CN103360483A - IgE结合减少，但T细胞抗原性未减弱的重组变应原 - Google Patents

Abstract

本发明广泛地涉及用于免疫治疗或免疫预防治疗变应性疾病的试剂。更具体地说，本发明提供一种修饰的变应原，该变应原表现出IgE相互作用性的减弱，包括刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞抗原性，它可用于I型变应性疾病状况的免疫调节。本发明还考虑了一种对变应性疾病，例如I型变应性疾病状况进行免疫调节的方法，该方法包括对患者施用表现出IgE相互作用性减弱，而保留T细胞抗原性的修饰的变应原。

Description

IgE结合减少,但T细胞抗原性未减弱的重组变应原

本申请是国际申请日为2002年9月13日、国际申请号为PCT/AUO2/01261、进入国家阶段的申请号为02823080.9、发明名称为“IgE结合减少，但T细胞抗原性未减弱的重组变应原”的PCT申请的分案申请。

发明领域

本发明广泛地涉及用于免疫治疗或免疫预防治疗变应性疾病的试剂。更具体地说，本发明提供一种修饰的变应原，该变应原表现出IgE相互作用性的减弱，包括刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞抗原性，它可用于I型变应性疾病状况的免疫调节。本发明还考虑了一种对变应性疾病，例如I型变应性疾病状况进行兔疫调节的方法，该方法包括对患者施用表现出IgE相互作用性减弱，而保留T细胞抗原性的修饰的变应原。

发明背景

本说明书提供的参考文献目录的详情列于该说明书的最后。

本申请中对任何现有技术的参考不是，也不应看作是承认或以任何形式提示该现有技术形成了任何国家中公知常识的一部分。

I型变应性疾病，例如季节性过敏性鼻炎(花粉症)、结膜炎、过敏性哮喘和过敏性皮炎代表了工业化国家中的主要健康问题(Wuthrich，Int.Arch.Allergy Immunol.90:3-10，1989)。目前估计，在发达国家中，有15-20%的人群受到某些形式的变态反应的侵害(Mtyamoto，Advances in Allergology and Clinical Immunology.Godard P，Bousquet J，Michel FB(eds)pp，343-347.The ParthfnopnPublishing Group，Cornforth，UK，1992)。因此，这些疾病的诊断和治疗就成了科学研究关心的焦点。

I型变应性反应的主要免疫学和生物化学基础是变应性物质(变应原)与IgE抗体的相互作用，该抗体结合在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和性Fc受体上。该相互作用导致了变应原特异的IgE抗体的交联，而其又刺激产生过敏症状的炎症递质的直接释放和级联产生。变应原存在于空气传播的颗粒中，例如房屋尘土，禾本科植物、杂草、树木的花粉，霉菌的孢子和动物的头皮屑。

目前，变应性疾病(例如鼻炎、结膜炎和过敏感性哮喘)治疗干预的一种方式包括注射假定为引起变态反应的变应原。这种方式称为脱敏治疗。目前用于该步骤中的提取物是由天然来源的物质制备的，其中除了变应原以外，例如，还含有患者对其不过敏的蛋白组分。

重组技术的发展提供了生产用于诊断和治疗目的的高水平纯化变应原的方法。但是，这种高纯度的重组变应原制剂即使在非常低的剂量下，也会产生高的过敏指数。因此，将其施用于患者时，要非常小心。所以需要开发一种降低过敏休克风险的重组变应原。

季节花粉症和过敏性哮喘的主要户外原因是空气传播的禾本科植物花粉(Smart，Int.Arch.Allergy Immuno1.7:243-248，1983)。花粉日程表说明，在春天和初夏，禾本科植物的花粉最多，这时禾本科植物开花，而且是过敏性哮喘发病的高峰。禾本科植物花粉的最重要来源是常见的农业牧草，该牧草已广泛地引入全世界不同温度和热带气侯的地区。在其温度使人感觉凉爽的地区，例如黑麦草、草地早熟禾、和梯牧草(都属于Pooideae亚科)等禾本科植物是有重要临床意义的，而在暖温和亚热带环境，狗牙根(属于Chloridoideae亚科)即成为变应原最重要的来源。对黑麦草花粉的蛋白进行了最全面的研究，而对草地早熟禾和梯牧草研究得较少。

对来源于一种禾本科植物的变应原敏感的个体往往对很多其他禾本科植物的变应原也敏感。尤其是对Pooideae亚科的禾本科植物花粉敏感(Smith等，“Analysis of rye-grass pollen allergens using twodimensional electrophoresis and immunoblotting.”In Kraft D(ed)，Molecular Biology and Immunology of Allergens，CRC Press，Boca Raton，FL，1994)，其中的免疫交叉反应性巳在采用IgE-结合测定的抑制试验，即放射变应原吸附测定(RAST)中证实。在这些实验中，来源于一种禾本科植物的花粉提取物能够抑制IgE与其他禾本科植物提取物的结合。

禾本科植物花粉的变应原组分可根据其物理化学和免疫学特性分为不同的组。按照应答的过敏性患者人数和相关的与变应原结合的IgE的量为标准来判断(Singh等，1991，同上)，大多数引起对Pooid禾本科植物花粉的变态反应的变应原为第1组和第5组变应原。在多年生黑麦草Lolium perenne的场合，花粉提取物含有17种以上能结合禾本科植物花粉过敏患者血清中的IgE的蛋白(Singh等，1991，同上)。但是，现已表明，第1组和第5组变应原在一起能够抑制大部分IgE与粗的花粉提取物结合(Bond等，J.Allergy Clin.Immunol.91:339，1993)。

一种28-33kDa的蛋白Lol p 5是第二位最普遍的黑麦草变应原，它引起85-90%的禾本科植物花粉过敏个体的变态反应。编码该第5组变应原的cDNA的分子克隆(Singh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:1384-1388，1991;Ong等，Gene 134:235-240，1993)表明，Lol p 5以同源的家族，但不同的同种型的形式存在，即使在变性的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分离后，它仍保留其IgE的反应性(Singh等，1991，同上)。

因此，需要开发一种用于变应性疾病状况的免疫治疗和免疫预防的修饰形式的重组变应原。

发明概述

在本说明书的自始至终，除非上下文的需要，否则，单词“包括”，是指包含所述要素或整数，或一组要素或整数;而不排除任何其他要素或整数，或一组要素或整数。

核苷酸和氨基酸序列用序列编号(SEQ ID NO:)表示。SEQ ID NOs:数字上相应于序列符号<400>1(SEQ ID NO:1)、<400>2(SEQ ID NO:2)等。序列符号概括在表1中。序列表提供在权利要求书之后。

