EA015446B1

EA015446B1 - Гипоаллергенные варианты основного аллергена из пыльцы betula verrucosa

Info

Publication number: EA015446B1
Application number: EA200801463A
Authority: EA
Inventors: Джованни Мистрелло; Стефания Дзанотта; Даниэла Ронкароло; Паоло Фаладжани
Original assignee: Лофарма С.П.А.
Priority date: 2005-12-29
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2011-08-30
Also published as: PT1973567E; BRPI0620749A2; ITMI20052517A1; CN101351224B; ATE457738T1; NO20082881L; WO2007073907A1; EP1973567B1; ES2341367T3; AU2006331005B2; DE602006012376D1; CA2634955C; EP2172215A3; CN101351224A; US8945574B2; ES2441217T3; AU2006331005A1; DK2172215T3; CA2634955A1; MX2008008578A

Abstract

В изобретении предложены гипоаллергенные варианты основного аллергена Bet v 1 из пыльцы растения Betula verrucosa и их применение для профилактического или терапевтического лечения аллергических заболеваний.

Description

В настоящем изобретении предложены варианты гипоаллергенных последовательностей белка Вс1 ν 1, молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие их, фармацевтические композиции, содержащие указанное, и их применение в профилактике и терапии аллергических заболеваний, вызываемых пыльцой растений вида Ве1и1а уеггисоха.

Предшествующий уровень техники

Причиной аллергий является нарушение функции иммунной системы, которая реагирует на безвредные белки, содержащиеся в пыльце, клещей, эпителий и некоторые продукты питания путем продуцирования антител 1дЕ-класса.

Последние данные указывают на то, что более 10% населения в западных страны страдают от данного заболевания, симптомы которого могут ухудшаться со временем, приводя, например, к астме или к сенсибилизации по отношению к другим аллергенам, затрудняя таким образом выбор подходящей терапии.

Специфическая гипосенсибилизирующая иммуннотерапия, в отличие от фармакологической терапии, является только этиологическим лечением аллергических заболеваний, способным положительно изменять иммунологические параметры, на которых основаны эти заболевания.

Гипосенсибилизирующая иммуннотерапия состоит во введении возрастающих доз стандартизованных экстрактов (вакцин), полученных из того же вещества, которое вызывает заболевание (1). Таким образом, у пациента постепенно индуцируют вид иммунологической толерантности на указанное вещество с последующим исчезновением аллергических симптомов.

Однако риск вызвать серьезные побочные эффекты (2), хотя и значительно сниженный при использовании либо вакцин с медленным высвобождением, либо вакцин, вводимых путями, альтернативными инъекциям, фактически ограничивает применение специфической гипосенсибилизирующей иммунотерапии в лечении аллергических заболеваний.

В посление годы наибольшее внимание уделяется разработке эффективных безопасных вакцин. В частности, важной целью является разработка вакцин, состоящих из мутагенизированных рекомбинантных белков, т. е. гипоаллергенных вариантов, способных положительно влиять на естественное развитие заболевания, не вызывая нежелательных побочных эффектов (3).

Пыльца растений, таксономически известных как Рада1е8 (береза, ольха, лещина, дуб, граб), является одной из наиболее важных причин аллергического ринита и астмы в областях умеренного пояса. Два основные аллергена березовой пыльцы Ве1 ν 1 (кДНК, депонированная в СепВапк асе. Νο. Х15877) и Ве1 ν 2 (асс. N0. М65179) представляют собой белки с молекулярной массой 17 и 14 кДа соответственно (4,5). Почти 95% пациентов с аллергией на березовую пыльцу продуцируют 1дЕ антитела против Ве1 ν 1 и 60% этих пациентов демонстрируют реактивность к одному Ве1 ν 1 (6).

