PT2281836E - Proteínas híbridas de alergénios major de parietaria judaica e suas utilizações - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

PROTEÍNAS HÍBRIDAS DE ALERGÉNIOS MAJOR DE PARIETARIA JUDAICA

E SUAS UTILIZAÇÕES A presente invenção proporciona proteínas hipoalergénicas diméricas de Parietaria judaica, moléculas de ácidos nucleicos que as codificam, composições farmacêuticas que as contêm, e a sua utilização na imunoterapia de doenças alérgicas causadas pelo pólen de plantas da espécie Parietaria judaica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As alergias são causadas por uma disfunção no sistema imunitário que reage através da produção de anticorpos de classe IgE a proteínas que, por si só, são completamente inócuas e estão principalmente contidas em pólen, ácaros, tecido epitelial, e alguns alimentos.

Estimativas recentes mostram que mais de 25% da população dos países industrializados é afectada por esta doença que, persistindo no tempo, pode causar o agravamento de sintomas (e.g. surgimento de asma), e sensibilização a outros alergénios, fazendo com que a escolha da terapia apropriada se torne mais complicada (1). A hipossensibilização por imunoterapia específica (SIT), ao contrário da terapia farmacológica, é a única forma de tratamento etiológico de doenças alérgicas que é capaz de afectar de forma benéfica alguns parâmetros imunológicos que constituem a base destas doenças. 1 ΕΡ2281836Β1 A SIT consiste na administração de doses crescentes de extractos padronizados (vacinas) obtidos a partir da mesma substância que causa a doença (2).

Desta forma, uma espécie de "tolerância imunológica" em relação à substância é gradualmente induzida nos pacientes. Esta tolerância imunológica está associada à redução, ou mesmo desaparecimento, dos sintomas alérgicos. 0 risco de provocar efeitos secundários, que podem inclusivamente ser de natureza grave (3) , mesmo que seja consideravelmente reduzido pelo uso de vacinas de libertação lenta ou vacinas de administração por vias alternativas a injecções, tem limitado a aplicabilidade da SIT na terapia de doenças alérgicas. Além disso, como a SIT é realizada através da administração de misturas de proteínas alergénicas e não-alergénicas de origem natural sem ter em conta o perfil de sensibilização do paciente, podem surgir novas reacções IgE a alergénios inicialmente prejudiciais presentes no extracto.

Um elemento relacionado com o benefício originado pela SIT é a indução de anticorpos de classe IgG específicos para o alergénio sensibilizante. Estes anticorpos (protectores) podem inibir a ligação da IgE ao antigénio, influenciando assim a estrutura tridimensional desta molécula (4, 5). 0 desenvolvimento de vacinas produzidas a partir de proteínas recombinantes possuindo menor alergenicidade, mas uma capacidade imunogénica inalterada pode resultar numa melhoria no campo da terapia de doenças alérgicas.

Durante os últimos 15 anos, têm sido feitos consideráveis avanços no campo da caracterização de 2 ΕΡ2281836Β1 alergénios graças à aplicação de tecnologias baseadas em ADN recombinante. Os ADNc que codificam alergénios principais estão disponíveis para estudos de alergenicidade e o desenvolvimento de testes de diagnóstico, e permitem SITs inovadoras baseadas na utilização de proteínas recombinantes purificadas e suas variantes geneticamente modificadas que são caracterizadas por terem actividade alérgica reduzida (6) . 0 pólen de Parietaria é uma das mais importantes causas de alergia na região do Mediterrâneo. Em particular, pelo menos 50% de todos os casos alérgicos no sul de Itália apresentam uma resposta positiva aos testes cutâneos de alergia por picada ao pólen de Parietaria (7).

Os dois principais alergénios do pólen de Parietaria judaica, i.e. Par j 1 (cuja sequência de nucleótidos está identificada na base de dados GenBank Acc. No. X95867) e Par j 2 (AC X95865), são proteínas com pesos moleculares de 14,4 e 11,3 kD, respectivamente, e partilham homologia sequencial e funcional (8, 9) . A percentagem de identidade sequencial é aproximadamente 45% e é mais proeminente na região N-terminal das proteínas, onde o epítopo IgE está localizado. Este epítopo é responsável por grande parte da reactividade cruzada entre as duas moléculas (10, 11) . Estes dois alergénios independentes exibem características comuns, e pertencem a uma família de proteínas de origem vegetal que é chamada ns-LTPs (Proteínas de transferência de lípidos não específicas) e caracterizada por uma estrutura tridimensional altamente conservada (12). Estas proteínas têm como função o transporte de moléculas lipídicas através da membrana. 3 ΕΡ2281836Β1 Têm sido realizados numerosos estudos para identificar ou alterar epitopos IgE de alergénios major de Parietaria.

Alterando algumas cisteinas que são relevantes para a manutenção da estrutura tridimensional em ambos os alergénios, foram obtidos por mutagénese dirigida (13) mutantes tridimensionais com ligação reduzida a IgE e alergenicidade diminuída em humanos. A utilização de péptidos sintéticos sobreponíveis correspondendo à sequência total de Par j 1 e Par j 2 permitiu a detecção de epitopos lineares que são capazes de se ligar a anticorpos IgE de pacientes alérgicos a Parietaria. 0 posicionamento destas sequências no modelo tridimensional dos 2 alergénios permitiu a localização de três regiões com alta reactividade a IgE e um alto grau de homologia em ambas as moléculas (11). 0 documento WO02/226674 (14) divulga uma variante hipoalergénica do alergénio major Par j 2 (correspondendo a SEQ ID NO: 10, ilustrada abaixo), na qual a alteração em 8 lisinas distribuídas pela proteína causa um forte decréscimo na capacidade de ligação a anticorpos IgE específicos. 0 documento EP1712560 (15) identifica os aminoácidos envolvidos nas reacções de ligação entre anticorpos IgE específicos e Par j 1. As diferentes combinações de resíduos mutados dão origem a moléculas com diferentes graus de alergenicidade e demonstram a presença de múltiplos epitopos que são reconhecidos em grau variável por pacientes alérgicos a Parietaria judaica. 4 ΕΡ2281836Β1 A possibilidade de utilizar moléculas multiméricas manipuladas feitas de diferentes alergénios do mesmo organismo para hipossensibilização por imunoterapia especifica é, há muito tempo, considerada fascinante. A alergia a pólen de Parietaria é um óptimo modelo de estudo, dado que esta alergia é causada principalmente pelos dois componentes alergénicos, Par j 1 e Par j 2, uma mistura dos quais é capaz de inibir a ligação entre IgEs específicos e pólen de Parietaria judaica até 95% (16), demonstrando assim que outros alergénios no extracto são clinicamente menos importantes. É sabido que Par j 1 e Par j 2 partilham numerosos epítopos IgE, e que Par j 2 pode ser utilizado como marcador para o diagnóstico de alergia a Parietaria. A associação de Par j 1 e Par j 2 numa única molécula híbrida representaria todo o repertório de epítopos de células T, e pode induzir uma forte resposta protectora IgG. 0 documento W02004/104047 (17) propõe uma molécula multimérica que compreende pelo menos uma primeira sequência de aminoácidos que corresponde a um dos alergénios major de Parietaria Par j 1 ou Par j 2, uma segunda sequência que codifica para Par j 1 ou Par j 2, e de preferência uma terceira sequência derivada de um dos dois alergénios major de Parietaria. São também objecto da invenção moléculas multiméricas nas quais alergénios major são mutados na região entre os aminoácidos 1 a 30, preferencialmente nas posições Lys 23, Glu 24, e Lys 27. Na secção dos Resultados, a capacidade para induzir a libertação de histamina a partir do dímero Parj2-Parjl wt ou mutado é analisada em comparação com uma mistura equimolar dos alergénios recombinantes Par j 1 e 5 ΕΡ2281836Β1