本发明提供了一种修饰的重组变应原，当该变应原处于天然存在的形式时，与敏感对象的变应性疾病状况有关。方便地，该修饰的重组变应原含有由天然存在的氨基酸序列修饰的氨基酸序列，使得该变应原缺乏或含有数量减少的IgE表位，和/或呈现出IgE结合能力的减弱，和/或呈现出刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞抗原性。

优选该变应性疾病状况为I型变应性疾病状况。

优选该重组的变应原为禾本科植物花粉变应原。

最优选该禾本科植物变应原为黑麦草花粉变应原，例如，但不限于，Lol p 5或免疫学上或植物学上相关的变应原，例如Phl p 5和Poa p 5。

在特别优选的实施方案中，本发明提供了一种修饰的Lol p 5变应原，该变应原缺乏或含有减少数量的IgE表位，和/或呈现出IgE结合能力的减弱，和/或呈现出刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞抗原性，其中所述Lol p 5变体选自具有SEQ ID NO:8-12所示的氨基酸序列(参见表1)的分子，或相应于免疫学上或植物学上相关变应原的修饰的变应原。

本发明还涉及含有修饰的变应原，例如禾本科植物变应原(例如，黑麦草花粉变应原)的组合物，该变应原缺乏或含有减少数量的IgE表位，和/或呈现出IgE结合能力的减弱，和/或呈现出刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞抗原性。该组合物还包括一种或多种药用载体和/或稀释剂。

本发明还提出一种对治疗对象的变应性疾病状况进行预防或治疗的方法，该方法包括对治疗对象施用有效量的修饰的变应原，该变应原缺乏或含有减少数量的IgE表位，和/或呈现出IgE结合能力的减弱，和/或呈现出刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞抗原性。

本说明书自始至终所用的序列符号概括在表1中。

表1

序列符号的概括

序列编号：	说明
		1	Lo1 p5同种型A的氨基酸序列
2	Lo1 p5同种型B的氨基酸序列
		3	Phl p5同种型A的氨基酸序列
4	Phl p5同种型B的氨基酸序列
		5	Poa p5同种型的氨基酸序列
6	Poa p5同种型的氨基酸序列
		7	Lol p5变体的氨基酸序列
8	Lo1 p5变体D1的氨基酸序列
		9	Lol p5变体D2的氨基酸序列
10	Lol p5变体D3的氨基酸序列
		11	Lo1 p5变体D4的氨基酸序列
12	Lol p5变体D5的氨基酸序列
		13	用于克隆D1的正向引物的核苷酸序列
14	用于克隆D1的反向引物的核苷酸序列
		15	用于克隆D2的正向引物的核苷酸序列
16	用于克隆D2的反向引物的核苷酸序列

17	用于克隆D3的正向引物的核苷酸序列
		18	用于克隆D3的反向引物的核苷酸序列
19	用于克隆D4的正向引物的核苷酸序列
		20	用于克隆D4的反向引物的核苷酸序列
21	用于克隆D5的正向引物的核苷酸序列
		22	用于克隆D5的反向引物的核苷酸序列

附图简述

图1表示推测的第5组变应原的氨基酸序列的比较。虚线表示引入以给出最大的序列对比的空位。与Lol p5A相同的残基用星号表示。

图2表示Lol p5A的氨基酸序列，表明在变应原中引入以得到D1、D2、D3、D4和D5突变体的突变。Lol p5A中改变的氨基酸用方框表示，而新的序列用黑体表示。

图3突变的Lol p5变体的示意图；例如，mut1含有D1突变。

图4表示在Lol p5A中产生突变所用的引物的序列。

图5表示Lol p5(未突变的)，以及9个突变的变体(mut1-mut9)的纯化蛋白与多克隆(p)、单克隆(m)抗体和7个黑麦草花粉过敏患者血清的反应性的狭线印迹分析。

图6表示Lol p5(未突变的)，以及9个突变的变体(mut1-mut9)的纯化蛋白与多克隆(p)、单克隆(m)抗体和黑麦草花粉过敏患者(患者2)血清的反应性的免疫印迹分析。

图7A、B和C是采用纯化的未突变的Lol p5和4种突变的蛋白(mut3、mut4、mut6、mut9)的ELISA测定的图示，表明了突变体与单克隆(mAbA7)和与两个患者(患者4和患者27)的IgE的反应性的减弱。

优选实施方案的详述

根据本发明，提供了用于免疫治疗和免疫预防的基本上低变应原性的基因工程变应原变体，该变应原变体不能与IgE相互作用，或减弱了与IgE相互作用的能力。确定氨基酸序列的某种修饰类型，以造成IgE表位的缺乏或数量的减少、降低IgE表位的活性、减弱与IgE相互作用的能力和/或降低刺激产生IgE的活性。

因此，本发明的一个方面提供一种修饰的重组变应原，其中处于天然存在形式的所述变应原与敏感的对象的变应性疾病状况有关，其中所述修饰的重组变应原含有由天然存在的氨基酸序列经修饰得到的氨基酸序列，从而使该变应原缺乏或含有减少数量的IgE表位，和/或表现出与IgE结合能力的减弱，和/或表现出刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞抗原性。

术语“敏感的”对象是按其最广泛的含义使用，以便包括表现出变应性疾病状况的个体，尤其是对变应原应答或与变应原有关的I型变应性疾病的症状的个体。“个体”优选的是人，但也可扩大至非人灵长目动物、家畜动物(例如绵羊、牛、猪、马、驴、山羊)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)和宠物(例如狗、猫)。

本发明特别涉及禾本科植物花粉变应原。

因此，本发明的另一个方面涉及修饰的重组禾本科植物花粉变应原，其中处于天然存在形式的所述禾本科植物花粉变应原与I型变应性疾病状况有关，其中所述修饰的重组禾本科植物花粉变应原含有由天然存在的氨基酸序列经修饰得到的氨基酸序列，从而使该变应原缺乏或含有减少数量的IgE表位，或表现出与IgE结合能力的减弱，和/或表现出刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞的抗原性。

在一个特别优选的实施方案中，禾本科植物花粉变应原是黑麦草或免疫学上相关的禾本科植物花粉变应原，例如，但不限于Lol p5、Phl p5。涉及的“禾本科植物花粉变应原”包括所有的黑麦草或免学上相关的禾本科植物花粉变应原，或其他禾本科植物变应原。

因此，本发明的这个方面，考虑一种修饰的重组黑麦草花粉变应原，它含有由天然存在的氨基酸序列经修饰得到的氨基酸序列，从而使该变应原缺乏或含有减少数量的IgE表位，和/或表现出与IgE结合能力的减弱，和/或表现出刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞抗原性。