Ве1 ν 1 присутствует в природе в более чем десяти изоформах, демонстрирующих идентичность последовательностей от 84,4 до 99,4% (7). Этот аллерген принадлежит к семейству белков, связанных с патогенезом, то есть повсеместно присутствующих белков, продуцируемых растениями в ответ на экологический или патологический стресс, предполагаемые функции которых связаны со стероидным транспортом (8, 9). Высокая степень гомологии последовательностей с аллергенами группы 1 в пыльце других растений отряда Рада1е8 объясняет, почему пациенты с 1дЕ, специфичным в отношении Ве1 ν 1, демонстрируют аллергические симптомы во время сезона образования пыльцы у разных растений, принадлежащих к тому же таксономическому отряду (10). Аллергия на березовую пыльцу часто сопровождается побочными реакциями, провоцируемыми потреблением свежих фруктов (например, вишни, яблок, груши) или овощей (например, сельдерея и моркови). Причиной является то, что такие продукты питания содержат белки, характеризующиеся высокой степенью гомологии последовательности и структуры с Ве1 ν 1, которые распознаются специфическими 1дЕ, индуцируемыми основным аллергеном березы (11). Иммуннотерапия аллергеном Ве1 ν 1 может быть эффективна в лечении аллергии на березовую пыльцу, а также поллиноза на другие растения отряда Рада1е§ и аллергии на пищу, содержащую аллергены, которые перекрестно реагируют с Ве1 ν 1 (12).

Фактором, коррелирующим с полезными эффектами гипосенсибилизирующей иммуннотерапии, является индукция 1дО антител, специфичных к сенсибилизирующему аллергену. Такие (защитные) антитела могут ингибировать связывание 1дЕ с антигеном, конкретно с Ве1 ν 1, изменяя трехмерную конформацию данной молекулы (13, 14). Разработка вакцин, состоящих из рекомбинантных белков, обладающих меньшей аллергенностью и неизмененными иммуногенными свойствами, улучшит терапию аллергических заболеваний.

Описание изобретения

Было обнаружено, что при замене или удалении одного или более аминокислотных остатков в белковой последовательности аллергена Ве1 ν 1 он становится менее реактивным к 1дЕ антителам.

В первом аспекте изобретения предложен гипоаллергенный белок, представляющий собой вариант последовательности аллергена Ве1 ν 1, отличающий тем, что он:

1) демонстрирует пониженную реактивность к 1дЕ по сравнению с Ве1 ν 1 аллергеном дикого типа (8Еф ΙΌ N0:1);

2) имеет аминокислотую последовательность, которая:

- 1 015446

а) по меньшей мере на 87%, предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 97% идентична 8ЕО ΙΌ N0:1;

б) при выравнивании последовательности с 8Е0 ΙΌ N0:1 присутствует по меньшей мере одна замена или делеция остатков, соответствующих аминокислотам 54, 115 и/или 123 из 8Е0 ΙΌ N0:1, где присутствует остаток Ьу8.

Варианты аллергена Ве1 ν 1, которые в соответствии с изобретением демонстрируют 1, 2 или 3 замены и/или делеции Ьу8 в указанных положениях, упоминаются как одиночный, двойной или тройной варианты замены и/или делеции соответственно. Более предпочтительными являются варианты замены, а не делеции, особенно те, при которых по меньшей мере один остаток Ьу8 в указанных положениях заменен нейтральной или полярная аминокислотой. Более предпочтительно указанная нейтральная или полярная аминокислота выбрана из А1а, Т11Г. 01у, Рго, Ьеи, Не, 8ег, Рйе, еще более предпочтительно из А1а, Тйг и 8ег.

В предпочтительном воплощении гипоаллергенный белок состоит из 8Е0 ΙΌ N0:1, несущей указанную по меньшей мере одну замену или делецию Ьу8 остатка в положениях 54, 115 и 123.

Типичные гипоаллергенные белки по изобретению, несущие 1 или 3 замены, идентифицированы в 8ЕО ΙΌ N0:2, 8ЕО ΙΌ N0:3, 8ЕО ΙΌ N0:4 и 8ЕО ΙΌ N0:5.

Замещенные и/или делеционные варианты аллергена Ве1 ν 1 по изобретению по сравнению с копией дикого типа демонстрировали снижение 1дЕ реактивности по меньшей мере на 25%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 80% на сыворотку пациентов, страдающих аллергией на пыльцу Ве1и1а теггиео^а.

