NO336740B1 - Rekombinant variant av Lol p 5 protein allergen med redusert IgE-binding, anvendelse derav samt sammensetning. - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse angår generelt reagenser anvendelige ved immunoterapeutisk eller immunoprofylaktisk behandling av allergiske sykdommer. Mer spesielt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse modifiserte allergener som har redusert IgE-interaktivitet omfattende redusert IgE-produksjonsstimulerende aktivitet, men beholder T-celle antigenisitet, som er nyttige for immunomodulering av type I allergiske sykdomstilstander.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Bibliografiske detaljer om referanser gitt i foreliggende beskrivelse er listet opp på slutten av beskrivelsen.

Type I allergiske sykdommer så som sesongmessig allergisk rhinitt (høyfeber), konjunktivitt, allergisk astma og allergisk dermatitt, representerer et vesentlig helseproblem i industrialiserte land (Wuthrich, Int. Arch. Allergy Immunol. 90:3-10, 1989). Det er for tiden beregnet at 15-20% av populasjonen i utviklede land er rammet av noen form for allergi (Miyamoto, Advances in Allergology and Clinical Immunology. Godard P, Bousquet J, Michel FB (ed.) s. 343-347. The Parthenon Publishing Group, Cornforth, UK, 1992). Derfor er diagnose og terapi for disse sykdommer blitt fokus for interesse for vitenskapelig undersøkelse.

SWOBODA INES ET AL., "Hypoallergenic forms of the ryegrass pollen allergen Loi p 5 as candidates for immunotherapy", International Archives of Allergy and Immunology, vol. 124, no. 1-3, 2001, s. 380-382 omtaler utvikling og fremstilling av forskjellige varianter av raigress pollenallergenet Loi p5

for å redusere allergenets IgE bindingskapasitet men beholde T celleepitopene som er avgjørende for immunoterapi.

SCHRAMM GABRIELE ET AL., "Allergen engineering: variants of the timothy grass pollen allergen Ph1 p 5b with reduced IgE-binding capacity but conserved T cell reactivity", The Journal of Immunology, vol. 162, 1999, s. 2406-2414 angir at immunoterapeutiske midler kan gjøres sikrere og mer effektive ved å fremstille modifiserte allergener med redusert IgE-

bindingskapasitet men med opprettholdt T celle reaktivitet.

SUPHIOGLU CENK ET AL., "Molecular basis of IgE-recognition of Loi p 5, a major allergen of rye-grass pollen", Molecular Immunology, vol. 35, no. 5, 1998, side 293-305 angir at identifisering av IgE-bindende (allergeniske) epitoper i gresspollen allergener er viktig i forhold til forståelsen av interaksjonen mellom allergenene og humane IgE antistoffer på molekylært nivå.

De primære immunologiske og biokjemiske basiske type I allergiske reaksjoner er interaksjonen av allergene substanser (allergener) med IgE-antistoffer bundet til høyaffinitet Fc-reseptorer på overflaten av mastceller og basofiler. Denne interaksjonen resulterer i kryssbinding av allergen-spesifikke IgE-antistoffer som så stimulerer en umiddelbar frigjøring og kaskade-produksjon av inflammatoriske mediatorer ansvarlige for allergiske symptomer. Allergener er til stede i partikler i luften så som husstøv, pollen fra gress, ugress og trær, soppsporer og dyreflass.

Nå involverer én form av terapeutisk intervensjon av allergiske sykdommer (så som rhinitt, konjunktivitt og allergisk astma) injeksjon av allergenet antatt å være ansvarlig for den allergiske responsen. Dette er referert til som hypo-sensibiliserings-behandling. Ekstrakter som for tiden anvendes i denne prosedyren blir fremstilt fra naturlige kilder og inneholder, i tillegg til allergenene, komponenter så som proteiner for hvilke pasienter ikke er allergiske.

Utvikling av rekombinante teknikker har gitt muligheter for å produsere høye nivåer av rensede allergener for diagnostiske og terapeutiske formål. Imidlertid resulterer det høye nivå av renhet av rekombinante allergen-preparater i en høy anafylaktogen indeks selv i meget små doser. Følgelig er ekstrem forsiktighet nødvendig når de blir administrert til pasienter. Det er derfor et behov for å utvikle rekombinante allergener med en redusert risiko for anafylaktisk sjokk.

Den viktigste utendørs årsaken til sesongmessig høyfeber og allergisk astma er gresspollen i luften (Smart et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 7:243-248, 1983). Pollen-kalendere viser at gresspollen er rikeligst om våren og tidlig sommer når gress blomstrer og dette er når de allergiske astmatopper forekommer. De viktigste kilder for gresspollen er vanlig landbruks beitegress som er bredt innført over hele verden, men varierer med temperatur og tropiske klimasoner. I kjølige temperatur-regioner, er gress så som raigress, engrapp og timotei (som alle tilhører underfamilien Pooideae) av klinisk betydning, mens i varm temperatur og subtropiske omgivelser er pollen fra Bermuda gress (underfamilie chloridoideae) den viktigste kilde for allergener. De mest omfattende undersøkelser er gjort på proteiner fra raigresspollen og i mindre grad engrapp og timotei.

Individer som er sensitive for allergener fra én gresstype er ofte sensitive for de fra flere andre gress-slekter. Dette gjelder spesielt for pollen fra gress i underfamilien Pooideae (Smith et al., " Analysis of rye- grass pollen- allergens using two dimensional electrophoresis and immunoblotting." I Kraft D (ed), Molecular Biology and Immunology of Allergens, CRC Press, Boca Raton, FL, 1994), hvor immunologisk kryss-reaktivitet er demonstrert i hemningsforsøk ved anvendelse av et IgE-bindingsforsøk, radioallergosorbent-test (RAST). I disse forsøk var pollen-ekstrakter fra ett gress i stand til å hemme binding av IgE til ekstrakter fra andre gress.

Allergene komponenter av gresspollen kan klassifiseres i forskjellige grupper i henhold til deres fysiokjemiske og immunologiske egenskaper. De viktigste allergener som fremkaller en allergisk reaksjon mot pollen fra Pooid-gress er gruppe 1 og 5 allergener, som bedømt ved både kriterier for antallet allergisk pasienter som responderer og relative mengder av IgE-binding til allergenene (Singh et al., 1991, supra). I tilfellet av flerårig raigress, Lolium perenne, inneholder pollen-ekstrakter mer enn 17 proteiner som har kapasitet til å binde IgE fra sera til gresspollen-allergiske pasienter (Smith et al., 1993, supra). Imidlertid er det vist at allergener fra gruppe 1 og 5 sammen kan hemme mesteparten av IgE-binding til rå pollen-ekstrakter (Bond et al., J. Allergy Clin. Immunol. 91:339, 1993).

Loi p 5, et protein på 28-33 kDa, er det andre mest utbredte raigress allergen som forårsaker allergi hos 85-90% av gresspollen-allergiske individer. Molekylær kloning av cDNA som koder for denne gruppe 5 allergen (Singh et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:1384-1388,1991; Ong et al., Gene 134:235-240, 1993) har vist at Loi p 5 eksisterer som en familie av homologe, men adskillbare isoformer som beholder deres IgE-reaktivitet selv etter separering ved denaturering på SDS-PAGE-geler og immunoblotting (Singh et al., 1991, supra).

Følgelig eksisterer et behov for å utvikle modifiserte former av rekombinante allergener anvendelige for immunoterapi og immunoforebygging av allergiske lidelser.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

I hele denne beskrivelsen, hvis ikke sammenhengen tilsier noe annet, skal ordet "omfatte" eller variasjoner så som "omfatter" eller "omfattende", forstås å angi inklusjon av et angitt element eller helt tall eller gruppe av elementer eller hele tall, men ikke eksklusjon av eventuelle andre elementer eller hele tall eller gruppe av elementer eller hele tall.

Nukleotid- og aminosyresekvenser er referert til med et sekvens-identifikator-nummer (SEKV ID NR:). SEKV ID NR: svarer nummerisk til sekvensidentifikatorene <400>1 (SEKV ID NR:1), <400>2 (SEKV ID NR:2), etc. En oppsummering av sekvensidentifikatorene er gitt i Tabell 1. En sekvensliste er gitt etter kravene.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et modifisert rekombinant allergen, hvor i naturlig forekommende form, allergenet er forbundet med allergiske sykdomstilstander hos sensitive individer. Hensiktsmessig omfatter modifisert rekombinant allergen en aminosyresekvens modifisert fra den naturlig forekommende aminosyresekvens slik at allergenet mangler eller omfatter redusert antall av IgE-epitoper og/eller oppviser redusert bindingskapasitet for IgE og/eller oppviser redusert IgE-produksjons-stimulerende aktivitet, mens det beholder T-celle-antigenisitet.

Fortrinnsvis er den allergiske sykdomstilstand en type I allergisk sykdomstilstand.

Fortrinnsvis er det rekombinante allergenet et gresspollen-allergen.

Mest foretrukket er gress-allergenet et raigresspollen-allergen så som, Loi p 5 eller immunologisk eller botanisk beslektede allergener så som Ph1 p 5 og Poa p 5.

