PT1434793E - Alérgenos recombinantes com ligação a ige reduzida, mas com antigenicidade de células t não diminuída - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ALÉRGENOS RECOMBINANTES COM LIGAÇÃO A IGE REDUZIDA, MAS COM ANTIGENICIDADE DE CÉLULAS T NÃO DIMINUÍDA" São aqui descritos reagentes úteis no tratamento imunoterapêutico ou imunoprofilático de doenças alérgicas. Mais particularmente, a presente invenção fornece alérgenos modificados que exibem interatividade de IgE reduzida, incluindo uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, mantendo no entanto a antigenicidade das células T, que são úteis na imunomodulação de patologias de doenças alérgicas de tipo I. A presente invenção contempla adicionalmente um método de imunomodulação de doenças alérgicas, tais como patologias de doenças alérgicas de tipo I, mediante a administração de alérgenos modificados que exibem interatividade de IgE reduzida, mantendo no entanto a antigenicidade das células T.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os pormenores bibliográficos das referências mencionadas na presente descrição são enumerados no final da descrição. A referência a qualquer técnica anterior na presente descrição não é nem deverá ser tomada como reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que a referida técnica anterior faz parte do conhecimento geral comum em qualquer pais.

As doenças alérgicas de tipo I, tais como a rinite alérgica sazonal (febre dos fenos), conjuntivite, a asma alérgica e dermatite alérgica, representam um grave problema de saúde nos paises industrializados (Wuthrich, Int. Arch. Immunol. 2 90: 3-10, 1989). Estima-se habitualmente que 15 a 20% da população dos paises desenvolvidos são atacados com alguma das formas de alergias (Miyamoto, Advances in Allergology and Clinicai Immunology. Godard P, Bousquet J, Michel FB (editores) pp. 343-347. The Parthenon Publishing Group,

Comforth, UK, 1992). Por conseguinte, o diagnóstico e a terapia destas doenças tornaram-se pontos focais de interesse para a investigação cientifica.

As bases primárias, imunológicas e bioquimicas, das reações alérgicas de tipo I são a interação de substâncias alergénias (alérgenos) com anticorpos IgE ligados a recetores Fc de alta afinidade sobre a superfície de células mastócitos e basófilas. Esta interação tem como resultado a reticulação de anticorpos IgE específicos do alérgeno, o que, por sua vez, estimula uma libertação imediata e a produção em cascata de mediadores inflamatórios responsáveis por sintomas alérgicos. Os alérgenos estão presentes em partículas transportadas pelo ar, tais como a poeira doméstica, o pólen de plantas herbáceas, ervas e árvores, esporos de fungos e caspa animal.

Presentemente, uma forma de intervenção terapêutica de doenças alérgicas (tais como a rinite, conjuntivite e asma alérgica) envolve a injeção do alérgeno que se supõe ser responsável pela resposta alérgica. Isto é designado como tratamento de hipossensibilização. Os extratos correntemente utilizados neste processo são preparados a partir de fontes naturais e contêm, para além dos alérgenos, componentes tais como proteínas, às quais os pacientes não são alérgicos. O desenvolvimento de técnicas recombinantes proporcionou os meios para se produzirem altos níveis de alérgenos 3 purificados, para fins de diagnóstico e terapêuticos. No entanto, o alto nivel de pureza das preparações de alérgenos recombinantes tem como resultado um elevado indice anafilactogénico, mesmo para doses muito baixas. Em conformidade, é necessário um cuidado extremo quando são administrados a pacientes. Há, Por conseguinte, necessidade de se desenvolverem alérgenos recombinantes com um risco reduzido de choque anafilático. A principal causa no exterior de febre dos fenos e asma alérgica sazonais é o pólen de ervas transportado pelo ar (Smart et al., Int. Arch. Immunol. 7: 243-248, 1983). Os calendários de pólenes mostram que o pólen das ervas tem a máxima abundância na primavera e início do verão, quando as ervas florescem, e isto coincide com os picos de incidência da asma alérgica. As fontes mais importantes de pólen de ervas são as ervas comuns dos pastos agrícolas, que têm sido largamente disseminadas por todo o mundo, mas variam com a temperatura e em zonas climáticas tropicais. Nas regiões de temperaturas frias, ervas tais como a azevém, a poa de Kentucky, e o timóteo (pertencentes todos à família das Pooideae) têm importância clínica, ao passo que a temperaturas amenas e em ambientes subtropicais o pólen da erva de Bermudas (subfamília das Chloridoideae) se torna a fonte mais importante de alérgenos. Têm sido feitos estudos muito compreensivos sobre proteínas do pólen da azevém e, em menor extensão, da poa de Kentucky e do timóteo.

Os indivíduos sensíveis aos alérgenos de uma erva são também, frequentemente, sensíveis aos de um grande número de outros géneros de ervas. Isto é particularmente verdadeiro para os pólenes de ervas pertencentes à subfamília das Pooideae (Smith et al., "Analysis of rye-grass pollen allergens using two dimensional electrophoresis and immunoblotting." In Kraft D (editores), Molecular Biology 4 and Immunology of Allergens, CRC Press, Boca Raton, FL, 1994), onde a reatividade cruzada imunológica foi demonstrada em experiências de inibição, utilizando-se um ensaio de ligação de IgE, o teste radioalergoabsorvente (RAST). Nestas experiências extratos de pólen de uma erva foram capazes de inibir a ligação de IgE a extratos de outras ervas.

Os componentes alergénicos do pólen de ervas podem ser classificados em diferentes grupos, de acordo com as suas propriedades fisico-quimicas e imunológicas. Os principais alérgenos que provocam uma reação alérgica ao pólen das ervas Pooid são os alérgenos dos grupos 1 e 5, como é avaliado por ambos os critérios do número de pacientes alérgicos que respondem e quantidades relativas de IgE que se ligam aos alérgenos (Singh et al., 1991, supra). No caso da azevém perene, Lolium perenne, os extratos de pólen contêm mais de 17 proteínas que têm a capacidade de ligar IgE do soro de pacientes alérgicos ao pólen de ervas (Smith et ai., 1993, supra). No entanto, demonstrou-se que os alérgenos dos grupos 1 e 5 em conjunto podem inibir a maior parte do IgE que se liga a extratos de pólen brutos (Bonde et ai., J. Allergy Clin. Immunol. 91: 339, 1993). A Lol p 5, uma proteína de 28-33 kDa, é o segundo alérgeno de azevém de maior prevalência que causa alergia em 85-90% dos indivíduos alérgicos ao pólen de ervas. A clonagem molecular de ADNcs que codificam este grupo 5 alérgeno (Singh et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 1384-1388, 1991; Ong et al., Gene 134: 235-240, 1993) demonstrou que a Lol 5 existe na forma de uma família de isoformas homólogas mas que se distinguem, que retêm a sua reatividade a IgE mesmo depois da separação em geles SDS-PAGE desnaturantes e imunoimpressão (Singh et ai., 1991, supra). 5

Swoboda I. et al. revelam formas hipoalergénicas do alérgeno do pólen de azevém Lol p 5 como candidatos para a imunoterapia (Swoboda I. et al., Int. Arch. Allerg. Immunol. 134: 1018-2438, 2001). Suphioglu revela a base molecular do reconhecimento de IgE de Lol p 5 (Suphioglu C. et al., Immunol. 35: 293-305, 1998) e Blaher revela a identificação dos epitopos de células T de Lol p 9 (Blaher B. et al. , J. Allergy Clin. Immunol. 98: 124-132, 1996),

Burton revela o contato do recetor da célula T e resíduos que se ligam a MHC de um epítopo de célula T de alérgeno de azevém (Burton M. D. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 103: 255-61, 1999) e De Lalla descreve a identificação de epitopos de células T em Lol p 5 por previsão computacional (Lalla De C. et al., J. Immunol. 163: 1725-1729, 1999). Ong revela os epitopos antigénico e alergénico de Lol p 5b utilizando fragmentação de genes (Ong E. K. et al., Immunol. 32: 295-302, 1995). O documento WO95/06728 descreve peptídeos de Lol p 5 compreendendo epitopos de células T e Swoboda revela mutantes de Lol p 5 com uma reduzida capacidade de ligação de IgE (Swoboda I. et al., europ. J. Immunol. 32: 270-280, 2002). Schramm revela a preparação de variantes de Phl p 5b com reduzida capacidade de ligação de IgE, mas não reatividade de células T conservada por engenharia de alérgenos (Schramm G. et al., J. Immunol. 162: 2406-2414, 1999) e Muller descreve epitopos de alérgenos de células T (Muller W. D. et al., Allergologie 22: 455-459, 1999). Wiederman revela a indução de tolerância da mucosa com moléculas hipoalergénicas num modelo murínico de asma alérgica (Wiedermann U. et al., Int. Arch. Allerg. Immunol. 124: 391-394, 2001) e Bannon revela a modificação, caraterização e eficácia in vitro dos principais alérgenos de amendoim para utilização em imunoterapia (Bannon G. A. Et al., Int. Arch. Allerg. Immunol. 124: 70-72, 2001). Akdis revela a regulação da resposta imune especifica por modificações químicas e 6 estruturais de alérgenos (Akdis C. A. et al., Int. Arch. Allerg. Immunol. 121: 261-269, 2000) e Son descreve a clonagem e a análise imunológica de Mal d 1 e Bet v 1 (Son D. Y. et al., Europ. J. Nutrit. 38: 201-215, 1999). Kraft revela a importância de alérgenos recombinantes para o diagnóstico e a terapia de alergias mediadas por IgE (Kraft D. et al., Int. Arch. Allerg. Immunol. 118: 171-176, 1999), Larche descreve terapias direcionadas para alérgenos, IgE e mastócitos (Larch M. et al., Progr. Respirat. Res. 31: 182-185, 2001) e Takai revela a combinação não anafilática de fragmentos parcialmente deletados de Der f 1 para a imunoterapia especifica de alérgenos (Takai T. et al., Mol. Immunol. 36: 1055-1065, 1999). Por conseguinte, existe uma necessidade de se desenvolverem formas modificadas de alérgenos recombinantes úteis na imunoterapia e na imunoprofilaxia de estados alérgicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Ao longo da presente descrição, a menos que o contexto exija o contrário, o termo "compreender", ou variantes tais como "compreende" ou "compreendendo" serão entendidos como implicando a inclusão de um dado elemento ou número, ou grupos de elementos ou de números, mas não a exclusão de qualquer outro elemento ou número ou grupo de elementos ou números.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos serão designadas por um número identificador da sequência (SEQ ID NO:). Os SEQ ID NOs: correspondem numericamente aos identificadores das sequências <400>1 (SEQ ID NO:l), <400>2 (SEQ ID NO:2), etc. A Tabela 1 fornece um resumo dos identificadores de sequências. É apresentada uma lista de sequências depois das reivindicações. 7 A presente invenção fornece um alérgeno recombinante modificado, em que, na forma de ocorrência natural, o alérgeno está associado a patologias de doenças alérgicas em sujeitos sensíveis. 0 alérgeno recombinante modificado compreende convenientemente uma sequência de aminoácido modificada a partir da sequência de aminoácido de ocorrência natural, de tal forma que o alérgeno não contenha, ou então compreenda, números reduzidos de epitopos de IgE e/ou exiba uma reduzida capacidade de ligação para o IgE, e/ou exiba uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, embora mantendo a antigenicidade das células T. 0 estado de doença alérgica é de preferência um estado de doença alérgica de tipo I. 0 alérgeno recombinante é de preferência um alérgeno de pólen de ervas.

Muito preferivelmente, o alérgeno de ervas é o alérgeno de pólen de azevém.