T细胞抗原性的保留包括有关T细胞表位的保留，换句话说，保留与T细胞相互作用的能力，以诱导T细胞应答。

在下文，进行有关Lol p5的描述。因为，迄今为止，Lol p5代表一种实践本发明的特别有用的变应原;但仍然在下述理解下进行：本发明扩大至任何一种变应原，尤其是与I型变应性疾病有关的变应原，例如，但不限于第5组禾本科植物花粉变应原。本发明的方法尤其可应用于除Lol p5之外的任何一种黑麦草，或兔疫学上相关的禾本科植物花粉变应原，如Phl p5和Poa p5。

在得到本发明的工作中，发明人使重组Lol p5在大肠杆菌中以非融合蛋白的形式表达，并发现，将cDNA的N-末端信号肽除去，然后克隆到细菌表达载体中，产生了可溶的重组形式的该变应原。该方法可避免从细菌细胞分离变应原时的苛刻变性条件。通过抑制ELISA试验，测定重组Lol p5与天然对应物的抗原相似性，发明人表明，该重组形式完全抑制了其分离形式的天然花粉对应物与IgE的结合。单个重组的同种型能够抑制IgE与天然变应原结合的事实进一步指明，不同的变应原同种型是相似的。发明人将重组的变应原用于免疫印迹抑制的研究，该研究中，使用重组Lol p5再温育的变应性血清对黑麦草可溶蛋白的双向免疫印迹进行探测。根据本发明，发现用一种形式预温育，完全消除了与所有由不同基因编码的不同形式的结合。这说明即使序列有轻微的不均一性，不同的变应原同种型在抗原学上是非常类似的。

完成本发明的下一步是确定变应原蛋白中可改变的关键氨基酸残基，它可经改变而消除或减弱IgE的相互作用，同时保持T细胞表位通常的结构和功能。

发明人确定了Lol p5的同种型A和B上的哪些氨基酸残基是保守的。理所当然，这种保守的氨基酸残基对IgE结合是重要的，因为在很多不同禾本科植物的变应原之间存在交叉反应性。通过选择性地使这些保守的氨基酸残基突变，可鉴定出缺乏IgE相互作用性，或IgE相互作用性减弱，而保留T细胞抗原性的突变体。

因此，本发明的另一个方面包括修饰的第5组禾本科植物花粉变应原，其中所述第5组禾本科植物花粉变应原含有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加，这些氨基酸残基至少在两种免疫交叉反应性的第5组禾本科植物花粉变应原中是保守的;与相应的天然形式相比，其中所述修饰的第5组禾本科植物花粉变应原缺乏或含有数量减少的IgE表位，和/或表现出结合IgE能力的减弱，和/或表现出刺激产生IgE的活性的降低。

按照本发明的这个方面，一种合适的参考氨基酸序列为SEQ IDNO:1，该序列是Lol p5，同种型A的氨基酸序列。例如图1所示，氨基酸序列的比较指出了在Lol p5和Phl p5的同种型A和B中，以及在Poa p5的同种型中保守的氨基酸残基。图1中，保守的残基用星号表示。然后很容易导入改变了一个或多个这些保守的残基的突变体。

本发明的另一个方面提供一种修饰的第5组禾本科植物花粉变应原，该变应原在相应于图3所描述的Lol p5的突变体1-9中的一个或多个突变体，或免疫学上相关变应原的相应突变体的位置上含有氨基酸截短或取代、缺失和/或添加。

在特别优选的实施方案中，本发明提供一种修饰的Lol p5变应原，该变应原缺乏或含有减少数量的IgE表位，和/或表现出与IgE结合能力的减弱，和/或表现出刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞的抗原性，其中所述Lol p5变体选自具有SEQ ID NO:8-12所示的氨基酸序列的分子，或提供相应于免疫学相关变应原的修饰的变应原。

由SEQ ID NO:8-12所表示的Lol p5变体在此分别称为突变体DI-D5。

本发明还提供一种核酸分子，它含有编码修饰的重组变应原的核苷酸序列，或含有与编码修饰的重组变应原的序列互补的核苷酸序列，其中处于天然存在形式的所述变应原与过敏对象的变应性疾病状况有关，其中所述修饰的重组变应原含有由天然存在的氨基酸序列经修饰得到的氨基酸序列，从而使该变应原缺乏或含有减数量的IgE表位，和/或表现出与IgE结合能力的减弱，和/或表现出刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞抗原性。

本发明的另一方面提供一种核酸分子，它含有编码修饰的重组变应原的核苷酸序列，或含有与编码修饰的重组变应原的序列互补的核苷酸序列，其中处于天然存在形式的所述变应原与过敏对象的I型变应性疾病状况有关，其中所述修饰的重组变应原含有由天然存在的氨基酸序列经修饰得到的氨基酸序列，从而使该变应原缺乏或含有减少数量的IgE表位，和/或表现出与IgE结合能力的减弱，和/或表现出刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞的抗原性。

本发明还有另一个方面涉及一种核酸分子，它含有编码修饰的重组禾本科植物花粉变应原的核苷酸序列，或含有与编码修饰的重组禾本科植物花粉变应原的序列互补的核苷酸序列，其中处于天然存在形式的所述禾本科植物花粉变应原与过敏对象的I型变应性疾病状况有关，其中所述修饰的重组禾本科植物花粉变应原含有由天然存在的氨基酸序列经修饰得到的氨基酸序列，从而使该变应原缺乏或含有减少数量的IgE表位，和/或表现出与IgE结合能力的减弱，和/或表现出刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞的抗原性。

本发明还又有一个方面涉及一种核酸分子，它含有编码修饰的重组黑麦草花粉变应原的核苷酸序列，或含有与编码修饰的重组黑麦草花粉变应原的序列互补的核苷酸序列，重组黑麦草属花粉变应原含有由天然存在的氨基酸序列经修饰得到的氨基酸序列，从而使该变应原缺乏或含有减少数量的IgE表位，和/或表现出与IgE结合能力的减弱，和/或表现出刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞抗原性。

因此，本发明特别优选的方面是提供编码修饰的禾本科植物花粉变应原的纯化核酸分子，更具体的是修饰的第5组禾本科植物花粉变应原，或其抗原片段，或其衍生物或同源物，或者这样的核酸分子的功能等同物，其中修饰的禾本科植物花粉变应原缺乏或含有减少数量的IgE表位，和/或表现出与IgE结合能力的减弱，和/或表现出刺激产生IgE的活性的降低，而保留T细胞的抗原性。优选编码第5组变应原的家族成员，如Lol p5、Poa p5和Phl p5的核酸序列。一种特别有用的核酸分子编码Lol p5的突变体Dl-D5。

本发明的核酸分子可以是基因组或cDNA分子，或相应的mRNA分子，也可以指一种基因。关于“基因”，就本发明而言，是指任何一种邻接的核苷酸序列，它的转录产生mRNA分子，或它的序列是mRNA分子，这种mRNA分子能够翻译产生蛋白。编码第5组禾本科植物花粉变应原家族成员的基因是指编码该蛋白，或该蛋白的衍生物或同源物的核苷酸序列，与相应天然存在的分子比较，该蛋白可含有单个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加。修饰的Lol p5基因亦指与mRNA互补的cDNA，该mRNA与Lol p5蛋白的全长或部分长度相对应，与天然存在的分子比较，至少有一处截短或氨基酸取代、添加和/或缺失。