I en spesielt foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en rekombinant variant av Loi p 5 protein allergen som har aminosyresekvensene ifølge SEQ ID NO:1 som bærer mutasjonene valgt fra gruppen bestående av

a. K172N, F173L, T174A og V175A (mut 4),

b. K57A, G273A, K275A, K172N, F173L, T174A og V175A (mut 6), og c. K57A, AG272, K172N, F173L, T174A og V175A (mut 8).

I en spesielt foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse videre rekombinant allergenvariant ifølge krav 1, som utviser reduserte antall av IgE epitoper og/eller utviser redusert bindingskapasitetfor IgE og/eller utviser redusert stimulering av IgE produksjonen, mens T-celle antigenisiteten beholdes.

I en spesielt foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse videre rekombinant allergenvariant ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2, hvor nevnte proteinallergen i naturlig forekommende form er assosiert med type 1 allergisk sykdom i sensitive individer.

I en spesielt foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse videre rekombinant allergenvariant ifølge krav 3, hvor type 1 allergisk sykdom er sensitiv overfor raigresspollen.

I en spesielt foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse videre rekombinant allergenvariant ifølge krav 3, hvor nevnte sensitive individ er et menneske, en primat, husdyrbesetning, laboratorietestdyr eller selskapsdyr.

I en spesielt foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse videre rekombinant allergenvariant ifølge krav 5, hvor nevnte sensitive individ er et menneske.

I en spesielt foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en sammensetning omfattende en rekombinant allergenvariant ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 og en eller flere midler valgt fra gruppen bestående av farmasøytiske akseptable bærere og fortynningsmidler.

I en spesielt foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse anvendelse av en rekombinant allergenvariant ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 for fremstilling av et medikament for anvendelse i en metode for profylakse eller behandling av en allergisk sykdomstilstand.

En oppsummering av sekvens-identifikatorer anvendt gjennom hele foreliggende beskrivelse er gitt i Tabell 1.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 er en representasjon som viser en sammenligning av utledede aminosyresekvenser av gruppe 5 allergener. Streker indikerer gap som er innført, for å gi maksimal oppstilling. Rester identiske med Loi p 5 A er angitt med stjerner. Figur 2 er en representasjon som viser aminosyresekvens av Loi p 5 A som indikerer mutasjoner innført i allergenet for å gi D1, D2, D3, D4 og D5 mutanter. Aminosyrer i Loi p 5 A som er endret er angitt med bokser, mens nye sekvenser er angitt med fet skrift. Figur 3 er en skjematisk representasjon av muterte Loi p 5 varianter; f.eks. inneholder mut 1 mutasjon D1. Figur 4 er en representasjon som viser sekvenser av primere anvendt for å skape mutasjoner i Loi p 5 A. Figur 5 er en diagrammatisk representasjon som viser slot blot analyse av Loi p 5 (ikke-mutert) og de ni muterte varianter (mut 1 til mut 9) av reaktivitet av de rensede proteinene til et polyklonalt (p), et monoklonalt (m) antistoff og til sera fra 7 raigresspollen-allergiske pasienter. Figur 6 er en diagrammatisk representasjon som viser immunoblot analyser av Loi p 5 (ikke-mutert) og de ni muterte varianter (mut 1 til mut 9) av reaktiviteter av de rensede proteinene til et polyklonalt (p), et monoklonalt (m) antistoff og til serum fra en raigresspollen-allergisk pasient (pasient 2). Figurer 7 A, B og C er grafiske representasjoner av ELISA forsøk ved anvendelse av renset ikke-mutert Loi p 5 og fire av de muterte proteiner (mut 3, mut 4, mut 6, mut 9) som viser en reduksjon i reaktivitet til de muterte varianter til monoklonal (mAb A7) og til IgE fra to pasienter (pasient 4, pasient 27).

DETALJERT BESKRIVELSE AV DE FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER

I henhold til foreliggende oppfinnelse blir genetisk konstruerte hovedsakelig hypoallergene varianter av allergener med en manglende evne eller redusert kapasitet til å interagere med IgE tilveiebragt for anvendelse ved immunoterapi og immunoprofylaksi. Visse typer av modifikasjoner av aminosyresekvensen er funnet å resultere i en mangel på eller reduserte antall av IgE-epitoper, redusert aktivitet til IgE-epitoper, redusert evne til å interagere med IgE og/eller redusert IgE produksjons-stimulerende aktivitet.

Følgelig tilveiebringer ett aspekt ved foreliggende oppfinnelse et modifisert rekombinant allergen, hvor nevnte allergen i naturlig forekommende form er forbundet med allergiske sykdomstilstander hos sensitive individer, hvor nevnte modifiserte rekombinante allergen omfatter en aminosyresekvens modifisert fra den naturlig forekommende aminosyresekvens slik at allergenet mangler eller omfatter reduserte antall av IgE-epitoper og/eller oppviser redusert bindingskapasitet for IgE og/eller oppviser redusert IgE produksjons-stimulerende aktivitet, men beholder T-celle antigenisitet.

Betegnelsen "sensitivt" individ blir anvendt i dens bredeste forstand og omfatter et individ som har symptomene på en allergisk sykdom og mer spesielt en type I allergisk sykdom som respons på eller assosiert med allergenet. Et "individ" er fortrinnsvis et menneske, men omfatter også en ikke-human primat, husdyrbesetning (f.eks. sau, ku, gris, hest, esel, geit), laboratorie-testdyr (f.eks. mus, rotte, kanin, marsvin) og et selskapsdyr (f.eks. hund, katt).

Foreliggende oppfinnelse er spesielt rettet mot gresspollen-allergener.

Det modifiserte rekombinant gresspollen-allergen, hvor nevnte gresspollen-allergen i naturlig forekommende form er forbundet med type I allergiske sykdomstilstander hvor nevnte modifiserte rekombinante gresspollen-allergen omfatter en aminosyresekvens modifisert fra den naturlig forekommende aminosyresekvens slik at allergenet mangler og/eller omfatter redusert antall av IgE epitoper eller oppviser redusert bindingskapasitet for IgE og/eller oppviser redusert IgE- produksjons-stimulerende aktivitet, men beholder T-celle antigenisitet.

Gresspollen-allergenet er raigress eller immunologisk beslektet gresspollen-allergen så som Loi p 5, men Ph1 p 5 og Pao p 5 er også mulig. Referanse til "gresspollen-allergen" omfatter alle raigress eller immunologisk beslektede gresspollen-allergener eller andre gress-allergener.

Følgelig omfatter dette aspekt ved foreliggende oppfinnelse et modifisert rekombinant raigresspollen-allergen omfattende en aminosyresekvens modifisert fra den naturlig forekommende aminosyresekvens slik at allergenet mangler eller omfatter redusert antall av IgE epitoper og/eller oppviser redusert bindingskapasitet for IgE og/eller oppviser redusert IgE-produksjons-stimulerende aktivitet, men beholder T-celle antigenisitet.

Retensjonen av T-celle antigenisitet omfatter referanse til retensjon av T-celle-epitoper eller en annen kapasitet til å interagere med T-celler for å fremkalle en T-celle-respons.

Foreliggende oppfinnelse er nedenfor beskrevet i relasjon til Loi p 5. Dette blir gjort siden Loi p 5 hittil representerer et spesielt anvendelig allergen for å utføre foreliggende oppfinnelse. Dette blir imidlertid gjort med den forståelse at den omfatter hvilket som helst allergen, spesielt et allergen involvert i type I allergiske sykdommer så som, men ikke begrenset til et gruppe 5 gresspollen-allergen. Metodene er spesielt anvendbare for hvilket som helst raigress eller immunologisk beslektet gresspollen-allergen i tillegg til Loi p 5 så som Phi p 5 og Poa p 5.

I arbeidet som førte til foreliggende oppfinnelse, uttrykte oppfinnerene rekombinant Loi p 5 i E. coli som et ikke-fusjonsprotein og fant at fjerning av det N-terminale signalpeptid fra cDNA før kloning i den bakterielle ekspresjonsvektor resulterte i en oppløselig rekombinant form av allergenet. Denne metode gjorde det mulig å unngå de strenge denaturerings-betingelser for isolering av allergenet fra bakterieceller. Rekombinant Loi p 5 ble testet for antigen-similaritet med dens naturlige motstykke ved hemnings-ELISA-forsøk og oppfinnerene viste at den rekombinante formen fullstendig hemmet IgE-binding av en isolert form av dens naturlige pollen-motstykke. Det faktum at enkle rekombinante isoformer kan hemme IgE-binding til naturlige allergener impliserte videre at forskjellige allergen-isoformer var lignende. Oppfinnerene anvendte rekombinante allergener i immunoblot hemnings-undersøkelser hvor allergiske sera reinkubert med rekombinant Loi p 5 ble anvendt for å probe to-dimensjonale immunoblott av raigress oppløselig protein. Det ble funnet i henhold til foreliggende oppfinnelse at preinkubering med én form fullstendig avskaffet binding til alle de forskjellige former kodet for av forskjellige gener. Dette viste at selv med sekvens mikro-heterogeniteter, var forskjellige allergen-isoformer antigent svært lignende.

Neste trinn i utviklingen av foreliggende oppfinnelse var å bestemme nøkkel-aminosyrerester i de allergene proteiner som kunne endres, som fjernet eller reduserte IgE interaktivitet, men som opprettholdt den generelle struktur og funksjonalitet av T-celle-epitopene.

