ES2492670T3 - Análogos peptídicos de la hormona estimulante de alfa-melanocitos - Google Patents

Análogos peptídicos de la hormona estimulante de alfa-melanocitos Download PDF

Info

Publication number
ES2492670T3
ES2492670T3 ES09763002.4T ES09763002T ES2492670T3 ES 2492670 T3 ES2492670 T3 ES 2492670T3 ES 09763002 T ES09763002 T ES 09763002T ES 2492670 T3 ES2492670 T3 ES 2492670T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
msh
ser
ala
compound
phe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES09763002.4T
Other languages
English (en)
Inventor
Michael A. Perricone
John Lyle Dzuris
Timothy E. Weeden
James E. Stefano
Clark Q. Pan
Andrea E. Edling
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genzyme Corp
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2492670T3 publication Critical patent/ES2492670T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
    • C07K14/685—Alpha-melanotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • A61K38/34—Melanocyte stimulating hormone [MSH], e.g. alpha- or beta-melanotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1021—Tetrapeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

Un compuesto sustancialmente puro que se une selectivamente al receptor de melanocortina 1 (MC1R), comprendiendo dicho compuesto: a) un tetrapéptido nuclear que tiene la secuencia: His Xaa1 Arg Trp (SEC ID Nº 1) o D-Trp D-Arg Xaa2 D-His (SEC ID Nº 2), donde Xaa1 es D-Cha, D-Phe o Cha, y Xaa2 es D-Cha, D-Phe o Phe; y b) un polipéptido en C-terminal que tiene la secuencia: D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEC ID Nº 3); o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

