PL214225B1

PL214225B1 - Zrekombinowany alergen, zastosowanie zrekombinowanego alergenu, kompozycja farmaceutyczna, sposób przygotowania kompozycji farmaceutycznej, sposób przygotowania zrekombinowanego alergenu, sekwencja DNA kodujaca zrekombinowany alergen, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza oraz sposób produkcji zrekombinowanego zmutowanego alergenu

Info

Publication number: PL214225B1
Application number: PL362273A
Authority: PL
Inventors: Jens Holm; Henrik Ipsen; Larsen Jøergen Nedergaard; Michael Dho Spangfort
Original assignee: Alk Abello As
Priority date: 2000-11-16
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2013-07-31
Also published as: EP1373510A2; DK1373510T3; NO20032213D0; ATE414773T1; HK1060371A1; HUP0302601A3; JP2004521618A; AU2350502A; PL362273A1; EP1373510B1; ES2317955T3; WO2002040676A2; HUP0302601A2; CA2429172C; WO2002040676A3; AU2002223505B2; KR100919914B1; DE60136653D1; CA2429172A1; NO329721B1

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 362273 (22) Data zgłoszenia: 16.11.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

16.11.2001, PCT/DK01/000764 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

23.05.2002, WO02/40676 (11) 214225 (13) B1 (51) Int.Cl.

C12N 15/23 (2006.01) C12N 15/12 (2006.01) C07K 14/415 (2006.01) A61K 39/35 (2006.01) A61P 37/06 (2006.01)

Zrekombinowany alergen, zastosowanie zrekombinowanego alergenu, kompozycja farmaceutyczna, sposób przygotowania kompozycji farmaceutycznej, (54) sposób przygotowania zrekombinowanego alergenu, sekwencja DNA kodująca zrekombinowany alergen, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza oraz sposób produkcji zrekombinowanego zmutowanego alergenu

	(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:	ALK-ABELLÓ A/S, H0rsholm, DK
16.11.2000, DK, PA200001718 16.11.2000, US, 60/249,361
14.06.2001, US, 60/298,170	(72) Twórca(y) wynalazku: JENS HOLM, Fredensborg, DK HENRIK IPSEN, Hiller0d, DK
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	J0ERGEN NEDERGAARD LARSEN,
18.10.2004 BUP 21/04	Grssted, DK MICHAEL DHO SPANGFORT, Viken, SE
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.07.2013 WUP 07/13	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marek Ginter

PL 214 225 B1

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Przedmiotem wynalazku są zrekombinowane alergeny, które są mutantami naturalnie występujących alergenów, a ponadto zastosowanie zrekombinowanego alergenu, kompozycja farmaceutyczna zawierająca zrekombinowany alergen, sposób przygotowania kompozycji farmaceutycznej, sposób przygotowania zrekombinowanych zmutowanych alergenów, sekwencja DNA kodująca zrekombinowany alergen, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza oraz sposób produkcji zrekombinowanego zmutowanego alergenu.

Stan techniki

Osobniki o genetycznych predyspozycjach stają się uczulone (alergiczne) na antygeny pochodzące z szeregu źródeł środowiskowych, na alergeny, na które osobniki te są eksponowane. Reakcja alergiczna zachodzi, gdy uprzednio uczulony osobnik jest ponownie eksponowany na taki sam lub homologiczny alergen. Odpowiedziami alergicznymi mogą być katar sienny, nieżyt nosa, zapalenie błony śluzowej nosa i astma, a nawet ogólnoustrojowa anafilaksja i śmierć, w odpowiedzi, na przykład, na ukąszenie przez pszczołę lub szerszenia albo na ugryzienie przez owada. Reakcja jest natychmiastowa i może być powodowana przez różne alergeny atopowe, takie jak związki pochodzące z traw, drzew, chwastów, owadów, pokarmów, leków, chemikaliów i perfum.

Jednak, odpowiedzi nie występują, gdy osobnik eksponowany jest na alergen po raz pierwszy. Wstępna odpowiedź przystosowawcza zajmuje jakiś czas i zwykle nie powoduje żadnych objawów. Ale gdy przeciwciała i komórki T zdolne do reakcji z alergenem zostają wyprodukowane, każda późniejsza ekspozycja może powodować objawy. Tak więc, odpowiedzi alergiczne wykazują, że sama odpowiedź immunologiczna może powodować znaczące stany patologiczne, które mogą stanowić zagrożenie dla życia.

Przeciwciała biorące udział w alergii atopowej należą głównie do immunoglobulin klasy IgE. IgE wiąże specyficzne receptory na powierzchni komórek tucznych i bazofili. Po wytworzeniu kompleksu specyficznego alergenu z IgE związanym z komórkami tucznymi, połączenie krzyżowe receptorów na powierzchni komórki powoduje sygnalizację przez receptory i odpowiedź fizjologiczną komórek docelowych. Degranulacja powoduje uwolnienie, między innymi, histaminy, heparyny, czynnika chemotaktycznego dla leukocytów kwasochłonnych, leukotrienów C4, D4 i E4, które powodują przedłużone zawężenie komórek mięśni gładkich oskrzeli. Powstałe skutki mogą mieć charakter ogólnoustrojowy lub miejscowy.

Reakcje nadwrażliwości z udziałem przeciwciał mogą być podzielone na cztery klasy, a mianowicie typ I, typ II, typ III i typ IV. Reakcja alergiczna typu I jest klasyczną bezpośrednią reakcją nadwrażliwości zachodzącą w ciągu sekund lub minut po ekspozycji na antygen. W tych objawach bierze udział IgE specyficzny w stosunku do alergenu.

Zwykle, reakcje alergiczne obserwowane są jako odpowiedź na alergeny białkowe występujące, na przykład, w pyłkach, w roztoczach kurzu domowego, we włosach i w łupieżu zwierząt, w truciznach i w produktach spożywczych.

Aby zmniejszyć lub wyeliminować reakcje alergiczne, zazwyczaj stosuje się podawanie szczepionek przeciw alergiom, które są starannie kontrolowane i powtarzane. Szczepienie przeciw alergiom tradycyjnie przeprowadzane jest przez podawanie pozajelitowe, donosowe, lub podjęzykowe w dawkach wzrastających przez całkiem długi okres czasu, i powoduje odczulenie pacjenta. Dokładny mechanizm immunologiczny nie jest znany, ale indukowane różnice w fenotypie komórek T specyficznych względem alergenu uważane są za szczególnie ważne.

Szczepienie przeciw alergiom.

Koncepcja szczepienia oparta jest na dwóch podstawowych cechach układu immunologicznego, a mianowicie na specyficzności i pamięci. Szczepienie jest bodźcem dla układu odpornościowego biorcy, i po powtórzonej ekspozycji na podobne białka układ odpornościowy będzie w stanie odpowiadać bardziej intensywnie na prowokację, na przykład, przez zakażenie mikroorganizmem. Szczepionki są mieszaninami białek przeznaczonymi do użycia w szczepieniu celem uzyskania takiej ochronnej odpowiedzi immunologicznej u biorcy. Ochrona będzie zawierała tylko składniki występujące w szczepionce i w antygenach homologicznych.

W porównaniu z innymi rodzajami szczepień, szczepienie na alergie jest utrudnione przez istnienie będącej w toku odpowiedzi odpornościowej u pacjentów alergicznych. Ta odpowiedź immunologiczna charakteryzowana jest przez obecność specyficznych dla alergenów IgE biorących udział

PL 214 225 B1 w uwalnianiu objawów alergicznych po ekspozycji na alergeny. Tak więc, szczepienie przeciw alergiom wykorzystujące alergeny z naturalnych źródeł powoduje nieodłączne ryzyko efektów ubocznych mogących prowadzić do najgroźniejszej konsekwencji, czyli do zagrożenia życia pacjenta.

Próby rozwiązania tego problemu mogą być podzielone na trzy kategorie. W praktyce często łączy się środki z więcej niż z jednej kategorii. Pierwsza kategoria środków obejmuje podawanie kilku małych dawek przez dłuższy okres czasu, aby osiągnąć znaczącą dawkę skumulowaną. Druga kategoria środków obejmuje fizyczną modyfikację alergenów przez włączenie alergenów do substancji żelowych, takich jak wodorotlenek glinu. Formuły z wodorotlenkiem glinu mają efekt adiuwantu i efekt depotu wolnego uwalniania alergenu zmniejszając stężenie tkankowe aktywnych składników alergenu. Trzecia kategoria środków obejmuje modyfikacje chemiczne alergenów w celu zmniejszenia alergenności, to znaczy wiązania IgE.

Szczegółowy mechanizm leżący u podstaw udanych szczepień na alergię pozostaje kontrowersyjny. Jest jednak zgoda co do tego, że komórki T odgrywają kluczową rolę w ogólnej regulacji odpowiedzi odpornościowych. Według obecnego konsensusu, stosunek między dwiema skrajnościami fenotypów komórek T, Th1 i Th2, określa status alergiczny osobnika. Po stymulacji alergenem, komórki Th1 wydzielają interleukiny dominowane przez interferon-γ prowadząc do odporności ochronnej, a wtedy osobnik jest zdrowy. Z drugiej strony, komórki Th2 wydzielają przede wszystkim interleukinę 4 i 5 prowadząc do syntezy IgE i eozynofilii, a wtedy osobnik jest alergiczny. Badania in vitro wykazały możliwość zmiany odpowiedzi komórek T specyficznych na alergen przez prowokację pochodzącymi od alergenu peptydami zawierającymi odpowiednie epitopy komórek T. Obecne próby nowych szczepionek na alergię są więc w znacznym stopniu oparte na adresowaniu komórek T, przy czym celem jest wyciszenie komórek T (indukcja anergii) lub przesunięcie odpowiedzi z fenotypu Th2 do fenotypu Th1. Epitopy wiążące przeciwciało (epitopy komórek B)

Badania krystalograficzne z promieniami rentgena kompleksów Fab - antygen zwiększyły zrozumienie epitopów wiążących przeciwciało. Według tego rodzaju badania, epitopy wiążące przeciwciało mogą być definiowane jako część powierzchni antygenu obejmująca atomy z reszt 15-25 aminokwasów, które pozostają w pewnej odległości od atomów przeciwciała pozwalającego na bezpośrednią interakcję. Powinowactwo interakcji antygen-przeciwciało nie może być przewidziane tylko z entalpii spowodowanej przez interakcje van der Waalsa, wiązania wodorowe lub wiązania jonowe. Entropia związana z nieomal całkowitym wyrzuceniem cząsteczek wody ze styku przedstawia wkład energii podobnej pod względem wielkości. Oznacza to, że doskonałe dopasowanie między konturami wzajemnie oddziałujących cząsteczek jest głównym czynnikiem leżącym u podstaw interakcji wysokiego powinowactwa antygen-przeciwciało.

W WO 97/30150 (publ. 1) zastrzegana jest populacja cząsteczek białek, które to cząsteczki białek mają rozkład specyficznych mutacji w sekwencji aminokwasów w stosunku do białek rodzicielskich. Z opisu widać, że wynalazek dotyczy produkcji analogów, które modyfikowane są w stosunku do białek rodzicielskich, ale które są pobierane, trawione i prezentowane komórkom T w taki sam sposób jak białko rodzicielskie (naturalnie występujące alergeny). Tym samym, uzyskiwana jest zmodyfikowana odpowiedź komórek T. Biblioteki zmodyfikowanych białek przygotowuje się stosując technikę określaną jako PM (Parsimonious Mutagenesis - oszczędna mutageneza).

W WO 92/02621 (publ. 2) opisane są zrekombinowane cząsteczki DNA, które to cząsteczki zawierają DNA kodujące polipeptyd mający co najmniej jeden epitop alergenu z drzew z rzędu Fagales, który to alergen wybrany jest spośród Aln g 1, Cor a 1 i Bet v 1. Wszystkie opisane tu zrekombinowane cząsteczki mają sekwencję aminokwasów albo część sekwencji aminokwasów, która odpowiada sekwencji naturalnie występującego alergenu.

WO 90/11293 (publ. 3) dotyczy, między innymi, izolowanych peptydów alergenicznych pyłku ambrozji i modyfikowanych peptydów pyłku ambrozji. Peptydy ujawnione w tej publikacji mają sekwencję aminokwasów odpowiadającą, albo sekwencji naturalnie występującego alergenu, albo jego naturalnie występujących izoform.

Chemiczna modyfikacja alergenów

Dokonano kilku prób w zakresie chemicznej modyfikacji alergenów. Próby we wczesnych latach siedemdziesiątych obejmują chemiczne łączenie alergenów z polimerami, i chemiczne sieciowanie alergenów stosując formaldehyd, itd. produkując tak zwane „alergoidy”. Zamysłem, na którym oparto te próby, było losowe niszczenie epitopów wiążących IgE przez przyłączenie ligandu chemicznego, w ten sposób zmniejszając wiązanie IgE przy zachowaniu immunogenności przez zwiększoną masę cząsteczkową kompleksów. Nieodłączne wady produkcji „alergoidów” związane są z trudnościami

PL 214 225 B1 w kontroli procesu chemicznego sieciowania i trudnościami w analizie i w standaryzacji powstałych kompleksów o wysokiej masie cząsteczkowej. „Alergoidy” są obecnie stosowane klinicznie i ze względu na losowe niszczenie epitopów wiążących IgE mogą być podawane wyższe dawki w porównaniu ze szczepionkami konwencjonalnymi, ale parametry bezpieczeństwa i skuteczności nie są poprawiane w stosunku do stosowania szczepionek konwencjonalnych.

Nieodległe próby modyfikacji chemicznej alergenów mają na celu całkowitą dysrupcję trzeciorzędowej struktury alergenu, eliminując w ten sposób wiązanie IgE zakładając, że niezbędny cel terapeutyczny jest komórką T specyficzną względem alergenu. Takie szczepionki zawierają peptydy syntetyczne pochodzące z sekwencji alergenu reprezentujące minimalne epitopy komórek T, dłuższe peptydy reprezentujące połączone epitopy komórek T, syntetyczne peptydy pochodzące od dłuższych sekwencji alergenów reprezentujące regiony immunodominujących epitopów komórek T, lub cząsteczki alergenu przecięte na dwie połowy za pomocą technik rekombinacji. Inną próbą opartą na tym rozumowaniu było zaproponowanie stosowania izoform zrekombinowanych o „niskim wiązaniu IgE”. W ostatnich latach stało się jasne, że naturalne alergeny są heterogenne, zawierają izoalergeny i warianty mające podstawione aż do około 25% swoich aminokwasów. Niektóre zrekombinowane izoalergeny okazały się być mniej wydajne w wiązaniu IgE, być może ze względu na nieodwracalną denaturację i stąd całkowitą dysrupcję struktury trzeciorzędowej.

Mutageneza in vitro i szczepienia przeciw alergiom

Próby zmniejszania alergenności za pomocą mutagenezy ukierunkowanej in vitro wykonane były przy wykorzystaniu kilku alergenów obejmujących Der f2 (Takai i wsp., publ. 4), Der p 2 (Smith i wsp., publ. 5), alergen 39 kDa Dermatophagoides farinae (Aki i wsp., publ. 6), fosfolipazę A2 jadu pszczoły (Forster i wsp., publ. 7), Ara h 1 (Burks i wsp., publ. 8), Ara h 2 (Stanley i wsp., publ. 9), Bet v 1 (Ferreira i wsp., publ. 10 i publ. 11), profilinę brzozy (Wiedemann i wsp., publ. 12) i Ory s 1 (Alvarez i wsp., publ. 13).

Rozumowaniem, na którym oparte były te próby, ponownie, jest adresowanie komórek T specyficznych względem alergenu, zarazem zmniejszając ryzyko efektów ubocznych z udziałem IgE przez zmniejszenie lub wyeliminowanie wiązania IgE przez dysrupcję trzeciorzędowej struktury zrekombinowanego zmutowanego alergenu. Rozumowanie, na którym oparte były te próby nie obejmuje koncepcji dominujących epitopów wiążących IgE i nie obejmuje koncepcji inicjacji nowej ochronnej odpowiedzi immunologicznej, która także obejmuje komórki B i generację przeciwciał.

Praca Ferreira i wsp. (publ. 11) opisuje zastosowanie mutagenezy ukierunkowanej w celu zmniejszenia wiązania IgE. Choć trójwymiarowa struktura Bet v 1 wymieniana jest w tej pracy, autorzy nie stosują tej struktury do przewidywania eksponowanych na rozpuszczalnik reszt aminokwasów do mutowania, z których połowa ma niski stopień ekspozycji na rozpuszczalnik. Stosują oni raczej metodę opracowaną dla przewidywania reszt funkcjonalnych w białkach inną niż koncepcja struktury opartej na identyfikacji konserwowanych obszarów powierzchni tu opisanej. Chociaż autorzy omawiają zachowanie struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla, to ta koncepcja nie jest częścią strategii terapeutycznej, ale jest ona włączona tylko po to, aby ocenić wiązanie IgE in vitro. Ponadto, dostarczane dowody nie są odpowiednie, ponieważ normalizacja widm CD uniemożliwia ocenę denaturacji części próbki, co jest powszechnym problemem. Nie jest omawiana strategia terapeutyczna mająca na celu indukowanie tolerancji w specyficznych komórkach T alergenu i inicjację nowej odpowiedzi immunologicznej.

Praca autorstwa Wiedemann i wsp. (publ. 12) opisuje zastosowanie mutagenezy ukierunkowanej i syntezy peptydów w celu scharakteryzowania epitopu przeciwciał monoklonalnych. Autorzy wiedzą o trzeciorzędowej strukturze antygenu i stosują tę wiedzę w celu wybrania aminokwasu eksponowanego na powierzchni do mutacji. Stosowany algorytm może być uznany za przeciwny w stosunku do tego opisanego przez obecnych wynalazców jako, że wybrany jest aminokwas różniący się od sekwencji homologicznych. Badania wykazują, że podstawienie aminokwasu eksponowanego na powierzchni ma zdolność modyfikowania właściwości wiązania przeciwciała monoklonalnego, co nie jest zadziwiające biorąc pod uwagę powszechną wiedzę. Opisane doświadczenia nie są zaprojektowane dla oceny modulacji wiązania przeciwciał poliklonalnych, takich jak IgE surowicy alergicznych pacjentów. Jedno z zawartych doświadczeń stosuje IgE surowicy i chociaż to doświadczenie nie jest odpowiednie do oceny ilościowej, dokonane mutacje nie wydają się wpływać na wiązanie IgE.

Praca Smith i wsp. (publ. 5) opisuje stosowanie mutagenezy ukierunkowanej w celu mapowania epitopów przeciwciała monoklonalnego i redukcji wiązania IgE. Autorzy nie znają struktury trzeciorzędowej i nie czynią żadnych prób oceny konserwacji struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla. StoPL 214 225 B1 sowany algorytm nie zapewnia, że aminokwasy wybrane do mutacji są faktycznie eksponowane na powierzchni cząsteczki. Tylko jeden z opisanych mutantów prowadzi do znaczącego zmniejszenia wiązania IgE. Ten mutant jest niedoskonały w wiązaniu wszystkich testowanych przeciwciał wskazując, że struktura trzeciorzędowa jest zaburzona. Autorzy nie określają strategii terapeutycznej i nie nadmieniają o inicjacji nowej odpowiedzi immunologicznej.

Praca Colombo i wsp. (publ. 14) opisuje badanie epitopu wiążącego IgE przez stosowanie mutagenezy ukierunkowanej i syntezy peptydów. Autorzy stosują trójwymiarowy model komputerowy struktury oparty na strukturze kryształu białka homologicznego, aby zilustrować obecność epitopu na powierzchni cząsteczki. Dalsza obecność epitopu na innym alergenie wykazującym homologię struktury pierwszorzędowej adresowana jest przez zastosowanie syntetycznych peptydów reprezentujących epitop. Strategia terapeutyczna oparta jest na traktowaniu stosującym ten syntetyczny peptyd reprezentujący monowalencyjny epitop wiążący IgE. Konserwowane obszary powierzchni między homologicznymi alergenami jak i terapeutyczna koncepcja inicjacji nowej ochronnej odpowiedzi immunologicznej nie są omawiane.

Praca Spangfort i wsp. (publ. 15) opisuje trójwymiarową strukturę oraz konserwowane grupy eksponowane na powierzchni głównego alergenu brzozy. Praca nie wymienia głównych epitopów wiążących IgE, ani mutagenezy ukierunkowanej, ani też nie jest podawane zastosowanie terapeutyczne.

W żadnych z opisanych powyżej badań wiązanie IgE nie jest obniżane przez podstawienie aminokwasów eksponowanych na powierzchni przy zachowaniu struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla. Rozumowanie, na którym opierają się próby wymienione powyżej nie obejmuje koncepcji dominujących epitopów wiążących IgE i nie obejmuje koncepcji terapeutycznej inicjowania nowej ochronnej odpowiedzi immunologicznej.

WO 99/47680 ujawnia wprowadzanie syntetycznych podstawień aminokwasów do zdefiniowanych krytycznych pozycji podczas utrzymywania struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla alergenu. W szczególności, publikacja WO 99/47680 ujawnia zrekombinowany alergen, który jest nienaturalnie występującym mutantem pochodzącym z naturalnie występującego alergenu, gdzie co najmniej jedna eksponowana na powierzchni, konserwowana reszta aminokwasu epitopu komórki B podstawiona jest przez inną resztę, która nie występuje w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów dowolnego znanego białka homologicznego w obrębie rzędu taksonomicznego, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen, przy czym ten zmutowany alergen ma zasadniczo taką samą strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla, jak ten naturalnie występujący alergen, a specyficzne wiązanie IgE do zmutowanego alergenu zmniejszone jest w porównaniu z wiązaniem tego naturalnie występującego alergenu.

Zrekombinowany alergen ujawniony w publikacji WO 99/47680 jest do uzyskania przez a) identyfikację reszt aminokwasów w naturalnie występującym alergenie, które konserwowane są z identycznością większą od 70% we wszystkich znanych białkach homologicznych w obrębie rzędu taksonomicznego, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen; b) zdefiniowanie co najmniej jednej grupy konserwowanych reszt aminokwasów, które połączone są spójnie na co najmniej 400 A²powierzchni trójwymiarowej cząsteczki alergenu, co jest zdefiniowane przez posiadanie dostępności dla rozpuszczalnika co najmniej 20%, przy czym ta co najmniej jedna grupa obejmuje co najmniej jeden epitop komórek B; i c) podstawienie co najmniej jednej reszty aminokwasu w tej co najmniej jednej grupie przez inny aminokwas, który jest niekonserwowany w danej pozycji, podczas gdy zasadniczo zachowuje ogólną strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla cząsteczki alergenu.

Krótki opis figur

Fig. 1 przedstawia startery oligonukleotydowe specyficzne dla mutanta stosowane dla mutanta Bet v 1 numer 1. Zmutowane nukleotydy podkreślono.

Fig. 2 przedstawia dwa startery do ogólnego stosowania (określone jako „cały sensowny” i „cały nonsensowny”), które były syntetyzowane i stosowane do wszystkich mutantów.

Fig. 3 przedstawia sekwencję DNA i aminokwasów naturalnie występującego alergenu Bet v 1 jak również szereg mutacji Bet v 1.

Fig. 4 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1 Glu45Ser.

Fig. 5 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1

Asn28Thr+Lys32Gln.

PL 214 225 B1

Fig. 6 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1 Pro108Gly.

Fig. 7 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1 Glu60Ser.

Fig. 8 przedstawia widmo CD zrekombinowanego i mutanta potrójnej grupy, zapisane w prawie równych stężeniach.

Fig. 9 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE surowicy z puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Bet v 1 trzech grup.

Fig. 10 przedstawia dostępność dla rozpuszczalnika indywidualnie porównanych reszt antygenu 5 i porównanie sekwencji antygenu 5 Vespula (panel lewy). Na prawym panelu fig. 10 przedstawiono powierzchnię cząsteczki antygenu 5 z konserwowanymi obszarami wśród antygenu 5:s Vespula.

Fig. 11 przedstawia sekwencję startera odpowiadającego amino końcowi Ves v 5 pochodzącego z nici sensownej. Sekwencja startera poniżej pochodzi od nici nonsensownej.

Fig. 12 przedstawia dwa startery do ogólnego stosowania (określone jako „cały sensowny” i „cały nonsensowny”), które były syntetyzowane i stosowane do wszystkich mutantów.

Fig. 13 przedstawia sekwencję DNA i aminokwasów dwóch naturalnie występujących alergenów Ves v 5, jak również dwóch mutacji Ves v 5.

Fig. 14 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Ves v 5 do IgE surowicy z puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Ves v 5 i przez mutanta Ves v 5 Lys72Ala.

Fig. 15 przedstawia teoretyczny model reakcji między alergenem i komórkami tucznymi za pomocą wiązania krzyżowego IgE.

Fig. 16 przedstawia sekwencję DNA i aminokwasów naturalnie występującego alergenu Der p 2.

Fig. 17 przedstawia schematycznie startery stosowane do wytworzenia mutacji. (I) przedstawia startery sensowne i antysensowne. (II) przedstawia ostateczne białko zrekombinowane niosące mutacje we wskazanych pozycjach.

Fig. 18 przedstawia ilustrację konstrukcji mutantów Bet v 1 i listę stosowanych starterów. Mutanty zawierają od pięciu do dziewięciu aminokwasów.

Fig. 19 przedstawia wprowadzone mutacje punktowe na powierzchni Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637). W mutancie Bet v 1 (2628) wprowadzono pięć mutacji pierwotnych w jednej połowie Bet v 1 pozostawiając drugą połowę niezmienioną. W mutancie Bet v 1 (2637) wprowadzono pięć pierwotnych i trzy wtórne mutacje w drugiej połowie, pozostawiając pierwszą połowę niezmienioną.

Fig. 20 przedstawia widmo dichroizmu kołowego zrekombinowanego Bet v 1.2801 (typ dziki) i mutanta Bet v 1 (2637) zapisane przy prawie identycznych stężeniach.

Fig. 21 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1.2801 (typ dziki) do IgE surowicy z puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1.2801 i przez Bet v 1 (2628), Bet v 1 (2637), i mieszaninę 1:1 Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637).

Fig. 22 przedstawia uwalnianie histaminy w ludzkich komórkach bazofili dla Bet v 1.2801 (typ dziki), Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637).

Fig. 23 przedstawia uwalnianie histaminy w ludzkich komórkach bazofili Bet v 1.2801 (typ dziki), Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637).

Fig. 24 przedstawia mutacje punktowe na powierzchni Bet v 1 (2744).

Fig. 25 przedstawia mutacje punktowe na powierzchni Bet v 1 (2753).

Fig. 26 przedstawia mutacje punktowe na powierzchni Bet v 1 (2744) i Bet v 1 (2753).

Fig. 27 przedstawia widmo dichroizmu kołowego zrekombinowanego Bet v 1.2801 (typ dziki) i Bet v 1 (2744), zapisane przy prawie równych stężeniach.

Fig. 28 przedstawia uwalnianie histaminy w ludzkich komórkach bazofili dla Bet v 1.2801 (typ dziki) i mutanta Bet v 1 (2744).

Fig. 29 przedstawia uwalnianie histaminy w ludzkich komórkach bazofili dla Bet v 1.2801 (typ dziki) i mutanta Bet v 1 (2744).

Fig. 30 przedstawia mutacje punktowe na powierzchni Bet v 1 (2733).

Fig. 31 przedstawia startery stosowane do mutagenezy ukierunkowanej Der p 2.

Fig. 32 przedstawia porównanie sekwencji Der p 2 z innymi alergenami roztoczy kurzu domowego grupy 2.

Fig. 33 przedstawia kontury powierzchni Der p 2 z czterech różnych kątów.

Fig. 34 przedstawia kontury powierzchni mutanta Der p 2 z czterech różnych kątów.

PL 214 225 B1

Fig. 35A i B przedstawia porównanie sekwencji Der p 1 z innymi alergenami roztoczy kurzu domowego grupy 1.

Fig. 36 przedstawia kontury powierzchni Der p 1 z czterech różnych kątów.

Fig. 37 przedstawia kontury powierzchni mutanta Der p 1 z czterech różnych kątów.

Fig. 38A-D przedstawiają porównanie sekwencji Phl p 5 z innymi alergenami trawy grupy 5.

Fig. 39A i B przedstawia kontury powierzchni, odpowiednio, Phl p 5 Model A i Model B, z czterech różnych kątów.

Fig. 40A i B przedstawia kontury powierzchni, odpowiednio, mutanta Phl p 5 Model A i Model B z czterech różnych kątów.

Fig. 41 przedstawia proliferację Limfocytów Krwi Obwodowej wyrażanych jako Indeks Stymulacji (SI) dla różnych preparatów Bet v 1.

Fig. 42-44 przedstawiają profil cytokin komórek T stymulowanych różnymi preparatami Bet v. Figura 42 przedstawia pacjenta z profilem Th0, fig. 43 - profil Th1, a fig. 44 - profil Th2.

Cel wynalazku

Niniejszy wynalazek oparty jest na unikalnym rozumowaniu. Według tego rozumowania, mechanizm udanego szczepienia przeciw alergiom nie jest zmianą będącej w toku odpowiedzi immunologicznej typu Th2, ale raczej równoległą inicjacją nowej odpowiedzi immunologicznej obejmującej rozpoznanie trzeciorzędowych epitopów przez komórki B i wytwarzanie przeciwciał. Uważa się, że ta nowa odpowiedź immunologiczna jest częściowo odpowiedzią immunologiczną typu Th1. Model ten opiera się na obserwacji, że na poziomy specyficznych IgE nie wpływa udane szczepienie, i że udanej terapii często towarzyszy znaczące podwyższenie specyficznych dla alergenu IgG4. Dodatkowo, badania biopsji nosa przed i po prowokacji alergenem nie wykazują obniżenia komórek T z fenotypem Th2-podobnym, ale raczej obserwuje się przyrost komórek T Th1-podobnych. Gdy szczepionka (lub kompozycje farmaceutyczne) podawana jest inną drogą niż przez drogi oddechowe, przypuszcza się, że nowa odpowiedź immunologiczna ewoluuje w miejscu fizycznie oddzielonym od będącej w toku odpowiedzi Th2, tym samym pozwalając na równoległe występowanie dwóch odpowiedzi.

Inny ważny aspekt układu immunologicznego to potwierdzenie istnienia tak zwanych dominujących epitopów wiążących IgE. Proponuje się, że te dominujące epitopy wiążące IgE są utworzone ze spójnych obszarów powierzchni zależnej struktury trzeciorzędowej dostatecznie dużych, aby zmieścić wiązanie przeciwciała, i konserwowane wśród izoalergenów, wariantów i/lub alergenów homologicznych z pokrewnych gatunków. Istnienie reagującego krzyżowego IgE zdolnego do wiązania podobnych epitopów na alergenach homologicznych opiera się na obserwacji klinicznej, że pacjenci alergiczni często reagują na kilka blisko spokrewnionych gatunków, na przykład, na olchę, brzozę i leszczynę, na wiele gatunków traw, lub kilka gatunków z rodzaju roztocza kurzu domowego Dermatophagoides. Ponadto, oparte jest ono na doświadczeniach laboratoryjnych wykazujących reaktywność krzyżową IgE między alergenami homologicznymi z pokrewnych gatunków a zdolnością jednego alergenu do inhibicji wiązania IgE do alergenów homologicznych (Ipsen i wsp., 1992, publ. 16). Wiadomym jest, że ekspozycja i odpowiedzi immunologiczne związane są w sposób zależny od dawki. Bazując na kombinacji tych obserwacji, przypuszcza się, że konserwowane obszary powierzchni eksponowane są na układ immunologiczny w wyższych dawkach niż niekonserwowane obszary powierzchni ze skutkiem wytworzenia przeciwciał IgE z wyższymi powinowactwami, i stąd występujące określenie „dominujące epitopy wiążące IgE”.

Według tego rozumowania, istotne jest, aby alergen miał strukturę trzeciorzędowego szkieletu α-węgla, który zasadniczo jest taki sam, jak naturalnego alergenu, tym samym zapewniając konserwację topologii powierzchni obszarów otaczających konserwowane grupy reprezentujące cele dla mutagenezy mającej na celu zmniejszenie wiązania IgE. Przez spełnienie tych kryteriów alergen można podawać w stosunkowo wyższych dawkach poprawiając jego skuteczność w generowaniu ochronnej odpowiedzi immunologicznej bez uszczerbku dla bezpieczeństwa.

Co więcej, wynalazek oparty jest na odkryciu, że objawy alergiczne wywoływane są przez połączenie krzyżowe alergenu z dwoma specyficznymi IgE związanymi z powierzchnią komórek efektorowych, to znaczy komórek tucznych i bazofili poprzez receptor IgE wysokiego powinowactwa, FceRI. Dla ilustracji, nawiązuje się do fig. 15, która przedstawia model teoretyczny alergenu z epitopami wiążącymi IgE. Indukcja uwalniania mediatora z komórki tucznej, a stąd objawy alergiczne, przeprowadzana jest przez połączenie krzyżowe z udziałem alergenu IgE związanego do powierzchni komórki tucznej, por. fig. 15A. W sytuacji przedstawionej na fig. 15B dwa z epitopów zostały zmutowane tak, aby obniżyć swoją zdolność wiązania IgE, i tym samym zapobiec wiązaniu krzyżowemu z udziałem

PL 214 225 B1 alergenu. W związku z tym, należy zauważyć, że alergeny na ogół zawierają więcej niż trzy epitopy komórek B. Jednak, z sytuacji teoretycznej przedstawionej na fig. 15 można założyć, że im więcej epitopów, które zmutowano, aby wyeliminować lub zmniejszyć ich zdolność wiązania IgE, tym niższe ryzyko połączenia krzyżowego z udziałem alergenu i powstających w efekcie objawów alergicznych.