Numa forma de realização particularmente preferida, a presente invenção fornece um alérgeno Lol p 5 modificado a que falta, ou então compreende, um número reduzido de epitopos de IgE, e/ou exibe uma reduzida capacidade de ligação de IgE, e/ou exibe uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, mantendo no entanto a antigenicidade das células T, em que a referida variante de Lol p 5 é selecionada de uma molécula que consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, incluindo as mutações escolhidas do grupo que consiste em: a) K172N, F173L, T174A e V175A (mut 4) b) K57A, G273A, K275A, K172A, F173L, T174A e V175A (mut 6) e c) K57A, AG272, K172A, F173L, T174A e V175A (mut 8) (ver figuras 2 e 3). É aqui descrita uma composição que compreende um alérgeno modificado, tal como um alérgeno de ervas (por exemplo, um alérgeno de pólen de azevém), a que falta, ou então compreende, um número reduzido de epitopos de IgE e/ou exibe uma reduzida capacidade de ligação de IgE, e/ou exibe uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, mantendo no entanto a antigenicidade das células T. A composição compreende adicionalmente um ou mais veiculos e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. É aqui descrito um método para a profilaxia ou o tratamento de uma patologia de doença alérgica num paciente, por administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um alérgeno modificado a que falta, ou então compreende, um número reduzido de epitopos de IgE, e/ou exibe uma reduzida capacidade de ligação de IgE, e/ou exibe uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, mantendo no entanto a antigenicidade das células T.

Na Tabela 1 é fornecido um resumo dos identificadores das sequências, usados na presente descrição. 9 TABELA 1

Resumo dos identificadores de sequências SEQ ID N°: DESCRIÇÃO 1 Sequência de aminoácidos de isoforma A de Lol p 5 2 Sequência de aminoácidos de isoforma B de Lol p 5 3 Sequência de aminoácidos de isoforma A de Phl p 5 4 Sequência de aminoácidos de isoforma B de Phl p 5 5 Sequência de aminoácidos da isoforma Poa p 5 6 Sequência de aminoácidos da isoforma Poa p 5 7 Sequência de aminoácidos da variante de Lol p 5 8 Sequência de aminoácidos da variante Dl de Lol p 5 9 Sequência de aminoácidos da variante D2 de Lol p 5 10 Sequência de aminoácidos da variante D3 de Lol p 5 11 Sequência de aminoácidos da variante D4 de Lol p 5 12 Sequência de aminoácidos da variante D5 de Lol p 5 13 Sequência de nucleótidos do iniciador dianteiro usado para a clonagem de Dl 14 Sequência de nucleótidos do iniciador oposto usado para a clonagem de Dl 15 Sequência de nucleótidos do iniciador dianteiro usado para a clonagem de D2 16 Sequência de nucleótidos do iniciador oposto usado para a clonagem de D2 17 Sequência de nucleótidos do iniciador dianteiro usado para a clonagem de D3 18 Sequência de nucleótidos do iniciador oposto usado para a clonagem de D3 19 Sequência de nucleótidos do iniciador dianteiro usado para a clonagem de D4 20 Sequência de nucleótidos do iniciador oposto usado para a clonagem de D4 21 Sequência de nucleótidos do iniciador dianteiro usado para a clonagem de D5 22 Sequência de nucleótidos do iniciador oposto usado para a clonagem de D5

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 é uma representação que mostra uma comparação das sequências de aminoácidos deduzidas de alérgenos do grupo 5. Os traços indicam intervalos que foram introduzidos para dar o alinhamento máximo. Os resíduos idênticos a Lol p 5 A estão indicados por asteriscos. 10 A figura 2 é uma representação que mostra a sequência de aminoácidos de Lol p 5 A, indicando as mutações introduzidas no alérgeno para dar os mutantes Dl, D2, D3, D4 e D5. Os aminoácidos de Lol p 5 A que foram mudados estão indicados a negrito. A figura 3 é uma representação esquemática de variantes de Lol p 5 mutadas; por exemplo, mut 1 contém a mutação Dl. A figura 4 é uma representação que mostra as sequências dos iniciadores usados para criar mutações em Lol p 5 A. A figura 5 é uma representação em diagrama que mostra análises "slot blot" de Lol p 5 (não mutado) e as nove variantes mutadas (mut 1 a mut 9) de reatividades das proteínas purificadas, a um anticorpo policlonal (p) , a um anticorpo monoclonal (m) e aos soros de 7 pacientes alérgicos ao pólen de azevém. A figura 6 é uma representação em diagrama que mostra análises "imunoblot" de Lol p 5 (não mutado) e das nove variantes mutadas (mut 1 a mut 9) de reatividades das proteínas purificadas a um anticorpo policlonal (p), a um anticorpo monoclonal (m) e ao soro de um paciente alérgico ao pólen de azevém (paciente 2).

As figuras 7 A, B e C são representações gráficas de ensaios ELISA utilizando Lol p 5 purificado não mutado e quatro das proteínas mutadas (mut 3, mut 4, mut 6, mut 9), mostrando uma redução da reatividade das variantes mutadas a um monoclonal (mAb A7) e ao IgE de dois pacientes (paciente 4, paciente 27). 11

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS São aqui descritas variantes de alérgenos modificados geneticamente, essencialmente hipoalergénicos, com incapacidade, ou capacidade reduzida, para interagir com IgE, que são fornecidas para utilização em imunoterapia e imunoprofilaxia. Alguns tipos de modificações das sequências de aminoácidos são determinados para terem como resultado ou a falta, ou um número reduzido, de epítopos de IgE, reduzida atividade dos epitopos de IgE, capacidade reduzida para interagir com IgE e/ou reduzida capacidade estimuladora da produção de IgE.

Em conformidade, numa forma de realização, um alérgeno recombinante modificado, em que o referido alérgeno, na sua forma de ocorrência natural, está associado a patologias de doenças alérgicas em pacientes sensíveis, em que o referido alérgeno recombinante modificado compreende uma sequência de aminoácidos modificada a partir da sequência de aminoácidos de ocorrência natural, de tal forma que o alérgeno ou não tenha, ou compreenda um número reduzido de epítopos de IgE, e/ou exiba uma reduzida capacidade de ligação para IgE e/ou exiba uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, retendo no entanto a antigenicidade das células T. 0 termo paciente "sensível" é usado no seu sentido mais vasto para incluir um indivíduo que exiba os sintomas de uma doença alérgica e mais particularmente de uma doença alérgica de tipo I, em resposta ou associada a um alérgeno. Um "indivíduo" é de preferência um ser humano, mas também se estende a um primata não humano, animal de criação (por exemplo, ovelhas, vacas, porcos, cavalos, burros, cabras), animais de testes de laboratório (por exemplo, rato, 12 ratinho, coelho, cobaia) e a um animal de companhia (por exemplo, cão, gato). A invenção está particularmente direcionada para alérgenos do pólen de ervas.

Em conformidade, numa outra forma de realização, um alérgeno de pólen de ervas recombinante modificado, em que o referido alérgeno de pólen de ervas, na forma de ocorrência natural, está associado a patologias de doenças alérgicas de tipo I, em que o referido alérgeno de pólen de ervas recombinante modificado compreende uma sequência de aminoácidos modificada a partir da sequência de aminoácidos de ocorrência natural, de tal forma que o alérgeno ou não tem, e/ou compreende um número reduzido de epitopos de IgE, ou exibe uma reduzida capacidade de ligação para IgE e/ou exibe uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, embora retendo a antigenicidade das células T.

Numa forma de realização particularmente preferida, o alérgeno de pólen de ervas é o alérgeno de pólen de azevém Lol p 5. A referência a alérgeno de pólen de ervas inclui todos os alérgenos de azevém ou alérgenos de pólen de ervas imunologicamente relacionados, ou outros alérgenos de ervas.

Por conseguinte, a presente forma de realização contempla um alérgeno de pólen de azevém recombinante modificado, compreendendo uma sequência de aminoácidos modificada a partir da sequência de aminoácidos de ocorrência natural, de forma que o alérgeno ou não tenha, ou compreenda um número reduzido de epitopos de IgE, e/ou exiba uma reduzida capacidade de ligação para IgE, e/ou exiba uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, mantendo no entanto a antigenicidade das células T. 13 A manutenção da antigenicidade das células T inclui referência à retenção dos epítopos de células T ou uma outra capacidade diferente para interagir com células T para provocar uma resposta da célula T. A exposição será descrita, de ora em diante, em relação ao Lol p 5. Isto é feito em virtude de o Lol p 5, até ao presente, representar um alérgeno particularmente útil, em que se pode praticar a presente invenção. Os métodos da presente invenção são aplicáveis em particular ao alérgeno do pólen de azevém, Lol p 5.

No trabalho que conduziu à presente exposição os inventores exprimiram o Lol p 5 recombinante em E. coli como uma proteina não de fusão, e descobriram que a remoção do peptideo sinal N-terminal do ADNc, antes da clonagem no vetor de expressão bacteriano, tinha como resultado uma forma recombinante solúvel do alérgeno. Esta abordagem torna possivel evitar as rigorosas condições da desnaturação para o isolamento do alérgeno a partir das células bacterianas. 0 Lol p 5 recombinante foi ensaiado quanto à semelhança antigénica com o seu equivalente natural, por experiências ELISA de inibição, e os autores demonstraram que a forma recombinante inibiu totalmente a ligação a IgE de uma forma isolada da sua congénere do pólen natural. 0 facto de as isoformas recombinantes simples poderem inibir a ligação de IgE aos alérgenos naturais implicava ainda que as diferentes isoformas de alérgenos eram semelhantes. Os inventores usaram alérgenos recombinantes em estudos de inibição por "imunoblot", em que eram usados soros alérgicos reincubados com Lol p 5 recombinante, para ensaiar "imunoblots" bidimensionais da proteina solúvel de azevém. Descobriu-se, de acordo com a presente invenção, que a pré-incubação com uma forma aboliu completamente a ligação a todas as formas diferentes 14 codificadas por diferentes genes. Isto mostrou que mesmo com micro-heterogeneidades das sequências, as isoformas de alérgenos diferentes eram semelhantes antigenicamente. 0 passo seguinte no desenvolvimento da presente exposição foi determinar resíduos de aminoácidos chave das proteínas alergénicas que poderiam ser mudados, que removiam ou reduziam a interatividade de IgE, mantendo no entanto a estrutura geral e a funcionalidade dos epítopos de células T.

Os autores determinaram que os resíduos de aminoácidos nas isoformas A e B de Lol p 5 eram conservados. Concluiu-se que os referidos resíduos de aminoácidos conservados seriam importantes para a ligação de IgE, uma vez que há reatividade cruzada entre um certo número de alérgenos de ervas diferentes. Mediante a realização de mutações sucessivas destes resíduos de aminoácidos conservados, foram identificados mutantes que têm uma interatividade de IgE nula ou reduzida, mantendo no entanto a antigenicidade das células T.

Em conformidade, uma outra forma de realização compreende um alérgeno modificado de pólen de ervas do grupo 5, em que o referido alérgeno de pólen de ervas do grupo 5 compreende uma substituição, deleção e/ou adição em um ou mais resíduos de aminoácidos que é ou são conservados em pelo menos dois grupos, com reatividade imunológica cruzada, de alérgenos de pólen de 5 ervas, e em que o referido alérgeno modificado de pólen de ervas do grupo 5 ou não tem, ou compreende números reduzidos de epítopos de IgE e/ou exibe uma reduzida capacidade de ligação para IgE, e/ou exibe uma reduzida atividade estimuladora de produção de Ige, em comparação com a forma de ocorrência natural correspondente. 15

De acordo com esta forma de realização, uma sequência de referência de aminoácidos conveniente é a SEQ ID NO: 1, que é a sequência de aminoácidos de Lol p 5, isoforma A. Uma comparação das sequências de aminoácidos, tal como na figura 1, mostra os resíduos de aminoácidos conservados nas isoformas A e B de Lol p 5 e de Phl p 5 e em isoformas de Poa p 5. Os resíduos conservados na figura 1 são indicados por asteriscos. São então introduzidos rapidamente mutantes, que alteram um ou mais destes resíduos conservados.

