DE60125809T2

DE60125809T2 - Diastereomere peptide und diese umfassende arzneimittel

Info

Publication number: DE60125809T2
Application number: DE60125809T
Authority: DE
Inventors: Yechiel Shai; Ziv Oren; Michal Shahar; Nurit Eyal
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2000-11-16
Filing date: 2001-11-07
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2021-11-08
Also published as: AU2002223983A1; WO2002040529A2; IL139720A0; EP1334124B1; ATE350395T1; IL155910A; DE60125809D1; US20040053847A1; WO2002040529A3; EP1334124A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft diastereomere Peptide und diese umfassende Arzneimittel.
Antimikrobielle Resistenz gegenüber herkömmlichen Antibiotika ist weltweit aufgrund deren extensiver Verwendung zu einem Hauptproblem geworden. Tatsächlich existieren bereits Bakterienstämme, die gegenüber allen erhältlichen Antibiotika resistent sind.
Die Entwicklung neuer Familien von Antibiotika, die das Resistenzproblem bewältigen können, ist zu einer sehr wichtigen Aufgabe geworden. Eine derartige Hauptfamilie besteht aus den antimikrobiellen Peptiden. Antimikrobielle Peptide sind natürliche Antibiotika, die einen Großteil der angeborenen Immunität einer Vielzahl von Organismen ausmachen. Während der letzten zwei Jahrzehnte haben zahlreiche Studien die entscheidende Rolle antimikrobieller Peptide als unterste Abwehrebene gegen einfallende Erreger und deren ungesteuerte Proliferation gezeigt.
Eine wichtige Eigenschaft der meisten antimikrobiellen Peptide ist deren Fähigkeit selektiv Bakterien aber nicht normale eukaryotische Zellen abzutöten. Viele Studien zeigen, dass eine spezifische Sekundärstruktur erforderlich ist und dass das gemeinsame, in den meisten von diesen gefundene Merkmal, ein amphipathischer Charakter und eine positive Gesamtladung ist. Die meisten Studien wurden mit linearen amphipathischen α-helikalen zytolytischen Peptiden (≤ 40 Aminosäuren) von einem Wirt-Abwehr-System (Boman, 1995) durchgeführt. Diese Polypeptide variieren beträchtlich in der Kettenlänge, Hydrophobie und Gesamtverteilung der Ladungen, aber teilen sich eine gemeinsame Struktur in Verbindung mit Lipid-Doppelschichten und zwar eine amphipathische α-helikale Struktur. Diese Gruppe schließt: (i) lytische Peptide, z.B. die aus der Cecropia-Motte isolierten Cecropine und die aus den Froschhäuten isolierten Magainine und Dermaseptine, die nur gegenüber Mikroorganismen toxisch sind; (ii) lytische Peptide wie das aus S. aureus isolierte δ-Hämolysin, die Säugetierzellen lysieren; und (iii) nicht zellselektive lytische Peptide wie das Bienengift Melittin und das Neurotoxin Pardaxin, die Mikroorganismen und Säugetierzellen lysieren können, ein.
Sowohl Pardaxin als auch Melittin sind mit einer starken antibakteriellen Aktivität auf Gramnegative und Gram-positive Bakterien ausgestattet; jedoch zeigen sie auch eine hohe hämolytische Aktivität gegenüber menschlichen Erythrozyten. Vor kurzem haben wir mehrere D-Aminosäuren in die α-helikalen zytolytischen Peptide Pardaxin (Shai und Oren, 1996; Internationale PCT Offenlegungsschrift Nr. WO 97/31019) und Melittin (Oren und Shai, 1997; WO 97/31019) eingebracht. Obwohl die so erhaltenen diastereomeren Pardaxin- und Melittin-Analoga verringerte zytotoxische Wirkungen auf Säugetierzellen aufwiesen, behielten sie eine hohe antibakterielle Aktivität bei, und liefern so die Grundlage für die Entwicklung von neuen aus D- und L-Aminosäuren bestehenden Peptid-Antibiotika, die gegenüber Mikroorganismen selektiv sind.
Die internationale PCT Offenlegungsschrift WO 98/37090 derselben Anmelder beschreibt Peptide, umfassend sowohl L- als auch D-Aminosäurereste mit einer positiven Gesamtladung von größer als +1, mit einer Sequenz von Aminosäureresten, sodass eine entsprechende Aminosäurensequenz, umfassend nur L-Aminosäurereste in der Natur nicht gefunden wird. Diese nicht-natürlichen, synthetischen Peptide können aus unterschiedlichen Anteilen von mindestens einer hydrophoben Aminosäure wie zum Beispiel Leucin, Isoleucin, Glycin, Alanin, Valin, Phenylalanin, Prolin, Tyrosin und Tryptophan und mindestens einer positiv geladenen Aminosäure wie zum Beispiel Lysin, Arginin und Histidin bestehen, in welcher Sequenz mindestens einer der Aminosäurereste eine D-Aminosäure ist. Mehrere Diastereomere, umfassend 6 bis 30 Aminosäurereste, die eine zytolytische Aktivität auf mikrobielle pathogene Organismen und maligne Zellen ausüben und nicht hämolytisch sind, werden in WO 98/37090 offenbart, aber die biologische Aktivität wurde nur für einige 6-mer, 8-mer und 12-mer Peptide getestet. Einige kurze Modellpeptide (12-Aminosäuren lang), die nur aus Leucin und Lysin mit unterschiedlichen Anteilen bestehen, in welchen ein Drittel der Sequenz aus D-Aminosäuren besteht, wurden ferner untersucht, und es wurde festgestellt, dass einige von ihnen eine selektive antimikrobielle Aktivität und verringerte hämolytische Aktivität aufweisen (Hong, Oren & Shai, 1999; Oren, Hong & Shai, 1997).
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung nicht-natürliche, synthetische diastereomere Peptide bereitzustellen, die zur topischen Verabreichung gegen mehrere Erreger geeignet sind.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung nicht-natürliche, synthetische diastereomere Peptide bereitzustellen, die zur Behandlung von Krebs geeignet sind.