本发明进一步考虑到融合分子。例如，对于本发明的某些方面，要求产生一种融合蛋白，它含有修饰的禾本科植物花粉变应原或其片段，或其衍生物，还含有另一种肽或蛋白的氨基酸序列，后者的例子是酶，例如β-半乳糖苷酶、磷酸酶、脲酶等。大多数融合蛋白是通过重组基因的表达而生成，该重组基因中，两个编码序列按其读框协调的方式连接在一起。或者，蛋白或肽可以通过化学方法在体外连接。所有这样的禾本科植物花粉变应原的融合蛋白，或杂合基因衍生物，或它的编码核酸序列都包括在本发明内。此外，禾本科植物花粉变应原的同源物和衍生物意味着包括其合成的衍生物。这里提出的核苷酸序列可以用来通过化学法合成完整的蛋白，或利用众所周知的方法(例如固相合成)，通过化学合成产生任意数量的片段(肽)。所有这样的化学合成肽都包括在本法明内。因此，本发明扩大至通过重组方法或化学合成制备的，分离的修饰的禾本科植物花粉变应原的家族成员、其片段及其衍生物、同源物和免疫学上的相关物。

术语“分离的”和“纯化的”在本发明中可以互换使用，在用重组DNA技术生产时，是指基本上不含细胞物质或培养基的肽、蛋白、蛋白片段和核酸序列;或在化学合成时，是指化学前体或其它化学物质。这里所用的术语“天然存在的”是指由禾本科植物花粉或其他植物部分纯化的蛋白或其片段，也包括由cDNA序列确定的有关的氨基酸序列，但该氨基酸序列与变应性状况相关的方式与禾本科植物花粉纯化的变应原的方式类似。

本发明范围内的核酸分子片段包括编码部分禾本科植物花粉变应原的核酸分子片段，它们在哺乳动物，优选在人类中，表现出T细胞抗原性，但缺乏与IgE的相互作用，或表现出与IgE相互作用的减弱。

理想的重组或合成产生的修饰的禾本科植物花粉变应原的片段和突变体不与IgE结合，和/或具有最小的与IgE相互作用能力，和/或具有最小的刺激产生IgE的能力。优选不会导致组胺释放的最小IgE相互作用活性。例如，优选修饰的变应原不引起1gE在肥大细胞或嗜碱细胞上的交联。最小的IgE相互作用活性是指小于由重组或合成产生的“天然存在的”禾本科植物花粉变应原，或完整的纯化天然禾本科植物花粉变应原的IgE相互作用量的IgE相互作用活性。IgE相互作用也可以测定为刺激产生1gE的活性。优选的片段还包括抗原片段，该片段施用于禾本科植物花粉敏感的个体，或对与禾本科植物花粉变应原交叉反应的变应原过敏的个体时，能够改善该个体对禾本科植物花粉变应原的变态反应。

本发明的抗原片段具有T细胞刺激活性，即T细胞抗原性，因而含有至少一个T细胞表位，是特别理想的。可以认为，T细胞表位参与对引起变态反应临床症状的蛋白变应原的免疫应答的发生和维持。这些T细胞表位被认为通过与抗原呈递细胞表面上的适当HLA分子结合，并剌激相关的T细胞亚群，而触发T辅助细胞的水平上的早期事件。这些事件导致T细胞的增殖、淋巴因子分泌、局部炎症反应、其它免疫细胞募集至该部位、并使B细胞级联激活而导致抗体的产生。这些抗体中的一种同种型，IgE，对过敏症状的发生是十分重要的，在早期的事件级联中，它的产生，根据所分泌的淋巴因子的性质，在T辅助细胞的水平上受到影响。T细胞表位是被T细胞受体识别的基本元件或最小的单位，该表位包含受体识别所必须的氨基酸。模拟T细胞表位和改善对蛋白变应原的变态反应的氨基酸序列都在本发明的范围内。

使患者暴露于本发明纯化的修饰的蛋白变应原之下，或暴露于含有至少一个T细胞表位、并来源于蛋白变应原的本发明抗原片段，可以使患者忍受适当的T细胞亚群，或对其无反应，从而使这些患者变得对该蛋白变应原无反应，并且不参与刺激因暴露而引起的免疫应答。此外，施用本发明的蛋白变应原或含有至少一个T细胞表位的本发明抗原片段，与暴露于天然存在的蛋白变应原或其部分相比，可以改善淋巴因子分泌的图形(例如引起IL-4的减少或IL-2的增加)。而且，暴露于这样的抗原片段或蛋白抗原，可对在正常情况下参与对该抗原应答的T细胞亚群产生影响，这样，这些T细胞就离开通常暴露于该抗原的部位(例如鼻粘膜、皮肤和肺)而靠近该片段或蛋白抗原的治疗施用部位。这种T细胞亚群的重新分布可以改善或减弱个体的免疫系统刺激在正常暴露于该变应原的部位的通常的免疫应答能力，导致过敏症状的减少。

本发明提供用于转化以表达本发明的核酸序列的表达载体和宿主细胞。本发明的表达载体包含编码修饰的禾本科植物花粉变应原、或其抗原片段、或其衍生物或同源物的核酸序列，或该核酸序列的功能等同物。上述的核酸序列可以在原核或真核宿主细胞中表达。合适的宿主细胞包括细菌细胞，例如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母、或哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。合适的表达载体、启动子、增强子，和其他表达调控元件可在Sambrook等，分子克隆：实验室指南，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，中查到。合适的在酵母中表达的载体包括YepSecl(Baldari等，BMBOJ.6:229-234，1987);pMF(Kurjan和Herkowti，Cell 30:933-943，1982);和JRY88(Schultz筝，Gene 54:113-123，1987)。

宿主细胞可用常规技术，例如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔进行转化，以表达本发明的核酸序列。转化宿主细胞的合适方法可在Sambrook等(1989，同上)和其他实验室教科书中查到。本发明的核酸序列也可以用标准的技术合成。

因此，本发明的另一个方面是提供一种生产重组的修饰的禾本科植物花粉变应原或其片段，或其衍生物或同源物，或其免疫相关物的方法，该方法包括在足以使重组DNA分子能稳定地保持的条件下和时间中培养含有可复制的重组DNA分子的生物，并指导修饰的禾本科植物花粉变应原或其片段，或衍生物、同源物或免疫相关物的合成，然后任选对其进行分离，所述重组DNA分子包含能够在所述生物中表达的启动子；位于所述启动子下游并从该启动子转录的编码修饰的禾本科植物花粉变应原或其家族成员、片段或同源物或衍生物、或其免疫相关物的基因；可选择标记和含有原核或真核复制起点的DNA载体。