Oppfinnerene bestemte hvilke aminosyrerester på isoformer A og B av Loi p 5 ble konservert. Det ble resonnert at slike konserverte aminosyrerester ville være viktige for IgE-binding siden det er kryss-reaktivitet mellom flere allergener fra forskjellig gress. Ved selektivt å mutere disse konserverte aminosyrerester, ble mutanter identifisert som hadde ingen eller redusert IgE-interaktivitet, men beholdt T-celle antigenisitet.

Følgelig omfatter et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse et modifisert gruppe 5 gresspollen-allergen, hvor nevnte gruppe 5 gresspollen-allergen omfatteren substitusjon, delesjon og/eller addisjon ved én eller flere aminosyrerester som er konservert i minst to immunologisk kryss-reaktive gruppe 5 gresspollen-allergener og hvor nevnte modifiserte gruppe 5 gresspollen-allergen mangler eller omfatter redusert antall av IgE-epitoper og/eller oppviser redusert bindingskapasitet for IgE og/eller oppviser redusert IgE produksjons-stimulerende aktivitet sammenlignet med den tilsvarende naturlig forekommende form.

I henhold til aspektet ved foreliggende oppfinnelse, er én egnet referanse-aminosyresekvens SEKV ID NR:1 som er aminosyresekvensen til Loi p 5, isoform A. En aminosyresekvens-sammenligning, så som i Figur 1, viser de konserverte aminosyrerester i isoformer A og B av Loi p 5 og Ph1 p 5 og i isoformer av Poa p 5. Konserverte rester i Figur 1 er angitt med stjerner. Mutanter blir deretter lett innført som endrer én eller flere av disse konserverte rester.

Et annet aspekt tilveiebringer et modifisert gruppe 5 gresspollen-allergen omfattende en aminosyre-trunkering eller substitusjon, delesjon og/eller addisjon i en posisjon svarende til én eller flere av mutanter 1 til 9 av Loi p 5 som vist i Figur 3 eller en tilsvarende mutant i et immunologisk beslektet allergen.

Et modifisert Loi p 5 allergen som mangler eller omfatter et redusert antall av IgE-epitoper og/eller oppviser redusert IgE-bindingskapasitet og/eller oppviser redusert IgE produksjons-stimulerende aktivitet, men beholder T-celle antigenisitet hvor nevnte Loi p 5 variant er valgt fra et molekyl som har aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR:8 til 12 eller et modifisert allergen svarende til et immunologisk beslektet allergen kan oppnåes.

Loi p 5 varianter identifisert ved SEKV ID NR:8 til 12 er referert til her som henholdsvis mutanter D1 til D5.

Et nukleinsyremolekyl omfattende en sekvens av nukleotider som koder for eller er komplementær til en sekvens som koder for et modifisert rekombinant allergen, hvor nevnte allergen i naturlig forekommende form er forbundet med allergiske sykdomstilstander hos sensitive individer, hvor nevnte modifiserte rekombinante allergen omfatteren aminosyresekvens modifisert fra den naturlig forekommende aminosyresekvens slik at allergenet mangler eller omfatter redusert antall av IgE-epitoper og/eller oppviser redusert bindingskapasitet for IgE og/eller oppviser redusert IgE produksjons-stimulerende aktivitet, men beholder T-celle antigenisitet kan oppnåes.

Et nukleinsyremolekyl omfattende en sekvens av nukleotider som koder for eller er komplementære til en sekvens som koder for et modifisert rekombinant allergen, hvor nevnte allergen i naturlig forekommende form er forbundet med type I allergiske sykdomstilstander hos sensitive individer, hvor nevnte modifiserte rekombinante allergen omfatter en aminosyresekvens modifisert fra den naturlig forekommende aminosyresekvens slik at allergenet mangler eller omfatter redusert antall av IgE-epitoper og/eller oppviser redusert bindingskapasitet for IgE og/eller oppviser redusert IgE produksjons-stimulerende aktivitet, men beholder T-celle antigenisitet kan oppnåes.

Et nukleinsyremolekyl omfattende en sekvens av nukleotider som koder for eller er komplementære til en sekvens som koder for modifisert rekombinant gresspollen-allergen, hvor nevnte gresspollen-allergen i naturlig forekommende form er forbundet med type I allergiske sykdomstilstander hos sensitive individer hvor nevnte modifiserte rekombinante gresspollen-allergen omfatter en aminosyresekvens modifisert fra den naturlig forekommende aminosyresekvens slik at allergenet mangler eller omfatter redusert antall av IgE-epitoper og/eller oppviser redusert bindingskapasitet for IgE og/eller oppviser redusert IgE produksjons-stimulerende aktivitet, men beholder T-celle antigenisitet kan oppnåes.

Et nukleinsyremolekyl omfattende en sekvens av nukleotider som koder for eller er komplementære til en sekvens som koder for modifisert rekombinant raigresspollen-allergen omfattende en aminosyresekvens modifisert fra den naturlig forekommende aminosyresekvens slik at allergenet mangler eller omfatter redusert antall av IgE-epitoper og/eller oppviser redusert bindingskapasitet for IgE og/eller oppviser redusert IgE produksjons-stimulerende aktivitet, men beholder T-celle antigenisitet kan oppnåes.

Rensede nukleinsyremolekyler som koder for et modifisert gresspollen-allergen og mer spesielt et modifisert gruppe 5 gresspollen-allergen eller et antigent fragment derav eller derivat eller homolog derav eller den funksjonelle ekvivalent av en slik nukleinsyresekvens hvor det modifiserte gresspollen-allergen mangler eller omfatter redusert antall av IgE-epitoper og/eller oppviser redusert bindingskapasitet for IgE og/eller oppviser redusert IgE produksjons-stimulerende aktivitet, men beholder T-celle antigenisitet kan oppnåes. Foretrukne nukleinsyresekvenser koder for gruppe 5 allergen familiemedlemmer så som Loi p 5, Poa p 5 og Phi p 5. Ett spesielt anvendelig nukleinsyremolekyl koder for Loi p 5 mutanter D1 til D5.

Nukleinsyremolekylet heri kan være genomisk eller cDNA-molekyler eller et tilsvarende mRNA-molekyl og kan refereres til som et gen. Referanse til et "gen", i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, betyr hvilken som helst sammenhengende sekvens av nukleotider, hvor transkripsjonen av disse fører til et mRNA-molekyl eller hvilken sekvens er et mRNA-molekyl, hvilket mRNA-molekyl kan translateres til et protein. Genet som koder for et gruppe 5 gresspollen-allergen familiemedlem betyr nukleotidsekvensen som koder for proteinet eller et derivat eller en homolog av proteinet som kan inneholde enkle eller multiple aminosyre-substitusjoner, delesjoner og/eller addisjoner i forhold til det tilsvarende naturlig forekommende molekyl. Et modifisert Loi p 5 gen angir også cDNA komplementære til mRNA svarende til den hele eller partielle lengde av et Loi p 5 protein som har minst én forkortning eller aminosyre-substitusjon, -addisjon og/eller -delesjon i forhold til de naturlig forekommende molekyler.

Det er mulig å produsere et fusjonsprotein omfattende modifisert gresspollen-allergen eller et fragment derav eller et derivat derav og en aminosyresekvens fra et annet peptid eller protein, idet eksempler på sistnevnte er enzymer så som p-galaktosidase, fosfatase, urease og lignende. De fleste fusjonsproteiner blir dannet ved ekspresjon av et rekombinant gen hvor to kodende sekvenser er bundet sammen slik at deres leserammer er i fase. Alternativt kan proteiner eller peptider være bundet in vitro ved kjemiske midler. Alle slike fusjonsproteiner eller hybride genetiske derivater av et gresspollen-allergen eller dets kodende nukleotidsekvenser er omfattet av foreliggende oppfinnelse. Videre skal homologer og derivater av et gresspollen-allergenprotein omfatte syntetiske derivater derav. Nukleotidsekvensene som belyst her, kan anvendes for kjemisk å syntetisere hele proteinet eller generere hvilket som helst antall fragmenter (peptider) ved kjemisk syntese ved velkjente metoder (f.eks. fastfase-syntese). Følgelig omfatter foreliggende oppfinnelse isolerte modifiserte gresspollen-allergen familiemedlemmer, fragmenter derav og deres derivater, homologer og immunologiske slektninger fremstilt ved rekombinante metoder eller ved kjemisk syntese.

Betegnelsene "isolert" og "renset" blir anvendt om hverandre her og refererer til peptider, proteiner, protein-fragmenter og nukleinsyresekvenser hovedsakelig fri for cellulært materiale eller dyrkningsmedium når produsert ved rekombinante DNA-teknikker eller kjemiske forløpere eller andre kjemikalier når syntetisert kjemisk. Betegnelsen "naturlig forekommende" som anvendt her angir proteiner eller fragmenter derav renset fra gresspollen eller annen plantedel. Den omfatter også referanse til en aminosyresekvens bestemt ved en cDNA-sekvens, men som er forbundet med allergiske lidelser på lignende måte som et allergen renset fra gresspollen.

Fragmenter av nukleinsyremolekyler innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse omfatter de som koder for deler av gresspollen-allergener som viser T-celle antigenisitet, men som mangler eller oppviser redusert IgE-interaksjon hos pattedyr, fortrinnsvis mennesker.