Uma outra forma de realização revela um alérgeno modificado de pólen de ervas do grupo 5, compreendendo um corte ou substituição, ou deleção e/ou adição de aminoácidos, numa posição correspondente a um ou mais dos mutantes 1 a 9 de Lol p 5, conforme se mostra na figura 3.

Numa forma de realização particularmente preferida, um alérgeno modificado de Lol p 5 que, ou não tem, ou compreende um número reduzido de epítopos de IgE, e/ou exibe uma reduzida capacidade de ligação de IgE, e/ou exibe uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, mantendo no entanto a antigenicidade de células T, em que a referida variante de Lol p 5 é selecionada de uma molécula que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que é portadora de mutações selecionadas do grupo que consiste em mut 4, mut 6 e mut 8. As variantes de Lol p 5, identificadas por SEQ ID NOs: 8 a 12, são aqui designadas como mutantes Dl a D5, respetivamente. A exposição revela ainda uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica, ou é complementar, de uma sequência que codifica um alérgeno recombinante modificado, em que o referido alérgeno, na sua forma de ocorrência natural, está associado a patologias de 16 doenças alérgicas em pacientes sensíveis, em que o referido alérgeno recombinante modificado compreende uma sequência de aminoácidos modificada a partir da sequência de aminoácidos de ocorrência natural, de tal forma que o alérgeno ou não tem, ou compreende um número reduzido de epitopos de IgE, e/ou exibe uma reduzida capacidade de ligação para o IgE, e/ou exibe uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, mantendo no entanto a antigenicidade de células T.

Uma outra forma de realização fornece uma molécula de ácido nucleico, compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica, ou é complementar, de uma sequência que codifica um alérgeno recombinante modificado, em que o referido alérgeno, na sua forma de ocorrência natural, está associado a patologias de doenças alérgicas em pacientes sensíveis, em que o referido alérgeno recombinante modificado compreende uma sequência de aminoácidos modificada a partir da sequência de aminoácidos de ocorrência natural, de tal forma que o alérgeno ou não tem, ou compreende um número reduzido de epitopos de IgE, e/ou exibe uma reduzida capacidade de ligação para o IgE, e/ou exibe uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, mantendo no entanto a antigenicidade de células T.

Ainda uma outra forma de realização é dirigida para uma molécula de ácido nucleico, compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica, ou é complementar, de uma sequência que codifica um alérgeno de pólen de ervas recombinante modificado, em que o referido alérgeno de pólen de ervas, na forma de ocorrência natural, está associado a patologias de doenças alérgicas de tipo I em pacientes sensíveis, em que o referido alérgeno de pólen de ervas recombinante modificado compreende uma sequência de aminoácidos modificada a partir da sequência de aminoácidos 17 de ocorrência natural, de tal forma que o alérgeno ou não tem, ou compreende, um número reduzido de epítopos de IgE, e/ou exibe uma reduzida capacidade de ligação para o IgE, e/ou exibe uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, mantendo no entanto a antigenicidade de células T.

Ainda uma outra forma de realização está relacionada com uma molécula de ácido nucleico, compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica, ou é complementar, de uma sequência que codifica um alérgeno de pólen de azevém recombinante modificado, compreendendo uma sequência de aminoácidos modificada a partir da sequência de aminoácidos de ocorrência natural, de tal forma que o alérgeno ou não tem, ou compreende, um número reduzido de epítopos de IgE, e/ou exibe uma reduzida capacidade de ligação para o IgE, e/ou exibe uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, mantendo no entanto a antigenicidade de células T.

Deste modo, uma forma de realização particularmente preferida revela moléculas de ácido nucleico purificadas que codificam um alérgeno modificado de pólen de ervas e mais particularmente um alérgeno modificado de pólen de ervas do grupo 5, ou um fragmento antigénico do mesmo, ou um derivado ou homólogo do mesmo, ou o equivalente funcional de uma tal sequência de ácido nucleico, em que o alérgeno modificado de pólen de ervas ou não tem, ou compreende, um número reduzido de epítopos de IgE, e/ou exibe uma reduzida capacidade de ligação para IgE, e/ou exibe uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, mantendo no entanto a antigenicidade de células T. As sequências de ácido nucleico preferidas codificam o membro da família de alérgenos do grupo Lol p 5. Uma molécula de ácido nucleico particularmente útil codifica mutantes de Lol p 5, mut 4, mut 6 e mut 8. 18 A molécula de ácido nucleico aqui descrita pode ser uma molécula genómica ou de ADNc, ou uma correspondente molécula de ARNm, e pode ser designada como um gene. A referência a um "gene", em relação à presente invenção, significa qualquer sequência contigua de nucleótidos, cuja transcrição conduz a uma molécula de ARNm, ou cuja sequência é uma molécula de ARNm, molécula essa de ARNm que é capaz de ser traduzida numa proteina. 0 gene que codifica um membro da familia do alérgeno do pólen de ervas do grupo 5 significa a sequência de nucleótidos que codifica a proteina ou um derivado ou um homólogo da proteina que pode conter substituições, deleções e/ou adições de aminoácidos, simples ou múltiplas, em relação à correspondente molécula de ocorrência natural. Um gene Lol p 5 modificado também se refere a ADNcs complementares dos ARNms correspondentes ao comprimento total ou parcial de uma proteina Lol p 5 que tem pelo menos um corte ou substituição, adição e/ou deleção em relação às moléculas de ocorrência natural. A descrição contempla ainda moléculas de fusão. Por exemplo, para alguns aspetos da presente invenção é desejável produzir uma molécula de fusão, compreendendo um alérgeno de pólen de ervas modificado, ou um fragmento do mesmo, ou um derivado do mesmo, e uma sequência de aminoácidos de um outro peptideo ou proteina, sendo exemplos destes últimos enzimas tais como β-galactosidase, fosfatase, ureases e semelhantes. A maior parte das proteinas de fusão é formada pela expressão de um gene recombinante em que duas sequências codificantes tenham sido reunidas de tal forma que as suas áreas de leitura estejam em fase. Em alternativa, proteinas ou peptideos podem ser ligados in vitro por meios quimicos. Todas estas proteinas de fusão ou derivados genéticos hibridos de um alérgeno de pólen de ervas, ou as suas sequências codificadoras, estão abrangidas pela presente invenção. 19

Além disso, por homólogos ou derivados de uma proteina de alérgeno de pólen de ervas entende-se que estão incluídos os derivados sintéticos da mesma. As sequências de nucleótidos, como foi aqui elucidado, podem ser usadas para sintetizar quimicamente a proteina inteira, ou gerar qualquer número de fragmentos (peptideos) por síntese química, por métodos bem conhecidos (por exemplo, síntese em fase sólida). Todos estes peptideos sintetizados quimicamente estão abrangidos pela presente invenção. Por conseguinte, a apresentação estende-se a membros da família de alérgeno modificado de pólen de ervas isolado, a fragmentos do mesmo e aos seus derivados, homólogos e análogos imunológicos, produzidos por meios recombinantes ou por síntese química.

Os termos "isolado" e "purificado" são aqui usados intermutavelmente e referem-se a peptideos, proteínas, fragmentos de proteínas, e sequências de ácidos nucleicos essencialmente isentas de material celular ou meio de cultura, quando produzidos por técnicas de ADN recombinante, ou precursores químicos ou outras substâncias químicas, quando sintetizados quimicamente. 0 termo "de ocorrência natural", tal como é aqui usado, refere-se a proteínas ou fragmentos das mesmas purificados a partir do pólen de ervas ou de outras partes da planta. Também inclui referências a uma sequência de aminoácidos determinada por uma sequência de ADNc mas que está associada a estados alérgicos, por uma via semelhante a um alérgeno purificado do pólen de ervas.

Os fragmentos de moléculas de ácido nucleico, no âmbito da presente descrição, incluem os que codificam partes de alérgenos do pólen de ervas que exibem antigenicidade de células T, mas que ou não têm, ou exibem uma reduzida interação de IgE em mamíferos, preferivelmente em humanos. 20

São desejáveis fragmentos e mutantes de alérgenos de pólen de ervas modificados, produzidos por técnicas recombinantes ou sinteticamente, que não se liguem a IgE e/ou que tenham uma capacidade mínima de interação com IgE, e/ou que tenham uma capacidade mínima para estimular a produção de IgE. É desejável que esta atividade mínima de interação com IgE

não conduza à libertação de histamina. Por exemplo, é preferível que o alérgeno modificado não cause a reticulação de IgE em mastócitos nem em basófilos. A atividade mínima de interação com IgE refere-se à atividade de interação com IgE que é menor do que a extensão de interação com IgE por uma proteína de alérgeno de pólen de ervas "de ocorrência natural", produzida por via recombinante ou sintética, ou por alérgeno de pólen de ervas nativo totalmente purificado. A interação com IgE também pode ser medida como atividade estimuladora da produção de IgE. Os fragmentos preferidos também incluem fragmentos antigénicos que, quando administrados a um indivíduo sensível ao pólen de ervas, ou a um indivíduo alérgico a um alérgeno que manifesta reação cruzada com o alérgeno do pólen de ervas, são capazes de modificar a resposta alérgica ao alérgeno do pólen de ervas do indivíduo.

São particularmente desejáveis os fragmentos antigénicos aqui descritos que tenham atividade estimuladora das células T, isto é, antigenicidade de células T, e deste modo compreendem pelo menos um epítopo de célula T. Crê-se que os epítopos de células T estão envolvidos na iniciação e na perpetuação da resposta imune a uma proteína do alérgeno que é responsável pelos sintomas clínicos da alergia. Pensa-se que estes epítopos de células T desencadeiam eventos prematuros ao nível da célula auxiliar T por ligação a uma molécula HLA apropriada sobre a 21 superfície de uma célula que apresente o antigene e estimulando a subpopulação de células T relevante. Estes eventos conduzem à proliferação de células T, secreção de linfoquina, reações inflamatórias locais, recrutamento de células imunes adicionais para o local e ativação da cascata de células B, conduzindo à produção de anticorpos. Um isotipo destes anticorpos, o IgE, é fundamentalmente importante para o desenvolvimento de sintomas alérgicos, e a sua produção é influenciada prematuramente na cascata de eventos, ao nível da célula auxiliar T, pela natureza das linfoquinas segregadas. Um epítopo de célula T é o elemento básico, ou a mais pequena unidade de reconhecimento por um recetor de célula T, compreendendo o epítopo aminoácidos essenciais ao reconhecimento do recetor. As sequências de aminoácidos que mimetizam as dos epítopos das células T e que modificam a resposta alérgica a proteínas de alérgenos estão abrangidas no âmbito da presente exposição.