^Е-реактивность белков 8Е0 ΙΌ N0:2-5 из объединенных сывороток пациентов с аллергией тестировали в анализе ЕЫ8А (твердофазный иммуносорбентный анализ) (фиг. 1). По сравнению с Ве1 ν 1 аллергеном дикого типа (8ЕО ΙΌ N0:1), 56% (8ЕО ΙΌ N0:2), 34% (8ЕО ΙΌ N0:3), 28% (8ЕО ΙΌ N0:4) и 80%-ное (8Е0 ΙΌ N0:5) среднее снижение ΙβΕ реактивности наблюдалось, когда такие белки инкубировали с различными разбавлениями (от 1:2 до 1:8) объединенной сыворотки пациентов, страдающих аллергией на пыльцу березы.

Эти результаты были подтверждены экспериментами ЕЫ8А ингибирования, которые позволяют оценить реактивность гомологичных эпитопов из разных белков. Связывание Ве1 ν 1 дикого типа (8Е0 ΙΌ N0:1) с ΙβΕ из объединенной сыворотки ингибируется на 100%, когда эту сыворотку предварительно обрабатывают тем же белком, в то время как наблюдаемое ингибирование составляет только 40%, когда сыворотку предварительно инкубируют с идентичными количествами варианта с тройной заменой (8Е0 ΙΌ N0:5) (фиг. 2). Эти результаты ясно указывают, что аминокислотные замены по положениям 54, 115 и 123 в 8Е0 ΙΌ N0:1 уменьшают ΙβΕ распознавание Ве1 ν 1 аллергена.

Кроме того, реактивность 8Е0 ΙΌ N08:2-5 белков в отношении 1дЕ из объединенной сыворотки, позитивной к пыльце ВеШ1а уеггисо8а, анализировали вестерн-блоттингом. Также в данном случае наблюдалось уменьшение 1дЕ реактивности в анализируемой сыворотке, которое по сравнению с Ве1 ν 1 дикого типа (8ЕО ΙΌ N0:1) составляло 88% для 8ЕО ΙΌ N0:2, 67% для 81Т) ΙΌ N0:3, 47% для 81Т) ΙΌ N0:4 и 100% для 8ЕО ΙΌ N0:5 (фиг. 3).

Кроме того, в экспериментах с иммунизацией Ва1Ь/с мышей как аллерген Ве1 ν 1 дикого типа, так и гипоаллергенный белок 8Е0 ΙΌ N0:5 доказали способность индуцировать Ι^Ο-специфичный иммунный ответ (фиг. 4). В частности, антитела против 8Е0 ΙΌ N0:5 были способны распознавать νΐ-копию (\ν\ν = дикий тип) 8Е0 ΙΌ N0:1 (фиг. 5), что означает, что замена остатка Ьу8 в положениях 54, 115 и/или 123 не обуславливает значительного изменения иммуногенность белка и, в частности, его ΙβΟ эпитопов. Наоборот, антитела, присутствующие в сыворотке мышей, иммунизированных некоррелированным антигеном, были не способны распознавать ни Ве1 ν 1 дикого типа, ни 8Е0 ΙΌ N0:5.

В дополнительном аспекте изобретения предложен иммунологически активный пептид, соответствующий фрагменту Ве1 ν 1, содержащему от 15 до 35, более предпочтительно от 15 до 20 аминокислотных остатков и несущий по меньшей мере одно из вышеописанных замен и/или делеций. При использовании здесь выражение иммунологически активный пептид указывает пептид, который способен вызывать ^Е-независимый иммунный ответ.

Замещенные и/или делеционные варианты по изобретению могут быть легко получены посредством мутагенеза последовательности кДНК (8Е0 ΙΌ N0:6) Ве1 ν 1 с использованием способов и методик, известных любому специалисту в данной области техники.

Последовательности кДНК, кодирующие одиночные и тройные варианты замены 8Е0 ΙΌ N0:2-5, идентифицированы в 8Е0 ΙΌ N0:7-10 соответственно.