Par j 2 isolados. É relatado (Figura 6, página 12) que o dimero wt (clone PjED) induz uma menor libertação de histamina em dois dos três pacientes testados (painéis G e H) , enquanto que o dimero mutado (clone PjEDmut) é igual ao dimero wt em dois dos três pacientes, e é menos efectiva em um dos três (painel F) , demonstrando assim que as mutações inseridas no clone PjEDmut nas posições Lys 23, Glu 24, e Lys 27 não são cruciais para a ligação especifica a IgEs em todos os pacientes alérgicos.

Num artigo datado de 2007 (18), Bonura et al. testaram o híbrido Par j 2-Par j 1 comparando-o com o seu derivado, rPjEDcys, que havia sido mutado em ambos os alergénios em cisteínas que são importantes para a manutenção da estrutura tridimensional. O híbrido mutado rPjEDcys tem reactividade IgE diminuída, como demonstrado em testes ELISA de inibição e experiências SPT, e por indução de libertação de histamina por basófilos. Além disso, a variante mutada mantém os seus epítopos de células T inalterados porque, quando injectado em ratinhos, é capaz de induzir uma produção de anticorpos IgG capazes de reconhecer os alergénios Par j 1 e Par j 2 isolados.

No mesmo ano, Gonzalez-Rioja et al. (16) testaram três moléculas híbridas diferentes feitas a partir dos dois alergénios major de Parietaria, Par j 1 e Par j 2, na sua forma tipo selvagem (Ql), ou na forma de mutantes nos quais apenas o fragmento 29-52 contendo 4 cisteínas envolvidas nas 4 ligações dissulfureto (Q2), e este fragmento mais uma supressão adicional de 8 resíduos (aminoácidos 72-79 de Par j 1, e 73-80 de Par j 2, Q3) correspondendo a dois epítopos IgE lineares putativos, foram deletados em ambas as proteínas. Os 6 ΕΡ2281836Β1 resultados mostram que o híbrido Q1 tem menor reactividade IgE comparado com a mistura dos dois alergénios isolados, e uma diminuição ainda maior é observada com Q2 e Q3. A capacidade para estimular linfócitos T permanece inalterada para os híbridos Q1 e Q2 comparada com a mistura das proteínas isoladas, enquanto que diminui significativamente no caso de Q3, indicando que a deleção destas sequências remove epítopos T importantes para a resposta protectora de anticorpos, ver também W02007/116316.

Nos dois artigos acima citados, a diminuição da alergenicidade das moléculas está relacionada com a mutação de algumas cisteínas que se sabe serem cruciais para a manutenção da sua estrutura tridimensional e, por isso, de epítopos conformacionais de células B.

Os resultados obtidos com alergénios major mutados em aminoácidos que não estão directamente envolvidos na estabilização da estrutura 3D (17) mostraram ser pouco encorajadores porque o mutante oligomérico demonstrou uma diminuição de alerginicidade não significativa, não só em relação à mistura dos componentes alergénios wt isolados, mas também comparado com a molécula dimérica wt. Estas moléculas não parecem ser candidatos eficazes para a utilização como ingrediente hipoalergénico único na terapia de alergia ao pólen de Parietaria judaica.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Verificou-se agora que a ligação dos alergénios Par j 1 e Par j 2 a IgEs pode ser diminuída utilizando-as na forma de uma proteína híbrida feita a partir da sequência do alergénio 7 ΕΡ2281836Β1

Par j 1 ligada à sequência do Par j 2, na qual ambas as sequências são mutadas através da substituição de resíduos de aminoácidos.

De acordo com uma primeira forma de realização, a invenção proporciona uma proteína híbrida que consiste em sequências Par j 1 e Par j 2 mutadas ligadas entre si em qualquer ordem ou directamente ou por interposição de um ligante, em que: (a) na sequência Par j 1 - que é ou SEQ ID N0:1 ou uma sequência de uma proteína de ocorrência natural que é idêntica a SEQ ID N0:1 em pelo menos 95%, de preferência pelo menos 98% - os resíduos de Lys nas posições 23, 27, 41, e 66 da SEQ ID N0:1, ou em posições correspondentes na referida sequência de ocorrência natural, são substituídos por aminoácidos neutros, polares, ou acídicos; (b) na sequência Par j 2 - que é ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de uma proteína de ocorrência natural que é idêntica a SEQ ID N0:2 em pelo menos 95%, de preferência, pelo menos 98% - os resíduos de Lys nas posições 19, 23, 27, 35, 41, 46, 73 e 78 da SEQ ID N0:2, ou em posições correspondentes na referida sequência de ocorrência natural, são substituídos por aminoácidos neutros, polares, ou acídicos; (c) as referidas sequências Par j 1 e Par j 2 têm uma orientação head-to-tail; 8 ΕΡ2281836Β1 (d) no caso de estar presente, o referido ligante consiste numa cadeia de aminoácidos contendo 1 a 8 aminoácidos.

As posições acima especificadas de resíduos mutados referem-se a moléculas Par j 1 e Par j 2 tal como identificadas pela SEQ ID NO: le 2, respectivamente. Contudo, a proteína híbrida de acordo com a invenção pode conter sequências de moléculas de ocorrência natural da mesma classe de Par j 1 e Par j 2, tal como Par j 1.0102 (Uniprot 004404), Par j 1.0201 (Uniprot Q40905), Par j 1.0101 (Uniprot P43217), Par j 2.0101 (Uniprot P55958), e Par j 2.0101 (Uniprot P55958), que são mutadas em resíduos Lys que correspondem aos resíduos Lys nas posições acima identificadas de SEQ ID NO:l ou 2, em alinhamentos de sequências entre as referidas moléculas de ocorrência natural e SEQ ID NO:l ou 2.