A exposição dos pacientes a proteínas de alérgenos modificados e purificados aqui descritos, ou aos fragmentos antigénicos dos mesmos que compreendem pelo menos um epítopo de célula T e são derivados de proteínas de alérgenos, podem tolerar ou anenergizar subpopulações apropriadas de células T, de tal forma que estas se tornem insensíveis à proteína de alérgeno e não participem na estimulação de uma resposta imune após uma tal exposição. Além disso, a administração da proteína de alérgeno da invenção ou de um fragmento antigénico da presente invenção, que compreenda pelo menos um epítopo de célula T pode modificar o perfil da secreção de linfoquina, em comparação com a exposição à proteína de alérgeno de ocorrência natural, ou a uma parte do mesmo (por exemplo, o resultado é uma diminuição de IL-4 e/ou um aumento de IL-2). Além disso, a exposição ao referido fragmento antigénico ou proteína de alérgeno pode influenciar 22 subpopulações de células T que normalmente participam na resposta ao alérgeno, de tal forma que estas células T são arrastadas para fora do local ou locais da exposição normal ao alérgeno (por exemplo, a mucosa nasal, pele e pulmão), para o local ou locais da administração terapêutica do fragmento ou proteina de alérgeno. Esta redistribuição de subpopulações de células T pode melhorar ou reduzir a capacidade de um sistema imune individual para estimular a resposta imune habitual no local da normal exposição ao alérgeno, tendo como resultado uma diminuição dos sintomas alérgicos. São aqui descritos vetores de expressão e células hospedeiras transformados de modo a exprimir as sequências de ácidos nucleicos da invenção. Os vetores de expressão da exposição compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica um alérgeno modificado de pólen de ervas, ou um fragmento antigénico do mesmo, ou um derivado ou homólogo do mesmo, ou o equivalente funcional da referida sequência de ácidos nucleicos. As sequências de ácidos nucleicos podem ser expressas em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas. As células hospedeiras apropriadas incluem células bacterianas, tais como E. coli, células de insetos, leveduras, ou células de mamíferos, tais como as células do ovário do hamster chinês (CHO). Os vetores de expressão, promotores, estimuladores, e outros elementos de controle de expressão apropriados, podem ser encontrados em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989. Os vetores apropriados para a expressão em leveduras incluem YepSecl (Baldari et al., EMBO J. 6: 229-234, 1987); pMF (Kurjan e Herskowtiz, Cell 30: 933-943, 1982); e JRY88 (Schultz et al., Gene 54: 113-123, 1987). 23

As células hospedeiras podem ser transformadas para exprimir as sequências de ácidos nucleicos aqui descritas, utilizando-se técnicas convencionais, tais como coprecipitação com fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, ou eletroporação. Os métodos apropriados para a transformação das células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook et ai., 1989, supra, e outros manuais de laboratório. As sequências de ácidos nucleicos também podem ser sintetizadas utilizando-se técnicas normalizadas.

Em conformidade, uma outra forma de realização revela um processo para a produção de um alérgeno de ervas modificado recombinante, ou de um seu fragmento, ou de um derivado ou homólogo do mesmo, ou de substâncias imunológicas aparentadas, compreendendo a cultura de um organismo que contém uma molécula de ADN recombinante replicável, compreendendo a referida molécula um promotor capaz de expressão no referido organismo, um gene que codifica um alérgeno modificado de pólen de ervas, ou um membro da familia do mesmo, um fragmento ou homólogo ou derivado do mesmo, ou uma substância imunologicamente aparentada do mesmo, localizada a jusante do referido promotor e transcrita do mesmo, um marcador selecionável e um veículo de ADN contendo uma origem de replicação procariótica ou eucariótica, em condições e durante um tempo suficientes para a referida molécula de ADN recombinante ser mantida estavelmente e dirigir a síntese do alérgeno modificado de pólen de ervas, ou do seu fragmento ou derivado, ou do homólogo ou da substância imunologicamente reativa do mesmo, e em seguida eventualmente isolando-se o mesmo.

Os alérgenos de pólen de ervas e os seus fragmentos (peptídeos) podem ser purificados a partir do meio de cultura das células, das células hospedeiras, ou ambos, 24 utilizando as técnicas conhecidas na técnica para a purificação de peptideos e proteínas, incluindo a cromatografia de permuta de iões, a cromatografia de filtração por gel, ultrafiltração, eletroforese, e a imunopurificação com anticorpos específicos para o alérgeno modificado de pólen de ervas. Os termos "isolado" e "purificado" são aqui usados intermutavelmente e referem-se a peptideos, proteínas, fragmentos de proteínas e sequências de ácidos nucleicos, essencialmente isentos de material celular ou de meio de cultura, quando produzidos por técnicas de ADN recombinante, ou precursores químicos ou outras substâncias químicas, quando sintetizados quimicamente.

Uma outra forma de realização fornece preparações de proteínas compreendendo as variantes de Lol p 5 portadoras das mutações mut 4, mut 6 ou mut 8, ou os seus equivalentes, homólogos ou derivados funcional ou imunologicamente equivalentes.

Deste modo, são aqui descritos alérgenos de pólen de ervas modificados, ou os seus derivados, que, quando administrados a um indivíduo sensível ao pólen de ervas, reduzem a resposta alérgica do indivíduo ao pólen de ervas, tal como o pólen de azevém ou o pólen de ervas imunologicamente relacionadas. Os alérgenos de pólen de ervas modificados preferidos incluem a proteína Lol p 5 modificada ou um derivado homólogo da mesma. Outros alérgenos preferidos são Phl p 5 e Poa p 5.

Para além da indução de uma substituição, adição e/ou deleção ou corte de amino, um outro exemplo de uma modificação de proteínas ou peptideos é a substituição de resíduos de cisterna, de preferência por alanina, serina, treonina, leucina ou ácido glutâmico, para minimizar a 25 dimerizaçao através de ligações de bissulfureto. Um outro exemplo de modificação das proteínas e peptídeos da invenção é por modificação química de cadeias laterais de aminoácidos ou a ciclização do peptídeo. A fim de melhorar a estabilidade e/ou a reatividade, as proteínas ou os peptídeos aqui descritos também podem ser modificados para incorporarem um ou mais polimorfismos na sequência de aminoácidos da proteína de alérgeno resultante de variação alélica natural. Além disso, os D-aminoácidos, os aminoácidos não naturais ou os análogos não aminoácidos podem ser substituídos ou adicionados, para se produzir uma proteína ou peptídeo modificados, dentro do âmbito desta exposição.

Uma outra forma de realização está relacionada com vetores recombinantes, compreendendo sequências de ADN que codificam proteínas que manifestam atividade alergénica modificada de pólen de uma espécie de herbácea. Mais particularmente, a espécie de herbácea pertence à família Poaceae (Gramineae), e ainda mais particularmente ao género Lolium. Ainda mais particularmente, a proteína alergénica é caraterizada por ser imunologicamente reativa em reação cruzada com o anticorpo da proteína Lol plb de pólen de Lolium perenne, nomeadamente:

Ervas pooide (festucoide). Grupo 1: Triticanea: Bromus inermis, giesta; Agropyron repens, grama inglesa; A. cristatum; Secale cereale centeio, Triticum aestivum, trigo. Grupo 2: poáceas: Dactylis glomerata, erva de azevém perene; L. multiflorum, azevém italiana; Poa pratensis, poa de Kentucky; P. compressa, cabelo-de-cão; Avena sativa, aveia; Holcus lanatus, erva veludo ou erva-lanar; Anthoxanthum odoratum; grama odorífera, 26

Arrhenatherum elatius, aveia dourada; Agrostis alba, agróstide branca; Pheleum pratense, timóteo; Phalaris arundinácea, caniço-malhado. Ervas Panicoid, Paspalum notatum, erva da Baía, ervas Andropogonoid: Sorgum halepensis, sorgo bravo.

Pode ser construída uma variedade de vetores de expressão para a produção de um alérgeno modificado de pólen de ervas, ou de um fragmento ou derivado do mesmo. A exposição estende-se a anticorpos monoclonais e policlonais para alérgenos de pólen de ervas modificados, ou os seus fragmentos, derivados ou homólogos.

Os anticorpos monoclonais são úteis para selecionar bibliotecas de ADNc, ou para proteínas purificadas produzidas por via recombinante, ou mesmo em terapia, para reduzir a atividade de uma proteína introduzida. Na discussão que se segue, as referências a proteínas de alérgenos de pólen de ervas incluem os seus derivados, homólogos e substâncias imunologicamente aparentadas, e os derivados químicos sintéticos dos mesmos. A discussão que se segue também inclui anticorpos específicos para Lol p 5 modificado purificado e os seus fragmentos, derivados e homólogos. Estes anticorpos são considerados como sendo úteis no desenvolvimento de ensaios de deteção (imunoensaios) para alérgenos de pólen de ervas modificados, em especial durante a monitorização de um regime terapêutico ou de diagnóstico, e na purificação de membros da família do pólen de ervas produzidos por via recombinante ou sintética, e em particular alérgenos do pólen de ervas do grupo 5. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. Além disso, está previsto incluir quaisquer segundos anticorpos (monoclonais ou 27 policlonais) dirigidos aos primeiros anticorpos discutidos acima. A apresentação contempla ainda a utilização destes primeiros ou segundos anticorpos em ensaios de deteção e, por exemplo, na monitorização do efeito de um diagnóstico ou de uma composição farmacêutica administrada. Além disso, enquadra-se no seu âmbito incluir anticorpos para quaisquer moléculas complexadas com uma proteina de alérgeno de pólen de ervas modificado. Por conseguinte, um anticorpo para uma proteina de alérgeno de pólen de ervas engloba anticorpos para esse proteina de alérgeno, ou partes antigénicas do mesmo, e para quaisquer moléculas associadas (por exemplo, regiões lipídicas, moléculas transportadoras, proteínas de fusão, e semelhantes).

Os membros da familia do pólen de ervas, ou os seus fragmentos, aqui considerados, são purificados e em seguida utilizados na produção de anticorpos. Podem ser obtidos tanto anticorpos policlonais como monoclonais por imunização com membros da familia da proteína do pólen de ervas, modificados por via recombinante ou sintética, e qualquer dos tipos pode ser utilizado em imunoensaios. Os métodos para a obtenção dos dois tipos de soros são bem conhecidos na técnica. Os soros policlonais têm menor preferência, mas são preparados de forma relativamente mais fácil, injetando-se um animal de laboratório apropriado com uma quantidade eficaz de um alérgeno modificado de pólen de ervas purificado, ou partes antigénicas do mesmo, recolhendo-se o soro do animal e isolando-se soros específicos por qualquer das técnicas imunoabsorventes conhecidas. Embora os anticorpos produzidos por este método sejam utilizáveis virtualmente em qualquer tipo de imunoensaio, são geralmente menos favorecidos em virtude da potencial heterogeneidade do produto. 28 É particularmente preferido o uso de anticorpos monoclonais num imunoensaio, em virtude da capacidade de se produzirem os mesmos em grandes quantidades e da homogeneidade do produto. A preparação de linhas de células de hibridoma para a produção de anticorpos monoclonais, resultante da fusão de uma linha de células imortal e linfócitos sensibilizados contra uma preparação imunogénica, pode ser realizada por técnicas que são bem conhecidas dos peritos na técnica (ver, por exemplo, Kohler e Milstein, Nature 256: 495-499, 1975; Kohler e Milsten, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976).

Ao invés da preparação dos soros policlonais, a escolha do animal está dependente da possibilidade de obtenção de linhas imortais apropriadas capazes de se fundirem com os linfócitos. Os ratinhos e ratos têm sido os animais de escolha na tecnologia de hibridomas e são usados com preferência. Os humanos também podem ser utilizados como fontes para linfócitos sensibilizados se estiverem disponíveis linhas de células humanas (ou não humanas) imortalizadas apropriadas. Para os fins da presente descrição, o animal escolhido pode ser injetado com doses de cerca de 0,1 mg até cerca de 20 mg de alérgeno modificado de pólen de ervas, purificado, ou partes do mesmo. Em geral, o material de injeção é emulsionado em adjuvante completo de Freund. Podem ser também necessárias injeções de reforço. A deteção da produção de anticorpos pode ser realizada por ensaio dos antissoros com antigénios convenientemente marcados. Os linfócitos podem ser obtidos removendo-se, de forma esterilizada, o baço ou gânglios linfáticos de animais sensibilizados e realizando-se a fusão. Em alternativa, os linfócitos podem ser estimulados ou imunizados in vitro. 29 A presença de alérgenos de pólen de ervas modificados, aqui considerada, ou de anticorpos específicos para os mesmos, no soro de um paciente, ou no tecido ou extrato de tecido de uma planta ou de um mamifero, pode ser detetada utilizando-se anticorpos preparados como foi descrito acima, ou monoclonais ou policlonais, virtualmente em qualquer tipo de imunoensaio. Foi previamente descrita uma vasta gama de técnicas de imunoensaios (patente U. S. n° 4,015,043, 4.424,279 e 4,018,653). Estas incluem ensaios tanto de um sitio, como de dois sitios, ou ensaios "sandwich", de tipos não competitivos, assim como nos tradicionais ensaios de ligação competitivos. Os ensaios em sandwich estão entre os ensaios mais úteis e comummente usados e são preferidos para utilização nas formas de realização aqui descritas. Existe um certo número de variações da técnica de ensaio em sandwich, e todas elas são consideradas como estando abrangidas pela exposição. Em resumo, num ensaio para diante tipico, um anticorpo não marcado é imobilizado num substrato sólido e a amostra a ser ensaiada é posta em contato com a molécula ligada. Após um periodo de incubação apropriado, durante um periodo de tempo suficiente para permitir a formação de um complexo anticorpo-antigene secundário, é em seguida adicionado e incubado um segundo anticorpo, marcado com uma molécula "repórter" capaz de produzir um sinal detetável, permitindo tempo suficiente para a formação de um complexo terciário de anticorpo-antigene-anticorpo marcado (por exemplo, anticorpo-proteina de alérgeno modificado de pólen de ervas-anticorpo). Qualquer material não reagido é removido por lavagem, e a presença do antigene é determinada por observação de um sinal produzido pela molécula repórter. Os resultados podem ser ou qualitativos, por simples observação do sinal visivel, ou podem ser quantificados por comparação com uma amostra de controle que contenha quantidades conhecidas de hapteno. As variações no ensaio 30 para diante incluem um ensaio simultâneo, em que tanto a amostra como o anticorpo marcado são adicionados simultaneamente ao anticorpo ligado, ou um ensaio reverso, em que o anticorpo marcado e a amostra a ser ensaiada são primeiro combinados, incubados, e em seguida adicionados simultaneamente ao anticorpo ligado. Estas técnicas são bem conhecidas dos peritos na técnica, incluindo quaisquer pequenas variações, como será imediatamente evidente.