Análogos peptídicos de la hormona estimulante de alfa-melanocitos
5 Campo de la técnica
La invención se refiere a análogos peptídicos de la hormona estimulante de alfa-melanocitos (α-MSH) nativa que tiene selectividad por l receptor de la melanocortina 1 (MC1R), a preparaciones farmacéuticas de los mismos, así como al uso de estos análogos en el tratamiento de afecciones médicas y veterinarias.
Técnica anterior
Los neuropétidos son péptidos pequeños biológicamente activos que están ampliamente distribuidos por el cuerpo y tienen funciones desde neurotransmisores a factor de crecimiento. Muchas pruebas han indicado que los 15 neuropéptidos tienen capacidades antiinflamatorias. Entre los muchos neuropéptidos se encuentran los péptidos melanocórticos (melanocortinas), que se unen y estimulan los receptores de la melanocortina (MC). Un ejemplo de una melanocortina incluye la hormona estimulante de α-melanocitos (α-MSH), principalmente conocidos por su capacidad para regular la pigmentación periférica, pero se sabe que tiene capacidades antiinflamatorias e inmunomoduladoras. El neuropéptido α-MSH se ha detectado en varios órganos y es producido por las neuronas, la
20 hipófisis, el intestino, la piel y las células inmunitarias.
Las capacidades inmunomoduladoras de α-MSH se han demostrado en modelos de hipersensibilidad por contacto cuando se indujo tolerancia específica de hapteno mediante inyección con α-MSH y en la supresión de la inflamación mediada por endotoxinas bacterianas. Asimismo, se ha demostrado que α-MSH tiene actividad 25 terapéutica en muchos modelos de enfermedades animales, tales como enfermedad inflamatoria intestinal, artritis y transplante de corazón experimental. Otros modelos animales de inflamación cerebral, lesión renal e inflamación hepática han demostrado efectos antiinflamatorios con este neuropéptido. La α-MSH suprime la producción de citocinas proinflamatorias tales como TNF-α, IL-6 e IL-1 e inhibe las quimiocinas que reducen la migración de macrófagos y neutrófilos hacia los sitios inflamatorios. El óxido nítrico (NO) es un mediador habitual para varias 30 formas de inflamación. También se ha demostrado que la α-MSH inhibe la síntesis de NO por los macrófagos y neutrófilos estimulados por endotoxina. Además de sus efectos sobre la producción de citocinas, la α-MSH regula por disminución la expresión del MHC de clase I, D86 y CD40 sobre los monocitos y las células dendríticas, que efectúa presentación de antígeno y coestimulación. También se sabe que la α-MSH aumenta la formación de la interleucina 10 (IL-10) en monocitos, que se cree que es un componente importante en los efectos
35 inmunosupresores.
Aunque los mecanismos moleculares de los efectos inmunomoduladores de α-MSH no se entienden por completo, un potencial mecanismo de acción de la α-MSH es su capacidad para inhibir la activación del factor nuclear κB en células. La inhibición de NF-κB tiene como resultado una supresión de la producción de citocinas proinflamatorias y 40 la síntesis de óxido nítrico por los macrófagos. La α-MSH funciona uniéndose a receptores específicos que pertenecen a un grupo de receptores acoplados a proteína G con siete dominios transmembrana. Estos receptores incluyen los receptores de melanocortina 1 y melanocortina 3 (MCR-1 y MCR-3) sobre los macrófagos mediante los cuales la unión de α-MSH inhibe el NF-κB. Muchos de los efectos inmunomoduladores de α-MSH también están mediados por la acumulación del AMPc. La unión de α-MSH a los receptores de melanocortina aumenta los niveles
45 de AMPc, que pueden suprimir la degradación de IκB y, por tanto, inhibe la translocación de NF-κB y la producción de óxido nítrico.
Los receptores de MC1, a los que se une y estimula la α-MSH, se ha implicado en varias respuestas antiinflamatorias e inmunomoduladoras. Se han identificado cinco tipos de receptores de melanocortina, MC1-MC5.
50 Se han encontrado receptores de MC1 sobre melanocitos, células de melanoma, macrófagos, neutrófilos, células de glioma, astrocitos, monocitos, células endoteliales, en determinadas áreas del cerebro, testículos y ovarios. Sigue habiendo un interés continuo en los compuestos y métodos para estimular los receptores de MC1 y producir respuestas antiinflamatorias e inmunomoduladoras eficaces.
55 Sumario de la invención
En el presente documento se proporciona un compuesto sustancialmente puro que se une de forma selectiva al receptor 1 de la melanocortina (MC1R), comprendiendo dicho compuesto un tetrapéptido central que tiene la secuencia His Xaa1 Arg Trp (SEC ID Nº 1) o D-Trp D-Arg Xaa2 D-His (SEC ID Nº 2); donde Xaa1 es D-Cha, D-Phe o
60 Cha, y Xaa2 es D-Cha, D-Phe o Phe; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y una secuencia en Cterminal es D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEC ID Nº 3).
En el presente documento también se proporciona un compuesto sustancialmente puro que se une de forma selectiva al receptor 1 de la melanocortina (MC1R), comprendiendo dicho compuesto un polipéptido que tiene la
65 secuencia:
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13,
donde Xaa1 es D-Val, D-Ala o D-Lys; Xaa2 es D-Pro, D-Ala o D-Lys;
5 Xaa3 es D-Lys, D-Orn, D-Nle, D-Ala o D-Lys; Xaa4 es Gly, o D-Ala; Xaa5 es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp, D-Phe, o D-Ala; Xaa6 es D-Arg, D-His, o D-Ala; Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp, D-4-nitro-Phe, o D-Ala; Xaa8 es D-His, His, D-Arg, Phe, o D-Ala; Xaa9 es D-Glu, D-Asp, D-citrulina, D-Ser, o D-Ala; Xaa10 es D-Met, D-butionina, D-Ile, o D-Ala; Xaa11 es D-Ser, D-Ile o D-Ala; Xaa12 es D-Tyr, D-Ser, o D-Ala;
15 Xaa13 es D-Ser o D-Ala;
donde no más de un Xaa1 -13 es D-Ala a excepción de cuando Xaa1 -3 son todos D-Ala, y no más de un Xaa1 -13 es L-aminoácido; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otro aspecto más, en el presente documento se proporciona un compuesto sustancialmente puro que comprende un polipéptido que tiene la secuencia:
D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg Phe D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEC ID Nº 4); D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEC ID Nº 5);
25 Ser Tyr Ser Met Glu His Cha Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEC ID Nº 6); o D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser (SEC ID Nº 7) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, los polipéptidos proporcionados en el presente documento están PEGilados.
En algunas realizaciones, los compuestos proporcionados en el presente documento se pueden conjugar a un resto biológicamente activo.
Los compuestos proporcionados en el presente documento se unen de forma selectiva al MC1R. En algunas 35 realizaciones, los compuestos exhiben al menos una de las siguientes propiedades: estabilidad en plasma in vitro y resistencia a la degradación con proteasa.
En un aspecto, en el presente documento se proporciona una composición farmacéutica que comprende uno cualquiera de los compuestos sustancialmente puros proporcionados en el presente documento y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una composición farmacéutica para usar en un método de tratamiento de una enfermedad o afección autoinmunitaria en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente
45 aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto proporcionado en el presente documento. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, diabetes de tipo I, anemia aplásica, enfermedad de Graves, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, lupus, artritis, osteoartritis, uveítis autoinmunitaria y miastenia gravis.
En otro aspecto más, en el presente documento se proporciona un uso en el tratamiento de la inflamación en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto proporcionado en el presente documento. En algunas realizaciones, la inflamación se asocia con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad, artritis reumatoide, alergia aterosclerosis, psoriasis, gastritis y enfermedad
55 isquémica cardíaca.
En un aspecto, en el presente documento se proporciona una composición para usar en un método para reducir o inhibir el rechazo de transplantes en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto proporcionado en el presente documento.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una composición para usar en un método para tratar el melanoma en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un
65 compuesto proporcionado en el presente documento.
En otro aspecto más, en el presente documento se proporciona una composición para usar en un método para tratar el melanoma en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado que comprende un compuesto proporcionado en el presente documento que está conjugado con una carga
5 antitumoral. La carga antitumoral puede ser un radionúclido, un radiosensibilizador, un fotosensibilizador, un agente quimioterapéutico o una toxina.
En el presente documento también se divulga un kit que comprende la composición farmacéutica de un compuesto proporcionado en el presente documento y, opcionalmente, instrucciones de uso.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la reducción de la uveítis por la α-MSH nativa. La Fig. 1A muestra datos de B10. Se trató a ratones RIII con una α-MSH nativa (100 µg/ratón) i.v. diariamente cuando las puntuaciones clínicas fueron 2-3.
15 La uveítis se redujo significativamente en comparación con el control sin tratar (p<0,01). La Fig. 1B muestra datos ratones B10.RIII tratados con α-MSH nativa (100 µg/ratón) i.p. o dexametasona i.p. (0,2 mg/kg o 2,0 mg/kg) diariamente cuando las puntuaciones clínicas fueron 1 -2 (n=5). La inflamación de la retina se redujo después del inicio del tratamiento (p<0,05). El asterisco indica diferencias significativas con respecto al control. La Figura 2 ilustra la mejora de la uveítis en etapa terminal de la enfermedad mediante RI α-MSH y α-MSH nativa. Se indujo EAU en ratones. B10.RIII y se administraron 100 µg/ratón de α-MSH nativa, RI α-MSH o PBS al día, i.v., el día 12 cuando los ratones llegaron a la última etapa de la enfermedad (puntuaciones de 3). La Fig. 2A muestra datos de ratones tratados con α-MSH o retro-RI α-MSH que mostraron una reducción de las puntuaciones oculares en la enfermedad uveítis en comparación con los ratones control con PBS. La Fig. 2B muestra puntuaciones oculares máximas individuales de ratones en cada grupo el día 16 después de la
25 inducción de EAU (n=8). El asterisco indica diferencias significativas entre los grupos (p<0,05). La Figura 3 muestra imágenes de la retina y puntuaciones oculares individuales de animales tratados con α-MSH o RI α-MSH. Se indujo EAU en ratones. B10.RIII y el tratamiento i.v. diario con 100 µg/ratón de α-MSH nativa, RI α-MSH o PBS comenzó el día 13 cuando los ratones llegaron a la última etapa de la enfermedad. Se muestran las imágenes del fondo de ojo de retinas que representan las medianas de las puntuaciones oculares de cada grupo tras 13 días de tratamiento (n=11). El ratón tratado con PBS con una puntuación ocular de 3 muestra lesiones inflamatorias en varios cuadrantes del ojo y vasculitis proximal al nervio óptico (Fig. 3A). Los ratones tratados con α-MSH y RI α-MSH con puntuaciones oculares de 1 muestran resolución de la uveítis con inflamación únicamente alrededor del nervio óptico (Figs. 3B y 3C, respectivamente). Las retinas representan la mediana de las puntuaciones oculares de cada grupo. Las puntuaciones oculares individuales de los ratones en
35 cada grupo el día 13 después del tratamiento se muestran en el gráfico. El asterisco indica diferencias significativas entre los grupos (p<0,01). La Figura 4 ilustra la histopatología de ratones tratados con RI α-MSH y α-MSH nativa en EAU. En ratones B10.RIII hembra se inyectaron con IRBP + CFA para inducir EAU. Los ratones se trataron diariamente i.v. con 100 µg/ratón de α-MSH retro-inversa, α-MSH nativa o PBS, cuando los ratones alcanzaron puntuaciones oculares de 3. El grupo de ratones tratados con RI α-MSH o α-MSH mejoraron la respuesta inflamatoria ocular (p<0,05). Las fotografías muestran una tinción con hematoxilina y eosina de los ojos 10 días después del inicio del tratamiento que representan las medianas de las puntuaciones oculares de los grupos de ratones tratados con PBS (Fig. 4A), α-MSH (Fig. 4B) y RI α-MSH (Fig. 4C). Aumento 100X. La Figura 5 muestra el efecto de dosis diarias intraperitoneales de α-MSH retro-inversa sobre la uveítis en
45 comparación con un péptido control de secuencia aleatoria. Se trató a los ratones B10.RIII diariamente mediante inyecciones intraperitoneales con 1,00 µg de RI α-MSH o un péptido control de d-aminoácido el día 11 tras la inducción de la enfermedad. Los datos muestran las puntuaciones oculares medias clínicas de RI α-MSH (n=4) y grupos de ratones tratados con péptido control de secuencia aleatoria (n= 5). Se trató a los ratones un total de 13 días. Los datos son representativos de dos experimentos. El asterisco indica diferencias significativas entre los grupos (p<0,04). La Figura 6 ilustra la eficacia de RI α-MSH en el tratamiento de la inflamación de la retina. Los ratones B10RIII fueron tratados con RI α-MSH (3, 10, o 100 µg/ratón) diariamente mediante inyecciones i-p-cuando las puntuaciones clínicas fueron 4. El péptido control de secuencia aleatoria se inyectó a 100 µg/ratón diariamente. El gráfico representa las puntuaciones clínicas en el tiempo. Se observó inflamación retiniana tras el inicio del
55 tratamiento con 100 o 10 µg/ratón. Se observaron respuestas clínicas beneficiosas limitadas en ratones tratados con una dosis menor de RI α-MSH (3 µg/ratón) o con PBS o el péptido control de secuencia aleatoria (n= 4). El asterisco indica diferencias significativas entre los grupos (p<0,05). La Figura 7 muestra el efecto de RI α-MSH sobre la producción de AMPc en células de melanoma murino. El AMPC se midió en células de melanoma B16-F1 tras el tratamiento de células con α-MSH nativa, α-MSH retroinversa o péptido control de secuencia aleatoria a concentraciones de 0,01 ng/ml -1000 ng/ml. La Fig. 7A muestra que tanto la α-MSH nativa como α-MSH aumentaban significativamente los niveles de AMPc. Los controles usados para medir l AMPc incluyeron forscolina a una concentración de 100 µM. La Fig. 7B muestra los datos de barrido de alanina. Los péptidos sustituidos con alanina de RI α-MSH a 1 µg/ml se analizaron para determinar los incrementos de los niveles de AMPc en la línea de células de melanoma B16-F1 murinas. Los
65 datos son representativos de dos experimentos. El listado de secuencias se puede encontrar en la Tabla 1. El asterisco indica diferencias significativas entre los grupos (p<0,01).
La Figure 8 ilustra la evolución de la enfermedad de EAE inducida por MOG. La EAE se indujo en ratones C57BL/6 mediante inyección de un péptido MOG35 -55 (200 µg/ratón) y emulsión de CFA. La toxina pertussis se inyectó el día 0 y el día 2. El tratamiento diario i.p. con 100 µg/ratón de α-MSH, RI α-MSH, o PBS comenzó el día
10. La Fig. 8A muestra puntuaciones de enfermedad clínica registradas a diario. La Fig. 8B muestra puntuaciones individuales de la enfermedad en cada grupo el día 20 tras la inducción de la enfermedad. La Figure 9 muestra la reducción de las puntuaciones medias de la enfermedad EAE por RI α-MSH. Se indujo EAE en ratones C57BL/6 mediante inyecciones con una emulsión del péptido MOG35 -55 (200 µg/ratón) y CFA. Se inyectó la toxina pertussis el día 0 y el día 2. El tratamiento i.p. diario con 100 µg o 30 µg/ratón de α-MSH o RI α-MSH, 2 mg/kg de dexametasona o PBS comenzó el día 10. Las puntuaciones de la enfermedad clínica se registraron a diario. La Figure 10 ilustra la histología de la médula espinal de ratones tratados con RI α-MSH. La EAE se indujo en ratones C57BL/6 mediante inyección de un péptido MOG35 -55 (200 µg/ratón) y emulsión de CFA. La toxina pertussis se inyectó el día 0 y el día 2. El tratamiento diario i.p. con 100 µg/ratón de RI α-MSH comenzó el día 10. La médula espinal se obtuvo el día 24 tras la inducción de la enfermedad. Se muestran dos ratones representativos de cada grupo: tratados con PBS (Figs. 10a y 10c) y tratados con RI α-MSH (Figs. 10b y 10d). Las flechas muestran los sitios de infiltración de células inflamatorias. La Figure 11 muestra la cantidad de ARNm de TNFα e IL-10 en el bazo de ratones sensibilizados con el péptido MOG durante la fase de la enfermedad de EAE. Los ratones se sensibilizaron con 200 µg de péptido MOG el día 0 y fueron tratados con PBS, α-MSH (100 µg) o RI α-MSH (100 µg) diariamente los días 10 -15. Los bazos se extrajeron los días 1 (Figs. 11a y 11b), 4 (Figs. 11c y 11d) y 7 (Figs, 11e y 11f) después del inicio del tratamiento y se analizó la expresión del ARNm de TNFα e IL-10 mediante PCR cuantitativa. Los datos muestran la media de 4 ratones en cada grupo de tratamiento. Los niveles de ARN se normalizan con la β-actina. La Figura 12 ilustra la respuesta de memoria al péptido MOG 35 – 55. Los ratones se sensibilizaron con 200 µg del péptido MOG35 -55 el día 0. Los días 2 -8 se inyectó a los ratones i.p. PBS, 100 µg de α-MSH o 100 µg de RI α-MSH (n=5). El día 9 se extrajeron los bazos (Fig. 12a) y los ganglios linfáticos (Fig. 12b) y se estimularon con 25 µg/ml del péptido MOG35 -55 o el péptido OVA in vitro. Las células se pulsaron con timidina [3H] el día 3 del cultivo. Los datos muestran la media ± SD. El sobrenadante se recogió de los cultivos de esplenocitos estimulados con el péptido MOG tras 24 horas y los niveles de citocinas de TNF-α e IFNγ (Fig. 12c) y MCP-1 (Fig. 12d) se analizaron mediante citometría de flujo. Los datos muestran la media ± SD. Los ratones no sensibilizados anteriormente fueron sensibilizados con el péptido MOG. La Figura 13 ilustra perfiles de citocinas en suero y bazo tras tratamiento con RI α-MSH en ratones sensibilizados con MOG. Los ratones se sensibilizaron con 200 µg del péptido MOG35 -55 el día 0. Los días 2 8 se inyectó a los ratones i.p. PBS, 100 µg de α-MSH o 100 µg de RI α-MSH (n=5). El día 9 se extrajeron 9 bazos y suero. Las Figs. 13a y 13b muestran los niveles de ARNm de TNF-α e IL-10 en el bazo, respectivamente, se cuantificaron mediante PCR en tiempo real. Los datos muestran la media de 4 ratones en cada grupo de tratamiento. Los niveles de ARN se normalizan con la β-actina. El suero también se analizó para determinar los niveles de citocinas mediante citometría de flujo. La Fig. 13c muestra los niveles séricos de TNF-α, MCP-1, IL-6 y la Fig. 13d muestra los niveles séricos de IL-10 e IL-12. Los ratones no sensibilizados anteriormente fueron sensibilizados con el péptido MOG. Los datos muestran la media ± SD. La Figura 14 muestra el efecto de α-MSH y RI α-MSH sobre los marcadores de macrófagos. Los ratones se sensibilizaron con el péptido MOG un vivo y fueron tratados diariamente con α-MSH o RI α-MSH (100 µg/ratón) los días 1 – 7. Los macrófagos esplénicos se analizaron mediante citometría de flujo para determinar los niveles de expresión de CD14, CD40 y CD86. Las células se confinaron en la población de macrófagos CD11b+ (Fig. 14a) o F4/80+ (Fig. 14b) Lo datos muestran el porcentaje medio positivo de la población de macrófagos confinados (n= 5). La Figura 15 ilustra un incremento inducido por LPS de los niveles de ARNm de mMC1R en los macrófagos peritoneales (Fig. 15a) y el bazo (Fig. 15b). Se inyectó en los ratones C57BL/6 (n=4) i.p. LPS (1 µg/ratón). Los macrófagos peritoneales y el bazo se extrajeron a 0,5 horas, 1 hora y 24 horas. Los niveles de ARNm de mMC1R se cuantificaron mediante PCR en tiempo real. Los niveles de ARN se normalizaron a 18 s. La Figura 16 muestra que el efecto de MSH es un modelo de inflamación por LPS in vivo. Se inyectó a los ratones C57BL/6 1 µg de LPS, i.p. Tras 30 minutos, los ratones se trataron con dexametasona (2 mg/kg) y α-MSH (Figs. 16a-16c) o el análogo 891 de RI α-MSH (Figs. 16d-16f), i.p. El suero se recogió 2 horas después de la exposición a LPS. Los niveles de TNF-α (Figs. 16a y 16d), MCP-1 (Figs. 16b y 16e), e IL-10 (Figs. 16c y 16f) se analizaron mediante ensayo con esferas citométrico mediante citometría de flujo. Los datos muestran las mediciones de citocinas individuales y la media de cada grupo (n=6). La Figure 17 ilustra la estabilidad de RI-α-MSH y α-MSH e plasma y suero. La muestra la estabilidad de los péptidos RI-α-MSH y α-MSH en plasma y PBS a 37ºC. La Fig. 17B muestra la semivida en suero de los péptidos RI-α-MSH y α-MSH tras una única inyección intravenosa. La Figure 18 muestra los resultados de estudios de unión de MSH (Fig. 18A) y RI-MSH (Fig. 18B) a los receptores 1, 3, 4 y de la melanocortina 5. La Figure 19 muestra la inversión del tetrapéptido central HfRW y MSH retroinversa. La Figure 20 ilustra la sustitución de residuos de aminoácidos no naturales en varias posiciones de RI-MSH. La Figura 21 ilustra un ensayo de unión competitiva representativo de RI-MSH y variaciones de los mismos en MC1R. La Figura 22 ilustra el efecto de análogos de RI α-MSH sobre los niveles de AMPc en células de melanoma murino B16 F1 Fig. 22A: Análogos 890, 891 y 892; Fig. 22B: Análogos 893, 894 y 895; Fig. 22C: Análogos 880,
886 y 878; y Fig. 22D Análogos 872, 878 y 869.
Descripción detallada de la invención
5 Definiciones
Las proteínas α-MSH y MC1R y ácidos nucleicos de los presentes métodos no se limitan a una fuente o especie concreta. Por tanto, las proteínas y ácidos nucleicos se pueden aislar o ser recombinantes.
La hormona estimulante de α-Melanocitos (α-MSH) es un polipéptido que comprende la secuencia Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEC ID Nº 8) (SYSMEHFRWGKPV). Recientemente se ha examinado la α-MSH por sus propiedades antiinflamatorias e inmunomoduladoras. La α-MSH se origina por la escisión proteolítica intracelular de la hormona propiomelanocortina (POMC).El neuropéptido α-MSH se ha detectado en varios órganos y es producid por las neuronas, la hipófisis, el intestino, la piel y las células inmunitarias. Se ha informado de que la α
15 MSH suprime la función efectora de los linfocitos T, induce los linfocitos T reguladores y tiene efectos beneficiosos sobre los modelos autoinmunitarios y de transplante.
“Conjugado” o “conjugado” incluye dos o más miembros que está fijados, unidos, acoplados, en complejos o asociados de otro modo entre sí. Los miembros se pueden unir entre sí mediante enlaces covalentes, enlaces iónicos, interacciones electrostáticas, puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals o medios físicos.
Restos “biológicamente activos” incluyen una molécula o compuesto que provoca o modula una respuesta fisiológica. En un aspecto, un compuesto biológicamente activo estimula los receptores de melanocortina, preferentemente los receptores MC-1.
25 Por “modula" y "modulación" se quiere decir que la actividad de una o más proteínas o subunidades proteicas está regulada por incremento o regulada o disminución, de forma que la expresión, nivel o actividad sea mayor o menor que lo observado en ausencia del modulador. Por ejemplo, el término “modular” puede significar “inhibir” o “estimular”.
“Secuencia del extremo C” incluye referencias al extremo de la cadena de aminoácidos que normalmente termina , aunque no necesariamente, con un grupo carboxilo. La convención para escribir las secuencias peptídicas es colocar el extremo C a la derecha y escribir la secuencia desde el extremo N al C. La secuencia del extremo C puede comprender de 1 a 100 aminoácidos, preferentemente de 2 a 15 aminoácidos e incluso más preferentemente
35 de 3 a 10 aminoácidos. La secuencia del extremo C puede terminar con un grupo carboxilo o el extremo puede estar modificado por métodos bien conocidos en la materia para que comprenda un miembro funcional (p. ej., un grupo diana, señal de retención, lípido y anclaje).
La presente invención proporciona un “compuesto sustancialmente puro”. La expresión “compuesto sustancialmente puro” se usa en el presente documento para describir una molécula, tal como un polipéptido (p. ej., un polipéptido que se une a MC1R, o un fragmento del mismo) que carece sustancialmente de otras proteínas, lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos y otros materiales biológicos con los que está asociado de forma natural. Por ejemplo, una molécula sustancialmente pura, tal como un polipéptido, puede ser al menos un 60%, en peso seco, de la molécula de interés. La pureza de los polipéptidos se puede determinar usando métodos estándar que incluyen, por ejemplo,
45 electroforesis en gel de poliacrilamida (p. ej., SDS-PAGE), cromatografía en columna (p. ej., cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) y análisis de la secuencia de aminoácidos en el extremo amino.
En una realización, la expresión “se une de forma selectiva” significa que un compuesto o polipéptido fabricado o usando en la presente invención se une preferentemente a un tipo de receptor sobre otro tipo de receptor cuando, en presencia de una mezcla de dos o más receptores (p. ej., receptores de melanocortina, receptores MC1, MC2, MC3, MC4, MC5).
“Aminoácido o “secuencia de aminoácidos” incluye una secuencia de oligopéptido, péptido, polipéptido o proteína” o un fragmento, porción o subunidad de cualquiera de estos, y moléculas de origen natural o sintético. Los términos
55 “polipéptido” y “proteína” incluyen aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir isoésteres peptídicos, y pueden contener aminoácidos modificados a parte de los 20 aminoácidos codificados por el gen. El término “polipéptido” también incluye péptidos y fragmentos, motivos de polipéptidos. Las abreviaturas de una sola letra en mayúsculas de los aminoácidos se refieren al isómero L natural. Las abreviaturas de una sola letra en minúsculas de los aminoácidos indican el isómero D.
Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan de forma intercambiable para hacer referencia a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Los péptidos y polipéptidos pueden estar compuestos completamente por análogos sintéticos no naturales de aminoácidos o son una molécula quimérica de aminoácidos peptídicos parcialmente naturales y análogos de aminoácidos parcialmente no naturales. En un aspecto, un polipéptido se usa 65 en una composición, sistema celular o proceso de la invención (p. ej., una célula huésped que tiene un plásmido que expresa al menos una enzima de la invención). Además, polipéptido puede hacer referencia a compuestos
comprendidos por polímeros de aminoácidos unidos covalentemente a otro grupo funcional (p. ej., grupo solubilizante, un grupo dirigido, PEG, grupos no aminoácidos u otro agente terapéutico).
Los aminoácidos se pueden abreviar usando la siguiente designación entre paréntesis: Prolina (Pro), Valina (Val),
5 Lisina (Lys), Ornitina(Orn), Norleucina (Nle), Glicina (Gly), Triptófano (Trp), Alanina (Ala), Fenilalanina (Phe), Arginina (Arg), Histidina (His), ácido glutámico (Glu), ácido aspártico (Asp), Serina (Ser), Metionina (Met), Isoleucina (Ile), Tirosina (Tyr), Ciclohexilalanina (Cha), 4-fluoro-D-fenilglicina (4-fluoro-D-Phg), 2-tienil-D-alanina (D-Thi).
“Tratamiento”, “que trata”, “tratar” o “terapia”, como se usan en el presente documento, hacen referencia a administrar a un mamífero agentes que pueden producir un efecto profiláctico, curativo u otro efecto beneficioso. Tratamiento puede dar como resultado adicionalmente atenuación o mejora de una enfermedad o síntomas de una enfermedad de un sujeto.
Como se usa en el presente documento, la forma del singular “un” “uno/una” y “el/la” incluyen las referencias en 15 plural a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo, “una” célula diana incluye una o más células diana.
Las composiciones polipeptídicas de la invención pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales. Los residuos peptídicos individuales se pueden unir mediante enlaces peptídicos, otros enlaces químicos o medios de acoplamiento, tales como, por ejemplo, glutaraldehído, ésteres de Nhidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos de unión que pueden ser una alternativa a los enlaces amida tradicionales ("enlace peptídico" incluyen, por ejemplo, cetometileno (p. ej., -C(=O)-CH2-para -C(=O)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH2-O), tioéter (CH2-S), tetrazol, tiazol, retroamida, tioamida o éster (véase, por ejemplo, Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp. 267 -357, "Peptide
25 Backbone Modifications," Marcel Dekker, NY, incorporado en el presente documento por referencia).
Los polipéptidos usados para poner en práctica el método de la invención se pueden modificar mediante procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional (p. ej., fosforilación, acilación etc.) o mediante técnicas de modificación química, y los polipéptidos modificados resultantes. Las modificaciones se pueden producir en cualquier punto en un polipéptido, incluida la estructura peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o varios grados en varios sitios en un polipéptido dado. Asimismo, un polipéptido dado puede tener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado nucleotídico, unión covalente
35 de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas, tal como arginilación. Véase, por ejemplo, Proteins -structure and molecular properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 2ª Ed., (1993); Post-translational covalent modification of proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pág. 1 -12 (1983).
Realizaciones adicionales de los compuestos
45 En algunas realizaciones, la invención proporcionada en el presente documento es un compuesto sustancialmente puro que se une de forma selectiva al receptor 1 de la melanocortina (MC1R), comprendiendo dicho compuesto un polipéptido que tiene la secuencia:
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13, donde Xaa1 es D-Val, D-Ala o D-Lys; Xaa2 es D-Pro, D-Ala o D-Lys; Xaa3 es D-Lys, D-Orn, D-Nle, D-Ala o D-Lys; Xaa4 es Gly, o D-Ala;
55 Xaa5 es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp, D-Phe, o D-Ala; Xaa6 es D-Arg, D-His, o D-Ala; Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp, D-4-nitro-Phe, o D-Ala; Xaa8 es D-His, His, D-Arg, Phe, o D-Ala; Xaa9 es D-Glu, D-Asp, D-citrulina, D-Ser, o D-Ala; Xaa10 es D-Met, D-butionina, D-Ile, o D-Ala; Xaa11 es D-Ser, D-Ile o D-Ala; Xaa12 es D-Tyr, D-Ser, o D-Ala; Xaa13 es D-Ser o D-Ala;
65 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, los análogos peptídicos proporcionados en el presente documento se unen selectivamente a MC1R y comprenden un polipéptido que tiene la secuencia: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13, donde Xaa1 es D-Val; Xaa2 es D-Pro; Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle; Xaa4 es Gly; Xaa5 es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp, o D-Phe; Xaa6 es D-Arg o D-His; Xaa7 es D-Cha, D-Phe,
5 Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp, o D-4-nitro-Phe; Xaa8 es D-His, His, D-Arg, Phe, o D-Ala; Xaa9 es D-Glu, D-Asp, D-citrulina o D-Ser; Xaa10 es D-Met, D-butuionina o D-Ile; Xaa11 es D-Ser o D-Ile; Xaa12 es D-Tyr o D-Ser; Xaa13e D-Ser; donde ni más de un Xaa1 -13 es un aminoácido L o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otras realizaciones, los análogos peptídicos proporcionados en el presente documento comprenden un polipéptido que tiene la secuencia: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13, donde Xaa1 es D-Val; Xaa2 es D-Pro; Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle; Xaa4 es Gly; Xaa5 es D-Trp o Trp; Xaa6 es D-Arg; Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe o D-Thi; Xaa8 es D-His o His; Xaa9 es D-Glu o D-Ser; Xaa10 es D-Met, D-butionina o D-Ile; Xaa11 es D-Ser o D-Ile; Xaa12 es D-Tyr o D-Ser; Xaa13 es D-Ser; donde no más de un Xaa1 -13 es un aminoácido
15 L, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Los compuestos proporcionados en el presente documento comprenden análogos peptídicos de la hormona estimulante de α-melanocortina (α-MSH).
En una realización alternativa, los análogos peptídicos consisten en D-aminoácidos. En otras realizaciones, los péptidos comprenden aminoácidos D, aminoácidos L o una mezcla de aminoácidos D y L. En otras realizaciones, los péptidos están comprendidos por al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % de aminoácidos D. Los compuestos de la invención también pueden incorporar los siguientes ejemplos no limitantes de aminoácidos no estándar: D-ornitina, D-norleucina, 3-benzotienilo-D-alanina, 5-hidroxi-D-Trp, 5-metoxi-D -Tip, 4-fluoro-D-fenilglicina
25 (4-fluoro-D-Phg), 3-piridil-D-alanina, 2-tienilo-D-alanina (D-Thi), D-ciclohexilalanina (D-Cha), 4-nitro-D-Phe, Dcitrulina, α-metil-D-Met, y D-butionina.
En algunas realizaciones, el tetrapéptido nuclear está comprendido por la secuencia de aminoácidos His Phe Arg Trp o Trp Arg Phe His, preferiblemente en la configuración de D-aminoácido. En otra realización, el tetrapéptido nuclear está comprendido por la secuencia de aminoácidos His D-Cha Arg Trp o Trp Arg D-Cha His, preferentemente en la configuración de D-aminoácido. En algunas realizaciones, el tetrapéptido nuclear se compone de 4 D-aminoácidos. En otras realizaciones, el tetrapéptido nuclear tiene al menos un aminoácido no estándar.
Los compuestos proporcionados en el presente documento pueden ser sintéticos o recombinantes. Los compuestos
35 de la invención pueden fabricarse mediante técnicas químicas convencionales conocidas en la materia. Los métodos de síntesis en fase sólida se explican en la literatura publicada, tal como, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (E. Atherton, et al. 1989). Los compuestos de la invención también pueden fabricarse mediante técnicas de biología molecular convencionales conocidas en la materia. Dentro de esta solicitud, a menos que se indique lo contrario, las definiciones de los términos y la ilustración de las técnicas de esta solicitud se pueden encontrar en cualquiera de varias referencias bien conocidas tales como: . Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Goeddel, D., ed., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1991); "Guide to Protein Purification" in Deutshcer, M.P., ed., Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1989); Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990); Freshney, R.I, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic
45 Technique, 2ª Ed., Alan Liss, Inc. New York, NY (1987); Murray, E.J., ed., Gene Transfer and Expression Protocols, pág. 109 -128, The Humana Press Inc., Clifton, NJ and Lewin, B., Genes VI, Oxford University Press, New York (1997).
En algunas realizaciones, los análogos peptídicos proporcionados en el presente documento se unen selectivamente
o activan el receptor 2 de la melanocortina (MC1R). Cualquier ensayo adecuado se puede emplear para medir la unión o la activación del MC1R. Por ejemplo, la inducción de AMPc in vitro puede usarse para evaluar la activación del MC1R. El evaluación in vitro puede indicar la activación in vivo. Las realizaciones adicionales de la presente invención comprenden cualquier polipéptido selectivo de los receptores de MC1. La identificación de un compuesto selectivo del receptor MC1 puede determinarse mediante un ensayo de cribado adecuado. Un ejemplo no limitante
55 de un ensayo de unión al de receptor MC1 se divulga en el Ejemplo 4. En algunas realizaciones, receptores MC1 preferibles comprenden un receptor 1 de la melanocortina de homo sapiens (nº de acceso en GenBank: NP_002377).
Otras realizaciones de la invención se refieren a compuestos que modulan los niveles de AMPc, óxido nítrico (NO), TNF-α, ARNm de TNF-α, ARNm de IL-10, IL-10, IFNγ, IL-6, IL-12 y / o MCP-1. En algunas realizaciones, los compuestos aumentan los niveles de AMPc. En otras realizaciones, los compuestos están dirigidos a la disminución o inhibición de los niveles de óxido nítrico (NO), TNF-α, ARNm de TNF α, ARNm de IL-10, IL-10, IFN, IL-6, IL-12 y / o MCP-1. La identidad de los compuestos que modulan los niveles antes mencionados se puede determinar a través de ensayos de cribado. Se pueden usar ensayos aceptables conocidos en la técnica para medir los niveles antes
65 mencionados. Ejemplos de ensayos para identificar compuestos que exhiben la modulación deseable de estos niveles se divulgan en los ejemplos.
En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invención pueden modular la respuesta inmunitaria y la inflamación por un mecanismo de acción alternativo y no se limita a los mecanismos divulgados en el presente documento.
5 ] En algunas realizaciones, los péptidos proporcionados en el presente documento han mejorado la estabilidad en plasma y la resistencia a la degradación por proteasas. La estabilidad en plasma y la resistencia a la degradación por proteasas se pueden evaluar mediante cualquier método adecuado. Un ejemplo no limitativo se ha divulgado en el Ejemplo 19. La evaluación in vitro puede indicar el rendimiento, resistencia mejorada y una semivida más larga in vivo.
Los métodos proporcionados en el presente documento pueden practicarse in vivo, ex vivo o in vitro.
Péptidos PEGilados
15 En algunas realizaciones, los péptidos se modifican para mejorar la semivida del péptido. En algunas realizaciones, el péptido está PEGilado. En algunas realizaciones, los péptidos PEGilados se dirigen a los péptidos unidos covalentemente o conjugados con una o más cadenas poliméricas de polietilenglicol (PEG). Cadenas poliméricas de PEG pueden incluir cadenas de PEG modificado, funcionalizado o derivado de otro modo. En otra realización, la cadena polimérica de PEG puede tener al menos uno o más puntos de ramificación. En algunas realizaciones preferidas, las cadenas poliméricas de PEG y el correspondiente péptido PEGilado son solubles en agua, son muy móviles en solución, carecen de toxicidad e inmunogenicidad, tener un aclaramiento fácil del cuerpo y puede tener una distribución alterada en el cuerpo. En algunas realizaciones preferidas, la naturaleza farmacocinética del péptido PEGilado se modula mediante el tipo de cadena de PEG. Las estrategias y los métodos para la preparación de péptidos PEGilados se llevan a cabo mediante métodos conocidos en la técnica (G. Pasuta y F. M. Veronese (2007)
25 "Polymer-drug conjugation, recent achievements and general strategies" Progress in Polymer Science 32(8 -9): 933 -961). En la técnica se pueden encontrar procesos de PEGilación de proteínas primera y segunda generación.
Un ejemplo de PEGilación comprende la primera etapa de la funcionalización adecuada del polímero de PEG en uno
o ambos terminales (para los PEG lineales). Los PEG que se activan en cada extremo con el mismo resto reactivo se conocen como "homobifuncionales", donde como si los grupos funcionales presentes fueran diferentes, por lo que el derivado de PEG se denomina como "heterobifuncional" o "heterofuncional." Los derivados químicamente activos
o activados del polímero de PEG están preparados para unir el PEG a la molécula deseada. La elección del grupo funcional adecuado para el derivado de PEG se basa en el tipo de grupo reactivo disponible en la molécula que se acopla al PEG. Ejemplos de aminoácidos reactivos incluyen lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido
35 glutámico, serina, treonina y tirosina. El grupo amino N-terminal y el ácido carboxílico C-terminal también se pueden utilizar.
Otros PEG heterobifuncionales para la conjugación: estos PEG heterobifuncionales son muy útiles en la unión de dos entidades, donde se necesita un espaciador biocompatible hidrófilo, flexible o biocompatible. Grupos terminales preferidos para los PEG heterobifuncionales son maliemida, vinilsulfonas, disulfuro de piridilo, aminas, ácidos carboxílicos y ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS)
En algunas realizaciones de la invención, el péptido PEGilado puede tener un intervalo de peso molecular entre 0,2 kDa y 100 kDa. En algunas realizaciones preferidas de la invención, el péptido PEGilado puede tener un intervalo de
45 peso molecular entre 0,2 kDa y 40 kDa. En algunas realizaciones preferidas de la invención, el péptido PEGilado puede tener un intervalo de peso molecular entre 0,2 kDa y 15 kDa. En otras realizaciones, el peso molecular promedio preferido (en Da; determinado por cromatografía de exclusión de tamaño) para PEG comercialmente disponible se puede seleccionar de <1k, 2k, 3.5k, 5k, 10k, 20k, 30k, 40k, y por encima, pero puede ser cualquier PM, dependiendo de la farmacocinética deseada. Por ejemplo, los PEG de bajo peso molecular heterobifuncionales que pueden utilizarse como ligadores y PEG de bajo peso molecular se pueden usar para mejorar la solubilidad del péptido. El PEG también puede ramificado, de varias ramas o en horquilla.
En algunas realizaciones, el péptido se conjuga con moléculas diana o funcionan como una molécula dirigida, donde la molécula dirigida se asocia preferentemente con un receptor deseado. En algunas realizaciones preferidas de la 55 invención el péptido se conjuga a un agente citotóxico. El término "agente citotóxico" se refiere a una sustancia que inhibe o previene la actividad de expresión de las células, la función de las células y / o causa la destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radiactivos, agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y / o variantes de los mismos. Ejemplos del agente citotóxico incluyen maitansina, dolastatina y sus análogos, incluyendo tasidotin y auristatina. En otras realizaciones de la invención, ejemplos de agentes citotóxicos incluyen maitansinoides, itrio, bismuto, ricina, cadena A de la ricina A-, saporina, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxi antracina diona, actinomicina, subunidad A de la toxina de la difteria, exotoxina truncada de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, 65 curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de Saponaria officinalis, y glucocorticoides y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos tales como AT211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos
radioactivos de Lu. Los anticuerpos también se pueden conjugar con una enzima activadora de profármacos anticancerosa capaz de convertir el profármaco en su forma activa.
El péptido se puede unir directa o indirectamente al agente citotóxico o dirigido mediante cualquier método conocido
5 en la actualidad en la materia En algunas realizaciones preferidas de la invención, el péptido está unido al agente citotóxico o agente dirigido mediante uno o más ligadores para formar un conjugado, siempre que la inclusión del ligador no impida sustancialmente la función, la unión, la toxicidad o la inclusión del péptido o agente conjugado.
Ejemplos de ligadores incluyen enlaces iónicos y covalentes y cualquier otra asociación suficientemente estable
10 mediante lo cual el agente diana será internalizado por una célula a la que está dirigido el conjugado. El resto ligador se selecciona dependiendo de las propiedades deseadas. Las consideraciones de la selección del ligador pueden incluir el alivio o disminución de la hindrancia estérica causada por la proximidad de elementos conjugados, la alteración de otras propiedades del conjugado, tal como la especificidad, toxicidad, solubilidad, estabilidad sérica y/o disponibilidad intracelular del conjugado y/o aumentar la flexibilidad del enlace. El ligador puede ser cualquier tipo de
15 enlace y se describen ejemplos en las patentes de EE.UU. Nº 7.166.702 y 5.194.425.
Los ligadores y enlaces adecuados para los conjugados unidos químicamente incluyen puentes disulfuro, enlaces tioéter, puentes disulfuro impedidos y enlaces covalentes entre grupos reactivos libres, tales como grupos amina y tiol. Estos enlaces se producen usando reactivos heterobifuncionales para producir grupos tiol reactivos sobre uno o 20 todos los polipéptidos y, después, haciendo reaccionar los grupos tiol en un polipéptido con grupos tiol reactivos o grupos amina con los que los grupos maleimido o grupos tiol se pueden unir sobre el otro. Otros ligadores incluyen ligadores escindibles con ácido, tales como bismalimidoetoxi propano, conjugados de transferían lábil a ácido y dihidrazida de ácido adípico, que se escindirían en compartimentos intracelulares más ácidos; reticuladores que se escinden tras la exposición a UV o luz visible y ligadores, tales como los diversos dominios, tales como CH1, CH2, y
25 CH3, desde la región constante de la IgG1 humana (véase Batra et al. (1993) Mol. Immunol. 30: 379 -386.
Los ligadores peptídicos y ligadores químicos se pueden insertar mediante acoplamiento covalente del ligador al péptido y al agente dirigido o citotóxico. Bis agentes heterobifuncionales descritos más adelante se pueden usar para efectuar dicho acoplamiento covalente.
30 Reactivos reticulantes heterobifuncionales
Numerosos reactivos de reticulación heterobifuncionales que se usan para formar enlaces covalentes entre grupos amino y grupos tiol y para introducir grupos tiol en proteínas son conocidos por los expertos en esta técnica (véase, 35 por ejemplo, el PIERCE CATALOG, Immuno Technology Catalog & Handbook, 1992 -1993, que describe la preparación y el uso de dichos reactivos y proporciona una fuente comercial de dichos reactivos; véase también Cumber et al. (1992), Bioconjugate Chem. 3': 397 -401; Thorpe et al. (1987) Cancer Res. 47: 5924 -5931; Gordon et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 308 -312; Walden et al. (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2: 191 -197; Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173: 723 -737; Mahan et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 163 -170; 40 Wawryznaczak et al. (1992) Br. J. Cancer 66: 361 -366; Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584 -589). Estos reactivos se pueden usar para formar enlaces covalentes entre el agente dirigido, la quimiocina y el agente diana. Estos reactivos incluyen: N-succinimidil-3-(2-piridiiditio)propionato (SPDP; disulfide linker); sulfosuccinimidilo 6-[3-(2-piridilditio)propionamido]hexanoato (sulfo-LC-SPDP); succinimidiloxicarbonil-α-metilo benzilo tiosulfato (SMBT, ligador disulfato impedido); succinimidilo 6-[3-(2-piridiiditio)propionamido]hexanoato (LC-SPDP); 45 sulfosuccinimidilo 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC); succinimidilo 3-(2-piridilditio)butirato (SPDB; ligador de enlace disulfuro impedido); sulfosuccinimidilo 2-(7-azido-4-metilcoumarin-3-acetamida) etil-1,3ditiopropionato (SAED); sulfosuccinimidilo 7-azido-4-metilcoumarin-3-acetato (SAMCA); sulfosuccinimidilo 6-[alfametil-alfa-(2-piridiiditio)toluamido]hexanoato (sulfo-LC-SMPT); 1,4-di-[3'-(2'-piridiiditio)propionamido]butano (DPDPB); 4-succinimidiloxicarbonil-α-metil-α-(2-piridiltio)tolueno (SMPT, ligador disulfato impedido); sulfosuccinimidil6[α-metil
50 α-(2-piridilditio)toluamido]hexanoato (sulfo-LC-SMPT); éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS); éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-MBS); N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato (SIAB; ligador tioéter); sulfosuccinimidil(4-yodoacetil)amino benzoato (sulfo-SIAB); succinimidil-4-(pmaleimidofenil)butirato (SMPB); sulfosuccinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato (sulfo-SMPB); azidobenzoilo hidrazida (ABH).
55 Otros reticuladores escindibles heterobifuncionales incluyen N-succinimidilo (4-yodoacetil)-aminobenzoato; sulfosuccinimidilo (4-yodoacetil)-aminobenzoato; 4-succinimidil-oxicarbonil-a-(2-piridilditio)-tolueno; sulfosuccinimidil6-[a-metil-a-(piridilditiol)-toluamido]hexanoato; N-succinimidil-3-(-2-piridiiditio)-proprionato; succinimidilo 6[3(-(-2piridilditio)-proprionamido]hexanoato; sulfosuccinimidilo 6[3(-(-2-piridilditio)-propionamido]hexanoato; 3-(2-piridiiditio)
60 propionilo hidrazida, reactivo de Ellman, ácido diclorotriazínico, S-(2-tiopiridil)-L-cisteína. Otros ejemplos de ocmpuetsos de unión bifuncionales se divulgan en las patentes de EE.UU. Nº 5.349.066, 5.618.528, 4.569.789,
4.952.394 y 5.137.877.
Ligadores escindibles con ácido, fotoescindibles y sensibles al calor
También se pueden usar ligadores escindibles con ácido, fotoescindibles y sensibles al calor, en particular cuando puede ser necesario escindir el agente diana para que sea más fácilmente accesible a la reacción. Los ligadores
5 escindibles con ácido incluyen bismaleimidoetoxi propano y ligadores de ácido adípido dihidrazida (véase, por ejemplo, Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584 -589) y conjugados de transferrina lábiles a ácidos que contienen una porción suficiente de transferrina para permitir la entrada en la vía de ciclado de la transferrina intracelular (véase, por ejemplo, Welhöner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 4309 -4314).
Los ligadores fotoescindibles son ligadores que se escinden con la exposición a la luz (véase, por ejemplo, Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104 -107), de modo que se libera el agente diana tras la exposición a la luz. Los ligadores fotoescindibles se escinden tras la exposición a la luz se conocen (véase, por ejemplo, Hazum et al. (1981) in Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunfeldt, K (Ed), pp. 105 -110, que describe el uso de un grupo nitrobencilo como un grupo protector fotoescindible para la cisteína; Yen et al. (1989) Makromol. Chem. 190: 69 -82, 15 que describe copolímeros fotoescindibles hidrosolubles, incluyendo copolímero hidroxipropilmetactilamida, copolímero de glicina, copolímero de fluoresceína y copolímero de metilrodamina; Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104 -107, que describe un reticulador y un reactivo que sufre degradación fotolítica tras la exposición a la luz UV cercana (350 nm); y Senter et al. (1985) Photochem. Photobiol. 42: 231 -237, que describe reactivos de reticulación de cloruro de nitrobenciloxicarbonilo que producen enlaces fotoescindibles), de modo que se libera el agente diana tras la exposición a la luz. Dichos ligadores tendrían un uso concreto en el tratamiento de afecciones dermatológicas u oftálmicas que se pueden exponer a la luz usando óptica de fibras. Tras la administración del conjugado, el ojo o la piel u otra parte del cuerpo pueden exponerse a la luz, lo que tiene como resultado la liberación del resto diana del conjugado. Dichos ligadores fotoescindibles son útiles en relación con protocolos diagnósticos en los que es deseable eliminar el agente dirigido para permitir la eliminación rápida del cuerpo del
25 animal.
Otros ligadores de la conjugación química
Otros ligadores incluyen ligadores de tritilo, en particular grupos tritilo derivados para generar un género de conjugados que proporcionan la liberación de agentes terapéuticos en varios grados de acidez o alcalinidad. La flexibilidad dio la capacidad para preseleccionar el intervalo de pH al cual se liberará el agente terapéutico permite la selección de un ligador en base a las diferencias fisiológicas conocidas entre tejidos que requieran la liberación de un agente terapéutico (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.612.474). Por ejemplo, la acidez de los tejidos tumorales puede ser inferior que la de los tejidos normales.
35 Ligadores peptídicos