Es ist nun festgestellt worden, dass gewisse diastereomere Peptide, die nicht in einer der vorstehend zitierten Referenzen offenbart und insbesondere nicht in dem vorstehend erwähnten WO 98/37090 offenbart werden, eine erhöhte Aktivität bei der topischen Verabreichung und zur Behandlung von Krebs in Vergleich zu dem ähnlichsten in WO 98/37090 offenbarten Diastereomer aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft so ein diastereomeres Peptid mit einer positiven Gesamtladung von größer als +1 und mit mindestens 15 Aminosäureresten, wobei die Reste ausgewählt sind aus: (i) Leucin und Lysin; (ii) Leucin, Lysin und Arginin; (iii) den Resten aus (i) oder (ii) und Glycin, Serin, Asparagin, Threonin oder Glutamin am N-Terminus; oder (iv) den Resten aus (i), (ii) oder (iii) und Lysin, Arginin, Glycin oder Serin am C-Terminus; und (v) cyclischen Analoga von (i), (ii), (iii) oder (iv). In einer Ausführungsform besteht das erfindungsmäßige diastereomere Peptid ausschließlich aus Leucin- und Lysinresten. Beispiele für derartige Peptide sind die 15-mer Peptide, die hier als Peptide 2, 3, 4, 7 und 10 bezeichnet werden, der Sequenzen:
In einer weiteren Ausführungsform besteht das erfindungsmäßige diastereomere Peptid aus Leucin-, Lysin- und Argininresten. Beispiele für derartige Peptide sind die 15-mer Peptide, die hier als Peptide 6 und 9 bezeichnet werden, der Sequenzen:
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung derartige diastereomere Peptide, die aus Leucin- und Lysin- oder aus Leucin-, Lysin- und Argininresten bestehen, mit einer zusätzlichen Aminosäure, ausgewählt aus Glycin, Serin, Asparagin, Threonin oder Glutamin am N-Terminus. In einer besonderen Ausführungsform ist diese zusätzliche Aminosäure ein Glycinrest und Beispiele davon sind die 16-mer Peptide der Sequenzen:
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung derartige diastereomere Peptide mit einer Aminosäure, ausgewählt aus Lysin, Arginin, Glycin und Serin am C-Terminus.
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung cyclische Analoga des diastereomeren Peptids. Beispiele für derartige cyclische Peptide schließen die Peptide der Sequenzen ein:
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel, umfassend ein erfindungsmäßiges diastereomeres Peptid und einen pharmazeutisch verträglichen Träger bereit.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Arzneimittel zur topischen Verabreichung, zum Beispiel zur Behandlung von topischen Infektionen, die durch pathogene Organismen verursacht werden, wie bakterielle Infektionen, besonders durch gegen Antibiotika resistente Bakterien verursachte Infektionen und durch pathogene Pilze verursachte Infektionen bereit. Obwohl alle erfindungsmäßigen Peptide zur topischen Verwendung als Antimykotika und Antibakterium betrachtet werden, wird nachstehend gezeigt, dass die Peptide, die hier als Peptide 2-8 bezeichnet werden, gute Kandidaten für diese Zwecke sind. Außerdem wird gezeigt, dass die Peptide 2 und 6 gegen Antibiotika-resistente Bakterien wirksam sind.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Arzneimittel bereit, umfassend ein erfindungsmäßiges diastereomeres Peptid zur Behandlung von Krebs. Es wird erwogen, dass alle erfindungsmäßigen Peptide zur Behandlung von malignen Tumoren, wie hier für die Peptide 2, 8, 9 und 10 gezeigt, nützlich sind. Insbesondere wurde in in vitro und in vivo Experimenten gezeigt, dass die Peptide 9 und 10 gegen Melanom-, Basal- und Plattenepithelzellenkarzinome oder Brust-, Darm-, Lungen- und Prostatatumore wirksam sind.
Die erfindungsmäßigen diastereomeren Peptide sind wirksam gegen Mycoplasmen und können weiterhin verwendet werden, um Mycoplasmeninfektion in Zellkulturen in einem Verfahren, umfassend Behandeln der Zellkultur mit dem diastereomeren Peptid zu steuern/eliminieren.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines erfindungsmäßigen diastereomeren Peptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur topischen Verabreichung oder eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs.
Die Erfindung betrifft noch weiterhin die Verwendung eines erfindungsmäßigen diastereomeren Peptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur topischen Verabreichung zur Behandlung einer Infektion, die durch einen pathogenen Organismus verursacht wird. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsmäßigen diastereomeren Peptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines malignen Tumors.
1 stellt ein Diagramm dar, das die Tumorwachstumskurve in SCID-Mäusen, die menschliche MCF-7 Brustzellen enthalten, nach Verabreichung des erfindungsmäßigen Peptids 9 (Quadrate), Mitomycin (Dreiecke) und PBS (Kontrolle, Kreise) zeigt.
2 stellt ein Diagramm dar, das die Körpergewichtskurve der SCID Mäuse, die menschliche MCF-7 Brustzellen enthalten, nach Verabreichung des erfindungsmäßigen Peptids 9 (Quadrate), Mitomycin (Dreiecke) und PBS (Kontrolle, Kreise) zeigt.
3 stellt ein Diagramm dar, das das Lungengewicht von C57-Black-Mäusen, die mit D-122 Lungenkarzinomzellen infiziert wurden, nach Verabreichung des erfindungsmäßigen Peptids 9 oder PBS (Kontrolle) zeigt.
Die erfindungsmäßigen diastereomeren Peptide sind zytolytische Mittel von sehr geringer Toxizität wie hier in Tiermodellen abgeschätzt wurde. Die Ergebnisse der Haut- und Augenirritationsstudien zeigten eine geringe Toxizität der Peptide bei Konzentrationen beträchtlich höher als jenen, die für deren antibakterielle, Antikrebs- und antifungale Aktivitäten notwendig sind.
Um die zytolytische Aktivität des diastereomeren Peptids zu verbessern, wurde der Einfluss von mehreren wichtigen Parameter wie Länge, amphipathische Gliederung, die Lage und Anzahl der D-Aminosäuren, zusätzliche Aminosäurereste an den N- und C-Termini und Polarität der diastereomeren Peptide auf deren Wirksamkeit, Selektivität und Aktivitätsspektrum untersucht. Zu diesem Zweck synthetisierten und charakterisierten wir strukturell und funktional eine Serie linearer zytolytischer Diastereomere. Die Peptide wurden dann hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität einerseits gegenüber pathogenen Zellen wie Bakterien, Krebszellen und Pilze und andererseits normalen Säugetierzellen wie einer normalen NIH-3T3 Fibroblastenzelllinie charakterisiert.