Embora a discussão a seguir esteja relacionada com a deteção do alérgeno do pólen de erva modificado, é igualmente aplicável à deteção de anticorpos para o mesmo e é entendida como sendo uma descrição suficiente da mesma.

No ensaio em sandwich para diante, tipico, um primeiro anticorpo, possuindo especificidade para o alérgeno modificado de pólen de ervas, ou partes antigénicas do mesmo, contempladas na presente invenção, é ligado a uma superfície sólida, ou por covalência, ou passivamente. A superfície sólida é tipicamente vidro ou um polímero, sendo os polímeros mais comummente usados a celulose, poliacrilamida, nylon, poliestireno, policloreto de vinilo ou polipropileno. Os suportes sólidos podem ter a forma de tubos, contas, discos ou microplacas, ou qualquer outra superfície apropriada para a realização de um imunoensaio. Os processos de ligação são bem conhecidos na técnica e geralmente consistem em reticulação, ligação covalente ou absorção física, o complexo polímero-anticorpo é lavado em preparação para a amostra de ensaio. É então adicionada ao complexo em fase sólida uma parte alíquota da amostra a ser ensaiada, e é incubada a temperaturas desde aproximadamente a temperatura ambiente até cerca de 37°C durante um período de tempo suficiente para permitir a ligação de qualquer subunidade presente no anticorpo. O período de incubação varia, mas geralmente está situado num intervalo de cerca 31 de 2 a 40 minutos, ou durante a noite se for mais conveniente. A seguir ao período de incubação, a fase sólida da subunidade do anticorpo é lavada e seca e incubada com um segundo anticorpo especifico para uma parte do hapteno. 0 segundo anticorpo é ligado a uma molécula repórter, que é usada para indicar a ligação do segundo anticorpo ao hapteno.

Entende-se por "molécula repórter", como é usado na presente especificação, uma molécula que, pela sua natureza quimica, fornece um sinal identificável analiticamente, que permite a deteção do anticorpo ligado ao antigénio. A deteção pode ser ou qualitativa, ou quantitativa. As moléculas repórter mais comummente usadas neste tipo de ensaio são enzimas, fluoróforos ou moléculas que contêm radionuclideos (isto é, radioisótopos). No caso de um imunoensaio com enzimas, é conjugado um enzima ao segundo anticorpo, geralmente por meio de glutaraldeido ou periodato. No entanto, e como será facilmente reconhecido, existe uma ampla variedade de diferentes técnicas de conjugação, que estão facilmente à disposição dos peritos na técnica. Os enzimas comummente usados incluem peroxidase de rábano, glucose oxidase, β-galactosidase e fosfatase alcalina, entre outros. Os substratos a serem usados com os enzimas específicos são escolhidos geralmente para a produção, após a hidrólise com o correspondente enzima, de uma mudança de cor detectável. Por exemplo, o fosfato de p-nitrofenilo é adequado para utilização com conjugados de fosfatase alcalina, para conjugados de peroxidase são comummente usados 1,2-fenilenodiamina, ácido 5-amino-salicílico ou toluidina. É também possível empregar substratos fluorogénicos, que conduzem a um produto fluorescente, em vez dos substratos cromogénicos mencionados acima. Em todos os casos, o anticorpo marcado com o enzima é adicionado ao primeiro complexo anticorpo 32 hapteno, deixam-se ligar, e em seguida o excesso de reagente é removidos por lavagem. É depois adicionada ao complexo terciário de anticorpo-antigénio-anticorpo uma solução que contém o substrato apropriado. 0 substrato vai reagir com o enzima ligado ao segundo anticorpo, originando um sinal visual qualitativo, que pode ser quantificado posteriormente, geralmente por espetrofotometria, dando uma indicação da quantidade de hapteno que estava presente na amostra. A "molécula repórter" também se estende à utilização na aglutinação de células ou na inibição de aglutinação, tal como com glóbulos vermelhos ou esférulas de látex, e semelhantes.

Em alternativa, os compostos fluorescentes, tais como a fluoresceina e a rodamina, podem ser acoplados quimicamente a anticorpos sem alterar a sua capacidade de ligação. Quando ativados por iluminação com luz de um comprimento de onda particular, o anticorpo marcado com o fluorcromo absorve a energia luminosa, induzindo um estado de excitabilidade na molécula, seguido pela emissão de luz com uma cor caraterística, detetável visualmente com um microscópio ótico. Tal como no EIA, o anticorpo marcado de modo fluorescente é ligado ao primeiro complexo anticorpo-hapteno. Depois da eliminação por lavagem do reagente não ligado, o complexo terciário remanescente é exposto em seguida a luz de comprimento de onda apropriado, e a fluoresceina observada indica a presença do hapteno com interesse. As técnicas de imunofluorescência e EIA estão ambas muito bem implantadas na técnica e são particularmente preferidas para o presente método. No entanto, também podem ser empregues outras moléculas repórter, tais como radioisótopos, moléculas quimioluminescentes ou bioluminescentes. É prontamente evidente para os peritos na técnica a forma de alterar o processo, de modo a adaptá-lo aos fins pretendidos. É 33 também evidente que o exposto pode ser também usado para detectar direta ou indiretamente (isto é, através de anticorpos) a proteína de alérgeno de pólen de ervas da presente invenção.

Em conformidade, uma forma de realização aqui descrita revela um método para a deteção de um alérgeno de pólen modificado, ou de um seu derivado ou homólogo, ou de uma proteína alergénica, imunologicamente reativa com o referido alérgeno modificado de pólen de ervas, ou um seu derivado ou homólogo, presente no soro, extrato de tecido, extrato de planta ou outro fluido ou composição biológica, compreendendo os passos de pôr em contato o referido fluido ou composição, a serem ensaiados, com um anticorpo contra a referida proteína de alérgeno de pólen de ervas modificado durante um certo tempo e em condições suficientes para se formar um complexo proteína alergénica modificada-anticorpo, e submeter o referido complexo a um meio de deteção. Para os métodos de purificação, também pode ser eficaz um anticorpo contra um alérgeno nativo, a fim de purificar um alérgeno modificado, e a referida forma de realização está aqui compreendida. A apresentação está também direcionada para um conjunto ("kit") para o ensaio rápido e conveniente para anticorpos contra os alérgenos de pólen de ervas modificados, ou os seus derivados, homólogos ou substâncias imunologicamente afins, em fluidos corporais de mamíferos, por exemplo, soro, extratos de tecidos, fluidos de tecidos), sobrenadantes de culturas de células in vitro, e lisados de células. 0 conjunto está compartimentado de modo a receber um primeiro recipiente adaptado para conter um componente antigénico do mesmo, e um segundo recipiente adaptado para conter um anticorpo contra o alérgeno de pólen de ervas, estando o referido anticorpo marcado com uma molécula 34 repórter capaz de originar um sinal detetável. Se a molécula repórter for um enzima, existe então um terceiro recipiente, adaptado para conter um substrato para o referido enzima. Numa utilização exemplificada do conjunto em questão, uma amostra a ser ensaiada é posta em contato com o conteúdo do primeiro recipiente, durante um certo tempo, e em condições para que um anticorpo, se estiver presente na amostra, se ligue ao alérgeno de pólen de ervas no referido primeiro recipiente.

Em virtude da presença de alérgenos no meio ambiente, a febre dos fenos e a asma sazonal continuam a ter morbidez significativa e impacto socioeconómico nas comunidades do Ocidente, apesar dos avanços feitos na farmacologia e na imunologia. Embora o espetro de medicamentos disponível, incluindo anti-histamínicos e esteroides, tenha tido como resultado a melhoria do tratamento das doenças alérgicas, têm efeitos colaterais infelizes associados a um longo prazo de utilização. Em consequência destes problemas, tem-se observado um interesse crescente na imunoterapia das doenças alérgicas. A imunoterapia envolve a injeção de potentes extratos de alérgenos para dessensibilizar os pacientes contra as reações alérgicas. Infelizmente, as preparações de pólen usadas como alérgenos são polivalentes e de fraca qualidade. Por consequência, as concentrações usadas são frequentemente altas, a fim de se induzirem respostas aos IgG, mas podem ser letais, em consequência do desencadeamento de reações sistémicas, incluindo a anafilaxia. 0 produto do gene clonado ou peptídeos sintéticos baseados na sequência dos alérgenos fornece um meio mais seguro para a terapia, uma vez que pode ser controlado qualitativamente, caracterizado e normalizado.

Em conformidade, é aqui descrito um método para dessensibilizar um mamífero (por exemplo, humano) alérgico 35 ao pólen de ervas, que compreende a administração ao referido mamifero de uma quantidade, eficaz para a dessensibilização, de um alérgeno modificado de pólen de ervas, que, ou não tem, ou compreende um número reduzido de epitopos de IgE, e/ou exibe uma reduzida capacidade de ligação de IgE, e/ou exibe uma reduzida atividade estimuladora da produção de IgE, ou um seu fragmento ou derivado, homólogo, ou substância imunologicamente afim do mesmo, durante um periodo de tempo e em condições suficientes para efetuar a dessensibilização do mamifero (por exemplo, humano) ao pólen de ervas. É aqui descrito um método para o tratamento da sensibilidade ao pólen de azevém, ou ao pólen de uma planta imunologicamente aparentada com a azevém, num mamifero (por exemplo, humano) sensivel ao referido pólen, compreendendo a administração ao mamifero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição terapêutica aqui descrita. A exposição revela ainda um método para o tratamento da sensibilidade aos alérgenos do pólen da azevém, ou a um alérgeno que manifesta uma reação cruzada imunologicamente com os alérgenos do pólen de azevém, compreendendo a administração a um mamifero de uma quantidade terapeuticamente eficaz da referida preparação de proteina aqui descrita.

Através da utilização dos peptídeos e proteínas aqui descritos, podem ser preparadas e administradas para fins terapêuticos (por exemplo, para modificar a resposta alérgica ao pólen da referida planta, de um indivíduo sensível a L. perenne), preparações de composição consistente e bem definida. A administração dos referidos peptídeos ou proteínas pode, por exemplo, modificar a resposta de IgE ao alérgeno do pólen de ervas. Os peptídeos modificados também podem ser usados para se estudar o 36 mecanismo da imunoterapia da alergia a L. perenne e criar derivados modificados ou análogos úteis em imunoterapia. A apresentação é direcionada, por conseguinte, à utilização de um alérgeno modificado na fabricação de um medicamento para o tratamento ou a profilaxia de indivíduos sensíveis a alérgenos.