Podem ser dispostas proteínas Par j 1 e Par j 2 em qualquer ordem na molécula híbrida, e com uma orientação head-to-tail, significando com isto que quando o N-terminal da proteína híbrida coincide com o N-terminal de Par j 1 ou Par j 2, o C-terminal da proteína híbrida coincide com o C-terminal de Par j 2 ou Par j 1, respectivamente. De acordo com uma forma de realização preferencial, o N-terminal da proteína híbrida é ocupado por Par j 1 e o C-terminal por Par j 2. O ligante que separa as sequências mutadas de Par j 1 e Par j 2 consiste, de preferência, numa cadeia de 8 aminoácidos, mais preferencialmente numa cadeia de 2 aminoácidos, ainda mais preferencialmente no dipéptido GlySer. 9 ΕΡ2281836Β1

Os resíduos de Lys acima identificados são preferencialmente substituídos por aminoácidos seleccionados a partir de Ala, Gly, Pro, Leu, Ile, Phe, Thr, Ser, Gin, Asn, Glu, e Asp, mais preferencialmente a partir de Ala, Gly, Thr, Ser, Gin, Asn, Glu, e Asp.

Numa forma de realização particularmente preferida da invenção, a proteína híbrida tem a sequência identificada em SEQ ID N.3. A reactividade desta proteína híbrida a IgE foi analisada em doze soros de indivíduos alérgicos a pólen de Parietaria através de ensaios ELISA (Figura 2) . Quando incubada com os soros, a proteína híbrida exibiu uma diminuição média na reactividade a IgEs de 41% comparado com o híbrido wt (SEQ ID N.4), com valores compreendidos entre 10 e 100%.

Estes resultados foram confirmados por experiências de ELISA de inibição, permitindo a avaliação da reactividade de epítopos homólogos em diferentes proteínas. A concentrações de inibição equimolares (0,150 nM) , a ligação entre extracto de Parietaria judaica adsorvido nos poços e anticorpos IgE específicos contido nos soros de 14 pacientes foi inibida, em média, em 69,8% quando o soro foi previamente tratado com a mistura de alergénios wt isolados, em 16,5% quando pré-incubados com a mistura dos dois componentes mutados, em 62,4% quando tratados com SEQ ID N.4, e em 7,6% quando pré-incubados com SEQ ID N.3 (Figura 3).

Assim, a capacidade do mutante híbrido de acordo com a invenção para inibir a ligação de extracto de Parietaria a anticorpos IgE específicos é significativamente menor do que 10 ΕΡ2281836Β1 ambas o híbrido wt SEQ ID N.4 (p<0.001) e a mistura dos dois alergénios mutados (p<0.05).

Além disso, as proteínas híbridas tipo-selvagem (SEQ ID N.4) e hipoalergénicas (SEQ ID NO.3), quando usadas para imunizar ratinhos Balb/c, demonstraram ser capazes de induzir uma resposta IgG específica a extracto de Parietaria (Figura 4). Moléculas híbridas SEQ ID N.3 e SEQ ID N.4 induziram uma resposta IgG a extracto de Parietaria anterior comparada com todo o extracto. Após quatro semanas da primeira imunização, correspondendo a uma semana depois da segunda imunização, a resposta IgG foi 2,5 vezes superior com SEQ ID N.4, e 1,7 vezes superior com SEQ ID N.3 do que a obtida por imunização com extracto de Parietaria. Além disso, a resposta anticorpos IgG obtida com SEQ ID N.3 foi muito mais forte do que a obtida por imunização com quantidades equimolares das duas variantes mutadas isoladas (mut mix) . Reciprocamente, anticorpos no soro de animais imunizados com um antigénio não relacionado não foram capazes de reconhecer extracto de Parietaria.

Relativamente à indução de anticorpos protectores capazes de bloquear a ligação de alergénios a anticorpos IgE, foi observado que anticorpos IgG produzidos contra SEQ ID N. 3 inibiram a ligação de IgEs de doentes alérgicos a Parietaria ao extracto total de Par j (Figura 5). Experiências ELISA de inibição mostraram que IgGs de ratinhos imunizados com SEQ ID N.3 inibiram a reactividade IgE de onze soros em 33,4% em média (com valores de 19,7 a 50,7%), e que anticorpos produzidos contra o extracto total de Parietaria inibiram esta ligação em 37,8% (27,5-47,3%), enquanto que IgGs obtidas por imunização com a mistura dos dois alergénios Par j 1 e 11 ΕΡ2281836Β1

Par j 2 mutados (mut mix) inibiram a ligação IgE-extracto, em média, em 28,6%, com valores de 13% a 50%. A proteína híbrida de acordo com a invenção pode ser facilmente preparada por mutagénese de Par j 1 (SEQ ID NO:5), Par j 2 (SEQ ID NO:6), isoformas ou suas variantes naturais, ou da sequência de ADNc do híbrido wt (SEQ ID N.7), através de métodos que são conhecidos por aqueles peritos na especialidade (ver e.g. 13, 18, 19).

Num aspecto adicional, portanto, a invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína híbrida tal como aqui definida.

Numa forma de realização preferida, uma tal molécula de ácido nucleico codifica a proteína SEQ ID NO:3 e consiste na sequência SEQ ID NO:8.

Ainda num outro aspecto, a invenção proporciona um vector de expressão contendo uma molécula de ácido nucleico como aqui definida juntamente com elementos para regulação da expressão em células eucarióticas e procarióticas, tais como promotores de transcripção, potenciadores, sequências de sinal e outras sequências para regulação da transcripção. O vector pode ser um plasmídeo, vírus, ou qualquer outro vector comummente usado em engenharia genética. A invenção compreende ainda uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica que é transformada ou transfectada com o vector da invenção. Células procarióticas tais como Escherichia coli e Bacilus subtilis, ou células eucarióticas tais como Saccharomyces cerevisiae são 12 ΕΡ2281836Β1 geralmente usadas para clonagem de vector e expressão de ADNc.

Além disso, podem ser produzidas proteínas híbridas hipoalergénicas de acordo com a invenção como proteínas de fusão.

Dada a reactividade diminuída a IgEs, a molécula híbrida de acordo com a presente invenção pode ser utilizada de maneira conveniente para a preparação de composições farmacêuticas para serem utilizadas na imunoterapia de indivíduos alérgicos a pólen de Parietaria judaica.