В дополнительных аспектах изобретения предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гипоаллергенный белок Ве1 ν 1, раскрытый здесь, или производный от него пептид, и экспрессирующий вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, функционально связанную с генетическими элементами, контролирующими экспрессию указанного белка или пептида в эукариотических или прокариотических клетках, такими как транскрипционные промоторы, энхансеры, сигнальные и лидерные последовательности или другие последовательности, вовлеченные в регуляцию транскрипции. Примеры векторов включают плазмиды, вирусы и фаги, но также можно использовать любой другой вектор,

- 2 015446 который обычно используют в генной инженерии.

Изобретение также включает прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяин, которая трансформирована или трансфицирована вектором, как описано выше. Прокариотические клетки, такие как ЕзсйепсЫа сой или ВасШиз зиЫйНз, или эукариотические клетки, такие как Бассйаготусез сегетыае, в общем случае используют для клонирования вектора и экспрессии кДНК.

Кроме того, гипоаллергенные варианты по изобретению могут продуцироваться как слитые белки.

Благодаря их пониженной 1дЕ-реактивности Ве! ν 1 варианты в соответствии с настоящим изобретением можно удобно использовать для получения фармацевтических композиций (например, таблеткок и капсул) для профилактического или терапевтического лечения субъектов, страдающих аллергией на пыльцу Ве!и1а νе^^исо8а.

Дополнительный аспект изобретения, следовательно, относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество гипоаллергенного варианта Ве! ν 1, как предложено здесь, возможно в комбинация с другими аллергенами Ве!и1а νе^^исо8а и/или с фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами. В предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция находится в форме вакцины для применения в профилактике или терапии аллергических заболеваний, включая бронхиальную астму, аллергический ринит, аллергический дерматит и аллергический конъюнктивит. Теория и практика вакцинации известны специалисту в данной области техники (15, 16).

Следующие ниже примеры дополнительно иллюстрируют данное изобретение. Если не указано иное, способы, используемые в примерах, описаны в БатЫгоок, Егйзсй ЕТ Машайз Мо1еси1аг с1ошп§. А 1аЫога!огу тапиаГ', II ей., νо1. 1-2-3, СБИ каЫ Ргезз 1989.

Пример 1. Сайт-специфический мутагенез кДНК, кодирующей аллерген Ве! ν 1.

Сайт-специфический мутагенез кДНК, кодирующей аллерген Ве! ν 1 (БЕ^ ΙΌ ΝΟ: 6), осуществляли посредством кДНК клонирования в прокариотическом векторе (рВ1иезспр!, гепВапк асс. п. Х52327) с последующей РСК (полимеразная цепная реакция)-амплификацией. Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров в РСК-реакции (см. таблицу), несли подходящие замены оснований. Для каждого мутагенеза использовали комплементарное олигонуклеотидное связывание с подходящей областью нити ДНК (17). После амплификации неизмененную первоначальную матрицу селективно расщепляли ферментативным гидролизом, катализируемым ферментом рестрикция Όρη. Клетки ЕзсйепсЫа сой затем трансформировали мутагенизированными молекулами. Клоны, полученные из одиночных бактериальных колоний, секвенировали в соответствии с Бапдег для обнаружения корректных модификаций оснований и отсутствия неспецифических мутаций в кДНК.

В таблице показаны последовательности олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров в сайт-специфическом мутагенезе (мутантные основания выделены жирным)__________

Олигонуклеотид	Последовательность
Ве! ν 1 54	сс! дда асс ай дед аад а!с аде й! ссс
Ββίν 1 115	дд! !сс а!с йд дед а!с аас аас аад !ас с
Ве! ν 1 123	аад !ас са! асс дса дда дас са! дад

Пример 2. Получение белка Ве! ν 1 и его вариантов.