Em conformidade, é aqui descrita uma composição farmacêutica, compreendendo uma quantidade, eficaz para a dessensibilização, ou terapeuticamente, de um alérgeno modificado de pólen de ervas e, em particular, de alérgenos de pólen de ervas do grupo 5, ou os seus derivados, homólogos, ou substâncias imunologicamente aparentadas dos mesmos, e uma ou mais substâncias veiculares e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Os ingredientes ativos de uma composição farmacêutica, compreendendo o agente profilático de alérgeno modificado de pólen de ervas, são previstos para exibirem uma excelente ação terapêutica ou atividade, por exemplo, na dessensibilização de humanos alérgicos ao pólen de ervas, quando administrados numa quantidade que depende de cada caso particular. Podem ser administrados, por exemplo, desde cerca de 0,5 Fg até cerca de 20 mg por kg de peso corporal e por dia. O regime de dosagem pode ser ajustado para proporcionar a resposta terapeuticamente ótima. Por exemplo, podem ser ministradas diariamente várias doses divididas, ou a dose pode ser reduzida proporcionalmente, como é indicado pelas exigências da situação terapêutica. O composto ativo pode ser administrado de uma forma conveniente, tal como pelas vias oral, intravenosa (quando é solúvel em água), intramuscular, subcutânea, intranasal, intradérmica, ou em supositórios ou em implantes (por exemplo, utilizando moléculas de libertação lenta). Consoante a via de administração, os ingredientes ativos que compõem a 37 composição farmacêutica da invenção podem ter que ser revestidos com um material para proteger os referidos ingredientes da ação de enzimas, ácidos e outras condições naturais que podem tornar inativos os referidos ingredientes. Por exemplo, o alérgeno modificado de pólen de ervas pode ser administrado num adjuvante, coadministrado com inibidores de enzimas ou em lipossomas. Adjuvante aqui é usado no seu sentido mais amplo e inclui qualquer composto estimulante imune, tal como uma interferona. Os adjuvantes aqui considerados incluem resorcinóis, meios tensioativos não iónicos, tais como o éter polioxietileno-oleilico e éter polietileno-n-hexadecílico. Os inibidores de enzimas incluem tripsina pancreática. Os lipossomas incluem emulsões CF água-em óleo-em água, assim como lipossomas convencionais. Para os fins de induzir a anergia das células T, a composição farmacêutica é de preferência administrada numa forma não imunogénica (por exemplo, não contém adjuvantes).

Os compostos ativos também podem ser administrados por via parentérica ou intraperitoneal. As dispersões podem ser também preparadas em glicerina, polietilenoglicóis liquidos e misturas dos mesmos, e em óleos. Em condições correntes de armazenagem e utilização, estas preparações contêm um conservante, para impedir o crescimento de microrganismos.

As formas farmacêuticas apropriadas para uso injetável incluem soluções aquosas esterilizadas (quando são solúveis em água) ou dispersões ou pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis. Em todos os casos, a forma deve ser esterilizada e deve ser fluida, na medida em que haja facilidade de ser injetada. Tem que ser estável nas condições de fabricação e armazenagem, e tem que ser preservada contra a ação contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos. A substância de suporte pode 38 ser um solvente ou um meio de dispersão, contendo, por exemplo, água, etanol, polióis (por exemplo glicerina, propilenoglicol, e polietilenoglicol liquido, e semelhantes), misturas apropriadas dos mesmos, e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, por utilização de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partículas requerido, no caso de uma dispersão, e através do uso de meios tensioativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser realizada por meio de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e semelhantes. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser levada a cabo mediante a utilização nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

As soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorporação dos compostos ativos na quantidade necessária do solvente apropriado, com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por esterilização por filtração. Em geral, as dispersões são preparadas por incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados numa substância veicular estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários entre os que foram enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação das soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são a secagem em vácuo e a técnica de liofilização, que produz um pó do ingrediente ativo e de mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução dos mesmos previamente esterilizada por filtração. 39

Quando um alérgeno modificado de pólen de ervas, ou um fragmento do mesmo, é convenientemente protegido, como foi descrito acima, o composto ativo pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou com uma substância veicular edivel assimilável, ou pode ser embalado em cápsulas de gelatina de capa dura ou mole, ou pode ser prensada na forma de comprimidos, ou pode ser incorporada diretamente com os alimentos da dieta. Para a administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de comprimidos ingeriveis, comprimidos bocais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas, e semelhantes. As referidas composições e preparações deverão conter pelo menos 1% em peso do composto ativo. A percentagem das composições e preparações pode, como é evidente, ser ajustada e pode estar situada convenientemente entre cerca de 5 e 8 0% do peso da unidade. A quantidade de composto ativo nestas composições terapeuticamente úteis é tal que seja obtida uma dosagem conveniente. As composições ou preparações preferidas aqui descritas são preparadas de modo que uma forma de unidade de dosagem oral contenha entre cerca de 10 Fg e 2000 mg do composto ativo.

Os comprimidos, pastilhas, pílulas, cápsulas e semelhantes também podem conter os ingredientes enumerados a seguir: um aglutinante, tal como goma de tragacanto, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes, tais como fosfato dicálcico; um agente desintegrante, tal como amido de milho, fécula da batata, ácido algínico e semelhantes; um lubrificante, tal como estearato de magnésio; e pode ser adicionado um agente edulcorante, tal como sacarose, lactose ou sacarina, ou um agente aromatizante, tal como óleo de hortelã-pimenta, óleo de gaultéria, ou aroma de cereja. Quando a forma de unidade de dosagem é uma cápsula, além dos materiais do tipo acima indicado esta pode conter 40 uma substância veicular liquida. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos, ou para de qualquer outro modo modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, os comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com goma-laca, açúcar ou ambos. Um xarope ou elixir pode conter o composto ativo, sacarose como agente edulcorante, metil- e propilparabenos como conservantes, um corante, e um agente aromatizante, tal como aromas de cereja ou laranja. Como é evidente, qualquer material usado na preparação de qualquer forma de unidade de dosagem deverá ser farmaceuticamente puro e essencialmente não tóxico nas quantidades empregues. Além disso, o composto ativo pode ser incorporado em composições e formulações de libertação controlada.

Tal como é aqui usada, a expressão "substância veicular e/ou diluente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardantes, e semelhantes. 0 uso destes meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, está contemplado o seu uso nas composições terapêuticas. Podem ser também incorporados nas composições ingredientes ativos suplementares. A presente invenção é descrita a seguir através dos seguintes exemplos não limitativos. 41 EXEMPLO 1

Geração de proteínas mutantes de Lol p 5

Para se criarem variantes hipoalergénicas de alérgenos reativos a não IgE, tornou-se necessário determinar quais são os residuos chave das proteinas que podem ser selecionados e que possam ser alterados, embora mantendo a estrutura geral e os epitopos das células T intactos. Uma vez que a mais alta frequência de ligação a IgE é observada em fragmentos de peptideos que se estendem em metade do terminal C de Lol p 5, os inventores introduziram mutações predominantemente no terminal C do alérgeno. Para se identificarem posições de aminoácidos em Lol p 5 com probabilidade de ter influência sobre a interatividade de IgE da proteina, as sequências de proteinas das isoformas A e B de Lol p 5 foram comparadas com alérgenos do grupo 5 de outras ervas (figura 1). Foi empregue mutagénese dirigida ao sitio para substituir residuos que são altamente conservados entre alérgenos do grupo 5 (Figura 2) . Foram geradas proteinas mutantes alteradas em um ou três domínios (Figura 3) .

Os Lol p 5 não mutados e as variantes mutadas de Lol p 5 foram expressas em formas solúveis de E. coli, usando-se o sistema de vetor de expressão pQE (QIAGEN). A expressão bacteriana (ver adiante) de proteínas, usando-se este vetor, introduz uma marca de poli-histidina no terminal C de moléculas que são úteis para a purificação de proteínas recombinantes por cromatografia de afinidade em um passo, em quelatos metálicos. 0 controle não mutagenisado e as proteínas mutadas foram ensaiadas em seguida quanto à reatividade de IgE, assim como quanto à reatividade com o anticorpo monoclonal A7 anti-Lol p 5 (Mab A7) e com 42 antissoro policlonal anti-Lol p 5 em ensaios de "slot blots" (Figura 5) , "Western blots" (Figura 6) e ELISA (Figura 7) . Os resultados mostraram uma substancial redução na atividade de ligação de IgE no caso de várias das proteínas mutadas (por exemplo, mut 4, mut 6, mut 9) . As moléculas alergénicas assim alteradas são potencialmente úteis para uma imunoterapia mais segura e mais eficaz para doenças alérgicas de tipo I e a abordagem descrita pode ser aplicada mais genericamente para produzir variantes de alérgenos não reativas ao IgE. EXEMPLO 2

Expressão e purificação de proteínas recombinantes Lol p 5 e mutantes

As sequências codificadoras de Lol p 5 e das proteínas mutantes foram introduzidas, em estrutura, no vetor de expressão pQE31 (QIAGEN). 0 vetor permite a expressão de proteínas recombinantes com uma marca de 6 resíduos de histidina no terminal N. A expressão e a recolha das proteínas foi realizada como é esquematizado no manual expressionista QIA. As proteínas marcadas com histidina foram purificadas utilizando-se resina de afinidade para metais TALON (Clontech), seguindo-se o processo para purificação em lote/coluna de corrente por gravidade, como é descrito no Manual do utilizador de resina de afinidade para metal TALON (Clontech). 43 EXEMPLO 3 SDS-page e Western blotting

Para SDS-PAGE 2,3 Fg de Lol p 5 e de cada uma das proteínas mutantes foram fervidos durante 5 minutos com 10 x o tampão de amostra de proteína. As amostras foram carregadas sobre um mini-gel de acilamida a 15% p/v, a 200 V, durante 40 minutos, num tampão de glicina 0,2 M, Tris 0,025 M, 0,1% p/v SDS.

Para a coloração, os geles foram agitados em Coomassie Brilliant Blue R250 a 0,1 p/v durante pelo menos uma hora. Os geles foram descorados em metanol a 20% v/v, ácido acético glacial a 7% v/v, glicerina a 3% v/v, durante uma noite, com duas mudanças de tampão.