Um outro aspecto da invenção refere-se, por conseguinte, a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de uma molécula híbrida como aqui proporcionada, opcionalmente em combinação com outros alergénios de Parietaria judaica e com veículos, excipientes e adjuvantes farmacologicamente aceitáveis. Numa forma de realização preferida, uma tal composição farmacêutica apresenta-se na forma de uma vacina adequada para o tratamento profiláctico ou terapêutico de doenças alérgicas tais como bronquite asmática, rinite alérgica e conjuntivite alérgica. Princípios e métodos para vacinação são conhecidos por aqueles peritos na especialidade, e são descritos em (20) e (21).

Os exemplos seguintes ilustram a invenção com mais pormenor. 13 ΕΡ2281836Β1

EXEMPLOS A menos que seja indicado de outra maneira, os métodos utilizados nos exemplos seguintes são descritos em Sambrook, Fritsch ET Maniatis "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" II Ed. Vol. 1-2-3 CSH Lab Press 1989. EXEMPLO 1 - Construção de um plasmídeo que codifica para a molécula híbrida Par j 1-Par j 2 tipo-selvagem (wtHybrid) A molécula híbrida contendo a informação genética para o híbrido Par j 1-Par j 2 tipo-selvagem foi obtida por fusão de ADNc que codificam para os alergénios isolados.

Os ADNc que codificam proteínas maduras Par j 1 e Par j 2 foram obtidas separadamente por PCR utilizando os oligonucleótidos iniciadores Pj 1 DIM FW (gcg cga aga aac ctg cgg gac tgt agt g) e Pjl DIM RV (gcg gga tcc ggc ttt ttc cgg tgc ggg ggg) para Par j 1, e os oligonucleótidos iniciadores Pj2 FW (cgc gga tcc gag gag gct tgc ggg) e PJ2 RV (gcg gga tcc cta ata gta acc tct gaa aat agt act ttg) para Par j 2. Os clones Par j 1 SEQ ID NO:5 e Par j 2 SEQ ID NO:6 foram usados como moldes. 0 produto da amplificação obtido a partir de Par j 1 foi re-amplifiçado por substituição do iniciador Pj 1 DIM FW por Pjl His FW(gcg cat atg cat cac cat cac cat cac gaa gaa acc tgc ggg act g) , pelo que foi inserida uma sequência codificante para seis histidinas a montante da sequência Par j 1. Um local de restrição Nde I (contendo a ATG) foi inserido no 5' do produto de amplificação de Par j 1, e um local de restrição Bam Η I foi inserido no seu 3 ' em substituição do codão de terminação. Um local de restrição Bam Η I foi inserido no local de ATG no 5'de Par j 2, e um 14 ΕΡ2281836Β1 local de restrição Bam Η I foi inserido no seu 3 ' após o codão de terminação. Os produtos amplificados foram purificados, digeridos com as enzimas de restrição Nde I e Bam Η I (Par j 1) , ou Bam Η I (Par j 2) (os locais de restrição estão sublinhados nas sequências dos iniciadores) , e subsequentemente inseridos nos locais de restrição Nde I/Bam Η I do vector pEt 3c (Stratagene, La Jolla, CA) para obter um construct capaz de expressar uma proteína de fusão Par j 1-Par j 2 precedida de uma sequência de seis histidinas. A introdução do local de restrição Bam Η I, que é necessária para a clonagem de fragmentos, permitiu a inserção de dois aminoácidos (glicina e serina) na junção das duas proteínas sem alteração da fase de leitura (Figura 1).

Os clones obtidos a partir de colónias bacterianas únicas foram sequenciados através do método de Sanger para verificar que a alteração de bases estava correcta, e a ausência de mutações não específicas no ADNc. EXEMPLO 2 - Construção de um plasmídeo que codifica para a molécula híbrida Par j 1-Par j 2 mutante (MutHybrid) A molécula híbrida codificante para o híbrido Par j 1-Par j 2 mutante foi obtida seguindo o método descrito no EXEMPLO 1 para o híbrido variante tipo-selvagem.

Os pares de oligonucleótidos utilizados na reacção de PCR foram idênticos, enquanto que os ADNc utilizados como moldes codificaram para duas variantes hipoalergénicas cujas sequências são aqui identificadas como SEQ ID NO: 9 (para o mutante Par j 1) e SEQ ID NO:10 (mutante Par j 2). 15 ΕΡ2281836Β1

Os clones obtidos a partir de colónias bacterianas únicas foram sequenciados através do método de Sanger para verificar que a alteração de bases estava correcta, e a ausência de mutações não especificas no ADNc. EXEMPLO 3 - Produção de proteínas Par j 1 e Par j 2, respectivas mutantes, ftrtHybrid e MutHybrid

Os ADNc de Par j 1 (SEQ ID NO:5) e Par j 2 (SEQ ID NO:6) tipo-selvagem, os ADNc mutados (SEQ ID NO: 9 e 10), e os ADNc híbridos wt e Mut manipulados (SEQ ID NO: 7 e 8), precedidos pela sequência que codifica para seis histidinas, foram clonados utilizando um vector de expressão e expressos em células de Escherichia coli de acordo com protocolos padronizados (22, 23). As células foram recolhidas através de centrifugação e ressuspensas numa solução-tampão de 50 mM NaH2P04, 300 mM NaCl, pH 8. As proteínas recombinantes foram isoladas após lise das células bacterianas por sonicação e remoção de precipitados celulares por meio de centrifugação. As proteínas foram purificadas a partir do sobrenadante por cromatografia de afinidade utilizando colunas de agarose às quais foi ligado o quelante de iões níquel-ácido nitrilotriacético, que interagem com a porção de seis histidinas fusionadas ao alergénio. EXEMPLO 4 - Características dos soros de indivíduos alérgicos

Foram recolhidos soros de indivíduos com uma história clínica de alergia sazonal ao pólen de Parietaria judaica, e reactividade RAST 3+ e 4+ específica para os alergénios Par j 1 e Par j 2. Um grupo de soros de indivíduos não alérgicos foi usado como controlo (resultados não publicados). 16 ΕΡ2281836Β1

EXEMPLO 5 - Reactividade da proteína híbrida SEQ ID N: 3 a IgEs de soros de pacientes alérgicos a Parietaria através de ensaios ELISA

