中1：10稀释的蒿属过敏患者血清，每孔100μl，37℃，2小时；

④二抗：PBST洗板3次，加入100μl的1:2500稀释的HRP标记的Anti-IgE，37℃，1小时；

⑤显色：PBST洗板3次，加入100μl的TMB显色液室温避光反应30分钟；

⑥终止：加入40μl/孔终止液终止反应，用酶标仪在450nm处测吸光度值。

非蒿属过敏患者血清作为阴性对照。根据文献，设定临界值(Cut-off value)为阴性对照组的平均值加上其3倍标准偏差，过敏血清测得的吸光度平均值高于此临界值的判定为阳性。

9.2竞争性抑制实验

为了测定重组过敏原抑制sIgE结合到黄花蒿花粉粗提物的程度，将不同浓度的重组过敏原分别与血清孵育后，测定血清中sIgE与粗提物结合率的变化。所用方法步骤如下：

①将黄花蒿花粉粗提物用PBS按10μg/ml，100μl/孔包被于酶标板上，4℃过夜；

②洗板和封闭；

③将不同浓度(10^-5、10^-4、10^-3、10^-2、10^-1、1、10μg/ml等浓度)的重组过敏原蛋白或黄花蒿粗提物与患者血清(1:20稀释于PBST中)混合，37℃预孵育1小时；

④以预孵育的患者血清、未预孵育的患者血清和阴性对照血清作为一抗，37℃孵育2小时；

⑤洗板、孵二抗、显色、终止和吸光度测定。

抑制率计算公式如下：

9.3免疫印迹试验(Western blot)

①电泳：利用SDS-PAGE电泳分离到Art an pl蛋白；

②转膜：恒流260mA将Art an pl蛋白转至PVDF膜，时间为(分子量+20)分钟；

③封闭：5％脱脂牛奶封闭2小时；

④孵一抗：PBST洗膜后，蒿属花粉过敏血清和阴性对照血清按1:15稀释作为一抗，4℃孵育过夜；

④孵二抗：次日，PBST洗膜后，1:5000稀释的Anti-IgE作为二抗，室温孵育90分钟；

⑤曝光：PBST洗涤后进行特异性检测。

9.4间接嗜碱性粒细胞激发试验

①每100μl EDTA抗凝的外周血，加1x红细胞裂解液2ml，轻弹试管混匀，室温避光孵育10min，至液体澄清透明，1000rpm离心5min，弃上清。

②将所得细胞重悬于预冷的乳酸buffer，冰上孵育3.5min。

③PBS洗三次(1000rpm离心5min，弃上清，PBS重悬)。

④Tris A Buffer+FBS重悬细胞，37℃孵育90min，每30min轻弹混匀。

⑤用终浓度10％的Art an pl过敏患者血清重悬，37℃孵育2h。

⑥Tris A Buffer洗三次，后重悬于150μl Tris A Buffer-Ca²⁺Mg²⁺中，37℃孵育30min。

⑦加10μg/ml重组Art an pl，37℃，5％CO₂培养箱激发30min，2μg/ml anti-IgE作为阳性对照。

⑧加900ul预冷的EDTA/CMF-PBS终止反应，4℃离心5min。

⑨弃上清，加荧光标记CD63和CCR3抗体和100μl Staining Buffer，冰上孵育20min。

⑩上机检测。

结果

1.蒿属花粉过敏患者的临床信息

用于黄花蒿花粉过敏原分析的蒿属过敏患者共200人，ImmunoCAP测定sIgE含量在4.69-100以上KU/L。用于阴性对照的血清中蒿属sIgE含量均小于0.35KU/L。

2.蒿属花粉潜在过敏原序列筛选

根据黄花蒿花粉转录组测序结果，与已知过敏原序列比对，筛选潜在过敏原序列，找到1个果胶裂合酶基因，利用PCR扩增及TA克隆成功扩增得到目的基因，暂命名为Art anpl。果胶裂合酶的全长引物和重组引物见表7。

表7.果胶裂合酶全长引物和重组引物

3.蒿属花粉新过敏原扩增及全长序列获取

根据转录组测序结果，通过PCR扩增、测序得到全长为1216bp的Art an pl的cDNA全长序列。PCR扩增结果见图1。Art an pl全长序列中含有一个1191bp的开放阅读框(Openreading frame，ORF)，编码396个氨基酸(图2)。