Fragmenter og mutanter av rekombinante eller syntetisk produserte modifiserte gresspollen-allergener som ikke binder IgE og/eller som har minimal IgE-interagerende evne og/eller som har minimal kapasitet til å stimulere IgE-produksjon er ønskelig. Det er foretrukket at slik minimal IgE-interagerende aktivitet ikke fører til histamin-frigjøring. For eksempel er det foretrukket at det modifiserte allergenet ikke forårsaker kryssbinding av IgE på mastceller eller basofiler. Minimal IgE-interagerende aktivitet angir IgE-interaksjonsaktivitet som er mindre enn mengden av IgE-interaksjon med rekombinante eller syntetisk produserte "naturlig forekommende" gresspollen-allergen-protein eller helt renset nativt gresspollen-allergen. IgE-interaksjon kan også måles som IgE-produksjons-stimulerende aktivitet. Foretrukne fragmenter omfatter også antigen-fragmenter som, når administrert til et gresspollen-sensitivt individ eller et individ allergisk for et allergen kryss-reaktivt med gresspollen-allergen, kan modifisere den allergiske responsen på gresspollen-allerget hos individet.

Antigen-fragmenter heri som har T-celle-stimulerende aktivitet dvs. T-celle antigenisitet og således omfatter minst én T-celle-epitop er spesielt ønskelig. T-celle-epitoper er antatt å medvirke til initiering og opprettholdelse av immunresponsen på et protein-allergen som er ansvarlig for de kliniske symptomene på allergi. Disse T-celle-epitoper er antatt å utløse tidlige hendelser på nivået av T-hjelpercelle ved å binde til et passende HLA-molekyl på overflaten av en antigenpresenterende celle og stimulere den relevante T-celle sub-populasjon. Disse hendelser fører til T-celleproliferasjon, lymfokin-sekresjon, lokale inflammatoriske reaksjoner, rekruttering av ytterligere immuncellertil stedet og aktivering av B-celle-kaskaden, hvilket fører til produksjon av antistoffer. Én isotype av disse antistoffer, IgE, er fundamentalt viktig for utvikling av allergiske symptomer og dens produksjon blir påvirket tidlig i kaskaden av hendelser, på nivået av T-hjelpercelle, av typen av lymfokinene utskilt. En T-celle-epitop er det basiske element eller minste enhet av gjenkjennelse av en T-celle-reseptor, hvor epitopen omfatter aminosyrer essensielle for reseptor-gjenkjennelse. Aminosyresekvenser som etterligner de til T-celle-epitoper og som modifiserer den allergiske responsen på protein-allergener er beskrevet heri.

Eksponering av pasienter for rensede modifiserte protein-allergener ifølge foreliggende oppfinnelse eller for antigene fragmenter ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter minst én T-celle-epitop og er avledet fra protein-allergener kan tolerere eller anergisere passende T-celle subpopulasjoner slik at de blir ikke-responsive for protein-allergenet og ikke deltar i stimulering av en immunrespons etter slik eksponering. I tillegg kan administrering av protein-allergenet ifølge foreliggende oppfinnelse eller et antigent fragment ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter minst én T-celle-epitop, modifisere den lymfokine sekresjonsprofil sammenlignet med eksponering for det naturlig forekommende protein-allergen eller del derav (f.eks. resultere i en reduksjon av IL-4 og/eller en økning i IL-2). Videre kan eksponering for slikt antigent fragment eller protein-allergen innvirke på T-celle subpopulasjoner som normalt deltar i responsen på allergenet slik at disse T-celler blir trukket vekk fra stedet (stedene) for normal eksponering for allergenet (f.eks. nasal mukosa, hud og lunge) mot stedet (stedene) for terapeutisk administrering av fragmentet eller protein-allergenet. Denne redistribusjon av T-celle sub-populasjoner kan forbedre eller redusere evnen til et individs immunsystem til å stimulere den vanlige immunrespons på stedet for normal eksponering for allergenet, hvilket resulterer i en reduksjon i allergiske symptomer.

Det er mulig å tilveiebringe ekspresjonsvektorer og vertsceller omdannet til å uttrykke nukleinsyresekvensene heri. Ekspresjonsvektorer omfatter en nukleinsyresekvens som koder for et modifisert gresspollen-allergen eller et antigent fragment derav eller et derivat eller en homolog derav eller den funksjonelle ekvivalent av en slik nukleinsyresekvens. Nukleinsyresekvensene kan uttrykkes i prokaryote eller eukariote vertsceller. Egnede vertsceller omfatter bakterieceller så som E. coli, insektceller, gjær eller pattedyrceller så som Kinesisk hamster eggstokk-celler (CHO). Egnede ekspresjonsvektorer, promotere, enhancere og andre ekspresjonskontroll-elementer kan finnes i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Egnede vektorer for ekspresjon i gjær omfatter YepSed (Baldari et al., EMBO J. 6:229-234, 1987); pMF (Kurjan og Herskowtiz, Cell 30: 933-943, 1982); og JRY88 (Schultz et al., Gene 54:113-123, 1987).

Vertsceller kan transformeres til å uttrykke nukleinsyresekvensene heri ved anvendelse av konvensjonelle teknikker så som kalsiumfosfat- eller kalsiumklorid-medutfelling, DEAE-dekstran-mediert transfeksjon eller elektroporering. Egnede metoder for transformering av vertscellene kan finnes i Sambrook etal. L 1989, supra og andre laboratorie- lærebøker. Nukleinsyresekvensene heri kan også syntetiseres ved anvendelse av standard teknikker.

En metode for å produsere et rekombinant modifisert gress-allergen eller et fragment derav eller et derivat eller homolog derav eller immunologiske slektninger derav omfatter dyrkning av en organisme inneholdende et replikerbart rekombinant DNA-molekyl, hvor nevnte molekyl omfatteren promoter som er i stand til ekspresjon i nevnte organisme, et gen som koder for et modifisert gresspollen-allergen eller familiemedlem, et fragment eller homolog eller derivat derav eller en immunologisk slektning derav, lokalisert nedstrøms for og transkribert fra nevnte promoter, en selekterbar markør og en DNA-konstituent inneholdende prokaryot eller eukariot replikasjonsorigo, under betingelser og i en tid tilstrekkelig for nevnte rekombinante DNA-molekyl til å bli holdt stabilt og styre syntesen av det modifiserte gresspollen-allergen eller fragment eller derivat, homolog eller immunologisk slektning derav og deretter eventuelt isolering av dette.

Gresspollen-allergener og fragmenter (peptider) derav kan renses fra celle-dyrkningsmedium, vertsceller eller begge ved anvendelse av teknikker kjent på området for rensning av peptider og proteiner, omfattende ionebytting-kromatografi, gelfiltrering-kromatografi, ultrafiltrering, elektroforese og immunorensning med antistoffer spesifikke for det modifiserte gresspollen-allergen. Betegnelsene "isolert" og "renset" blir anvendt om hverandre her og refererer til peptider, proteiner, proteinfragmenter og nukleinsyresekvenser hovedsakelig fri for cellulært materiale eller dyrkningsmedium når produsert ved rekombinante DNA-teknikker eller kjemiske forløpere eller andre kjemikalier når syntetisert kjemisk.

Således tilveiebringer foreliggende oppfinnelse modifiserte gresspollen-allergener eller deres derivater som, når administrert til et gresspollen-sensitivt individ, reduserer den allergiske responsen til individet mot gresspollen så som raigresspollen eller pollen fra immunologisk beslektet gress. Foretrukne, modifiserte gresspollen-allergener omfatter modifisert Loi p5 protein eller et derivat eller homolog derav. Andre foretrukne allergener er Phi p 5 og Poa p 5.

I tillegg til å innføre en amino-substitusjon, addisjon og/eller delesjon eller trunkering, er et annet eksempel på en modifikasjon av proteiner eller peptider substitusjon av cysteinrester fortrinnsvis med alanin, serin, treonin, leucin eller glutaminsyre for å minimalisere dimerisering via disuifidbindinger. Et annet eksempel på modifikasjon av proteinene og peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er ved kjemisk modifikasjon av aminosyre-sidekjeder eller cyklisering av peptidet.

For å forbedre stabilitet og/eller reaktivitet kan proteiner eller peptider ifølge foreliggende oppfinnelse også modifiseres for å innføre én eller flere polymorfier i aminosyresekvensen av protein-allergenet som er et resultat av naturlig allelisk variasjon. I tillegg kan D-aminosyrer, ikke-naturlige aminosyrer eller ikke-aminosyre-analoger være substituert eller addert for å produsere et modifisert protein eller peptid innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

Rekombinante vektorer omfattende DNA-sekvenser som koder for proteiner som oppviser modifisert allergen aktivitet fra pollen fra gressarter kan dannes. Mer spesielt tilhører gressartene familien Poaceae ( Gramineae) og enda mer spesielt, til slekten Lolium. Enda mer spesielt er det allergene proteinkarakterisertsom immunologisk kryss-reaktivt med antistoff til Loi plb protein av Lolium perenne-pollen, nemlig:

Pooid (festucoid) gress. Gruppe 1: Triticanea: Bromus inermis,

bladfaks; Agropyron repens, kveke; A. cristatum; Secale cereale rug; Triticum aestivum, hvete. Gruppe 2: Poanae: Dactylis glomerata, flerårig hundegress; L. multiflorum, italiensk raigress; Poa pratensis, engrapp; P. compressa, flatt plengress;

Avena sativa, havre; Holcus lanatus, fløyelsgress eller

Yorkshire fog; Anthoxanthum odoratum; gulaks; Arrhenatherum

elatius, hestehavre; Agrostis alba, rødtopp; Phleum pratense,

timotei; Phalaris arundinacea, strandrør. Panicoid gress,

Paspalum notatum, Bahia-gress, Andropogonoid-gress:

Sorghum halepensis, Johnson-gress.