Die Wirksamkeit und Selektivität der neuen erfindungsmäßigen Diastereomere wird hier in den Antikrebs-, Antifungal- und Antimycoplasmaassays demonstriert. Die Gruppe der hier gezeigten 15- und 16-mer Diastereomere war gegen maligne Zellen, pathogene Pilze und Mycoplasmen signifikant aktiver, als das Stand der Technik 12-mer Diastereomer (siehe Peptid 1 in Beispiel 1). Außerdem waren sie gegen maligne Zellen bei Konzentrationen aktiv, die 3-15-fach niederer sind als die Konzentrationen, bei denen sie gegen normale NIH-3T3 Fibroblastenzellen wirken.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die neuen erfindungsmäßigen diastereomeren Peptide besonders zur topischen Verabreichung nützlich. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „topisch" „einen besonderen Oberflächenbereich betreffend" und das an einen gewissen Bereich der Oberfläche verabreichte topische Mittel wird nur den Bereich beeinflussen, an welchen es verabreicht wird. So werden jede und alle Verabreichungen, in welchen die Peptide lokal und nicht durch die Blutzirkulation wirken, durch die vorliegende Erfindung umfasst.
Die hohe Wirksamkeit, das breite Aktivitätsspektrum und die niedere in vivo Toxizität der erfindungsmäßigen Modelldiastereomere ebnen den Weg zu deren Verwendung in topischen Verabreichungen gegen eine breite Vielfalt von pathogenen Organismen bei topischen Infektionen. Derartige Verabreichungen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf die Behandlung von Akne, Pilzinfektionen der Kopfhaut, mit chirurgischen oder traumatischen Wunden in Verbindung stehenden Pilz- oder bakteriellen Infektionen, chronischen oder schlecht heilenden Hautverletzungen (hauptsächlich in Diabetes), vaginalen Infektionen (Vaginitis), Augen- und Ohrinfektionen und Brandwunden; Infektionen des Mundes und Halses und lokalisierten Infektionen wie chronische Lungeninfektionen bei Mukoviszidose, Emphysemen oder Asthma, die mit einem Aerosol oder einer anderen Formulierung zur nasalen oder pulmonalen Verabreichung behandelt werden können.
Topische Infektionen werden durch opportunistische Kolonisation einer großen Vielzahl von endogenen und exogenen pathogenen Zellen charakterisiert. Außerdem erfordert die Behandlung von schweren Wunden wie Brand- oder schlecht heilenden Wunden, z.B. Fußgeschwür bei Patienten mit Diabetes mellitus, eine langfristige Verabreichung von Antibiotika und führt zu einer Auswahl von resistenten Bakterien wie Streptococcus pyogenes oder dem Methicilin-resistenten Staphylococcus aureus. Diese Probleme könnten durch die erfindungsmäßigen diastereomeren Peptide wegen deren breitem Aktivitätsspektrum und deren Fähigkeit gegen nichtresistente und resistente Bakterien zu wirken, wie im Falle von Peptid 2 gegen Staphylococcus aureus und dem Methicilin-resistenten Staphylococcus aureus demonstriert wird, bewältigen werden. Die beobachtete Resistenz der Diastereomere gegenüber proteolytischer Verdauung kann es ihnen ermöglichen, das Verdauungssystem in intakter Form zu ereichen und dort bakterielle Infektionen wie chronischen Befall der Magenschleimhaut durch Helicobacter pylori und bakterielle Darminfektionen zu eliminieren.
Die Aktivität der diastereomeren Peptide gegen verschiedene Pilzstämme weist auf deren potentielle Verwendung zur Behandlung von Nagelpilz wie: (i) Onychomycose, der gängigsten Nagelinfektion hauptsächlich durch Dermatophyten, insbesondere durch Trichophyton rubrum und weniger häufig durch Trichophyton mentagrophytes und Epidermophyton floccosum verursacht; (ii) durch Schimmel verursachte Infektionen; und (iii) durch Hefen, besonders Candida albicans verursachte Infektionen, wie in chronischer Paronychie und Onycholyse und chronischer mukocutaner Candidose hin.
In einer weiteren erfindungsmäßigen Ausführungsform sind die neuen, erfindungsmäßigen diastereomeren Peptide als Antikrebsmittel nützlich. Die beobachtete hohe Wirksamkeit der diastereomeren Peptide gegenüber einer Vielfalt von malignen Zellen wie in den Beispielen hier gezeigt, weist auf die Existenz eines gemeinsamen Targets für deren Wirkung hin. Dieses Target ist höchstwahrscheinlich die maligne Zellmembran, die wie sich gezeigt hat, höhere Mengen an negativ geladenem Phosphatidylserin als normale Säugetierzellen exprimiert (Utsugi et al., 1991). So kann das diastereomere Peptid auch gegen topische und Hautkrebsarten wie Melanom, gegen sekundäre topische Tumore in Brust-, Lungen-, Prostata- und Darmkrebspatienten, wie auch gegen Basal- und Plattenepithelzellenkarzinome wirken.
Die erfindungsmäßigen Diastereomere können auch zur Nahrungsmittelkonservierung, als Nahrungsergänzungsmittel, in tierärztlichen Zusammensetzungen, als Alternative zu Antibiotika für Tiernahrung, als Anti-Mycoplasma, antibakterielle und antifungale Mittel für Gewebekulturmedien und als Reagenz zur Transformation/Transfektion von Targetzellen mit den gewünschten DNA oder RNA Molekülen verwendet werden.
Als Zusammenfassung stellen die erfindungsmäßigen einfachen diastereomeren Modellpeptide eine wirksame Alternative zu der komplexen Sequenz von hydrophoben und polaren Aminosäuren der bekannten natürlichen amphipathischen α-helikalen antimikrobiellen Peptide bereit, die erforderlich sind, um deren monomere Form, Selektivität und Kopplungsstelle zu erhalten. Außerdem kann durch Modulieren die Länge, Amphipathizität, Lage und Anzahl von D-Aminosäuren und der Polarität der hydrophoben und positiv geladenen Aminosäuren die Membranselektivität und antipathogene Aktivität der gewünschten diastereomeren Peptide bestimmt werden. So stellen die erhöhte Struktur- und Sequenzflexibilität der erfindungsmäßigen diastereomeren antimikrobiellen Modellpeptide wichtige Vorteile zum Design eines Repertoires von wirksamen antipathogenen diastereomeren Polypeptiden zur Behandlung von Erkrankungen bereit.