4.黄花蒿花粉新过敏原序列保守性分析

通过多重序列比对，黄花蒿花粉果胶裂合酶Art an pl与其他花粉中的果胶裂解酶(pectate lyase)序列一致性比较见图3，其与艾蒿Art v 6相似度最高，为73％，与其他花粉的果胶裂解酶(pectate lyase)的相似度在45％-67％(表8)。

表8.黄花蒿花粉Art an pl氨基酸序列与其他花粉的果胶裂解酶(pectatelyase)相似度比较

5.蒿属花粉新过敏原诱导表达

经IPTG过夜诱导表达和SDS-PAGE验证Art an pl诱导表达情况(图4A)，结果表明重组蛋白在包涵体表达，分子量为43kDa左右。镍柱纯化后得到高纯度Art an pl蛋白(图4B)。采用透析稀释法进行蛋白复性，通过BCA法测定最终所得重组Art an pl蛋白的浓度为0.7mg/ml。

6.蒿属花粉新过敏原免疫原性分析

6.1酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫印迹实验(Western blot，WB)

ELISA结果显示在200例蒿属过敏患者血清中，90例显示IgE能与Art an pl结合，阳性率为45％。取50例血清对进行WB实验，其中12份血清显示出阳性条带，阳性率为24％，与ELISA结果相比，阳性率明显偏低，表明Art an pl构象表位影响其免疫活性(图5)。

6.2竞争抑制性ELISA

选取ELISA和WB中显示出强阳性信号的血清进行竞争抑制性ELISA，分析重组过敏原对血清中sIgE结合至黄花蒿花粉粗提物上的抑制程度，发现Art an pl在浓度为10^-4μg/ml时达到最大抑制率约为9％(图6)。

6.3间接嗜碱性粒细胞激发试验

通过CD63和CCR3双阳性细胞的比例进一步验证Art an pl蛋白可激发嗜碱性粒细胞，从而释放炎症因子引发过敏反应(图7)。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> 黄花蒿花粉果胶裂合酶及其应用

<130> RYP2010671.7

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 396

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Ile Phe Tyr Phe Val Val Ile Leu Thr Leu Ala Phe Val Ile

1 5 10 15

Val Gly Glu Ala Val Arg Thr Asp Ile Asn Asn Glu Phe Glu Leu Ala

20 25 30

Gln Leu Asn Ser Thr Arg Arg Asp Leu His Glu Cys Gln Ala Asn Asn

35 40 45

Ile Ile Asp Lys Cys Trp Arg Cys Lys Pro Asn Trp Cys Glu Asn Arg

50 55 60

Gln Ala Leu Ala Asn Cys Ala Gln Gly Phe Ala Lys Gly Thr Thr Gly

65 70 75 80

Gly Lys Gly Gly Glu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Pro Ser Asp Asp Asp