Дикого типа (БЕ9 II) N. 6) и мутагенизированные (БЕ9 II) N. 7-10) кДНК Ве! ν 1, фланкированные последовательностью, кодирующей шесть гистидинов, клонировали и экспрессировали в ЕзсйепсЫа сой в соответствии со стандартными протоколами (18, 19). Клетки собирали центрифугированием, ресуспендировали в буфере 50 мМ №Н_:РО|, 300 мМ №С1, рН 8, и лизировали обработкой ультразвуком. Рекомбинантные белки разделяли центрифугированием. Осадок, содержащий нерастворимый белковый агрегат, ресуспендировали в 100 мМ ΝΗ₂ΡΟ₄, 10 мМ Трис-НС1, 8 М мочевины (рН 8) (денатурирующий буфер) и перемешивали в течение 60 мин. Солюбилизированные рекомбинантные белки отделяли от нерастворимого дебриса центрифугированием и очищали аффинной хроматографией в денатурирующих условиях, используя колонки агароза, связанные с нитрилотриуксусной кислотой, которая хелатирует ионы никеля, взаимодействующие с шесть-гистидиновым участком, слитым с аллергеном. Осуществляли рефолдинг очищенных белков посредством диализа в течение 16 ч при 4°С в растворе 0,68%. №С1, 0,275% №НСО;.

Пример 3. Характеристики сыворотки из субъектов с аллергией.

Сыворотку собирали от субъектов с сезонной аллергией на пыльцу Ве!и1а νе^^исоза в клиническом анамнезе и КАБТ 4+ специфической реактивностью к аллергенам В. νе^^исоза и затем их объединяли. Объединенную сыворотку от пациентов без аллергии использовали в качестве отрицательного контроля.

Пример 4. ЕБ1БА анализ реактивности вариантов Ве! ν 1 к 1дЕ из объединенной сыворотки.

Одинаковое количество аллергена дикого типа и мутагенизированных вариантов (0,5 мкг) в 50 мМ карбонатном/бикарбонатном буфере, рН 9,6, адсорбировали на лунки полистирольных планшетов для анализа ЕБ1БА путем инкубации при 4°С в течение 16 ч. Лунки промывали промывным раствором (60 мМ фосфатный буфер, рН 6,5, содержащий 0,05% Твин-20) и блокировали разбавляющим раствором (25% лошадиная сыворотка, 1 мМ ЕОТА, 0,05% Твин 20, 0,01% Тиомерсал в 150 мМ фосфатном буфере, рН 7,4). 100 мкл аликвоты серийных разбавлений (в разбавляющем буфере) объединенной сыворотки

- 3 015446 людей КЛ8Т 4+ добавляли к каждому образцу и инкубировали при 25°С в течение 2 ч. После трех промывок добавляли пероксидаза-конъюгированную античеловеческий 1дЕ сыворотку (1:1500 в разбавляющем буфере) и затем инкубировали при 25°С в течение 1,5 ч. После трех промывок осуществляли колориметрическую реакцию путем добавления 100 мкл ТМВ реагента (ΒίοΕΧ ЕаЬогаЮпск. ϋ\νίη§5 МШк, МО) и инкубировали в течение 15 мин при 25°С. Реакцию останавливали путем добавления 100 мкл 1 н. НС1 и считывали при 450 нм. используя микропланшетный считывающий спектрофотометр.

Пример 5. ЕЬ18А анализ ингибирования. Ингибирование Вс1 ν 1 вариантами связывания Вс1 ν 1 дикого типа с 1дЕ из объединенной сыворотки.