Quantidades iguais (0.075 nM) de SEQ ID NO: 4 e a sua variante mutante SEQ ID NO:3, em solução-tampão de 50 mM carbonato/bicarbonato, pH 9,6, foram adsorvidas em poços de placas de poliestireno para ensaios ELISA por incubação a 4°C durante 16 horas. Os poços foram então lavados com solução de lavagem (solução-tampão fosfato 60 mM, pH 6.5, contendo 0,05% Tween-20), e os sítios livres foram bloqueados com solução de diluição (15% soro de cabra, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, em solução-tampão fosfato a 150 mM, pH 7.4). Alíquotas iguais (100 μΐ) de 12 soros humanos positivos para Par j 1 e Par j 2, ou soros de indivíduos não alérgicos (resultados não publicados), numa diluição de 1:10 em tampão de diluição foram adicionados a cada amostra e incubados a 25°C durante 3 horas. Após três lavagens, soro anti-IgE humana conjugada com peroxidase diluído 1:3500 em tampão de diluição foi adicionado, e incubado a 25°C durante 1,5 horas. Após três lavagens, o desenvolvimento da reacção colorimétrica foi obtido através da adição de 100 μΐ de reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD), e incubação durante 20 minutos a 25°C. A reacção foi interrompida pela adição de 100 μΐ de HC1 1 N, e analisada através da leitura a 450 nm com um espectrofotómetro. 17 ΕΡ2281836Β1 EXEMPLO 6 - Ensaio ELISA de inibição - SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 3 inibem a ligação de extracto de Parietaria judaica a IgEs em soros

Quantidades iguais (1 pg) de extracto de Parietaria judaica em solução-tampão de carbonato/bicarbonato a 50 mM, pH 9.6, foram adsorvidas em poços de placas de poliestireno para ensaios ELISA por meio de incubação a 4°C durante 16 horas. Os poços foram então lavados com solução de lavagem (solução-tampão de fosfato 60 mM, pH 6.5, contendo 0,05% Tween-20), e os sítios livres foram bloqueados com solução de diluição (15% soro de cabra, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, em solução-tampão fosfato a 150 mM, pH 7.4). Alíquotas (100 μΐ) de uma diluição 1:5 de soro humano RAST 4+ e 3+ para Par j 1 e Par j 2 foram pré-incubadas com quantidades equimolares (0.150 nM) de alergénios (híbridos) wt, mutados ou manipulados a 25 °C durante 2 horas. As misturas foram então adicionadas a cada poço, e incubadas a 4°C durante 16 horas. Após três lavagens com solução-tampão fosfato a 0.06 M, pH 6.5, 0,05% Tween-20, soro anti-IgE humana conjugada com peroxidase diluído 1:3000 em tampão de diluição foi adicionado, e incubado a 25°C durante 1.5 horas. Após três lavagens, a o desenvolvimento da reacção colorimétrica foi obtido através da adição de 100 μΐ de reagente TMB (BioFX Laboratories, Owing Mills, MD), e incubação durante 20 minutos a 25°C. A reacção foi interrompida por meio da adição de 100 μΐ de HC1 1 N, e analisada através da leitura a 450 nm com um espectrofotómetro. A percentagem de inibição foi calculada através da utilização da seguinte fórmula: 100 x [ (A-B) /A] , em que A é a absorbância a 450 nm na ausência de inibidor, e B a absorbância na presença de inibidor. 18 ΕΡ2281836Β1

Tabela. Moléculas híbridas tipo-selvagem e mutadas inibem ligação Parietaria judaica-IgE

Soro wt Mix Mut Mix SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 3 1 84.2 7.0 87.6 0.4 2 83.4 10.1 77.7 -0 . 6 3 61.2 24.0 59.7 -4.2 4 71.8 5.4 47.7 1. 0 5 62.7 13.9 61.5 12.9 6 39.9 5.8 30.6 12.5 7 78.9 13.6 79.3 12.6 8 85.4 21.8 83.9 14.8 9 73.7 1.7 46.5 8 . 9 10 83.4 30.9 81. 6 17.3 11 70.7 30.8 70.5 22.5 12 31.0 1.5 4.0 -3.4 13 79.6 9.6 63.4 5.5 14 71.6 54.8 80.0 6.7 % inibição média 69.8 16.5 62.4 7.6 Desvio padrão 16.52 14.77 23.63 8.20 EXEMPLO 7 - Imunização de ratinhos Balb/c

Cinco grupos de ratinhos cada um composto por três animais fêmeas de estirpe Balb/c (Charles River) foram imunizados subcutaneamente com 200 μΐ de emulsão feita de 100 μΐ de adjuvante completo de Freund e quantidades equimolares (0.150 nM) de antigénio recombinante ou extracto de Parietaria judaica (20 pg) em 100 μΐ de solução salina. Outros dois reforços foram realizados após 21 e 42 dias 19 ΕΡ2281836Β1 substituindo o adjuvante completo por adjuvante incompleto. Como controlo, três ratinhos receberam o mesmo tratamento com um antigénio não relacionado (resultados não publicados). Quatro, seis, e nove semanas depois da primeira imunização, colheitas de sangue foram realizadas a partir da veia jugular dos ratinhos, e a resposta de anticorpos ao respectivo imunogénio foi verificada por meio de ELISA.

EXEMPLO 8 - Análise da resposta IgG específica em ratinhos imunizados por ensaio ELISA

Quantidades iguais (1 pg) de extracto de Parietaria judaica em solução-tampão de carbonato/bicarbonato a 50 mM, pH 9.6, foram adsorvidas em poços de placas de poliestireno para ensaios ELISA por meio de incubação a 4°C durante 16 horas. Os poços foram depois lavados com solução de lavagem (solução-tampão de fosfato 60 mM, pH 6.5, contendo 0,05% Tween-20), e os sitios livres foram bloqueados com solução de diluição (15% soro de cabra, 1 mM EDTA, 0.05% Tween-20, em solução-tampão fosfato a 150 mM, pH 7.4) . Soros de ratinhos foram agrupados de acordo com o tipo imunogénico e o tempo decorrido a partir da primeira imunização. Aliquotas iguais (100 μΐ) de cada grupo foram adicionadas a cada poço numa diluição de 1:27000 em tampão de diluição, e incubadas a 25°C durante 3 horas. Após três lavagens, soro anti-IgG de rato total conjugada com peroxidase diluído 1:8000 em tampão de diluição foi adicionado, e incubado a 25°C durante 1,5 horas. Após três lavagens, o desenvolvimento da reacção colorimétrica foi obtido através da adição de 100 μΐ de reagente TMB (BioFX Laboratories, Owing Mills, MD), e incubação durante 20 minutos a 25°C. A reacção foi interrompida por meio da adição de 100 μΐ de HC1 1 N, e 20 ΕΡ2281836Β1 analisada através da leitura a 450 nm com um espectrofotómetro. EXEMPLO 9 - Ensaio ELISA de inibição: IgGs contra SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 3 inibem a ligação entre extracto de Parietaria judaica e IgEs em soros de pacientes alérgicos a Parietaria