En rekke ekspresjonsvektorer kan konstrueres for fremstilling av et modifisert gresspollen-allergen eller et fragment eller derivat derav.

Monoklonale og polyklonale antistoffer mot modifiserte gresspollen-allergener eller fragmenter, derivater eller homologer derav kan dannes.

De monoklonale antistoffene er anvendelige for screening av cDNA-biblioteker eller for rensing av rekombinant produserte proteiner eller til og med for terapi for å redusere aktiviteten til et innført protein. I den følgende omtale omfatter referanse til gresspollen protein-allergener deres derivater, homologer og immunologiske slektninger og kjemisk syntetiske derivater derav. Den følgende omtale omfatter også antistoffer spesifikke for renset modifisert Loi p 5 og fragmenter, derivater og homologer derav. Slike antistoffer er antatt å være anvendelige for utvikling av deteksjonsforsøk (immunoanalyser) for modifiserte gresspollen-allergener spesielt under overvåkning av et terapeutisk eller diagnostisk regime og for rensingen av rekombinante eller syntetisk produserte gresspollen-familiemedlemmer og spesielt gruppe 5 gresspollen-allergen. Antistoffene kan være monoklonale eller polyklonale. Det er mulig å innkludere hvilke som helst andre antistoffer (monoklonale eller polyklonale) rettet mot de første antistoffer beskrevet ovenfor. Det er mulig å anvende disse første eller andre antistoffer i deteksjonsforsøk og for eksempel ved overvåkning av effekten av et diagnostisk eller et administrert farmasøytisk preparat. Det er mulig å inkludere antistoffer til hvilke som helst molekyler komplekser! med et modifisert gresspollen-proteinallergen. Følgelig omfatter et antistoff til et gresspollen- proteinallergen antistoffer til et slikt proteinallergen eller antigene deler derav og til hvilke som helst assosierte molekyler (f.eks. lipid-regioner, bærer-molekyler, kondenserte proteiner og lignende).

Gresspollen-familiemedlemmer eller fragmenter derav, betraktet her blir renset og deretter anvendt i antistoff-produksjon. Både polyklonale og monoklonale antistoffer kan oppnås ved immunisering med rekombinante eller syntetisk modifiserte gresspollen-protein-familiemedlemmer og begge typer er anvendbare for immunoanalyser. Metodene for å oppnå begge typer av sera er velkjent på området. Polyklonale sera er mindre foretrukket, men blir relativt lett fremstilt ved injeksjon i et egnet laboratoriedyr av en effektiv mengde av et renset modifisert gresspollen-allergen eller antigene deler derav, oppsamling av serum fra dyret og isolering av spesifikke sera ved hvilken som helst kjente immunoabsorbent-teknikker. Selv om antistoffer produsert ved denne metoden er anvendbare i praktisk talt hvilken som helst type av immunoassay, er de generelt mindre favorisert på grunn av potensiell heterogenitet av produktet.

Anvendelse av monoklonale antistoffer i en immunoassay er spesielt foretrukket på grunn av muligheten til å produsere dem i store mengder og homogeniteten av produktet. Fremstilling av hybridom-cellelinjerfor monoklonal antistoff-produksjon utledet ved kondensering av en udødelig cellelinje og lymfocytter sensibilisert mot immunogen-preparatet kan utføres ved teknikker som er velkjent for fagfolk på området, (se for eksempel Kohler og Milstein, Nature 256:495-499, 1975; Kohler og Milsten, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976).

I motsetning til fremstilling av polyklonale sera er valget av dyr avhengig av tilgjengeligheten av passende udødelige linjer som er i stand til å kondensere med lymfocytter. Mus og rotte er de valgte dyrene innen hybridom-teknologi og blir fortrinnsvis anvendt. Mennesker kan også anvendes som kilder for sensibiliserte lymfocytter hvis passende immortaliserte humane (eller ikke-humane) cellelinjer er tilgjengelig. For formålet ifølge foreliggende oppfinnelse kan det valgte dyret injiseres med fra ca. 0,1 mg til ca. 20 mg renset modifisert gresspollen-allergen eller deler derav. Vanligvis blir injeksjonsmaterialet emulgert i Freund's complete adjuvans. Boosting-injeksjoner kan også være nødvendig. Deteksjon av antistoff-produksjon kan utføres ved testing av antisera med passende merket antigen. Lymfocytter kan oppnås ved å fjerne milten eller lymfeknutene til sensibiliserte dyr på en steril måte og utføre fusjon. Alternativt kan lymfocytter stimuleres eller immuniseres in vitro.

Tilstedeværelse av modifiserte gresspollen-allergener omfattet her eller antistoffer spesifikke for disse, i en pasients serum, plante- eller pattedyrvev eller vevekstrakt, kan detekteres ved anvendelse av antistoffer fremstilt som ovenfor, enten monoklonale eller polyklonale, i praktisk talt hvilken som helst type immunoassay. Et bredt område av immunoassay-teknikker er tilgjengelig som det kan sees ved referanse til U.S. patent nr. 4,015,043, 4,424,279 og 4,018,653. Dette omfatter både enkel-sete og to-sete eller "sandwich", forsøk av ikke-kompetitive typer, så vel som i de tradisjonelle kompetitive bindingsforsøk. Sandwich-forsøk er blant de mest anvendelige og vanlig anvendte forsøk og er favorisert for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse. Flere variasjoner av sandwich-forsøksteknikk eksisterer og alle skal omfattes av foreliggende oppfinnelse. Kort angitt, i et typisk forover forsøk, blir et umerket antistoff im mobilisert i et fast substrat og prøven som skal testes bragt i kontakt med det bundede molekyl. Etter en egnet inkuberingsperiode, i et tidsrom tilstrekkelig til å tillate dannelse av et antistoff-antigen sekundært kompleks, blir et andre antistoff, merket med et rapportørmolekyl som er i stand til å produsere et detekterbart signal, deretter tilsatt og inkubert, i et tidsrom tilstrekkelig for dannelse av et tertiært kompleks av antistoff-antigen-merket antistoff (f.eks. antistoff-modifisert gresspollen-allergen-protein-antistoff). Eventuelt uomsatt materiale blir vasket vekk og tilstedeværelse av antigenet blir bestemt ved observasjon av et signal produsert av rapportørmolekylet. Resultatene kan enten være kvalitative, ved enkel observasjon av det synlige signalet eller kan kvantifiseres ved å sammenligne med en kontrollprøve inneholdende kjente mengder av hapten. Variasjoner av forover-forsøk omfatter et samtidig forsøk, hvor både prøve og merket antistoff blir tilsatt samtidig til det bundede antistoffet eller et revers-forsøk hvor det merkede antistoffet og prøve som skal testes først blir kombinert, inkubert og deretter tilsatt samtidig til det bundede antistoffet. Disse teknikker er velkjent for fagfolk på området, omfattende hvilke som helst mindre variasjoner som klart vil være åpenbare.

Selv om den følgende omtale angår detektering av modifisert gresspollen-allergen, er den like anvendbar for detektering av antistoffer for samme og det skal være en tilstrekkelig beskrivelse derav.

I et typisk forover sandwich-forsøk blir et første antistoff som har spesifisitet for modifisert gresspollen-allergen eller antigene deler derav, enten kovalent eller passivt bundet til en fast overflate. Den faste overflaten er typisk glass eller en polymer, idet de vanligst anvendte polymerer er cellulose, polyakrylamid, nylon, polystyren, polyvinylklorid eller polypropylen. De faste bærerene kan være i form av rør, kuler, skiver av mikroplater eller hvilken som helst annen overflate egnet for utførelse av en immunoassay. Bindingsprosessene er velkjente på området og består generelt av kryssbinding, kovalent binding eller fysisk adsorbering, polymer-antistoff-komplekset blir vasket ved preparering for testprøven. En aliquot av prøven som skal testes blir deretter satt til fastfase-komplekset og inkubert fra omkring romtemperatur til ca. 37°C i et tidsrom tilstrekkelig til å tillate binding av hvilken som helst subenhet til stede i antistoffet. Inkuberingsperioden vil variere, men vil generelt være i området ca. 2-40 minutter eller natten over hvis mer hensiktsmessig. Etter inkuberingsperioden blir antistoff-subenhet-fastfase vasket og tørket og inkubert med et andre antistoff spesifikt for en del av haptenet. Det andre antistoffet er bundet til et rapportørmolekyl som blir anvendt for å indikere bindingen av det andre antistoffet til haptenet.