Los restos ligadores pueden ser péptidos. Los ligadores peptídicos se pueden usar en el conjugado. El ligador peptídico normalmente tiene de 2 a 60 residuos de aminoácidos, por ejemplo de 5 a 40 o de 10 a 30 residuos de aminoácidos. La longitud seleccionada dependerá de factores tales como el uso para el cual se incluye el ligador.
El resto ligador puede ser una secuencia de aminoácidos espaciadora flexible, tale como las conocidas en la investigación de anticuerpos monocatenarios. Ejemplos de dichos restos ligadores conocidos incluyen GGGGS, (GGGGS)n, GKSSGSGSESKS, GSTSGSGKSSEGKG, GSTSGSGKSSEGSGSTKG, GSTSGSGKSSEGKG,
45 GSTSGSGKPGSGEGSTKG, EGKSSGSGSESKEF, SRSSG, SGSSC. Un ligador sensible a la tripsina toxina diftérica que tiene la secuencia AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM también es útil.
Restos de unión adicionales se describen en, por ejemplo, Huston et al., Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5879 5883, 1988; Whitlow, M., et al., Protein Engin. 6: 989 -995, 1993; Newton et al., Biochemistry 35: 545 -553, 1996; A.
J. Cumber et al., Bioconj. Chem. 3: 397 -401, 1992; Ladurner et al., J. Mol. Biol. 273: 330 -337, 1997; y la patente de EE.UU. Nº 4.894.443.
Otros ligadores incluyen: Sustratos enzimáticos, tales como sustrato de catepsina B, sustrato de catepsina D, sustrato de tripsina, sustrato de trombina, sustrato de subtilisina, sustrato de factor Xa y sustrato de enteroquinasa;
55 ligadores que aumentan la solubilidad, flexibilidad y/o escindibilidad intracelular incluyen ligadores tales como (glymser)n y (sermgly)n, (véase, por ejemplo, la publicación PCT Nº WO 96/06641, que proporciona ejemplos de ligadores para usar en conjugados). En algunas realizaciones, se pueden incluir varios ligadores con el fin de aprovechar las propiedades deseadas de cada ligador.
Preparación de conjugados
Los conjugados con agentes diana ligados se pueden preparar mediante conjugación química, tecnología de ADN recombinante o combinaciones de expresión recombinante y conjugación química. El péptido de la invención y el agente citotóxico o dirigido pueden estar unidos en cualquier orientación y más de un agente dirigido y / o agente
65 diana pueden estar presentes en un conjugado
En algunas formas de realización preferidas de la invención, el agente citotóxico se une al péptido por medio de un espaciador polimérico hidrofílico y biocompatible, incluyendo un alquilo de cadena corta, ácido polisiálico o hialurónico, un polipéptido o un PEG. En algunas formas de realización preferidas de la invención, el agente citotóxico se conjuga a través de un enlazador escindible, por ejemplo, un enlace disulfuro o péptido que contiene
5 una secuencia escindible por las proteasas lisosomales tales como las catepsinas. En algunas realizaciones preferidas de la invención, el espaciador está unido o bien al extremo N o C del péptido.
Formulaciones
Los procedimientos de preparación de estas formulaciones o composiciones incluyen la etapa de poner en contacto un compuesto de la presente invención con el vehículo y, opcionalmente, uno o más ingredientes auxiliares. En general, las formulaciones se preparan poniendo en contacto de forma uniforme y estrecha un compuesto de la presente invención con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o con ambos y, después, en caso necesario, dando forma al producto.
15 Las formulaciones farmacéuticas pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de productos farmacéuticos. Tales formulaciones pueden contener agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes. Una formulación puede mezclarse con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que son adecuados para la fabricación. Tal "excipiente" se refiere generalmente a un material sustancialmente inerte que es no tóxico y no interacciona con otros componentes de la composición de una manera perjudicial. Excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, líquidos tales como agua, solución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico, glicerol y etanol. Se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos minerales tales como trifluoroacetato, clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares, y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos,
25 malonatos, benzoatos.
El agente terapéutico se puede administrar en una composición farmacéutica o medicamento adecuado para la administración. Las formulaciones pueden comprender uno o más diluyentes, emulsionantes, conservantes, tampones, excipientes, etc, y pueden proporcionarse en formas tales como polvos liofilizados, aerosoles, cremas, lociones, geles, en parches, implantes, etc. Las formulaciones farmacéuticas para administración oral pueden formularse usando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosis apropiadas y adecuadas. Dichos soportes permiten formular las composiciones farmacéuticas en formas de dosificación unitaria de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y similares, para ingestión por el paciente. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden formular usando
35 un excipiente sólido, opcionalmente moliendo una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, tras añadir las compuestos adicionales adecuados, si se desea, para obtener núcleos de comprimidos o núcleos de grageas. Excipientes sólidos adecuados son cargas de hidratos de carbono o de proteínas, por ejemplo azúcares, incluidos lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa sódica; y gomas, incluidas arábiga y de tragacanto; y proteínas tales como gelatina y colágeno. Se pueden añadir agentes disgregantes o solubilizantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico o una sal de los mismos, tal como alginato de sodio.
Las suspensiones acuosas pueden contener un agente activo (por ejemplo, un polipéptido quimérico o peptidomimético de la invención) en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones 45 acuosas. Dichos excipientes incluyen un agente de suspensión, tal como carboximetilceulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato sódico, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga, y agentes de dispersión o humectantes tales como fosfatida natural (p. ej., lecitina), un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso (p. ej., estearato de polioxietileno), un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga (p. ej., heptadecaetilenoxicetanol), un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un anhídrido de hexitol (p. ej., monooleato de polioxietilensorbitano) o o un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de ácido graso y un anhídrido de hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietileno sorbitán). La suspensión acuosa puede también contener uno o más conservantes, tales como p-hidroxi-benzoato de etilo o de n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes aromatizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa, aspartamo o
55 sacarina. Las formulaciones se pueden ajustar para la osmolaridad.
Productos farmacéuticos a base de aceite son útiles para la administración de agentes activos hidrófobos de la invención. Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo un agente activo (p. ej., Una composición quimérica de la invención) en un aceite vegetal, tal como aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo, aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida; o una mezcla de éstos. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.716.928, que describe el uso de aceites esenciales o componentes de aceites esenciales para aumentar la biodisponibilidad y reducir la variabilidad inter e intraindividual de compuestos farmacéuticos hidrófobos administrados por vía oral (véase también la patente de EE.UU. Nº 5.858.401). Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, tal como cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Los agentes 65 edulcorantes se pueden añadir para proporcionar una preparación oral de sabor agradable, tal como glicerol, sorbitol
o sacarosa. Estas formulaciones se pueden conservar mediante la adición de un antioxidante tal como ácido
ascórbico. Como ejemplo de un vehículo oleoso inyectable, véase Minto (1997) J. Pharmacol.Exp.Ther.281: 93
102. formulaciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden también estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral, descrito anteriormente, o una mezcla de éstos. Agentes emulsionantes adecuados incluyen gomas naturales, tales como goma arábiga y goma
5 tragacanto, fosfatidas naturales, tales como lecitina de soja, ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, tales como monooleato de sorbitano, y productos de condensación de estos ésteres parciales con óxido de etileno, tal como monooleato de polioxietileno sorbitano. La emulsión también puede contener agentes edulcorantes y agentes aromatizantes, como en la formulación de jarabes y elixires. Dichas formulaciones pueden también contener un demulcente un conservante o un colorante.
También se contempla que una composición o medicamento que comprende el agente terapéutico pueden contener un vehículo farmacéuticamente aceptable que sirve como estabilizante, en particular para agentes peptídicos, proteicos, polinucleotídicos. Ejemplos de vehículos adecuados que también actúan como estabilizantes para péptidos incluyen grados farmacéuticos de dextrosa, sacarosa, lactosa, trehalosa, manitol, sorbitol, inositol,
15 dextrano, y similares. Otros vehículos adecuados incluyen almidón, celulosa, sodio o fosfatos de calcio, ácido cítrico, ácido tartárico, glicina, polietilenglicoles de alto peso molecular (PEG), y combinación de los mismos. También puede ser útil emplear un lípido y / o detergente cargado. Los lípidos cargados adecuados incluyen, sin limitación, fosfatidilcolinas (lecitina). Detergentes serán típicamente un tensioactivo no iónico, aniónico, catiónico o anfótero. Ejemplos de tensioactivos adecuados incluyen, por ejemplo, tensioactivos Tergitol® y Triton® (Union Carbide Chemicals and Plastics, Danbury, CT), polioxietilensorbitanos, por ejemplo, tensioactivos TWEEN® (Atlas Chemical Industries, Wilmington, DE), éteres de polioxietileno, por ejemplo Brij, ésteres de ácidos grasos farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, lauril sulfato y sus sales (SDS). Se dispone de una exhaustiva discusión de excipientes, vehículos, estabilizantes, sustancias coadyuvantes farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J.1991).
25 Las composiciones farmacéuticas de la presente invención adecuadas para administración parenteral comprenden uno o más compuestos de la invención en combinación con una o más soluciones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos estériles u otras formas sólidas que se pueden reconstituir en soluciones inyectables estériles o dispersiones justo antes de usar, que pueden contener azúcares, alcoholes, antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que convierten a la formulación en isotónica con la sangre del receptor al que está destinada o agentes de suspensión o espesantes.
Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden usar en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol), y mezclas
35 adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones pueden también contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de los microorganismos con los compuestos de la presente invención se puede asegurar mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenes, clorobutanol, fenol, ácido sórbico. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico, solución salina tamponada con fosfato en las composiciones.
45 Además, una absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede efectuar mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y/o gelatina.
En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un fármaco, es deseable ralentizar la absorción del fármaco de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede conseguir mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene mala solubilidad en agua. Por tanto, la tasa de absorción del fármaco depende de su tasa de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retardada de un fármaco administrado parenteralmente se consigue disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo oleoso.
55 En los métodos de la invención, los compuestos farmacéuticos también pueden liberarse como microesferas para liberación lenta en el cuerpo. Por ejemplo, las microesferas pueden administrarse mediante inyección intradérmica de fármaco que liberan lentamente por vía subcutánea; véase Rao (1995) J. Biomater Polym.Ed. 7: 623-645; como formulaciones en gel biodegradables e inyectables, véase, por ejemplo, Gao (1995) Daño.Res.12: 857-863 (1995); o, como microesferas para administración oral, véase, por ejemplo, Eyles (1997) J. Pharm.Pharmacol. 49: 669 -674.
Las formas depot inyectables se fabrican formando matrices en microcapsulares de los compuestos de la presente invención en polímeros biodegradables, tales como poliláctido-poliglicólido. Dependiendo de la proporción entre el fármaco y el polímero, y la naturaleza del polímero concreto empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las
65 formulaciones depot inyectables también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejido corporal.
El polipéptido se puede administrar por sí solo o en combinación con otro compuesto terapéutico. En particular, el polipéptido puede administrarse en combinación con un compuesto terapéutico usado para tratar el melanoma, la inflamación o una enfermedad autoinmunitario en el mamífero. El polipéptido y el compuesto terapéutico adicional se
5 pueden formular en las mismas o diferentes composiciones. El polipéptido puede administrarse simultáneamente, secuencialmente o por separado a partir del compuesto terapéutico adicional.
Dosificación
Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que es eficaz para alcanzar la respuesta terapéutica deseada para un paciente concreto, composición y modo de administración sin que sea tóxico para el paciente. Cuando los compuestos de la presente invención se administran como sustancias farmacéuticas a seres humanos y animales, se pueden administrar per se o como composición farmacéutica que contiene, por ejemplo de
15 0,1 a 99 % (más preferentemente, de 0,5 a 90%) del ingrediente activo, más preferentemente, del 10% al 30% en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El nivel de dosificación seleccionado dependerá de diversos factores, incluyendo la actividad del compuesto concreto de la presente invención usado, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción o metabolismo del compuesto concreto usado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con el compuesto concreto usado, la velocidad y la extensión de la absorción, la edad, el sexo, el peso, el estado de salud general y el historial médico previo del paciente que se esté tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
25 Un médico o veterinario expertos en la técnica pueden determinar fácilmente y prescribir la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar las dosis de los compuestos de la invención usadas en la composición farmacéutica a niveles inferiores a los necesarios con el fin de conseguir el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosis hasta conseguir el efecto deseado.
En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la invención será la cantidad del compuesto que es la dosis menor eficaz para producir un efecto terapéutico. Dicha dosis eficaz dependerá, en general, de los factores descritos anteriormente. Generalmente, las dosis oral, intravenosa, intracerebroventricular y subcutáneas de los compuestos de la presente invención para un paciente, cuando se usa para los efectos indicados, tendrán un intervalo de 1 mcg a 5 mg por kilogramo de peso corporal por hora. En otras realizaciones, la dosis tendrá un
35 intervalo de 5 mcg a 2,5 mg por kilogramo de peso corporal por hora. En realizaciones adicionales, la dosis tendrá un intervalo de 5 mcg a 1 mg por kilogramo de peso corporal por hora.
Si se desea, la dosis diaria eficaz del compuesto activo puede administrarse en dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos adecuados a lo largo del día, opcionalmente en formas monodosis. En una forma de realización, el compuesto se administra como una dosis por día. En otras realizaciones, el compuesto se administra de forma continua, como a través de vías intravenosas u otras. En otras realizaciones, el compuesto se administra con menos frecuencia que a diario, tales como semanal o menos.
Aunque es posible administrar el compuesto de la presente invención, es preferible administrar el compuesto como 45 una formulación farmacéutica (composición).
El sujeto que recibe este tratamiento es cualquier animal que lo necesite, incluyendo primates, en particular seres humanos, y otros mamíferos tales como conejos, equinos, bovinos, tales como bovino, cerdos, cabras y ovejas; y las aves de corral y animales domésticos en general.
El compuesto de la invención puede administrarse como tal o en mezclas con portadores farmacéuticamente aceptables y también se puede administrar en conjunto con agentes antimicrobianos tales como penicilinas, cefalosporinas, aminoglucósidos y glucopéptidos. La terapia auxiliar, por tanto, incluye la administración secuencial, simultánea y separada, o coadministración, del compuesto activo de modo que los efectos terapéuticos de la primera
55 administrada no ha desaparecido completamente cuando se administra el siguiente compuesto.
Posibles vías de administración de los compuestos divulgados
Estos compuestos se pueden administrar a humanos y otros animales para terapia por cualquier vía de administración adecuada. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "vía" de la administración se pretende incluir la inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyección intraocular, inyección intradérmica, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, administración intratraqueal, administración intraadiposal, la administración intraarticular, administración intratecal, administración epidural, por inhalación, administración intranasal, administración oral, administración sublingual, administración bucal, administración rectal, administración 65 vaginal, la administración intracisternal, la administración transdérmica y la administración tópica, o administración a través de liberación local (por ejemplo mediante catéter o stent). Los compuestos también pueden administrarse o
coadministrarse en formas de dosificación de liberación lenta.
En los métodos de la invención, los compuestos farmacéuticos se pueden administrar también por vías intranasal, intraocular, periocular e intravaginal, incluyendo supositorios, insuflación, polvos y formulaciones de aerosol (para
5 ejemplos de inhalantes de esteroides, véase Rohatagi (1995) J. Clin.Pharmacol.35: 1187 -1193; Tjwa (1995) Ann. Allergy Asthma Immunol. 75: 107 -111). Las formulaciones de supositorios pueden preparar mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a las temperaturas habituales pero líquido a la temperatura corporal y que por lo tanto se funda en el cuerpo liberando el fármaco. Dichos materiales son manteca de cacao y polietilenglicoles.
10 En los métodos de la invención, los compuestos farmacéuticos pueden administrarse por vía transdérmica, por una vía tópica, formulados como barras aplicadoras, soluciones, suspensiones, emulsiones, geles, cremas, ungüentos, pastas, jaleas, polvos y aerosoles.
15 En los métodos de la invención, los compuestos farmacéuticos pueden administrarse por vía parenteral, tal como por vía intravenosa (IV) o administración en una cavidad corporal (por ejemplo, el espacio sinovial) o lumen de un órgano. Estas formulaciones pueden comprender una solución de agente activo disuelto en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están agua, y solución de Ringer, y solución isotónica de cloruro sódico. Además, se pueden emplear aceites fijos estériles en
20 forma de un disolvente o un medio de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier aceite fijo suave incluyendo mono-o diglicéridos sintéticos.
Como se describe en el presente documento, los métodos de la presente invención se pueden usar solos o en combinación con otros enfoques para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o las demás condiciones
25 descritas en el presente documento.
La combinación concreta de terapias (terapéuticas y procedimientos) para usar en un régimen de combinación tendrá en cuenta la compatibilidad de las terapéuticas y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico que se desea conseguir. También se apreciará que las terapias empleadas pueden conseguir un efecto deseado para el
30 mismo trastorno (por ejemplo, un compuesto de la invención se puede administrar junto con otro agente usado para tratar el mismo trastorno) o pueden conseguir efectos diferentes (p. ej., control de cualquier efecto adverso). Como se usa en el presente documento, agentes terapéuticos adicionales que normalmente se administran para tratar prevenir una enfermedad o afección concreta se conocen como “adecuados para la enfermedad o afección que se esté tratando”.
35 Un tratamiento de combinación de la presente invención como se define el presente documento se puede lograr por medio de la administración simultánea, secuencial o separada de los componentes individuales de dicho tratamiento.
Aplicaciones terapéuticas
40 Administración del polinucleótido o un compuesto modulador (en lo sucesivo "agente terapéutico") como se trata en el presente documento pueden ser o bien para el propósito preventivo o terapéutico. Cuando se proporciona de manera preventiva, el agente terapéutico se proporciona antes de cualquier síntoma. La administración preventiva del agente terapéutico sirve para prevenir o atenuar cualquier síntoma. Cuando se proporciona terapéuticamente, se
45 proporciona el agente terapéutico con la aparición (o poco después) de un síntoma de la enfermedad o trastorno. La administración terapéutica del agente terapéutico sirve para atenuar cualquier exacerbación real de los síntomas.
El individuo tratado puede ser cualquier mamífero. En un aspecto, el mamífero es un ser humano. En otro aspecto, el ser humano tiene una enfermedad o afección autoinmunitaria. En otros aspectos, la enfermedad o afección
50 autoinmunitaria está asociada se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, diabetes de tipo I, anemia aplásica, enfermedad de Graves, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, lupus, artritis, osteoartritis, uveítis autoinmunitaria, encefalomielitis autoinmunitaria y miastenia gravis.
En otros aspectos, el ser humano tiene una enfermedad o afección inflamatoria. En otro aspecto, la enfermedad o
55 afección inflamatoria se asocia con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad, artritis reumatoide, alergia aterosclerosis, psoriasis, gastritis y enfermedad isquémica cardíaca. En otro aspecto, la inflamación está asociada con la muerte cerebral, preferentemente donde los niveles circulantes de α-MSH endógena o α-MSH en el tejido cerebral se reducen. En aún otro aspecto, el agente terapéutico se utiliza para tratar a un sujeto con una enfermedad o trastorno mediado por α-MSH o por el receptor de MC1.
60 En otro aspecto, la presente invención está dirigida al tratamiento de un sujeto con melanoma. En un aspecto, la presente invención atenúa o mejora el melanoma en los sujetos. En aún otro aspecto, los compuestos de la presente invención se usan en ensayos para la detección o pruebas de imágenes de melanoma.
Kits que comprenden los compuestos divulgados
La invención también proporciona kits para llevar a cabo los regímenes terapéuticos de la invención. Tales kits comprenden cantidades terapéuticamente eficaces de un péptido que tiene actividad específica como moduladores 5 de MC1R, en forma farmacéuticamente aceptable, solo o en combinación con otros agentes, en forma farmacéuticamente aceptable. Formas farmacéuticas preferidas incluyen péptidos en combinación con solución salina estéril, solución de dextrosa, solución tamponada, u otro fluido estéril farmacéuticamente aceptable. Alternativamente, la composición puede estar liofilizada o desecada. En este ejemplo, el kit puede comprender además una solución farmacéuticamente aceptable, preferentemente estéril, para formar una solución para fines de inyección. En otra realización, el kit puede comprender además una aguja o jeringa, preferentemente envasada en forma estéril, para inyectar la composición. En otras realizaciones, el kit comprende además un medio de instrucciones para la administración de la composición a un sujeto. Los medios de instrucción puede ser un inserto escrito, una grabación de audio, una grabación audiovisual, o cualquier otro medio para enseñar la administración de la composición a un sujeto. En una realización, el kit comprende (i) un primer recipiente que contiene un péptido que
15 tiene actividad moduladora-específica del MC1R (ii) medios de instrucciones para su uso.
Realizaciones adicionales de método de tratamiento
En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para reducir o inhibir el rechazo de trasplante en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar a dicho sujeto una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de al menos uno de los compuestos peptídicos proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para reducir o inhibir una respuesta inmune del sujeto provocada por tejidos, células u órganos trasplantados. Ejemplos de un tejido trasplantado son un aloinjerto en el transplante de corazón experimental y células de los