禾本科植物花粉变应原及其片段(肽)可以采用本领域中纯化肽和蛋白的已知技术，由细胞培养基、宿主细胞或两者进行纯化，这些已知技术包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、电泳，以及利用对修饰的禾本科植物花粉变应原特异的抗体的免疫纯化。术语“分离的”和“纯化的”在此可互换使用，在用重组DNA技术生产时，是指基本上不合细胞物质或培养基的肽、蛋白、蛋白片段和核酸序列，或化学合成时，是指化学前体或其它化学物质。

本发明的另一个方面提供了包含Lol p5 D1、D2、D3、D4和D5或其功能等同物或免疫等同物、同源物或衍生物的蛋白制剂。

由此，本发明提供了修饰的禾本科植物花粉变应原或其衍生物，将其施用于禾本科植物花粉敏感的个体时，减弱了该个体对禾本科植物花粉，例如黑麦草花粉或免疫相关的禾本科植物的花粉的变态反应。优选的修饰的禾本科植物花粉变应原包括修饰的Lol p5蛋白或其衍生物或同源物。其它优选的变应原是Phl p5和Poa p5。

除了诱导氨基酸的取代、添加和/或缺失或截短以外，蛋白或肽的修饰的另一个例子是优选用丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或谷氨酸取代半胱氨酸残基，使通过二硫键进行的二聚化作用减到最小。本发明的蛋白和肽的修饰的另一个例子是氨基酸侧链的化学修饰，或该肽的环化。

为了提高稳定性和/或反应性，本发明的蛋白或肽也可以进行修饰，以便在天然等位变异所产生的蛋白变应原的氨基酸序列中掺入一个或多个多态性。另外，D-氨基酸、非天然的氨基酸或非氨基酸类似物可以用于取代或添加，以产生在本发明范围内的修饰的蛋白或肽。

本发明的另一个方面涉及含有编码一种蛋白的DNA序列的重组载体，该蛋白表现出改进的禾本科植物种花粉变应原活性。更具体地说，该禾本科植物的种属于禾本科，再更具体是属于黑麦草属，还再更具体的说，该变应性蛋白具有与多年黑麦草花粉Lol pIb蛋白的抗体免疫交叉反应的特性，即：

Pooid(festucoid)禾本科植物，第1组：Triticanea：无芒雀麦；偃麦草；冰草；黑麦，普通小麦。第2组：Poanae：鸭茅：多年黑麦草；多花黑麦草；草地早熟禾；加拿大早熟禾；燕麦；绒毛草；黄花茅；燕麦草；小糠草；梯牧草；丝带草。Panicoid grass，Paspalum notatum，须芒草属：石茅高粱。

可以构建出很多表达载体用于生产修饰的禾本科植物花粉变应原或其片段或衍生物。

本发明扩大到修饰的禾本科植物花粉变应原或其片段、衍生物或同源物的单克隆和多克隆抗体。

上述单克隆抗体可用于筛选cDNA库，或纯化重组生产的蛋白，或甚至用于治疗中，以降低导入的蛋白的活性。在以下的讨论中，涉及的禾本科植物花粉变应原包括其衍生物、同源物和免疫相关物，及其化学合成的衍生物。以下的讨论还包括对纯化的修饰Lol p5及其片段、衍生物和同源物特异的抗体。考虑这种抗体可用于建立对修饰的禾本科植物花粉变应原的检测分析方法(免疫测定法)中，尤其是在监测治疗或诊断方案期间，以及用于重组或合成生产的禾本科植物花粉家族成员，特别是第5组的禾本科植物花粉变应原的纯化中。上述的抗体可以是单克隆的或多克隆的。此外，针对上述讨论的第一抗体的任何第二抗体(单克隆或多克隆)也包括在本发明的范围内。本发明还考虑将这些第一或第二抗体用于检测分析中，例如用于监测诊断或施用的药物制剂的效果中。还有，任何与修饰的禾本科植物花粉变应原复合的分子的抗体也包括在本发明的范围内。因此，禾本科植物花粉蛋白变应原的抗体包括这种蛋白变应原、或其抗原部分、以及任何有关的分子(例如脂质区、载体分子、融合蛋白等)的抗体。

这里所研究的禾本科植物花粉家族成员或其片段可经纯化后用于抗体的生产。通过用重组或合成的修饰的禾本科植物花粉蛋白家族成员免疫，可得到多克隆和单克隆抗体，这两种类型的抗体都可用于免疫测定。获得该两种类型的血清的方法在本领域是众所周知的。多克隆血清较不优选，但相对容易通过下述方法制备：对合适的实验室动物注射有效量纯化的修饰的禾本科植物花粉变应原或其抗原部分，收集动物的血清，然后用任何已知的免疫吸附剂技术分离特异的血清。虽然这种方法生产的抗体最终可用于任何类型的免疫测定，但由于该产品潜在的异质性，一般较少被选用。

由于大量生产的能力和产品的均一性，单克隆抗体在免疫测定中特别优选。采用本领域技术人员所熟知的技术(例如，参见Kohler和Milstein，Nature 256：495-499，1975；Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6：511-519，1976)，可以通过永生化细胞系与对免疫原性的制剂增敏淋巴细胞融合，获得生产单克隆抗体的杂交瘤细胞系制品。

与多克隆血清制剂不同，动物的选择取决于能够与淋巴细胞融合的合适的永生化细胞系的可得性。小鼠和大鼠是被选择用于杂交瘤技术中的动物，而且是优选使用的动物。如果可得到合适的永生化人(或非人的)细胞系，人类也可以用作增敏的淋巴细胞的来源。对于本发明目的，可以对选择的动物注射约0.1mg-约20mg纯化的修饰的禾本科植物花粉变应原或其一部分。通常，将注射的物质在福氏完全佐剂中乳化。也可能需要加强注射。采用适当标记的抗原，通过测定抗血清可以对抗体生产进行检测。淋巴细胞可在无菌的状态下，通过取出敏化动物的脾脏或淋巴结而得到，然后进行融合。或者，可以在体外刺激或免疫淋巴细胞。