Zur topischen Verabreichung können die aktiven Komponenten mit einer Vielfalt von kosmetisch und/oder pharmazeutisch verträglichen Trägern formuliert werden. Der Begriff „pharmazeutisch verträglicher Träger" verweist auf ein Vehikel, welches die aktiven Komponenten an das beabsichtigte Target abgibt, und welches keinen Schaden in Menschen oder anderen Empfänger-Organismen verursacht. Es sollte selbstverständlich sein, dass „pharmazeutisch" wie hier verwendet sowohl menschliche als auch tierische Arzneimittel umfasst. Nützliche Träger schließen zum Beispiel Wasser, Aceton, Ethanol, Ethylenglycol, Propylenglycol, Butan-1,3-diol, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Mineralöl ein. Methodik und Komponenten zur Formulierung von Arzneimitteln sind wohl bekannt und können zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, achtzehnte Auflage, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co. Easton Pa., 1990 gefunden werden. Der Träger kann in jeder Form, passend für die Art und Weise der Abgabe, zum Beispiel Lösungen, kolloidale Dispersionen, Emulsionen (Öl in Wasser oder Wasser in Öl), Suspensionen, Cremen, Lotionen, Gelen, Schäumen, Mousse, Sprays und dergleichen sein.
Die Formulierung kann zusätzlich zum Träger und den antimikrobiellen Komponenten auch andere optionale Materialien umfassen, welche abhängig von dem Träger und/oder der beabsichtigten Verwendung der Formulierung ausgewählt werden können. Zusätzliche Komponenten schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Antioxidantien, Chelatbilder, Emulsionstabilisatoren, z.B. Carbomer, Konservierungsmittel, z.B. Methylparaben, Duftstoffe, Befeuchtungsmittel, z.B. Glycerin, Imprägniermittel, z.B. PVP/Eicosen Copolymer, wasserlösliche Filmbildner, z.B. Hydroxypropylmethylcellulose, öllösliche Filmbildner, kationische oder anionische Polymere und dergleichen.
Die antimikrobiellen Komponenten sind gut zur Kombination mit anderen wirksamen Komponenten, die zur topischen Verabreichung bestimmt sind, geeignet.
Die Erfindung wird jetzt mit Bezugnahme auf einige nicht limitierende Beispiele beschrieben.
BEISPIELE
Experimentelle Verfahren
(i) Materialien
4-Methylbenzhydrylaminharz (BHA) und Butyloxycarbonyl (Boc) Aminosäuren wurden von Calbiochem-Novabiochem Co. (La Jolla, CA, USA) erworben. Andere Reagenzien, die zur Peptidsynthese verwendet wurden, schlossen Trifluoressigsäure (TFA, Sigma), N,N-Diisopropylethylamin (DIEA, Sigma), Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, Fluka), 1-Hydroxybenzotriazol (1-HOBT, Pierce) und Dimethylformamid (DMF, Peptidsynthese Qualität, Biolab, IL) ein. Alle anderen Reagenzien waren analytisch rein. Puffer wurden in doppelt destilliertem Wasser hergestellt.
(ii) Peptidsynthese und Reinigung
Peptide wurden durch ein Festphasenverfahren auf einem 4-Methylbenzhydrylaminharz (BHA) (0,05 mäq.) (Merrifield et. al., 1982; Shai et. al., 1990) synthetisiert. Die harzgebundenen Peptide wurden durch Fluorwasserstoffsäure (HF) von dem Harz gespalten und nach HF-Verdampfung und Waschen mit trockenem Ether, mit 50% Acetonitril/Wasser extrahiert. HF-Spaltung der an das BHA-Harz gebundenen Peptide führte zu C-Terminus amidierten Peptiden. Jedes rohe Peptid enthielt wie durch RP-HPLC (reverse phase high-performance liquid chromatography) gezeigt wurde, einen Hauptpeak, aus 60-80 Gew.-% reinem Peptid. Die synthetisierten Peptide wurden weiter durch RP-HPLC auf einer C₁₈-Umkehrphasen Bio-Rad semipräparativen Säule (250 × 10 mm, 300 nm Porengröße, 5-μm Partikelgröße) gereinigt. Die Säule wurde in 40 min. unter Verwendung eines linearen Gradienten von 25-60% Acetonitril in Wasser, wobei beide 0,05% TFA (v/v) enthielten, bei einer Flussrate von 1,8 ml/min. eluiert. Die gereinigten Peptide, welche wie durch analytische HPLC gezeigt homogen (~95%) waren, wurden einer Aminosäurenanalyse und Elektrospray Massenspektroskopie unterworfen, um deren Zusammensetzung und Molekulargewicht zu bestätigen.
(iii) Synthese von cyclischen Diastereomeren.
Die cyclischen Peptide wurden durch ein Festphasenverfahren wie vorstehend in Abschnitt (ii) beschrieben, ohne oder mit Cysteinresten an beiden der N- und C-Termini der Peptide synthetisiert. Die Cyclisierung ohne Cystein wird durch Schützen des N-Terminus, Aktivieren des C-Terminus, Entfernen der Schutzgruppe vom N-Terminus und Umsetzung der C- und N-terminalen Reste, noch während der Bindung an das Harz durchgeführt. Wenn das Peptid Cysteinreste an beiden der N- und C-Termini enthält, werden nach der HF-Spaltung und RP-HPLC Reinigung, die Peptide in geringer Konzentration in PBS (pH 7,3) gelöst, und die Cyclisierung ist nach 12 h abgeschlossen. Die cyclischen Peptide werden weiter auf RP-HPLC gereinigt und einer Aminosäurenanalyse unterworfen, um deren Zusammensetzung zu bestätigen und SDS-PAGE, um deren monomeren Zustand zu bestätigen.
Beispiel 1. Synthese von 15-mer und 16-mer linearen diastereomeren Peptiden und cyclischen Peptiden
Die nachstehenden 15-mer und 16-mer C-amidierten diastereomeren Peptide 2-10, die aus der hydrophoben Aminosäure Leu und der positiv geladenen Aminosäure Lys und gegebenenfalls der positiv geladenen Aminosäure Arg und/oder der N-cap Aminosäure Gly bestehen und die 4-5 D-Aminosäurereste enthalten, wurden wie in den experimentellen Verfahren, Abschnitt (ii) und (iii) beschrieben, synthetisiert. Peptid 1 ist ein 12-mer Diastereomer, das in der vorstehend erwähnten WO 98/37090 beschrieben und hier zu Vergleichszwecken verwendet wird. Die Peptide werden nachstehend durch fettgedruckte Zahlen dargestellt.
Die fettgedruckten und unterstrichenen Aminosäuren sind D-Aminosäuren.