Med "rapportørmolekyl" som anvendt i foreliggende beskrivelse, menes et molekyl som ved dets kjemiske natur, tilveiebringer et analytisk identifiserbart signal som tillater deteksjon av antigen-bundet antistoff. Deteksjonen kan være enten kvalitativ eller kvantitativ. De vanligst anvendte rapportørmolekyler i denne type forsøk er enten enzymer, fluoroforer eller radionuklid-inneholdende molekyler (dvs. radioisotoper). I tilfellet av et enzym-immunoassay blir et enzym konjugert til det andre antistoff, generelt ved hjelp av glutaraldehyd eller perjodat. Som det lett vil forstås eksisterer imidlertid en rekke forskjellige konjugeringsteknikker, som er lett tilgjengelige for fagfolk. Vanlig anvendte enzymer omfatter pepperrot-peroksydase, glukose-oksydase, p-galaktosidase og alkalisk fosfatase, blant andre. Substratene som skal anvendes med de spesifikke enzymer er generelt valgt for produksjon, etter hydrolyse med det tilsvarende enzym, av en detekterbar fargeforandring. For eksempel er p-nitrofenylfosfat egnet for anvendelse med alkaliske fosfatase-konjugater, for peroksydase-konjugater, er 1,2-fenylendiamin, 5-aminosalicylsyre eller toluidin vanlig anvendt. Det er også mulig å anvende fluorogene substrater, som gir et fluorescerende produkt heller enn de kromogene substrater angitt ovenfor. I alle tilfeller blir det enzym-merkede antistoff satt til det første antistoff-hapten-kompleks, får binde og deretter blir overskudd av reagens vasket vekk. En løsning inneholdende det passende substrat blir deretter satt til det tertiære komplekset av antistoff-antigen-antistoff. Substratet vil reagere med enzymet bundet til det andre antistoff, hvilket gir et kvalitativt visuelt signal, som videre kan kvantifiseres, vanligvis spektrofotometrisk, for å gi en indikasjon på mengden av hapten som var til stede i prøven. "Rapportørmolekyl" omfatter også anvendelse av celle-agglutinering eller hemning av agglutinering så som røde blodceller eller lateks-kuler og lignende.

Alternativt kan fluorescerende forbindelser, så som fluorescein og rhodamin, være kjemisk koblet til antistoffer uten endring av deres bindingskapasitet. Når aktivert ved illuminasjon med lys med en spesiell bølgelengde, adsorberer det fluorokrom-merkede antistoff lysenergien, som fremkaller en tilstand av eksitabilitet i molekylet, fulgt av emisjon av lyset med en karakteristisk farge visuelt detekterbar med et lysmikroskop. Som i EIA får det fluorescerende merkede antistoff binde til det første antistoff-hapten-kompleks. Etter awasking av ubundet reagens, blir det gjenværende tertiære kompleks deretter eksponert for lyset med den passende bølgelengde, fluorescein observert indikerer tilstedeværelse av haptenet av interesse. Immunofluorescens- og EIA-teknikker er begge meget veletablerte på området og er spesielt foretrukket for foreliggende metode. Imidlertid kan andre rapportørmolekyler, så som radioisotope, kjemilluminescente eller bioluminescente molekyler også anvendes. Det vil lett være klart for en fagmann hvorledes variere metoden for å passe til det aktuelle formål. Det vil også være klart at det foregående kan anvendes for å detektere direkte eller indirekte (dvs. via antistoffer) gresspollen-allergenproteinene heri.

Det er mulig med en metode for detektering av et modifisert pollenallergen eller et derivat eller en homolog derav eller et allergent protein immunologisk reaktivt med nevnte modifiserte gresspollen-allergen eller et derivat eller homolog til stede i serum, vevekstrakt, planteekstrakt eller annen biologisk væske eller preparat, omfattende trinnene å kontakte nevnte væske eller preparat som skal testes, med et antistoff til nevnte modifiserte gresspollen-proteinallergen i en tid og under betingelser tilstrekkelig til at et modifisert allergent protein-antistoff-kompleks blir dannet og underkaste nevnte kompleks for en detekteringsmetode. For rensningsmetoder kan et antistoff til et nativt allergen også være effektivt for å rense et modifisert allergen.

Det er mulig å tilveiebringe et sett for raske og hensiktsmessige forsøk for antistoffer til modifiserte gresspollen-allergener eller derivater, homologer eller immunologiske slektninger derav i pattedyr-kroppsvæsker, f.eks. serum, vevekstrakter, vevfluider), in vitro cellekultur supernatanter og cellelysater. Settet er delt i rom for å motta en første beholder tilpasset for å inneholde en antigen-komponent derav og en andre beholder tilpasset for å inneholde et antistoff til gresspollen-allergenet, idet nevnte antistoff er merket med et rapportørmolekyl som er i stand til å gi et detekterbar! signal. Hvis rapportørmolekylet er et enzym, da blir en tredje beholder tilpasset for å inneholde et substrat for nevnte enzym inkludert. I en eksemplifisert anvendelse av foreliggende sett blir en prøve som skal testes bragt i kontakt med innholdet av den første beholder i en tid og under betingelser for at et antistoff, hvis til stede i prøven, binder til gresspollen-allergenet i nevnte første beholder.

På grunn av tilstedeværelse av allergener i omgivelsene, fortsetter høyfeber og sesongmessig astma å ha betydelig sykdoms- og sosio-økonomisk innvirkning på vestlige samfunn, til tross for fremskritt gjort i deres farmakologi og immunologi. Mens det tilgjengelige spektrum av medikamenter, omfattende antihistaminer og steroider har resultert i forbedring ved behandling av allergisk sykdom, harde uheldige bivirkninger forbundet med langvarig anvendelse. På grunn av disse problemer er fornyet interesse vist for immunoterapi av allergisk sykdom. Immunoterapi involverer injeksjon av kraftige allergen-ekstrakterforå desensibilisere pasienter mot allergiske reaksjoner. Uheldigvis er pollen-preparater anvendt som allergener polyvalente og av dårlig kvalitet. Følgelig er konsentrasjoner anvendt ofte høye for å fremkalle IgG-responser, men kan være dødelige gjennom trigging av systemiske reaksjoner, omfattende anafylaksi. Det klonede genprodukt eller de syntetiske peptider basert på sekvensen av allergener tilveiebringer et sikrere medium for terapi siden det kan kvalitetskontrolleres, karakteriseres og standardiseres.

Det er mulig å desensibilisere et pattedyr (f.eks. menneske) allergisk mot gresspollen ved administrering til nevnte pattedyr av en desensibiliserings-effektiv mengde av et modifisert gresspollen-allergen som mangler eller omfatter reduserte antall av og/eller oppviser redusert IgE-bindingsaktivitet og/eller oppviser redusert IgE produksjons-stimulerende aktivitet eller et fragment eller derivat, homolog eller immunologisk slektning derav, i en tid og under betingelser tilstrekkelige til å bevirke desensibilisering av pattedyret (f.eks. menneske) for gresspollen.

Det er videre mulig å behandle sensitivitet til raigresspollen eller pollen fra en immunologisk slektning av raigress hos et pattedyr (f.eks. menneske) sensitivt for slik pollen, ved administrering til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av et terapeutisk preparat ifølge foreliggende oppfinnelse. Det er videre mulig å behandle sensitivitet for raigresspollen-allergen eller et allergen immunologisk kryss-reaktivt med raigresspollen-allergen ved administrering til et pattedyr av en terapeutisk effektiv mengde av nevnte preparat ifølge foreliggende oppfinnelse.

Gjennom anvendelse av peptidene og proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse, kan preparater med konsistent, veldefinert sammensetning og biologisk aktivitet fremstilles og administreres for terapeutiske formål (f.eks. for å modifisere den allergiske responsen til et L. perenne sensitivt individ for pollen fra en slik plante. Administrering av slike peptider eller protein kan for eksempel modifisere IgE-respons på gresspollen-allergenet. Rensede peptider kan også anvendes for å undersøke mekanismen ved immunoterapi av L perenne allergi og for å utforme modifiserte derivater eller analoger anvendelige i immunoterapi.

Foreliggende oppfinnelse er derfor rettet mot anvendelse av et modifisert allergen ved fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av allergen-sensitive individer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor et farmasøytisk preparat omfattende en desensibiliserende eller terapeutisk effektiv mengde av modifisert gresspollen-allergen og spesielt gruppe 5 gresspollen-allergen eller derivater, homologer eller immunologiske slektninger derav og én eller flere farmasøytisk akseptable bærere og/eller fortynningsmidler. De aktive bestanddelene av et farmasøytisk preparat omfattende det modifiserte gresspollen-allergen er profylaktisk antatt å vise utmerket terapi eller aktivitet, for eksempel ved desensibilisering av mennesker allergiske for gresspollen når administrert i en mengde som avhenger av det spesielle tilfellet. For eksempel kan fra ca. 0,5 Fg til ca. 20 mg pr. kg. kroppsvekt pr. dag administreres. Dose-regimet kan reguleres for å gi den optimale terapeutiske respons. Foreksempel kan mange oppdelte doser administreres daglig eller dosen kan være proporsjonalt redusert som indikert ved behovet ved den terapeutiske situasjonen. Den aktive forbindelsen kan administreres på en hensiktsmessig måte så som oralt, intravenøst (når vannoppløselig), intramuskulært, subkutant, intranasalt, intradermalt eller ved suppositorium eller implantering (f.eks. ved anvendelse av molekyler med langsom frigjøring). Avhengig av administreringsveien kan de aktive bestanddelene som omfatter det farmasøytiske preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse måtte belegges med et materiale for å beskytte nevnte bestanddeler fra virkningen av enzymer, syrer og andre naturlige betingelser som kan inaktivere nevnte bestanddeler. For eksempel kan det modifiserte gresspollen-allergen administreres i et adjuvans, samadministreres med enzym-inhibitorer eller i liposomer. Adjuvans blir anvendt i den bredeste forstand og omfatter hvilken som helst immun-stimulerende forbindelse, så som interferon. Adjuvantia påtenkt her omfatter resorcinoler, ikke-ioniske overflateaktive midler så som polyoksyetylen-oleyleter og n-heksadecyl-polyetylen-eter. Enzyminhibitorer omfatter pankreatisk trypsin. Liposomer omfatter vann-i-olje-i-vann CF emulsjoner så vel som konvensjonelle liposomer. For formålet å fremkalle T-celle anergi, blir det farmasøytiske preparatet fortrinnsvis administrert i ikke-immunogen form (f.eks.inneholder det ikke adjuvans).