мкг аликвоты аллергена дикого типа в 50 мМ карбонатном/бикарбонатном буфере. рН 9.6. адсорбировали на лунки полистирольных планшетов для ЕЬ18А анализа путем инкубации при 4°С в течение 16 ч. Лунки промывали раствором для промывки (60 мМ фосфатный буфер. рН 6.5. содержащий 0.05% Твин-20) и блокировали разбавляющим буфером (25% лошадиная сыворотка. 1 мМ ΕΌΤΆ. 0.05% Твин 20. 0.01% Тиомерсал в 150 мМ фосфатном буфере. рН 7.4). 100 мкл аликвоты КА8Т 4+ объединенной сыворотки людей. разбавленные 1:3 в буфере для разбавления. предварительно инкубировали при 25°С в течение 2 ч с серийными разбавлениями аллергена дикого типа и мутагенизированного варианта. Полученный раствор помещали в лунки и инкубировали при 4°С в течение 16 ч. После трех промывок 0.06 М фосфатным буфером. рН 6.5. Твин-20 0.05%. добавляли пероксидаза-конъюгированную античеловеческий 1дЕ сыворотку с разбавлением 1:1500 (в буфере для разбавления). с последующей инкубацией при 25°С в течение 1.5 ч. После трех промывок осуществляли колориметрическую реакцию путем добавления 100 мкл ТМВ реагента (ΒίοΕΧ ЬаЬогаЮпек. Θνίη^κ МШк. ΜΌ) и инкубирования при 25°С в течение 15 мин. Реакцию останавливали путем добавления 100 мкл 1 н. НС1 с последующим спектрофотометрическим считыванием при 450 нм.

Процент ингибирования рассчитывали следующим образом: 100х[(А-В)/А]. где А представляет собой поглощение при 450 нм в отсутствие ингибитора. в то время как В представляет собой поглощение в присутствии ингибитора.

Пример 6. Вестерн-блоттинг анализ реактивности Ве1 ν 1 вариантов в отношении 1дЕ из объединенной сыворотки.

Равные количества аллергена дикого типа и мутагенизированных форм (1.5 мкг) анализировали электрофорезом на полиакриламидном геле с последующим электроблоттингом на нитроцеллюлозной мембране. как описано Το\\Τίη (20).

Мембрану сначала инкубировали в течение одного часа в ΤΒ8Τ (ΤΒ8. 0.05% Твин-20). содержащем 5% обезжиренного сухого молока (насыщающий буфер). и затем инкубировали в течение ночи с объединенной сывороткой из субъектов с аллергией к Βеΐи1а уеггисо^а. демонстрирующим 4+ реактивность. разбавляли 1:3 в ΤΒ8Τ 2% обезжиренном сухом молоке. После часовой инкубации мембрану промывали три раза ΤΒ8Τ. Мембран-связанные антитела контактировали с пероксидаза-конъюгированной античеловеческий 1дЕ сывороткой и после несколько промывок детектировали с помощью хемилюминисцентной системой детекции. используя люминол в качестве субстрата пероксидазы (ЕСЬ. Атеткйат).

Пример 7. Протокол иммунизация Βа1Ь/с мышей.

Две группы по 5 самок Βа1Ь/с мышей (Сйат1е8 Р|уег) подкожно иммунизировали 200 мкл эмульсии. содержащей 100 мкл полного адъюванта Фрейнда и 20 мкг антигена (8ЕО ГО N0:1 и 8ЕО ГО N0:5) в 100 мкл физиологического раствора. Проводили три дополнительных бустерных иммунизации с 1недельными интервалами. заменяя полный адъювант неполным. В качестве контроля пяти мышам вводили некоррелированный антиген. Через семь суток после последней иммунизации из хвоста отбирали образец крови и использовали в ЕЬ18А для контроля за антительным ответом против каждого иммуногенного агента. У мышей. иммунизированных 8ЕО ГО N0:5. также анализировали способность распознавать белок дикого типа.

Пример 8. ЕЬ18А анализ 1дО-специфического ответа у иммунизированных мышей.

Одинаковые количества Βеΐ ν 1 дикого типа и варианта 8ЕО ГО N0:5 (0.25 мкг) в 50 мМ карбонатном/бикарбонатном буфере. рН 9.6. адсорбировали на лунки полистирольных планшетов для ЕЬ18А анализа путем инкубации в течение 16 ч при 4°С. Лунки промывали промывным раствором (60 мМ фосфатный буфер. рН 6.5. содержащий 0.05% Твин-20) и блокировали разбавляющим раствором (25% лошадиная сыворотка. 1 мМ Ε^ΤА. 0.05% Твин 20. 0.01% Тиомерсал в 150 мМ фосфатном буфере. рН 7.4). 100 мкл аликвоты серийных разбавлений (в буфере для разбавления) сыворотки от каждой мыши помещали в лунки и инкубировали в течение 2 ч при 25°С.