Die nachstehenden cyclischen amidierten diastereomeren Peptide 11-13 wurden hergestellt:
Beispiel 2. Antibakterielle Aktivität der diastereomeren Peptide
Die antibakterielle Aktivität der Peptide wurde in sterilen 96-well Platten (Nunc F96 Mikrotiterplatten) in einem Endvolumen von 100 μL wie folgt untersucht: Aliquote (50 μl) einer Suspension, die Bakterien in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Colony-Forming Units (CFU)/ml in Kulturmedium LB (Lauria broth) enthielt, wurden zu 50 μl Wasser, das das Peptid in 2-fachen Serienverdünnungen in Wasser enthielt, gegeben. Die Wachstumsinhibition wurde durch Messen der Absorbanz bei 600 nm mit einem Mikroplatten Autolesegerät E1309 (BioTek Instruments) nach einer Inkubationszeit von 18-20 h bei 37°C bestimmt. Antibakterielle Aktivitäten wurden als die minimale inhibitorische Konzentration (MIC), die Konzentration bei welcher 100% Wachstumsinhibition nach 18-20 h Inkubation beobachtet wurde, ausgedrückt. Bei den verwendeten Bakterien handelte es sich um: Escherichia coli ATCC 25922, Acinetobacter baumannii ATCC 19606, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterobacter cloacae ATCC 49141. Die antibakterielle Aktivität der Peptide 2 und 6 wurde auch gegenüber den resistenten Bakterien: Methicilin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 700698 und Vancomycin-resistenten Enterococcus faecium (VRE) ATCC 700221 untersucht.
Die Ergebnisse für die in Tabelle 1 zusammengefassten Peptide 1-8 zeigen, dass die erfindungsmäßigen Peptide 2-8 gegen die meisten der untersuchten Bakterien signifikant wirksamer sind, als das bekannte Peptid 1. Außerdem sind die Peptide 2 und 6 gegenüber den vorstehend erwähnten resistenten Bakterien MRSA und VRE hoch aktiv, welches andeutet, dass diese Bakterien gegenüber den diastereomeren Peptiden nicht resistent sind. Tabelle 1 Minimale inhibitorische Konzentration (μg/ml) von diastereomeren Peptiden für Bakterienwachstum

N.D. = nicht bestimmt

Beispiel 3. Antifungale Aktivität der Diastereomere
Die antifungale Aktivität der Diastereomere wurde in sterilen 96-well Platten (Nunc F96 Mikrotiterplatten) in einem Endvolumen von 200 μL wie folgt untersucht: 100 μL einer Suspension, die Pilze in einer Konzentration von 1 × 10⁴ Colony-Forming Units (CFU)/ml in Kulturmedium (RPMI 1640, 0,165M MOPS pH 7,0, mit L-Glutamin, ohne NaHCO₃) enthielt, wurde zu 100 μL Wasser, das das Peptid in 2-fachen Serienverdünnungen in Wasser enthielt gegeben. Die Pilze wurden in der Gegenwart der diastereomeren Peptide für 248 h bei 35°C in einem Binder KB115 Inkubator unter Schütteln inkubiert. Die Wachstumsinhibition wurde durch Messen der Absorbanz bei 620 nm mit einem Mikroplatten Autolesegerät E1309 (BioTek Instruments) bestimmt. Die antifungale Aktivität wird als die minimale inhibitorische Konzentration (MIC), die Konzentration bei welcher 100% Wachstumsinhibition nach der vorstehend erwähnten Inkubationszeit beobachtet wurde, ausgedrückt. Bei den verwendeten Pilze handelte es sich um: Aspergillus niger ATCC 9642, Candida albicans ATCC 10231 und Cryptococcus neoformans ATCC 66031.
Die in Tabelle 2 zusammengefassten Ergebnisse für die Peptide 1-8 zeigen, dass während das bekannte 12-mer Peptid 1 gegen C. albicans und A. niger nicht aktiv war, waren die erfindungsmäßigen Peptide 2-8 gegen alle untersuchten Pilze aktiv.
Tabelle 2 MIC (μg/ml) des diastereomeren Peptids für Pilze
Beispiel 4. Antikrebs-Aktivität der diastereomeren Peptide
4a. In vitro Aktivität gegen eine murine Melanomzelllinie
Die Antikrebs-Aktivität der Diastereomere 1, 2, 8, 9 und 10 wurde gegen die murine B16-F10 Melanomzelllinie untersucht. Melanomzellen wurden in RPMI-1640 Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika ergänzt wurde, bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre bei 5% CO₂ und 95% Luft gezüchtet. Zusätzlich wurde die Zellselektivität der diastereomeren Peptide durch Untersuchen deren Wirkung auf eine normale NIH-3T3 Fibroblastenzelllinie studiert. Murine NIH-3T3 Fibroblastenzellen wurden in DMEM Medium, das mit 10% bovinem Kälberserum und Antibiotika ergänzt wurde, unter denselben Bedingungen wie vorstehend für murine B16-F10 Melanomzellen beschrieben, gezüchtet. Melanomzellen (2 × 10⁵ Zellen ml^–1) oder NIH-3T3 Zellen (2,5 × 10⁵ Zellen ml^–1) wurden auf Gewebekulturplatten (3,5 cm) gesiedelt. Nach 48 h wurden die Zellen zweimal mit dem entsprechenden Medium gewaschen. Dann wurden die Zellen bei 37°C in Medium (ohne Serum und Antibiotika) in Gegenwart der getesteten, in PBS gelösten, diastereomeren Peptide bei verschiedenen Konzentrationen inkubiert. In Kontrollexperimenten wurden PBS allein oder das chemotherapeutische Mittel Mitomycin C zu den Zellen gegeben. Im Anschluss an die 24 h Inkubation wurden die Zellen mit Trypsin (0,25%)/EDTA (0,05%) geerntet und für 10 min bei 270 g zentrifugiert. Die ausgefällten Zellen wurden in dem geeigneten Medium suspendiert und in einem Hämozytometer (Neubauer) gezählt. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch Trypan-blau Farbstoffausschluss bestimmt. Antikrebs-Aktivitäten wurden als LC50, die Konzentration bei der 50% Zellmortalität nach 24 h Inkubation beobachtet wurde, ausgedrückt.
Die in Tabelle 3 zusammengefassten Ergebnisse für die Peptide 2, 8, 9 und 10 zeigen, dass die erfindungsmäßigen Diastereomere 2, 8, 9, 10 gegen die Melanomzelllinie signifikant wirksamer als das bekannte 12-mer Diastereomer 1 sind. Außerdem waren die Peptide 2, 8, 9, 10 gegen eine Melanomzelllinie bei Konzentrationen aktiv, welche 3-15-fach niederer sind als die Konzentration, bei welcher sie gegen eine normale NIH-3T3 Fibroblastenzelllinie wirken. Im Gegensatz dazu waren sowohl Mitomycin C als auch Peptid 1 gegen beide Zelllinien bei ähnlichen Konzentrationen aktiv. Die Ergebnisse lassen klar erkennen, dass die neuen erfindungsmäßigen diastereomeren Peptide selektiver als das klinisch verwendete chemotherapeutische Mittel Mitomycin C sind.