Jednak po to, aby zmutowany alergen był zdolny do podniesienia odpowiedzi immunologicznej, w tym odpowiedzi IgG, alergen musi zawierać co najmniej jeden nienaruszony epitop. Korzystnie, nienaruszony epitop jest dominującym epitopem, ponieważ taki zmutowany alergen zapewnia zwiększoną ochronę, gdy stosowany jest do szczepienia.

W efekcie, idea wynalazcza niniejszego wynalazku oparta jest na rozpoznaniu, że zmutowany alergen mający mutacje zmniejszające wiązanie IgE w wielu epitopach komórek B, i co najmniej jeden nienaruszony epitop, z jednej strony, zmniejsza wiązanie krzyżowe związane z alergenem i, z drugiej strony, pozwala na wywołanie odpowiedzi IgG ze zdolnością wiązania współzawodniczącą z tą dla IgE. Tak więc, ten zmutowany alergen tworzy wysoce korzystny alergen, przez co ryzyko reakcji anafilaktycznych pozostaje silnie zmniejszone.

Niniejszy wynalazek oparty jest także na rozpoznaniu, że szczepionka zawierająca mieszaninę różnych takich zmutowanych alergenów, gdzie idealnie wiele lub wszystkie epitopy występują jako nienaruszone, jest równie skuteczna w swej zdolności do indukowania ochrony przeciwko alergicznym objawom jak naturalnie występujący alergen, z którego pochodzą alergeny zmutowane.

Istota wynalazku

Zgodnie z wynalazkiem, zrekombinowany alergen, który jest mutantem naturalnie występującego alergenu, w którym ten zmutowany alergen ma 5 do 20 mutacji, z których każda obniża zdolność wiązania specyficznego IgE zmutowanego alergenu w porównaniu ze zdolnością wiązania IgE tego naturalnie występującego alergenu o co najmniej 5% w co najmniej jednym immunooznaczeniu stosując surowicę od osobnika alergicznego na naturalnie występujący alergen lub jego pule, w którym każda mutacja jest podstawieniem jednej eksponowanej na powierzchni reszty aminokwasowej inną resztą, gdzie ta eksponowana na powierzchni reszta aminokwasowa ma dostępność dla rozpuszczalnika ponad 20%, przy czym odchylenie średnie kwadratowe współrzędnych atomowych struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla tego zmutowanego alergenu i tego naturalnie występującego alergenu wynosi poniżej 2 A, i który daje nie konserwatywne podstawienie reszty w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów dowolnego znanego białka homologicznego w gatunku taksonomicznym, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen, charakteryzuje się tym, że 5 do 20 mutacji (mutacji pierwotnych) jest oddalonych od siebie o co najmniej 15 A, przy czym te mutacje pierwotne umieszczone są w taki sposób, że co najmniej jeden kolisty obszar powierzchniowy z obszarem 800 A² pozbawiony jest mutacji.

Korzystnie, mutacje pierwotne rozmieszczone są w odstępach 20 A, korzystniej 25 A, a najkorzystniej 30 A.

Korzystnie, zrekombinowany alergen w dodatku do 5 do 20 mutacji pierwotnych, zawiera co najmniej jedną dodatkową mutację (mutację drugorzędową), która oddalona jest mniej niż 15 A od dowolnej mutacji pierwotnej, przy czym każda mutacja drugorzędowa obniża zdolność wiązania specyficznego IgE zmutowanego alergenu w porównaniu ze zdolnością wiązania tego naturalnie występującego alergenu o co najmniej 5% w co najmniej jednym immunooznaczeniu stosując surowicę od osobnika alergicznego na naturalnie występujący alergen lub jego pule, w którym każda mutacja drugorzędową jest podstawieniem jednej eksponowanej na powierzchni reszty aminokwasowej inną resztą, gdzie ta eksponowana na powierzchni reszta aminokwasowa ma dostępność dla rozpuszczalnika ponad 20%, przy czym odchylenie średnie kwadratowe współrzędnych atomowych struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla tego zmutowanego alergenu i tego naturalnie występującego alergenu wynosi poniżej 2 A, i który daje nie konserwatywne podstawienie reszty w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów dowolnego znanego białka homologicznego w gatunku taksonomicznym, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen, przy czym te mutacje drugorzędowe umieszczone są poza wymienionym kolistym obszarem powierzchniowym.

Korzystnie, co najmniej jeden z eksponowanych na powierzchni aminokwasów, które mają być podstawione w naturalnie występującym alergenie ma dostępność dla rozpuszczalnika ponad 30%, korzystniej ponad 40%, a najkorzystniej ponad 50%.

Korzystnie, co najmniej jeden z eksponowanych na powierzchni aminokwasów, które mają być podstawione w naturalnie występującym alergenie jest konserwowany z więcej niż 70%, korzystnie

PL 214 225 B1 więcej niż 80%, a najkorzystniej więcej niż 90% identyczności we wszystkich znanych białkach homologicznych w obrębie gatunku, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen.

Korzystnie, każda reszta aminokwasowa, która ma być włączona do zmutowanego alergenu nie występuje w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów dowolnego znanego białka h omologicznego w obrębie rodzaju taksonomicznego, korzystnie podrodziny, bardziej korzystnie rodziny, jeszcze bardziej korzystnie nadrodziny, bardziej korzystnie legionu, bardziej korzystnie podrzędu, a najbardziej korzystnie rzędu, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen.

Korzystnie, wiązanie specyficznego IgE do zmutowanego alergenu jest zmniejszone o co najmniej 10%.

Korzystnie, wymieniony kolisty obszar powierzchniowy obejmuje atomy 15-25 reszt aminokwasowych.

Korzystnie, eksponowane na powierzchni reszty aminokwasowe szeregowane są względem dostępności dla rozpuszczalnika, i że podstawiony jest jeden lub więcej aminokwasów wśród aminokwasów bardziej dostępnych dla rozpuszczalnika.

Korzystnie, eksponowane na powierzchni reszty aminokwasowe szeregowane są względem stopnia konserwacji we wszystkich znanych białkach homologicznych w gatunku, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen, i że podstawiony jest jeden lub więcej aminokwasów wśród aminokwasów bardziej konserwowanych.

Korzystnie, zmutowany alergen nie jest naturalnie występującym alergenem.

Korzystnie, zrekombinowany alergen zawiera od 6 do 15, korzystniej od 7 do 12, a najkorzystniej od 8 do 10 mutacji pierwotnych.

Korzystnie, zmutowany alergen zawiera od 1 do 4 mutacji drugorzędowych na mutację pierwotną.

Korzystnie, jedno lub więcej z podstawień przeprowadzane jest za pomocą mutagenezy ukierunkowanej.

Korzystnie, jedno lub więcej z podstawień jest przeprowadzane przez tasowanie DNA.

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem alergenu inhalacyjnego.

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem alergenu pyłku.

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem alergenu pyłku z rzędu taksonomicznego

Fagales, Oleales lub Pinales.

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem Bet v 1.

Korzystnie, jedno lub więcej podstawień wybranych jest z grupy złożonej z: V2, E87, K-129,

E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, I-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87 i E-73.

Korzystnie, jedno lub więcej podstawień wybranych jest z grupy złożonej z: V2, D72, E87,

K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, I-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87 i E-73.

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem alergenu pyłku pochodzącego z rzędu taksonomicznego Poales.

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem alergenu pyłku pochodzącego z rzędu taksonomicznego Asterales lub Urticales.

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem alergenu roztocza kurzu domowego.

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem alergenu roztocza pochodzącego od Dermatophagoides.

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem alergenu karalucha.

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem alergenu zwierzęcego.

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem alergenu zwierzęcego pochodzącego od kota, psa lub konia.

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem alergenu jadu.

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem alergenu jadu pochodzącego z rzędu taksonomicznego Hymenoptera.

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem alergenu jadu z rzędu taksonomicznego

Vespidae, Apidae i Formicoidae.

PL 214 225 B1

Korzystnie, zrekombinowany alergen jest mutantem Ves v 5.

Korzystnie, jedno lub więcej podstawień wybranych jest z grupy złożonej z: K-16, K-185, K-11, K-44, K-210, R-63, K-13, F-6, K-149, K-128, E-184, K-112, F-157, E-3, K-29, N-203, N-34, K-78, K-151, L-15, L-158, Y-102, W-186, K-134, D-87, K-52, T-67, T-125, K-150, Y-40, Q-48, L-65, K-81, Q-101, Q-208, K-144, N-8, N-70, H-104, Q-45, K-137, K-159, E-205, N-82, A-111, D-131, K-24, V-36, N-7, M-138, T-209, V-84, K-172, V-19, D-56, P-73, G-33, T-106, N-170, L-28, T-43, Q-114, C-10, K-60, N-31, K-47, E-5, D-145, V-38, A-127, D-156, E-204, P-71, G-26, Y-129, D-141, F-201, R-68, N-200, D-49, S-153, K-35, S-39, Y-25, V-37, G-18, W-85 i 1-182.

Korzystnie, zrekombinowany alergen określony powyżej stosuje się jako lek.

Wynalazek obejmuje także zastosowanie zrekombinowanego alergenu określonego powyżej, do przygotowania leku do zapobiegania i/lub do leczenia alergii.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, która charakteryzuje się tym, że zawiera zrekombinowany alergen określony powyżej w zakresie od 0,0001 ąm do 1000 ąm oraz, że jest w postaci szczepionki przeciwko reakcjom alergicznym wywoływanym przez naturalnie występujący alergen u pacjentów cierpiących na alergię, i że ponadto zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub zaróbkę wybrane z wody, roztworu soli, dekstrozy, glicerolu, etanolu, mannitu, laktozy, skrobi, stearynianu magnezu, sacharyny sodowej, celulozy, węglanu magnezu i ich kombinacji, oraz adiuwantu wybranego z wodorotlenku glinu, fosforanu glinu, fosforanu wapnia, komórek bakterii, endotoksyn bakterii Gram-ujemnych lub lipopolisacharydu, emulsji olejowej, adiuwantu Freunda całkowitego i niecałkowitego; i adiuwantu saponinowego.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób otrzymywania kompozycji farmaceutycznej określonej powyżej, który charakteryzuje się tym, że obejmuje zmieszanie zrekombinowanego alergenu określonego powyżej w zakresie od 0,0001 ąm do 1000 ąm z farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami i/lub zarobkami wybranymi z wody, roztworu soli, dekstrozy, glicerolu, etanolu, mannitu, laktozy, skrobi, stearynianu magnezu, sacharyny sodowej, celulozy, węglanu magnezu i ich kombinacji, oraz adiuwantu wybranego z wodorotlenku glinu, fosforanu glinu, fosforanu wapnia, komórek bakterii, endotoksyn bakterii Gram-ujemnych lub lipopolisacharydu, emulsji olejowej, adiuwantu Freunda całkowitego i niecałkowitego; i adiuwantu saponinowego.

Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej, charakteryzującej się tym, że jest otrzymywana za pomocą sposobu określonego powyżej.

Z kolei, sposób otrzymywania zrekombinowanego alergenu określonego powyżej, charakteryzuje się tym, że

a) identyfikuje się szereg reszt aminokwasowych w naturalnie występującym alergenie, który ma dostępność dla rozpuszczalnika co najmniej 20%;

b) wybiera się 5 do 20 ze zidentyfikowanych reszt aminokwasowych w taki sposób, że każdy wybrany aminokwas oddalony jest od innych wybranych aminokwasów co najmniej 15 A, i że wybrane aminokwasy umieszczone są w taki sposób, że co najmniej jeden kolisty obszar powierzchniowy z obszarem 800 A² nie zawiera żadnego wybranego aminokwasu; oraz

c) wykonuje się dla każdego z wybranych aminokwasów mutację pierwotną, która obniża zdolność wiązania specyficznego IgE zmutowanego alergenu w porównaniu ze zdolnością wiązania tego naturalnie występującego alergenu o co najmniej 5% w co najmniej jednym immunooznaczeniu stosując surowicę od osobnika alergicznego na naturalnie występujący alergen, gdzie każda mutacja pierwotna jest podstawieniem wybranej reszty aminokwasowej przez inny aminokwas, przy czym odchylenie średnie kwadratowe współrzędnych atomowych struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla tego zmutowanego alergenu i tego naturalnie występującego alergenu wynosi poniżej 2 A, i który daje nie konserwatywne podstawienie reszty w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów dowolnego znanego białka homologicznego w gatunku taksonomicznym, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen.

Korzystnie, w sposobie tym szereguje się reszty aminokwasowe względem dostępności dla rozpuszczalnika, i podstawia się jeden lub więcej aminokwasów spośród tych bardziej dostępnych dla rozpuszczalnika.

Korzystnie, wybiera się zidentyfikowane reszty aminokwasowe, które są konserwowane z więcej niż 70% identyczności we wszystkich znanych białkach homologicznych w obrębie gatunku, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen.

PL 214 225 B1

Korzystnie, szereguje się reszty aminokwasowe względem stopnia konserwacji we wszystkich znanych białkach homologicznych w obrębie gatunku, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen, i że podstawia się jeden lub więcej aminokwasów spośród tych bardziej konserwowanych.

Korzystnie, sposób ten obejmuje wybranie zidentyfikowanych aminokwasów tak, aby wytworzyć zmutowany alergen, który ma zasadniczo taką samą strukturę trzeciorzędową szk ieletu α-węgla jak ten naturalnie występujący alergen.

Korzystnie, podstawienie reszt aminokwasowych przeprowadzane jest za pomocą mutagenezy ukierunkowanej.

Natomiast, sposób otrzymywania zrekombinowanego alergenu określonego powyżej charakteryzuje się tym, że alergen produkowany jest z sekwencji DNA uzyskanej przez tasowanie DNA (inżynieria molekularna) DNA kodującego odpowiedni naturalnie występujący alergen.

Przedmiotem wynalazku jest też sekwencja DNA kodująca zrekombinowany alergen określony powyżej.

Korzystnie, sekwencja DNA jest pochodną sekwencji przedstawionej na fig. 3, gdzie sekwencja DNA jest zmutowana, aby kodować alergen mający 5 do 20 mutacji wybranych z grupy złożonej z: V2,

E87, K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, I-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87 i E-73.

D72, E87, K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, I-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87 i E-73.

Korzystnie, sekwencja DNA jest pochodną sekwencji przedstawionej na fig. 13, gdzie sekwencja DNA jest zmutowana, aby kodować alergen mający 5 do 20 mutacji wybranych z grupy złożonej z: K-16, K-185, K-11, K-44, K-210, R-63, K-13, F-6, K-149, K-128, E-184, K-112, F-157, E-3, K-29, N-203, N-34, K-78, K-151, L-15, L-158, Y-102, W-186, K-134, D-87, K-52, T-67, T-125, K-150, Y-40, Q-48, L-65, K-81, Q-101, Q-208, K-144, N-8, N-70, H-104, Q-45, K-137, K-159, E-205, N-82, A-111, D-131, K-24, V-36, N-7, M-138, T-209, V-84, K-112, V-19, D-56, P-73, G-33, T-106, N-170, L-28, T-43, Q-114, C-10, K-60, N-31, K-47, E-5, D-145, V-38, A-127, D-156, E-204, P-71, G-26, Y-129, D-141, F-201, R-68, N-200, D-49, S-153, K-35, S-39, Y-25, V-37, G-18, W-85 i I-182.

Korzystnie, sekwencja DNA jest pochodną sekwencji przedstawionej na fig. 16, gdzie sekwencja DNA jest zmutowana, aby kodować alergen mający 5 do 20 mutacji wybranych z grupy złożonej z: R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, Κ-82, Κ-6, Κ-96, Κ-48, Κ-55, K-89, Q-85, W-92, I-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K-126, L-61, Ρ-26, N-93, D-64, 1-28, Κ-14, Κ-100, Ε-62, I-127, E-102, Ε-25, P-66, L-17, G-60, Ρ-95, E-53, V-81, Κ-51, N-103. Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, Η-124, 1-68, Ρ-79, K-109 i R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, Κ-82, Κ-6, Κ-96, Κ-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, I-97, H-22, V-65, S-24, Η-74, K-126, L-61, P-26, N-93, D-64, 1-28, K-14, K-100, Ε-62, I-127, Ε-102, E-25, P-66, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, H-124, I-68, P-79, K-109 i K-15.

Zgodnie z wynalazkiem, wektor ekspresyjny, charakteryzuje się tym, że obejmuje DNA określone jak wyżej.

Zgodnie z wynalazkiem, komórka gospodarza, charakteryzuje się tym, że zawiera wektor ekspresyjny określony powyżej.

Z kolei, sposób produkcji zrekombinowanego zmutowanego alergenu, charakteryzuje się tym, że obejmuje etap hodowania komórki gospodarza określonej powyżej.

Niniejszy wynalazek dotyczy wprowadzania syntetycznych podstawień aminokwasów do szeregu określonych istotnych pozycji, na przykład, epitopów wiążących IgE, z celem zmniejszenia zdolności wiązania specyficznego IgE każdego zmutowanego epitopu.

Uważa się, że epitopy komórek B mogą być rozmieszczone na nieomal całej powierzchni alergenu. Co więcej, istnieją dowody doświadczalne, że co najmniej niektóre epitopy stanowią część skupienia epitopów obejmującego dużą liczbę zachodzących na siebie epitopów. Tak więc, teoretyczną podstawą tego wynalazku jest to, że dowolny eksponowany na powierzchni aminokwas stanowi potencjalne miejsce mutacji, co może spowodować zmniejszoną zdolność wiązania specyficznego IgE.

PL 214 225 B1

Tak więc, pierwotne mutacje definiowane są przez ich umiejscowienie w stosunku do siebie nawzajem, to znaczy są umieszczone oddzielnie, aby zapewnić, że są mutacjami w oddzielnych skupieniach epitopów.

Szczegółowy opis wynalazku

W korzystnym wykonaniu wynalazku, mutacje pierwotne oddalone są o 20 A, korzystnie o 25 A, a najbardziej korzystnie o 30 A.

Uważa się, że alergen zawiera szereg potencjalnych regionów wiążących dla specyficznych IgE, przy czym każdy region ma w przybliżeniu wielkość 800 A², i każdy region powierzchniowy zawiera dużą liczbę zachodzących na siebie epitopów. Tak więc, alergen posiada szereg potencjalnych mutacji pierwotnych na obszarze powierzchni podzielonej przez 800 A².

Korzystnie, zrekombinowany alergen według wynalazku zawiera od 5 do 20, korzystniej od 6 do 15, bardziej korzystnie od 7 do 12, a najbardziej korzystnie od 8 do 10 mutacji pierwotnych.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, region powierzchniowy nie zawierający mutacji ma powierzchnię 700 A², korzystniej 600 A², bardziej korzystnie 500 A², a najbardziej korzystnie 400 A².

W korzystnym wykonaniu wynalazku, zrekombinowany alergen zawiera szereg mutacji drugorzędowych, z których każda obniża zdolność wiązania specyficznego IgE zmutowanego alergenu w porównaniu ze zdolnością wiązania tego naturalnie występującego alergenu, gdzie każda mutacja drugorzędowa jest podstawieniem jednej eksponowanej na powierzchni reszty aminokwasu inną resztą, która nie występuje w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów żadnego znanego homologicznego białka w gatunku taksonomicznym, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen, i gdzie te mutacje drugorzędowe usytuowane są poza tym obszarem kolistym.

Mutacje drugorzędowe mogą być zlokalizowane blisko mutacji pierwotnej, to znaczy mutacja drugorzędowa może być mutacją dodatkową dla tego samego epitopu, który jest mutowany przez mutację pierwotną.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, co najmniej jeden z eksponowanych na powierzchni aminokwasów, które mają być podstawione w naturalnie występującym alergenie ma dostępność dla rozpuszczalnika ponad 20%, korzystnie ponad 30%, bardziej korzystnie ponad 40%, a najbardziej korzystnie ponad 50%.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku, co najmniej jeden z eksponowanych na powierzchni aminokwasów, które mają być podstawione w naturalnie występującym alergenie, konserwowany jest z ponad 70%, korzystnie z ponad 80%, a najkorzystniej z ponad 90% identycznością we wszystkich znanych białkach homologicznych w obrębie gatunku, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen.

Korzystnie, zrekombinowany alergen według wynalazku ma zasadniczo taką samą strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla, jak ten naturalnie występujący alergen.

Gdy porównuje się strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla cząsteczek mutanta i naturalnie występującego alergenu, odchylenie średnie kwadratowe współrzędnych atomowych wynosi korzystnie poniżej 2 A.

W korzystnym wykonaniu zrekombinowanego alergenu według wynalazku, każda reszta aminokwasu, która ma być włączona do zmutowanego alergenu nie występuje w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów żadnego znanego białka w obrębie rodzaju taksonomicznego, korzystnie podrodziny, korzystniej rodziny, bardziej korzystnie nadrodziny, bardziej korzystnie legionu, bardziej korzystnie podrzędu, a najbardziej korzystnie rzędu, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, zrekombinowany zmutowany alergen według wynalazku jest nienaturalnie występującym alergenem.

Wiązanie specyficznego IgE do zmutowanego alergenu jest korzystnie zmniejszone o co najmniej 5%, korzystnie o co najmniej 10% w porównaniu z naturalnie występującymi izoalergenami lub podobnymi białkami zrekombinowanymi w immunooznaczeniu z surowicami od specyficznych względem źródła reagujących z IgE pacjentów alergicznych lub ich pul.

Innym sposobem oceny obniżonego wiązania IgE i zmniejszonej zdolności pośredniczenia w wiązaniu krzyżowym mutanta jest zdolność mutanta do inicjowania uwalniania histaminy (histamine release - HR). Uwalnianie histaminy można mierzyć w kilku oznaczeniach uwalniania histaminy. Obniżone uwalnianie histaminy mutantów wynika ze zmniejszonego powinowactwa w stosunku do specyficznego IgE związanego z powierzchnią komórki, jak i z ich zmniejszonej zdolności do ułatwiania wiązania krzyżowego. HR jest korzystnie obniżone o 5-100%, korzystniej o 25-100%, bardziej

PL 214 225 B1 korzystnie o 50-100%, a najkorzystniej o 75-100% dla mutantów według wynalazku w porównaniu z naturalnie występującymi alergenami.

Zwykle, kolisty obszar powierzchni z powierzchnią 800 A² nie zawierający mutacji obejmuje atomy 15-25 reszt aminokwasów.

Korzystny zrekombinowany antygen według wynalazku charakteryzuje się tym, że eksponowane na powierzchni reszty aminokwasów szeregowane są względem dostępności dla rozpuszczalnika, i tym, że jeden lub więcej aminokwasów spośród bardziej dostępnych dla rozpuszczalnika jest podstawiony.

Dalszy korzystny zrekombinowany alergen według wynalazku charakteryzuje się tym, że eksponowane na powierzchni reszty aminokwasów są szeregowane względem stopnia konserwacji we wszystkich znanych białkach homologicznych w obrębie gatunku, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen oraz, że jeden lub więcej aminokwasów spośród bardziej konserwatywnych jest podstawiony.

Korzystnie zrekombinowany alergen według wynalazku zawiera od 1 do 4 mutacji drugorzędowych na mutację pierwotną.

Korzystne wykonanie wynalazku charakteryzuje się tym, że jedno lub więcej z podstawień przeprowadzane jest za pomocą mutagenezy ukierunkowanej.

Inne korzystne wykonanie wynalazku charakteryzuje się tym, że jedno lub więcej z podstawień przeprowadzane jest za pomocą mutagenezy losowej.

Dalsze korzystne wykonanie wynalazku charakteryzuje się tym, że jedno lub więcej z podstawień przeprowadzane jest przez tasowanie DNA.

Zrekombinowane alergeny, według wynalazku, mogą być odpowiednio mutantem alergenu inhalacyjnego pochodzącego m.in. z drzew, traw, ziół, grzybów, roztoczy kurzu domowego, karaluchów, włosów i łupieżu zwierząt. Ważne alergeny pyłku z drzew, traw i ziół są to takie pochodzące z rzędów taksonomicznych Fagales, Oleales i Pinales obejmując m.in. brzozę (Betula), olchę (Alnus), leszczynę (Corylus), grab (Carpinus) i oliwkę (Olea), rząd Poales obejmujący m.in. trawy z rzędów Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis i Secale, rzędy Asterales i Urticales obejmujące m.in. zioła z rzędów Ambrosia i Artemisia. Ważne alergeny inhalacyjne z grzybów są m.in. takie pochodzące z rzędów Alternaria i Cladosporium. Inne ważne alergeny inhalacyjne są to te z roztoczy kurzu domowego z rzędu Dermatophagoides, te z karaluchów i te z ssaków, takich jak kot, pies i koń. Ponadto, zrekombinowane alergeny według wynalazku mogą być mutantami alergenów jadu, obejmując takie pochodzące z owadów kłujących lub gryzących, takich jak te z rzędów taksonomicznych Hymenoptera obejmując pszczoły (nadrodzina Apidae), osy (nadrodzina Vespidea) i mrówki (nadrodzina Formicoidae).

Specyficzne składniki alergenów obejmują, na przykład, Bet v 1 (B. verrucosa, brzoza), Aln g 1 (Alnus glutinosa, olcha), Cor a 1 (Corylus avelana, leszczyna) i Car b 1 (Carpinus betulus, grab) rzędu Fagales. Inne to Cry j 1 (Pinales), Amb a 1 i 2, Art v 1 (Asterales), Par j 1 (Urticales), Ole e 1 (Oleales), Ave e 1, Cyn d 1, Dac g 1, Fes p 1, Hol 1 I, Lol p 1 i 5, Pas n 1, Phl p 1 i 5, Poa p 1, 2 i 5, Sec c 1 i 5, i Sor h 1 (różne pyłki trawy), Alt a 1 i Cla h 1 (grzyby), Der f 1 i 2, Der p 1 i 2 (roztocza kurzu domowego, D. farinae i D. pteronyssinus, odpowiednio), Lep d 1 i 2 (Lepidoglyphus destructor; roztocze magazynowe), Bla g 1 i 2, Per a 1 (karaluchy, Blatella germanica i Periplaneta americana, odpowiednio), Fel d 1 (kot), Can f 1 (pies), Equ c 1, 2 i 3 (koń), Apis m 1 i 2 (pszczoła miodowa), Ves v 1, 2 i 5, Pol a 1, 2 i 5 (wszystko osy) i Sol i 1, 2, 3 i 4 (mrówka czerwona).

W jednym wykonaniu, zrekombinowany alergen jest mutantem Bet v 1.

Aminokwasy potencjalnie odpowiednie do podstawienia obejmują aminokwasy V2, D72, E87, K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, 1-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87 i E-73. Jedno lub więcej z pierwotnych i drugorzędowych podstawień może być wybrane z grupy złożonej z V2F, V2L, V21, V2M, Y5V, T10P, T10A, K20N, D25E, N28T, K32Q, Q36A, Q36K, E42S, E45S, N47S, K55N, K65N, D72H, D72Q, D72N, T77A, N78K, E87G, E96L, K97S, K103V, P108G, D109N, K123I, D125Y, K129N, K134E, R145E, S149R, S149T, D156H i +160N, gdzie + oznacza, że włączony jest dodatkowy aminokwas.

Przykłady mutantów Bet v 1 według wynalazku są, jak następuje (nawiasy, gdy są stosowane, oznaczają mutacje pierwotne i drugorzędowe):

PL 214 225 B1

Mutant A:

(Asn28Thr, Lys32Gln), (Asn78Lys, Lys103Val), Arg145Glu, (Asp156His, + 160Asn).

Mutant B:

Tyr5Val, Glu42Ser, Glu45Ser, Asn78Lys, Lys103Val, Lys123Ile, Lys134Glu, Asp156His.

Mutant 2595 (Przykład 2):

N28T, K32Q, E45S,P108G

Mutant 2628 (Przykład 4):

Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lys134Glu.

Mutant 2637 (Przykład 4):

Ala16Pro, (Asn28Thr, Lys32Gln), Lys103Thr, Pro108Gly, (Leu152Lys, Ala153Gly, Ser155Pro).

Mutant 2724:

N28T, K32Q, N78K, K103V, P108G, R145E, D156H, +160N.

Mutant 2733 (Przykład 4):

(Tyr5Val, Lys134Glu), (Asn28Thr, Lys32Gln), Glu45Ser, Lys65Asn, (Asn78Lys, Lys103Val), Lys97Ser, Pro108Gly, Arg145Glu, (Asp156His, +160Asn)

Mutant 2744:

(Tyr5Val, Lys134Glu), (Glu42Ser, Glu45Ser), (Asn78Lys, Lys103Val), Lys123Ile, (Asp156His, +160Asn).

Mutant 2753 (Przykład 4):

(Asn28Thr, Lys32Gln), Lys65Asn, (Glu96Leu, Lys97Ser), (Pro108Gly, Asp109Asn), (Asp125Tyr, Glu127Ser), Arg145Glu.

Mutant 2744 + 2595:

Y5V, N28T, K32Q, E42S, E45S, N78K, K103V, P108G, K123I, K134E, D156H, + 160N.

Mutant 2744 + 2628:

Y5V, E42S, E45S, K65N, N78K, K97S, K103V, K123I, K134E, D156H, +160N.

Mutant 2744 + 2595 + 2628:

Y5V, N28T, K32Q, E42S, E45S, K65N, N78K, K97S, K103V, P108G, K123I, K134E, D156H, +160N.

Co więcej, wszystkie z powyższych mutantów zawierają jedno lub więcej z następujących podstawień: V2F, V2L, V2I, V2M, T10A, K20N, Q36A lub Q36K, D72H, D72Q, D72N, E87G, K129N i S149R lub S149T.

W innym wykonaniu, zrekombinowany alergen pochodzi z alergenu jadu z rzędu taksonomicznego Vespidae, Apidae i Formicoidae.

W dalszym wykonaniu, zrekombinowany alergen pochodzi z Ves v 5. Aminokwasy potencjalnie odpowiednie do podstawienia obejmują aminokwasy K-16, K-185, K-11, K-44, K-210, R-63, K-13, F-6,

K-149, K-128, E-184, K-112, F-157, E-3, K-29, N-203, N-34, K-78, K-151, L-15, L-158, Y-102, W-186, K-134, D-87, K-52, T-67, T-125, K-150, Y-40, Q-48, L-65, K-81, Q-101, Q-208, K-144, N-8, N-70, H-104, Q-45, K-137, K-159, E-205, N-82, A-111, D-131, K-24, V-36, N-7, M-138, T-209, V-84, K-172, V-19, D-56, P-73, G-33, T-106, N-170, L-28, T-43, Q-114, C-10, K-60, N-31, K-47, E-5, D-145, V-38, A-127, D-156, E-204, P-71, G-26, Y-129, D-141, F-201, R-68, N-200, D-49, S-153, K-35, S-39, Y-25, V-37, G-18, W-85 i I-182. Jedno lub więcej z pierwotnych i drugorzędowych podstawień może być wybrane z grupy złożonej z K29A, T67A, K78A, V84S, Y102A, K112S, K144A, K202M i N203G.

W dalszym wykonaniu, zrekombinowany alergen pochodzi z Der p 2. Aminokwasy potencjalnie odpowiednie do podstawienia obejmują aminokwasy R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K-82, K-6, K-96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, I-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K-126, L-61, P-26, N-93, D-64, I-28, K-14, Κ-100, E-62, I-127, E-102, E-25, P-66, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, Η-124, I-68, P-79, K-109 i R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K-82, K-6, K-96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, I-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K-126, L-61, P-26, N-93, D-64, I-28, K-14, Κ-100, E-62, I-127, E-102, E-25, P-66, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, Η-124, I-68, P-79, K-109, K-15. Jedno lub więcej z pierwotnych i drugorzędowych podstawień może być wybrane z grupy złożonej z K6A, N10S, Kl5E, S24N, H30N, K48A, E62S, H74N, K77N, K82N, K100N i R128Q.

Przykłady mutantów Bet v 1 według wynalazku są jak następuje:

Mutant A:

K6A, K15E, H30N, E62S.

PL 214 225 B1

Mutant B:

K6A, K15E, H30N, E62S, H74N, K82N.

Mutant C:

K6A, N10S, K15E, S24N, H30N, K48A, E62S, H74N, K77N, K82N, K100N i R128Q

Szczepionki

Przygotowanie szczepionek jest ogólnie dobrze znane w tej dziedzinie. Szczepionki są zwykle przygotowywane w postaci zastrzyków, albo jako roztwory płynne albo jako zawiesiny. Takie szczepionki mogą być też emulgowane lub formułowane tak, aby umożliwić podawanie donosowe, jak i doustne, w tym podawanie ustne i podjęzykowe. Omawiany składnik immunogenny (zrekombinowany alergen, jak określono powyżej) może być odpowiednio zmieszany z zaróbkami, które są farmaceutycznie dopuszczalne i ponadto kompatybilne ze składnikiem czynnym. Przykłady odpowiednich zaróbek to woda, sól fizjologiczna, dekstroza, glicerol, etanol, i tym podobne, jak i ich kombinacje. Szczepionka może dodatkowo zawierać inne substancje, takie jak środki zwilżające, czynniki emulgujące, czynniki buforujące lub adiuwanty wzmagające skuteczność szczepionki.