25 islotes pancreáticos.
Actividad inmunosupresora en el modelo de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE)
Se generaron nuevos análogos peptídicos de D-aminoácidos de α-MSH y se evaluaron los efectos moduladores inmunes en la uveítis autoinmunitaria experimental (EAU) y los modelos de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE), así como en un modelo de enfermedad inflamatoria inducida por lipopolisacárido (LPS). El tratamiento con el análogo de RI α-MSH redujo las puntuaciones clínicas de la enfermedad y la incidencia de la enfermedad en el modelo EAU y en un modelo de EAE de ratón inducida por MOG. Además, los niveles de expresión de mana de el TNF-α e IL-10 en bazo y ganglios linfáticos de ratones sensibilizados con MOG
35 disminuyeron en los ratones tratados. En un modelo de inflamación sistémica inducida por LPS, el tratamiento con α-MSH un análogo disminuyó los niveles de citocinas en suero. Estos datos indican que estos nuevos análogos de α-MSH tienen el potencial para uso terapéutico en las enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias.
Materiales y procedimientos
Péptidos. α-MSH (SYSMEHFRWGKPV) se adquirió en Bachem (King of Prussia, PA). Un análogo de D-aminoácido de RI α-MSH analógica (vpkgwrfhemsys), un péptido sustituido con alanina de RI α-MSH, (estearilo) HfRW (820), (Ph (CH2)3CO) HfRW (819), y el análogo de RI α-MSH 891 [vpkGwr (D-Cha) hsiiss] fueron sintetizados por Genzyme Corporation con una metodología en fase sólida estándar y se purificó por HPLC de fase inversa. Un péptido de
45 control D-aminoácido de secuencia aleatoria (ksrsmgvfpeyh) fue sintetizado por Genzyme Corporation. Un péptido de control D-aminoácido irrelevante (plykkiikklles) fue sintetizado por Genzyme Corporation.
Animales. Los ratones B10.RIII-H2r hembra de cinco a seis semanas de edad se adquirieron en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).
Los ratones C57BL/6 hembra de seis a ocho semanas de edad o macho se adquirieron en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Todos los protocolos para los estudios en animales contaron con la aprobación del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de animales (IACUC) Genzyme Corporation
55 Inducción de EAU. En ratones B10.RIII hembra se inyectaron, por vía subcutánea , en dos sitios (entre los omóplatos y en la región pélvica) un total de 200 µg del péptido de la proteína de unión al interfotorreceptor (IRBP) 161-180 (New England Peptide; Fitchburg, MA), respectivamente, en 2 mg / ml de adyuvante completo de Freund (CFA, Sigma, St. Louis, MO) con micobacteria de tuberculosis H37Ra (Difco, Detroit, MI).
Puntuación ocular. Los ojos de los ratones se dilatan utilizando una o dos gotas de Mydriacyl 1% (Alcon, Humacao, Puerto Rico) y se dejaron descansar en una habitación oscura durante aproximadamente 5 minutos. Los ratones se sujetan manualmente y se visualizan las retinas de ambos ojos con un oftalmoscopio indirecto con una lente de 78 dioptrías. Los ojos se puntúan según la inflamación utilizando un sistema de puntuación progresiva entre 0-5. Puntuación 0: retina normal. Puntuación 1: inflamación vascular proximal al nervio óptico. Puntuación 2: <5 lesiones 65 inflamatorias confinadas a un cuadrante del ojo. Puntuación 3: <> 5 lesiones inflamatorias en más de un cuadrante del ojo.. Puntuación 4: Las lesiones inflamatorias son contiguas. Puntuación 5: desprendimiento de retina. Se
extrajeron los ojos enteros de los ratones y se introdujeron en PBS. Los ojos se incluyeron en medio OCT para la fijación en congelación. Se cortaron secciones de 5 micrómetros a través del plano del nervio óptico-papilar y se tiñeron con hematoxilina y eosina.
5 Estudios de unión a los receptores de melanocortina. Se midieron los perfiles de unión para α-MSH, RI α-MSH, y el péptido de secuencia aleatoria a los receptores de melanocortina: 1, 3, 4, y 5 .La unión se realizó mediante un ensayo de unión competitiva con (Nle4, D-Phe7) α-MSH (Bachem). El análisis de la unión lo realizó Cerep laboratories (París, Francia) con muestras codificadas.
A la unión de los péptidos le siguió también una competición con 125I-NDP-MSH para la unión a los receptores de melanocortina 1, 3, 4, y 5 usando preparaciones de membrana de las líneas celulares HEK293. Los péptidos se mezclaron con 125I (Nle4, D-Phe7) -α-MSH (PerkinElrner, Boston MA) en placas de 96 pocillos de fondo en V en tampón (HEPES 25 mM a pH 7, CaCl2 1,5 mM2,MgSO4 1 mM, NaCl 100 mM, 0,2% de BSA) y se mezclaron con preparaciones de membrana a partir de líneas de células HEK293 transfectadas (Perkin Elmer, Boston MA) que
15 contienen 1-10 fmol del receptor durante 1 hora a 25 ° C. Se usó (Nle4, D-Phe7) -NDP-MSH (Bachem) a 3 M como control positivo. Las mezclas se filtraron a través de filtros GFC de 96 pocillos (Millipore, Billerica, MA), se lavaron 3 veces con tampón de unión sin BSA, se secaron y contaron.
Medición de AMPc. Las células B16-F1 (línea celular de melanoma) de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA) se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano en 5x104/ pocillo y se cultivaron durante la noche en DMEM (Cambrex, Walkersville, MD) suplementado con glutamina 2 mM, antibióticos (100 U / ml de penicilina y 100 U / ml de estreptomicina) y 10% de suero bovino fetal inactivado con calor (Invitrogen, Grand Island, NY). Las células se trataron después con α-MSH nativa (0,01-1000 ng / ml), α-MSH retro-inversa (0,01-1000 ng / ml),
o un péptido control de aminoácido D de secuencia aleatoria (0,01-1000 ng / ml) durante 30 minutos. Las células se
25 lisaron y se midieron los niveles de AMPc intracelular mediante un kit de inmunoensayo enzimático (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). La forscolina (Sigma, St. Louis, MO) a 100 M sirvió como control positivo.
Indicción de EAE y puntuación. Ratones C57BL / 6 hembra se inmunizaron con una emulsión de péptido MOG3555 (200 g / ratón New England Peptide; Fitchburg, MA) en adyuvante completo de Freund (CFA, Sigma, St. Louis, MO) que contiene 0,6 mg de Mycobacterium tuberculosis ( Difco, Detroit, MI). La emulsión se liberó en un volumen de 0,2 ml por ratón mediante inyección subcutánea a dos sitios. Se usó la toxina de Bordetella pertussis (PTX, Sigma) en PBS a una dosis de 400 ng / animal a través de una vía de administración i.p. y se administra el día 0 y el día 3. Se monitorizó a los ratones a diario para detectar los síntomas de parálisis de la EAE. Los ratones se puntuaron según los síntomas clínicos utilizando un sistema de puntuación progresiva entre 0-5. Puntuación 0:
35 ausencia de enfermedad; Puntuación 1: cola flácida; Puntuación 2; debilidad de las extremidades posteriores; Puntuación 3: parálisis de las extremidades posteriores; Puntuación 4: debilidad de las extremidades / parálisis parcial del frente; Puntuación 5; muerte. Se recogieron la médula espinal y el cerebro y se incluyeron en parafina para la tinción de hematoxilina y eosina.
Ensayo de proliferación. Esplenocitos y células de ganglios linfáticos de ratón C57BL/6 se cultivaron en placas de 96 pocillos a 5 x 105 células/pocillo, Se añadió el péptido MOG35 -55 u OVA 257 -264 a los pocillos a una concentración de 25 µg/ml. El sobrenadante se recogió 48 horas después de la estimulación con el péptido MOG. Tras 3 días en cultivo, las células se pulsaron con [3H]timidina a 1 µCi/pocillo durante 8 horas. La incorporación de timidina se midió mediante cpm.
45 Análisis de ARN de citocinas-RT-PCRq El ARNA total se extrajo de los tejidos con TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). 1 µg del ARN total se retrotranscribió y se usó en PCR cuantitativa usando incorporación de verde SYBR con reactivos de Applied Biosystems (Foster City, CA) en un ABI 7900. Un patrón de ADNc se pasó en cada PCR para las dianas citocinas y las concentraciones de mensajes se normalizaron con respecto a la β-actina de ratón. Los cebadores usados para obtener estos datos fueron los siguientes: TNFα de ratón directo -ggcaggtctactttggagtcattgc e inverso-acattcgaggctccagtgaattcgg (1). Se usó IL-10 de ratón directa: tgctatgctgcctgctctta y tcatttccgataaggcttgg inversa (2). Las secuencias para la β-actina de ratón son: gtgggccgctctaggcaccaa directa y ctctttgatgtcacgcacgatttc
(3) inversa.
55 Análisis CBA: El análisis por citometría de flujo de perfiles de citocinas inflamatorias de suero de ratón o sobrenadante celular se midió usando el kit Cytometric Bead Array Kit (CBA) de BD Biosciences (San Jose, CA). Las muestras se procesaron de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Análisis de ARN mMClR-RT-PCRq El ARNA total se extrajo de los tejidos con TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). 1 µg del ARN total se retrotranscribió y se usó en PCR cuantitativa usando n kit Taíman con reactivos de Applied Biosystems (Foster City, CA) en un ABI 7900. Un patrón de ADNc se pasó en cada PCR para mMCIR y para las concentraciones de mensajes se normalizaron con respecto al control endógeno eucariótico 18S (sonda VIC/MGB, Applied Biosystems parte nº 4319413E). Los cebadores para mMClR fueron los siguientes: Directo CTCTGCCTCGTCACTTTCTTTCTA e inverso AACATGTGGGCATACAGAATCG y sonda CCATGCTGGCACTCA.
65 Estos se diseñaron usando Primer Express 3,0 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Modelo de LPS. Ratones C57BL/6 macho se expusieron a LPS (1 ug/RATÓN), i.p. Tras 30 minutos, se trató a los ratones con dexametasona (2 mg/kg; Sigma), análogo RI-α-MSH 891 o RI-α-MSH. A las 2 horas de la exposición a LPS, se extrajo sangre para obtener el suero de los ratones. El análisis de las citocinas se midió mediante citometría de flujo con un kit de matriz con esferas citométrico (BD Biosciences).
5 Análisis estadístico. Los resultados se expresan como la media ± SD. Cada experimento se repitió al menos dos veces. Para analizar los resultados se usó un ANOVA de una vía y el ensayo de comparación múltiple de Tukey.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención.
10 Ejemplo 1.
Actividad inmunosupresora en el modelo de uveítis autoinmunitaria experimental (EAU)
15 La uveítis autoinmunitaria es un trastorno inflamatorio del ojo que puede producir dolor y pérdida de visión. Los esteroides y fármacos inmunosupresores actualmente son las únicas terapéuticas para la uveítis y a menudo tienen toxicidades graves oculares y sistémicas. Por tanto, se desean terapéuticas alternativas más seguras.
La EAU es un modelo animal de uveítis humana que afecta 2,3 millones de individuos en EE.UU. La inmunización
20 con la proteína de unión retinoide interfotoreceptor (IRBP) o sus fragmentos peptídicos o S-antígeno retiniano (S-Ag) con adyuvante pueden inducir enfermedades en cepas susceptibles de roedores. La enfermedad implica infiltración de células inflamatorias en la retina del ojo y los daños a los fotorreceptores con recuperación natural sin recaídas espontáneas. La transferencia adoptiva de linfocitos T uveitogénicos en receptores roedores singeneicos sugiere que la uveítis es una enfermedad autoinmunitaria mediada por linfocitos T específicos de órgano como muchas otras
25 enfermedades autoinmunitarias, tales como esclerosis múltiple, diabetes de tipo 1 y artritis reumatoide.
El microentorno ocular es un sitio inmunológico privilegiado en el que se ponen en marcha mecanismos para mantener la inmunosupresión para prevenir la inflamación local. Varios neuropéptidos que se expresan en las neuronas en el tejido ocular ayudan a sostener el privilegio inmunitario en el ojo. Uno de estos neuropéptidos es α
30 MSH que se expresan de forma constitutiva en el microentorno ocular a una concentración fisiológica de 30 pg/ml.
La administración sistémica de α-MSH nativa durante la inducción de uveítis inducida por endotoxina en ratas inhibió el número de células infiltrantes y los niveles de IL-6, TNF-α, MCP-1, M1P-2, y óxido nítrico en el humor acuoso de un modo dependiente de la dosis. En un ratón, la administración en el modelo de EAU de α-MSH en el tiempo
35 máximo de inflamación retiniana suprimió la gravedad de la enfermedad. La α-MSH puede inducir células reguladoras T mediante el receptor 5 de la melanocortina (MCR-5) en los linfocitos T y suprime la EAU.
Se evaluó la eficacia del tratamiento con α-MSH nativa en el modelo de uveítis posterior murina. La uveítis se indujo en ratones B10.RIII con una inyección de IRBP 161 -180 y CFA. El inicio de la enfermedad se produjo alrededor del 40 día 10 después de la sensibilización. Cuando se alcanzaron puntuaciones oculares de 2-3 el día 13 se administró a los ratones α -MSH nativa a 200 µg/ratón i.v. durante 7 días consecutivos o se dejaron sin tratar. Dado que el tratamiento profiláctico puede estar dirigido a actividades en la fase de sensibilización de la enfermedad más que en la fase efectora, el tratamiento se inició cuando se observó inflamación activa de la retina. Además, esta estrategia terapéutica recapitula mejor la aplicación clínica. Los ratones tratados con la µ-MSH mostraron una reducción de las
45 puntuaciones oculares clínicas medias a lo largo del curso de 7 días del tratamiento en comparación con los ratones sin tratar (Figure 1a). Los ratones tratados con α-MSH mostraron una puntuación ocular media máxima de 2,83 ± 0,39 el día 13 en comparación con el grupo de ratones sin tratar que alcanzó una puntuación ocular media máxima de 3,67 ± 0,52 el día 15.
50 Ejemplo 2
Comparación de α-MSH nativa con dexametasona en el modelo de uveítis autoinmunitaria experimental B10.RIII
Las formas actuales de terapia para la uveítis incluyen corticosteroides y agentes inmunosupresores. La eficacia de
55 la α-MSH nativa se comparó con una terapia de corticosteroides conocida, la dexametasona. La uveítis se indujo en ratones B10.RIII con inyecciones de IRBP161 -180 y CFA. En el momento del inicio de la enfermedad, cuando los ratones alcanzaron una puntuación ocular clínica de 1, se administró a los ratones inyecciones diarias intraperitoneales de α-MSH nativa (100 µg/ratón), 0,2 mg/kg de dexametasona o 2,0 mg/kg de dexametasona. Los ratones fueron tratados a diario durante 21 días. Los ratones tratados con α-MSH nativa mostraron una reducción
60 significativa de las puntuaciones oculares clínicas medias durante el curso del tratamiento en comparación con los ratones control tratados con PBS (Fig. 1B). Los datos mostraron que la administración i.p. diaria de α-MSH nativa suprimía la uveítis en un mayor grado que el tratamiento con dexametasona a la dosis de 0,2 mg/kg o 2,0 mg/kg.
Ejemplo 3
Un nuevo análogo de α-MSH retro-inverso se une específicamente al MCR-1
5 Se sintetizó un nuevo análogo peptídico D-amino estable de la α-MSH nativa (RI α-MSH) y se evaluaron las capacidades moduladoras inmunitarias in vitro y en el modelo de uveítis autoinmunitaria (EAU) experimental. Los estudios de unión indicaron que al contrario que la α-MSH nativa, RI α-MSH se une específicamente al receptor de la α-MSH antiinflamatoria (MCR-2) pero a ninguno de los demás receptores de la α-MSH (MCR-3, 4 o 5).
10 Se analizó la unión del análogo RI α-MSH a los receptores de melanocortina (MCR). Se realizó un ensayo de unión competitiva usando un panel de MCR que incluyen MCR 1, 3, 4 y 5. La unión de los péptidos se siguió mediante una competición con 125I-NDP-MSH como se ha descrito anteriormente. La α-MSH nativa se unió a los MCR 1, 3, 4 y 5. No obstante, al contrario que la α-MSH nativa, RI α-MSH solo se unió a al PCR-1, que regula las respuestas inflamatorias (Tabla 1). Un péptido control de D-aminoácido de secuencia aleatoria no se unió a los receptores de
15 melanocortina. El desarrollo de un análogo de α-MSH con unión específica a MCR-1 y la exclusión de la unión a MCR-3 y MCR-4 puede disminuir los posibles efectos secundarios que la α-MSH nativa produce a través de la unión a estos receptores.
A la unión de los péptidos le siguió una competición con 125I-NDP-MSH para la unión a los receptores de melanocortina 1, 3, 4, y 5 usando preparaciones de membrana de las líneas celulares HEK293. Como se muestra en la Figura 18, RI α-MSH mostró una selectividad muy fuerte por MC1R, con valores de Ki en exceso de 30 µ, con tanto MC 3, 4 como 5R, mientras que la α-MSH mostró una unión significativa a los cuatro receptores, con una
5 selectividad menor de 100 veces para MC1R en relación con MC3R.
Ejemplo 4
El tratamiento con el análogo retroinverso de la α-MSH mejora la enfermedad en la EAU
Efectos inmunomoduladores del nuevo análogo peptídico de α-MSH retro-inverso se observó en el modelo experimental de ratón uveítis autoinmunitaria (EAU) y los resultados se compararon con los del péptido α-MSH nativa. La administración sistémica de RI α-MSH en el inicio de la enfermedad o durante la etapa tardía de la enfermedad mejoró de manera espectacular reproducible la uveítis. Además, el tratamiento con el nuevo análogo
15 peptídico de RI α-MSH suprimió la uveítis con una magnitud similar a la del péptido α-MSH nativa. Estos datos indican que el nuevo análogo de RI α-MSH muestra actividades antiinflamatorias y tiene un uso terapéutico en la uveítis y otras enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias.
Se indujo EAU ratones B10.RIII hembra con IRBP 161-180. Se examinó la eficacia de la RI α-MSH y la α-MSH nativa como agente terapéutico en lugar de un tratamiento profiláctico. Los ratones se trataron diariamente mediante inyección intravenosa de 100 μg / ratón de RI α-MSH, 100 g / ratón de α-MSH nativa, o PBS comenzando cuando los ratones alcanzaron una fase moderada de la enfermedad de la uveítis (puntuaciones oculares de 2). Como se ve en la figura. 2Alos ratones tratados con PBS control alcanzaron puntuaciones oculares máximas el día 16 con una puntuación ocular media de 2,75 ± 0,68. Sin embargo, los ratones tratados diariamente con el análogo RI α-MSH o
25 la α-MSH nativa mostraron una reducción significativa de las puntuaciones oculares clínicas medias durante todo el curso del tratamiento en comparación con los ratones tratados con control de PBS. El día 16, cuatro días después del inicio del tratamiento, 5 de los 8 ratones en el grupo tratado con PBS tenían una puntuación ocular máxima de 3
o mayor, mientras que sólo 1 de los 8 ratones tratados con α-MSH nativa y 0 de los 8 ratones tratados con RI α MSH tenían una puntuación ocular máxima de ojo de 3 o mayor (Fig.2B).
Ejemplo 5
Las imágenes de la retina y la exploración histológica de los sujetos tratados con RI α-MSH muestran supresión de la enfermedad en modelos de EAU
35 Las imágenes de la retina de ratones tratados diariamente con RI α-MSH o con α-MSH nativa comenzando en la etapa tardía de la uveítis mostraron una supresión de la enfermedad en comparación con los ratones tratados con PBS control. Las imágenes del fondo de ojo se adquirieron el día 13 después del comienzo del tratamiento (Figura 3). La enfermedad en el grupo tratado con PBS se estabilizó o avanzó y tenía una puntuación ocular mediana de 3 con vasculitis grave y lesiones inflamatorias en todo el ojo (Fig.3A). Sin embargo, la enfermedad se resolvió rápidamente tanto en los ratones tratados con TRI α-MSH como en los tratados con el péptido α-MSH nativo. Las imágenes de la retina de los ojos mostraron puntuaciones de 1 con inflamación sólo en el nervio óptico (Figs. 3B y 3C). Las puntuaciones oculares máximas para los ratones individuales en cada grupo se muestran en la figura 3D. .En el grupo tratado con PBS, 7 de los 11 ratones tenían puntuaciones oculares de 3 o más. .Sin embargo, sólo 2 de
45 los 11 ratones en los grupos tratados con α-MSH nativa y con y RI α-MSH tuvieron puntuaciones oculares de 3 o mayores.
El análisis histológico de los ojos 10 días después del inicio del tratamiento diario mostró que tanto RI α-MSH como la α-MSH nativa reducen la patología en el ojo (Fig.4). Los ratones tratados con α-MSH nativa y RI α-MSH muestran la arquitectura normal de la retina con una ligera inflamación en la región del nervio óptico (Figs. 4B y 4C). Por el contrario, los ratones tratados con PBS muestran inflamación ocular y daño tisular. La inflamación se ve en las regiones de la retina y el nervio óptico con daño fotorreceptor (Fig.4A).
Ejemplo 6
55 Comparación de las administraciones intraperitoneales de retroinverso α-MSH a un péptido control mezclado en EAU
La uveítis se indujo en B10.Ratones RIII con IRBP161-180 y CFA inyecciones. Los inventores evaluaron el iniciar el tratamiento durante la fase tardía de la enfermedad (las puntuaciones de los ojos de 2-3) con RIα-MSH por inyecciones intraperitoneales diarias y la eficacia en comparación con un control revueltos D péptido de aminoácidos. Los ratones fueron tratados diariamente, ip, durante 13 días con RIα-MSH o revueltos péptido a 100 g / ratón .Los ratones tratados con RI α-MSH mostraron una reducción significativa (p <0,04) en las puntuaciones medias de los ojos clínicos en los días 15, 21 y 23 del curso de la enfermedad en comparación con los ratones de
65 control péptido revueltos (Fig.5).Individuales puntajes máximos oculares en el día 23 después de la inducción de la enfermedad mostraron un 75% de los ratones con las puntuaciones ≤1 en el RI α-MSH en comparación con ninguno
de los ratones en el grupo control mezclado péptido con puntuaciones ≤ 1.Los pesos individuales de los ratones se registraron a 4 puntos de tiempo durante todo el curso de la enfermedad. Todos los ratones, tanto en el RI α-MSH tratadas y revueltos grupos de péptidos tratados mantuvieron su peso o mostraron aumento de peso normal (datos no mostrados).Dosificación intraperitoneal diario con los péptidos no se tradujo en la pérdida de peso.Además, la vía
5 de administración intraperitoneal de nativa α-MSH o RI α-MSH a 100 g / ratón tuvo una eficacia en la uveítis cuando se administró el tratamiento en el inicio de la enfermedad, cuando los ratones alcancen una puntuación clínica de ojo 1 (datos no mostrados).Por lo tanto, la vía de administración intraperitoneal de RI α-MSH mostró una reducción significativa en las puntuaciones de enfermedad en comparación con un péptido de control revuelto.
Ejemplo 7
Administración de RI α-MSH A diversas dosificaciones al modelo de EAU
También se examinaron la eficacia y la dosificación óptima del tratamiento retro-inverso α-MSH durante la fase
15 tardía de la uveítis grave. En ratones B10.RIII se inyectón IRBP161-180 y CFA para inducir uveítis. Los ratones fueron tratados diariamente, i.p., con el péptido control PBS de secuencia aleatoria (100 g / ratón), o RI α-MSH a 100 mg, 10 mg o 3 mg / ratón. El tratamiento se inició en el momento del pico de la enfermedad, cuando los ratones alcanzaron puntuaciones oculares 4 se produjeron lesiones inflamatorias en todo el segmento posterior del ojo y la posible hemorragia. Las enfermedades en los grupos tratados con PBS y péptidos de secuencia aleatorias siguieron siendo graves (Fig.6). En contraste con ello, el tratamiento con RI α-MSH en 100 g o 10 g / ratón mejoró la uveítis rápidamente (p ≤ 0,05).Además, las dosis de 10 y 100 g / ratón fueron igualmente efectivas. La dosis / ratón de 3 g de RI α-MSH no redujo ni inhibió la enfermedad.
Ejemplo 8
25 Efecto de la α-MSH Retro-inversa sobre los niveles de AMPc
Se examinaron los niveles de AMPc en células de melanoma B16-F1 nativa después del tratamiento con α-MSH, RI α-MSH, o un péptido control de secuencia aleatoria. La línea de células de melanoma B16-F10 expresa un alto número de receptores MCR1 (3000-4000 receptores / célula) en comparación con líneas de células macrófagos que expresan sólo 100-200 receptores / célula .Por lo tanto se seleccionaron para examinar el efecto del tratamiento RI α-MSH en la línea de células de melanoma. Las células de melanoma murino B16-F1 se trataron con α-MSH nativa, RI α-MSH, o péptidocontrol de secuencia aleatoria a concentraciones de 1 pg / ml-1 g / ml .Después de 30 min, las células se lisaron y el AMP intracelular se midió mediante un inmunoensayo enzimático La forscolina se usó
35 habitualmente para elevar los niveles de AMPc, el tratamiento de control (100 mM) de las células mostró un aumento del AMPc (3455,39 ± 406,6 SD). los niveles de cAMP fueron significativamente elevados de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con α-MSH nativa en comparación con las células no tratadas (Fig.7A). El análogo de RI α-MSH también aumentó significativamente los niveles de AMPc de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control sin tratar o el péptido codificado. Sin embargo, una mayor concentración de RI α-MSH (100 ng / ml) fue necesaria aumentar el AMPc en comparación con la α-MSH nativa que aumentó el AMPc en una / ml de concentración de 10 pg. Esta diferencia en la concentración de péptido necesaria para aumentar los niveles de AMPc puede ser el resultado de la afinidad de unión al receptor MCR1.
Ejemplo 9
45 Variación de secuencia y efectos sobre los niveles del AMPc y unión a MC1R
La MSH se une a MC1R, MC3R, MC4R, and MC5R, siendo el MC1R una de las dianas deseadas para las enfermedades mediadas por el sistema inmunológico. La MSH retro-inversa (RI-MSH) se ha diseñado para que tenga una mayor estabilidad en plasma (Fig. 17) y efectividad por MC1R, pero su afinidad por MC1R es 11 veces menor que la del péptido MSH nativa (Tabla 1). Para restaurar la afinidad por MC1R, se injertaron RI-MSH modificaciones que se sabe que mejoran la afinidad por MC1R de MSH. De las tres sustituciones de la secuencia Nterminal de SYSME -acilo graso, ácido fenilbutírico y la secuencia SSIIS, que potencian la afinidad por MC1R de la MSH, sólo el último condujo a mejoras significativas para RI-MSH. El análogo del barrido de de RI-MSH exhibió una