Os geles foram submetidos a Western blot num aparelho para western blot BIORAD com célula mini-Protean II, num tampão de 0,025 M de Tris, 0,2 M de glicina, 20% v/v de metanol, sobre membrana de nylon Nytran 0,2 Fm (Schleicher & Schuell), a 100 V, durante 1 hora, a 4°C. EXEMPLO 4

Análise Slot blot

Para a análise "slot blot", foram adicionados 0,7 Fg de proteínas mutantes e Lol p 5 nas fendas de um aparelho de slot blot Hybri-Slot com coletor (Life Technologies, Inc.) e foram processados sobre membrana de nylon Nytran de 0,1 Fm (Schleicher & Schuell), sob vácuo de uma trompa de vácuo. 44 EXEMPLO 5

Incubação de manchas com anticorpos e soros de pacientes

Antes da incubação com anticorpos ou soros, todas as manchas "western" e "slot" foram bloqueadas em pó de leite desnatado a 10% p/v em PBS (150 mM de cloreto de sódio, 36 mM de fosfato monobásico de sódio, monohidrato, 7 mM de fosfato dibásico de sódio, dihidrato) durante uma hora, sob agitação. As manchas foram lavadas com PBS, 0,5% v/v de Tween 20, duas vezes com PBS e foram incubadas por uma noite com anticorpos monoclonais (mAb A7: diluido a 1:5), anticorpos policlonais (Bl: diluídos a 1:50) ou soros de pacientes. Todas as diluições foram preparadas em PBS, 0,5% p/v de BSA, 0,1% p/v de azida de sódio, e foram agitadas com as manchas por uma noite, à temperatura ambiente. Após a lavagem como acima, as manchas foram incubadas com anticorpos secundários (Promega) anti-rato (mAb7) ou anti-coelho (Bl) conjugados com fosfatase alcalina, diluído a 1:5000 em PBS, 0,5% v/v de Tween 20, 1% p/v de BSA durante 1 hora, com agitação, à temperatura ambiente. Todas as manchas foram em seguida lavadas como acima. Os anticorpos anti-rato e anti-coelho ligados foram detetados por uma reação corada — 10 mL de tampão de fosfatase alcalina (0,1 M Tris, pH 9,5, 0,1 M de cloreto de sódio, 0,05 M de cloreto de magnésio) com 66 FL de BCIP de lote (5% p/v de fosfato de bromocloroindolilo em 100% v/v de dimetil-formamida). — A manchas incubadas com os soros de pacientes i p c foram ensaiadas com anticorpo anti-humano marcado com I (Bioclone), diluído a 1:5 em PBS, 0,5% v/v de Tween 20, 1% p/v de BSA (tampão B) por uma noite, sob agitação, à temperatura ambiente. Todas as manchas foram lavadas como acima. Depois da lavagem, o IgE anti-humano marcado com 45 I125, ligado, foi detetado por exposição a filme Kodak Biomax MS a -70°C. EXEMPLO 6 ELISA direto

As cavidades de uma placa ELISA (Greiner) foram revestidas com 50 FL de partes alíquotas de diluições a 100, 500, 1000, 5000 e 10 000 ng/mL de Lol p 5 e as quatro proteínas mutantes, e foram incubadas a 4°C por uma noite. As cavidades foram depois lavadas quatro vezes com PBS, 0,5% v/v de Tween 20. Depois de bloqueio com o tampão B à temperatura ambiente, por uma hora, as cavidades foram de novo lavadas e foram incubadas com 50 FL de uma diluição apropriada dos soros dos pacientes em tampão B, a 4°C, por uma noite. As cavidades foram lavadas como acima antes da incubação com 50 FL de uma diluição a 1:2000 de anticorpo IgE anti-humano (conjugado de fosfatase alcalina: Sigma) em tampão B, à temperatura ambiente, durante uma hora. Depois de uma série final de lavagens, o IgE anti-humano ligado foi detetado com o sistema Blue Phos de substrato de fosfatase para microcavidades (laboratórios Kirkgaard & Perry). O desenvolvimento da cor foi detetado por um leitor de placas Spectracount (Packard) a 630 nm.

Os peritos na técnica compreenderão que a invenção aqui descrita é suscetível de outras variações e modificações além das que foram descritas concretamente. Deverá compreender-se que a invenção inclui todas essas variações e modificações. A invenção também inclui todos os passos, caraterísticas, composições e compostos referidos ou indicados na presente descrição, individual ou coletivamente, e qualquer uma e todas as combinações de 46 46 ou quaisquer dois ou mais dos referidos passos carateristicas. 47

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Ala Asp Ala Gly Tyr Thr Pro Ala Ala Ala Ala Thr Pro Ala Thr Pro 15 10 15

Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Gly Lys Ala Thr Thr Asp Glu Gin 20 25 30

Lys Leu Leu Glu Asp Vai Asn Ala Ala Gly Phe Lys Ala Ala Vai Ala 35 40 45

Ala Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala Asp Lys Phe Lys Ile Phe Glu Ala 50 55 60

Ala Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ala Ala Lys $5 70 75 80

Ala Pro Gly Leu Ile Pro Lys Leu Asp Thr Ala Tyr Asp Vai Ala Tyr 85 90 95

Lys Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Vai 100 105 110

Thr Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg Vai Ile Ala Gly Ala Leu Glu Vai 51 115 120 125

His Ala Vai Lys Pro Ala Thr Glu Glu vai Pro Ala Ala Lys Ile Pro 130 135 140

Thr Gly Glu Leu Gin Ile Vai Asp Lys Ile Asp Ala Ala Phe Lys lie 145 150 155 ISO

Ala Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp Lys Phe Thr Vai 165 170 175

Phe Glu Ser Ala Phe Asn Lys Ala Leu Asn Glu Cys Thr Gly Gly Ala 180 185 190

Tyr Glu Thr Tyr Lys Phe Ile Pro Ser Leu Glu Ala Ala Vai Lys Gin 195 200 205

Ala Tyr Ala Ala Thr Vai Ala Ala Ala Pro Glu vai Lys Tyr Ala Vai 210 215 220

Phe Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Ile Thr Ala Met Thr Gin Ala Gin 225 230 235 240

Lys Ala Gly Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Vai 245 250 255

Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala 260 265 270

Gly Gly Tyr Lys Ala 275 <210> 2 <211> 138 <212> PRT <213> Isoforma <400> 2 52

Ala Thr Pro Ala Thr Ala Ala Thr Pr o Thr Pro Ala Thr Pr o Ala Thr 15 10 15

Pro Ala Ala Vai Pro Ser Glu Ile Lys Ile Vai Vai Tyr Thr Vai Glu 20 25 30

Thr Gly Ala Thr Asn Phe Vai Glu Gly Leu Ala Ser Gly Tyr Ala Asp 35 40 45

Gin Ser Lys Asn Gin Thr Ser Ala Leu Lys Leu Glu Gin Tyr Ala Thr 50 S5 60

Ala Lys Vai Gly Ala Ala Ala Vai Leu Ile Vai Arg Thr Ala Asn Thr 65 70 75 60

Asn Ile Lys Vai Ser Leu Ala Asp Ser Thr Leu Vai Lys Gin Thr Thr 85 90 95

Ser Thr Lys Vai Ser Glu Glu Glu Ala Thr Thr Ala Thr Pro Thr Pro 100 105 HO

Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Pro Ala Ala Ala Tyr Thr Ala Thr 115 120 125

Pro Ala Ala Thr Pro Ala Thr Thr Pro Vai 130 135 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Isoforma <400> 3 53

Leu Gly Thr Pro Gly Tyr Thr Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Gly Ala 15 10 15

Asp Ala Ala Glu Ile Lys Ile Leu Gly Gly Vai Gin Tyr Arg Thr Vai 20 25 30

Thr Gly Pro Ala Asn Phe Ala Glu Gly Leu Ser Gly Glu Pro Lys Gly 35 40 45

Ala Ala Glu Ser Ser Ser Lys Ala Ala Thr Ser Ala Lys Leu Thr Tyr 50 55 60

Ala Thr Ser Ile Thr Ala Lys Vai Ala Vai Ile Glu Vai Vai Ala Ala 65 70 75 80

Asp Glu ile Lys Ala Ser Ser Ala Thr Thr Thr Lys Ser Glu Ala Pro 85 90 95

Pro Leu Pro Pro Pro Pro Gin Pro Pro Pro Leu Ala Gly Ala Thr Vai 100 105 110 <210> 4 <211> 67 <212> PRT <213> Isoforma <400> 4 54

Ala Ala Gly Glu Ile Lys IIe Vai Arg Gin Ala Thr Ser Pro Arg His 15 10 IS

Pro Arg Pro Arg Gin Gly Ala Gly Vai Ser Ala Ser Vai Phe Ser Ala 20 25 30

Ser Vai Pro Gly Met Ala Ile Vai Ala Thr Ala Asp Ala Ile Lys Ser 35 40 45

Asp Cys Ala Thr Ser Glu Vai Ser Lys Vai Gin Ala Thr Ser Gly Ala S0 55 60

Ala Vai Vai 65 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> Isoforma <400> 5

Vai Gly Ala Pro Thr Leu Thr Pro Pro Ala Ala Gly Tyr Thr Pro Ala 1 5 10 15

Ala Pro Ala Gly Ala Ala Pro Ile Lys Ile Gly Vai Ala Vai Tyr Thr 20 25 30

Vai Thr Gly Ala Ser Asn Phe Ala Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro Lys 35 40 45

Gly Ala Ala Ala Ala Ser Ser Asn Ala Vai Thr Ser Ala Lys Leu Ser 50 55 60 55

Tyr Vai Ala Thr Leu Ser Ile Thr Gly Lys Ala Ala Vai Ile Vai Vai 65 70 75 80

Ala Ala Asp Ile Lys Ala Ser Gin Ser Ala Ser Thr Ala Thr Lys Ser 85 90 95

Ala Vai Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ala Vai Gly Ala Vai Gly Ala Gly 100 105 110

Tyr Lys Thr Gly Ala Ala Pro Thr Vai 115 120 <210> 6 <211> 98 <212> PRT <213> Isoforma <400> 6

Leu Ser Gly Ala Pro Thr Pro Ala 1 5

Ala Gly Tyr Thr Pro Ala Ala Pro 10 15

Ala Gly Ala Ala Pro Met Ile Lys 20

Ile Vai Gly Gly Vai Ala Asn Tyr 25 30

Thr Vai Thr Gly Ala Ala Ser Asn 35 40

Phe Ala Glu Ala Leu Ser Thr Glu 45

Pro Lys Gly Ala Ala Ala Asp Ser 50 55

Ser Lys Ala Ala Thr Ser Ala Lys 60

Leu Ser Asp Tyr Ala Thr Ser Ile 65 70

Thr Gly Ala Lys Ala Thr Ala Vai 75 80

Ile Vai Vai Ala Ala Asp Ile Lys 85

Ala Ser Gin Ser Ala Ser Thr Ala 90 95

Ala Vai 56 <210> 7 <211> 305 <212> PRT <213> Lol ρ 5 <400> 7 57

Met Ala Val Gin Lys Tyr Thr Vai 1 5

Ala Leu Phe Leu Ala Val Ala Leu 10 15

Val Ala Gly Pro Ala Ala Ser Tyr 20

Ala Ala Asp Ala Gly Tyr Thr Pro 25 30

Ala Ala Ala Ala Thr Pro Ala Thr 35 40

Pro Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala 45

Gly Gly Lys Ala Thr Thr Asp Glu 50 55

Gin Lys Leu Leu Glu Asp Val Asn 60

Ala Gly Phe Lys Ala Ala Val Ala 65 70

Ala Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala 75 80

Asp Lys Phe Lys Ile Phe Glu Ala 85

Ala Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly 90 95

Leu Leu Ala Thr Ser Ala Ala Lys 100

Ala Pro Gly Leu Ile Pro Lys Leu 105 110

Asp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Tyr 115 120

Lys Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro 125

Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Val 130 135

Thr Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg 140

Val Asn Leu Ala Ala Ile Ala Gly 145 ISO

Ala Leu Glu Val His Ala Val Lys 155 160

Pro Ala Thr Glu Glu Val Piro Ala 165

Ala Lys Ile Pro Thr Gly Glu Leu 170 17S

Gin Ile val Asp Lys Ile Asp Ala 180

Ala Phe Lys Ile Ala Ala Thr Ala 185 190

Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp 195 200

Lys Phe Thr Val Phe Glu Ser Ala 205

Phe Asn Lys Ala Leu Âsn Glu Cys 210 215

Thr Gly Gly Ala Tyr Glu Thr Tyr 220 58

Lys Phe Ile Pro Ser Leu Glu Ala 225 230

Ala Vai Lys Asp Ala Tyr Ala Ala 235 240

Thr Vai Ala Ala Ala Pro Glu Vai 245

Lys Tyr Ala Vai Phe Glu Ala Ala 250 255

Leu Thr Lys Ala Xle Thr Ala Met 260

Thr Gin Ala Gin Lys Ala Gly Lys 265 270

Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly 275 280

Ala Ala Thr Vai Ala Thr Gly Ala 285

Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala 290 295

Thr Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Lys 300

Ala 305 <210> 8 <211> 276

<212> PRT <213> Lol p 5, variante Dl <400> 59

Ala Asp Ala Gly Tyr Thr Pro Ala Ala Ala Ala Thr Pro Ala Thr Pro 1 5 10 15 Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Gly Lys Ala Thr Thr Asp Glu Gin 20 25 30 Lys L€U Leu Glu Asp Vai Asn Ala Gly Phe Lys Ala Ala Val Ala Ala 35 40 45 Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala Asp Ala Phe Lys Ile Phe Glu Ala Ala 50 55 60 Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ala Ala Lys Ala 65 70 75 80 Pro Gly Leu Ile Pro Lys Leu Asp Thr Ala Tyr Asp Vai Ala Tyr Lys 85 90 95 Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Val Thr 100 105 110 60

Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg Vai Ile Ala Gly Ala Leu Glu Vai His 115 120 125

Ala Vai Lys Pro Ala Thr Glu Glu Vai Pro Ala Ala Lys Ile Pro Thr 130 135 140

Gly Glu Leu Gin Ile Vai Asp Lys Ile Asp Ala Ala Phe Lys Ile Ala 145 ISO 155 160

Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp Lys Phe Thr Vai Phe 165 170 175

Glu Ser Ala Phe Asn Lys Ala Leu Asn Glu Cys Thr Gly Gly Ala Tyr 180 185 190

Glu Thr Tyr Lys Phe Ile Pro Ser Leu Glu Ala Ala Vai Lys Asp Ala 135 200 205

Tyr Ala Ala Thr Vai Ala Ala Ala Pro Glu Vai Lys Tyr Ala Vai Phe 210 215 220

Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Ile Thr Ala Met Thr Gin Ala Gin Lys 225 230 235 240

Ala Gly Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Vai Ala 245 250 255

Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly 260 265 270

Gly Tyr Lys Ala 275

<210> 9 <211> 276 <212> PRT <213> Lol p 5, variante D2 <400> 9

Ala Asp Ala Gly Tyr Thr Pro Ala Ala Ala Ala Thr Pro Ala Thr Pro 1 5 10 15 61

Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Gly Lys Ala Thr Thr Asp Glu Gin 20 25 30

Lys Leu Leu Glu Asp Vai Asn Ala Gly Phe Lys Ala Ala Vai Ala Ala 35 40 45

Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala Asp Lys Phe Lys Xle Phe Glu Ala Ala 50 55 60

Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ala Ala Lys Ala 65 70 75 S0

Pro Gly Leu Ile Pro Lys Leu Asp Thr Ala Tyr Asp Vai Ala Tyr Lys 85 90 95

Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Vai Thr 100 105 110

Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg Vai Ile Ala Gly Ala Leu Glu Vai His 115 120 125

Ala Vai Lys Pro Ala Thr Glu Glu Vai Pro Ala Ala Lys Ile Pro Thr 130 135 140

Gly Glu Leu Gin Ile Vai Asp Lys Ile Asp Ala Ala Phe Lys Ile Ala 145 150 155 160

Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp Lys Phe Thr Vai Phe 165 170 175

Glu Ser Ala Phe Asn Lys Ala Leu Asn Glu Cys Thr Gly Gly Ala Tyr 180 185 190

Glu Thr Tyr Lys Phe Ile Pro Ser Leu Glu Ala Ala Vai Lys Asp Ala 195 200 205

Tyr Ala Ala Thr Vai Ala Ala Ala Pro Glu Vai Lys Tyr Ala Vai Phe 210 215 220

Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Ile Thr Ala Met Thr Gin Ala Gin Lys 225 230 235 240

Ala Gly Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Vai Ala 62 245 250 255

Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly 260 265 270

Ala Tyr Ala Ala 275

<210> 10 <211> 275 <212> PRT <213> Lol p 5, variante D3 <400> 10 63

Ala Asp Ala Gly Tyr Thr Pro Ala Ala Ala Ala Thr Pro Ala Thr Pro 1 5 10 15

Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Gly Lys Ala Thr Thr Asp Glu Gin 20 25 30

Lys Leu Leu Gin Asp Vai Asn Ala Gly Phe Lys Ala Ala Vai Ala Ala 35 40 45

Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala Asp Lys Phe Lys Ile Phe Glu Ala Ala 50 55 60

Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ala Ala Lys Ala 65 70 75 80

Pro Gly Leu Ile Pro Lys Leu Asp Thr Ala Tyr Asp Vai Ala Tyr Lys 85 90 95

Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Vai Thr 100 105 110

Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg Vai Ile Ala Gly Ala Leu Glu Vai His 115 120 125

Ala Vai Lys Pro Ala Thr Glu Glu Vai Pro Ala Ala Lys Ile Pro Thr 130 135 140

Gly Glu Leu Gin Ile Vai Asp Lys 145 150

Ile Asp Ala Ala Phe Lys Ile Ala 155 160 64

Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp Lys Phe Thr Vai Phe 165 170 175

Glu Ser Ala Phe Asn Lys Ala Leu Asn Glu Cys Thr Gly Gly Ala Tyr 180 185 190

Glu Thr Tyr Lys Phe Ile Pro Ser Leu Glu Ala Ala Vai Lys Asp Ala 195 200 205

Tyr Ala Ala Thr Vai Ala Ala Ala Pro Glu vai Lys Tyr Ala Vai Phe 210 215 220

Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Ile Thr Ala Met Thr Gin Ala Gin Lys 225 230 235 240

Ala Gly Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Vai Ala 245 250 255

Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly 260 265 270

Tyr Lys Ala 275

<210> 11 <211> 276 <212> PRT <213> Lol p 5, variante D4 <400> 11 65 Ala Asp Ala Gly Tyr Thr Pro Ala Ala Ala 1 S 10

Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Gly Lys 20 25

Lys Leu Leu Glu Asp Vai Asn Ala Gly Phe 35 40

Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala Asp Lys Phe 50 5S

Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly Leu Leu Ala

Ala Thr Pro Ala Thr Pro 15 Ala Thr Thr Asp Glu Gin 30 Lys Ala Ala Vai Ala Ala 45 Lys Ile Phe Glu Ala Ala 60 Thr Ser Ala Ala Lys Ala 66 65 70 75 80

Pro Gly Leu Ile Pro Lys Leu Asp Thr Ala Tyr Asp Vai Ala Tyr Lys 85 90 95

Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Vai Thr 100 105 110

Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg Vai Ile Ala Gly Ala Leu Glu Vai His 115 120 125

Ala Vai Lys Pro Ala Thr Glu Glu Vai Pro Ala Ala Lys Ile Pro Thr 130 135 140

Gly Glu Leu Gin Ile Vai Asp Lys Ile Asp Ala Ala Phe Lys Ile Ala 145 150 155 160

Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp Asn Leu Ala Ala Phe 165 170 175

Glu Ser Ala Phe Asn Lys Ala Leu Asn Glu Cys Thr Gly Gly Ala Tyr 180 1S5 190

Glu Thr Tyr Lys Phe Ile Pro Ser Leu Glu Ala Ala Vai Lys Asp Ala 195 200 205

Tyr Ala Ala Thr vai Ala Ala Ala Pro Glu Vai Lys Tyr Ala Vai Phe 210 215 220

Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Ile Thr Ala Met Thr Gin Ala Gin Lys 225 230 235 240

Ala Gly Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Vai Ala 245 250 255

Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly 260 265 270

Gly Tyr Lys Ala 275 67 67 <2 10> 12 <2 11> 276 <2 12> PRT <2 13> Lol p 5 <4 Λ O O 12 variante D5 68

Ala Asp Ala Gly Tyr Thr Pro Ala Ala Ala Ala Thr pro Ala Thr Pro 15 10 15

Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Gly Lys Ala Thr Thr Asp Glu Gin 20 25 30

Lys Leu Leu Glu Asp Vai Asn Ala Gly Phe Lys Ala Ala Vai Ala Ala 35 40 45

Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala Asp Lys Phe Lys Ile Phe Glu Ala Ala 50 55 60

Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ala Ala Lys Ala 65 70 75 80

Pro Gly Leu Ile Pro Lys Leu Asp Thr Ala Tyr Asp Vai Ala Tyr Lys 85 90 95

Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Vai Thr 100 105 110

Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg Vai Ile Ala Gly Ala Leu Glu Vai His 115 120 125

Ala Vai Lys Pro Ala Thr Glu Glu Va'1 Pro Ala Ala Lys Ile Pro Thr 130 135 140

Gly Glu Leu Gin Ile Vai Asp Lys Ile Asp Ala Ala Phe Lys Ile Ala 145 150 155 160

Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp Lys Phe Thr Vai Phe 165 170 175

Glu Ser Ala Phe Asn Lys Ala Leu Asn Glu Cys Thr Gly Gly Ala Tyr 180 185 190

Glu Thr Tyr Lys phe Ile Pro Ser Leu Glu Ala Gly Ala Ala Asp Ala 195 200 205 69

Tyr Ala Ala Thr Vai Ala Ala Ala Pro Glu Vai Lys Tyr Ala Vai Phe 210 215 220

Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Ile Thr Ala Met Thr Gin Ala Gin Lys 225 230 235 240

Ala Gly Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Vai Ala 245 250 255

Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly 260 265 270

Gly Tyr Lys Ala 275

<210> 13 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador para diante Dl <400> 13 24 cctccggcgg acgcgttcaa gatc

<210> 14 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador rev. Dl <400> 14 gatcttgaac gcgtccgccg gagg

<210> 15 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial 24 <220> 70 <223> Iniciador para diante D2 <400> 15 gctgctggtg cctacgcagc ctgatcagc 29 <210> 16 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador rev. D2 <400> 16 gctgateagg etgcgtaggg aceageage 29 <210> 17 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador para diante D3 <400> 17 ecaeegecge tgcttgaggc tacaaagc 28 <210> 18 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador rev. D4 <400> 18 71 getttgtagc ctcaacjcagc ggcggfcgg 2 8

<210> 19 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador para diante D5 <400> 19 ccaeeasega feaacttggce gcctfccgaga gtge 34

<210> 20 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador rev. D5 <400> 20 gcacfccfccga aggcggccaa gttafccgttg gtgg 34 <210> 21 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador para diante D6 <400> 21 cctcgaggcc ggggcegcge sggcctae 28 <210> 22 <211> 29 72

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador rev. D5 <400> 22 cgtaggectg cgcggcGceg gcetcgagg 23

Lisboa, 27 de Novembro de 2013

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Variante recombinante de proteína de alérgeno Lol p 5, que consiste nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 portadoras de mutações selecionadas do grupo que consiste em a) K172N, F173L, T174A e V175A (mut 4), b) K57A, G273A, K275A, K172N, F173L, T174A e V175A (mut 6) e c) K57A, AG212, K172N, F173L, T174A e V175A (mut 8) .

2. Variante recombinante de alérgeno de acordo com a reivindicação 1, a qual compreende números reduzidos de epítopos de IgE e/ou exibe uma reduzida capacidade de ligação para IgE, e/ou exibe uma reduzida estimulação da produção de IgE, mantendo no entanto a antigenicidade de células T.

3. Variante recombinante de alérgeno de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que o referida proteína de alérgeno, na sua forma de ocorrência natural, está associado a doenças alérgicas de tipo I em pacientes sensíveis.

4. Variante recombinante de alérgeno de acordo com a reivindicação 3, em que a doença alérgica de tipo I é a sensibilidade a pólen de azevém.

5. Variante recombinante de alérgeno de acordo com a reivindicação 3, em que o referido paciente sensível é um humano, um primata, um animal de criação, um animal para ensaios laboratoriais ou um animal de companhia. 2

6. Variante recombinante de alérgeno de acordo com a reivindicação 5, em que o referido paciente sensível é um humano.

7. Composição, compreendendo uma variante recombinante de alérgeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e uma ou mais substâncias veiculares e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

8. Variante recombinante de alérgeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, para utilização num método de tratamento do corpo de um humano ou de um animal, por terapia.

9. Utilização de uma variante recombinante de alérgeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, na fabricação de um medicamento para utilização num método para a profilaxia ou o tratamento de uma patologia de doença alérgica. Lisboa, 27 de Novembro de 2013