De aktive forbindelser kan også administreres parenteralt eller intraperitonealt. Dispersjoner kan også fremstilles i glycerol, flytende polyetylenglykoler og blandinger derav og i oljer. Under vanlige lagringsbetingelser og anvendelse inneholder disse preparater et konserveringsmiddel for å forhindre veksten av mikroorganismer.

De farmasøytiske formene egnet for injiserbar anvendelse omfatter sterile vandige løsninger (når vannoppløselige) eller dispersjoner eller sterile pulvere for fremstilling av injiserbare løsninger. I alle tilfeller må formen være steril og må være flytende i den grad at lett sprøytbarhet eksisterer. Den må være stabil under betingelsene for fremstilling og lagring og må konserveres mot forurensende virkning av mikroorganismer så som bakterier og sopper. Bæreren kan være et løsningsmiddel eller dispersjonsmedium inneholdende, for eksempel vann, etanol, polyol (for eksempel glycerol, propylen-glykol og flytende polyetylenglykol og lignende), egnede blandinger derav og vegetabilske oljer. Riktig fluiditet kan for eksempel holdes ved anvendelse av et belegg så som lecitin, ved opprettholdelse av den nødvendige partikkelstørrelse i tilfellet av dispersjon og ved anvendelse av overflateaktive midler. Forhindring av virkningen av mikroorganismer kan gjøres med forskjellige antibakterielle og antifungale midler, foreksempel parabener, klorbutanol, fenol, sorbinsyre, thimerosal og lignende. I mange tilfeller vil det være foretrukket å inkludere isotoniske midler, for eksempel sukkere eller natriumklorid. Forlenget absorpsjon av de injiserbare preparater kan frembringes ved anvendelse i preparatene av midler som forsinker absorpsjon, for eksempel aluminium-monostearat og gelatin.

Sterile injiserbare løsninger blir fremstilt ved å innføre de aktive forbindelser i den nødvendige mengden i det passende løsningsmiddel med forskjellige av de andre bestanddeler oppregnet ovenfor, som nødvendig, fulgt av filter-sterilisering. Generelt blir dispersjoner fremstilt ved å innføre de forskjellige steriliserte aktive bestanddeler i en steril bærer som inneholder det basiske dispersjonsmedium og de nødvendige andre bestanddeler fra de oppregnet ovenfor. I tilfellet av sterile pulvere for fremstilling av sterile injiserbare løsninger, er de foretrukne fremstillingsmetoder vakuumtørkings- og frysetørkings-teknikk som gir et pulver av den aktive bestanddel pluss hvilken som helst ytterligere ønsket bestanddel fra tidligere steril-filtrert løsning derav.

Når et modifisert gresspollen-allergen eller et fragment derav er hensiktsmessig beskyttet som beskrevet ovenfor, kan den aktive forbindelsen administreres oralt, foreksempel med et inertfortynningsmiddel eller med en assimilerbar spiselig bærer eller den kan innelukkes i gelatinkapsler med hardt eller mykt skall eller den kan komprimeres til tabletter eller den kan inntas direkte med mat i kostholdet. For oral terapeutisk administrering kan den aktive forbindelsen innføres i tilsetningsmidler og anvendes i form av svelgbare tabletter, buckale tabletter, trocher, kapsler, eliksirer, suspensjoner, siruper, kjeks og lignende. Slik formuleringer og preparater bør inneholder minst 1 vekt% av aktiv forbindelse. Prosentdelen av formuleringene og preparatene kan selvfølgelig varieres og kan hensiktsmessig være mellom ca. 5 til 80% av vekten til enheten. Mengden av aktiv forbindelse i slike terapeutisk anvendelige preparater er slik at en egnet dose vil oppnås. Foretrukne formuleringer eller preparater ifølge foreliggende oppfinnelse blir fremstilt slik at en oral doseenhetsform inneholder mellom ca. 10 Fg og 2000 mg aktiv forbindelse. Tabletter, trocher, piller, kapsler og lignende kan også inneholde bestanddelene listet opp nedenfor: Et bindemiddel så som gummi tragant, akasie, maisstivelse eller gelatin; tilsetningsmidler så som dikalsiumfosfat; et desintegreringsmiddel så som maisstivelse, potetstivelse, alginsyre og lignende; et smøremiddel så som magnesiumstearat; og et søtningsmiddel så som sukrose, laktose eller sakkarin kan tilsettes eller et smaksgivende middel så som peppermynte, vintergrønnolje eller kirsebærsmak. Når doseenhetsformen er en kapsel kan den inneholde, i tillegg til materialer av typen ovenfor, en flytende bærer. Forskjellige andre materialer kan være til stede som belegg eller for på annen måte å modifisere den fysiske formen av doseenheten. For eksempel kan tabletter, piller eller kapsler belegges med skjellakk, sukker eller begge. En sirup eller eliksir kan inneholde den aktive forbindelsen, sukrose som et søtningsmiddel, metyl og propylparabener som konserveringsmidler, et fargemiddel og smaksmiddel så som kirsebær- eller appelsinsmak. Selvfølgelig må hvilket som helst materiale anvendes for fremstilling av hvilken som helst doseenhetsform være farmasøytisk ren og hovedsakelig ikke-toksisk i de anvendte mengdene. I tillegg kan den aktive forbindelsen innføres i formuleringer og preparater med forlenget frigjøring.

Som anvendt her omfatter "farmasøytisk akseptabel bærer og/eller fortynningsmiddel" hvilke som helst og alle løsningsmidler, dispersjonsmedier, belegg, antibakterielle og antifungale midler, isotoniske og absorpsjonsforsinkende midler og lignende. Anvendelse av slike medier og midler for farmasøytisk aktive substanser er velkjent på området. Bortsett fra hvis hvilke som helst konvensjonelle medier eller midler er inkompatible med den aktive bestanddel, omfattes anvendelse derav i de terapeutiske preparatene. Supplerende aktive bestanddeler kan også innføres i preparatene.

Foreliggende oppfinnelse er ytterligere beskrevet i de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Dannelse av Loi p 5 mutant- proteiner

For å konstruere hypoallergene, ikke-lgE-reaktive allergen-varianter, var det nødvendig å bestemme hvorvidt nøkkelrestene i proteinene kan velges for endring mens den generelle struktur og T-celle-epitoper holdes intakt. Siden den høyeste hyppighet av IgE-binding er observert i peptid-fragmenter som spenner over den C-terminale halvparten av Loi p 5, innførte oppfinnerene mutasjoner overveiende i C-terminus av allergenet. For å identifisere aminosyre-posisjoner i Loi p 5 sannsynlige å ha en innvirkning på IgE-interaktivitet til proteinet, ble proteinsekvenser av isoform A og B av Loi p 5 sammenlignet med gruppe 5 allergener fra andre gress (Figur 1). Setedirigert mutagenese ble anvendt for å erstatte rester som er meget konservert blant gruppe 5 allergener (Figur 2). Mutant-proteiner endret i ett eller tre domener ble dannet (Figur 3).

Ikke-mutert Loi p 5 og muterte varianter av Loi p 5 ble uttrykt i oppløselige former i E coli ved anvendelse av pQE ekspresjonsvektorsystem (Qiagen). Bakteriell ekspresjon (se nedenfor) av proteiner ved anvendelse av denne vektor innfører et polyhistidin-merke ved N-terminus av molekylene som er anvendelige for rensning av rekombinante proteiner med ett-trinn metallchelat affinitetskromatografi. Ikke-mutert kontroll og muterte proteiner ble deretter testet for IgE-reaktivitet så vel som for reaktivitet med anti-Lol p 5 monoklonalt antistoff A7 (Mab A7) og polyklonalt anti-Lol p 5 antiserum i slot blot (Figur 5), Western blot (Figur 6) og ELISA forsøk (Figur 7). Resultatene viste en vesentlig reduksjon i IgE-bindingsaktivitet i tilfellet av mange av de muterte proteiner (f.eks. mut 4, mut 6, mut 9). Slike konstruerte allergene molekyler er potensielt anvendelige for sikrere og mer effektiv immunoterapi for type I allergiske sykdommer og den beskrevne metode kan generelt anvendes for å produsere ikke-lgE reaktive varianter av allergener.