55 relación estructura-actividad similar a la de barrido de alanina de MSH, pero la exploración por inversión estereoquímica de la región central de 4 residuos de unión a MC1R sugiere diferencias significativas entre MSH y RI-MSH. Además, la sustitución con ciclohexilalanina en el residuo clave fenilalanina mejoró la RI-MSH, pero no la unión de MSH a MC1R. La combinación de las sustituciones de ciclohexilalanina y SSIIS condujo a la restauración completa de la afinidad de MSH por MC1R, al tiempo que conserva la configuración retro-inversa crítica para la mejora de la estabilidad y la alta selectividad por MC1R de RI-MSH.
Un conjunto de análogos de barrido de alanina (péptidos 804-816) de MSH retro-inversa (RI-MSH) se preparó y se analizó para determinar la inducción de AMPc en células de melanoma murino B16 / murino F1 y humano M624. Una subpoblación basada en los resultados del AMPc se analizaron después para determinar la unión a MC1R. Los
65 valores de Ki observados para la unión a MC1R se muestran en la Tabla 1.
Las células de melanoma murino B16-F1 se trataron con α-MSH nativa, RI α-MSH, péptido control de secuencia aleatoria, KPV o péptidos sustituidos con alanina de RI α-MSH a 1 µg/ml (Fig. 7B). El tratamiento con forscolina control (100 µM) de las células mostró un incremento del AMPc (3294,82 ± 54,53). Los niveles de AMPc se elevaron significativamente en las células tratadas con α-MSH nativa y RI α-MSH en comparación con las células sin tratarm 5 tratadas con el péptido de secuencia aleatoria o tratadas con KPV. Los péptidos sustituidos con alanina designados 810, 811, and 812 mostraron ausencia de incremento de la actividad de AMPc y exhibieron niveles de AMPc equivalentes a las células sin tratar, tratadas con el péptido de secuencia aleatoria o tratadas con KPV. Los péptidos designados 810, 811 y 812 tienen sustituciones de alanina en la secuencia tetrapeptídica central nuclear (región D-Trp D-Arg D-Phe D-His; AA 5 -8) que se ha propuestos que están implicadas en la unión de α-MSH nativa al receptor de melanocortina y su actividad biológica. Las sustituciones de alanina en las regiones N-terminal o Cterminal del péptido RI α-MSH no afectaron a la acumulación de AMPc en las células de melanoma. Las sustituciones de alanina en los aminoácidos de metionina e histidina (807 y 809) también mostraron una reducción de la acumulación de AMPc aunque no tan grande como la observada en la secuencia tetrapeptídica nuclear (810, 811 o 812). Los residuos en el tetrapéptido nuclear (wrfh) y, en menor medida, la metionina 4 de RI-MSH son
15 cruciales para la unión a MC1R.
Otro medio que se ha mostrado que aumenta la afinidad de MSH por MC1R se ha demostrado usando selecciones en base a la expresión en fagos de las secuencias variantes de MSH. Una secuencia altamente selectiva de MC1R (MS05) se encontró después mediante recombinación del péptido seleccionado de expresión en fagos y una porción de la secuencia de MSH parental, que dio una afinidad del orden subnanomolar para MC1R. Inesperadamente, la versión retroinversa de esta secuencia mostró una afinidad más alta por MC1R (1 nM, Tabla 1 péptido 886) que RI-MSH (4 nM), aunque se indicó que MS05 tenóa una afinidad ligeramente menor por MC1R que MSH (Ki 0,865nM vs. 0,557 nM para MSH).
25 La sustitución de una serie de residuos de aminoácidos no naturales que incorporan ligeras diferencias en la carga y la estructura en cada una de las posiciones de RI-MSH mostró que el MC1 R tolera únicamente cambios altamente conservadores. Todos menos 3 mostraron una unión menor o equivalente. Dos cambios proporcionaron un incremento significativo de la afinidad por MC1R: Sustitución de la D-fenilalanina por D-ciclohexilalanina (D-Cha, péptido 869; 2,2 nM Ki) y sustitución de D-metionina por D-butionina (péptido 878, 2,3 nM Ki). La sustitución con Lciclohexilalanina se realizó y se halló que inhibía ligeramente la unión a MC1R (péptido 892, Ki of 0,51 nM vs. 0,41 nM para MSH). Inesperadamente, la combinación de las sustituciones de butionina y ciclohexilalanina no produjo un incremento significativo adicional en la afinidad por MC1R (péptido 890, 1,9 nM Ki). No obstante, la combinación del cambio que comprende sustitución de la secuencia N-terminal retroinversa de MS05 (siiss) para la secuencia Cterminal (emsys) y D-ciclohexilalanina para D-Phe en RI-MSH produjo una mayor potenciación de la unión que cada
35 uno de los cambios por separado, lo que indica que los efectos son sinérgicos. El péptido resultante (891) mostró una Ki para MC1R indistinguible de la MSH. aunque este y los demás cambios también produjeron incrementos de la afinidad por los otros MCR, los valores de Kui todavía estaban en el intervalo micromolar, lo que indica que la selectividad de RI-MSH estaba muy conservada. Los cambios se ilustran en la figura 20. En la figura 21 se muestra un ensayo de unión competitiva representativo. Véase la Tabla 1 para los valores de Ki observados.
Ejemplo 10
El tratamiento con RI α-MSH reduce las puntuaciones de la enfermedad clínica en la EAE
45 Se evaluó el efecto de la administración de α-MSH nativa y el análogo RI α-MSH en un modelo de EAR progresiva crónica en ratón. Ratas C57BL/6 hembra se inmunizaron con 200 µg del péptido MOG 35 -55 emulsionado con CFA. La toxina pertussis se administró los días 0 y 2. Los ratones se monitorizaron a diario para detectar signos de síntomas clínicos y pérdida de peso. Se evaluaron los ratones para detectar síntomas de parálisis de inicio el día 8 y se puntuaron en un sistema de clasificación de 0-5. La aparición de síntomas clínicos de parálisis se manifestó alrededor del día 9-11 en la mayoría de los ratones (Fig. 8A). El tratamiento intraperitoneal (i.p.) diario con α-MSH o RI α-MSH a 100 µg/ratón o con control PBS comenzó el día 10. Los ratones tratados con100 µg de RI α-MSH mostraron una reducción significativa de la puntuación media de la enfermedad clínica en comparación con el control PBS (Fig. 8A). La significación de p≤ 0,05 se alcanzó los días 14 -22 en RI α-MSH en comparación con el vehículo control PBS. No obstante, el tratamiento con el péptido α-MSH nativa no tuvo un efecto sobre la inducción o la
55 progresión de la enfermedad. El porcentaje máximo de incidencia de la enfermedad en el grupo de ratones tratado con RI α-MSH (20 %) también se redujo en comparación con el grupo de ratones tratado con PBS (80 %) o con α-MSH nativa (75%).
Ejemplo 11
Variación de la dosis de RI α-MSH en la EAE
El efecto terapéutico de RI α-MSH fue evidente a la dosis de 100 µg/ratón. El tratamiento con los péptidos α-MSH o RI α-MSH de 100 µg/ratón y de 30 µg/ratón se analizó en el modelo de EAE con MOG de ratón. El tratamiento i.p. 65 diario comenzó el día 10 tras la inmunización con MOG. El tratamiento diario con dexametasona (2 mg/kg) se añadió como terapéutico control. Los ratones tratados con 100 µg de RI α-MSH mostraron repetidamente una reducción de
la puntuación media de la enfermedad clínica en comparación con el PBS control (Fig. 9). No obstante, la dosis de 30 µg/ratón de RI α-MSH no tuco un efecto significativo sobre la reducción de las puntuaciones clínicas medias. El tratamiento con dexametasona también mostró una reducción de las puntuaciones de la enfermedad durante la evolución de la enfermedad. Aunque los ratones tratados con α-MSH nativa tenían una puntuación clínica media
5 menor que el PBS, los ratones tratados con α-MSH no mostraron una eficacia similar a la de los ratones tratados con RI α-MSH o dexametasona. El porcentaje de la incidencia de la enfermedad en el grupo tratado con RI α-MSH alcanzó un máximo de 35% y el 40% de dexametasona en comparación con los ratones tratados con PBS, que mostraron una incidencia máxima del 75% de a enfermedad (Fig. 9). Estos datos indican que el tratamiento con el análogo peptídico RI α-MSH en la EAE disminuye significativamente las puntuaciones clínicas medias de la enfermedad y la incidencia de la enfermedad.
Ejemplo 12
Histología del SNC
15 Se recolectaron las médulas espinales el día 24 tras la inducción de la enfermedad en ratones tratados con PBS y RI α-MSH. La tinción con hematoxilina y eosina de secciones de médula espinal se usó para evaluar el grado de inflamación y el número de lesiones. La patología de la EAE muestra áreas de infiltración focal con células inflamatorias y desmielinización. La evaluación histopatológica de la médula espinal demostró eficacia del tratamiento con RI α-MSH en el modelo de EAE MOG. Se muestran secciones de ratones representativos de la puntuación clínica media para cada grupo de tratamiento en las Figs 10a-10d. Los datos muestran extensos infiltrados inflamatorios en el grupo de ratones tratados con PBS en comparación con los ratones tratados con RI α-MSH con ausencia de área focal de inflamación.
25 Ejemplo 13
Medición de TNF-α e IL-10 en el bazo durante la progresión de la enfermedad
Se examinó el mecanismo de acción de los efectos del tratamiento con RI α-MSH en la EAE. Se ha notificado que la α-MSH nativa tiene un efecto sobre los monocitos/macrófagos disminuyendo los niveles de TNF-α y aumentando los de IL-10. Los niveles de ARNm de TNF-α e IL-10 en el bazo de ratones sensibilizados con MOG tratados con RI α-MSH o α-MSH nativa se evaluaron mediante PCR cuantitativa. Los ratones se inmunizaron con MOG p35 -55 y el tratamiento diario con RI α-MSH o α-MSH nativa comenzó el día 10. Se recolectaron muestras de bazo de ratones los días 1, 4 y 7 después del inicio del tratamiento diario. Los datos muestran que el tratamiento con RI α-MSH and
35 α-MSH disminuyó significativamente (p≤ 0,001) el TNF-α en comparación con el PBS control tras 7 días de tratamiento diario (Fig. 11e). No obstante no se produjo ningún cambio significativo en el nivel de TNF-α a puntos de tiempo previos (Día 1 y día 4; Figs. 11a y 11c). Los niveles de ARNm de IL-10 también se redujeron el día 7 en los grupos de tratamiento tanto con RI α-MSH como con αMSH en comparación con el PBS control (Fig. 11f). No obstante, no se detectaron diferencias en los niveles de ARNm de IL-10 a los puntos de tiempo anteriores (Figs. 11b y 11d). Aunque el tratamiento con la α-MSH nativa no redujo las puntuaciones clínicas medias de enfermedad o el porcentaje de la incidencia de la enfermedad. En este estudio, el tratamiento con α-MSH redujo los niveles de ARNm tanto de TNF-α como de IL-10 en el bazo en comparación con el PBS control el día 17 de la progresión de la enfermedad. El análogo RI α-MSH puede reducir los niveles de ARNm en el bazo después del tratamiento diario.
45 Ejemplo 14
Efecto de RI α-MSH sobre la respuesta de recuerdo al péptido MOG
Se evaluaron los efectos del tratamiento de los ratones con α-MSH o RI α-MSH in vivo sobre las respuestas de recuerdo al péptido MOG 35 – 55. Los ratones se sensibilizaron con el péptido MOG35 -55 y los días 2-8 se trató a los ratones con PBS, 100 µg de α-MSH o 100 µg de RI α-MSH. El día 9, se recolectaron los bazos y los ganglios linfáticos drenantes y se analizaron las respuestas de recuerdo al péptido MOG35 -55 in vitro mediante la incorporación de [3H] timidina. Los datos muestran una disminución significativa de las respuestas proliferativas de las células del bazo al péptido MOG35 -55 en el grupo de ratones tratado con α-MSH en comparación con el grupo
55 tratado con PBS (Fig. 12a). El grupo tratado con RI α-MSH mostró una ligera reducción de las respuestas de recuerdo al péptido MOG35 – 55. No obstante, las respuestas de recuerdo al péptido MOG en la población de células de los ganglios linfáticos no mostró una disminución significativa en la capacidad de respuesta entre los grupos tratados con PBS, α-MSH, y RI α-MSH (Fig. 12b).
El sobrenadante celular se recogió de las células del bazo estimuladas con el péptido MOG35 -55 in vitro de cada uno de los grupos de tratamiento in vivo (sin tratar, PBS, α-MSH, RI α-MSH). Los niveles de citocinas se evaluaron mediante una matriz de esferas citométricas con citometría de flujo. Los datos muestran una disminución de los niveles de TNF-α, IFNγ, IL-6 y MCP-1 en los grupos tratados con α-MSH y RI α-MSH en comparación con el grupo tratado con PBS (Figs 12c y 12d). Los niveles de citocinas del sobrenadante de las células de bazo en los grupos
65 tratados con α-MSH y RI α-MSH fueron similares a los niveles de citocinas de las células de bazo de ratones sin sensibilizar.
Por tanto, el tratamiento con el péptido RI α-MSH tuvo un efecto sobre las respuestas de recuerdo de las citocinas al péptido MOG pero no afectó a las respuestas de proliferación de linfocitos T.
Ejemplo 15 5 Efectos del tratamiento de ratones con α-MSH o RI α-MSH durante la fase de sensibilización de la EAE
Los ratones se inmunizaron con el péptido MOG 35-55 y los días 2-8 se les trató a diario con el PBS vehículo control, α-MSH o RI α-MSH. Se extrajeron los bazos de los ratones individuales el día 9 y la expresión de ARNm de citocinas se cuantificó usando PCR en tiempo real. La figura 13 muestra los niveles de expresión de ARNm de TNFα e IL-10 n bazos de ratones tratados con PBS, α-MSH o RI α-MSH en la fase de sensibilización a la enfermedad. Los ratones no expuestos previamente no inmunizados con el péptido MOG se utilizaron para cuantificar los niveles de ARNm basales de TNF-α e IL-10.El tratamiento con α-MSH o RI α-MSH disminuyó los niveles de ARNm de TNFα e IL-10 en comparación con el vehículo control PBS.
15 También se obtuvieron muestras de suero sanguíneo el día 9 del estudio y se evaluaron los niveles de las citocinas: TNF-α, MCP-1, IL-12, IL-10 e IL-6 (figuras 13c y 13d).Los datos muestran una disminución de MCP-1 e IL-6 tanto en la grupos tratados con α-MSH como con RI α-MSH en comparación con el grupo control PBS. MCP-1 se redujo significativamente (p <0,01) en el grupo tratado con RI α-MSH en comparación con el control PBS .Además, el grupo TRATADO CON RI α-MSH exhibió una disminución de TNF-α e IL-12 en comparación con el grupo tratado con PBS. No hubo diferencias en los niveles séricos de IL-10 entre los tres grupos tratados.
Ejemplo 16
25 RI α-MSH no tiene un efecto sobre los marcadores de macrófagos
Se analizaron los macrófagos CD11b+y F4 / 80+esplénicos para determinar los niveles de expresión en superficie de CD86, CD40, y CD14 por citometría de flujo después de 7 días de dosificación diaria con α-MSH o RI α-MSH en ratones inmunizados con MOG 35-55 .Los datos no muestran diferencias en los niveles de expresión de CD86, CD40 o CD14 en la población celular de macrófagos CD11b+o F4 / 80+ en ratones tratados con α-MSH o RI α-MSH (Fig.14). Los resultados mostraron un resultado similar cuando se examinaron los monocitos de sangre para CD86, CD40, y los niveles de expresión de CD14 (datos no mostrados).
Ejemplo 17
35 Efectos en el modelo de inflamación con LPS en ratón
Se ha informado que la α-MSH nativa inhibe la inflamación mediante la regulación por disminución de la producción de TNF-α través de la estimulación de los receptores de melanocortina (MCR), en particular el receptor de melanocortina 1. El LPS estimula los mediadores inflamatorios tales como TNF-α, MCP-1, IL-6 e IFN  y se ha utilizado como un modelo de inflamación aguda. Se examinó su el análogo de α-MSH puede suprimir las citocinas inflamatorias en un modelo de inflamación en ratón inducida por LPS. Se determinaron los niveles de expresión de MC1R en el bazo y los macrófagos peritoneales tras la administración de LPS. En los ratones CD11b+o F4 / 80+ se inyectó LPS i.p. y en varios puntos de tiempo tras la inyección de LPS se extrajeron los bazos y los macrófagos
45 peritoneales para su análisis. Los datos no muestran diferencias discernibles en los niveles de expresión de ARNm de MC1R entre cualquiera de los puntos de tiempo en los macrófagos peritoneales (Fig. 15a). Sin embargo, la administración de LPS sí aumentó los niveles de ARNm de MC1R por encima de los ratone no sensibilizados que no recibieron LPS. En el bazo, los niveles de ARNm de MC1R se elevaron 30 minutos después de la inyección de LPS y luego disminuyeron una hora después de la inyección (Fig. 15b). El LPS aumentó de manera similar los niveles de ARNm de MC1R en el bazo por encima de los niveles basales en ratones no sensibilizados previamente.
Los datos que demuestran la expresión de ARNm de MC1R en el bazo y macrófagos peritoneales indicaron que 30 minutos después de la estimulación con LPS podría ser el punto de tiempo óptimo para el tratamiento con α-MSH o con análogo de RI α-MSH. En ratones .C57BL/6 se inyectó LP i.p. y 30 minutos más tarde se administró α-MSH 55 nativa o el análogo RI de α-MSH 891 a dosis comprendidas entre 5 mg / kg y 0,156 mg / kg. El análogo de RI α-MSH 891 es un análogo de RI α-MSH al que se añadieron D-Cha y D-aminoácidos hsiiss a la secuencia de péptido nuclear. El análogo de RI α-MSH 891 ha demostrado tener una mayor afinidad de unión por el MC1R de ratón y una mayor potencia para estimular el AMPc (datos no mostrados). Los resultados mostraron una reducción significativa de los niveles de TNF-α y de IL-10 en los grupos tratados con α-MSH nativa en comparación con el vehículo control PBS (Figs. 16a y 16c). MCP-1 no se vio afectada por el tratamiento con α-MSH nativa (Fig. 16b). El tratamiento de ratones expuestos LPS con el análogo de RI α-MSH 891 mostró resultados similares con una disminución significativa de los niveles de TNF-α e IL-10 sin afectación a los niveles de MCP-1 en comparación con el vehículo control (Figs. 16d-16f) .Las dosis más bajas tanto de α-MSH nativa como del análogo de RI α-MSH 891 mostraron la mayor supresión de las citocinas inflamatorias. El control positivo con dexametasona mostró consistentemente
65 supresión de los niveles de TNF-α y MCP-1.
Ejemplo 18
Estabilidad de los péptidos en plasma
5 La semivida en suero de la α-MSH nativa se ha estimado que es de aproximadamente 10 minutos. A pesar de esta semivida limitada, el péptido todavía es capaz de provocar potentes actividades antiinflamatorias. Sin embargo, se necesitan análogos de α-MSH más estables para aumentar la potencia de las actividades antiinflamatorias y un mayor desarrollo como agente terapéutico. Un análogo de D-aminoácido de α-MSH nativa(referido α-MSH retroinversa o RI α-MSH) se sintetizó y es más estable que la α-MSH nativa. La forma D-aminoácido de los péptidos
10 es más resistente a la proteólisis y se metaboliza a un ritmo más lento que la forma de L-aminoácido de los péptidos.
La estabilidad de RI-α-MSH se determinó mediante incubación en plasma o PBS in vitro a 37 ° C durante 24 horas. Se tomaron alícuotas y las proteínas se precipitaron con 2 volúmenes de acetonitrilo. Se usó α-MSH como control y bradicinina como patrón interno. Después de la centrifugación, las muestras se congelaron a -80 ° C hasta el análisis
15 CL/ EM / EM (MRM) usando una columna C18 de separación y en modo de ionización por electropulveriación positiva. Como se muestra en la figura. 17a, MSH mostró una semivida de aproximadamente 3 horas en el plasma, pero era estable en PBS. Sin embargo, RI-α-MSH fue estable tanto en PBS como en plasma, sin mostrar degradación detectable en 24 horas.
20 Los perfiles farmacocinéticos (PK) de α-MSH y RI-α-MSH sugieren que RI-α-MSH tiene una semivida en suero más larga que la α-MSH nativa(Fig. 17b). Los ratones tratados con una dosis única de 100 mg de RI-α-MSH o α-MSH tenían niveles mensurables en suero de RI-α-MSH después de 24 horas, pero no hubo niveles detectables de α-MSH 120 minutos después del tratamiento (n = 5).
25 Ejemplo 19
Efectos de unión de los péptidos retroinversos
Un tetrapéptido MSH nuclear que contiene un D-Phe (HfRW) es suficiente para producir una unión significativa a
30 MC1R (20-50 nM Ki). Sin embargo, se observa muy poca unión con la versión retro-inversa del mismo tetrapéptido (wrFh, 883, Ki> 30um, Tabla 1), que muestra que el péptido retroinverso no entra completamente en contacto con el receptor del mismo modo que HfRW. La adición de grupos acilo grasos a el extremo N de HfRW mejora selectivamente su unión a MC1R, produciendo una afinidad comparable a la MSH. Esto se observa para el péptido de estearilo-HfRW en MC1R (1,3 nM, péptido 820). La adición de un grupo estearilo diaminohexano a wrFh
35 retroinverso (péptido 882) mejora la unión a MC1R (120 nM,> 250 veces) y en un grado comparable de adición de ácido esteárico con el extremo N-terminal de HfRW (80 veces) , pero no alcanza la afinidad que se ha observado para RI-MSH (4,1 nM), indicando de nuevo que otros residuos en RI-MSH desempeñan un papel más importante en la unión de RI-MSH a MC1R que con MSH.
40 Ejemplo 20
Efectos de estereoquímica sobre la unión de los péptidos retroinversos
La estereoquímica de los residuos en el tetrapéptido nuclear retroinverso tiene un efecto significativamente diferente
45 en la unión a MC1R que en la forma L de MSH. Como se muestra en la Figura 19, la inversión de los residuos del tetrapéptidos nuclear en RI-MSH a la forma L (péptidos 884, 893-895) reducen todos la afinidad del péptido para MC1R. Sorprendentemente e inesperadamente, la inversión de D-Phe-Phe a L en la secuencia RI causó una reducción de 20 veces la unión, mientras que se ha informado que el cambio correspondiente en HFRW (L-Phe a D-Phe) para mejorar la unión tanto como 400 veces. Para los otros residuos, se encontró que la inversión
50 estereoquímica tenía un efecto menor sobre RI-MSH que sobre el péptido HfRW nuclear, lo que de nuevo indica que la importancia relativa de cada residuo en el tetrapéptido nuclear es menor en RI-MSH que en el tetrapéptido HfRW.
Ejemplo 21
55 Efectos de la protección terminal de la MSH retroinversa
Otra posible ruta para lograr una mayor afinidad por MC1R se basa en la observación de que la protección terminal del péptido HfRW con ácido fenilbutírico aumenta de forma selectivamente y fuerte la afinidad de HfRW por MC1R (Ki = 18:00).S in embargo, no se observó aumento en la afinidad de RI-MSH truncada que lleva un fenilpropilamida
60 en C-terminal (péptido 847), observándose una Ki de 150 nM tanto para el péptido truncado en el residuo de histidina (péptido 847int) y su aducto aminopropil-fenilo (péptido 847, Tabla 1), lo que demuestra que con RI-MSH, la unión se altera de una manera que no permite la interacción simultánea de la secuencia de tetrapéptido y el sitio de interacción aromático postulado cerca del elemento de unión a histidina en MC1R.
Ejemplo 22
Síntesis de un conjugado de toxina de MSH retroinversa
5 Una versión modificada del péptido 891 (Tabla 1) en el que una cisteína se añade al extremo N se genera mediante química Fmoc. Un conjugado de monometil auristatina E (MMAE) que contiene un enlazador valina-citrulina sensible a la proteasa con un resto maleimido-caproil para el acoplamiento a los tioles se sintetiza de acuerdo con Doronina et al. (2003) Mature Biotechnol.21: 778-784, incorporada el presente documento por referencia. El péptido y el conjugado MMAE se incuban en una solución de fosfato Na 25 mM Na, EDTA 2 mM, pH 7 durante 14 h a 25 ° C y el
10 producto se purificó mediante HPLC de fase inversa C18 (RP-HPLC).
Ejemplo 23
Efecto de LOS análogos de RI α-MSH sobre los niveles de AMPc en líneas celulares de melanoma murino
15 Tanto la α-MSH nativa como RI α-MSH aumentan los niveles de AMPc en células de melanoma murino. Se generaron análogos peptídicos de RI α-MSH para determinar si las modificaciones en la secuencia central del péptido RI α-MSH elevarían los niveles de AMPc en comparación con el péptido RI α-MSH. Se realizó un experimento de respuesta a la dosis para los análogos de RI α-MSH generados en el ensayo de AMPc utilizando
20 células de melanoma B16-F1 murinas.
Cultivos de células in vitro: células de melanoma murino B16-F1 se cultivaron en placas de 96 pocillos 5 x 104células / pocillo durante la noche en medio con L-glutamina y penicilina / estreptomicina y FBS. Se eliminó el medio y se añadió un medio nuevo con IBMX a las células durante 1 hora. Las células se trataron con los análogos
25 peptídicos de RI α-MSH, o RI α-MSH (890, 891, 892, 893, 894 o 895) Las células se lisaron después de 30 minutos usando un kit de ensayo de AMPc y el sobrenadante se utilizaron en el ensayo. La forscolina 10 mM sirvió como control positivo.
Niveles de AMPc: Se midieron los niveles intracelulares de AMPc usando un kit de ensato de cometición con AMPc 30 (Amersham Biosciences). Rodas las muestras con lisados celulares se diluyeron a 1100 para su análisis.
Péptidos:
869 vpkGwr(d-Cha)hemsys
872 vpkGwrfremsys
880 vpkGwrFhsiiss
878 vpkGwrfhe(d-butionina)sys
886 RI-MS05 vpkgwrfhsiiss
890 vpkGwr(d-Cha)he(d-Butionina)sys
891 vpkGwr(d-Cha)hsiiss
892 SYSMEH(Cha)RWGKPV
893 vpkGWrfhemsys
894 vpkGwRfhemsys
895 vpkGwrfHemsys
35 Resultados: Las células B16-F1 de melanoma murino se trataron con análogos RI α-MSH o RI α-MSH (869, 872, 880, 878, 886 and 890 – 895) a un intervalo de concentración de 10 -4-10 -11 M. Los niveles de AMPc de las células tratadas con los análogos RI α-MSH, o RI α-MSH La mayoría de los análogos de RI α-MSH mostraron mejores valores de CE50 en comparación con RI α-MSH con la excepción del análogo 894. Los análogos 891, 892 and 886 mostraron la mejora más alta de los valores de CE50 en el ensato de AMPc en comparación con el péptido RI α
40 MSH. En resumen, los análogos de RI α-MSH mostraron una respuesta mejorada a la dosis y un valor de EC50 en comparación con el péptido RI α-MSH. Véase en la Fig. 22 los datos gráficos y en la Tabla 2 los datos de CE50.
Tabla 2
CE50, uM
CE50, uM
CE50, uM
α-MSH
0,0004 α-MSH 0,0004 α-MSH 0,0004
RI α-MSH
9,7 RI α-MSH 9,7 RI α-MSH 9,7
ID del análogo:
ID del análogo:
ID del análogo:
890
3,6 878 0,13 869 0,014
891
0,081 880 0,023 872 2,0
892
0,021 886 0,002 878 0,13
893
0,27
894
212
895
0,3