Szczepionki są najczęściej podawane pozajelitowo przez zastrzyk podskórny lub domięśniowy. Preparaty, które są odpowiednie do podawania inną drogą obejmują preparaty doustne i czopki. Szczepionki do podawania doustnego mogą być odpowiednio formułowane z zaróbkami zwykle stosowanymi do takich preparatów, na przykład, farmaceutyczne klasy mannitu, laktozy, skrobi, stearynianu magnezu, sacharyny sodowej, celulozy, węglanu magnezu i tym podobne. Kompozycje mogą być formułowane jako roztwory, zawiesiny, emulsje, tabletki, pigułki, kapsułki, preparaty o podtrzymywanym uwalnianiu, aerozole, proszki lub granulaty.

Szczepionki podawane są w taki sposób, aby były kompatybilne z preparatem dawkowanym i w takiej ilości, aby były terapeutycznie skuteczne i immunogenne. Ilość składnika czynnego zawartego w szczepionce zależy od osobnika, który ma być leczony, m.in., od zdolności układu immunologicznego osobnika do odpowiedzi na terapię, drogi podawania oraz wieku i wagi osobnika. Odpowiednie zakresy dawki mogą wahać się od około 0,0001 pg do 1000 pg.

Jak nadmieniono powyżej, zwiększony efekt może być uzyskany przez dodatek adiuwantów do preparatu. Przykładami takich adiuwantów są wodorotlenek glinu i fosforan glinu (ałun) lub fosforan wapnia jako roztwór 0,05 do 0,1 procentowy w buforowanej, fosforanem, soli fizjologicznej, syntetyczne polimery cukrów lub glikolid polilaktydowy (PLG) stosowany jako roztwór 0,25 procentowy. Mieszanina z komórkami bakterii, takimi jak C. parvum, endotoksyny lub składniki lipopolisacharydowe bakterii gram-ujemnych, emulsje w fizjologicznie dopuszczalnych nośnikach olejowych, takich jak monooleinian sorbitanu (Arlacel A) lub emulsja z 20% roztworem perfluorowęgla (na przykład, Fluosol-DA) stosowana jako substytut blokujący - też mogą być stosowane. Emulsje olejowe, takie jak MF-59, mogą być także stosowane. Inne adiuwanty, takie jak adiuwanty całkowite i niecałkowite Freund'a, jak również saponiny, takie jak QuilA, Qs-21 i ISCOM, i RIBI mogą być również stosowane.

Najczęściej, aby uzyskać efekt, konieczne będzie wielokrotne podawanie szczepionki. Często, szczepionka podawana jest jako pierwsze podanie, po którym następują kolejne szczepienia lub inne podania. Liczba szczepień zwykle będzie mieścić się w zakresie od 1 do 50, zazwyczaj nie przekraczając 35 szczepień. Szczepienia będą normalnie przeprowadzane w cyklu dwutygodniowym lub dwumiesięcznym, przez okres od 3 miesięcy do 5 lat. Rozważane to jest, aby zapewnić pożądany poziom skutku profilaktycznego lub terapeutycznego.

Zrekombinowany alergen może być stosowany jako preparat farmaceutyczny, który jest odpowiedni do dostarczenia pewnej ochrony przed odpowiedziami alergicznymi w okresie roku, przy występowaniu objawów (profilaktyka). Zazwyczaj, terapia będzie musiała być powtarzana każdego roku, aby utrzymać efekt ochronny. Preparaty formułowane dla aplikacji donosowej, doustnej i pod język są szczególnie odpowiednie do tego celu.

Sposób przygotowania zrekombinowanego alergenu według wynalazku

Jak nadmieniono powyżej, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu przygotowywania zrekombinowanego zmutowanego alergenu według wynalazku, patrz zastrz. 48.

Eksponowane na powierzchni aminokwasy odpowiednie do podstawienia według wynalazku mogą być identyfikowane na podstawie informacji o ich dostępności dla rozpuszczalnika (wody), która wyraża stopień ekspozycji na powierzchni. Korzystne wykonanie sposobu według wynalazku charakteryzuje się szeregowaniem wymienionych zidentyfikowanych reszt aminokwasów względem dostępności dla rozpuszczalnika i podstawieniem jednego lub więcej aminokwasów spośród bardziej dostępnych dla rozpuszczalnika.

PL 214 225 B1

Drugim parametrem, który może wpływać na identyfikację eksponowanych na powierzchni aminokwasów odpowiednich do substytucji według wynalazku, jest stopień, w którym aminokwas konserwowany jest we wszystkich znanych białkach homologicznych w obrębie gatunku, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen. Alternatywnie stopień, w którym we wszystkich znanych białkach homologicznych w obrębie rodzaju taksonomicznego, podrodziny, rodziny, nadrodziny, legionu, podrzędu lub rzędu, z których ten naturalnie występujący alergen pochodzi, stosowany jest jako taki drugi parametr.

Tak więc, korzystne wykonanie sposobu według wynalazku charakteryzuje się wyborem identyfikowanych reszt aminokwasów, które konserwowane są z więcej niż 70%, korzystnie więcej niż 80%, a najkorzystniej więcej niż 90% identycznością, we wszystkich znanych białkach homologicznych w obrębie gatunku, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen.

Ponadto, szczególnie korzystne wykonanie sposobu według wynalazku charakteryzuje się szeregowaniem wymienionych zidentyfikowanych reszt aminokwasów pod względem stopnia konserwacji we wszystkich znanych białkach homologicznych w obrębie gatunku, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen i podstawieniem jednego lub wielu aminokwasów spośród bardziej konserwowanych.

Dalsze korzystne wykonanie sposobu według wynalazku obejmuje wybranie zidentyfikowanych aminokwasów tak, aby utworzyć zmutowany alergen, który ma zasadniczo taką samą trzeciorzędową strukturę szkieletu α-węgla, jak ten naturalnie występujący alergen.

Inne korzystne wykonanie sposobu według wynalazku charakteryzuje się tym, że podstawienie reszt aminokwasów przeprowadzane jest przez mutagenezę ukierunkowaną.

Inne korzystne wykonanie sposobu według wynalazku charakteryzuje się tym, że podstawienie reszt aminokwasów przeprowadzane jest przez tasowanie DNA.

Kryteria do podstawienia

Dla cząsteczek, dla których określona była struktura trzeciorzędowa (na przykład, krystalografia promieni rentgenowskich, lub mikroskopia elektronowa NMR), mutant niosący podstawione aminokwas(y) powinien korzystnie spełniać następujące kryteria:

1. Ogólna struktura trzeciorzędowa szkieletu α-węgla cząsteczki korzystnie jest konserwowana. „Konserwowana” definiowane jest jako odchylenie średnie kwadratowe współrzędnych atomowych porównując struktury poniżej 2A. To jest ważne z dwóch powodów: a) Oczekuje się, że cała powierzchnia naturalnego alergenu stanowi zachodzące na siebie kontinuum potencjalnych epitopów wiążących przeciwciało. Na większość powierzchni cząsteczki podstawienia nie wpływają, i w związku z tym zachowuje ona swoje właściwości wiążące przeciwciało, co jest ważne dla generacji nowych ochronnych specyficzności przeciwciał skierowanych na epitopy obecne także na alergenie naturalnym; b) Stabilności, zarówno jeśli chodzi o trwałość jak i po wstrzyknięciu do płynów ustrojowych.

2. Aminokwasy, które mają być podstawione korzystnie umieszczone są na powierzchni, i przez to dostępne są dla wiązania przeciwciał. Aminokwasy usytuowane na powierzchni w strukturze trójwymiarowej mają zwykle dostępność dla rozpuszczalnika (wody) co najmniej 20%, odpowiednio 20-80%, bardziej odpowiednio 30-80%. Dostępność dla rozpuszczalnika określana jest jako powierzchnia molekularna dostępna dla kuli o promieniu porównywalnym do cząsteczki rozpuszczalnika (woda, r = 1,4 A).

3. Każdy z podstawionych aminokwasów korzystnie umieszczony jest w konserwowanych obszarach mających powierzchnię większą niż 400 A². Konserwowane obszary określane są jako koherentnie połączone obszary eksponowanych na powierzchni reszt aminokwasów i szkieletu. Konserwowane reszty aminokwasów definiowane są przez dopasowanie sekwencji wszystkich znanych (wydedukowanych) sekwencji aminokwasów białek homologicznych w obrębie tego samego taksonomicznego gatunku, rodzaju, podrodziny, rodziny, nadrodziny, legionu, podrzędu lub rzędu. Pozycje aminokwasów mające identyczne reszty aminokwasów w ponad 70% sekwencji uważane są za konserwowane. Oczekuje się, że konserwowane obszary zawierają epitopy, na które skierowane są IgE większości pacjentów.

Konserwacja struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla jest najlepiej określana przez uzyskanie identycznych struktur za pomocą krystalografii promieniowania rentgenowskiego lub NMR przed i po mutagenezie. Przy braku danych strukturalnych opisujących mutanta, nierozróżnialne widma CD lub dane immunochemiczne, na przykład, reaktywność przeciwciał, mogą uczynić prawdopodobnym konserwację struktury trzeciorzędowej α-węgla, w porównaniu do danych uzyskanych przez analizę strukturalnie określonej cząsteczki.

PL 214 225 B1

4. W obszarach konserwowanych, aminokwasy do mutagenezy korzystnie powinny być wybrane spośród najlepiej dostępnych dla rozpuszczalnika (wody) umieszczonych korzystnie blisko środka obszaru konserwowanego.

5. Korzystnie, polarna reszta aminokwasu podstawiona jest przez inną resztę polarną, a niepolarna reszta aminokwasu podstawiona jest przez inną niepolarną resztę aminokwasu.

W celu zasadniczego utrzymania struktury trójwymiarowej alergenu, aminokwas, który ma być włączony może być wybrany na podstawie porównania z białkiem, które jest strukturalnym homologiem alergenu, na przykład, białkiem, które należy do tego samego rzędu taksomicznego jak alergen, i które nie ma żadnej reaktywności krzyżowej z alergenem.

DNA według wynalazku

W korzystnym wykonaniu, sekwencja DNA według wynalazku jest pochodną sekwencji DNA kodującej naturalnie występujący alergen.

Korzystnie, pochodna DNA uzyskiwana jest przez mutagenezę ukierunkowaną lub losową DNA kodującego naturalnie występujący alergen.

W pierwszym szczególnie korzystnym wykonaniu, sekwencja DNA jest pochodną sekwencji przedstawionej na fig. 3, gdzie sekwencja DNA jest zmutowana tak, aby kodowała alergen mający co najmniej cztery mutacje wybrane z grupy obejmującej K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93,

K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, I-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87, E-73.

W drugim szczególnie korzystnym wykonaniu, sekwencja DNA jest pochodną sekwencji przedstawionej na fig. 13, gdzie sekwencja DNA jest zmutowana tak, aby kodowała alergen mający co najmniej cztery mutacje wybrane z grupy obejmującej K-16, K-185, K-11, K-44, K-210, R-63, K-13, F-6,

K-149, K-128, E-184, K-112, F-157, E-3, K-29, N-203, N-34, K-78, K-151, L-15, L-158, Y-102, W-186, K-134, D-87, K-52, T-67, T-125, K-150, Y-40, Q-48, L-65, K-81, Q-101, Q-208, K-144, N-8, N-70, H-104, Q-45, K-137, K-159, E-205, N-82, A-111, D-131, K-24, V-36, N-7, M-138, T-209, V-84, K-172, V-19, D-56, P-73, G-33, T-106, N-170, L-28, T-43, Q-114, C-10, K-60, N-31, K-47, E-5, D-145, V-38, A-127, D-156, E-204, P-71, G-26, Y-129, D-141, F-201, R-68, N-200, D-49, S-153, K-35, S-39, Y-25, V-37, G-18, W-85 i I-182.

W trzecim szczególnie korzystnym wykonaniu, sekwencja DNA jest pochodną sekwencji przedstawionej na fig. 16, gdzie sekwencja DNA jest zmutowana tak, aby kodowała alergen mający co najmniej cztery mutacje wybrane z grupy obejmującej R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31,

K-82, K-6, p K-96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, I-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K-126, L-61, P-26, N-93, D-64, I-28, K-14, Κ-100, E-62, I-127, E-102, E-25, P-66, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, Η-124, I-68, P-79, K-109 i R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K-82, K-6, K-96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, I-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K-126, L-61, P-26, N-93, D-64, I-28, K-14, Κ-100, E-62, I-127, E-102, E-25, P-66, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, Η-124, I-68, P-79, K-109, K-15.

Tasowanie DNA

Zrekombinowany zmutowany alergen według wynalazku może być produkowany stosując sekwencję DNA uzyskaną przez tasowanie DNA (inżynierię genetyczną) odpowiedniego naturalnego DNA. Tasowanie DNA może być przeprowadzone według procedur ujawnionych w publikacji autorstwa Punnonen i wsp. (publ. 25) jak i procedur ujawnionych w wymienionych tam pracach, z których wszystkie włączone są tu tytułem odniesienia.

Oznaczenie diagnostyczne

Ponadto, zrekombinowane zmutowane alergeny według wynalazku mają możliwości diagnostyczne i zalety. Szczepionki alergiczne według uprzedniego stanu wiedzy oparte są na ekstraktach naturalnie występującego źródła alergenu, i w ten sposób reprezentują szeroki zakres izoform. Osobnik alergiczny był pierwotnie uczulony i ma IgE na jedną lub kilka z obecnych izoform. Niektóre z izoform mogą być istotne względem reakcji alergicznych osobnika alergicznego z uwagi na homologię i następnie reaktywność krzyżową z izoformą, na którą osobnik jest alergiczny, podczas gdy inne izoformy mogą nie być istotne jako, że nie niosą żadnych epitopów wiążących IgE, na które osobnik ma specyficzne IgE. Ze względu na tę heterogenność specyficzności populacji IgE, niektóre izoformy

PL 214 225 B1 mogą stąd być bezpieczne do podawania, to znaczy, nie powodują odpowiedzi alergicznej poprzez IgE, podczas gdy inne izoformy mogą być szkodliwe powodując niepożądane skutki uboczne.

Tak więc, mutacje według wynalazku i kompozycje według wynalazku przeznaczone do podania terapeutycznego mogą być też stosowane dla oznaczenia diagnostycznego in vivo lub in vitro, aby badać odpowiedniość, bezpieczeństwo albo wynik terapii takimi mutantami lub kompozycjami. Próbki diagnostyczne do stosowania obejmują próbki ustrojowe, takie jak surowice.

Zatem, wynalazek dotyczy także oznaczenia diagnostycznego do ocenienia odpowiedniości, bezpieczeństwa i wyniku terapii osobnika stosując zmutowany zrekombinowany alergen według wynalazku lub kompozycję według wynalazku, gdzie próbka zawierająca IgE osobnika mieszana jest z wymienionym mutantem lub z wymienioną kompozycją i oceniania jest pod kątem poziomu reaktywności między IgE w tej próbce i tym mutantem. Ocena poziomu reaktywności między IgE w próbce i mutantem może być przeprowadzona stosując dowolne znane immunooznaczenie.

Definicje

W związku z niniejszym wynalazkiem, określenie „zmniejszyć zdolność wiązania specyficznego IgE w porównaniu ze zdolnością wiązania IgE wymienionego naturalnie występującego alergenu” oznacza, że obniżenie jest mierzalne w sposób statystycznie znaczący (p <0,05) w co najmniej jednym immunooznaczeniu stosując surowicę od osobnika alergicznego na naturalnie występujący alergen. Korzystnie, zdolność wiązania IgE jest zmniejszona o co najmniej 5%, a korzystniej o co najmniej 10%.

Określenie „aminokwas eksponowany na powierzchni” oznacza, że reszta aminokwasu umieszczona jest na powierzchni struktury trójwymiarowej w taki sposób, że gdy alergen jest w roztworze, co najmniej część co najmniej jednego atomu reszty aminokwasu dostępna jest dla kontaktu z otaczającym rozpuszczalnikiem. Korzystnie, reszta aminokwasu w strukturze trójwymiarowej ma dostępność dla rozpuszczalnika (wody) co najmniej 20%, odpowiednio, co najmniej 30%, bardziej odpowiednio, co najmniej 40%, a najkorzystniej co najmniej 50%.

Określenie „dostępność dla rozpuszczalnika” definiowane jest jako obszar cząsteczki dostępny dla kuli z promieniem porównywalnym do cząsteczki rozpuszczalnika (woda, r = 1,4 A).

Określenie „eksponowany na powierzchni” i „eksponowany na rozpuszczalnik” stosowane są wymiennie.

Określenie „gatunek taksonomiczny, z którego taki naturalny alergen pochodzi” oznacza gatunek w układzie taksonomicznym.

Ponadto, określenie „wymieniony zmutowany alergen ma zasadniczo taką samą strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla jak ten naturalnie występujący alergen” oznacza, że gdy porównuje się struktury, odchylenie średnie kwadratowe współrzędnych atomowych wynosi poniżej 2 A.

W związku z niniejszym wynalazkiem określenie „podstawienie” oznacza delecję, podstawienie lub dodanie aminokwasu w porównaniu z sekwencją aminokwasów naturalnie występującego alergenu.

Niniejszy wynalazek jest dodatkowo ilustrowany następującymi poniżej nie ograniczającymi przykładami.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Przykład 1 opisuje przygotowanie zrekombinowanych zmutowanych alergenów z jedną i z trzema mutacjami pierwotnymi. Zrekombinowane zmutowane alergeny według wynalazku, to znaczy alergeny zawierające co najmniej cztery mutacje pierwotne mogą być przygotowane przy użyciu tych samych procedur. Identyfikacja wspólnych epitopów w obrębie alergenów pyłku Fagales.

Główny alergen pyłku brzozy Bet v 1 wykazuje około 90% identyczność sekwencji aminokwasów z głównymi alergenami z pyłków taksonomicznie spokrewnionych drzew, to znaczy Fagales (na przykład, leszczyna i grab) i pacjenci alergiczni na pyłek brzozy często wykazują kliniczne objawy krzyżowej reakcji alergicznej na te białka homologiczne do Bet v 1.

Bet v 1 wykazuje także około 50-60% identyczność sekwencji z białkami alergicznymi obecnymi w niektórych owocach (na przykład, w jabłkach i w czereśniach) i w warzywach (na przykład, w selerze i w marchwi), i są kliniczne dowody na alergiczną reaktywność krzyżową między Bet v 1 i tymi białkami związanymi z pożywieniem.

Ponadto Bet v 1 dzieli znaczącą identyczność sekwencji (20-40%) z grupą białek roślinnych zwanych białkami związanymi z patogenezą (PR-10), jednak nie ma doniesień o alergicznej reaktywności krzyżowej do tych białek PR-10.

Modelowanie molekularne sugeruje, że struktury Fagales i alergenów pokarmowych oraz białek

PR-10 są bliskie identyczności ze strukturą Bet v 1.

PL 214 225 B1

Podstawa strukturalna alergicznej reaktywności krzyżowej Bet v 1 opisana została w publikacji Gajhede i wsp. 1996 (publ. 17), gdzie trzy obszary na powierzchni molekularnej Bet v 1 mogły być zidentyfikowane jako wspólne dla trzech znanych głównych alergenów pyłku drzew. Tak więc, dowolny IgE rozpoznający te obszary na Bet v 1 byłby zdolny do reagowania krzyżowego i do wiązania innych głównych alergenów pyłku Fagales oraz powodować objawy alergiczne. Identyfikacja tych wspólnych obszarów wykonana była po dopasowaniu wszystkich znanych sekwencji aminokwasów głównych alergenów pyłków roślin w kombinacji z analizą powierzchni molekularnej Bet v 1 wykazaną przez strukturę trzeciorzędową α-węgla opisaną w publ. 17. Dodatkowo, obszary zdefiniowane były jako mające pewną minimalną wielkość (> 400 A²) w oparciu o powierzchnię pokrytą przez przeciwciało po wiązaniu.

Selekcja reszt aminokwasów dla mutagenezy ukierunkowanej

Reszty aminokwasów dla mutagenezy ukierunkowanej wybrano spośród reszt obecnych w obszarach specyficznych dla Bet v 1 i wspólnych obszarach, ponieważ oczekuje się, że ich modyfikacje wpłyną na wiązanie IgE surowicy od większości pacjentów wykazujących alergiczną reaktywność krzyżową na pyłek drzew.

Orientacja względna i procent ekspozycji na rozpuszczalnik każdej reszty aminokwasu w obrębie odpowiedniego obszaru wyliczona była w oparciu o ich współrzędne atomowe. Reszty mające niski stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (< 20%) nie były uważane za istotne dla mutagenezy ze względu na możliwą dysrupcję struktury lub brak interakcji z przeciwciałem. Pozostałe reszty uszeregowano według ich stopnia ekspozycji na rozpuszczalnik.

Dopasowanie sekwencji

Sekwencje homologiczne do sekwencji testowanej (Bet v 1 Nr 2801, WHO IUIS Nomenclature

Subcommittee on Allergens - Podkomitet ds. Nazewnictwa Alergenów) pochodziły z baz danych sekwencji GenBank i EMBL za pomocą poszukiwania BLAST (Altschul i wsp., publ. 18). Wszystkie sekwencje z BLAST z prawdopodobieństwem mniejszym niż 0,1 były uwzględnione, i skonstruowano jedną listę zawierającą nienadmiarową listę sekwencji homologicznych. Były one dopasowane za pomocą CLUSTAL W (Higgins i wsp., publ. 19) i wyliczono procent identyczności dla każdej pozycji w sekwencji uwzględniając pełną listę lub tylko spokrewnione gatunki taksonomicznie. Łącznie 122 sekwencje były homologiczne do Bet v 1 Nr 2801, z czego 57 sekwencji pochodziło z taksonomicznie pokrewnych gatunków.

Sklonowanie genu kodującego Bet v 1

Przygotowano RNA z pyłku Betula verrucosa (Allergon, Szwecja) za pomocą ekstrakcji fenolem i strącenia LiCl. Przeprowadzono chromatografię powinowactwa na oligo-(dT) celulozie partiami w probówkach Eppendorfa, i dwuniciowy cDNA syntetyzowano stosując handlowo dostępny zestaw (Amersham). DNA kodujący Bet v 1 amplifikowano za pomocą PCR i sklonowano. Pokrótce, przeprowadzono PCR stosując cDNA jako matrycę i startery zaprojektowane tak, aby pasowały do sekwencji cDNA w pozycjach odpowiadających, odpowiednio, amino końcowi Bet v 1 i regionowi 3' nie ulegającemu translacji. Startery przedłużano na końcach 5', aby uwzględnić miejsca restrykcyjne (NcoI i HindllI) dla ukierunkowanego wklonowania do pKK233-2.

Subklonowanie do pMAL-c

Gen kodujący Bet v 1 następnie subklonowano do wektora fuzyjnego pMAL-c dla białka wiążącego maltozę (New England Biolabs). Gen zamplifikowano za pomocą PCR i subklonowano do ramki odczytu z malE, aby wygenerować operony fuzyjne białka wiążącego maltozę (MBP) i białka Bet v 1, w których MBP i Bet v 1 były odseparowane przez miejsce rozszczepienia przez proteazę czynnika XA położonych tak, aby odtworzyć po rozszczepieniu autentyczną sekwencję aminoterminalną Bet v 1, jak to opisano w publ. 15. Pokrótce, przeprowadzono PCR stosując pKK233-3 z Bet v 1 wstawionym jako matryca i startery odpowiadające, odpowiednio, amino- i karboksykońcowi białka. Starter bliski promotora przedłużony został do końca 5', aby zmieścić 4 kodony kodujące w ramce odczytu miejsce rozszczepienia przez proteazę czynnika Xa. Oba startery zostały następnie przedłużone w końcach 5', aby zmieścić miejsca restrykcyjne (Kpnl) w celu klonowania. Geny kodujące Bet v 1 subklonowano stosując 20 cykli PCR, aby zredukować częstość artefaktów PCR.

Mutageneza in vitro

Mutagenezę in vitro przeprowadzono za pomocą PCR stosując zrekombinowany pMAL-c z Bet v 1 wstawionym jako matryca. Każdy zmutowany gen Bet v 1 wygenerowano za pomocą PCR stosując zrekombinowany pMAL-c z wstawionym Bet v 1 jako matryca. Każdy zmutowany gen Bet v 1 wygenerowano za pomocą 3 reakcji PCR stosując 4 startery.

PL 214 225 B1

Syntetyzowano dwa specyficzne względem mutacji startery oligonukleotydowe uwzględniając każdą mutację, jedną dla każdej nici DNA, patrz fig. 1 i 2. Stosując zmutowany nukleotyd(y), jako punkt wyjścia, oba startery zostały wydłużone o 7 nukleotydów w stronę końca 5' i o 15 nukleotydów w stronę końca 3'. Wydłużające nukleotydy były identyczne pod względem sekwencji z genem Bet v 1 w danym regionie.

Dodatkowo syntetyzowano dwa ogólnie stosowalne startery („cały sensowny” i „cały nonsensowny” na fig. 2) i stosowano dla wszystkich mutantów. Te startery miały 15 nukleotydów długości i odpowiadały pod względem sekwencji regionom wektora pMAL-c około 1 kpz powyżej i poniżej od Bet v 1. Sekwencja wyższego startera pochodzi z nici sensownej, a sekwencja niższego startera pochodzi z nici nonsensownej, patrz fig. 2.

Dwie niezależne reakcje PCR przeprowadzono zasadniczo według procedur standardowych (Saiki i wsp., 1988, publ. 20) z wyjątkiem tego, że przeprowadzono tylko 20 cykli temperatury, aby zmniejszyć częstość artefaktów PCR. Każda reakcja PCR stosowała pMAL-c z Bet v 1 wstawionym jako matryca i jeden specyficzny względem mutacji oraz jeden ogólnie stosowalny starter w znaczących kombinacjach.

Wprowadzenie czterech podstawień aminokwasów (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly) w mutancie trójgrupowym było przeprowadzone tak, jak to opisano powyżej, w procesie etap po etapie. Najpierw wprowadzono mutację Glu45Ser, a następnie mutację Pro108Gly, a na koniec wprowadzono mutacje Asn28Thr, Lys32Gln stosując pMAL-c ze wstawionym Bet v 1 Nr 2801, Bet v 1 (Glu45Ser), Betv 1 (Glu45Ser, Pro108Gly) jako matryce, odpowiednio.

Produkty PCR oczyszczono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i elektroelucji, po czym nastąpiło wytrącanie etanolem. Przeprowadzono trzecią reakcję PCR stosując połączone produkty PCR z dwóch pierwszych reakcji PCR, jako matrycę i oba ogólnie stosowalne startery. Ponownie zastosowano 20 cykli standardowego PCR. Produkt PCR oczyszczono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i elektroelucji, po czym nastąpiło wytrącanie etanolem, cięcie enzymami restrykcyjnymi (BsiWl/EcoRl), i zligowano kierunkowo do pMAL-c z wstawionym Bet v 1 ciętym tymi samymi enzymami.

Figura 3 przedstawia poglądowo wszystkie 9 mutacji Bet v 1, które są jak następuje:

Thr10Pro, Asp25Gly, Asn28Thr + Lys32Gln, Glu45Ser, Asn47Ser, Lys55Asn, Glu60Ser (nie grupa), Thr77Ala i Pro108Gly. Przygotowano także dodatkowego mutanta z czterema mutacjami (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108GLy). Z tego wybrano pięć mutantów do dalszego testowania: Asn28Thr + Lys32Gln, Glu45Ser, Glu60Ser, Pro108Gly i mutant trójgrupowy Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly.

Sekwencjonowanie nukleotydów

Określenie sekwencji nukleotydów genu kodującego Bet v 1 przeprowadzono, odpowiednio, przed i po subklonowaniu, oraz po mutagenezach in vitro.

Plazmidowe DNA z 10 ml kultury bakteryjnej, która wzrastała do nasycenia przez całą noc w środowisku LB uzupełnionym 0,1 g/l ampicyliny, zostało oczyszczone na kolumnach Qiagen-tip 20 i sekwencjonowane przy użyciu zestawu do sekwencjonowania DNA (USB) według wersji Sequenase 2.0, zgodnie z zaleceniem dostawców.

Ekspresja i oczyszczanie zrekombinowanego Bet V 1 i mutantów

Zrekombinowane Bet v 1 (Bet v 1 Nr 2801 i mutanty) poddane były wzmożonej ekspresji u Escherichia coli DH 5a połączonej (fuzja) z białkiem wiążącym maltozę i oczyszczone, jak to opisano w publ. 15. Pokrótce, zrekombinowane komórki E. coli wzrastały w temperaturze 37°C do osiągnięcia gęstości optycznej 1,0 przy 436 nm, po czym indukowano ekspresję białka połączonego z Bet v 1 poprzez dodanie IPTG. Komórki były oddzielane przez wirowanie 3 godziny po indukcji, ponownie zawieszone w buforze lizującym i rozbite przez sonikację. Po sonikacji i po dodatkowym wirowaniu, połączone zrekombinowane białko było izolowane poprzez chromatografię powinowactwa na amylozie i kolejno rozszczepiane podczas inkubacji z czynnikiem Xa (publ. 15). Po cięciu czynnikiem Xa, zrekombinowany Bet v 1 izolowano przez filtrację na żelu i jeśli było to niezbędne, poddawano dodatkowej turze chromatografii powinowactwa na amylozie w celu usunięcia śladowych ilości białka wiążącego maltozę.

Oczyszczone zrekombinowane białko Bet v 1 zagęszczano przez ultrafiltrację do około 5 mg/ml i przechowywano w temperaturze 4°C. Ostateczny stan preparatu oczyszczonego, zrekombinowanego Bet v 1 wynosił 2-5 mg na litr kultury komórek E. coli.

PL 214 225 B1

Preparaty oczyszczonego, zrekombinowanego Bet v 1 widoczne były jako pojedyncze paski po elektroforezie poliakrylamidowej SDS z barwieniem srebrem, o przybliżonej masie cząsteczkowej 17,5 kDa. Sekwencjonowanie N-terminalne pokazało spodziewane sekwencje jakie pochodziły od sekwencji nukleotydowej cDNA, a ilościowa analiza aminokwasów wykazała oczekiwany skład aminokwasów.

Jak wykazano wcześniej (publ. 15), zrekombinowane Bet v 1 Nr 2801 jest immunochemicznie nierozróżnialne od naturalnie występującego Bet v 1. Immunoelektroforeza przy użyciu króliczych przeciwciał poliklonalnych

Siedem mutantów Bet v 1 utworzono jako zrekombinowane białka Bet v 1, i oczyszczono, jak to opisano powyżej, oraz testowano na ich aktywność w stosunku do króliczych przeciwciał poliklonalnych skierowanych przeciw naturalnie występującemu Bet v 1 izolowanemu z pyłku brzozy. Podczas analizy w warunkach naturalnych przez immunoelektroforezę, przeciwciała królicze były w stanie wytrącić wszystkie mutanty wskazując, że mutanty te miały konserwowaną strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla.

W celu analizy wpływu na odpowiedź ludzkich poliklonalnych IgE, do dalszych analiz, wyselekcjonowano mutanty Glu45Ser, Pro108Gly, Asn28Thr+ Lys32Gln i Glu60Ser.

Mutant Bet v 1 Glu45Ser

Kwas glutaminowy w pozycji 45 wykazuje wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (40%) i umiejscowiony jest w obszarze powierzchni molekularnej wspólnym dla alergenów Fagales (obszar I). Stwierdzono, że reszta serynowa zajmuje pozycję 45 w niektórych białkach PR-10 homologicznych do Bet v 1, co wskazuje, że kwas glutaminowy może być zastąpiony przez serynę bez zaburzenia stru ktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla. Dodatkowo jako, że żaden ze znanych alergenów Fagales nie ma seryny w pozycji 45, podstawienie kwasu glutaminowego seryną daje w efekcie nie występującą naturalnie cząsteczkę Bet v 1. Oznaczenie proliferacji komórek T stosując zrekombinowanego mutanta Bet v 1 Glu45Ser

Analizę przeprowadzono jak opisano w Spangfort i wsp. 1996a. Stwierdzono, że zrekombinowany mutant Bet v 1 Glu45Ser był zdolny do indukowania proliferacji w liniach komórek T od trzech różnych pacjentów alergicznych na pyłek brzozy ze wskaźnikami stymulacji podobnymi do zrekombinowanych i naturalnie występujących mutacji.

Krystalizacja i strukturalne oznaczenie zrekombinowanego Glu45Ser Bet v 1

Wzrost kryształów zrekombinowanego Glu45Ser Bet v 1 otrzymywano przez dyfuzję gazową w temperaturze 25°C zasadniczo tak, jak to opisano w publikacji Spangfort i wsp. 1996b, publ. 21). Glu45Ser Bet v 1 w stężeniu 5 mg/ml zmieszano z równą objętością 2,0 M siarczanu amonu, 0,1 M cytrynianu sodu, 1% (obj./obj.) dioksanu, pH 6,0 i zrównoważono wobec 100 x objętości 2,0 M siarczanu amonu, 0,1 M cytrynianu sodu, 1% (obj./obj.) dioksanu, pH 6,0. Po 24 godzinach równoważenia, hodowlę kryształu indukowano przez stosowanie techniki zaszczepiania opisanej w publ. 21, stosując kryształy zrekombinowanego Bet v 1 typu dzikiego jako źródła zarodzi.