在患者的血清、植物或哺乳动物的组织或组织提取物中存在的修饰的禾本科植物花粉变应原，或其特异的抗体，可以用上述制备的单克隆或多克隆抗体，基本用任何类型的免疫测定法进行检测。参考美国专利No.4，015，043、4，424，279和4，018，653可见，有很多免疫测定技术可供使用。这些技术包括非竞争型的单位点和双位点测定法，或“夹心”测定法；以及传统的竞争性结合测定法。夹心测定法是其中最有用，而且是最常用的方法，适合于本发明中使用。夹心测定技术有很多变化，所有这些变化也包括在本发明内。简单地说，在通常的正向测定中，将未标记的抗体固定在固体基质上，并使被测样品与结合的分子接触。经过足以形成抗体-抗原第二复合物的一段适当时间的温育后，加入标记了能产生可检测信号的报道分子的第二抗体，并温育足够的时间，使抗体-抗原-标记的抗体的第三复合物(例如，抗体-修饰的禾本科植物花粉变应原蛋白-抗体)形成。洗去任何未反应的物质，然后通过观察报道分子产生的信号来确定该抗原的存在。该结果可以是定性的，即通过简单地观察可见的信号；或者也可以是定量的，即通过与含有已知量半抗原的对照样品比较。正向测定的变化包括同步测定，或反向测定，前者是将样品和标记的抗体同时加到结合的抗体上；后者是将标记的抗体先和被测样品结合、温育，然后同时加到结合的抗体上。显而易见，这些技术，包括任何细小的改变，是本领域的技术人员所熟知的。

虽然以下的讨论是有关检测修饰的禾本科植物花粉变应原，但它同样可用于检测该变应原的抗体，而且看成是对该检测的充分描述。

在典型的正向夹心测定中，本发明中考虑的对修饰的禾本科植物花粉变应原或其抗原部分具有特异性的第一抗体，与固体表面共价或被动结合。该固体表面通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以是管状、珠状、圆盘状微孔板，或任何其它适合于进行免疫测定的表面。上述的结合方法在本领域是众所周知的，通常包括交联共价结合或物理吸附。在测试样品制备中，洗涤聚合物-抗体复合物。然后将一份待测样品加到固相复合物上，并在约室温-约37℃下温育一段时间，该时间足以使任何存在于抗体中的亚单位结合。该温育的时间可以变动，但一般在约2-40分钟的范围，或者，如在方便的条件下，可以过夜。在温育期之后，将抗体亚单位固相洗涤并干燥，然后用半抗原的一部分特异的第二抗体温育。第二抗体与用来表示第二抗体与半抗原结合的报道分子连接。

本发明中所用的“报道分子”是指一种分子，根据其化学性质，该分子提供了一种通过分析可鉴别的，能够检测与抗原结合的抗体的信号。该检测可以是定性或定量的。在这种测定类型中最常用的报道分子是酶、荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)。在酶免疫测定的场合，酶与第二抗体偶联，通常是通过戊二醛或高碘酸盐偶联。但是，显而易见，有很多不同的偶联技术很容易可提供给熟练的技术人员使用。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶，以及其它。一般，选择通过相应的酶的水解，产生可检测的颜色变化的底物与特异性酶一起使用。例如，磷酸对硝基苯基酯适合与碱性磷酸酶偶联物共用；对于过氧化物酶偶联物，通常使用1，2-苯二胺、5-氨基水杨酸，或甲苯胺。也可以使用产生荧光产物的荧光团底物，而不用上述的生色底物。在所有的场合中，将酶标记的抗体加到第一抗体半抗原复合物上，使其结合，然后洗去过量的试剂。随后将含有适合底物的溶液加入抗体-抗原-抗体三元复合物中。该底物会与连接在第二抗体上的酶反应，给出定性的可见信号，该信号通常可用分光光度计进一步定量，给出存在于样品中的半抗原量的指示。“报道分子”也可以扩大到使用细胞凝集或凝集的抑制，例如红血细胞或乳胶珠等。

或者，荧光化合物，例如荧光素和罗丹明，可以与抗体化学偶联而不会改变其结合的能力。荧光染料标记的抗体被特定波长的光照射激活时，吸收该光能，在分子内诱导激发状态，随后发射出用光学显微镜通过视觉可检测的特有颜色的光。如在EIA中那样，使荧光素标记的抗体与第一抗体-半抗原复合物结合。洗去未结合的试剂后，将留下的三元复合物暴露于适合波长的光，观察到的荧光团表明了目的半抗原的存在。免疫荧光和EIA技术在本领域中都已非常成熟，特别优选用于本发明的方法中。但其它报道分子，例如放射性同位素、化学发光或生物发光分子也可以使用。对熟练的技术员来说，如何变化程序以适应于所要求的目的，是显而易见的。上述的内容可以直接或间接(即通过抗体)用于检测本发明的禾本科植物花粉变应原蛋白，也是显而易见的。

因此，本发明的一个方面是提供一种检测以下物质的方法：修饰的花粉变应原或其衍生物或同源物；或与存在于血清、组织提取物、植物提取物、或其它生物体液或组合物中的所述修饰的禾本科植物花粉变应原或其衍生物或同源物发生免疫反应的变应原蛋白，该方法包括下述步骤：在规定的条件下，使待测的所述体液或组合物与所述修饰的禾本科植物花粉变应原接触一段时间，该条件和时间足以使修饰的变应性蛋白-抗体复合物生成，并用某种检测方法对所述复合物进行检测。对于纯化的方法，天然变应原的抗体对修饰的变应原的纯化也有效，这样的实施方案也包括在本发明内。

本发明也涉及一种试剂盒，它可快速、方便地测定哺乳动物的体液(例如血清、组织提取液、组织液)、体外细胞培养物上清液，以及细胞裂解物中修饰的禾本科植物花粉变应原或其衍生物、同源物或免疫相关物的抗体。该试剂盒分成间隔，以便容纳用来装入其抗原组分的第一容器，和用来装入该禾本科植物花粉变应原的抗体的第二容器，所述抗体用能够给出可检测信号的报道分子标记。如果该报道分子为酶，则还提供用来装入所述酶的底物的第三容器。在举例说明的本发明试剂盒的使用中，待测样品与第一容器的内含物在抗体所要求的条件下，接触一段时间，如果样品中存在抗体，则使其可与所述第一容器中的禾本科植物花粉变应原结合。

由于变应原在环境中的存在，尽管在其药物学和免疫学方面取得进展，花粉症和季节性的哮喘对西方社区仍然有严重的发病率和社会-经济方面影响。虽然广范围的可用药物，包括抗组胺剂和类固醇，改善了对变应性疾病的治疗状况，但这些药物存在与长期使用有关的不适宜的副作用。由于这些问题，对变应性疾病的免疫治疗的关注又重新出现。免疫治疗涉及将可能的变应原提取物注射给脱敏患者而抗变应性反应。遗憾的是用作变应原的花粉制剂是多价的，而且质量差。因此，往往需要使用高的浓度，以诱导IgG应答，但这样有可能通过引发全身的反应，包括过敏反应而致死。根据变应原的序列克隆的基因产物或合成的肽提供了用于治疗的安全介质，因为人们可以控制它的质量、对其鉴定和标准化。