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto sustancialmente puro que se une selectivamente al receptor de melanocortina 1 (MC1R), comprendiendo dicho compuesto:
    5 a) un tetrapéptido nuclear que tiene la secuencia:
    His Xaa1 Arg Trp (SEC ID Nº 1) o D-Trp D-Arg Xaa2 D-His (SEC ID Nº 2),
    donde Xaa1 es D-Cha, D-Phe o Cha, y
    Xaa2 es D-Cha, D-Phe o Phe; y
    b) un polipéptido en C-terminal que tiene la secuencia: D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEC ID Nº 3);
    15 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  2. 2. Un compuesto sustancialmente puro que se une selectivamente al receptor de melanocortina 1 (MC1R), comprendiendo dicho compuesto un polipéptido que tiene la secuencia:
    Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13,
    donde Xaa1 es D-Val, D-Ala o D-Lys;
    Xaa2 es D-Pro, D-Ala o D-Lys;
    Xaa3 es D-Lys, D-Orn, D-Nle, D-Ala o D-Lys; 25 Xaa4 es Gly, o D-Ala;
    Xaa es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp, D-Phe, o D-Ala;
    Xaa6 es D-Arg, D-His, o D-Ala;
    Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp, D-4-nitro-Phe, o D-Ala;
    Xaa8 es D-His, His, D-Arg, Phe, o D-Ala;
    Xaa9 es D-Glu, D-Asp, D-citrulina, D-Ser, o D-Ala;
    Xaa10 es D-Met, D-butionina, D-Ile, o D-Ala;
    Xaa11 es D-Ser, D-Ile o D-Ala;
    Xaa12 es D-Tyr, D-Ser, o D-Ala; y
    Xaa13 es D-Ser o D-Ala; 35
    donde no más de un Xaa1 -13 es D-Ala a excepción de cuando Xaa1 -3 son todos D-Ala, y no más de un Xaa1 -13 es
    L-aminoácido;
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  3. 3. El compuesto de la reivindicación 2, comprendiendo dicho compuesto un polipéptido que tiene la secuencia:
    Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaas Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13,
    donde Xaa1 es D-Val; 45 Xaa2 es D-Pro;
    Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle;
    Xaa4 es Gly;
    Xaa5 es D-Trp, Trp, D-3-benzotienil-Ala, D-5-hidroxi-Trp, D-5-metoxi-Trp, or D-Phe;
    Xaa6 es D-Arg, D-His;
    Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-fluoro-Phg, D-3-piridil-Ala, D-Thi, D-Trp o D-4-nitro-Phe;
    Xaa8 es D-His, His, D-Arg, Phe, o D-Ala;
    Xaa9 es D-Glu, D-Asp, D-citrulina o D-Ser;
    Xaa10 es D-Met, D-butionina, D-Ile;
    Xaa11 es D-Ser o D-Ile; 55 Xaa12 es D-Tyr o D-Ser; y
    Xaa13 es D-Ser;
    donde no más de un Xaa1 -13 es un aminiácido L;
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  4. 4. El compuesto de la reivindicación 2, comprendiendo dicho compuesto un polipéptido que tiene la secuencia:
    Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13,
    65 donde Xaa1 es D-Val; Xaa2 es D-Pro;
    Xaa3 es D-Lys, D-Orn o D-Nle; Xaa4 es Gly; Xaa5 es D-Trp o Trp; Xaa6 es D-Arg;
    5 Xaa7 es D-Cha, D-Phe, Phe o D-Thi; Xaa8 es D-His o His; Xaa9 es D-Glu o D-Ser; Xaa10 es D-Met, D-butionina, D-Ile; Xaa11 es D-Ser o D-Ile;
    10 Xaa12 es D-Tyr o D-Ser; y Xaa13 es D-Ser;
    donde no más de un Xaa1 -13 es un aminiácido L;
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 15
  5. 5. Un compuesto sustancialmente puro que comprende un polipéptido que tiene la secuencia:
    D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg Phe D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEC ID Nº 4); D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEC ID Nº 5);
    20 Ser Tyr Ser Met Glu His Cha Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEC ID Nº 6); o D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser (SEC ID Nº 7) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  6. 6. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho polipéptido está PEGilado. 25
  7. 7.
    El compuesto de la reivindicación 5, donde dicho compuesto se une selectivamente al MC1R.
  8. 8.
    El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho compuesto exhibe al menos una de las propiedades siguientes:
    30 capacidad para activar selectivamente el CM1R; estabilidad en plasma in vitro; o resistencia a la degradación con proteasa.
    35 9. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para usar como medicamento.
  9. 10. Los compuestos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho compuesto está conjugado con un resto biológicamente activo.
    40 11. Una composición farmacéutica, que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  10. 12. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 o el compuesto de la reivindicación 9, para
    usar en el tratamiento de una afección seleccionada del grupo: inflamación, enfermedad autoinmunitaria, melanoma, 45 reducción del rechazo de transplantes o inhibición del rechazo de transplantes.
  11. 13. La composición farmacéutica o el compuesto de la reivindicación 12, donde dicha enfermedad o afección autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en, o se asocia con, uno de los siguientes esclerosis múltiple, diabetes de tipo I, anemia aplásica, enfermedad de Graves, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, lupus,
    50 artritis, uveítis autoinmunitaria, miastenia gravis, enfermedad intestinal inflamatoria, artritis reumatoide, alergia, aterosclerosis, psoriasis, gastritis y enfermedad cardíaca isquémica.
  12. 14. Una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad
    terapéuticamente eficaz de un conjugado que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las 55 reivindicaciones 1 a 5 conjugados con una carga antitumoral para usar en el tratamiento del melanoma.
  13. 15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, donde dicha carga antitumoral es un radionúclido, un radiosensibilizador, un fotosensibilizador, un agente quimioterapéutico o una toxina.
ES09763002.4T 2008-05-27 2009-03-20 Análogos peptídicos de la hormona estimulante de alfa-melanocitos Active ES2492670T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56373 1993-04-30
US5637308P 2008-05-27 2008-05-27
PCT/US2009/037809 WO2009151708A2 (en) 2008-05-27 2009-03-20 Peptide analogs of alpha-melanocyte stimulating hormone