Po około 2 miesiącach, zebrano kryształy i analizowano je stosując promienie rentgenowskie wygenerowane z anody wirującej Rigaku, jak to opisano w publ. 21, a struktura była rozwiązana stosując podstawienie molekularne. Struktura mutanta Glu45Ser Bet v 1.

Strukturalny efekt mutacji skierowano przez wzrost trójwymiarowych kryształów białka Bet v 1 Glu45Ser poddanych dyfrakcji przy rozdzielczości 3,0 A, podczas analizy promieniami rentgenowskimi generowanymi z wirującej anody. Podstawienie kwasu glutaminowego przez serynę w pozycji 45 zostało zweryfikowane przez zmapowanie gęstości struktury elektronowej Glu45Ser Bet v 1, która także pokazała, że zachowana została cała struktura trójwymiarowa szkieletu α-węgla.

Właściwości wiążące IgE mutanta Glu45Ser Bet v 1

Właściwości wiążące mutanta Glu45Ser Bet v 1 porównano ze zrekombinowanym Bet v 1 w oznaczeniu w fazie płynnej inhibicji stosując IgE surowicy zbiorczej pochodzącej od pacjentów alergicznych na brzozę.

Zrekombinowany Bet v 1 Nr 2801 biotynylowano w stosunku molowym 1:5 (Bet v 1 Nr 2801:biotyna). Oznaczenie inhibicji przeprowadzono, jak następuje: próbkę surowicy (25 μΊ) inkubowano z anty IgE w fazie stałej, płukano, zawieszano ponownie i dalej inkubowano z mieszaniną biotynylowanego Bet v 1 Nr 2801 (3,4 nM) i danego mutanta (0-28,6 nM). Ilość biotynylowanego Bet v 1 Nr 2801 wiązanego do fazy stałej oceniono z pomiaru RLU po inkubacji ze streptawidyną oznakowaną estrem akrydyny. Stopień inhibicji wyliczono jako stosunek między RLU otrzymanym z zastosowaniem buforu i mutanta jako inhibitora.

PL 214 225 B1

Figura 4 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE w surowicy z surowicy zbiorczej pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Glu45Ser Bet v 1.

Istnieje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek potrzebnych do uzyskania 50% inhibicji wiązania IgE w surowicy obecnej w surowicy zbiorczej. Zrekombinowany Bet v 1 osiąga 50% inhibicji przy około 6,5 ng podczas, gdy odpowiednie stężenie dla mutanta Glu45Ser Bet v 1 wynosi około 12 ng. To wykazuje, że mutacja punktowa wprowadzona do mutanta Glu45Ser Bet v 1 wyraźnie obniża powinowactwo w stosunku do specyficznego IgE w surowicy 2-krotnie. Maksymalny poziom inhibicji osiągany przez mutanta Glu45Ser Bet v 1 jest wyraźnie niższy w porównaniu do zrekombinowanego Bet v 1. To może wskazywać, że po podstawieniu Glu45Ser, część specyficznych IgE występujących w surowicy zbiorczej jest niezdolna do rozpoznania mutanta Glu45Ser Bet v 1.

Mutant Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln

Asparaginian i lizyna, odpowiednio, w pozycjach 28 i 32 wykazują wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (odpowiednio, 35% i 50%) i umiejscowione są w obszarze powierzchni molekularnej wspólnym dla alergenów Fagales (obszar II). W strukturze, asparaginian 28 i lizyna 32 umiejscowione są blisko siebie na powierzchni molekularnej i najprawdopodobniej oddziałują wzajemnie za pomocą wiązań wodorowych. Znaleziono resztę treoniny i glutaminy w pozycjach 28 i 32, odpowiednio w niektórych z białek PR-10 homologicznych do Bet v 1, co przemawia za tym, że asparaginian i lizyna mogą być podstawione, odpowiednio, treoniną i glutaminą, bez zaburzenia struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla. Dodatkowo jako, że żadna z naturalnie występujących sekwencji izoalergenów nie ma treoniny i glutaminianu, odpowiednio, w pozycjach 28 i 32, powoduje powstanie nie występującej naturalnie cząsteczki Bet v 1.

Właściwości wiązania DNA mutanta Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln

Właściwości wiążące mutanta Asn28Thr+Lys32Gln porównano ze zrekombinowanym Bet v 1 w oznaczeniu w fazie płynnej inhibicji stosując IgE surowicy zbiorczej pochodzącej od pacjentów alergicznych na brzozę opisanych powyżej.

Figura 5 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE w surowicy z puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Asn28Thr+Lys32Gln Bet v 1.

Istnieje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek potrzebnych do uzyskania 50% inhibicji wiązania do IgE w surowicy obecnej w surowicy zbiorczej. Zrekombinowany Bet v 1 osiąga 50% inhibicji przy około 6,5 ng, podczas gdy odpowiednie stężenie dla mutanta Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln wynosi około 12 ng. To wykazuje, że mutacje punktowe wprowadzone w mutancie Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln obniżają powinowactwo dla specyficznego IgE w surowicy około 2-krotnie.

Maksymalny poziom inhibicji osiągnięty przez mutanta Asn28Thr+Lys32Gln Bet v 1 jest wyraźnie niższy w porównaniu ze zrekombinowanym Bet v 1. To może wskazywać, że po substytucjach Asn28Thr+Lys32Gln, część specyficznego IgE obecnego w surowicy zbiorczej nie jest zdolna do rozpoznania mutanta Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln.

MutantBetv 1 Pro108Gly

Prolina w pozycji 108 wykazuje wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (60%>) i umiejscowiona jest w obszarze powierzchni molekularnej wspólnym dla antygenów Fagales (obszar III). Znaleziono resztę glicyny w pozycji 108 w niektórych białkach PR-10 homologicznych do Bet v 1 sugerując, że prolina może być podstawiona glicyną bez zaburzenia struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla. Dodatkowo, jako że żadna z naturalnie występujących sekwencji izoalergenów nie ma glicyny w pozycji 108, podstawienie proliny glicyną powoduje powstanie nie występującej naturalnie cząsteczki Bet V 1.

Właściwości wiążące mutanta Bet v 1 Pro108Gly

Właściwości wiążące mutanta Pro108Gly porównano ze zrekombinowanym Bet v 1 w oznaczeniu w fazie płynnej inhibicji stosując IgE surowicy zbiorczej pochodzącej od pacjentów alergicznych na brzozę opisanych powyżej.

Figura 6 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE w surowicy z puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Pro108Gly Bet v 1.

Istnieje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek potrzebnych do uzyskania 50% inhibicji wiązania do IgE w surowicy obecnej w surowicy zbiorczej. Zrekombinowany Bet v 1

PL 214 225 B1 osiąga 50% inhibicji przy około 6,5 ng, podczas gdy odpowiednie stężenie dla mutanta Bet v 1 Pro108Gly wynosi około 15 ng. To wykazuje, że pojedyncza mutacja punktowa wprowadzona w mutancie Bet v 1 Pro108Gly obniża powinowactwo dla specyficznego IgE w surowicy około 2-krotnie.

Maksymalny poziom inhibicji osiągnięty przez mutanta Pro108Gly Bet v 1 jest nieco niższy w porównaniu ze zrekombinowanym Bet v 1. To może wskazywać, że po substytucji Pro108Gly, część specyficznego IgE obecnego w surowicy zbiorczej nie jest zdolna do rozpoznania mutanta Bet v 1 Pro108Gly.

Mutant Bet v 1 Glu60Ser (mutant bez obszaru)

Kwas glutaminowy w pozycji 60 wykazuje wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (60%), jednak, nie jest umiejscowiony w obszarze powierzchni molekularnej wspólnym dla antygenów Fagales. Znaleziono resztę seryny w pozycji 60 w niektórych z białek PR-10 homologicznych do Bet v 1 sugerując, że kwas glutaminowy może być podstawiony seryną bez zaburzenia struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla. Dodatkowo jako, że żadna z naturalnie występujących sekwencji izoalergenów nie ma seryny w pozycji 60, podstawienie kwasu glutaminowego seryną powoduje powstanie nie występującej naturalnie cząsteczki Bet v 1.

Właściwości wiążące mutanta Bet v 1 Glu60Ser

Właściwości wiążące IgE mutanta Glu60Ser porównano ze zrekombinowanym Bet v 1 w oznaczeniu w fazie płynnej inhibicji stosując IgE surowicy zbiorczej pochodzącej od pacjentów alergicznych na brzozę opisanych powyżej.

Figura 7 przedstawia inhibicje wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 do IgE w surowicy z puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta Glu60Ser Bet v 1. W przeciwieństwie do mutantów Glu45Ser, Pro108Gly i Asn28Thr+Lys32Gln, podstawienie kwasu glutaminowego 60 przez serynę nie wykazuje żadnych znaczących skutków na właściwości wiązania IgE. To wskazuje, że substytucje poza zdefiniowanymi wspólnymi obszarami Fagales mają tylko marginalny wpływ na wiązanie specyficznego IgE w surowicy popierając koncepcję, że konserwowane obszary powierzchni molekularnych alergenu przechowują dominujące epitopy wiążące IgE.

Mutant trójobszarowy Bet v 1

W mutancie trójobszarowym, mutacje punktowe (Glu45Ser, Asn28Thr+Lys32Gln i Pro108Gly) wprowadzone do trzech różnych obszarów wspólnych u Fagales opisanych powyżej były równocześnie wprowadzone w celu utworzenia mutanta syntetycznego niosącego cztery podstawienia aminokwasów. Analiza strukturalna mutanta trójobszarowego Bet v 1

Integralność strukturalną oczyszczonego mutanta trójobszarowego analizowano przy pomocy spektroskopii dichroizmu kołowego (CD). Figura 8 przedstawia spektra CD rekombinanta i mutanta trójobszarowego, mierzone przy prawie równych stężeniach. Nakładanie się szczytów amplitud i pozycji w spektrach CD z dwóch zrekombinowanych białek pokazuje, że dwa preparaty zawierają prawie równe ilości struktur drugorzędowych, co wyraźnie sugeruje, że wprowadzone substytucje aminokwasów nie wpływają na strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla.

Własności wiązania IgE przez mutanta trójobszarowego Bet v 1

Własności wiązania IgE przez mutanta trójobszarowego Bet v 1 porównano z rekombinantem Bet v 1 w oznaczeniu w fazie płynnej inhibicji IgE stosując IgE surowicy zbiorczej pochodzącej od pacjentów z alergią na pyłek brzozy opisanych powyżej.

Figura 9 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1 z IgE w surowicy od puli pacjentów alergicznych przez niebiotynylowany Bet v 1 i przez mutanta trójobszarowego Bet v 1. W przeciwieństwie do pojedynczych mutantów opisanych powyżej, krzywa inhibicji mutanta trójobszarowego nie jest dłużej równoległa w stosunku do krzywej rekombinanta. Pokazuje to, że substytucje wprowadzone u mutanta trójobszarowego zmieniły własności wiązania IgE i profil epitopu w porównaniu z rekombinantem. Brak równoległego przebiegu utrudnia ocenę ilościową spadku powinowactwa mutanta trójobszarowego dla specyficznego IgE w surowicy.

Zrekombinowany Bet v 1 osiąga 50% inhibicji przy około 6 ng, podczas gdy odpowiadające stężenie dla mutanta trójobszarowego Bet v 1 wynosi 30 ng, to znaczy zmniejsza powinowactwo 5-krotnie. Jednak, w celu osiągnięcia 80% inhibicji, odpowiednie ilości wynoszą, odpowiednio, 20 ng i 400 ng, co oznacza spadek 20-krotny.

Oznaczenie proliferacji komórek T przy użyciu mutanta trójobszarowego Bet v 1

Analizę przeprowadzono tak, jak to opisano w publ. 15. Stwierdzono, że mutant trójobszarowy Bet v 1 był zdolny do indukowania proliferacji linii komórek T od trzech różnych pacjentów z alergią na

PL 214 225 B1 pyłek brzozy, ze stymulacją o wskaźnikach podobnych jak u rekombinanta i naturalnie pojawiającego się mutanta. Sugeruje to, że mutant trójobszarowy może inicjować komórkową odpowiedź immunologiczną niezbędną do produkcji przeciwciał.

P r z y k ł a d 2

Przykład 2 opisuje przygotowanie zrekombinowanych zmutowanych alergenów z jedną mutacją pierwotną. Zrekombinowane zmutowane alergeny według wynalazku, to znaczy alergeny zawierające co najmniej cztery mutacje pierwotne mogą być przygotowane przy użyciu tych samych procedur.

Identyfikacja wspólnych epitopów antygenu 5 głównego alergenu jadu Vespula vulgaris. Antygen 5 jest jednym z trzech białek jadu osy, które są znane jako alergeny ludzkie. Osowate obejmują szerszenie, pszczoły i osy. Dwa inne, znane alergeny jadu osowatych to fosfolipaza A1 i hialuronidaza. Antygen 5 osy zwyczajnej (Ves v 5) został sklonowany i wyrażony jako zrekombinowane białko w układzie drożdży (Monsalve i wsp. 1999, publ. 22). Trójwymiarowa struktura krystaliczna zrekombinowanego Ves v 5 ostatnio została określona z rozdzielczością 1,8 A (w preparacie). Głównymi właściwościami struktury są cztery nici β i cztery α-helisy ułożone w trzy nakładające się warstwy tworzące „α-β-α sandwicz”. Identyczność sekwencji między alergenami homologicznymi do antygenu 5 od różnych gatunków osy wynosi około 90%, co sugeruje obecność konserwowanych obszarów powierzchni molekularnej i epitopów komórek B.

Obecność i identyfikacja wspólnych obszarów przeprowadzono po uszeregowaniu wszystkich znanych sekwencji aminokwasów, jak to uprzednio opisano dla trzech alergenów pyłkowych, alergenów antygenu 5 Vespula w połączeniu z analizą powierzchni molekularnej antygenu 5, ujawnionej przez strukturę trójwymiarową Ves v 5.

Figura 10 przedstawia dostępność dla rozpuszczalnika indywidualnie uszeregowanych reszt antygenu 5 i uszeregowanie sekwencji antygenu 5 (lewy panel). Prawy panel pokazany na fig. 10 przedstawia powierzchnię molekularną antygenu 5 z konserwowanymi obszarami antygenu 5:s Vespula, które zabarwiono.

Wybór reszt aminokwasowych do mutagenezy ukierunkowanej

Reszty aminokwasowe do ukierunkowanej mutagenezy wybrano spośród reszt umiejscowionych w obszarach wspólnych dla Vespula jako, że spodziewano się, że ich modyfikacje wpływają na wiązanie IgE w surowicy od większości pacjentów wykazujących kliniczną, alergiczną reaktywność krzyżową w stosunku do Vespula.

Względna orientacja i procent ekspozycji każdej reszty aminokwasowej w odpowiednim obszarze obliczano na podstawie ich współrzędnych atomowych. Reszty mające niski stopień ekspozycji na rozpuszczalnik nie były uznane za odpowiednie do mutagenezy w związku z ewentualnym zaburzeniem struktury lub brakiem interakcji z przeciwciałem. Pozostałe reszty oceniano według stopnia ich ekspozycji na rozpuszczalnik.

Klonowanie genu kodującego Ves v 5

Całkowite RNA izolowano z jadu kwaśnych gruczołów osy Vespula vulgaris zgodnie z opisem w publikacji Fang i wsp. 1988( publ. 23).

Synteza pierwszej nici DNA, amplifikacja PCR i klonowanie genu Ves v 5 przeprowadzono zgodnie z opisem w publikacji Lu i wsp. 1993 (publ. 24).

Subklonowanie do pPICZaA

Gen kodujący Ves v 5 subklonowano następnie do wektora pPICZaA (Invitrogen) w celu sekrecyjnej ekspresji Ves v 5 u Pichia pastoris. Gen był amplifikowany za pomocą PCR i subklonowany do ramki zawierającej sekwencje kodujące dla sygnału sekrecji czynnika α Saccharomyces cerevisiae. W konstrukcie tym czynnik α rozszczepiano, in vivo, przez system proteaz Kex2 Pichia pastoris podczas sekrecji białka.

W skrócie, reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu Ves v 5 jako matrycy i starterów odpowiadających, odpowiednio, końcowi aminowemu i karboksylowemu białka. Startery rozciągały się w końcu 5' w celu objęcia miejsc restrykcyjnych do klonowania, odpowiednio, EcoRl i Xbal. Nukleotydy kodujące miejsca rozszczepień Kex2 znajdowały się w tym konstrukcie w odległości 18 nukleotydów powyżej względem końca aminowego białka, czego efektem była ekspresja Ves v 5 z sześcioma dodatkowymi aminokwasami, Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Phe, w końcu aminowym.

Wprowadzenie pPICZaA- Ves v 5 do P. pastoris

Wektory pPICZ aA z wprowadzonym genem Ves v 5 linearyzowano przez restrykcję Sac I i wprowadzono do miejsca AOXl w genomie Pichia pastoris. Insercję przeprowadzono poprzez

PL 214 225 B1 rekombinację homologiczną na komórkach KM71 Pichia pastoris zgodnie z zaleceniami firmy Invitrogen.

Mutageneza in vitro

Mutageneza in vitro przeprowadzono przy zastosowaniu techniki PCR używając rekombinanta ρΡ^ΖαΑ z Ves v 5 wprowadzonego jako matryca. Każdy mutant genu Ves v 5 utworzono w 3 reakcjach PCR przy zastosowaniu 4 starterów.

Dwa startery oligonukleotydowe specyficzne dla mutacji zsyntetyzowano mieszcząc każdą mutację, jedną dla każdej nici DNA, patrz fig. 11 i 12. Stosując zmutowany(e) nukleotyd(y) jako punkt startu, oba startery wydłużono o 6-7 nukleotydów w końcu 5' i o 12-13 nukleotydów w końcu 3'. Wydłużone nukleotydy miały identyczne sekwencje, jak w genie Ves v 5 w danym regionie.

Dwa możliwe do zastosowania startery (określane jako „całe sensowne” i „całe nonsensowne” na fig. 12) były dalej syntetyzowane i użyte u wszystkich mutantów. Aby zapewnić ekspresję mutantów Ves v 5 z autentycznym końcem aminowym, jeden starter odpowiadający końcowi aminowemu białka wydłużono w końcu 5' z miejscem Xho I. Po insercji genów mutanta Ves v 5 do wektora pPICZuA miejsce rozszczepienia przez proteazę Kex2 odtwarzano bezpośrednio powyżej względem końca aminowego Ves v 5. Sekwencja drugiego startera odpowiadała sekwencji rejonu wektora pPICZaA usytuowanego w przybliżeniu 300 pz (par zasad), poniżej genu Ves v 5. Sekwencja startera odpowiadającego końcowi aminowemu Ves v 5 pochodziła od nici sensownej, a sekwencja startera dolnego pochodziła od nici nonsensownej, patrz fig. 11.

Zasadniczo przeprowadzono dwie niezależne reakcje PCR zgodnie z procedurami standardowymi (Saiki i wsp. 1988) z takim wyjątkiem, że przeprowadzono tylko 20 cykli temperaturowych w celu zmniejszenia częstości artefaktów PCR. W każdej reakcji PCR stosowano pPICZαA z Ves v 5 wprowadzonym jako matryca oraz jeden specyficzny dla mutacji i jeden ogólnie możliwy do zastosowania starter w istotnych kombinacjach.

Produkty PCR oczyszczono przy użyciu „Concert, Rapid PCR Purification System” (Life Technologies). Trzecią reakcję PCR przeprowadzono stosując łączone produkty PCR z dwóch pierwszych reakcji PCR jako matrycę i oba ogólnie możliwe do zastosowania startery. Ponownie, zastosowano 20 cykli standardowej techniki PCR. Produkt PCR oczyszczono technologią „Concert, Rapid PCR Purification System” (Life Technologies), cięto enzymami restrykcyjnymi (Xhol/Xbal)) i ligowano kierunkowo do wektora pPICZαA ograniczonego tymi samymi enzymami. Figura 13 przedstawia przegląd wszystkich mutacji Ves v 5.

Wprowadzenie mutantów pPICZαA-Ves v 5 do P. pastoris

Wektory pPICZαA z wprowadzonymi zmutowanymi genami Ves v 5 Iinearyzowano przez restrykcję Sac I i wprowadzono w miejsce AOXI w genomie Pichia pastoris. Insercje przeprowadzono przez rekombinację homologiczną w komórkach KM71 Pichia pastoris, zgodnie z zaleceniem firmy Invitrogen.

Sekwencjonowanie nukleotydów

Wyznaczenie sekwencji nukleotydowej genu kodującego Ves v 5 przeprowadzono, odpowiednio, przed i po subklonowaniu oraz po mutagenezach in vitro.

Plazmidowe DNA z 10 ml kultury bakteryjnej, która wzrastała do nasycenia przez całą noc w środowisku LB uzupełnionym 0,1 g/l ampicyliny, oczyszczono na kolumnach Qiagen-tip 20 i sekwencjonowano przy użyciu zestawu do sekwencjonowania DNA (USB), zgodnie z zaleceniem dostawców.

Ekspresja i oczyszczenie zrekombinowanego Ves v 5

Zrekombinowane komórki drożdży szczepu KM71 Pichia pastoris wzrastały w 500 ml butelkach zawierających 100 ml buforu fosforanowego o pH 6,0, który zawierał podłoże azotowe dla drożdży, biotynę, glicerol i histydynę, w temperaturze 3°C i wstrząsano przy 225 obr/min do A₆₀₀ nm z 4-6. Komórki zebrano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w 10 ml podobnego buforowanego środowiska zawierającego metanol zamiast glicerolu. Inkubację kontynuowano w 30°C przez 7 dni, dodając codziennie 0,05 ml metanolu.

Komórki zebrano przez odwirowanie, a zgromadzony płyn hodowlany zagęszczono przez ultrafiltrację. Po dializie wobec 50 mM buforu octanu amonowego, pH 4,6, próbkę umiejscowiono w kolumnie wymiany kationowej SE-53 FPLC (Pharmacia), zrównoważoną w tym samym buforze. Kolumnę eluowano liniowym gradientem 0-1,0 M NaCl, 50 mM octanu amonu. Pik elucyjny zrekombinowanego Ves v 5 w około 0,4 M NaCl zebrano i dializowano wobec 0,02 N kwasu octowego. Po zatężeniu do około 10 mg/ml, oczyszczony Ves v 5 przechowywano w temperaturze 4°C.

PL 214 225 B1

Krystalizacja zrekombinowanego Ves v 5

Kryształy Ves v 5 wzrastały dzięki technice dyfuzji par w temperaturze 25°C. W celu krystalizacji, 5 ąl 5mg/ml Ves v 5 zmieszano z 5 ąl 18% PEG 6000, 0,1 M cytrynianu sodu, pH 6,0 i równoważono przeciw 1 ml 18% PEG 6000, 0,1 M cytrynianowi sodu, pH 6,0.

Dane dyfrakcji promieni rentgenowskich zebrano przy 100K od natywnych kryształów Ves v 5 i po inkorporacji pochodnych ciężkiego atomu, i użyto do rozwiązania trójwymiarowej struktury Ves v 5, patrz fig. 10 (manuskrypt w przygotowaniu).

Immunoelektroforeza przy zastosowaniu króliczych przeciwciał poliklonalnych

Dwa mutanty Ves v 5 utworzono jako zrekombinowane białka Ves v 5 i dalej testowano na ich reaktywność w stosunku do króliczych przeciwciał poliklonalnych skierowanych przeciwko zrekombinowanemu Ves v 5. Podczas analizy przy zastosowaniu immunoelektroforezy („rocket”) w warunkach natywnych, przeciwciała królicze były zdolne do wytrącania zrekombinowanego Ves v 5 jak również dwóch mutantów, co wskazuje, że mutanty posiadają konserwowaną strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla.

Inhibicja specyficznych IgE surowicy

Własności wiązania IgE przez mutanty Ves v 5 porównano z własnościami zrekombinowanego Ves v 5 w oznaczeniu inhibicji IgE w fazie płynnej stosując IgE surowicy zbiorczej pochodzącej od pacjentów z alergią na jad os.

Oznaczenie inhibicji przeprowadzono tak, jak to opisano powyżej, stosując biotynylowany rekombinant Ves v 5 zamiast Bet v 1.

Mutant Lys72Ala Ves v 5

Lizyna w pozycji 72 wykazuje wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (70%) i jest umiejscowiona w obszarze na powierzchni molekularnej, wspólnej dla antygenu 5 Vespula. Względna orientacja i wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik przemawiają za tym, że lizyna 72 może być zastąpiona resztą alaniny bez zniekształcania struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla. Dodatkowo, ponieważ żadna z naturalnie występujących sekwencji izoalergenu nie posiada alaniny w pozycji 72, substytucja lizyny alaniną jest źródłem nienaturalnie występującej cząsteczki Ves v 5.

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Lys72Ala Ves v 5

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Lys72Ala Ves v 5 porównano ze zrekombinowanym Ves v 5 w oznaczeniu inhibicji IgE w fazie płynnej stosując IgE surowicy zbiorczej pochodzącej od pacjentów z alergią na jad osy, jak to opisano powyżej.

Figura 14 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Ves v 5 do IgE w surowicy pochodzącej z puli alergicznych pacjentów przez niebiotynylowane Ves v 5 i przez mutanta Lys72Ala Ves v 5.

Istnieje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek niezbędnych do osiągnięcia 50% inhibicji wiązania do IgE w surowicy obecnej w surowicy zbiorczej. Zrekombinowane Ves v 5 osiąga 50% inhibicji przy około 6 ng, podczas gdy odpowiadające stężenie dla mutanta Lys72Ala Ves v 5 wynosi około 40 ng. Pokazuje to, że punktowe mutacje wprowadzone do mutanta Lys72Ala Ves v 5 obniżają powinowactwo do specyficznych IgE w surowicy około 6-krotnie.

Maksymalny poziom inhibicji osiągany przez mutanta Lys72Ala Ves v 5 jest wyraźnie niższy w porównaniu z rekombinantem Ves v 5. Może to wskazywać, że po substytucji Lys72Ala, część specyficznych IgE występujących w surowicy nie jest w stanie rozpoznać mutanta Lys72Ala Ves v 5.

Mutant Tyr96Ala Ves v 5

Tyrozyna w pozycji 96 wykazuje wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (65%) i jest umiejscowiona w obszarze powierzchni molekularnej, wspólnej dla antygenu 5 Vespula. Względna orientacja i wysoki stopień ekspozycji na rozpuszczalnik przemawiają za tym, że tyrozyna 96 może być zastąpiona resztą alaniny bez zniekształcania struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla. Dodatkowo, ponieważ żadna z naturalnie występujących sekwencji izoalergenu nie posiada alaniny w pozycji 96, substytucja tyrozyny alaniną jest źródłem nienaturalnie występującej cząsteczki Ves V 5.

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Tyr96Ala Ves v 5

Właściwości wiązania IgE przez mutanta Tyr96Ala Ves v 5 porównano ze zrekombinowanym Ves v 5 w oznaczeniu inhibicji IgE w fazie płynnej stosując IgE surowicy zbiorczej pochodzącej od pacjentów alergicznych najad osy, jak to opisano powyżej.

Figura 14 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Ves v 5 z IgE w surowicy pochodzącej od grupy pacjentów alergicznych przez niebiotynylowane Ves v 5 i przez mutanta Tyr96Ala Ves v 5.

PL 214 225 B1

Istnieje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek niezbędnych do osiągnięcia 50% inhibicji wiązania IgE w surowicy występującej w surowicy zbiorczej. Zrekombinowane Ves v 5 osiąga 50% inhibicji przy około 6 ng, podczas gdy odpowiadające stężenie dla mutanta Tyr96Ala Ves v 5 wynosi około 40 ng.

Pokazuje to, że mutacje punktowe wprowadzone do mutanta Tyr96Ala Ves v 5 obniżają powinowactwo dla specyficznych IgE w surowicy około 6-krotnie.

Maksymalny poziom inhibicji osiągany przez mutanta Tyr96Ala Ves v 5 jest wyraźnie niższy w porównaniu z rekombinantem Ves v 5. Może to wskazywać, że po substytucji Tyr96Ala, część specyficznych IgE występujących w surowicy zbiorczej nie jest zdolna do rozpoznawania mutanta Tyr96Ala Ves v 5.

P r z y k ł a d 3

Identyfikacja i wybór aminokwasów do podstawienia

Parametry dostępności dla rozpuszczalnika i stopnia konserwacji zastosowano do identyfikacji i do wyboru eksponowanych na powierzchni aminokwasów odpowiednich do podstawienia dla alergenów Bet v 1, Der p 2 i Ves v 5.

Dostępność dla rozpuszczalnika

Dostępność dla rozpuszczalnika obliczono stosując oprogramowanie Insight II version 97.0 (MSI) i promień sondy wynoszący 1,4 A (powierzchnia Connolly).

Wewnętrzne jamy wykluczono z analiz przez zapełnienie sondami stosując oprogramowanie PASS (Putative Active Sites With Spheres - Przypuszczalne Miejsca Aktywne z Kulami). Sondy na powierzchni usunięto następnie ręcznie.

Konserwacja

Bet v 1:

Struktura 3-wymiarowa oparta jest na numerze dostępu Z80104 (1bv1.pdb).

innych sekwencji Bet v 1 włączonych do analizy konserwatywnych reszt obejmuje numery dostępu:

P15494=X15877=Z80106, Z80101, AJ002107, Z72429, AJ002108, Z80105, Z80100, Z80103, AJ001555, Z80102, AJ002110, Z72436, P43183=X77271, Z72430, AJ002106, P43178=X77267, P43179=X77268, P43177=X77266, Z72438, P43180=X77269, AJ001551, P43185=X77273,

AJ001557, Z72434, AJ001556, Z72433=P43186, AJ001554, X81972, Z72431, P45431=X77200, P43184=X77272, P43176=X77265, S47250, S47251, Z72435, Z72439, Z72437, S47249.

Der p 2:

Struktura 3-wymiarowa oparta jest na numerze dostępu P49278 (1a9v.pdb).

innych sekwencji Der p 2 włączonych do analizy konserwatywnych reszt obejmuje następujące podstawienia:

ALK-G: V40L, T47S, M111L, D114N.

ALK-101: M76V.

ALK-102: V40L, T47S.

ALK-104: T47S, M111I, D114N.

ALK-113: T47S.

ALK-120: V40L, T47S, D114N.

Ves v 5:

Struktura 3-wymiarowa oparta jest na numerze dostępu Q05110 (współrzędne pdb niepublikowane).

Inna sekwencja Ves v 5 włączona do analizy konserwatywnych sekwencji obejmuje jedno podstawienie aminokwasu: M202K.

Wyniki Bet v 1 aminokwasów wysoce eksponowanych na rozpuszczalnik:

K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, T-77, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, L-62, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, I-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87, E-73.

aminokwasów wysoce eksponowanych na rozpuszczalnik i konserwowanych (> 70%):

K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, E-127, Q-36,

E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50,

N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, I-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103,

Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87, E-73.

PL 214 225 B1

Wykonano 23 mutacje:

Y5V, T10P, D25E, N28T, K32Q, E42S, E45S, N47S, K55N, K65N, T77A, N78K, E96L, K97S, K103V, P108G, D109N, K123I, D125Y, K134E, R145E, D156H, +160N.

Tabela 1 przedstawia listę w porządku malejącym ekspozycji na rozpuszczalnik aminokwasów Bet v 1. Kolumna 1 wylicza numery aminokwasów startując od amino-końca, kolumna 2 podaje aminokwas w skrótach jednoliterowych, kolumna 3 wylicza normalizowany wskaźnik ekspozycji na rozpuszczalnik, a kolumna 4 wylicza procent znanych sekwencji mających odpowiedni aminokwas w tej pozycji.