Quantidades iguais (1 pg) de extracto de Parietaria judaica em solução-tampão de carbonato/bicarbonato a 50 mM, pH 9.6, foram adsorvidas em poços de placas de poliestireno para ensaios ELISA por meio de incubação a 4°C durante 16 horas. Os poços foram então lavados com solução de lavagem (solução-tampão de fosfato 60 mM, pH 6.5, contendo 0.05% Tween-20), e os sitios livres foram bloqueados com solução de diluição (15% soro de cabra, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, em solução-tampão fosfato a 150 mM, pH 7.4). Alíquotas (100 μΐ) de grupos diluídos a 1:25 de soros de ratinho recolhidos sete semanas após a primeira imunização foram incubados a 4°C durante 16 horas. Após três lavagens com solução-tampão fosfato a 0.06 M, pH 6.5, 0,05% Tween-20, doze soros humanos, diluídos 1:10, RAST 4+ e 3+ a Par j 1 e Par j 2 foram adicionados a 25°C durante 2 horas. Após três lavagens com solução-tampão fosfato a 0.06 M, pH 6.5, 0,05% Tween-20, soro anti-IgE humana conjugada com peroxidase diluído 1:3500 em tampão de diluição foi adicionado, e incubado a 25°C durante 1,5 horas. Após três lavagens, o desenvolvimento da reacção colorimétrica foi obtido através da adição de 100 μΐ de reagente TMB (BioFX Laboratories, Owing Mills, MD) , e incubação durante 20 minutos a 25°C. A reacção foi interrompida por meio da adição de 100 μΐ de HC1 1 N, e analisada através da leitura a 450 nm com um 21 ΕΡ2281836Β1 espectrofotómetro. A percentagem de inibição foi calculada através da utilização da seguinte fórmula: 100 x [(A-B)/A], em que A é a absorbância a 450 nm na ausência de soro humano inibidor, e B a absorbância na presença de soro humano inibidor. EXEMPLO 10 - Análise estatística

Nas figuras, os resultados são expressos como valores médios com o correspondente desvio padrão.

Software UNISTAT 5.5 Light para Excel foi usado para análises estatísticas. Os resultados foram analisados pelo teste t para amostras emparelhadas.

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ALERGÉNIOS MAJOR DE PARIETARIA

<12 0> PROTEÍNAS HÍBRIDAS DE JUDAICA E SUAS UTILIZAÇÕES

<130> 8887MEUR <160> 15 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 139 <212> PRT <213> Parietaria judaica 26 ΕΡ2281836Β1 <400> 1

Glu Glu Thr Cys Gly Thr Vai Vai Gly Ala Leu Met Pro Cys Leu Pro 1 5 io 15

Phe Vai Gin Gly Lys Glu Lys Glu Pro Ser Lys Gly Cys Cys Ser Gly 20 25 30

Ala Lys Arg Leu Asp Gly Glu Thr Lys Thr Gly Pro Gin Arg Vai His 35 40 45

Ala Cys Glu Cys Ile Gin Thr Ala Met Lys Thr Tyr Ser Asp Ile Asp 50 55 60

Gly Lys Leu Vai Ser Glu Vai Pro Lys His Cys Gly Ile Vai Asp Ser 65 70 75 80

Lys Leu Pro Pro Ile Asp Vai Asn Met Asp Cys Lys Thr Leu Gly Vai 85 90 95

Vai Pro Arg Gin Pro Gin Leu Pro Vai Ser Leu Arg His Gly Pro Vai 100 105 110

Thr Gly Pro Ser Asp Pro Ala His Lys Ala Arg Leu Glu Arg Pro Gin 115 120 125

Ile Arg Vai Pro Pro Pro Ala Pro Glu Lys Ala 130 135 <210> 2 <211> 102 <212> PRT <213> Parietaria judaica 27 ΕΡ2281836Β1 <4Ο0> 2

Gin Asp Ile Met Pro Cys Leu His 10 15

Glu Glu Ala Cys Gly Lys Vai Vai 1 5

Phe Vai Lys Gly Glu Glu Lys Glu 20

Pro Ser Lys Glu Cys Cys Ser Gly 25 30

Thr Lys Lys Leu Ser Glu Glu Vai 35 40

Lys Thr Thr Glu Gin Lys Arg Glu 45

Ala Cys Lys Cys Ile Vai Arg Ala 50 55

Thr Lys Gly Ile Ser Gly Ile Lys 60

Asn Glu Leu Vai Ala Glu Vai Pro 65 70

Lys Lys Cys Asp Ile Lys Thr Thr 75 80

Leu Pro Pro Ile Thr Ala Asp Phe 85

Asp Cys Ser Lys Ile Gin Ser Thr 90 95

Ile Phe Arg Gly Tyr Tyr 100 <210> 3 <211> 243 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência si 28 ΕΡ2281836Β1 <400> 3

Glu Glu Thr Cys Gly Thr Vai Vai Gly Ala Leu Met Pro Cys Leu Pro 15 10 15

Phe Vai Gin Gly Lys Glu Ala Glu Pro Ser Ala Gly Cys Cys Ser Gly 20 25 30

Ala Lys Arg Leu Asp Gly Glu Thr Ala Thr Gly Pro Gin Arg Vai His 35 40 45

Ala Cys Glu Cys Ile Gin Thr Ala Met Lys Thr Tyr Ser Asp Ile Asp 50 55 60

Gly Ala Leu Vai Ser Glu Vai Pro Lys His Cys Gly Ile Vai Asp Ser 65 70 75 80

Lys Leu Pro Pro Ile Asp Vai Asn Met Asp Cys Lys Thr Leu Gly Vai 85 90 95 29 ΕΡ2281836Β1

Vai Pro Arg Gin Pro Gin Leu Pro 100

Thr Gly Pro Ser Asp Pro Ala His 115 120

Ile Arg Vai Pro Pro Pro Ala Pro 130 135

Cys Gly Lys Vai Vai Gin Asp Ile 145 150

Gly Glu Glu Ala Glu Pro Ser Ala 165

Leu Ser Glu Glu Vai Ala Thr Thr 180

Cys Ile Vai Arg Ala Thr Lys Gly 195 200

Vai Ala Glu Vai Pro Gly Lys Cys 210 215

Ile Thr Ala Asp Phe Asp Cys Ser 225 230 Gly Tyr Tyr <210> 4 <211> 243 <212> PRT <213> Desconhecido <22 0> <223> Sequência sintética