Tabelle 3 Letale Konzentration (LC50) (μg/ml) der Peptide 1, 2, 8, 9 und 10 gegen Melanom- und normale Fibroblastenzelllinien
4b. In vitro Aktivität gegen menschliche Tumorzelllinien
Die Antikrebs-Aktivität der erfindungsmäßigen Diastereomere 9 und 10 wurde auch wie in Tabelle 4 nachstehend gezeigt gegen 5 verschiedene menschliche Tumorzelllinien untersucht: Tabelle 4 Menschliche Tumorzelllinien
Aliquote von 100 μL Suspension der Tumorzellen (etwa 2,5-5 × 10³/Well) wurden in 96-well Mikrotiterplatten in einer Atmosphäre von 5% CO bei 37°C platziert. Nach 24 Stunden wurden für eine zusätzliche 72 stündige Inkubation 100 μl Wachstumsmedium, 2 μl Testlösung, Mitomycin oder Vehikel (PBS, pH = 7,4) in Duplikaten pro Well zugegeben. Das getestete diastereomere Peptid wurde bei Konzentrationen von 100, 10, 1, 0,1 und 0,01 μM bewertet. Am Ende der Inkubation wurden für eine weitere 6 stündige Inkubation 20 μl AlamarBlue 75% Reagens zu jedem Well gegeben, vor der Detektion der Zelllebensfähigkeit mittels Fluoreszenzintensität. Die Fluoreszenzintensität wurde unter Verwendung eines Spectraflour Plus Platten-Lesegeräts mit Anregung bei 530 nm und Emission bei 590 nm gemessen.
Die Assays wurden verwendet, um Veränderungen bei der Zellproliferation nachzuweisen, basierend auf der Fähigkeit der lebensfähigen Zellen, den Übergang von AlamarBlue von seiner oxidierten (nicht fluoreszierend, blau) zu einer reduzierten Form (fluoreszierend, rot) zu bewirken. Aus den von der AlamarBlue Reaktion erhaltenen Ergebnissen kann die Zellproliferation quantifiziert und die metabolische Aktivität der lebensfähigen Zellen untersucht werden.
Wie in Tabelle 5 gesehen werden kann, zeigen die Diastereomere 9 und 10 eine signifikante Wachstumsinhibition (> 50%) relativ zu der jeweiligen Vehikel-behandelten Kontrollgruppe bei Assaykonzentrationen zwischen etwa 1 und 20 μM in allen der 5 verschiedenen menschlichen Tumorzelllinien. Dies zeigt, dass die erfindungsmäßigen diastereomeren Peptide ein breites Aktivitätsspektrum gegen Krebs aufweisen. Die starke Aktivität der Peptide gegen die verschiedenen Arten von Tumorzelllinien und deren Zellselektivität macht sie zu guten Kandidaten, um als Antikrebs-Arzneimittel verwendet zu werden. Tabelle 5 IC50 (μg/ml) der Peptide 9 und 10 gegen menschliche Tumorzelllinien

*IC₅₀ (50% Inhibitionskonzentration) ist die Konzentration an Testverbindung, in welcher die Zunahme der Anzahl behandelter Zellen von der Zeit₀ nur 50% im Vergleich zu der entsprechenden Zunahme in den Vehikel-(Kontrolle)-behandelten Zellen am Ende des Experiments betrug.

4c. In vivo Aktivität gegen Brustkrebs
Der in vivo Antikrebs-Assay wurde an SCID (Severe Combined Immune Deficiency) Mäusen unter Verwendung des Xenotransplantationsmodells von menschlichen MCF-7 Brustzellen durchgeführt. Gruppen von 6 weiblichen SCID-Mäusen, die 18-20 g wogen (6-Wochen alt), die in einem Tierisolator (IVC Ständer) unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen bei 24 ± 1°C gezüchtet wurden, wurden verwendet. Lebensfähige menschliche MCF-7 Brustkarzinomzellen (ATCC HTB-22, 1 × 10⁷ Zellen in 0,2 ml PBS) wurden subkutan (s.c.) in die dorsale Seite der SCID Mäuse injiziert. 50 μg/Maus Östradiolbenzoat wurde wöchentlich als Ergänzung für 4 Wochen s.c. injiziert. Als die Tumorgröße > 5 mm im Durchmesser (etwa Tag 12) erreichte, wurden die Tiere wahllos in Gruppen von sechs zugeordnet, und die Verabreichung von Vehikel und/oder Testverbindungen wurde begonnen. 3 mg/kg Peptid 9 oder Vehikelkontrolle (PBS, pH = 7,4) in einem Dosiervolumen von 10 ml/kg wurde den Tieren zweimal pro Woche für 6 Dosen intravenös (i.v.) verabreicht. Mitomycin in einer Dosis von 2 mg/kg wurde zweimal pro Woche für 5 Dosen intraperitoneal (i.p.) verabreicht. Die Tumorgröße, Körpergewicht und Anzeichen einer offenkundigen Toxizität bei Tieren wurden nach jeder Behandlung protokolliert und beobachtet. Am Ende des Experiments wurde eine hämatologische Analyse durchgeführt.
Die in 1 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass Peptid 9 bei einer Dosierung von 3 mg/kg eine inhibitorische Wirkung auf das Tumorwachstum während der Testperiode zeigte. Obwohl das chemotherapeutische Mittel Mitomycin wirksamer als Peptid 9 war (1), zeigten die mit Mitomycin behandelten Tiere während der Assaydauer schwerwiegende Nebenwirkungen, während die mit Peptid 9 behandelten Tiere Nebenwirkungen entfalteten, welche nur nach der Verabreichung der Verbindung auftraten und innerhalb 1 Stunde verschwanden. 2 zeigt, dass die mit Mitomycin behandelten Tiere und selbst die Kontrollmäuse Anzeichen von Schwäche und Gewichtsverlust zeigten, die sich mit Fortschreiten des Experiments verschlimmerten. Im Gegensatz dazu waren die mit Peptid 9 behandelten Tiere in einem guten Zustand, sie zeigten keine Anzeichen von Schwäche und behielten ihr Körpergewicht während der Studiendauer. Zusätzlich zeigte eine hämatologische Analyse, die am Ende des Assays durchgeführt wurde, dass Mitomycin auch eine signifikante Abnahme der weißen Blutzellen (WBC), roten Blutzellen (RBC) und Blutplättchen verursacht, während Peptid 9 keine Abnahme bei den WBC und Blutplättchen verursacht, und nur eine geringfügige Abnahme bei den RBC wurde in den mit Peptid 9 behandelten Tieren verzeichnet (Tabelle 6).