Tabela 1: Bet v 1

Nr	AA	Eksp. na rozpuszcz.	Kons. %
1	2	3
129K	1,000	90
60E	0,986	97
47N	0,979	100
65K	0,978	100
108P	0,929	100
159N	0,869	100
93D	0,866	100
123K	0,855	100
32K	0,855	100
125D	0,821	74
145R	0,801	90
109D	0,778	82
77T	0,775	56
127E	0,760	100
36Q	0,749	95
131E	0,725	100
152L	0,718	97
6E	0,712	100
96E	0,696	100
156D	0,693	97
63P	0,692	97
76H	0,683	90
8E	0,638	97
134K	0,630	100
45E	0,623	100
10T	0,613	97
12V	0,592	100
20K	0,584	100
62L	0,575	5
155S	0,568	97
126H	0,551	95

PL 214 225 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
50P	0,541	100
78N	0,538	100
119K	0,529	100
2V	0,528	100
24L	0,528	100
42E	0,519	100
4N	0,517	95
153A	0,513	100
441	0,508	97
138E	0,496	100
61G	0,488	100
130A	0,479	97
70R	0,474	100
28N	0,469	90
35P	0,467	100
149S	0,455	92
103K	0,447	100
150Y	0,438	100
154H	0,436	100
43N	0,412	100
106A	0,411	95
115K	0,411	100
14P	0,410	97
5Y	0,410	100
137Κ	0,396	100
141Ε	0,387	95
87Ε	0,385	100
73Ε	0,384	100
16Α	0,367	100
79F	0,362	100
3F	0,355	100
158Υ	0,346	100
105V	0,336	100
101E	0,326	100
64F	0,325	100
861	0,322	100
39S	0,314	100
124G	0,310	100

PL 214 225 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
72D	0,308	97
142Τ	0,293	67
66Υ	0,289	100
55Κ	0,288	100
7Τ	0,279	67
40S	0,274	95
25D	0,271	87
135Α	0,267	92
68Κ	0,262	100
97Κ	0,247	100
46G	0,235	100
27D	0,232	97
1G	0,227	100
113I	0,225	77
51G	0,220	100
92G	0,218	100
80Κ	0,212	100
110G	0,211	100
107T	0,203	85
94T	0,202	92
41V	0,201	97
48G	0,198	100
91I	0,192	18
31P	0,188	100
75D	0,188	97
33V	0,183	100
49G	0,176	100
17R	0,172	100
99S	0,158	64
89G	0,154	100
53I	0,154	100
121H	0,153	100
9T	0,150	72
74V	0,148	97
132Q	0,146	72
57S	0,137	49
148E	0,135	100
82N	0,133	41

PL 214 225 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
128V	0,125	64
117S	0,124	87
90P	0,117	67
116I	0,112	100
122T	0,107	100
139M	0,104	62
95L	0,104	97
54K	0,096	100
146A	0,095	100
59P	0,088	97
157A	0,088	100
133V	0,077	44
88G	0,068	100
140G	0,053	85
37A	0,042	95
81Y	0,041	100
23I	0,036	95
104I	0,036	92
15A	0,036	97
58F	0,029	100
29L	0,028	100
19F	0,027	100
100N	0,022	97
22F	0,021	97
71V	0,014	100
111G	0,014	100
13I	0,014	100
18L	0,014	97
114L	0,014	100
11S	0,007	100
151L	0,007	97
144L	0,007	90
52T	0,007	100
84S	0,007	97
118N	0,007	97
102I	0,007	100
21A	0,000	97
26G	0,000	97

PL 214 225 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
30F	0,000	44
34A	0,000	100
38I	0,000	87
56I	0,000	100
67V	0,000	97
69D	0,000	62
83Y	0,000	95
85V	0,000	72
98I	0,000	95
112S	0,000	77
120Y	0,000	95
136S	0,000	67
143L	0,000	100
147V	0,000	100

Der p 2 aminokwasów wysoce eksponowanych na rozpuszczalnik:

R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K-82, K-6, K-96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, I-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K-126, L-61, P-26, N-93, D-64, I-28, K-14, Κ-100, E-62, I-127, E-102, E-25, P-66, D-114, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, H-124, I-68, P-79, K-109, K-15.

aminokwasy wysoce eksponowane na rozpuszczalnik i konserwowanych (> 70%):

R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K-82, K-6, K-96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, I-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K-126, L-61, P-26, N-93, D-64, I-28, K-14, Κ-100, E-62, I-127, E-102, E-25, P-66, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, H-124, I-68, P-79, K-109, K-15.

Wykonano 6 mutacji:

K6A, K15E, H30N, E62S, H74N, K82N

Tabela 2 przedstawia listę w porządku malejącym ekspozycji na rozpuszczalnik aminokwasów Der p 2. Kolumna 1 wylicza numery aminokwasów startując od amino-końca, kolumna 2 podaje aminokwas w skrótach jednoliterowych, kolumna 3 wylicza normalizowany wskaźnik ekspozycji na rozpuszczalnik, a kolumna 4 wylicza procent znanych sekwencji mających odpowiedni aminokwas w tej pozycji.

Tabela 2: Der p 2

Nr	AA	Eksp. na rozpuszcz.	Kons. %
1	2	3
128R	1,000	100
129D	0,965	100
11H	0,793	100
30H	0,712	100
IS	0,700	100
77K	0,694	100
75Y	0,681	100

PL 214 225 B1 cd. tabeli 2

1	2	3
31R	0,677	100
82K	0,658	100
6K	0,645	100
96K	0,643	100
48K	0,642	100
55K	0,641	100
89K	0,627	100
85Q	0,624	100
92W	0,610	100
97I	0,581	100
22H	0,568	100
65V	0,559	100
24S	0,557	100
74H	0,542	100
126K	0,542	100
61L	0,539	100
26P	0,516	100
93N	0,513	100
64D	0,509	100
28I	0,504	100
14K	0,493	100
100K	0,489	100
62E	0,454	100
127I	0,439	100
102E	0,428	100
25E	0,428	100
66P	0,427	100
114D	0,418	57
17L	0,412	100
60G	0,390	100
95P	0,388	100
53E	0,377	100
81V	0,377	100
51K	0,370	100
103N	0,369	100
2Q	0,386	100
46N	0,360	100
42E	0,357	100

PL 214 225 B1 cd. tabeli 2

1	2	3
91T	0,340	100
87D	0,334	100
10N	0,333	100
111M	0,325	71
8C	0,323	100
124H	0,315	100
68I	0,313	100
79P	0,307	100
109K	0,307	100
15K	0,302	100
49T	0,292	100
44N	0,291	100
113D	0,290	100
63V	0,286	100
105V	0,280	100
19P	0,270	100
84Q	0,264	100
76M	0,262	86
7D	0,251	100
116V	0,244	100
78C	0,238	100
36Q	0,235	100
45Q	0,233	100
40V	0,223	57
57S	0,212	100
38E	0,205	100
69D	0,203	100
9A	0,196	100
71N	0,190	100
98A	0,186	100
115G	0,180	100
13I	0,179	100
123T	0,179	100
34P	0,178	100
4D	0,157	100
20G	0,150	100
107T	0,143	100
12E	0,137	100
94V	0,137	100

PL 214 225 B1 cd. tabeli 2

1	2	3
121I	0,136	100
83G	0,128	100
70P	0,128	100
73C	0,120	100
3V	0,116	100
35F	0,111	100
59D	0,099	100
29I	0,098	100
23G	0,085	100
54I	0,075	100
5V	0,075	100
101S	0,074	100
72A	0,069	100
27C	0,060	100
32G	0,059	100
99P	0,058	100
86Y	0,056	100
16V	0,052	100
50A	0,040	100
90Y	0,039	100
18V	0,035	100
33K	0,033	100
52I	0,029	100
58I	0,029	100
104V	0,024	100
112G	0,023	100
21C	0,023	100
88I	0,023	100
117L	0,016	100
56A	0,011	100
41F	0,011	100
120A	0,006	100
119C	0,006	100
67G	0,005	100
122A	0,005	100
37L	0,000	100
39A	0,000	100
43A	0,000	100

PL 214 225 B1 cd. tabeli 2

1	2	3
47T	0,000	29
80L	0,000	100
106V	0,000	100
108V	0,000	100
110V	0,000	100
118A	0,000	100
125A	0,000	100

Ves v 5 aminokwasów wysoce eksponowanych na rozpuszczalnik:

K-16, K-185, K-11, Κ-44, K-210, R-63, K-13, F-6, Κ-149, Κ-128, E-184, K-112, K-202, F-157, Ε-3, Κ-29, Ν-203, Ν-34, Κ-78, K-151, L-15, L-158, Y-102, W-186, K-134, D-87, Κ-52, Τ-67, T-125, K-150, Y-40, Q-48, L-65, K-81, Q-101, Q-208, K-144, N-8, N-70, H-104, Q-45, K-137, K-159, E-205, N-82, A-111, D-131, K-24, V-36, N-7, M-138, T-209, V-84, K-172, V-19, D-56, P-73, G-33, T-106, N-170, L-28, T-43, Q-114, C-10, K-60, N-31, K-47, E-5, D-145, V-38, A-127, D-156, E-204, P-71, G-26, Y-129, D-141, F-201, R-68, N-200, D-49, S-153, K-35, S-39, Y-25, V-37, G-18, W-85, I-182.

aminokwasów wysoce eksponowanych na rozpuszczalnik i konserwowanych (> 70%):

K-16, K-185, K-11, K-44, K-210, R-63, K-13, F-6, Κ-149, K-128, E-184, K-112, F-157, Ε-3, Κ-29, Ν-203, Ν-34, K-78, K-151, L-15, L-158, Y-102, W-186, K-134, D-87, Κ-52, T-67, T-125, K-150, Y-40, Q-48, L-65, K-81, Q-101, Q-208, K-144, N-8, N-70, H-104, Q-45, K-137, K-159, E-205, N-82, A-111, D-131, K-24, V-36, N-7, M-138, T-209, V-84, K-172, V-19, D-56, P-73, G-33, T-106, N-170, L-28, T-43, Q-114, C-10, K-60, N-31, K-47, E-5, D-145, V-38, A-127, D-156, E-204, P-71, G-26, Y-129, D-141, F-201, R-68, N-200, D-49, S-153, K-35, S-39, Y-25, V-37,G-18, W-85, I-182.

Wykonano 9 mutacji:

K29A, T67A, K78A, V84S, Y102A, K112S, K144A, K202M, N203G

Tabela 3 przedstawia listę w porządku malejącym ekspozycji na rozpuszczalnik aminokwasów Ves v 5. Kolumna 1 wylicza numery aminokwasów startując od amino-końca, kolumna 2 podaje aminokwas w skrótach jednoliterowych, kolumna 3 wylicza normalizowany wskaźnik ekspozycji na rozpuszczalnik, a kolumna 4 wylicza procent znanych sekwencji mających odpowiedni aminokwas w tej pozycji.

Tabela 3: Ves v 5

Nr	AA	Eksp. Na rozpuszcz.	Kons. %
1	2	3
16K	1,000	100
185K	0,989	100
11K	0,978	100
44K	0,978	100
210K	0,962	100
63R	0,956	100
13K	0,951	100
6F	0,868	100
149K	0,868	100
128K	0,857	100
184E	0,841	100
112K	0,824	100

PL 214 225 B1 cd. tabeli 3

1	2	3
202K	0,824	50
157F	0,819	100
3E	0,802	100
29K	0,797	100
203N	0,797	100
34N	0,775	100
78K	0,775	100
151K	0,753	100
15L	0,714	100
158L	0,714	100
102Y	0,687	100
186W	0,665	100
134K	0,654	100
87D	0,621	100
52K	0,615	100
67T	0,610	100
125T	0,610	100
150K	0,604	100
40Y	0,593	100
48Q	0,593	100
65L	0,593	100
81K	0,588	100
101Q	0,577	100
208Q	0,566	100
144K	0,560	100
8N	0,555	100
70N	0,549	100
104H	0,549	100
45Q	0,538	100
137K	0,538	100
159K	0,533	100
205E	0,511	100
82N	0,500	100
111A	0,500	100
131D	0,495	100
24K	0,489	100
36V	0,489	100
7N	0,484	100

PL 214 225 B1 cd. tabeli 3

1	2	3
138M	0,473	100
209T	0,473	100
84V	0,462	100
172K	0,451	100
19V	0,445	100
56D	0,445	100
73P	0,440	100
33G	0,429	100
106T	0,429	100
170N	0,429	100
28L	0,423	100
43T	0,423	100
114Q	0,423	100
10C	0,412	100
60K	0,407	100
31N	0,396	100
47K	0,396	100
5E	0,390	100
145D	0,390	100
38V	0,379	100
127A	0,379	100
156D	0,379	100
204E	0,374	100
71P	0,363	100
26G	0,352	100
129Y	0,352	100
141D	0,341	100
201F	0,341	100
68R	0,335	100
200N	0,308	100
49D	0,302	100
153S	0,302	100
35K	0,297	100
39S	0,291	100
25Y	0,280	100
37V	0,280	100
18G	0,275	100
85W	0,275	100

PL 214 225 B1 cd. tabeli 3

1	2	3
182I	0,275	100
46E	0,264	100
126A	0,253	100
88E	0,247	100
76P	0,236	100
79N	0,236	100
124S	0,236	100
30P	0,231	100
123G	0,231	100
162H	0,231	100
183Q	0,231	100
12I	0,225	100
197P	0,225	100
130D	0,220	100
148P	0,214	100
180K	0,214	100
23C	0,209	100
75P	0,209	100
113Y	0,209	100
108R	0,203	100
188K	0,203	100
51L	0,198	100
59Q	0,198	100
121L	0,198	100
122T	0,198	100
154G	0,192	100
53E	0,170	100
72G	0,170	100
41G	0,165	100
86N	0,165	100
147N	0,165	100
173E	0,165	100
27S	0,159	100
94Q	0,159	100
187H	0,159	100
142E	0,154	100
64G	0,148	100
17G	0,143	100

PL 214 225 B1 cd. tabeli 3

1	2	3
133V	0,137	100
42L	0,121	100
155N	0,121	100
55N	0,115	100
91Y	0,115	100
69G	0,110	100
103G	0,110	100
198S	0,110	100
109D	0,093	100
207Y	0,082	100
96W	0,077	100
161G	0,077	100
140E	0,071	100
152F	0,071	100
80M	0,066	100
117Q	0,066	100
4A	0,060	100
32C	0,055	100
90A	0,055	100
206L	0,055	100
22A	0,049	100
110V	0,044	100
146Y	0,044	100
14C	0,038	100
9Y	0,033	100
62Α	0,033	100
132Ρ	0,033	100
57F	0,027	100
99Q	0,027	100
100C	0,027	100
199G	0,027	100
77Α	0,022	100
105D	0,022	100
119V	0,022	100
20H	0,016	100
83L	0,016	100
120A	0,016	100
139W	0,016	100

PL 214 225 B1 cd. tabeli 3

1	2	3
176C	0,016	100
178S	0,016	100
181Y	0,016	100
95V	0,011	100
115V	0,011	100
116G	0,011	100
165Q	0,011	100
169A	0,011	100
189H	0,011	100
66E	0,005	100
74Q	0,005	100
89L	0,005	100
92V	0,005	100
98N	0,005	100
118N	0,005	100
168W	0,005	100
21T	0,000	100
50I	0,000	100
54H	0,000	100
58R	0,000	100
61I	0,000	100
93A	0,000	100
97A	0,000	100
107C	0,000	100
135L	0,000	100
136V	0,000	100
143V	0,000	100
160T	0,000	100
163Y	0,000	100
164T	0,000	100
166M	0,000	100
167V	0,000	100
171T	0,000	100
174V	0,000	100
175G	0,000	100
177G	0,000	100
179I	0,000	100
190Y	0,000	100

PL 214 225 B1 cd. tabeli 3

1	2	3
191L	0,000	100
192V	0,000	100
193C	0,000	100
194N	0,000	100
195Y	0,000	100
196G	0,000	100

P r z y k ł a d 4

Ten przykład opisuje przygotowanie i charakterystykę zrekombinowanych zmutowanych alergenów Bet v 1, według wynalazku, to znaczy alergenów ze zmniejszonym powinowactwem do wiązania IgE zawierających co najmniej cztery mutacje pierwotne.

Wybór reszt aminokwasów do mutagenezy ukierunkowanej Bet v 1

Dostępność dla rozpuszczalnika reszt aminokwasów Bet v 1 przedstawiono w przykładzie 3, tabela 1. Stopień konserwacji aminokwasów oparty jest na dopasowaniu sekwencji wykonanym na Serwerze ExPaSy Molecular Biology (http://www.expasy.ch/) stosując algorytm ClustalW na poszukiwaniu BLAST, gdzie jako sekwencję wprowadzaną stosuje się sekwencję aminokwasów Bet v 1.2801 typu dzikiego. Porównanie obejmuje 67 sekwencji alergenów (39 sekwencji Bet v 1, 11 sekwencji Car b 1, 6 sekwencji Cor a 1 i 13 sekwencji Aln g 1) z gatunków z rzędu Fagales (Bet v 1: Betula verrucosa; Car b 1: Carpinus betulus; Cor a 1: Corylus avellana; Aln g 1: Alnus glutinosa). Pod względem zmutowanych alergenów Bet v 1 pokazanych w przykładzie, docelowe reszty do podstawienia były oparte na > 95% identyczności aminokwasów.

Jak opisano w przykładzie 1, reszty aminokwasów z wysokim stopniem ekspozycji na rozpuszczalnik i z wysokim stopniem konserwacji między alergenami pyłku z pokrewnych gatunków wybrano do mutagenezy ukierunkowanej. Reszty mające niski stopień ekspozycji na rozpuszczalnik (< 20%) nie uważano za odpowiednie do mutagenezy ze względu na możliwe zaburzenia struktury trzeciorzędowej lub brak interakcji z przeciwciałami.

Wprowadzone reszty były wszystkie obecne w odpowiednich pozycjach w izoformach w grupie roślinnych białek zwanych białkami związanymi z patogenezą (PR-10). Modelowanie molekularne sugeruje, że struktury trzeciorzędowe alergenów Fagales i białek PR-10 są prawie identyczne. Bet v 1 ma znaczącą identyczność sekwencji (20-40%) z białkami PR-10. Jednak, nie ma doniesień o krzyżowej reaktywności alergicznej do tych białek PR-10. Zatem, wymiana wysoce konserwowanego i eksponowanego na rozpuszczalnik aminokwasu z Bet v 1 na aminokwas w odpowiedniej pozycji w białku PR-10, daje zmutowane białko Bet v 1 z niezmienioną strukturą trzeciorzędową szkieletu α-węgla, ale ze zmniejszonym powinowactwem wiązania IgE.

Mutageneza in vitro

Mutagenezę in vitro przeprowadzono za pomocą PCR stosując zrekombinowany pMAL-c z Bet v 1 wstawionym jako matryca. Przygotowanie zrekombinowanych zmutowanych alergenów zawierających od pięciu do dziewięciu mutacji pierwotnych obejmowało dwa etapy PCR; etap I i II. Najpierw, każdą pojedynczą mutację (lub kilka mutacji, jeśli są one umiejscowione blisko siebie w sekwencji DNA) wprowadzono do kolejnych sekwencji DNA Bet v 1.2801 lub pochodnych Bet v 1.2801 stosując startery oligonukleotydowe sensowne i anty- sensowne specyficzne dla mutacji mieszczące każdą mutację/mutacje wraz z sensownymi i antysensownymi starterami oligonukleotydowymi mieszczącymi, odpowiednio, albo powyżej albo poniżej, mutacje sąsiadujące lub N-koniec/C-koniec Bet v 1, jak przedstawiono schematycznie na fig. 17 (I).

Po drugie, produkty PCR z reakcji PCR I oczyszczono, zmieszano i zastosowano jako matryce dla dodatkowej reakcji PCR (II) ze starterami oligonukleotydowymi mieszczącymi N-koniec i C-koniec Bet v 1, jak zilustrowano schematycznie na fig. 17 (II). Produkty PCR oczyszczono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i oczyszczono w żelu po PCR (Life Technologies) po strąceniu etanolem, po czym pocięto enzymami restrykcyjnymi (SacI/EcoRI) lub (SacI/XbaI) i ligowano kierunkowo do pMAL-c ograniczonego tymi samymi enzymami.

Figura 18 przedstawia syntetyzowane startery oligonukleotydowe i schematycznie ilustruje konstrukcję mutantów Bet v 1 z mutacjami pierwotnymi w ilości od pięciu do dziewięciu. Zmutowane amiPL 214 225 B1 nokwasy korzystnie wybrano z grupy złożonej z aminokwasów, które charakteryzują się tym, że są wysoce eksponowane na rozpuszczalnik i konserwowane tak, jak to opisano w przykładzie 3. Mutanty Bet v 1 są następującymi mutacjami pierwotnymi i drugorzędowymi podanymi w nawiasach.

Mutant Bet v 1 (2628): Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lys134Glu. Mutant Bet v 1 (2637): Ala16Pro, (Asn28Thr, Lys32Gln), Lys103Thr, Pro108Gly, (Leu152Lys, Ala153Gly, Ser155Pro).

Mutant Bet v 1 (2733): (Tyr5Val, Lys134Glu), (Asn28Thr, Lys32Gln), Glu45Ser, Lys65Asn, (Asn78Lys, Lys103Val), Lys97Ser, Pro108Gly, Arg145Glu, (Asp156His, +160Asn).

Mutant Bet v 1 (2744): (Tyr5Val, Lys134Glu), (Glu42Ser, Glu45Ser), (Asn78Lys, Lys103Val), Lys123Ile, (Asp156His, +160Asn).

Mutant Bet v 1 (2753): (Asn28Thr, Lys32Gln), Lys65Asn, (Glu96Leu, Lys97Ser), (Pro108Gly, Asp109Asn), (Asp125Tyr, Glu127Ser), Arg145Glu.

Sekwencjonowanie nukleotydów

Określenie sekwencji nukleotydów genu kodującego Bet v 1 przeprowadzono, odpowiednio, przed i po subklonowaniu oraz po mutagenezie in vitro.

DNA plazmidowe z 10 ml hodowli bakterii wyhodowanej do nasycenia przez noc w podłożu płynnym LB uzupełnionym 0,1 g/l ampicyliny oczyszczono w kolumnach w końcówce Qiagen 20 i sekwencjonowano stosując zestaw do sekwencjonowania Ready Reaction Dye Termination Cycle Sequencing i Sekwencer Flureseencyjny AB PRISM 377, oba z firmy Perkin Elmer, zgodnie z zaleceniami dostawcy.

Ekspresja i oczyszczanie zrekombinowanego Bet v 1 i mutantów

Zrekombinowany Bet v 1 (Bet v 1.2801 i mutanty) nadeksprymowano w Escherichia coli DH 5α w formie fuzji z białkiem wiążącym maltozę i oczyszczono, jak to opisano w publ. 15. Pokrótce, zrekombinowane komórki E. coli hodowano w 37°C do gęstości optycznej 0,8 przy 600 nm, po czym indukowano ekspresję białka fuzyjnego Bet v 1 przez dodanie IPTG. Komórki zebrano przez od wirowanie 3 godziny po indukcji, ponownie zawieszono w buforze do Iizy i rozbito za pomocą sonikacji. Po sonikacji i dodatkowym wirowaniu, zrekombinowane białko fuzyjne wyizolowano za pomocą chromatografii powinowactwa na amylozie, a następnie pocięto przez inkubację czynnikiem Xa (publ. 15). Po cięciu F Xa, zrekombinowany Bet v 1 izolowano przez sączenie w żelu i poddawano drugiej rundzie chromatografii powinowactwa na amylozie w celu usunięcia śladowych ilości białka wiążącego maltozę.

Oczyszczony zrekombinowany Bet v 1 zatężono przez ultrasączenie do około 5 mg/ml i przechowywano w temperaturze 4°C. Ostateczne wydajności preparatów oczyszczonego zrekombinowanego Bet v 1 wynosiły od 2 do 5 mg na litr hodowli komórek E. coli.

Oczyszczone zrekombinowane preparaty Bet v 1 pojawiły się jako pojedyncze prążki po elektroforezie w żelu poliakryloamidowym SDS barwionej srebrem z pozorną masą cząsteczkową 17,5 kDa.

Poprzednio (publ. 15) wykazano, że zrekombinowany Bet v 1 Nr 2801 jest immunochemicznie nie do rozróżnienie od naturalnie występującego Bet v 1.

Mutanty Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637)

Figura 19 przedstawia wprowadzone mutacje punktowe na powierzchni molekularnej Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637). U mutanta Bet v 1 (2628) wprowadzono pięć mutacji pierwotnych w jednej połowie Bet v 1 pozostawiając drugą połowę bez zmian. U mutanta Bet v 1 (2637) wprowadzono pięć pierwotnych i trzy drugorzędowe mutacje w drugiej połowie pozostawiając pierwszą połowę bez zmian. W ten sposób mutacje w mutancie Bet v 1 (2628) i w mutancie Bet v 1 (2637) wpływają na inne połowy powierzchni Bet v 1, odpowiednio.

Krystalizacja i określenie struktury zrekombinowanych mutantów Bet v 1 (2628)

Kryształy zrekombinowanego Bet v 1 (2628) hodowano przez dyfuzję par w 25°C zasadniczo jak opisano w (Spangfort i wsp. 1996b, publ. 21). Bet v 1 w stężeniu 5 mg/ml zmieszano z równą objętością

2,2 M siarczanu amonu, 0,1 M cytrynianu sodu, 1% (obj./obj.) dioksanu, pH 6,3 i równoważono wobec 100 x objętości 2,2 M siarczanu amonu, 0,1 M cytrynianu sodu, 1% (obj./obj.) dioksanu, pH 6,3. Po 24 godzinach równoważenia, hodowlę kryształu indukowano przez zastosowanie techniki zaszczepiania opisanej w publ. 21, stosując kryształy zrekombinowanego Bet v 1 typu dzikiego jako źródła zarodzi.

Po około 4 miesiącach zebrano kryształy i analizowano je stosując promienie rentgenowskie wygenerowane z anody obrotowej Rigaku, jak to opisano w publ. 21, a strukturę rozwiązano stosując zastąpienie molekularne.

Struktura mutanta Bet v 1 (2628)

Efekt strukturalny mutacji adresowano przez hodowlę trójwymiarowych kryształów białka Bet v 1 (2628) rozpraszających do 2,0 A rozdzielczości podczas analizy promieniami rentgenowskimi generowanymi z anody obrotowej. Podstawienia Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lys134Glu

PL 214 225 B1 sprawdzono przez mapę gęstości elektronów Bet v 1 (2628), która także wykazała, że jest zachowana ogólna struktura trójwymiarowa szkieletu α-węgla.

Analiza strukturalna mutanta Bet v 1 (2637)

Integralność strukturalną oczyszczonego mutanta Bet v 1 (2637) badano za pomocą spektroskopii dichroizmu kołowego (CD). Figura 20 przedstawia widma CD zrekombinowanego Bet v 1.2801 (typ dziki) i mutanta Bet v 1 (2637) zapisane w prawie równych stężeniach. Zachodzenie na siebie amplitud szczytów i pozycji w widmach CD z dwóch zrekombinowanych białek wykazuje, że dwa preparaty zawierają równe ilości struktur drugorzędowych silnie sugerując, że wprowadzone podstawienia aminokwasów nie wpływają na strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla.

Właściwości wiązania IgE mutantów Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637)

Właściwości wiążące mutanta Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637), jak i mieszaniny 1:1 Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637) porównano ze zrekombinowanym Bet v 1.2801 typu dzikiego w oznaczeniu w fazie płynnej inhibicji stosując IgE surowicy zbiorczej pochodzącej od pacjentów alergicznych na brzozę.

Jak opisano w przykładzie 1, zrekombinowany Bet v 1.2801 biotynylowano w stosunku molowym 1:5 (Bet v 1 Nr 2801:biotyna). Oznaczenie inhibicji przeprowadzono jak następuje: próbkę surowicy (25 μΐ) inkubowano z anty IgE fazy stałej, płukano, zawieszano ponownie, i dalej inkubowano z mieszaniną biotynylowanego Bet v 1.2801 i danego mutanta albo mieszaniny 1:1 dwóch mutantów. Ilość biotynylowanego Bet v 1.2801 związanego z fazą stałą oceniano z pomiaru RLU po inkubacji ze streptawidyną znakowaną estrem akrydyny. Stopień inhibicji wyliczono jako stosunek między RLU otrzymanych z zastosowaniem buforu i mutanta jako inhibitora.

Figura 21 przedstawia inhibicję wiązania biotynylowanego zrekombinowanego Bet v 1.2801 do IgE surowicy z puli alergicznych pacjentów przez niebiotylowany Bet v 1.2801 i przez Bet v 1 (2628), Bet v 1 (2637), i mieszaninę 1:1 Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637).

Istnieje wyraźna różnica w ilości odpowiednich zrekombinowanych białek potrzebnych do osiągnięcia 50% inhibicji wiązania do IgE w surowicy obecnego w surowicy zbiorczej. Zrekombinowany Bet v 1.2801 osiąga 50% inhibicji przy około 5 ng, podczas gdy odpowiednie stężenie dla mutanta Bet v 1 (2628) wynosi około 15-20 ng. To wykazuje, że mutacja punktowa wprowadzona w mutancie Bet v 1 (2628) obniża powinowactwo dla specyficznego IgE w surowicy około 3-4 krotnie.

Maksymalny poziom inhibicji osiągany przez zmutowane białko Bet v 1 (2628) jest wyraźnie niższy w porównaniu ze zrekombinowanym Bet v 1.2801. To może wskazywać, że część specyficznego IgE w surowicy zbiorczej nie jest zdolna do rozpoznawania zmutowanego białka Bet v 1 (2628) ze względu na wprowadzone mutacje punktowe.

Bet v 1 (2637) osiąga 50% inhibicję przy około 400-500 ng wykazując, że mutacja punktowa wprowadzona u mutanta Bet v 1 (2637) obniża powinowactwo dla specyficznej IgE w surowicy około 80 do 100 razy w porównaniu z Bet v 1.2801. Duża różnica w wiązaniu IgE jest dalej wspierana przez wyraźną różnicę w nachyleniu krzywej inhibicji uzyskanej ze zmutowanym białkiem Bet v 1 (2637) w porównaniu z krzywą inhibicji dla Bet v 1.2801. Różne nachylenia dowodzą, że obniżenie wiązania IgE jest wynikiem wyraźnie innego wzoru epitopu mutanta w porównaniu z Bet v 1.2801.

Oprócz inhibicji z pojedynczymi modyfikowanymi alergenami badano mieszaninę 1:1 Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637) mającą takie same stężenia molowe Bet v 1 jak każda z próbek z Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637), odpowiednio, która wykazywała pełną (100%) zdolność inhibicji wiązania IgE do rBet v 1.2801. Zdolność do pełnej inhibicji wiązania IgE jest wyraźnym wskazaniem, że wszystkie reaktywne epitopy obecne na Bet v 1.2801 występowały w mieszaninie alergenów 1:1. Dalsze wsparcie pochodzi z porównywalnego nachylenia obu krzywych inhibicji dla Bet v 1.2801 i mieszaniny alergenów. Zmniejszona reaktywność IgE mieszanej próbki alergenu wykazywana jest przez potrzebę czterokrotnie wyższego stężenia mieszaniny alergenów w porównaniu z Bet v 1.2801, dla uzyskania 50% inhibicji wiązania IgE.

Oznaczenie proliferacji komórek T stosując alergeny zrekombinowanego mutanta Bet v 1

Analizę przeprowadzono tak, jak opisano w publ. 15. Oba zmutowane białka Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637) były zdolne do indukowania proliferacji w liniach komórek T od pacjentów alergicznych na pyłek brzozy ze wskaźnikami stymulacji podobnymi do zrekombinowanych i naturalnie występujących. Sugeruje to, że zarówno, zmutowane białka Bet v 1 (2628) jak i Bet v 1 (2637) mogą inicjować komórkową odpowiedź immunologiczną potrzebną do produkcji przeciwciał.

Oznaczenia uwalniania histaminy z ludzkimi bazofilami

Uwalnianie histaminy z bazofilowych leukocytów przeprowadzono jak następuje. Heparynizowaną krew (20 ml) pobrano od każdego pacjenta uczulonego na pyłek brzozy, przechowywano

PL 214 225 B1 w temperaturze pokojowej, i użyto w ciągu 24 godzin. Dwadzieścia pięć mikrolitrów heparynizowanej całej krwi zastosowano do powleczonych włóknami szklanymi studzienek płytek mikrotytracyjnych (Reference Laboratory, Kopenhaga, Dania) i inkubowano z 25 mikrolitrami alergenu lub anty-IgE przez 1 godzinę w 37°C. Następnie płytki płukano i usunięto substancje interferujące. Na koniec, mierzono histaminę związaną z płytkami spektrofotofluorymetrycznie.

Właściwości uwalniania histaminy zmutowanych białek Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637)

Właściwości uwalniania histaminy przedstawiono na fig. 22 i fig. 23. Testowano siłę zmutowanych białek Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637) do indukcji uwalniania histaminy z ludzkich bazofili od dwóch pacjentów alergicznych na pyłek brzozy. W obu przypadkach krzywe uwalniania zmutowanych alergenów indukujących uwalnianie histaminy były wyraźnie przesunięte w prawo w porównaniu z krzywą uwalniania Bet v 1.2801. Przesunięcie wskazuje, że siła Bet v 1 (2628) i Bet v 1 (2637) jest obniżona 3 do 10-krotnie.

Mutant Bet v 1 (2744) i mutant Bet v 1 (2753)

Mutant Bet v 1 (2744) i mutant Bet v 1 (2753) skonstruowano podobnie do stosowania jako mieszaną szczepionkę alergenu. W tych zmutowanych alergenach mutacje punktowe rozprowadzono po całej powierzchni, jak to przedstawiono na fig. 24 i fig. 25, i ponownie zaprojektowano, aby wpływać na różne obszary powierzchni w dwóch cząsteczkach, odpowiednio, jak pokazano na fig. 26. Jednak te zmodyfikowane alergeny mogły by być również indywidualnie stosowane jako pojedyncze szczepionki alergenów.