85 90 95

Ala Ala Asn Pro Lys Glu Gly Thr Leu Arg Cys Gly Val Thr Lys Asn

100 105 110

Lys Pro Leu Trp Ile Ile Phe Glu Lys Asp Met Val Ile Asn Leu Lys

115 120 125

His Glu Leu Val Ile Gln Cys Asp Lys Thr Ile Asp Gly Arg Gly Ala

130 135 140

Lys Val Glu Ile Thr Gly Ala Gly Leu Thr Leu Met Asn Val Lys Asn

145 150 155 160

Val Ile Ile His Gly Ile His Ile His Asp Ile Val Ala Lys Gly Gly

165 170 175

Gly Met Ile Lys Asn Ser Asp Gly Pro Pro Gly Leu Arg Gln Lys Ser

180 185 190

Asp Gly Asp Gly Ile Cys Val Thr Gly Ser Ser Lys Val Trp Ile Asp

195 200 205

His Cys Thr Leu Ser Asn Ala Phe Asp Gly Leu Ile Asp Val Thr Leu

210 215 220

Lys Ser Ser Phe Ile Thr Ile Ser Asn Cys Lys Phe Thr His His Gln

225 230 235 240

Lys Val Ile Leu Phe Gly Ala Asp Asp Ser His Thr Gln Asp Gln Asp

245 250 255

Met Leu Ala Thr Val Ala Phe Asn Leu Phe Thr Asp Gly Cys Asp Gln

260 265 270

Arg Met Pro Arg Cys Arg His Gly Phe Phe Gln Val Val Asn Asn Asn

275 280 285

Tyr Cys Gly Trp Gly Thr Tyr Ala Ile Gly Gly Ser Ala Lys Pro Thr

290 295 300

Ile Leu Ser Cys Gly Asn Leu Phe Lys Ala Pro Asn Asp Pro Ala Lys

305 310 315 320

Lys Lys Val Leu Val Arg Ala Asp Ala Pro Glu Ser Glu Ser Met Lys

325 330 335

Trp Asn Trp Arg Thr His Lys Asp Lys Leu Glu Asn Gly Ala Ile Phe

340 345 350

Ile Pro Ser Gly Cys Asp Pro Gln Leu Thr Pro Ala Gln Lys Ala Gly

355 360 365

Leu Ile Glu Ala Glu Pro Gly Glu Asn Val Pro Lys Leu Thr Ser Cys

370 375 380

Ala Gly Val Leu Ser Cys Lys Pro Gly Gln Pro Cys

385 390 395

<210> 2

<211> 1191

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggaaattt tttatttcgt tgtgatttta accttagctt ttgttattgt gggggaagct 60

gttcgtactg acataaacaa tgaattcgaa ctggctcaac tgaattcaac aaggcgggac 120

ttacacgaat gtcaagcaaa caacataata gacaagtgtt ggaggtgtaa acccaattgg 180

tgtgaaaacc gacaagcatt agctaactgt gcacaaggtt tcgcaaaggg aaccacaggt 240

ggcaaaggtg gagaaatcta taaggtgacc aatccttcag atgatgatgc tgcaaatcca 300

aaggaaggga cactccgatg tggtgtcacc aaaaataaac cattgtggat catctttgaa 360

aaagatatgg tcatcaattt gaaacatgag cttgttatac aatgtgacaa aacaattgat 420

ggtagaggtg cgaaagttga gatcacaggt gcaggtctca ccctcatgaa tgttaaaaat 480

gtgatcattc atgggataca tattcatgac attgttgcaa aggggggtgg aatgattaag 540

aactccgacg gtccaccagg attgagacaa aagagtgacg gtgatggtat atgcgtcact 600

ggttcatcca aggtatggat cgatcattgc acacttagca acgcctttga tgggctcatt 660

gacgtcacct tgaaaagctc attcattacc atttccaatt gcaaattcac ccatcaccaa 720

aaggtcatat tgtttggggc agacgattca cacactcaag atcaagatat gctagcaact 780

gtcgcattca acctgtttac tgatggatgt gaccaaagaa tgccaaggtg tcgacatggg 840

ttcttccaag ttgttaacaa caattattgc ggatggggga cgtacgccat tggtggtagt 900

gccaaaccta cgatcctcag ctgtggcaac ctatttaagg ctcctaatga ccctgccaag 960

aaaaaggtgt tggtgagggc tgatgcacca gaatcagagt cgatgaagtg gaattggaga 1020

actcataaag acaaacttga aaatggagct attttcatac catctgggtg tgatccgcag 1080

ttaacccctg ctcaaaaggc cggcttgatt gaagcggaac caggagagaa tgttccaaaa 1140

ctaaccagtt gtgctggtgt actctcatgc aaacccggac aaccttgtta a 1191

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaataatcac aaaatggaaa tt 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatgctgatc gattaacaa 19

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taagaaggag atataccatg ggccgtactg acataaacaa t 41

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtggtggtgg tggtgctcga gacaaggttg tccgggtttg 40

Claims

1.黄花蒿花粉果胶裂合酶，其特征在于，所述裂合酶具有：(1)：SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或(2)：在(1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有黄花蒿花粉果胶裂合酶活性的由(1)衍生的酶。

2.编码权利要求1所述裂合酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列具有：(1)：SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或(2)：与(1)的核苷酸序列互补的序列；或(3)：与(1)的核苷酸序列具有95％以上同源性的序列。

3.制备权利要求1所述裂合酶的重组蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：根据权利要求2所述的核苷酸序列设计特异性引物，PCR扩增得到所述裂合酶的基因并克隆到大肠杆菌pET28a表达载体上，再将获得的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21；经IPTG诱导胞内表达，收集菌体经超声破碎后采用亲和层析纯化得到所述裂合酶的重组蛋白。

4.药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的裂合酶。

5.权利要求4所述的药物组合物在制备用于治疗蒿属花粉过敏对象的制剂中的用途；优选地，所述制剂为疫苗。

6.用于检测蒿属花粉过敏原的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的裂合酶或权利要求4所述的药物组合物。

7.权利要求6所述的试剂盒在检测蒿属花粉过敏原中的用途。

8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求2所述的核苷酸序列。

9.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统包含权利要求3所述的表达载体。

10.根据权利要求9所述的表达系统，其特征在于，所述表达系统为感受态细胞，优选大肠杆菌。