Die in diesem Experiment erhaltenen Ergebnisse deuten an, dass Peptid 9 ein potentieller Kandidat zur Verwendung als Antikrebs-Arzneimittel ist, wahrscheinlich in höheren Konzentrationen als hier gezeigt. Es wurde festgestellt, dass Peptid 9 im Vergleich zu Mitomycin C weniger toxisch ist und nur leichte vorübergehende Nebenwirkungen verursacht, während Mitomycin C schwerwiegende Nebenwirkungen, die für einen langen Zeitraum selbst ein paar Wochen nach seiner letzten Verabreichung anhielten, verursachte. Tabelle 6 Hämatologische Analyse

N = Anz. der Tiere
WBC = weiße Blutzellen; RBC = rote Blutzellen; PLT = Blutplättchen.

4d. In vivo Aktivität gegen Lungenkrebs
Um die Fähigkeit der erfindungsmäßigen Diastereomere zu untersuchen, die Lungenmetastasenbildung zu inhibieren, wurde das murine maligne 3LL D-122 Lewis Lungenkarzinommodell (D122 Klon des 3LL Karzinoms von C57BL/6 Abstammung) mit männlichen C57-Black-Mäusen (Porgador et al., 1993) verwendet. Die Tiere wurden in einem Tierisolator (IVC Ständer) unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen bei 24 ± 1°C gezüchtet. Malignante 3LL D-122 Zellen (1 × 10⁷ Zellen/0,2 ml PBS) wurden den zwanzig, 8-9 Wochen alten, männlichen C57-Black-Mäusen, die 18-22 g wogen, intravenös (i.v.) injiziert. Nach 24 Stunden wurden die Tiere wahllos zwei Gruppen zugeordnet, und die Verabreichung von Vehikel (Kontrolle) oder einer Testverbindung wurde begonnen. 5 mg/kg Peptid 9 oder 10 ml/kg Kontrolle (PBS, pH = 7,4) wurde den Mäusen jeden Tag drei Tage lang in der ersten Woche und dann einmal pro Woche in den nächsten zwei Wochen, für insgesamt 5 Behandlungen in einem Zeitraum von 21 Tagen i.v. verabreicht. Am 28. Tag wurden die Mäusen geopfert, und deren Lungen wurden entfernt und gewogen, um das Ausmaß an Lungenmetastasen zu messen. Die Metastasenbelastung wird als das mittlere Lungengewicht der mit D-122 Zellen infizierten Mäuse minus dem mittleren Lungengewicht von 5 normalen Mäusen (158 ± 2 mg) definiert.
Die Ergebnisse werden in 3 abgebildet. Wie gezeigt, haben die mit D-122 Lungenkarzinomzellen infizierten und mit dem erfindungsmäßigen Peptid 9 behandelten Mäuse ein signifikant niedrigeres Lungengewicht (282 ± 28 mg) im Vergleich zu D-122 infizierten und unbehandelten Mäusen (896 ± 39 mg). Die Metastasenbelastung wurde in der mit Peptid 9 behandelten Gruppe im Vergleich zu der unbehandelten Gruppe um 80% verringert. Diese Befunde zeigen, dass Peptid 9 auch signifikant gegen Lungentumormetastasen aktiv ist und als Breitband-Arzneimittel gegen Krebs verwendet werden kann.
Beispiel 5. Resistenz der Diastereomere gegenüber proteolytischer Verdauung
Um ihr Target zu erreichen, haben die Diastereomere der proteolytischen Verdauung durch Proteasen standzuhalten, welche während der Zeit von deren Verabreichungsort bis zum Erreichen des Zielortes auftreten kann. Die Anfälligkeit des erfindungsmäßigen Diastereomers 2 gegenüber proteolytischer Verdauung durch Pepsin (aus Schweinemagenschleimhaut, Sigma), Trypsin (aus Rinderpankreas, Sigma) und Elastase (aus menschlichen Leukocyten, Sigma) wurde durch Umkehrphasen-HPLC bewertet. Als Kontrolle verwendeten wir das natürliche, alles L-Aminosäuren, antimikrobielle Peptid Cecropin B. Gleiche Mengen an Peptiden wurden in PBS (35 mM Phosphatpuffer/0,15M NaCl, pH 7,3) bei einer Endkonzentration von 140 ☐M gelöst, zu welchen 25 ☐M Protease gegeben wurden. Die Proben wurden unter Schütteln für 30 min. bei 37°C inkubiert. Nach der Zugabe des passenden Proteaseinhibitors, um die Umsetzung zu beenden, wurden die Aliquote auf die C₁₈-Säule injiziert, und die Mengen an intakten Diastereomeren wurden unter Verwendung deren Absorbanz bei 215 nm abgeschätzt. Die in Tabelle 7 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsmäßigen Diastereomere gegenüber Proteaseverdauung im Vergleich zum natürlichen antimikrobiellen Peptid Cecropin B signifikant weniger anfällig sind.
Tabelle 7 Proteolytische Verdauung (%) der Diastereomere
Beispiel 6. Aktivität der erfindungsmäßigen Diastereomere gegen Mycoplasmen
Mycoplasmen sind die kleinsten frei lebenden Mikroorganismen, die etwa 300 nm im Durchmesser sind. Sie sind durch eine dreischichtige Membran gebunden und im Gegensatz zu herkömmlichen Bakterien, haben sie keine starre Zellwand. Daher sind sie gegenüber Penicillinen und anderen Antibiotika, die auf Bakterien wirken, nicht empfindlich. Mycoplasmeninfektion von Zellkulturen ist weit verbreitet und hat wesentliche nachteilige Wirkungen auf die zelluläre Physiologie und den Stoffwechsel. Da Zellkulturen sowohl in der Forschung als auch bei industriellen Herstellungsverfahren extensiv verwendet werden, ist es erforderlich, einen Weg zu finden, um eine Mycoplasmenkontamination zu vermeiden.