Analiza strukturalna zmutowanego białka Bet v 1 (2744)

Integralność strukturalną oczyszczonego mutanta Bet v 1 (2744) badano za pomocą spektroskopii dichroizmu kołowego (CD). Figura 27 przedstawia widma CD zrekombinowanego Bet v 1.2801 (typ dziki) i mutanta Bet v 1 (2744) zapisane w prawie równych stężeniach. Zachodzenie na siebie amplitud pików i pozycji w widmach CD z dwóch zrekombinowanych białek wykazuje, że dwa preparaty zawierają równe ilości struktur drugorzędowych silnie sugerując, że wprowadzone podstawienia aminokwasów nie wpływają na strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla.

Właściwości uwalniania histaminy Bet v 1 (2744)

Właściwości uwalniania histaminy z pięciu doświadczeń z bazofilowymi leukocytami od pięciu różnych pacjentów alergicznych na pyłek brzozy przedstawiono na fig. 28 i fig. 29A-D. Testowano zdolność zmutowanego białka Bet v 1 (2744) do indukcji uwalniania histaminy z ludzkich bazofili. Krzywe uwalniania zmutowanych alergenów histaminy były wyraźnie przesunięte w prawo w porównaniu z krzywą uwalniania Bet v 1.2801 wskazując, że siła Bet v 1 (2744) uwalniania histaminy jest obniżona 3 do 5 krotnie.

Mutant Bet v 1 (2733)

Skonstruowano i wyrażono w sposób zrekombinowany mutanta Bet v 1 (2733) z dziewięcioma mutacjami pierwotnymi. Rozmieszczenie mutacji punktowych na Bet v 1 (2733) pozostawia kilka obszarów powierzchni zawierających > 400 A² bez zmian. Figura 30 przedstawia wprowadzone mutacje punktowe na powierzchni cząsteczki Bet v 1 (2733).

P r z y k ł a d 5

Ten przykład opisuje klonowanie genu kodującego Der p 2 z Dermatophagoides pteronyssinus i konstrukcję mutantów z obniżonym powinowactwem wiązania IgE.

Produkty zamplifikowane PCR z syntezy pierwszej nici cDNA całkowitego RNA Dermatophagoides pteronyssinus uzyskano od Dr Wendy-Anne Smith i Dr Wayne Thomasa (TVW Telethon Institute for Child Health Research, 100 Roberts Rd, Subiaco, Western Australia 6008). W czasie ampli-fikacji biblioteki pierwszej nici cDNA zamplifikowano wybiórczo Der p 2 stosując startery specyficzne dla Der p 2. Fragmenty PCR następnie sklonowano do miejsca Bam HI pUC19 (New England BioLabs). Sekwencjonowanie DNA Der p 2 przeprowadzono stosując specyficzne względem wektora startery sensowne (5'-GGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGG-3') oraz startery antysensowne (5'-GGAAACA-GCTATGACCATGATTACGCC-3').

W sumie zidentyfikowano siedem unikalnych izoform Der p 2 określonych jako ALK-101, ALK-102,

ALK-103, ALK-104, ALK-113, ALK-114 i ALK-120. Klon określony jako ALK-114 wybrano jako punkt wyjścia do generacji mutacji z niskim powinowactwem do IgE ze względu na jego wysoką identyczność sekwencji ze strukturą Der p 2 NMR z numerem dostępu do baz danych 1A9V. W porównaniu z ALK-114, 6 pozostałych naturalnie występujących izoform zawiera następujące podstawienia:

ALK-101 :M76 V.

ALK-102: V40L, T47S.

PL 214 225 B1

ALK-103: M111L,D114N.

ALK-104: T47S, M111L, D114N.

ALK-113: T47S.

ALK-120: V40L, T47S, D114N.

Wstawienie Der p 2 do pGAPZα-A

Gen kodujący Der p 2 (ALK-114) wstawiono następnie do wektora pGAPZα-A (Invitrogen) dla wydzielanej ekspresji Der p 2 w drożdżach Pichia pastoris. Gen zampliflkowano stosując starter sensowny OB27 (5'-GGAATTCCTCGAGAAAAGAGATCAAGTCGATGTCAAAGATTGTGCC-S') oraz starter antysensowny OB28 (5'-CGTTCTAGACTATTAATCGCGGATTTTAGCATGAGTTGC-3') odpowiadające amino- i karboksy końcom polipeptydu Der p 2, odpowiednio. Startery wydłużono na 5' końcu, aby zmieścić miejsca restrykcyjne Xho I i Xba I, odpowiednio. Miejsce restrykcyjne Xho I łączy pierwszy kodon Der p 2 w fazie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą miejsce cięcia KEX2 (LYS-ARG) pGAPZα-A. Przeprowadzono pojedynczą rundę amplifikacji PCR w objętości 100 mikrolitrów (ąl): 0,1 mg DNA matrycy ALK-114, 1 x bufor do polimerazy Expand (dostępny od Boehringer Mannheim), 0,2 milimolarne (mM) każdy z czterech dNTP, 0,3 mikromolarny (μΜ) każdy z sensownych i antysensownych starterów i 2,5 jednostki polimerazy Expand (dostępna od Boehringer Mannheim). DNA amplifikowano w 25 cyklach: 95°C przez 15 sekund, 45°C przez 30 sekund, 72°C przez 1 minutę, po czym następował 1 cykl 72°C przez 7 minut. Powstały fragment PCR ALK-114 z 475 par zasad oczyszczono stosując procedurę oczyszczania QIAquick z wirowaniem (dostępne od Qiagen). Oczyszczony fragment DNA następnie trawiono XhoI i XbaI, oczyszczono z żelu i ligowano z podobnie oczyszczonym pGAPZα-A. Reakcję ligacji transformowano do szczepu DH5α E. coli, ze skutkiem uzyskania plazmidu pCNo06.

Sekwencję nukleotydów Der p 2 potwierdzono za pomocą sekwencjonowania DNA przed i po klonowaniu oraz po mutagenezie in vitro (patrz poniżej).

Sekwencje Der p 2

SEK NR ID 1 odpowiada sekwencji kwasu nukleinowego Der p 2 (ALK-114) gatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaaaagttttggtaccagga tgccatggttcagaaccatgtatcattcatcgtggtaaaccattccaattggaagccgtt

121 ttcgaagccaaccaaaacacaaaaaccgctaaaattgaaatcaaagcctcaatcgatggt

181 ttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattacatgaaatgcccattg

241 gttaaaggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttccgaaaattgcaccaaaa

301 tctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttatgggtgatgatggtgttttggcctgtgct

361 attgctactcatgctaaaatccgcgattaa

SEK NR ID 2 odpowiada wydedukowanej sekwencji aminokwasów Der p 2 (ALK-14):

dqvdvkdcanheikkvlvpgchgsepciihrgkpfqleavfeanqntktakieikasidg levdvpgidpnachyrakcplvkgqqydikytwnvpkiapksehvwtvkvmgddgvlaca

121 iathakird

Wstawienie pGAPZα-A-Der p 2 do P. pastoris

Wektor pCBo06 linearyzowano stosując enzym restrykcyjny Avr II i transformowano do kompetentnego szczepu P. pastoris X-33, jak to opisano w instrukcji Invitrogen. Wybrano zrekombinowane komórki oporne na 100 mikrogramów na mikrolitr (ąg/ml) zeocyny, a kolonie oczyszczono na świeżych płytkach YPD zawierających 100 (ąg/ml) zeocyny.

Ekspresja i oczyszczanie zrekombinowanego Der p 2

250 ml podłoża YPD (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton, 2% glukoza) zawierającego 100 ąg/ml zeocyny zaszczepiono nocną hodowlą zrekombinowanych komórek drożdży wyrażających Der p 2. Hodowlę hodowano w 30°C przez 72 godziny, aby uzyskać optymalną ekspresję Der p 2. Komórki zebrano za pomocą wirowania i powstały supernatant hodowli nasycono 50% siarczanem amonu. Po wirowaniu, przy 3000 x g przez 30 minut, supernatant nasycono 80% siarczanem amonu. Po odwirowaniu, osad ponownie zawieszono w 150 milimolarnym (mM) NH4HCO3 i frakcjonowano na kolumnie do sączenia w żelu Superit dex 75, równoważonej tym samym buforem. Der p 2 eluował jako główny pik odpowiadający swojej oczekiwanej masie cząsteczkowej. Elucję Der p 2 monitorowano zarówno za pomocą elektroforezy SDS PAGE, jak i barwienia srebrem oraz przez analizę immunoblotów stosując przeciwciała poliklonalne specyficzne względem Der p 2.

Wybór reszt aminokwasów do mutagenezy ukierunkowanej

Wybór reszt aminokwasów do mutagenezy oparto na identyfikacji reszt, które są wysoce eksponowane na rozpuszczalnik i wysoce konserwowane wśród alergenów z roztoczy kurzu domowego

PL 214 225 B1 (Der p 2/f 2 i Eur m 2) i roztoczy magazynowych (Tyr p 2, Lep d 2, Gly d 2). Wysoce eksponowane na rozpuszczalnik reszty aminokwasów identyfikowano wzrokowo za pomocą analizy powierzchni molekularnej struktury Der p 2 NMR (#1.9, 1A9V.pdb). Do mutagenezy wybrano dwanaście reszt aminokwasów: K6A, N10S, K15E, S24N, H30N, K48A, E62S, H74N, K77N, K82N, K100N i R128Q.

Mutageneza ukierunkowana

Poniżej opisano konstrukcję zrekombinowanych zmutowanych alergenów z pojedynczymi mutacjami pierwotnymi i ich wielokrotne kombinacje.

Plazmidy ekspresyjne kodujące mutanty Der p 2 wyprodukowano stosując pCBo06 jako matrycę DNA. Reakcje PCR przeprowadzono stosując startery sensowne i antysensowne włączające w to określone mutacje. Pary starterów stosowane w reakcjach PCR dla generowania specyficznych mutacji podano na fig. 31. Mutacje na rysunku wskazano tłustym drukiem, a miejsca restrykcyjne stosowane w kolejnym etapie klonowania podkreślono. Dla konstrukcji mutantów K6A, K15E, H30N, H74N i K82N reakcje PCR przeprowadzono zasadniczo tak, jak to opisano w części „Klonowanie Der p 2 do pGAPZα-A”. Oczyszczone fragmenty PCR strawiono w określonych miejscach restrykcyjnych (patrz fig. 31), oczyszczono w żelu, wligowano do podobnie strawionego pCBo06 i transformowano do E. coli ϋΗ5α.

Mutację E62S wygenerowano stosując alternatywną metodologię mutagenezy PCR opisaną dla generacji mutantów Bet v 1 w przykładzie 1. Syntetyzowano dwa specyficzne dla mutacji startery oligonukleotydowe pokrywające określone mutacje (OB27 i OB28, podane na fig. 31). Dwoma dodatkowymi starterami wykorzystanymi dla drugorzędowego etapu wzmocnienia były OB27 i OB28, jak to opisano w części „Wstawienie Der p 2 do pGAPZα-A”.

Wyprodukowane zmutowane alergeny charakteryzowano stosując takie same metody, jak to opisano w przykładzie 4, na przykład , spektroskopię dichroizmu kołowego (CD), krystalizację, pomiar właściwości wiązania IgE, uwalnianie histaminy, zdolność do stymulacji proliferacji komórek T itd.

P r z y k ł a d 6

Zmutowane zrekombinowane alergeny roztoczy (Der p 2) z poprawionym bezpieczeństwem dla specyficznych szczepionek na alergie

W tym przykładzie pokazano koncepcję niniejszego wynalazku dla alergenów roztocza kurzu domowego na przykładzie jednego alergenu, Der p 2. Manipulowanie innymi alergenami roztocza kurzu domowego może być przeprowadzone za pomocą procedur ekwiwalentnych.

Projektowanie zrekombinowanych zmutowanych cząsteczek Der p 2

SEK NR ID 3 przedstawia sekwencję nukleotydów i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu Der p 2-ALK-G, który jest izoformą typu dzikiego.

SEK NR ID 3: Sekwencja nukleotydów i wydedukowana sekwencja aminokwasów Der p 2-ALK-G

GAT EJ

CAA GTC

GAT D

GTC AAA GA? TGT GCC AA.T CAT

GAA ATC AAA AAA

<5

0

V

X

c

A

X

B

X

15

GTT

TTG

GTA

CCA

GGA

TGC

CAT

GGT

TCA

GAA

CCA

TGT

ATC

ATT

CAT

90

V

X»

V

ί

5

c

H

G

3

a

P

C

X

30

CG?

GCT

AAA

CCA

TTC

CAA TTG

GAA

GCT

TTA

ttc

GAA

GCC

ART

CAA

45

135

R

G

K

r

F

Q

Ł

a

A

b

F

a

A

N

Q

AAC

KX

AAA

ACA

GCT

AAA AT?

GAR ATC

AAA

GCT

TCA

ATC

GA?

GGT

60

ISO

X

3

K

T

A

K

X

S

X

K

A

s

I

a

G

TTA

GAA

GTT

GA?

GTT

CCC

GGT

ATC

GAT

CCA

AAT

GCA

TGC

CAT

TAT

75

225

L

8

V

D

V

p

G

X

C

P

U

A

C

Ή

Y

ATG

AAA

TG?

CCA

TTG

GT?

AAA

GGA

CAA

TAT

GA?

ATT

AAA

ΤΑΪ

90

270

K

X

C

P

L

V

X

G

Q

Y

D

X

K

Y

ACA

TGG

Aft?

STT

CCA AAA

ATT

GCA

CCA AAA

TC?

GAA

AAT

GTT

GTC

2 OS

325

T

W

N

V

P

K

X

A

P

K

s

E

K

V

GTC

ACT

CTT

AAA

GTT

TTG

GGT

GAT

AAT

5GT

GT?

TTG

GCC

TGT

GCT

360

V

T

V

X

V

Ł

G

D

K

G

V

Xi

A

c

A

120

GCT

ACT

CA?

GCT

AAA ATC

CGC

CAT

129

387

I

A

Ϊ

B

A

X

I

S

D

Fig. 32 przedstawia dopasowanie sekwencji wykonane na Serwerze ExPaSy Molecular Biology (http://www.expasy.ch/) stosując algorytm ClustalW na poszukiwaniu BLAST stosując sekwencje ami48

PL 214 225 B1 nokwasów Der p 2-ALK-G przedstawioną w SEK NR ID 3 jako sekwencję wprowadzaną. Dopasowanie obejmuje sekwencje z gatunków roztoczy kurzu domowego, to znaczy Der p 2, Der f 2 i Eur m 2. Na fig. 32 reszty aminokwasów identyczne jak aminokwasy w tej samej pozycji w sekwencji białka Der p 2-ALK-G są zaznaczone przez stosowanie czarnych liter na szarym tle. Aminokwasy nieidentyczne wydrukowane są w kolorze czarnym na białym tle.

Obrazy struktury powierzchni

Sekwencje aminokwasów przedstawiające alergeny grupy 2 roztoczy kurzu domowego mają podobieństwo większe niż 85%, a część powierzchni molekularnej jest konserwowana (obszary zabarwione na szaro), patrz fig. 33.

Figura 33 przedstawia obrysy powierzchni widziane pod 4 różnymi kątami przy superpozycji sekwencji białka Der p 2-ALK-G na opublikowaną strukturę PDB:1A9V NMR, struktura numer 1 z 10 zawartych w pliku PDB.

Konserwowane i wysoce eksponowane na rozpuszczalnik aminokwasy przestrzennie rozmieszczone na całej powierzchni w odległości w zakresie od 25 do 30 A wybrano do mutacji. W częściach poniżej podano następujące informacje: listę aminokwasów uważanych za odpowiednie do mutacji (A), listę zaprojektowanych mutantów (B) i sekwencje DNA reprezentujące mutanty określone jako (C). Figura 34 przedstawia, jako przykład, kontury mutanta numer 1. Szara barwa oznacza konserwowane reszty aminokwasów. Czarna barwa oznacza reszty aminokwasów wybranych do mutacji.

A. Lista aminokwasów wybranych do mutacji

K15, S24, H30, R31, K48, E62, H74, K77, K82, K100, R128 B.

B. Lista zaprojektowanych mutantów

Mutant 1:

K15E, S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N

Mutant 2:

K15E, S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, R128Q

Mutant 3:

K15E, S24N, H30G, K48A, K77N, K82N, K100N, R128Q

Mutant 4:

K15E, S24N, H30G, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q

Mutant 5:

K15E, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q

Mutant 6:

S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q

Mutant 7:

K15E, S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N

Mutant 8:

K15E, S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, R128Q

Mutant 9:

K15E, S24N, R31S, K48A, H74N, K82N, K100N, R128Q

Mutant 10:

K15E, S24N, R31S, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q

Mutant 11:

K15E, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q

Mutant 12:

S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q

C. Sekwencja nukleotydowa mutantów

Mutant 1:

K15E, S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatg

AACtgtccattggttAACggaeaacaatatgatattaaafcatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgfccactgttaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatccgcgat

PL 214 225 B1

Mutant 2:

K15E, S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, RI28Q

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggttfcaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatg

AACtgtccattggttAACggacaacaafeatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaaaatctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgtfcttggcctgfcgctattgctaetcatgctaaaatcCAGgat

Mutant 3;

KI5E, S24N, H30G, K48A, K77N, K82N, K100N, R128Q

GafccaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgtfcttggtacca ggatgceatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatg

AACŁgfcccattggttAACggacaacaatatgatattaaatafcacatggaatgtfccca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgttfctggcctgtgcfcattgctacfccatgctaaaatcCAGgat

Mutant 4:

K15E, S24N, 1I3OG, E62S, K77N, K82N, KłOON, R128Q

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggtftACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaaaaacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatg

AACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaMCtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggfcgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat

Mutant 5:

K15E, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaafccatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggttcagaaccatgtatcatfGGCcgtggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttęccggtatcgatccaaatgcatgccattatatg AACtgtccafctggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcafcgctaaaatcCAGgat

PL 214 225 B1

Mutant 6:

S24N, H30G, K48A, EÓ2S, K77N, K82N, K100N, R128Q Gatcaagfccgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaaaagttttggtacca ggatgccatggtAftCgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccatfcatatg AACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctafctgctactcatgctaaaatcCAGgat

Mutant 7:

K15E, S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagctfcca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatceaaatgcatgcAACtatatg aaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcacŁgttaaagfctttgggtgatast ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatccgcgat

Mutant 8:

K15E, S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, R128Q

GatcaagtcgatgtcaaagsttgŁgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccatfcccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatg aaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaaaatctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat

Mutant 9:

K15E, S24N, R31S, K48A, H74N, K82N, K100N, R128Q

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgfcfcttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttagaagttgatgttcccggfcatcgatccaaatgcatgcRACtatatg aaatgtccattggttA&Cggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtetgaaaatgfctgtcgtcactgtfeaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat

PL 214 225 B1

Mutant 10:

K15E, S24N, R31S, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcaŁAGCggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgca.tgcAACtatatg aaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat

Mutant 11:

K15E, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K1O0N, R128Q

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggttcagaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttea atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatg aaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagfctttgggtgataat ggtgttttggccŁgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat

Mutant 12:

S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K10ON, R128Q

Gatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaaaagttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtafccattcafcAGCggtaaaccattccaafctggaa gctttat±cgaagccaatcaaaactcaGCGacagcfeaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatg aaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagfctttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat

P r z y k ł a d 7

Zmutowane zrekombinowane alergeny roztoczy (Der p 1) z poprawionym bezpieczeństwem dla specyficznych szczepionek na alergie

W tym przykładzie pokazano koncepcję obecnego wynalazku dla alergików roztocza kurzu domowego na przykładzie jednego alergenu, Der p 1. Manipulowanie innymi alergenami roztocza kurzu domowego może być przeprowadzone za pomocą procedur ekwiwalentnych.

Projektowanie zrekombinowanych zmutowanych cząsteczek Der p 1

SEK NR ID 4 przedstawia sekwencję nukleotydów i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu Der 1-ALK, który jest izoformą typu dzikiego.

SEK NR ID 4: Sekwencja nukleotydów i wydedukowana sekwencja aminokwasów Der p 1-ALK

PL 214 225 B1

ACT T

AAC GCC TGC AOT ATC AAT GGA AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT

45

W

A

C

8

I

N

G

W

A

P

A

E

I

£>

15

TTG

CGA

CAA

AT©

CGA

ACT

GTC

ACT

ccc

ATT

CGT

ATG

CAA

6GA

esc

90

L

R

Q

M

A

T

V

T

P

X

R

M

G

©

90

Te?

GGT

TCA

TGT

TGG

GCT

TTC

TCT

GGT

GTT

GCC

GCA

ACT

GAA

TCA

135

c

G

S

c

W

A

F

8

©

V

A

T

E

s

45

GCT

TAT

TTG

GCT

TAC

CGT

AAT

CAA

TCA

TTG

GAT

CTT

GCT

GAA

CAA

280

A

¥

L

A

Y

R

N

Q

s

L

D

L

A

E

©

«0

GAA TTA

GTC

©AT

TST

GCT

TCC

CAA

CAC

GGT

TGT

CAT

GGT

GAT

ACC

225

E

L

V

0

c

A

a

Q

H

G

C

H

G

D

T

75

ATT

CCA

CGT

GGT

ATT

GAA

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

GGT

GTC

CAA

270

I

P

R

3

I

E

Y

2

<3

H

N

G

V

a

SO

GAA

AGC

TAC

TAT

CGA

TAC

©TT

GCA

CGA

GAA

CAA

TCA

TGC

CGA

325

fi

a

Y

R

¥

V

A

R

E

0

s

C

R

205

CCA

AAT

©CA

CAA

CGT

TTC

GGT

ATC

TCA AAC

TAT

TGC

CAA

ATT

TAC

360

P

R

A

G

A

F

©

2

fi

M

Y

C

Q

I

Y

223

CCA

AAT

©TA

AAC AAA ATT

CGT

GRA

GCT

TTG

GCT

CAA

ACC

CAC

405

P

M

y

N

K

I

R

E

A

L

A

Q

T

H

235

AGC

GCT

ATT

scc

GTC ATT ATT

6GC

ATC

AAA

GAT

TTA GAC

GCA

TTC

450

S

A

ł

A

V

I

©

I

K

D

L

D

A

F

150

CGT

CAT

TAT

©AT

©SC

CGA ACA

ATC

ATT

CAA

CSC

GAT

AAT

GGT

TAC

495

R

H

Y

D

G

R

T

I

1

C

R

D

R

G

Y

265

CAA

CCA

AAC

TAT

CAC

GCT

GTC

AAC

ATT

STT

GCT

TAC

AGt

AAC

GCA

540

©

P

R

Y

H

A

V

N

I

V

G

Y

S

N

A

260

CAA

S©T

GTC

GAT

TAT

TGG

ATC

GTA

CGA

AAC

AGT

TGG

GAT

ACC

AAT

565

Q

s

V

D

Y

W

1

V

R

N

S

W

D

T

M

195

TGG

GGT

©AT

AAT

GGT

TAC

GGT

TAT

TTT

GCT

(3CC

AAC

ATC

GAT

TTG

630

W

©

D

N

G

Y

G

Y

F

A

N

1

0

L

210

ATS

ATG

ATT

GAA

TAT

CCA

TAT

GTT

GTC

ATT

CTC

666

M

I

E

Y

P

Y

V

2

L

222

Fig. 35 przedstawia dopasowanie sekwencji wykonane na Serwerze ExPaSy Molecular Biology (http://www.expasy.ch/) stosując algorytm ClustalW na poszukiwaniu BLAST stosując sekwencje aminokwasów Der p 1-ALK przedstawioną w SEK NR ID 4 jako sekwencję wprowadzaną. Dopasowanie obejmuje sekwencje z gatunków roztoczy kurzu domowego, to znaczy Der p 1, Der f 1 i Eur 10 m 1. Na fig. 35 reszty aminokwasów identyczne jak aminokwasy w tej samej pozycji w sekwencji białka Der p 1-ALK zaznaczone są przez stosowanie czarnych liter na szarym tle.

Aminokwasy nieidentyczne wydrukowane są w kolorze czarnym na białym tle.

Obrazy struktury powierzchni

Sekwencje przedstawiające alergeny grupy 1 roztoczy kurzu domowego są podobne w pewnym stopniu, a część powierzchni molekularnej jest konserwowana (obszary zabarwione na szaro), patrz fig. 36. Figura 36 przedstawia obrysy powierzchni widziane pod 4 różnymi kątami przy superpozycji sekwencji białka Der p 1-ALK na model struktury molekularnej Der p 1.

Do mutacji wybrano konserwowane i wysoce eksponowane na rozpuszczalnik aminokwasy rozmieszczone przestrzennie na całej powierzchni w odległości w zakresie od 25 do 30 A. W częściach poniżej podano następujące informacje: listę aminokwasów uważanych za odpowiednie do mutacji (A), listę zaprojektowanych mutantów (B) i sekwencje DNA reprezentujące mutanty określone jako (C). Figura 37 przedstawia, jako przykład, kontury mutanta numer 11. Szara barwa oznacza konserwowane reszty aminokwasów. Czarna barwa oznacza reszty aminokwasów wybranych do mutacji.

A. Lista aminokwasów wybranych do mutacji

E13, P24, R20, Y50, S67, R78, R99, Q109, R128, R156, R161, P167, W192

B. Lista zaprojektowanych mutantów

Mutant 1:

P24T, Y50V, R78E, R99Q, R156Q, R161E, P167T

PL 214 225 B1

Mutant 2:

Q P24T, Y50V, R78Q, R99E, R156E, R161Q, P167T

Mutant 3:

R20E, Y50V, R78Q, R99Q, R156E, R161E, P167T

Mutant 4:

R20Q, Y50V, R78E, R99E, R156Q, R161Q, P167T

Mutant 5:

P24T, Y50V, S67N, R99E, R156Q, R161Q, P167T

Mutant 6:

R20E, Y50V, S67N, R99E, R156Q, R161E, P167T

Mutant 7:

R20Q, Y50V, S67N, R99Q, R156E, R161E, P167T

Mutant 8:

E13S, P24T, Y50V, R78E, R99Q, Q109D, R128E, R156Q, R161E, P167T Mutant 9:

E13S, P24T, Y50V, R78Q, R99E, Q109D, R128Q, R156E, R161Q, P167T Mutant 10:

E13S, P24T, Y50V, R78E, R99Q, Q109D, R128E, R156Q, R161E, P167T, W192F Mutant 11:

E13S, P24T, Y50V, R78Q, R99E, Q109D, R128Q, R156E, R161Q, P167T, IR W192F

C. Sekwencja nukleotydowe mutantów

Mutant 1:

P24T, Y50V, R78E, R99Q, R156Q, R161E, P167T

A«T	AAC GCC	TOG ASI ATC	AW	SSA AAT	GCT CCA OCT GAA ATC	SAT	TTG (SA CAA ATS	OSA	60
ACT	src act	ACC ATT Cni	ATS	CAA SSA	SSC TGT GST TCA TGT	TOG	GCT TTC TC? GGT	GTT	i:o
<3 CC	GCA ACT	GAA TCA GCT	TAT	TT6 ser	SIS CST AAT CAA TCA	TTG	SAT CTT SCT SAA	CAA	ISO
GAA	TTA GTC	GAT tgt gct	TCC	CAA CAC	asr tst cat ser sat	ACC	ATT CCA SAA GGT	ATT	240
GAA	TAO ATC	CAA CAT AAT	SGT	GTC GTC	CAA SAA ABC TAC TAT	CGA	TAC GTT SCA CAG	SAA	300
CAA	TCA TOS	D3A CGA CCA	AAT	SCA CAA	CST TTC GBT ATC TCA	AAC	TAT TSC CAA ATT	TAC	360
CCA	CCA AAT	STA AAC AAA	ATT	cet sAa	SCT TT® set CAA ACC	CAC	AGC SCT ATT SOC	GTC	420
ATT	ATT GGC	ATT AAA SAT	TTA <sac sca	TTC CST CAT TAT SAT	ckjc	CA5 ACA ATC ATT	CAA	480
GAA	GAT AAT	«GT TAC CAA	ACC	AAC TAT	CAC SCT GTC AAC ATT	SIT	gst tac Atrr aac	GCA	540
CAA	GST GTC	SAT TAT 'TGG	ATC	GTA CGA AAC AST TG® SAT ACC	AAT	TGG GOT SAT AAT	Gst	600
TAC	ggt tat	ttt oct ecc	AAC	ATC SAT	TTG ATS ATG ATT SAA	SAA	TAT CCA TAT ΘΤΤ	ero	660

ATT crc «««

Mutant 2

P24T, Y50V, R78Q, R99E, R156E, R161Q, P167T

ACT AAC

«CC

TGC

AST

ATC

AAT

G6A

AAT

GCT CCA Gd

GAR

ATC

SAT

TTG

CGA

CAA

ATS

CGA

60

ACT

gTC

ACT

ACC

ATT

cer

ATS

CAA

GGA

GGC

TGT

GGT

TCA

TGT

TGG

GCT

TTC

TC?

GOT

GTT

120

sec

GCA

ACT

SAA

TCA

ser

TAT

TTG

GCT

GTG

CGT

AAT

CAA

TCA

WG

GAT

CTT

GCT

SAA

CAA

100

SAA

ΤΓΑ

arc

SAT

TGT

per

?CC

CAA

CAC

GOT

TGT

CAT

GST

SAT

ACC

ATT

CCA

CAG

GST

ATT

240

BAA

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

GST

3TC

GTC

CAA

SAA

AGC

TAC

TAT

CGA

TAC

GTT

GCA

GAA

SAA

300

CAA

TCA

TGC

CGA

CCA

AAT

SCA

CAA

CST

TTC

ser

ATC

TCA

AAC

TAT

TGC

CAA

ATT

•ZAC

360

CCA

AAT

STA

AAC

AAA

ATT

cer

GAA

GCT

TTG

GCT

CAft

ACC

CAC

AUC

GCT

ATT

GCC

GTC

420

ATT

GGC

ATC

aąa

5AT

TTA

GAC

GCA

TTC

CGT

CAT

TAT

SAT

GGC

SAA

ACA

ATC

ATT

CAA

400

GAG

SAT

AAT

SET

TAC

CAA

ACC

AAC

TAT

CAC

GCT

GTC

AAC

ATT

GTT

GGT

TAC

AGT

AAC

SCA

540

CAA

GOT

GTC

SAT

TAT

TOG

ATC

STA

CGA

AAC

AST

TGG

GAT

ACC

AAT

TOG

GST

GAT

AAT

GGT

600

TAC

GST

TAT

TTT

cer

GCC

AAC

ATC

SAT

TTG

ATG

ATT

SAA

GAA

TAT

CCA

TAT

GT?

GTC

660

ATT CTC £S6

PL 214 225 B1

Mutant 3:

R20E, Y50V, R78Q, R99Q, RI56E, RlóiE, P167T

AST

AAC

sec

Tęc AQT

ATC

AAT

gsa

AA?

©err

CCA

GCT

ΟΛΑ

ATC

SAT

TTB

CGA

CAA

ATS

GAA

50

ASrT

«re

ACT

CCC ATT

CGT

ATC

CAA

gga

<3GC

TGT

GCT

TCA

TGT

TSS

ser

TTC

TCT

OGT

ott

IZO

SCC

OGA

ACT

GAA TCA

CCT

TAS

TOł

GCT

CTTG

CtfF

AAT

CAA.

TCA

T?G

GAT

CTT

ser

SAA

CAA

m

OftA

TTA

3TC

GAT

TOT

GCT

toc

CAA

CAC

GGT

TCT

cwc

GGT

SAT

ACC

ATT

CCA

CAC

GGT

ATT

34J>

GAA TAC

«TC

CAA

CA?

AAT

GST

STC

otc

CAA

OAA

M-C

TAC

TAT

CGA

TAC

EETT

GCA

CAG

GAA

30-0

CAR TCA

TCO

C$A

CGA

CCft

AAT

EGA

CAA

CGT

TTC

GST

ATC

TCA

AAC

TAT

TCC

CAR

ATT

TAC

5fiQ

CCA

AAT

GTA

AAC

AAA

ATT

CS?

BAR

SC?

ΤΤφ

GCT

CAA

ACC

CAC

AGG

ser

ATT

sec

CTC

4 JO

ATT

AT£

Ara

OAT

TTA

GAC

OCR

TTC

CST

CAT

TAT

SAT

asc

SAA

AGA

ATC

ATT

CAA

4 βθ

CAG

SAT

Aft?

cer

tac

CAA

ACC

AAC

TA?

CAC

GCT

GTC

AAC

ATT

OTT

GCT

TAC

AOT

AAC

iiCA

540

CAA

sst

STC

GAT

7A?

TOS

ATC

STA

OSA AAC

fcST

T«S

SWT

ACC

AAT

TGG

GCT

SAT

RAT

QGT

€0C

SAC

GOT

TAT

TT?

cc?

sec

RAC

ATC

GA?

?TG

ATS

ATT

SAP.

GAA

TAT

CCA

TAT

ST?