因此，本发明考虑了一种使对禾本科植物花粉过敏的哺乳类动物(例如人)脱敏的方法，该方法包括：在足以使哺乳动物(例如人)对禾本科植物花粉有效脱敏的时间和条件下，对所述哺乳类动物施用脱敏有效量的修饰的禾本科植物花粉过敏原，或其片段或衍生物、免疫相关物，这种过敏原缺乏或含有减少数量的IgE表位，和/或表现出与IgE结合能力的减弱，和/或表现出刺激产生IgE的活性的降低。

本发明还提供一种对黑麦草花粉，或来源于黑麦草的免疫相关物的花粉敏感的哺乳类动物(例如人)，治疗其对该花粉敏感性的方法，该方法包括对所述哺乳类动物施用有效治疗量的本发明的治疗组合物。本发明还进一步提供一种治疗对黑麦草属花粉变应原，或与黑麦草花粉变应原免疫交叉反应的变应原的敏感性的方法，该方法包括对哺乳类动物施用有效治疗量的本发明的蛋白制剂。

通过使用本发明的肽和蛋白，可以制备稳定的、组成确定的、以及有生物活性的制剂，并用于治疗(例如，改善黑麦草敏感个体对这种植物花粉的变态反应)。例如，将这样的肽或蛋白施用对象，可以改善IgE对禾本科植物花粉变应原的应答。纯化的肽也可以用于研究治疗黑麦草变态反应的机制，以及用于设计可用于免疫治疗的修饰的衍生物或类似物。

因此，本发明涉及修饰的变应原在生产变应原敏感个体的治疗或预防药物中的用途。

因此，本发明提供一种药物组合物，它包括脱敏或治疗有效量的修饰的禾本科植物花粉过敏原，特别是笫5组禾本科植物花粉过敏原，或其衍生物、同源物或免疫相关物，以及包括一种或多种药用载体和/或稀释剂。对包含修饰的禾本科植物花粉变应原的药物组合物中的活性组分进行考虑，以便在对禾本科植物花粉过敏的人进行脱敏中，按照由具体情况确定的量施用时，使该组合物表现出优良的治疗或预防活性。例如，可按每公斤体重每天约0.5Fg-20mg的量施用。剂量方案可以调节，以提供最优的治疗反应。例如，可将分成几次的剂量每天施用，或者按照治疗状况的紧急状况，将剂量按比例减少。活性化合物可以用方便方式施用，例如通过口服、静脉内(水可溶时)、肌肉内、皮下、鼻内、皮内或栓剂的途径或植入(例如，用缓慢释放分子)。根据施用的途径，包含于本发明的药物组合物的活性成分可能需要用材料包裹起来，以防止所述成分受到酶、酸和其它可能使该成分失活的自然条件的作用。例如，修饰的禾本科植物花粉过敏原可以在佐剂中施用；与酶抑制剂或在脂质体中共同施用。佐剂按其最广的含义使用，并包括任何免疫刺激化合物，例如，干扰素。这里考虑的佐剂包括间苯二酚；非离子型表面活性剂，例如，聚氧乙烯油醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰腺胰蛋白酶。脂质体包括水包油包水CF乳状液，以及常规使用的脂质体。为了诱导T细胞的无反应性，优选该药物组合物以非免疫原性的形式(例如，不含佐剂)施用。

该活性化合物也可以胃肠外施用或腹膜内施用。也可以在甘油、液体聚乙二醇和它们的混合物中，以及在油中制备分散体。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

适合于注射用的药物形式包括无菌水溶液(可溶于水时)或分散体，或用于制备可注射溶液的无菌粉末。在所有的场合，该药物的形式必需是无菌的并且必需易于保持其注射性能的流体。该药物在生产和储存的条件下必需稳定，而且必需保护其能抗微生物，例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、异丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物，和植物油的分散介质。通过使用包衣，如卵磷脂包衣；在用分散体的场合，通过维持所要求的颗粒大小；以及通过使用表面活性剂，可以保持适合的流动性。通过使用各种抗细菌剂和抗真菌剂，可以达到防止微生物作用的目的，例如使用对羟苯苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在很多场合，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如一硬脂酸铝和明胶，可以达到延迟吸收该可注射组合物的目的。

无菌可注射溶液的制备方法如下：将所要求量的活性化合物，以及根据需要选用的以上列举的各种其它组分一起掺入合适的溶剂中，随后过滤灭菌。通常，分散体的制备方法是：将各种灭菌的活性组分掺入无菌的载体中，该载体含有基本的分散介质，以及选自以上列举的所需其它组分。在生产用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该方法可产生一种由活性组分加上任何额外的所需组分的粉末，其中额外的所需组分来源于其预先过滤灭菌的溶液。

在修饰的禾本科植物花粉变应原或其片段按以上所述被合适地保护起来后，该活性化合物可以通过口服施用，例如，与惰性稀释剂或与可吸收的可食载体一起服用：或者可以封装入硬的或软的明胶胶囊壳内、或可以压成片剂、或直接掺入饮食的食品内。对于口服治疗施用，该活性化合物可以与赋形剂掺合，然后以可食用的片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、薄膜片等形式使用。这样的组合物和制剂应含有至少l重量％的活性化合物。当然，可以很方便地使该组合物和制剂在单位剂量中的重量百分率为5-80％。在这种可用于治疗的组合物中，活性化合物的量是能达到合适剂量的量。所制备的本发明的优选组合物或制剂中，口服的剂量单位形式含有约10Fg-2000mg的活性化合物。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可以含有下列组分：粘合剂，例如，黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如，磷酸二钙；崩解剂，例如，玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸等；润滑剂，例如，硬脂酸镁；以及甜味剂，例如，可加入蔗糖、乳糖或糖精；或增香剂，例如，薄荷、冬青油、或樱桃香料。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料外，它可以含有液体载体。各种其他材料可作为包衣存在，或者，用于修饰该剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可包被虫胶、糖或两者。糖浆或酏剂可含有活性化合物、用作甜味剂的糖、用作防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和香料，例如樱桃或柑桔香料。当然用于制备任何剂量单位形式的任何材料都应是药物纯的，而且在该用量下，基本上是无毒的。此外，该活性化合物可以掺入持续释放的制剂和配方中。

这里所用的“药用载体和/或稀释剂”包括任一种和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和延迟吸收剂等。将这种介质和试剂用于药物活性物质中，在本领域是众所周知的。除了一些常规使用的介质和试剂与该活性组分相容之外，将上述这些介质和试剂用于治疗组合物中是经过仔细考虑的。补充的活性组分也可以掺入该组合物中。