EKSEMPEL 2

Ekspresjon og rensning av rekombinant Loi p 5 og mutant- proteiner

De kodende sekvensene av Loi p 5 og mutant-proteiner ble innført i-ramme i ekspresjonsvektoren pQE31 (QIAGEN). Vektoren tillater ekspresjon av rekombinante proteiner med et N-terminalt, 6-rest histidin-merke. Ekspresjon og høsting av proteinene ble utført som beskrevet i QIA expressionist manual. Histidin-merkede proteiner ble renset ved anvendelse av TALON metallaffinitet-harpiks (Clontech) ved å følge metoden for batch/gravitasjonsstrøm kolonnerensning som beskrevet i TALON Metal Affinity Resin brukermanual (Clontech).

EKSEMPEL 3

SDS- page og Western blotting

For SDS-PAGE ble 1,3 Fg av Loi p5 og hvert av mutant-proteinene kokt i 5 minutter med 10 x proteinprøvebuffer. Prøver ble lastet på en 15% vekt/volum akrylamid minigel ved 200 V i 40 minutter i en buffer av 0,2 M glycin, 0,025 M Tris, 0,1% vekt/volum SDS.

For merking ble geler ristet i 0,1% vekt/volum Coomassie Brilliant Blue R250 i minst en time. Geler ble avfarget i 20% volum/volum metanol, 7% volum/volum iseddik, 3% volum/volum glycerol, natten over med to buffer-byttinger.

Geler ble western blottet i et BIORAD mini-Protean II celle western blot apparat i en buffer av 0,025 M Tris, 0,2 M glycin, 20% volum/volum metanol på Nytran 0,2 Fm nylonmembran (Schleicher & Schuell) ved 100 V i 1 time ved 4°C.

EKSEMPEL 4

Slot blot analyse

For slot blot analyse ble 0,7 Fg av mutant-proteiner og Loi p5 tilsatt til spaltene i et Hybri-Slot manifold slot blot apparat (Life Technologies, Inc.) og blottet på Nytran 0,2 Fm nylonmembran (Schleicher & Schuell) under sug fra et vannvakuum.

EKSEMPEL 5

Inkubering av blot med antistoffer og pasient- sera

Før inkubering med antistoffer eller sera ble alle western og slot blot blokkert i 10% vekt/volum skummetmelk-pulver i PBS (150 mM natriumklorid, 36 mM natriumfosfat monobasisk, monohydrat, 7 mM natriumfosfat dibasisk, dihydrat) i én time med risting. Blottene ble vasket én gang med PBS, 0,5% volum/volum Tween 20, to ganger med PBS og inkubert natten over med monoklonale antistoffer (mAb A7: fortynnet 1:5), polyklonale antistoffer (B1: fortynnet 1:50) eller pasient-sera. Alle fortynninger ble fremstilt i PBS, 0,5% vekt/volum BSA, 0,1% vekt/volum natriumazid og ristet med blottene natten over ved romtemperatur. Etter vasking som ovenfor ble blottene inkubert med alkalisk-fosfatase konjugert anti-mus (mAb A7) eller anti-kanin (B1) sekundære antistoffer (Promega) fortynnet 1:5000 i PBS, 0,5% volum/volum Tween 20, 1% vekt/volum BSA i 1 time med risting ved romtemperatur. Alle blot ble så vasket som ovenfor. Bundet anti-mus og anti-kanin antistoffer ble detektert ved en farge-reaksjon -10 ml alkalisk fosfatase buffer (0,1 M Tris, pH 9,5, 0,1 M natriumklorid, 0,05 M magnesiumklorid) med 66 Fl av BCIP-lager (5% vekt/volum bromklorindolylfosfat i 100% volum/volum dimetylformamid). Blottene inkubert med pasient-sera ble probet med l<125->merket anti-humant antistoff (Bioclone) fortynnet 1:5 i PBS, 0,5% volum/volum Tween 20, 1% vekt/volum BSA (buffer B) natten over med risting ved romtemperatur. Alle blottene ble vasket som ovenfor. Etter vasking ble bundet l<125->merket anti-humant IgE detektert ved å eksponeres for Kodak Biomax MS film ved -70°C.

EKSEMPEL 6

Direkte EUSA

Brønnene av en ELISA plate (Greiner) ble belagt med 50 Fl aliquoter av 100, 500, 1000, 5000 og 10000 ng/ml fortynninger av Loi p5 og de fire mutant-proteiner og inkubert ved 4°C natten over. Brønnene ble deretter vasket fire ganger med PBS, 0,5% volum/volum Tween 20. Etter blokkering med buffer B ved romtemperatur i én time, ble brønnene vasket igjen og inkubert med 50 Fl av en passende fortynning av pasient-sera i buffer B ved 4°C natten over. Brønner ble vasket som ovenfor før inkubering med 50 Fl av en 1:2000 fortynning av anti-humant IgE antistoff (Alkalisk-Fosfatase konjugert: Sigma) i buffer B ved romtemperatur i én time. Etter en endelig serie av vaskinger, ble bundet anti-humant IgE detektert med Blue Phos mikrobrønn fosfatase-substrat-system (Kirkegaard & Perry Laboratories). Fargeutvikling ble detektert med en Spectracount plateleser ved 630 nm (Packard).

Fagfolk på området vil forstå at oppfinnelsen beskrevet her er mottagelig for variasjoner og modifikasjoner forskjellig fra de spesifikt beskrevet. Det skal forstås at oppfinnelsen omfatter alle slike variasjoner og modifikasjoner. Oppfinnelsen omfatter også alle trinn, trekk, preparater og forbindelser referert til eller angitt i denne beskrivelsen, individuelt eller kollektivt og hvilke som helst og alle kombinasjoner av hvilke som helst to eller flere av nevnte trinn eller trekk.

BIBLIOGRAFI

Bond, J.F, Segal, D.B, Yu X-B, Theriault, K.A, Pollock, M.S, Yeung H. J. Allergy Clin. Immunol. 91:339, 1993.

Baldari et al., EMBO J. 6:229-234, 1989.

Kohler and Milstein, Nature 256:495-499, 1975.

Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976.

Kurjan and Herskowitz, Cell 30:933-943, 1982.

Miyamoto T: Advances in Allergology and Clinical Immunology. Godard P, Bousquet J, Michel FB (eds) pp. 343-347. The Parthenon Publishing Group, Cornforth, UK, 1992.

Ong, E.K, Griffith, I.J., Knox, R.B., Singh, M.B. Gene 134:235- 240, 1993.

Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2<nd>Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989.

Schultz et al., Gene 54:113-123, 1987.

Singh, M.B., Hough, T., Theerakulpisut, P., Avjioglu, A., Davies, S., Smith, P.M., Taylor, P., Simpson, R.J., Ward. L.D., McCluskey, J., Puy, R., Knox, R.B. Proe. Nati. Acad. Sei USA 88:1384-1388, 1991.

Smart, I.J., Heddle, R.J., Zola, H., Bradley, J., Int. Arch. Allergy Immunol. 72: 243-248, 1983.

Smith, P.M., Ong, E.K, Avjioglu, A., Singh, M.B., Knox, R.B. Analysis of rye-grass pollen allergens using two dimensjonal electrophoresis and immunoblotting. In Kraft D (ed), Molecular Biology and Immunology of Allergens, CRC Press, Boca Raton, FL, 1993.

Smith, P.M., Ong, E.K., Knox, R.B., Singh, M.B. Mol. Immunol. 31:491-498, 1994.

Wuthrich, B., Int. Arch. Allergy Immunol. 90:3-10, 1989.

Claims (8)

1. Rekombinant variant av Loi p 5 protein allergen som har aminosyresekvensene ifølge SEQ ID NO:1 som bærer mutasjonene valgt fra gruppen bestående av a. K172N, F173L, T174A og V175A (mut 4), b. K57A, G273A, K275A, K172N, F173L, T174A og V175A (mut 6), og c. K57A, AG272, K172N, F173L, T174A og V175A (mut 8).

2. Rekombinant allergenvariant ifølge krav 1, som utviser reduserte antall av IgE epitoper og/eller utviser redusert bindingskapasitet for IgE og/eller utviser redusert stimulering av IgE produksjonen, mens T-celle antigenisiteten beholdes.

3. Rekombinant allergenvariant ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2, hvor nevnte proteinallergen i naturlig forekommende form er assosiert med type 1 allergisk sykdom i sensitive individer.

4. Rekombinant allergenvariant ifølge krav 3, hvor type 1 allergisk sykdom er sensitiv overfor raigresspollen.

5. Rekombinant allergenvariant ifølge krav 3, hvor nevnte sensitive individ er et menneske, en primat, husdyrbesetning, laboratorietestdyr eller selskapsdyr.

6. Rekombinant allergenvariant ifølge krav 5, hvor nevnte sensitive individ er et menneske.

7. Sammensetning omfattende en rekombinant allergenvariant ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 og en eller flere midler valgt fra gruppen bestående av farmasøytiske akseptable bærere og fortynningsmidler.

8. Anvendelse av en rekombinant allergenvariant ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 for fremstilling av et medikament for anvendelse i en metode for profylakse eller behandling av en allergisk sykdomstilstand.