STC

«63

AW rac 666

Mutant 4;

R20Q, Y50V, R78E, R99E, R156Q, R1Ó1Q, P167T

AC? AMG GCC TfflC AG? AK AA? SGR AA? GC? CCA GC? GAA ATC GA? TTG CGA CAA Αϊβ CRS ¢0

AC? BTC W? CCC A?? CS? ATS CAA GGA GOC TOT GOT TCA *Sf TGG ΒΟί TTC TC? GS? GTT 120

0CC SCA AC? SAR TCA GC? TA? TTG GCT GTG COT RA? CAA TCA TTG GA? OT? SC? SAA CAA 186

SRA WA BTC GA? TG? 6CT TCC CAA CAC GUT TG? CA? GB? GA? ACC ATT CCA GAA GGT ATT 240

GRA TAC ATC CAA CA? AAT GS? STC ®TC CAA GAR ABC TAC TA? CGA TAC OT? GCA BRR GAA 306

CAA TCA TGC CSA CGA CCA AA? SCA CAA CG? TTC GOT ATC TCA AAC TA? TGC CAA ATT TAC 300

CCA CCR RAT CTR RAC ARA ATT CGT SRA GC? TTG SC? CAA ACC CAC RGC «7Γ ATT GOC GTC 420

AT? ATT GOC ATC ΛΑΑ GA? 5PTA SAG GCR TTa CG? CA? TA? GA? GGC ERG ACR ATC AT? CAA 480

CAG GRT AA? &SS TRC CAA ACC RAC TA? CAC GCT 5K AAC W? BOT GOT TAC AST RAC GCA 840

CAA GOT STC GAT TAT TGS ATC STA COA ARC ROT TOS GA? tGC AfiT TBO GGT SA? ART GB? 600 flW GOT TA? TT? GCT gcę RAC ATC GA? TTS ATG ATG ATT GAR GRA TA? CCA TA? ST? G?C 660

AT? OTC «66

Mutant 5:

P24T, Y50V, S67N, R99E, R156Q, R161Q, P1Ó7T

ACT

RAC

GCC

?ac

AST

ATC

AA?

£5SA

AR?

ecs

CCA

GCT

SAA

ATC

OAT

TTG

CGA

CAA

MG

CSA

«0

ACT

OTC

MC?

ACC

ATT

CGT

ATS

CAR

GGA

esc

TG?

GCT

TCA

TGT

TOS

set

TTC

TCT

45GT

GTT

120

SOC

GCA

ΑΟΓ

GAR

TCA

GCT

TA?

TOJ

GOT

OTS

CGT

AA?

CAA

TCK

?T6

GM

CTT

SC?

S&A

160

GAA

TTA OTC

GAT

TGT

GCT

AAC

CAA

CAC

GOT

TB?

CA?

GOT

GftT

ACC

ATT

CGA

cer

GGT

ATT

840

GAA

TAC

ATC

CAR

CA?

AA?

GS?

OTC

CAA

GAR

RGC

TAC

TM

CGA

TAC

OT?

OCA

SRA BAA

300

CAA

TCA

TOC

©3A

CGA

CCA

aa?

GCA

CAA

COT

tłe

GGT

ATC

TCA

AAC

TAT

ΪΘΟ

CAA

M-r

TAC

360

OCR CCR

RA?

OTA

ΛΑΟ

AAA

ATT

COT

6RA

GC?

TTG

GOT

CAR ACC

CAC

ASC

SC?

ATT

GCC

OTC

420

ATT

GGC

ATC

ΑΑΆ

GAT

TTA

GAC

gCA ttc

COT

CA?

TA?

GAT

BBC

CAO

ACA

ATC

ATT

CAA

480

<3&

SA?

AA?

GB?

TAC

CAA

ACC

AAC

TA?

CAC

GCT

OTC

AAC

ATT

BT?

sgT

TAC

ROT. AAC

GCA

B40

CAA

GGT

OTC

GA?

TAT

TGS

ATC

GIA

CGA

AAC

AG?

?G3

GA?

ACC

AAT

TSG

GG?

GA? AA?

GGT

600

TAC

GOT

TAI

TT?

GCT

GCC

AAC

AK

GA?

TTG

ATS

ATG

ATT

GM

GAR

TAT

CGA

TAT OT?

OTC

660

AT? OTC 666

PL 214 225 B1

Mutant 6:

R20E, Y50V, S67N, R99E, RI5óQ, RlólE, FIÓ7T
ACT GCC	TSC wr ATC AM <ΜΑ ΑΛΤ SC? CCA SCT SRA ATC	SAT TTS	CGA	GAR	ATO	SAA	GO
ACT GTC AC?	CCC ATT CG? A?S CRA SGA GOC TOP GGT ‘JtA TCP	TOG βστ		tct ser	STt 120
□CG UCA Afft	om ks ec? par psa ser ot cbt aa? caa tca	TTS GRT	CTT*	GCT ΟΛΛ	GM IW
GAA ΤΓΑ GtC	3Λΐ τβί Sc? AAC CAA KAC GOT TCT CM CA?	ACC ATT	CSA	COT W?	WT SW
SAA TAC MC	CAR CAT ΑΛΤ GGT STC 6TC SRA GAM ASC TAC TAT	CGA TAC	etr	GCA GRA	GAM	a oo
CAA TCA TGC	CGA COA CCA AAT tJCA SAR CGT TTC GGT ATC TCA AAC PAT	TGC	CAA	ATT	TAC	360
CCA CCA AAT	GTA AAC AAA. ATT CG? SAR SCT TTG GCT CMS ACC	GAC ASC	GCT	ATT	GCC	GTC	420
ATT ATT GGC	ATC AAA GAT TTA GAC GCA TTC CGT CAP TAT SM	600 CAG	ACA	ATC	ATT	CAA	ββο
GAR 6AT MAT	GGT TAC CAR ACC AiRC TAT CAC GCT GTC AAC ATT	GT7 GGT	TAC	AGT	AAC	CCA	MO
CAA GGT GTC	GAT TAT TSS ATC STA C3A AAC AST TSS GA? ACC	AAT TSS	3<JT	SAT	AAT	GGT	SCO
TAC G3T TAT	ΤΪΤ GCT GCC AAC ATC GA? TTG ATE ATC AT? 5AA	W TAT	CCA	TAT	GIT	GTC	660

ATT CJC 666

Mutant 7:

R20Q, Y50V, S67N, R99Q, R15ÓE, RlólE, P167T

AC?

AAC

GOC

TGC

AST

ATC

AAT

GGA

AAT

GCT

CCA

GCT

GAA

ATC OAf

TTG

CGA

CAft

ATG

CAG

6Q

ACT

GTC

ACT

CCC

ATT

CGT

ATG

CAA

GGA

GGC

TGT

βατ

TCA

TGT tgg

GCT

TTC

TCT

GGT

GTT

120

GCC

GCA

ACT

GAA

TCA

GOT

TAT

TTS

GCT

GTG

CG?

ΑΛΤ

CAA

TCA TTC

GAT

CTT

GCT

GAA

CAA

100

GAA

TTA

GTC

SAT

W

GCT

AAC

CAA

CAC

GGT

TG?

CAT

3GT

m ACC

ATT

CCA

OGT

GGT

ATT

£40

GAA

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

®5T

GTC

CAA

GAA

Ree

TAC

TAT CGA

TAC

GTT

GCA

GAG

GAA

300

CRA

TCA

TGC

CGA

CCA

AAT

GCA

CAA

CS?

TTC

ser

ATC

TCA AAC

TAT

TGC

CAA ΜΪ

TAC

3ΐύ

CCA

AAT

GTA

AAC

AAA ATT

CGT

GAA

GCT

TTfl GCT

CAA

ACC CAC

ASC

GCT

ATT

GCC

GTC

<20

ATT

GGC

ATC

AAA

SAT

V7A

GAC

□CA

TTC

CGT

CAT

TftT

GAT GGC

GAA

ACA

ATC

ATT

GAA

4 30

GAA

SAT

AAT

GGT

TAC

CAA ACC

AAC

TAT

CAC

GCT

erc

AAC

ATT GTT

GGT

TAC

AGT

AAC

GCA

54 0

CAA

K5T

GTC

GA?

TAT

TGG

ATC

GTA

CGA

AAC

AST

TGG

GAT

ACC AAT

TGG

GGT

SA?

AAT

Θ0Τ

£00

TAC

GGT

TAT

TTT

ser

3CC AAC

ATC

GMT

TTG

ATG

ATT

gma. saa

TAT

CCA

TAT

GTT

«TC

660

ATT ¢10 s«

Mutant 8:

E13S, P24T, Y50V, R78E, R99Q, Q109D, R128E, R15óQ_t RlólE, P167T

ACT	AAC GCC	TGC AST ATC	AAT	AAT	GCT CCA GCT AOC ATC	GA? TTS OSA CAR	ATS C0A	60
ACT	«?c war	ACC «ΡΤ CGT	ATG	CAA «GA	GSC TOT CGT TCA TQT	TSS GCP TTC TCT	GGT OPT	IZO
GCC	CCS. RCT	<3AA TCA GCT	TAT	TTG GCT	STG CGT AAT CAA TCA	TTS SAT CTT sot	OAA CAA	160
GAA	TTA <3TC	OAT TOT GCT	ICC	CAA CAC	GGT T<3T CAT GGT GAT	ACC ΛΪΤ CCA SRA	GOT AtT	£40
GAA	TAC ATC	CAA CAT AAT	GGT	STO GTC	CAA «ΑΑ ΑΘΟ TAC TAT	CSA TAC srr SCA	CftS GAA	300
CRA TCft TOC	CGA CGA CCA AAT	GCft <sAT	WST TTC as? KTC ?CR SAC ?M TSC CRM ATT TAC	Ϊ60
CCA	CCA AM	GTA AAC AAA	ATT	GAA GĄA	GCT TTe gct car acc	CAC ĄSC GCT ATT	GCC GTC	4W
ATT	ATT ecc	ATC AAA SAT	TTA	GAC OCA	TTC CGT CAT TAT GA?	GOC CAO AGA ATC	ATT GRA	460
GAA	GAT AAT	GGT TAC CAA	ACC	AAC ’2AT	CAC GCT GTC AAC ATT	GTT GGT TAC AOT	AAC OCR	640
CAA	ssr «tc	GAT TĄT TGG	ATO	«TA ęGA	AAC A3T TGG GAT ACC	AAT TGG GGT GAT	AAT GGT	600
TAC	GGT TAT	TTT GCT GCC	AAC	ATC SAT	TTG ATG ATG ATT 6AA	SAA TAT CCA TAT GTT GTC	6SO

ATT CTC 666

PL 214 225 B1

Mutant 9

EI3S, P24T, Y50V, R78Q, R99E, Q109D, R128Q, R15ÓE, RI61Q, P1Ó7T

AC?

AAC

GCC

TGC

AGT

ATC

AAT

OSA

AA?

GCT

CCA

GCT

AGC

ATC

GAT

TTG

CGA

CAA

ATG

CGA

60

ACT

GTC

ACT

ACC

ATT

CGT

ATS

CAA

OGA

GGC

TGT

GGT

TCA

TGT

TGG

GCT

TTC

TC?

GGT

GT?

120

GCC

GCA

ACT

GAA

TCA

GCT

TAT

TTG

GCT

GTG

CGT

AAT

CAA

TCA

TTG

GAT

CTT

GCT

GAA

CAA

ieo

SAR

TTA

GTC

GAT

TG?

GCT

tcc

CAA

CAC

GGT

TST

CAT

087

GAT

ACC

ATT

CCA

CAG

GOT

ATT

240

GM

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

GGT

GTC

CAA

GAA

AGC

TAC

TAT

COA

TAC

GT?

SCA

GAA

GAR

300

CM

TCA

TGC

CGft

OSA

CCA

AAT

CCA

GAT

CS?

TTC

GGT

ATC

TCA

AAC

TAT

TGC

CAA

ATT

TAC

360

CCA

AAT

CFTA

MC

MA

ATT

cag

GAA

GCT

ttg

GCT

CAA

ACC

CAC

AGC

Gct

ATT

GCC

GTC

<20

ATT

GOC

ATC

AM

GAT

TPA

GAC

GCA

TTC

CGT

CA?

TAT

GAT

sec

GM

ACft

ATC

ATT

CAA

<00

CA3

CAT

AAT

GOT

TAC

CAA

ACC

RAC

TAT

CAC

GCT

GTC

MC

ATT

GT?

CGT

TAC

AST

AAC

GCA

540

CM

GGT

GTC

GAT

TAT

TGG

ATC

STA

OSA

AAC AGT

TGG

SAT

ACC

AAt

TGG

GGT

GAT

AAT

GGT

600

TAC

GGT

TA?

TTT

GCT

SCO

AAC

ATC

SAT

We ATG

ATS

ATT

GAA

8AA

TAT

CCA

tm an

GTC

660

ATT CTC «6«

Mutant 10:

E13S, P24T, Y50V, R78E, R99Q, Q109D, R128E, R15ÓQ, R161E, P167T, W192F

ACT	AAC GCC	TGC AGT ATC	AAT	GGA AAT	GCT CCA GCT AGC ATC	SA?	TTG CGA CM ATG	COft	60
ACT	C-TC ACT	ACC ATT O3T	ATS	CM «5Α	GGC TCT GGT TCA TCT	TOG	GCT TTC TCT GS?	GT?	120
GOC	GCA ACT	GAA TCA GCT	TAT	TTG GCT	GTS Oj? AAT CAA TCA	TTG	SAT CTT GCT GM	CAA 160
GAA	TTA GTC	GAT TG? GCT	TCC	CM CAC	GGT TCT CAT GGT GAT	ACC	ATT OCR CAft GGT	ATT	04 0
GM	TAC ATC	CAA CAT AAT	GGT	GTC GTC	CAA GAA AGC TAC TAT	C3A	TAC CTT GCA CAC	GM	300
CAft	TCA TGC	CSft CGA CCA	Aft?	GCA GAT	CGT TTC GGT ATC TCA	MC	TAT TGC CAA ATT	TAC	360
CCA	CCA AAT	STA MC AM	ATT	GAA GAA	GCT TTG GCT CAA ACC	CAC	AGC GC? ATT GCC	otc	420
ATT	ATI GOC	ATC AAA GAT	TTA GAC GCA TTC CGI CAT TAT GAT	GGC	GAG ACA ATC ATT	CM	480
GAA	GAT AAT	GGT TAC CM	ACC	AftC TftT	CAC GCT CTC AftC ATT	STT	GGT TAC AST AAC	GCA	540
CM	GGT GTC	SAT TAT TGG	ATC	STA CGA	AAC AST TT? GAT ACC	AAT	TGG GGT GAT AAT	GG?	600
TAC	GGT TAT	TTT GCT GCC	AAC	ATC GAT	TTG ATG ATG ATT GAA	OM	TAT CCA TA? OT?	GTC	660

ATT CTC «Εβ

Mutant 11:

E13S, P24T, Y50V, R78Q, R99E, Q109D, R128Q, R15ÓE, R161Q, P167T, W192F

ACT

AAC

GCC

TGC

AGT

ATC

AA?

GSA

AAT

GCT

CCA

GC?

AGO

ATC

GAT

TTS

CGA

CAft

ATG

CGA

60

AC?

STC

ACT

ACC

ATT

O3T

ATS

CM

GSft

GGc

TG?

GGT

TCA

TG?

TSS

GCT

TTC

?CT

m

CTT

120

GCC

GCA

ACT

GM

TCA

GCT

TA?

TTG

GCT

GTG

CS?

MT

CM

TCA

TTG

GAT

CTT

GCT

SM

CAA

160

GAA

TTA

GTC

GAT

?GT

GCT

TCC

CAft

CAC

GGT

TGT

CAT

GGT

GAT

ACC

ATT

CCA

CAG

GGT

ATT

240

GAA

TftC

ATC

CM

CAT

MT

SGT

GTC

CM

GM

AGC

TAC

TA?

CGA

TAC

STT

GCA

GM

GAA

300

CAA

TCA

TGC

CGA

CCA

AAT

GCA

GAT

CG?

TTC

QGT

A?C

TCA

AAC

7AT

TCC

CM

ATT

TAC

360

CCft

CCA

AA?

STĄ

AAC

AM

ATT

CAG

GM

GCT

TTG

GC?

CAA

ACC

CAC

AGC

GCT

ATT

GCC

GTC

420

ATT

GGC

ATC

AM

GAT

TTA

GAC

GCA

TTC

ce?

CA?

TAT

GAT

GGC

GAA

ACA

ATC

ATT

CAA

4 BO

CAG

GA?

AAT

GGT

TAC

CAA

ACC

AAC

TAT

CAC

GCT

GTC

AAC

ATT

GTT

G<5T

TAC

AST

MC

GCA

540

CM

GGT

G?C

GAT

TA?

TGS

ATC

GTA

CGA

AAC

AGT

TTT

GAT

ACC

AAT

TGG

GGT

GAT

Aft?

GGT

600

TAC

«5?

TAT

TTT

GC?

scc

AAC

ATC

GA?

TTG

ATG

ATS

ATT

GAA GAA

TAT

CCA

TAT

G?T

GTC

660

att ctc see

P r z y k ł a d 8

Zmutowane zrekombinowane alergeny trawy (Phl p 5) z poprawionym bezpieczeństwem dla specyficznych szczepionek na alergie

PL 214 225 B1

W tym przykładzie pokazano koncepcję niniejszego wynalazku dla alergenów roztocza pyłku trawy na przykładzie jednego alergenu, Phl p 5. Manipulowanie innymi alergenami pyłku traw może być przeprowadzone za pomocą procedur ekwiwalentnych.

Projektowanie zrekombinowanych zmutowanych cząsteczek Phl p 5

SEK NR ID 5 przedstawia sekwencję nukleotydów i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu Phl p 5.0103, który jest izoformą typu dzikiego.

SEK NR ID 5: Sekwencja nukleotydów i wydedukowana sekwencja aminokwasów Phl p 5.0103 gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60

ABŁGYGPATPAAPAAGYTPA 20 acccccgcogcccoggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120

TPAAPAGAEFAGKATTEEQK 40 ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcocg 180

LXEKIHAGPKAAŁAAAAGVP 60 ccagcggacaagtacaggaegttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccfctc 240

PADKYRTFVATFGAASNKAF 80 gcggagggcetctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgcte 300

AEGLSGEFKGAAESSSKAAL 100 acctccaagctcgacgcegcctacaagcfccgcctacaagacagccgagggcgcgacgcot 360

TSKLDAAYKŁAY.KTASGATP 120 gaggccaagfcacgacgcetacgtcgccacegtaagcgaggcgctccgcatcatcgccggc 420

EAKYDAYVATVSEAŁRIIAG 140 accctcgaggtccacgccgtcaageccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccgge 480

TLEVHAVKPAAEBVKVIPAG 160 gagctgeaggtcatcgagaaggtogacgccgccttcaaggtcgcfcgccaccgccgccaac 540

ElQVIEKVsAArKVAATAAH 180 gccgcccccgccaacgacaagttoaccgtcttcgaggccgocttcaacgacgccatcaag 600

AAPANDKFTVFSAAFNDAIK 200 gcgagcacgggcggcgcctacgegagctacaagttcatccccgcccfcggaggccgccgtc 660

ASTGGAYESYKFIPAŁEAAY 220 aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgceggaggtcaagtacactgtctttgag 720

KQAYAATVATAPEVKYTVFE 240 accgcactgaaaaaggccatcaccgccatgtecgaagcacagaaggctgccaagcccgcc 780

TAŁKKAITAMSEAOKAAKPA 260 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgęggccaccggcgccgccaccgcc 840

AAATATATAAVGAATGAATA 280 gcfcacfcggfcggctacaaagtc 861

A T G G Y κ v

Fig. 38 przedstawia dopasowanie sekwencji wykonane na Serwerze ExPaSy Molecular Biology (http://www.expasy.ch/) stosując algorytm ClustalW na poszukiwaniu BLAST stosując sekwencje aminokwasów Phl p 5.0103 przedstawioną w SEK NR ID 5 jako sekwencję wprowadzaną. Dopasowanie obejmuje sekwencje alergenów grupy 5 z gatunków traw, Phl p 5, Poa p 5, Lol p 5, Hol l 5, Pha a 5, Hor v 9 i Hor v 5. Na fig. 38 reszty aminokwasów identyczne jak aminokwasy w tej samej pozycji w sekwencji białka Phl p 5.0103 zaznaczone są przez stosowanie czarnych liter na szarym tle. Aminokwasy nieidentyczne wydrukowane są w kolorze czarnym na białym tle.

Obrazy struktury powierzchni

Sekwencje przedstawiające alergeny grupy 5 pyłków traw są w pewnym stopniu podobne i część powierzchni molekularnej jest konserwowana (obszary zabarwione na szaro), patrz fig. 39. Figura 39 przedstawia obrysy powierzchni widziane pod 4 różnymi kątami przy superpozycji sekwencji białka Phl p 5.0103 na model struktury molekularnej Phl p 5. Model struktury obejmuje cząsteczkę w dwóch połowach, Model A (aminokwasy 34-142) przedstawiono na fig. 39A, a Model B (aminokwasy 149-259) na fig. 39B.

PL 214 225 B1

Wysoce eksponowane na rozpuszczalnik aminokwasy przestrzennie rozmieszczone na całej powierzchni w odległości w zakresie od 25 do 30 A wybrano do mutacji. W częściach poniżej podano następujące informacje: listę aminokwasów uważanych za odpowiednie do mutacji (A), listę mutantów zaprojektowanych (B) i sekwencje DNA reprezentujące zaprojektowane mutanty (C). Figura 40 A i B przedstawia, jako przykład, kontury mutanta numer 1, odpowiednio, Model A i Model B. Szara barwa oznacza konserwowane reszty aminokwasów. Czarna barwa oznacza reszty aminokwasów wybranych do mutacji.

A. Lista aminokwasów wybranych do mutacji

I45, R66, E133, R136, I137, D186, F188, K211, P214, Q222, P232, L243, Q254

B. Lista zaprojektowanych mutantów

Mutant 1:

I45K, E133S, F188I, Q222K, L243E, Q254K

Mutant 2:

R66N, E133S, F188I, Q222K, L243E, Q254K

Mutant 3:

I45K, R136S, F188I, Q222K, L243E, Q254K

Mutant 4:

I45K, I137K, F188I, Q222K, L243E, Q254K

Mutant 5:

I45K, E133S, D186H, Q222K, L243E, Q254K

Mutant 6:

I45K, E133S, Q222K, P232G, L243E, Q254K

Mutant 7:

I45K, E133S, F188I, P214G, L243E, Q254K

Mutant 8:

I45K, E133S, F188I, K211N, L243E, Q254K

Mutant 9:

R66N, R136S, F188I, Q222K, L243E, Q254K

Mutant 10:

R66N, I137K, F188I, Q222K, L243E, Q254K

Mutant 11:

I45K, E133S, D186H, P214G, L243E, Q254K

Mutant 12:

I45K, E133S, D186H, K211N, L243E, Q254K

Mutant 13:

I45K, E133S, P214G, P232G, L243E, Q254K

Mutant 14:

I45K, E133S, K211N, P232G, L243E, Q254K

C. Sekwencje nukleotydowe mutantów

Mutant 1:

I45K, E133S, F188I, Q222K, L243E, Q254K:

gccgatctcggtfcacggcccggcęaccccagctgccccggccgccggcfcagacacccgcc 60 acccccgccgceccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgacegaggagcagaag 120 ctgafccgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg ISO ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaaęaaggccttc 240 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300 acctccaagctęgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcet 360 gaggccaagtacgacgccfcacgtcgceaccgtaagcAGCgcgctccgcafccatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480 gagefcgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccacegccgccaac S40 gecgcccccgccaacgacaagATTacegtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagtfccatccccgccctggaggccgccgtc 660 aagAAAgcctacgccgccaccgfccgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgeaGftAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780 gccgctgccaecgccaccgcaaccgęcgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840 gctactggtggctacaaagtc 861

PL 214 225 B1

Mutant 2:

R66N, E133S, F188I, Q222K, L243E, Q254K:

gccgafcctcggttacggccecgecaccccagctgcęccggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagatcaacgccggctfccaaggcggcettggccgctgccgccggcgtcccg 180 ecagcggacaagtacAACacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300 acetccaagctegacgccgccfcacaagctcgccfcacaagacagccgagggcgcgaegcct 360 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgfcaagcASCgcgctccgcatoatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatecccgccggc 480 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgceacęgccgccaac 540 gcogcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccfcfccaacgacgccafceaag 600 gegagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatcccegcccfcggaggccgcogfcc 660 aagAAAgcctacgccgccaccgfccgccaccgcgccggaggtcaagfcacactgfcctfctgag 720 accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgfcccgaagcaAAAaaggcfcgccaagcccgcc 760 g ccgetgcca ccg ccaccg caa ccg ccgccgtt gg cg c gg c caccggcgccgccaccgcc 840 gctactggtggctacaaagfcc 861

Mutant 3:

I45K, R136S, FI 881, Q222K, L243E, Q254K:

gccgafcctcggttacggceccgccaccccagcfcgccccggccgccggctacacccccgcc 60 accccęgecgccccggc«ggageggagccageaggfcaaggęgacgaccgaggagcagaag 120 ctgafccgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180 ccageggacaagtacaggaęgtfccgfccgcaaccttcggcgcggcateca&eaaggectte 240 gcggagggcctctegggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctęcaaggccgcgctc 300 accfcccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctaeaagacagccgagggcgcgacgcct 360 gaggccaagtacgącgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctcAGCatcatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgcogge 480 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgocttoaaggtcgctgccaccgccgccaac 540 gccgcccccgccaaeg*caagATTaecgtcttcgaggccgccttcaacgaGgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660 aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgcaGAAaaaaaggecafccacegecafcgfcccgaagcaAAAaaggcfcgccaagcccgcc 760 gccgctgccaccgccacegcaaecgęcgccgttggegcggccaccggcgcegecaccgcc 840 gctactggtggctacaaagfcc 861

Mutant 4;

I45K, I137K, FI881, Q222K, L243E, Q254K:

gccgatctcggttaeggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgscgąccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagAAAaacgccggctteaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180 ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcetctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgęgctc 300 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgontecaagacagccgagggcgcgacgcct 360 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctccgcftAAategccggc 420 aecętcgaggtecacgccgtcaagcccgcggcageggaggteaaggtcatccccsgccggc 480 gagctgcaggtęafccgagaaggtcgacgccgccttcaąggtcgctgccaccgccgccaac 540 gccgccccegccaacgacaagATTaecgtetfccgaggccgcetteaacgacgccatcaag 600 gcgagc&cgggcggegcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggecgcegtc 660 aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720

BccgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780 gccgctgccaccgccaccgeaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840 gctactggtggctacaaagfcc 861

PL 214 225 B1

Mutant 5:

Ϊ45Κ, E133S, D186H, Q222K, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagefcgccceggccgeeggetacacecccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgecgaccgaggagcagaag 120 ctgafccgagaagAAAaacgceggottcaaggcggecttggccgctgccgceggcgtcccg 180 cc&gcggacaagtBCaggacgttcgtcgcaaccŁŁcggcgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggecfeefccgggcgageacaagggcgecgacgaatccagctccaaggccgegctc 300 acctcceagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccgge 420 accctegaggtccacgcogtcaagcecgcggccgaggaggtcaaggtcatceccgccggc 400 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540 gccgcccccgccaacCATaagtteacagtcttcgaggccgccttaaaogacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccotggaggccgccgtc 660 aagAAAgcctacgccgceaccgtegccaccgcgecggaggtcaagtacactgfcefcttgag 720 accgcaeAAeaaaaggccatcaccgecafcgtccgaagoaAAAaaggctgceaagcccgce 780 gccgctgccaccgccaecgcaaccgccgccgttggcgcggcoaccggcgccgccaccgce 840 gctactggtggctacaaagtc 861

Mutant 6:

I45K, E133S, Q222K, P232G, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagAAAaacgocggottcaaggcggccttggccgetgccgccggogtccog ISO ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggcctte 240 geggagggcetcfccgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctecaaggcegcgcte 300 acctccaagctcgacgocgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420 accctcgaggfcccacgccgteaagccegcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgecaccgccgecaac 540 gccgccoccgccaacgacaagttcaecgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgeegtc €60 aagAAAgcctacgcogccaccgtcgCcaccgcgSGCgaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgcaGftAaaaaaggccateaccgceatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780 gcegctgccaccgccaccgcaaccgecgccgttggegcggecaccggcgccgccaccgcc 840 gctactggtggotacaaagtc 861

Mutant 7:

I45K, E133S, F188I, P214G, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacogccccgccaęcccagctgccccggecgccggctacacscccgcc 60 acccccgccgccc cggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 12 0 ctgatogagaagAAAaacgccggcttcaaggcggecttggccgctgccgcaggogtcocg 180 ccagcgga caagta caggacgtt cgtcgcaa cctt cggcgcggcctccaa caaggccttc 240 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360 gaggccaagtacgacgcctaegtcgccaccgtaagcAGcgcgctccgcatcatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaageccgcggccgaggaggtcaaggtcatcccęgccggc 480 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgecgccttcaaggtcgctgęcaccgccgccaac 540 gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtettcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatcGGCgccctggaggccgccgtc 660 &agcaggcctecgccgccaccgtcgęceccgcgcęggaggtcaagta.cactgtctttgag 720 accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780 gccgctgccaccgceaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgceaccgcc 840 gctactggtggctacaaagtc 86Χ

Mutant 8

I45K, E133S, FI881, K21 IN, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggcęgccggctacacccccgce 60 acccccgccgceocggccggagcggagecagęaggtaaggogaogaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgecgccggcgtcccg 180 ccageggacasgtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcot 360 gaggccaagtacgacgcctacgtcgcca.ccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480 gagctgcaggtcatcgagaaggfccgacgccgccttcaaggtcgctgccaoegccgooaac 540 gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacAACttcatccccęccctggagęccgccgtc 660 aagcaggccttacgccgccaccgtcgccaccgegccggaggtcaagtacactętctttgag 720 accgcaGAAaaaaaggecatcaccgeęatgtccgaagoaAAAaaggcfcgccaagcccgce 780 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840 gctactggtggctacaaagtc 861

PL 214 225 B1

Mutant 9:

R66N, R136S, F188I, Q222K, L243E, Q254K:

gecgatetcggttacggccccgccaceccagctgecceggccgccggctacaccccegcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180 ccagcggacaagtacAACacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300 aectccaagctcgacgccgcetacaagctcgcctacaagacagecgagggcgcgacgcct 360 gaggccaagtacgacgcctacgtegecaccgtaagcgaggcgctcAGCatcatcgccggc 420 acectcgaggtecacgccgtcaagcccgeggccgaggaggtcaaggteatccccgccggc 480 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540 gcegcccccgecaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatc»ag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660 aagAA&gc«tacgccgccaccgtcgceaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgec 7 BO gecgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840 gctactggtggctacaaagtc 861 Mutant 10;

R66N, I137K, F188I, Q222K, L243E, Q254K:

gccgatetcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgecggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcecg 180 cc&gcggacaagtacAACacgttcgtcgcaaccttcggcgeggcetccaacaaggccttc 240 gcggagggcctetcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300 acctccaagcfccgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgetccgcAAAatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgecggc 480 gagctgcaggtcatcgagaaggtogacgccgccttcaaggtcgctgocaccgcogccaac 540 gcegeccccgccaacgacaagATTaccgtcfctcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcaegggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggacgcegtc 660 nagAfcAgeetacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagccegcc 780 gccgctgccaccgaKaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgoe 840 gctactggtggctacaaagtc 861 Mutant 11;

I45K, E133S, D18ÓH, P214G, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacaceceegcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagAAAaaęgccggcttcaaggeggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180 ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgCtc 300 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 350 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420 accct cgagg tcea cgccgtcaagcccgcggccga ggaggtcaaggtcatc cccgccggc 480 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540 gccgcccccgccaacCATaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaaęgacgccatcaag 600 gcgageacgggcggcgcefcacgagagctacaagtfceatcGGCgccctggaggccgccgtc 660 aagcaggcctacgcęgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgeaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAftAaaggctgccaagcccgcc 780 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840 gctactggtggctacaaagtc 861

PL 214 225 B1

Mutant 12:

I45K, E133S, D186H, K21 IN, L243E, Q254K;

gccgatctcggttacggccccgccaccecagctgecccggccgccggctacaccceegcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggegacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagAAAascgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180 ceagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggęgecgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360 gaggccaagtacgacgcctacgtegccaccgtaagcAGCgegctccgcateatcgecggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggeegaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgecgeeaac 540 gccgcccccgccaacCATaagttcaccgtcttcgaggcegccttcaaegacgccateaag 600 gcgagcaogggcggcgcctacgagagctacAACttcatccccgccctggaggccgccgtc 660 aagcaggcctacgccgccaccgtcgecaccgcgccggaggfccaagtacactgtctttgag 720 acegcaGAAaaaaaggccafccaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggecaccggcgccgccaccgcc 840 gctactggtggctacaaagtc 861

Mutant 13:

I45K, E133S, P214G, P232G, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccceggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagęagaag 120 ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180 ccagcggacaagtacaggaegttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcctctegggcgagcceaagggcgecgccgaatccagctccaaggccgcgcOc 300 acctccaagctcgacgeegcctacaagctcgcctacaagaeagecgagggcgcgacgcct 360 gaggccaagtacgaęgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctcegcatcatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480 gagetgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540 gccgcecccgccaacgacaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatcGGCgccctggaggcogccgtc 660 aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgGGCgaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840

Mutant 14:

I45K, E133S, K21 IN, P232G, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgecgccceggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgteccg 1B0 ccagęggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggcctte 240 gcggagggcctctcgggegagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360 gaggccaagtacgacgcctacgtegecacegtaagcAGCgcgetcegcatcatcgccggc 420 aecctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggfccaaggtcatecccgccggc 480 gagctgcaggteatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540 gccgcccccgccaacgacaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggęggcgcctacgagagctacAACttcatccccgccctggaggccgccgtc 660 aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgGGCgaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840 gctactggtggctacaaagtc 861

P r z y k ł a d 9

Reaktywność wobec komórek T zrekombinowanego i zmutowanego Bet v 1 Cel:

Zbadanie odpowiedzi komórek T in vitro na zmutowane alergeny pod kątem proliferacji i produkcji cytokin.