通过以下非限定的实施例，对本发明作进一步描述。

实施例1

Lol p5突变蛋白的生成

为了通过基因工程获得低变应原性、非IgE反应的变应原变体，必需确定能否可选出蛋白的关键残基，该残基可以改变，而能保持其一般的结构和T细胞表位的完整。因为在跨Lo1 p5 C末端一半的肽片段处，观察到频率最高的IgE结合，所以发明人主要在该变应原的C末端引入突变。为了鉴定Lo1 p5中可能对该蛋白的IgE相互作用性有影响的氨基酸位置，将Lol p5同种型A和B的蛋白序列与其它禾本科植物的5组变应原比较(图1)。采用定点诱变，置换第5组变应原中的高度保守的残基(图2)。生成了一个或三个结构域发生改变的突变蛋白(图3)。

用pQE表达载体系统(Qiagen)使非突变的Lol p5和突变的Lo1 p5变体在大肠杆菌中以可溶的形式表达。使用这种载体进行的蛋白的细菌表达(见下文)中，在该分子的N末端引入了多聚组氨酸标记，这有助于通过一步金属螯合亲和层析进行重组蛋白的纯化。然后在狭线印迹(图5)，蛋白印迹(图6)和ELISA测定(图7)中，测定非突变的对照和突变蛋白的IgE反应性，以及与抗Lol p5单克隆抗体A7(Mab A7)和多克隆抗Lo1 p5抗血清的反应性。结果表明，在几个突变蛋白的场合(例如，突变体4、突变体6、突变体9)，很大程度上减弱了IgE的结合活性。这样的基因工程变应原分子可能有助于I型变应性疾病的更安全和更有效的免疫治疗，所描述的方法一般可以应用于产生变应原的非IgE反应变体。

实施例2

重组Lol P5和突变蛋白的表达和纯化

将Lol P5和突变蛋白的编码序列按读码框引入表达载体pQE31(QIAGEN)中。该载体可使N末端含有6个组氨酸残基标记的重组蛋白表达。该蛋白的表达和收集按照概括在QIA表达指南中所述进行。按照概括在TALON金属亲和树脂用户指南(C1ontech)中所述的批式/重力流动柱纯化步骤，用TALON金属亲和树脂(C1ontech)纯化组氨酸标记的蛋白。

实施例3

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹

为进行SDS-PAGE，将1.3Fg的Lol p5和每种突变蛋白用10×蛋白样品缓冲液煮沸5分钟。将样品在15％w/v的丙烯酰胺微型凝胶上加样后，在含0.2M甘氨酸，0.025M Tris，0.1％w/v SDS的缓冲液中，200V下电泳40分钟。

将凝胶在0.1％w/v考马斯亮兰R250中振荡至少1小时，进行染色。使凝胶在20％v/v甲醇，7％v/v冰醋酸，3％v/v甘油中退色过夜，其间更换缓冲液2次。

用BIORAD mini-Protean II细胞蛋白印迹装置，使凝胶在含0.025MTris，0.2M甘氨酸，20％v/v甲醇的缓冲液中，在0.2Fm的尼龙膜(Schleicher&Schuel1)上进行蛋白印迹，印迹条件为100V，4℃下印迹1小时。

实施例4

狭线印迹分析

将0.7Fg的突变蛋白和Lo1 P5加入Hybri-Slot多功能狭线印迹装置(Life Technologies)中的狭线中，并在通过水真空抽吸的条件下，印迹到Nytran 0.2Fm的尼龙膜(Schleicher&Schuell)上，进行狭线印迹分析。

实施例5

用抗体及患者血清的温育印迹

将所有的蛋白印迹和狭线印迹在10％w/v的溶于PBS(150mM氯化钠，36mM磷酸二氢钠一水合物，7mM磷酸氢二钠二水合物)的脱脂奶粉中，振荡下封闭1小时，然后用抗体或血清温育。用PBS，0.5v/vTween 20洗涤一次，用PBS洗涤两次，然后用单克隆抗体(1∶5稀释的mAbA7)，多克隆抗体(1∶50稀释的B1)或患者血清温育。所有的稀释物都用PBS，0.5％w/v BSA，0.1％w/v叠氮化钠制备，然后与印迹在室温下振荡过夜。将印迹按以上所述洗涤后，与用PBS，0.5v/vTween20，1％w/v BSA按1∶5000稀释的碱性磷酸酶偶联的抗小鼠(mAbA7)或抗兔(B1)第二抗体(Promega)在室温下振荡温育过夜。然后将所有的印迹按以上所述洗涤。通过颜色反应检测结合的抗小鼠和抗兔抗体-10m1碱性磷酸酶缓冲液(0.1M Tris，pH9.5，0.1M氯化钠，0.05g氯化镁)和66Fl的BCIP贮液(5％w/v溶于100％二甲基甲酰胺的溴氯吲哚磷酸酯)。用患者血清温育的印迹物用PBS，0.5v/v Tween 20，1％w/v BSA(缓冲液B)按1∶5稀释的I¹³¹标记的抗人抗体(Bioclone)，在室温下振荡过夜，进行探测。所有印迹按以上所述洗涤，洗涤后，用Kodak Biomax MS胶片在-70C下曝光，检测结合的I¹³¹标记的抗人IgE。

实施例6

直接ELISA

用50F1的100、500、1000、5000和10000ng/ml的Lol p5和4种突变蛋白的稀释物等分物涂布ELISA板(Greiner)的孔，并在4℃下温育过夜。然后用PBS，0.5v/v Tween 20将孔洗涤4次。用缓冲液B在室温下封闭1小时后，再将孔洗涤，并用50F1用缓冲液B适当稀释的患者血清在4℃下温育过夜。按以上所述，洗涤孔，然后用50F1用缓冲液B按1∶2000稀释的抗人IgE抗体(碱性磷酸酶偶联的，Sigma)在室温下温育1小时。在最后的一系列洗涤后，用Blue Phos微孔磷酸酶底物系统(Kirkegaard&Perry实验室)检测结合的抗人IgE。用Spectracount平板读数器检测在630nm的显色(Packard)。

本领域的技术人员会意识到，除具体描述外，这里所描述的发明易于变更和改进。应该懂得，本发明包括所有这样的变更和改进。本发明也包括本说明书中单独或集中地涉及或指出的所有步骤、特性、组合物和化合物，以及任意两个或多个所述步骤或特性的任何和所有组合。

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Wuthrich，B.，Int.Arch.Allergy Immunol.90：3-10，1989.

Claims (3)

1.Lol p5蛋白变应原的重组变体，其中所述Lol p5蛋白变应原的重组变体的氨基酸序列为携带选自下述的突变的SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列：

a. K172N,F173L,T174A和V175A（mut4）；或

b. K57A,G273A,K275A,K172N,F173L,T174A和V175A（mut6）。

2.包含权利要求1的重组变应原变体以及药学上可接受的载体和/或稀释剂的组合物。

3.权利要求1的重组变应原变体在制备用于预防或治疗变应性疾病状况的方法的药物中的用途。

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