Vai Ser Leu Arg His Gly Pro Vai 105 110 Lys Ala Arg Leu Glu Arg Pro Gin 125 Glu Lys Ala Gly Ser Glu Glu Ala 140 Met Pro Cys Leu His Phe Vai Gin 155 160 Glu Cys Cys Ser Gly Thr Lys Gly 170 175 Glu Gin Ala Arg Glu Ala Cys Lys 185 190 Ile Ser Gly Ile Lys Asn Glu Leu 205 Asp Ile Ser Thr Thr Leu Pro Pro 220 Lys Ile Gin Ser Thr Ile Phe Arg 235 240 30 ΕΡ2281836Β1 <4Ο0> 4

Glu Glu Thr Cys Gly Thr Vai Vai Gly Ala Leu Met Pro Cys Leu Pro 15 10 15

Phe Vai Gin Gly Lys Glu Lys Glu Pro Ser Lys Gly Cys Cys Ser Gly 20 25 30

Ala Lys Arg Leu Asp Gly Glu Thr Lys Thr Gly Pro Gin Arg Vai His 35 40 45 31 ΕΡ2281836Β1

Ala Cys Glu Cys Ile Gin Thr Ala Met Lys Thr Tyr Ser Asp Ile Asp 50 55 60

Gly Lys Leu Vai Ser Glu Vai Pro Lys His Cys Gly Ile Vai Asp Ser 65 70 75 80

Lys Leu Pro Pro Ile Asp Vai Asn Met Asp Cys Lys Thr Leu Gly Vai 85 90 95

Vai Pro Arg Gin Pro Gin Leu Pro Vai Ser Leu Arg His Gly Pro Vai 100 105 110

Thr Gly Pro Ser Asp Pro Ala His Lys Ala Arg Leu Glu Arg Pro Gin 115 120 125

Ile Arg Vai Pro Pro Pro Ala Pro 130 135

Glu Lys Ala Gly Ser Glu Glu Ala 140

Cys Gly Lys Vai Vai Gin Asp Ile 145 150

Met Pro Cys Leu His Phe Val Lys 155 160

Gly Glu Glu Lys Glu Pro Ser Lys 165

Glu Cys Cys Ser Gly Thr Lys Lys 170 175

Leu Ser Glu Glu Vai Lys Thr Thr 180

Glu Gin Lys Arg Glu Ala Cys Lys 185 190

Cys Ile Val Arg Ala Thr Lys Gly 195 200

Ile Ser Gly Ile Lys Asn Glu Leu 205

Val Ala Glu Val Pro LysLys Cys 210 215

Asp Ile Lys Thr Thr Leu Pro Pro 220

Ile Thr Ala Asp Phe Asp Cys Ser 225 230

Lys Ile Gin Ser Thr Ile Phe Arg 235 240

Gly Tyr Tyr <210> 5 <211> 420 32

ΕΡ2281836Β1 <212> ADN <213> Parietaria judaica <400> 5 gaagaaacct gcgggactgt agtgggagcg ctgatgccgt gcctgccgtt cgtgcagggg 60 aaagagaaag agccgtcaaa ggggtgctgc agcggcgcca aaagattgga cggggagacg 120 aagacggggc cgcagagggt gcacgcttgt gagtgcatcc agaccgccat gaagacctat 180 tccgacatcg acgggaaact cgtcagcgag gtccccaagc actgcggcat cgttgacagc 240 aagctcccgc ccattgacgt caacatggac tgcaagacac ttggagtggt acctcggcaa 300 ccccaacttc cagtctctct ccgtcatggt cccgtcacgg gcccaagtga ccccgcccac 360 aaagcacggt tggagagacc ccagattaga gttccgcccc ccgcaccgga aaaagcctaa 420

<210> 6 <211> 309 <212> ADN <213> Parietaria judaica <400> 6 gaggaggctt gcgggaaagt ggtgcaggat ataatgccgt gcctgcattt cgtgaagggg 60 gaggagaagg agccgtcgaa ggagtgctgc agcggcacga agaagctgag cgaggaggtg 120 aagacgacgg agcagaagag ggaggcctgc aagtgcatag tgcgcgccac gaagggcatc 180 .tccggtatca aaaatgaact tgtcgccgag gtccccaaga agtgcgatat taagaccact 240 ctcccgccca tcaccgccga cttcgactgc tccaagatcc aaagtactat tttcagaggt 300 tactattag 309

<210> 7 <211> 732 <212> ADN <213> Desconhecido <220> 33 ΕΡ2281836Β1 <223> Sequência sintética <4Ο0> 7 gaagaaacct gcgggactgt agtgggagcg ctgatgccgt gcctgccgtt cgtgcagggg 60 aaagagaaag agccgtcaaa ggggtgctgc agcggcgcca aaagattgga cggggagacg 120 aagacggggc cgcagagggt gcacgcttgt gagtgcatcc agaccgccat gaagacctat 180 tccgacatcg acgggaaact cgtcagcgag gt.cccGâ.3.çjc actgcggcat cgttgacagc 240 aagctcccgc ccattgacgt caacatggac tgcaagacac ttggagtggt acctcggcaa 300 ccccaacttc cagtctctct ccgtcatggt cccgtcacgg gcccaagtga ccccgcccac 360 aaagcacggt tggagagacc ccagattaga gttccgcccc ccgcaccgga aaaagccgga 420 tccgaggagg cttgcgggaa agtggtgcag gatataatgc cgtgcctgca tttcgtgaag 480 ggggaggaga aggagccgtc gaaggagtgc tgcagcggca cgaagaagct gagcgaggag 540 gtgaagacga cggagcagaa gagggaggcc tgcaagtgca tagtgcgcgc cacgaagggc 600 atctccggta tcaaaaatga acttgtcgcc gaggtcccca agaagtgcga tattaagacc 660 actctcccgc ccatcaccgc cgacttcgac tgctccaaga tccaaagtac tattttcaga 720 ggttactatt ag 732

<210> 8 <211> 732 <212> ADN <213> Desconhecido <22 0> <223> Sequência sintética 34 ΕΡ2281836Β1 <4Ο0> 8 gaagaaacct gcgggactgt agtgggagcg ctgatgccgt gcctgccgtt cgtgcagggg 60 aaagaggcag agccgtcagc ggggtgctgc agcggcgcca aaagattgga cggggagacg 120 gcgacggggc cgcagagggt gcacgcttgt gagtgcatcc agaccgccat gaagacctat 180 tccgacatcg acggggcact cgtcagcgag gtccccaagc actgcggcat cgttgacagc 240 aagctcccgc ccattgacgt caacatggac tgcaagacac ttggagtggt acctcggcaa 300 ccccaacttc cagtctctct ccgtcatggt cccgtcacgg gcccaagtga ccccgcccac 360 aaagcacggt tggagagacc ccagattaga gttccgcccc ccgcaccgga aaaagccgga 420 tccgaggagg cttgcgggaa agtggtgcag gatataatgc cgtgcctgca tttcgtgcag 480 ggggaggagg cggagccgtc ggcggagtgc tgcagcggca cgaaggggct gagcgaggag 540 gtggcgacga cggagcaggc gagggaggcc tgcaagtgca tagtgcgcgc cacgaagggc 600 atctccggta tcaaaaatga acttgtcgcc gaggtccccg ggaagtgcga tattagcacc 660 actctcccgc ccatcaccgc tgacttcgac tgctccaaga tccaaagtac tattttcaga 720 ggttactatt ag 732