Metody:

PBL (Peripheral blood lymphocytes - limfocyty krwi obwodowej) od pacjentów alergicznych stosowano w następującym badaniu.

PL 214 225 B1

Ustalono osiem linii komórek T specyficznych dla bet v 1 z PBL z naturalnie oczyszczonym bet v 1, aby utrzymać różnorodność izoform bet v 1, które są prezentowane komórkom T, jak to opisano w uprzednio opublikowanym protokole (26).

Dziesięć linii PBL i osiem komórek T stymulowano ekstraktem brzozy (Bet v), naturalnie oczyszczonym bet v 1 (nBet v 1), rekombinantem Bet v 1 (rBet v 1 Iuv wt; 27) i czterema różnymi zmutowanymi formami rBet v 1 (opisane gdzie indziej): 2595, 2628, 2637,2744, 2773. Później stwierdzono, że mutant 2637 jest częściowo rozwinięty i nie będzie przedmiotem omówienia.

₅

Pokrótce: Do 96-studzienkowej płytki okrągłodennej dodano PBL w ilości 2 x 10⁵ na studzienkę. Różne próbki brzozy dodawano w trzech różnych stężeniach w czterech powtórzeniach i pozwalano im na rośnięcie przez 6 dni. W dniu 6 połowa objętości komórek (100 ul) z każdej studzienki z najwyższym stężeniem brzozy zebrano do produkcji cytokin. Do studzienek dodano radioaktywną znakowaną tymidynę. Następnego dnia (dzień 7) komórki zebrano na sączku. Do sączka dodano płyn scyntylacyjny i zmierzono radioaktywność w liczniku scyntylacyjnym.

Podobnie w 96-studzienkowej płytce okrągłodennej dodano komórki T w ilości 2 x 10⁴ na stu₅ dzienkę i stymulowano napromieniowanymi autologicznymi PBL (1 x 10⁵ komórek/studzienkę) i 3 różne stężenia różnych próbek brzozy. Po 1 dniu komórki z każdej studzienki z najwyższym stężeniem brzozy zebrano do produkcji cytokin. Do studzienek dodano radioaktywną znakowaną tymidynę. W dniu 2 komórki zebrano na sączku i liczono jak opisano dla PBL.

Supernatanty z czterech powtórzeń łączono i mierzono cytokiny stosując metodę CBA (cytokine bead array) od Becton Dickinson.

Wyniki

Dziesięć hodowli PBL wykazało specyficzną stymulację przez brzozę. Ogólnie proliferacja PBL na różne próbki brzozy była podobna, chociaż było widać pewne różnice. W 3 PBL nBet v 1 stymulował proliferację lepiej niż rBet v 1 i mutanty. Zmutowane próbki brzozy stymulowały PBL nieomal identycznie jak rBet v 1 (fig. 41). Figura 41 przedstawia Indeks Stymulacji dla wymienionych powyżej preparatów Bet v 1. Indeks stymulacji (SI) wylicza się jako proliferację (cpm: count per minute - zliczeń na minutę) stymulowanej próbki (najwyższe stężenie) podzielone przez proliferację (cpm) kontroli z podłożem. PPD oznacza oczyszczoną pochodną białek z Mycobacterium tuberculosis, która służy jako kontrola dodatnia.

Produkcja cytokin była zdominowana przez IFN-gamma i wzrastała proporcjonalnie z proliferacją PBL. Nie było oznak przesunięcia Th1/Th2 (fig. 42-44). Figura 42 przedstawia pacjenta z profilem Th0, fig. 43 profil Th1, a fig. 44 profil Th2. Produkcja cytokin zmierzono w pg/ml wskazano jako sztabki, a stosunek między IL-5/IFN-gamma jest dolną linią kreskową (oś Y z prawej). Proliferacja mierzona w cpm widoczna jest na osi Y z prawej jako linia ciągła mierzona w cpm. Podłoże i MBP (maltose binding protein - białko wiążące maltozę) są włączone jako kontrole tła.

Osiem linii komórek T ustalono na nBet v 1 i wszystkie, poza jedną, proliferowały równie dobrze na wszystkich próbkach brzozy. Cztery linie komórek T wydzielały cytokiny podobne do Th0 w oparciu o stosunek IL-5 i IFN-gamma (Th2 > 5, 5 > Th0 > 0,2, 0,2 > Th1). Te linie komórek T wydzielały cytokiny Th1 a jedna linia komórek T wydzielała cytokiny Th2. Różne próbki brzozy nie wpływały na stosunek między IL-5/IFN-gamma.

Wniosek:

Wszystkie hodowle PBL i 7/8 linii komórek T, które wykazywały specyficzną stymulację przez nBet v 1 także odpowiadały na rBet v 1 i mutanty. Te dane sugerują, że dla stymulacji komórek T pojedyncza izoforma Bet v 1 lub te 4 mutanty mogą zastąpić mieszaninę indywidualnych izoform spotykanych w naturalnych preparatach alergenów. Tak więc, szczepionki oparte na zrekombinowanych alergenach lub tych 4 mutantach będą adresować istniejącą populację komórek T specyficznych dla Bet v 1.

P r z y k ł a d 10

Indukcja przeciwciał IgG specyficznych dla Bet v 1 i przeciwciał blokujących po immunizacji zrekombinowanymi i zmutowanymi białkami Bet v 1

W tej części definiuje się określenie „przeciwciała blokujące” jako przeciwciała, inne niż ludzkie przeciwciała IgE, które są zdolne do wiązania antygenu i do zapobiegania wiązania ludzkich przeciwciał IgE do tego antygenu.

Zdolność białka typu dzikiego Bet v 1 2227 (rBet v 1) i zmutowanych białek Bet v 1 2595, 2628, 2744 i 2773 do indukcji specyficznych dla Bet v 1 przeciwciał IgG i przeciwciał blokujących testowano w doświadczeniach z immunizacją myszy.

PL 214 225 B1

Myszy BALB/cA (8 w każdej grupie) immunizowano przez dootrzewnowe zastrzyki ze zrekombinowanym białkiem Bet v 1 2227 typu dzikiego lub czterema zmutowanymi białkami. Myszy immunizowano cztery razy z odstępem dawki 14 dni. Różne białka koniugowano do 1,25 mg/ml Alhydgrogel'u, (żel wodorotlenku glinu, 1,3% pH 8,0-8,4, Superfos Biosector). Myszy immunizowano albo 1 ąg białka/dawkę albo 10 ąg białka/dawkę. Próbki krwi pobierano przez skrwawianie z oczodołu w dniu 0, 14, 35, 21, 49 i 63.

Specyficzne poziomy przeciwciał analizowano za pomocą bezpośredniego testu ELISA stosując płytki mikrotytracyjne powleczone rBet v 1 i biotynylowane przeciwciała królika anty mysi IgG (Jackson) jako przeciwciało do detekcji. Immunizacja zrekombinowanym białkiem typu dzikiego Bet v 1 2227 lub czterema zmutowanymi białkami indukowała silną odpowiedź IgG specyficzną dla r Bet v 1. Ten wynik wykazuje, że cztery zmutowane białka są zdolne do indukcji przeciwciał, które silnie reagują krzyżowo z białkiem typu dzikiego Bet v 1 2227.

Aby ocenić indukcję przeciwciał blokujących, próbki surowicy od pacjentów alergicznych na pyłki brzozy inkubowano z paciorkami paramagnetycznymi powleczonymi monoklonalnym przeciwciałem myszy anty-ludzki IgE. Po inkubacji paciorki płukano i ponownie zawieszono w buforze lub rozcieńczonych próbkach (1:100) surowicy myszy od nieimmunizowanych myszy (kontrola) lub myszy immunizowanych, jak to opisano powyżej. Biotynylowany rBet v 1 dodano następnie do tej mieszaniny paciorków i przeciwciał z surowicy myszy. Po inkubacji paciorki płukano i wykrywano związany biotynylowany rBet v 1 stosując streptawidynę znakowaną akrydyną. Inkubacja paciorków z surowicą od nieimmunizowanych myszy nie zmieniała wiązania rBet v 1 do paciorków. Przeciwnie, inkubacja paciorków z surowicą od myszy immunizowanych zrekombinowanymi białkami Bet v 1 2227 typu dzikiego lub czterema białkami zmutowanymi znacząco zmniejszała wiązane rBet v 1 do paciorków wykazując obecność przeciwciał specyficznie blokujących Bet v 1 w próbkach surowicy. Tak więc, w dniu 63 jedna lub więcej próbek surowicy ze wszystkich grup immunizowanych wysoką dawką (10 ąg/dawkę) była zdolna do zmniejszenia wiązania rBet v 1 do paciorków o ponad 80%. Te wyniki wykazują, że cztery zmutowane białka są zdolne do indukcji przeciwciał, które mogą działać jako przeciwciała specyficznie blokujące Bet v 1.

Literatura

1. WO 97/30150 (Pangenetics B.V., Molecules for the induction of immunological tolerance)

2. WO 92/02621 (Biomay Biotechnik Produktions- und Handelsgesell- schaft mbH, Allergens of Alder pollen and applications thereof)

3. WO 90/11293 (Immunologic Pharmaceutical Corporation, The University of North Carolina at Chapel Hill, Allergenic proteins from ragweed and uses thereof)

4. Takai T, Yokota T, Yasue M, Nishiyama C, Yuuki T, Mori A, Okudaira H, Okumura Y: „Engineering of the major house dust mite allergen Der f 2 for allergen-specific immunotherapy”. Nat Biotechnol 15, 754-758 (1997)

5. Smith AM, Chapman MD: „Localization of antigenic sites on Der p 2 using oligonucleotidedirected mutagenesis targeted to predicted surface residues”. Clin Exp Allergy 27, 593-599 (1997)

6. Aki T, Ono K, Hidaka Y, Shimonishi Y, Jyo T, Wada T, Yamashita M, Shigeta S, Murooka Y, Oka S: „Structure of IgE epitopes on a new 39-kD allergen molecule from the house dust mite, Dermatophagoides farinae”. Int Arch Allergy Immunol 103, 357-364 (1994)

7. Forster E, Dudler T, Gmachl M, Aberer W, Urbanek R., Suter M: „Natural and recombinant enzymatically active or inactive bee venom phospholipase Al has the same potency to release histamine from basophils in patients with Hyme-noptera allergy”. J Allergy Clin Immunol 95, 1229-1235 (1995)

8. Burks AW, Shin D, Cockrell G, Stanley JS, Helm RM, Bannon GA: „Mapping and mutational analysis of the IgE-binding epitopes on Ara h 1, a legume vicilin protein and a major allergen in peanut hypersensitivity”. Eur J Biochem 245, 334-339 (1997)

9. Stanley JS, King N, Burks AW, Huang SK, Sampson H, Cockrell G, Helm RM, West CM, Bannon GA: „Identification and mutational analysis of the immunodominant IgE binding epitopes of the major peanut allergen Ara h 2”. Arch Biochem Biophys 342, 244-253 (1997)

10. Ferreira F, Rohlfs A, Hoffmann-Sommergruber K, Schenk S, Ebner C, Briza P, Jilek A, Kraft D, Breitenbach M, Scheiner O: „Modulation of IgE-binding properties of tree pollen allergens by sitedirected mutagenesis”. Adv Exp MedBiol 409, 127-135 (1996)

PL 214 225 B1

11. Ferreira F, Ebner C, Kramer B, Casari G, Briza P, Kungl AJ, Grimm R, Jah-Schmid B, Breiteneder H, Kraft D, Breitenbach M, Rheinberger H-J, Scheiner O, „Modulation of IgE reactivity of allergens by site-directed mutagenesis: Potential use of hypeallergenic variants for immunotherapy”, FASEB Journal for Experimental Biology Vol. 12, No. 2, February 1998, 231-242 (1998)

12. Wiedemann P, Giehl K, Almo SC, Fedorov AA, Girvin M, Steinberger P, Rudiger M, Ortner M, Sippl M, Dolecek C, Kraft D, Jockusch B, Valenta R: „Molecular and structural analysis of a continuous birch profilin epitope defined by a monoclonal antibody”. J Biol Chem 271, 29915-29921 (1996)

13. Alvarez AM, Fukuhara E, Nakase M, Adachi T, Aoki N, Nakamura R, Matsuda T: „Four rice seed cDNA clones belonging to the alpha-amylase/trypsin inhibitor gene family encode potential rice allergens”. Biosci Biotechnol Biochem 59, 1304-1308 (1995)

14. Colombo P, Kennedy D, Ramsdale T, Costa MA, Djro G, Izzo V, Salvadori S, Guerrini R, Cocchiara R, Mirisola MG, Wood S, Geraci D, Journal of Immunology Vol. 160, No. 6, 15 March. 1998, 2780-2875

15. Spangfort MD, Ipsen H, Sparholt SH, Aasmul-Olsen S, Larsen MR, Mortz E, Roepstorff P, Larsen JN: „Characterization of Purified Recombinant Bet v 1 with Authentic N-terminus, Cloned in Fusion with Maltose-Binding Protein”. Prot Exp Purification 8, 365-373 (1996a)

16. Ipsen H, Wihl J-A, Petersen BN, Lowenstein H: „Specificity mapping of patients IgE response towards the tree pollen major allergens Aln g I, Bet v 1 and Cor a I” Clin. Exp. Allergy 22, 391-9, (1992)

17. Gajhede M, Osmark P, Poulsen EM, Ipsen H, Larsen JN, Joost van Neerven RJ, Schou C, Lownstein H, and Spangfort MD: „X-ray and NMR structure of Bet v 1, the origin of birch pollen allergy”. Nature structural biology 3, 1040- 1045(1996)

18. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, and Lipman DJ: „Basic local alignment search tool”. J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)

19. Higgins D, Thompson J, Gibson T, Thompson JD, Higgins DG, and Gibson TJ: „CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680 (1994)

20. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA: „Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase”. Science 239, 487-491 (1988)

21. Spangfort MD, Larsen JN, Gajhede M: „Crystallization and Preliminary X-ray Investigation at 2.0 A Resolution of Bet v 1, a Birch Pollen Protein Causing IgE-Mediated Allergy”. PROTEINS, Struc Func Genet 26, 358-360 (1996b)

22. Monsalve RI, Lu G, and King TP: „Recombinant venom allergen, antigen 5 of yellow jacket (Vespula vulgaris) and paper wasp (Polistes annularis) by expression in bacteria or yeast” (1999) Submitted

23. Fang KSF, Vitale M, Fehlner P and King TP: „cDNA cloning and primary structure of a white-face hornet venom allergen, antigen 5”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 895 (1988)

24. Lu G, Villalba M, Coscia MR, Hoffman DR and King TP: „Sequence Analysis and Antigenic Cross-reactivity of a Venom Allergen, Antigen 5, from Hornets, Wasps, and Yellow Jackets”. Journal of Immunology 150, 2823-2830 (1993)

25. Punnonen J: „Molecular Breeding of Allergy Vaccines and Antiallergic Cytokines”. Int Arch Allergy Immunol 2000; 121:173-182

26. P.A. Wurtzen, M. Wissenbach, H. Ipsen, A. Bufe, J. Arnved, and R. J. J. vanNeerven. J Allergy Clin Immunol, 1999; 104; 115-23

27. Sparholt SH, Larsen JN, Ipsen H, Schou C, van Neerven RJ, Clin Exp Allergy 1997 Aug ; 27(8):932-41

PL 214 225 B1

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zrekombinowany alergen, który jest mutantem naturalnie występującego alergenu, w którym ten zmutowany alergen ma 5 do 20 mutacji, z których każda obniża zdolność wiązania specyficznego IgE zmutowanego alergenu w porównaniu ze zdolnością wiązania IgE tego naturalnie występującego alergenu o co najmniej 5% w co najmniej jednym immunooznaczeniu stosując surowicę od osobnika alergicznego na naturalnie występujący alergen lub jego pule, w którym każda mutacja jest podstawieniem jednej eksponowanej na powierzchni reszty aminokwasowej inną resztą, gdzie ta eksponowana na powierzchni reszta aminokwasowa ma dostępność dla rozpuszczalnika ponad 20%, przy czym odchylenie średnie kwadratowe współrzędnych atomowych struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla tego zmutowanego alergenu i tego naturalnie występującego alergenu wynosi poniżej 2 A, i który daje nie konserwatywne podstawienie reszty w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów dowolnego znanego białka homologicznego w gatunku taksonomicznym, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen, znamienny tym, że 5 do 20 mutacji (mutacji pierwotnych) jest oddalonych od siebie o co najmniej 15 A, przy czym te mutacje pierwotne umieszczone są w taki sposób, że co najmniej jeden kolisty obszar powierzchniowy z obszarem 800 A² pozbawiony jest mutacji.
2. Zrekombinowany alergen według zastrz. 1, znamienny tym, że mutacje pierwotne rozmieszczone są w odstępach 20 A, korzystnie 25 A, a najkorzystniej 30 A.
3. Zrekombinowany alergen według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w dodatku do 5 do 20 mutacji pierwotnych, zawiera co najmniej jedną dodatkową mutację (mutację drugorzędową), która oddalona jest mniej niż 15 A od dowolnej mutacji pierwotnej, przy czym każda mutacja drugorzędowa obniża zdolność wiązania specyficznego IgE zmutowanego alergenu w porównaniu ze zdolnością wiązania tego naturalnie występującego alergenu o co najmniej 5% w co najmniej jednym immunooznaczeniu stosując surowicę od osobnika alergicznego na naturalnie występujący alergen lub jego pule, w którym każda mutacja drugorzędowa jest podstawieniem jednej eksponowanej na powierzchni reszty aminokwasowej inną resztą, gdzie ta eksponowana na powierzchni reszta aminokwasowa ma dostępność dla rozpuszczalnika ponad 20%, przy czym odchylenie średnie kwadratowe współrzędnych atomowych struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla tego zmutowanego alergenu i tego naturalnie występującego alergenu wynosi poniżej 2 A, i który daje nie konserwatywne podstawienie reszty w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów dowolnego znanego białka homologicznego w gatunku taksonomicznym, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen, przy czym te mutacje drugorzędowe umieszczone są poza wymienionym kolistym obszarem powierzchniowym.
4. Zrekombinowany alergen według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że co najmniej jeden z eksponowanych na powierzchni aminokwasów, które mają być podstawione w naturalnie występującym alergenie ma dostępność dla rozpuszczalnika ponad 30%, korzystniej ponad 40%, a najkorzystniej ponad 50%.
5. Zrekombinowany alergen według zastrz. 4, znamienny tym, że co najmniej jeden z eksponowanych na powierzchni aminokwasów, które mają być podstawione w naturalnie występującym alergenie jest konserwowany z więcej niż 70%, korzystnie więcej niż 80%, a najkorzystniej więcej niż 90% identyczności we wszystkich znanych białkach homologicznych w obrębie gatunku, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen.
6. Zrekombinowany alergen według zastrz. 3, znamienny tym, że każda reszta aminokwasowa, która ma być włączona do zmutowanego alergenu nie występuje w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów dowolnego znanego białka homologicznego w obrębie rodzaju taksonomicznego, korzystnie podrodziny, bardziej korzystnie rodziny, jeszcze bardziej korzystnie nadrodziny, bardziej korzystnie legionu, bardziej korzystnie podrzędu, a najbardziej korzystnie rzędu, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen.
7. Zrekombinowany alergen według zastrz. 3, znamienny tym, że wiązanie specyficznego IgE do zmutowanego alergenu jest korzystnie zmniejszone o co najmniej 10%.
8. Zrekombinowany alergen według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że wymieniony kolisty obszar powierzchniowy obejmuje atomy 15-25 reszt amino-kwasowych.
9. Zrekombinowany alergen według zastrz. 5, znamienny tym, że eksponowane na powierzchni reszty aminokwasowe szeregowane są względem dostępności dla rozpuszczalnika, i że podstawiony jest jeden lub więcej aminokwasów wśród aminokwasów bardziej dostępnych dla rozpuszczalnika.
10. Zrekombinowany alergen według zastrz. 9, znamienny tym, że eksponowane na powierzchni reszty aminokwasowe szeregowane są względem stopnia konserwacji we wszystkich znaPL 214 225 B1 nych białkach homologicznych w gatunku, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen, i że podstawiony jest jeden lub więcej aminokwasów wśród aminokwasów bardziej konserwowanych.
11. Zrekombinowany alergen według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że zmutowany alergen nie jest naturalnie występującym alergenem.
12. Zrekombinowany alergen według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera od 6 do 15, korzystnie od 7 do 12, a najkorzystniej od 8 do 10 mutacji pierwotnych.
13. Zrekombinowany alergen według zastrz. 11, znamienny tym, że zmutowany alergen zawiera od 1 do 4 mutacji drugorzędowych na mutację pierwotną.
14. Zrekombinowany alergen według zastrz. 13, znamienny tym, że jedno lub więcej z podstawień przeprowadzane jest za pomocą mutagenezy ukierunkowanej.
15. Zrekombinowany alergen według zastrz. 14, znamienny tym, że jedno lub więcej z podstawień jest przeprowadzane przez tasowanie DNA.
16. Zrekombinowany alergen według zastrz. 15, znamienny tym, że jest mutantem alergenu inhalacyjnego.
17. Zrekombinowany alergen według zastrz. 16, znamienny tym, że jest mutantem alergenu pyłku.
18. Zrekombinowany alergen według zastrz. 17, znamienny tym, że jest mutantem alergenu pyłku z rzędu taksonomicznego Fagales, Oleales lub Pinales.
19. Zrekombinowany alergen według zastrz. 18, znamienny tym, że jest mutantem Bet v 1.
20. Zrekombinowany alergen według zastrz. 19, znamienny tym, że jedno lub więcej podstawień jest wybranych z grupy złożonej z: V2, E87, K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, I-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87 i E-73.
21. Zrekombinowany alergen według zastrz. 19, znamienny tym, że jedno lub więcej podstawień wybranych jest z grupy złożonej z: V2, D72, E87, K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, I-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87 i E-73.
22. Zrekombinowany alergen według zastrz. 17, znamienny tym, że jest mutantem alergenu pyłku pochodzącego z rzędu taksonomicznego Poales.
23. Zrekombinowany alergen według zastrz. 17, znamienny tym, że jest mutantem alergenu pyłku pochodzącego z rzędu taksonomicznego Asterales lub Urticales.
24. Zrekombinowany alergen według zastrz. 16, znamienny tym, że jest mutantem alergenu roztocza kurzu domowego.
25. Zrekombinowany alergen według zastrz. 24, znamienny tym, że jest mutantem alergenu roztocza pochodzącego od Dermatophagoides.
26. Zrekombinowany alergen według zastrz. 16, znamienny tym, że jest mutantem alergenu karalucha.
27. Zrekombinowany alergen według zastrz. 16, znamienny tym, że jest mutantem alergenu zwierzęcego.
28. Zrekombinowany alergen według zastrz. 27, znamienny tym, że jest mutantem alergenu zwierzęcego pochodzącego od kota, psa lub konia.
29. Zrekombinowany alergen według zastrz. 1 do 15, znamienny tym, że jest mutantem alergenu jadu.
30. Zrekombinowany alergen według zastrz. 29, znamienny tym, że jest mutantem alergenu jadu pochodzącego z rzędu taksonomicznego Hymenoptera.
31. Zrekombinowany alergen według zastrz. 30, znamienny tym, że jest mutantem alergenu jadu z rzędu taksonomicznego Vespidae, Apidae i Formicoidae.
32. Zrekombinowany alergen według zastrz. 29 albo 30 albo 31, znamienny tym, że jest mutantem Ves v 5.
33. Zrekombinowany alergen według zastrz. 32, znamienny tym, że jedno lub więcej podstawień wybranych jest z grupy złożonej z: K-16, K-185, K-11, K-44, K-210, R-63, K-13, F-6, Κ-149, K-128, E-184, K-112, F-157, Ε-3, K-29, Ν-203, Ν-34, K-78, K-151, L-15, L-158, Y-102, W-186, K-134,

PL 214 225 B1

D-87, K-52, Τ-67, T-125, K-150, Y-40, Q-48, L-65, K-81, Q-101, Q-208, K-144, N-8, N-70, H-104, Q-45, K-137, K-159, E-205, N-82, A-111, D-131, K-24, V-36, N-7, M-138, T-209, V-84, K-172, V-19, D-56, P-73, G-33, T-106, N-170, L-28, T-43, Q-114, C-10, K-60, N-31, K-47, E-5, D-145, V-38, A-127, D-156, E-204, P-71, G-26, Y-129, D-141, F-201, R-68, N-200, D-49, S-153, K-35, S-39, Y-25, V-37, G-18, W-85 i I-182.
34. Zrekombinowany alergen według jednego z zastrz. 33, do stosowania jako lek.
35. Zastosowanie zrekombinowanego alergenu według zastrz. 1 do 33, do przygotowania leku do zapobiegania i/lub do leczenia alergii.
36. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera zrekombinowany alergen według jednego z zastrz. 1 do 33 w zakresie od 0,0001 gm do 1000 gm oraz, że jest w postaci szczepionki przeciwko reakcjom alergicznym wywoływanym przez naturalnie występujący alergen u pacjentów cierpiących na alergię, i że ponadto zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub zaróbkę wybrane z wody, roztworu soli, dekstrozy, glicerolu, etanolu, mannitu, laktozy, skrobi, stearynianu magnezu, sacharyny sodowej, celulozy, węglanu magnezu i ich kombinacji, oraz adiuwantu wybranego z wodorotlenku glinu, fosforanu glinu, fosforanu wapnia, komórek bakterii, endotoksyn bakterii Gramujemnych lub lipopolisacharydu, emulsji olejowej, adiuwantu Freunda całkowitego i niecałkowitego; i adiuwantu saponinowego.
37. Sposób otrzymywania kompozycji farmaceutycznej według zastrz. 36, obejmujący zmieszanie zrekombinowanego alergenu według jednego z zastrz. 1 do 33 w zakresie od 0,0001 gm do 1000 gm z farmaceutycznie dopuszczalnymi substancjami i/lub zaróbkami wybranymi z wody, roztworu soli, dekstrozy, glicerolu, etanolu, mannitu, laktozy, skrobi, stearynianu magnezu, sacharyny sodowej, celulozy, węglanu magnezu i ich kombinacji, oraz adiuwantu wybranego z wodorotlenku glinu, fosforanu glinu, fosforanu wapnia, komórek bakterii, endotoksyn bakterii Gram-ujemnych lub lipopolisacharydu, emulsji olejowej, adiuwantu Freunda całkowitego i niecałkowitego; i adiuwantu saponinowego.
38. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że jest otrzymywana za pomocą sposobu określonego w zastrz. 37.
39. Sposób otrzymywania zrekombinowanego alergenu określonego w dowolnym z zastrz. 1 do 33, znamienny tym, że:

a) identyfikuje się szereg reszt aminokwasowych w naturalnie występującym alergenie, który ma dostępność dla rozpuszczalnika co najmniej 20%;

b) wybiera się 5 do 20 ze zidentyfikowanych reszt aminokwasowych w taki sposób, że każdy wybrany aminokwas oddalony jest od innych wybranych aminokwasów o co najmniej 15 A, i że wybrane aminokwasy umieszczone są w taki sposób, że co najmniej jeden kolisty obszar powierzchniowy z obszarem 800 A² nie zawiera żadnego wybranego aminokwasu; oraz

c) wykonuje się dla każdego z wybranych aminokwasów mutację pierwotną, która obniża zdolność wiązania specyficznego IgE zmutowanego alergenu w porównaniu ze zdolnością wiązania tego naturalnie występującego alergenu o co najmniej 5% w co najmniej jednym immunooznaczeniu stosując surowicę od osobnika alergicznego na naturalnie występujący alergen, gdzie każda mutacja pierwotna jest podstawieniem wybranej reszty aminokwasowej przez inny aminokwas, przy czym odchylenie średnie kwadratowe współrzędnych atomowych struktury trzeciorzędowej szkieletu α-węgla tego zmutowanego alergenu i tego naturalnie występującego alergenu wynosi poniżej 2 A, i który daje nie konserwatywne podstawienie reszty w tej samej pozycji w sekwencji aminokwasów dowolnego znanego białka homologicznego w gatunku taksonomicznym, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen.
40. Sposób według zastrz. 39, znamienny tym, że szereguje się reszty aminokwasowe względem dostępności dla rozpuszczalnika, i że podstawia się jeden lub więcej aminokwasów spośród tych bardziej dostępnych dla rozpuszczalnika.
41. Sposób według zastrz. 39 albo 40, znamienny tym, że wybiera się zidentyfikowane reszty aminokwasowe, które są konserwowane z więcej niż 70% identyczności we wszystkich znanych białkach homologicznych w obrębie gatunku, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen.
42. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że szereguje się reszty aminokwasowe względem stopnia konserwacji we wszystkich znanych białkach homologicznych w obrębie gatunku, z którego pochodzi ten naturalnie występujący alergen, i że podstawia się jeden lub więcej aminokwasów spośród tych bardziej konserwowanych.

PL 214 225 B1
43. Sposób według zastrz. 39 albo 40, albo 41, albo 42, znamienny tym, że obejmuje wybranie zidentyfikowanych aminokwasów tak, aby wytworzyć zmutowany alergen, który ma zasadniczo taką samą strukturę trzeciorzędową szkieletu α-węgla jak ten naturalnie występujący alergen.
44. Sposób według zastrz. 39 albo 40, albo 41, albo 42, albo 43, znamienny tym, że podstawienie reszt aminokwasowych przeprowadzane jest za pomocą mutagenezy ukierunkowanej.
45. Sposób przygotowania zrekombinowanego alergenu określonego w jednym z zastrz. 1-33, znamienny tym, że alergen produkowany jest z sekwencji DNA uzyskanej przez tasowanie DNA (inżynieria molekularna) DNA kodującego odpowiedni naturalnie występujący alergen.
46. Sekwencja DNA kodująca zrekombinowany alergen określony w jednym z zastrz. 1 do 33.
47. Sekwencja DNA według zastrz. 46, znamienna tym, że sekwencja jest pochodną sekwencji przedstawionej na fig. 3, gdzie sekwencja DNA jest zmutowana, aby kodować alergen mający 5 do 20 mutacji wybranych z grupy złożonej z: V2, E87, K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, I-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87 i E-73.
48. Sekwencja DNA według zastrz. 46, znamienna tym, że sekwencja jest pochodną sekwencji przedstawionej na fig. 3, gdzie sekwencja DNA jest zmutowana, aby kodować alergen mający 5 do 20 mutacji wybranych z grupy złożonej z: V2, D72, E87, K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, I-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87 i E-73.
49. Sekwencja DNA według zastrz. 46, znamienna tym, że sekwencja jest pochodną sekwencji przedstawionej na fig. 13, gdzie sekwencja DNA jest zmutowana, aby kodować alergen mający 5 do 20 mutacji wybranych z grupy złożonej z: K-16, K-185, K-11, K-44, K-210, R-63, K-13, F-6, Κ-149, K-128, E-184, K-112, F-157, Ε-3, Κ-29, Ν-203, Ν-34, K-78, K-151, L-15, L-158, Y-102, W-186, K-134, D-87, Κ-52, Τ-67, T-125, K-150, Y-40, Q-48, L-65, K-81, Q-101, Q-208, K-144, N-8, N-70, H-104, Q-45, K-137, K-159, E-205, N-82, A-111, D-131, K-24, V-36, N-7, M-138, T-209, V-84, K-112, V-19, D-56, P-73, G-33, T-106, N-170, L-28, T-43, Q-114, C-10, K-60, N-31, K-47, E-5, D-145, V-38, A-127, D-156, E-204, P-71, G-26, Y-129, D-141, F-201, R-68, N-200, D-49, S-153, K-35, S-39, Y-25, V-37, G-18, W-85 i I-182.
50. Sekwencja DNA według zastrz. 46, znamienna tym, że sekwencja jest pochodną sekwencji przedstawionej na fig. 16, gdzie sekwencja DNA jest zmutowana, aby kodować alergen mający 5 do 20 mutacji wybranych z grupy złożonej z: R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K-82, K-6, K-96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, I-97, B-22, V-65, S-24, H-74, K-126, L-61, P-26, N-93, D-64,I-28, K-14, Κ-100, E-62, I-127, E-102, E-25, P-66, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103. Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, H-124, I-68, P-79, K-109 i R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K-82, K-6, K-96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, I-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K-126, L-61, P-26, N-93, D-64, I-28, K-14, Κ-100, E-62, I-127, E-102, E-25, P-66, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, H-124, I-68, P-79, K-109 i K-15.
51. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że obejmuje DNA określone w jednym z zastrz. 46-50.
52. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera wektor ekspresyjny określony w zastrz. 51.
53. Sposób produkcji zrekombinowanego zmutowanego alergenu, znamienny tym, że obejmuje etap hodowania komórki gospodarza określonej w zastrz. 52.