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2492670T3 true ES2492670T3 (es) 2014-09-10

Family

ID=41278142

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14178968T Active ES2715329T3 (es) 2008-05-27 2009-03-20 Análogos peptídicos de hormonas estimulantes de alfa melanocitos
ES09763002.4T Active ES2492670T3 (es) 2008-05-27 2009-03-20 Análogos peptídicos de la hormona estimulante de alfa-melanocitos

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14178968T Active ES2715329T3 (es) 2008-05-27 2009-03-20 Análogos peptídicos de hormonas estimulantes de alfa melanocitos

Country Status (16)

Country Link
US (4) US8440793B2 (es)
EP (2) EP2816055B1 (es)
JP (4) JP5624027B2 (es)
KR (4) KR101666631B1 (es)
CN (2) CN107098957A (es)
AU (1) AU2009258054B2 (es)
BR (1) BRPI0912141A2 (es)
CA (2) CA2726076C (es)
DK (2) DK2297178T3 (es)
ES (2) ES2715329T3 (es)
IL (3) IL209369A (es)
MX (3) MX2010012990A (es)
PT (2) PT2297178E (es)
RU (1) RU2496786C2 (es)
TR (1) TR201903610T4 (es)
WO (1) WO2009151708A2 (es)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2297178T3 (da) 2008-05-27 2014-09-01 Genzyme Corp Peptidanaloger af alpha-melanocytstimulerende hormon
CN101914138A (zh) * 2010-07-13 2010-12-15 华东师范大学 一种用偶联剂制得的肝癌靶向肽-阿霉素及合成方法
CN102008732B (zh) * 2010-11-08 2012-10-24 武汉华耀生物医药有限公司 一种叶酸偶联抗体药物及其制备方法与应用
WO2012158960A2 (en) 2011-05-17 2012-11-22 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Inc. Melanocortin 1 receptor ligands and methods of use
EP2925340B8 (en) 2012-11-21 2019-07-24 University Of Cincinnati Pharmaceutical compositions comprising selective agonists of melanocortin 1 receptor and their use in therapeutic methods
WO2015067503A1 (en) * 2013-11-07 2015-05-14 Clinuvel Ag Alpha-msh analogues for use in the treatment of psoriasis
EP3212220A1 (en) * 2014-10-28 2017-09-06 Clinuvel AG Inflammatory disease
AU2016298175B2 (en) 2015-07-28 2022-01-06 University Of Iowa Research Foundation Compositions and methods of treating cancer
SG10201506686WA (en) * 2015-08-24 2017-03-30 Agency Science Tech & Res Conjugates
CN106905432B (zh) * 2015-12-18 2018-12-21 兰州大学 一种α促黑素细胞激素的融合蛋白及其制备方法和应用
EP3448872A4 (en) * 2016-04-27 2019-12-11 The Regents of the University of California PREPARATION OF FUNCTIONAL HOMOCYSTEINRESTES IN POLYPEPTIDES AND PEPTIDES
US20220072092A1 (en) * 2016-06-24 2022-03-10 University Of Iowa Research Foundation Compositions and methods of treating melanoma
US11179484B2 (en) 2016-06-24 2021-11-23 University Of Iowa Research Foundation Compositions and methods of treating melanoma
US11591367B2 (en) 2016-10-04 2023-02-28 Dsm Ip Assets B.V. Melanocortin-1-receptor agonists
KR101957014B1 (ko) * 2017-04-18 2019-06-20 순천대학교 산학협력단 항염증 활성을 나타내는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물
WO2021056106A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Dds Research Inc. Lipid vesicle compositions with penetration enhancing agents
US20230058316A1 (en) * 2020-02-07 2023-02-23 Ewha University - Industry Collaboration Foundation Pegylated ige-dependent histamine-releasing factor (hrf)-binding peptide and use thereof
US11529335B2 (en) 2020-07-31 2022-12-20 University Of Iowa Research Foundation Compositions and methods for treating cancer
RU2766340C1 (ru) * 2021-02-10 2022-03-15 Игорь Закванович Зайцев Пептидный толерогенный компаунд
JP2024511214A (ja) * 2021-03-24 2024-03-12 ジーエルオー ファーマ，インク． 皮膚色素沈着を軽減するためのペプチドおよび方法
WO2023091689A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 University Of Iowa Research Foundation Combined use of mcr1-directed radiotherapy and immune checkpoint inhibition in the treatment of melanoma

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4894443A (en) 1984-02-08 1990-01-16 Cetus Corporation Toxin conjugates
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4952394A (en) 1987-11-23 1990-08-28 Bristol-Myers Company Drug-monoclonal antibody conjugates
US5194425A (en) 1988-06-23 1993-03-16 Anergen, Inc. Mhc-mediated toxic conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US5137877B1 (en) 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
US5618528A (en) 1994-02-28 1997-04-08 Sterling Winthrop Inc. Biologically compatible linear block copolymers of polyalkylene oxide and peptide units
US5612474A (en) 1994-06-30 1997-03-18 Eli Lilly And Company Acid labile immunoconjugate intermediates
WO1996006641A1 (en) 1994-08-29 1996-03-07 Prizm Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of vascular endothelial growth factor with targeted agents
US5716928A (en) 1995-06-07 1998-02-10 Avmax, Inc. Use of essential oils to increase bioavailability of oral pharmaceutical compounds
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
WO1998002192A1 (en) * 1996-07-12 1998-01-22 Immunomedics, Inc. Radiometal-binding peptide analogues
WO1999021571A1 (en) 1997-10-27 1999-05-06 Trega Biosciences, Inc. Melanocortin receptor ligands and methods of using same
US7157418B1 (en) 1998-07-22 2007-01-02 Osprey Pharmaceuticals, Ltd. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
US20020193332A1 (en) * 2001-02-12 2002-12-19 Hedley Mary Lynne Methods of treating bladder disorders
US6969702B2 (en) * 2002-11-20 2005-11-29 Neuronova Ab Compounds and methods for increasing neurogenesis
WO2005120588A2 (en) * 2004-05-26 2005-12-22 The Curators Of The University Of Missouri Peptides delivered to cell nuclei
EP3925614A3 (en) 2005-07-08 2022-03-23 Ipsen Pharma Melanocortin receptor ligands
US20100009340A1 (en) * 2006-04-05 2010-01-14 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for the analysis and treatment of aids wasting syndrome and immune cell dysfunction
FR2914646A1 (fr) 2007-04-04 2008-10-10 Neorphys Soc Par Actions Simpl Analogues peptidiques des recepteurs des melanocortines
US8069129B2 (en) * 2007-04-10 2011-11-29 Ab Initio Technology Llc Editing and compiling business rules
CN101302245B (zh) 2007-05-09 2011-11-16 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 黑色素皮质激素受体四肽类激动剂及其制备方法和用途
DK2297178T3 (da) 2008-05-27 2014-09-01 Genzyme Corp Peptidanaloger af alpha-melanocytstimulerende hormon

Also Published As

Publication number Publication date
JP2011521949A (ja) 2011-07-28
MX2010012990A (es) 2011-05-25
JP2017061573A (ja) 2017-03-30
US20170313756A1 (en) 2017-11-02
US20160046688A1 (en) 2016-02-18
CA2726076A1 (en) 2009-12-17
US20130303452A1 (en) 2013-11-14
MX356295B (es) 2018-05-22
EP2816055B1 (en) 2018-12-19
IL209369A0 (en) 2011-01-31
JP2014210805A (ja) 2014-11-13
KR20180118250A (ko) 2018-10-30
IL245906A0 (en) 2016-07-31
BRPI0912141A2 (pt) 2016-07-26
KR101666631B1 (ko) 2016-10-17
WO2009151708A2 (en) 2009-12-17
AU2009258054A1 (en) 2009-12-17
US9115174B2 (en) 2015-08-25
JP5624027B2 (ja) 2014-11-12
JP6170019B2 (ja) 2017-07-26
ES2715329T3 (es) 2019-06-03
RU2496786C2 (ru) 2013-10-27
DK2297178T3 (da) 2014-09-01
KR20170102050A (ko) 2017-09-06
CA2998948A1 (en) 2009-12-17
US20090297444A1 (en) 2009-12-03
IL252058A0 (en) 2017-07-31
CN102143970A (zh) 2011-08-03
KR20160092046A (ko) 2016-08-03
JP2019065053A (ja) 2019-04-25
JP6585099B2 (ja) 2019-10-02
EP2816055A1 (en) 2014-12-24
DK2816055T3 (en) 2019-04-01
CN102143970B (zh) 2017-02-08
US8440793B2 (en) 2013-05-14
AU2009258054B2 (en) 2014-03-20
TR201903610T4 (tr) 2019-03-21
PT2816055T (pt) 2019-03-18
US10385108B2 (en) 2019-08-20
CA2726076C (en) 2018-04-10
KR20110050593A (ko) 2011-05-16
MX2018006299A (es) 2021-11-11
EP2297178B1 (en) 2014-07-30
KR101810110B1 (ko) 2017-12-18
IL209369A (en) 2017-05-29
RU2010153217A (ru) 2012-07-10
US9738698B2 (en) 2017-08-22
EP2297178A2 (en) 2011-03-23
CN107098957A (zh) 2017-08-29
PT2297178E (pt) 2014-08-26
WO2009151708A3 (en) 2010-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2492670T3 (es) Análogos peptídicos de la hormona estimulante de alfa-melanocitos
US6703381B1 (en) Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
TW487711B (en) Conjugates of lipophilic moieties and peptides
ES2544573T3 (es) Inhibidores diméricos de afinidad elevada de PSD-95 y su uso para el tratamiento del daño cerebral isquémico y del dolor
JP4933440B2 (ja) 経皮デリバリーのための薬剤組成物
HK1160656A (zh) α-促黑素細胞激素的肽類似物
HK1160656B (en) Peptide analogs of alpha-melanocyte stimulating hormone