<210> 9 <211> 420 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> sequência sintética <400> 9 gaagaaacct gcgggactgt agtgggagcg ctgatgccgt gcctgccgtt cgtgcagggg 60 aaagaggcag agccgtcagc ggggtgctgc agcggcgcca aaagattgga cggggagacg 120 gcgacggggc cgcagagggt gcacgcttgt gagtgcatcc agaccgccat gaagacctat 180 tccgacatcg acggggcact cgtcagcgag gtccccaagc actgcggcat cgttgacagc 240 aagctcccgc ccattgacgt caacatggac tgcaagacac ttggagtggt acctcggcaa 300 ccccaacttc cagtctctct ccgtcatggt cccgtcacgg gcccaagtga ccccgcccac 360 aaagcacggt tggagagacc ccagattaga gttccgcccc ccgcaccgga aaaagcctaa 420 35 ΕΡ2281836Β1 <210> 10 <211> 309 <212> ADN <213> Desconhecido <22 0> <223> sequência sintética <400> 10 gaggaggctt gcgggaaagt ggtgcaggat ataatgccgt gcctgcattt cgtgcagggg 60 gaggaggcgg agccgtcggc ggagtgctgc agcggcacga aggggctgag cgaggaggtg 120 gcgacgacgg agcaggcgag ggaggcctgc aagtgcatag tgcgcgccac gaagggcatc 180 tccggtatca aaaatgaact tgtcgccgag gtccccggga agtgcgatat tagcaccact 240 ctcccgccca tcaccgccga cttcgactgc tccaagatcc aaagtactat tttcagaggt 300 tactattag 309 <210> 11 <211> 28 <212> ADN <213> Desconhecido <22 0> <22 3> oligonucleótido iniciador <400> 11 gcgcgaagaa acctgcggga ctgtagtg 28

<210> 12 <211> 30 <212> ADN 36 ΕΡ2281836Β1 <213> Desconhecido <22 0> <223> oligonucleótido iniciador <4 0 0> 12 gcgggatccg gctttttccg gtgcgggggg 30

<210> 13 <211> 24 <212> ADN <213> Desconhecido <22 0> <223> oligonucleótido iniciador <4 0 0> 13 cgcggatccg aggaggcttg cggg 24

<210> 14 <211> 39 <212> ADN <213> Desconhecido <22 0> <223> oligonucleótido iniciador <4 0 0> 14 gcgggatccc taatagtaac ctctgaaaat agtactttg 39 37 ΕΡ2281836Β1

<210> 15 <211> 46 <212> ADN <213> Desconhecido <22 0> <223> oligonucleótido iniciador <4 0 0> 15 gcgcatatgc atcaccatca ccatcacgaa gaaacctgcg ggactg 46

Lisboa, 30 de Maio de 2012 38

Claims (14)

1. ΕΡ2281836Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína híbrida que consiste em alergénios Par j 1 e Par j 2 mutados, opcionalmente separados por um ligante, em que: a) sequência Par j 1 é ou SEQ ID N0:1 ou a sequência de uma proteína de ocorrência natural idêntica a SEQ ID N0:1 em pelo menos 95%, e na referida sequência Par j 1, os resíduos de Lys nas posições 23, 27, 41 e 66 da SEQ ID N0:1, ou nas posições correspondentes das referidas proteínas de ocorrência natural em que correspondentes resíduos de Lys estão presentes nos respectivos alinhamentos da sequência, são substituídos por aminoácidos neutros, polares ou acídicos; b) sequência Par j 2 é ou SEQ ID N0:2 ou a sequência de uma proteína de ocorrência natural idêntica a SEQ ID N0:2 em pelo menos 95%, e na referida sequência Par j 2, os resíduos de Lys nas posições 19, 23, 27, 35, 41, 46, 73 e 78 da SEQ ID N0:2, ou nas posições correspondentes das referidas proteínas de ocorrência natural em que correspondentes resíduos de Lys estão presentes nos respectivos alinhamentos da 1 ΕΡ2281836Β1 sequência, sao substituídos por aminoácidos neutros, polares ou acídicos; c) sequências Par j 1 e Par j 2, tal como acima definidas, podem ser indiferentemente localizadas nos N-ou C- terminais da proteína híbrida, desde que tenham orientação head-to-tail; d) Se presente, o referido ligante consiste em 1 a 8 aminoácidos.
2. 2. Proteína híbrida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por os referidos resíduos de Lys serem substituídos por aminoácidos selecionados a partir de Ala, Gly, Pro, Leu, Ile, Phe, Thr, Ser, Gin, Asn, Glu, Asp.
3. 3. Proteína híbrida de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por os referidos aminoácidos serem selecionados a partir de Ala, Gly, Thr, Ser, Gin, Asn, Glu, Asp.
4. 4. Proteína híbrida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido ligante ser um dipéptido.
5. 5. Proteína híbrida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por Par j 1 e Par j 2 estarem localizadas nos terminais N- e C-, respectivamente.
6. 6. Proteína híbrida de acordo com a reivindicação 1, tendo a sequência SEQ ID NO:3.
7. 7. Molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de acordo com as reivindicações 1-6. 2 ΕΡ2281836Β1
8. 8. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6, tendo a sequência SEQ ID NO:8.
9. 9. Vector de expressão que contém a molécula de ácido nucleico de acordo com as reivindicações 7-8.
10. 10. Célula hospedeira que contém o vector de acordo com a reivindicação 9.
11. 11. Composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de uma proteína híbrida de acordo com as reivindicações 1-6 juntamente com veículos e excipientes farmacoloqicamente aceitáveis.
12. 12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, que se apresenta na forma de uma vacina adequada para imunoterapia de doenças alérgicas.
13. 13. Proteína híbrida de acordo com as reivindicações 1-6, ou composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 11- 12, para o tratamento profiláctico ou terapêutico de doenças alérgicas causadas pelo pólen de Parietaria judaica.
14. 14. Proteína híbrida de acordo com as reivindicações 1-6, ou composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 11-12, para o tratamento de asma brônquica alérgica ou rinoconjuntivite alérgica. Lisboa, 30 de Maio de 2012 3