После трех промывок пероксидаза-конъюгированную анти-мышиный 1дО сыворотку разбавляли 1:2000 в буфере для разбавления и добавляли к лункам. затем инкубировали в течение 1.5 ч при 25°С. После трех промывок осуществляли колориметрическую реакцию путем добавления 100 мкл ТМВ реагента (ΒίοΕΧ ЬаЬогаЮпек. 0\νίη§5 Мйк. МО) и инкубировали в течение 15 мин при 25°С. Реакцию останавливали 100 мкл 1 н. НС1 с последующим спектрофотометрическим считыванием при 450 нм. На фиг. 4 и 5 показана средняя реактивность. полученная при анализе сыворотки от 5 мышей для каждой группы.

Краткое описание графических матеиалов

Фиг. 1 - ЕЫ8А анализ 1дЕ реактивности к Βеΐ ν 1 аллергену и к Βеΐ ν 1 гипоаллергенным вариантам;

- 4 015446 фиг. 2 - ингибирование 1дЕ связывания с Вс! ν 1 аллергеном; фиг. 3 - вестерн-блоттинг анализ 1дЕ реактивности к Вс! ν 1 аллергену и его вариантам; фиг. 4 - мышиный 1дС ответ на соответствующие иммуногенные белки; фиг. 5: 1дС ответ у мышей, иммунизированных 8ЕО ΙΌ N0:5.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1) по меньшей мере на 87%, предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 97% идентична 8Еф ΙΌ N0:1;

1. Белок, представляющий собой гипоаллергенный вариант основного аллергена пыльцы Вс!и1а усггисока (Вс! ν 1) и отличающийся тем, что он:

а) обладает пониженной реактивностью к 1дЕ по сравнению с Вс! ν 1 дикого типа (8ЕО ΙΌ NО: 1);

б) имеет аминокислотную последовательность, которая:

2. Белок по п.1, отличающийся тем, что указанные остатки Ьу§ замещены нейтральными или полярными аминокислотами.

2) при выравнивании последовательности с 8Еф ΙΌ N0:1 присутствует по меньшей мере одна замена или делеция Ьу§ остатков в положениях, соответствующих аминокислотам 54, 115 и/или 123 в 8Еф ΙΌ N0:1.

3. Белок по п.2, отличающийся тем, что указанные нейтральные или полярные аминокислоты выбраны из А1а, Тйт, 01у, Рго, Ьеи, Не, Р11С. 8ет.

4. Белок по п.3, отличающийся тем, что указанные аминокислоты представляют собой А1а, 8ет или Т11Г.

5. Белок по п.1, выбранный из группы, состоящей из 8Еф ΙΌ N0:2, 8Еф ΙΌ N0:3, 8Еф ΙΌ N0:4, 8Еф ΙΌ N0:5.

- 5 015446

6. Иммунологически активный пептидный фрагмент белка по пп.1-5, содержащий от 15 до 35 аминокислот и несущий по меньшей мере одну замену и/или делецию Ьук, как определено выше.

7. Фрагмент по п.6, содержащий от 15 до 20 аминокислот.

8. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок по пп.1-5 или фрагмент по пп.6, 7.

9. Молекула нуклеиновой кислоты по п.8, выбранная из группы, состоящей из 8Еф ΙΌ N0:7, 8Еф ГО N0:8, 8Еф ГО N0:9, 8Еф ГО N0:10.

10. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по пп.8-9.

11. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.10.

12. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество белка по пп.1-5 или фрагмента по пп.6, 7 вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами.

13. Вакцина, включающая композицию по п.12.

14. Применение белка по пп.1-5 или фрагмента по пп.6, 7 для приготовления лекарственного средства для профилактики или терапевтического лечения аллергических заболеваний.

15. Применение по п.14, где заболевание представляет собой бронхиальную астму, ринит, конъюнктивит или атопический дерматит.