Um die Aktivität der erfindungsmäßigen Diastereomere gegen Mycoplasmen zu untersuchen, wurden 500 μl Mycoplasma pneumoniae Zellen in eine Zellkulturflasche, die 50 ml SP-4 Wachstumsmedium (Jacob et al., 1985) enthielt, eingeführt. Die Zellen wurden 3-4 Tage lang bei 37°C gezüchtet. Vor dem Assay wurden die Mycoplasmazellen 3-mal mit serumfreien Medium (ohne fötales Kälberserum) gewaschen und dann mit 5 ml verdünntem Medium geerntet. Die Zellkonzentration wurde auf annähernd 1 × 10⁶ Zellen ml^–1 eingestellt. Danach wurden 150 μl von entweder Diastereomer 1 oder 2 in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu 150 μl Mycoplasmazellen gegeben. Das Gemisch wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Als Kontrolle wurden Zellen mit PBS allein inkubiert. Am Ende der Inkubationsperiode wurden 150 μl des Gemisches in Gewebekulturflaschen (in Duplikaten), die 15 ml SP-4 Medien enthielten, geimpft. Nach 3-4 Tagen wurde die Lebensfähigkeit der Mycoplasmen durch Zählen der Anzahl der gewachsenen Zellen in jeder Flasche bestimmt. Antimycoplasma-Aktivität wird als die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) ausgedrückt, die Konzentration bei der 100% Wachstumsinhibition nach der vorstehend erwähnten Inkubationszeit beobachtet wurde.
Wie in Tabelle 8 gezeigt, war das 12-mer Diastereomer 1, das vom Stand der Technik bekannt war, gegen Mycoplasmen weniger aktiv als das 15-mer Peptid 2 der vorliegenden Erfindung. Außerdem waren im Vergleich zu ihrer Aktivität gegen die normale Zelllinie (Tabelle 3) beide Peptide gegen NIH-3T3 Fibroblasten bei Konzentrationen wirksam, die 2-fach höher sind, als die Konzentration, bei der sie gegen Mycoplasmen wirken, dies deutet darauf hin, dass die diastereomeren Peptide eine selektive Aktivität gegen Mycoplasmen aufweisen.
Tabelle 8 MIC (μg/ml) der Peptide 1 und 2 gegen Mycoplasmen
Beispiel 7. Wirkung der erfindungsmäßigen Diastereomere auf primäre Haut- und Augenirritation bei Kaninchen
Der Zweck dieses Experiments war eine Information über die Irritation zu liefern, die voraussichtlich von einer einzelnen Einträufelung von Peptid 2 in das Auge oder von einer einzelnen topischen Einwirkung auf dieses auftritt. Die Untersuchung wurde von der Dienstleistungsfirma „PSL" (Product Safety Labs, 725 Cranbury Road, East Brunswick, New Jersey, USA) durchgeführt.
Für den Augenirritationstest wurden drei gesunde Kaninchen (1 männliches und 2 weibliche) ohne vorher vorhandene okulare Irritation ausgewählt. Vor der Einträufelung wurde das Peptid 2 in 0,9% Kochsalzlösung gelöst, um eine 0,5% Konzentration zu ergeben und dann unter Verwendung eines Vortex-Mischers gut gemischt. Ein Zehntel eines Milliliters der hergestellten Testsubstanz wurde in den Bindehautsack des rechten Auges jedes Kaninchens durch Wegziehen des unteren Lids vom Augapfel eingeträufelt. Die oberen und unteren Lider wurden dann vor dem Loslassen für etwa eine Sekunde sanft zusammengehalten, um den Verlust an Testsubstanz herabzusetzen. Das linke Auge blieb unbehandelt und diente als Kontrolle. Die Okulare Irritation wurde durch Beleuchten mit einer weißen Lichtquelle für 1, 24, 48 und 72 Stunden nach der Einträufelung gemäß der in „PSL" verwendeten „Punkteskala für okulare Läsionen" abgeschätzt. Fluoresceinfarbstoff wurde nach 24 Stunden verwendet, um das Ausbleiben einer Hornhautschädigung zu bestätigen.
Für den Hautirritationstest wurden drei gesunde Kaninchen ausgewählt. Am Tag vor der Verabreichung wurde das Fell jedes Tiers an der Behandlungsstelle durch Schur entfernt. Es wurde Acht gegeben, dass ein Abreiben der Haut vermieden wurde. Nach dem Scheren und vor der Verabreichung wurde die Haut der Tiere auf jegliche Abnormalitäten gemäß des in „PSL" verwendeten „Punktesystems für primäre Hautirritationen" hin geprüft. Wurden irgendwelche Punkte größer null für eine Behandlungsstelle vergeben, wurde das Tier vom Test entfernt und ersetzt. Vor dem Einwirken wurde das Peptid 2 in 0,9% Kochsalzlösung gelöst, um eine 0,5% Konzentration zu ergeben und dann unter Verwendung eines Vortex-Mischers gut gemischt. Fünf Zehntel eines Milliliters der hergestellten Testsubstanz wurde direkt auf die Haut der Behandlungsstelle aufgetragen. Der ganze Rumpf jedes Tiers wurde dann mit einem nicht irritierenden okklusiven Heftpflaster eingewickelt, um ein Verrutschen des Pflasters zu verhindern. Die Tiere wurden der Testsubstanz für einen Zeitraum von 24 Stunden ausgesetzt. Elisabethanische Stellringe wurden jedem Kaninchen für die bezeichnete Einwirkungszeit angelegt. Im Anschluss an die Einwirkungszeit wurden die Pflaster entfernt, und die Behandlungsstellen wurden mit Wasser oder einem passenden Lösungsmittel unter Verwendung von sauberen Tüchern abgewischt, um jede restliche Testsubstanz zu entfernen. Die Behandlungsstellen wurden innerhalb 1 Stunde und annähernd nach 24, 48 und 72 Stunden nach der Entfernung des Pflasters auf Anzeichen von Hautrötung und Ödem gemäß dem von Draize (Draize et al., 1944) entwickelten „Punktesystem für primäre Hautirritationen" untersucht. Individuelle Punkte wurden für jedes Kaninchen protokolliert. Eine narrative Beschreibung der relevanten Hautbeobachtungen und alle Anzeichen der Gesamttoxizität wurden protokolliert. Außerdem wurde die Evaluierung der Reversibilität oder Irreversibilität der beobachteten Effekte vermerkt.
Gemäß den erhaltenen Ergebnissen wurde während der Augenirritationsstudie keine Hornhauttrübung oder Iritis vermerkt und keine Anzeichen von Hautrötung und Ödem wurden während des Hautirritationstests beobachtet. So kann daraus geschlossen werden, dass das Peptid 2 bei der hohen Konzentration von 0,5% (5 mg/ml) keine Augen- oder Hautirritation verursacht.
Beispiel 8. Liposomverkapselung der diastereomeren Peptide
Liposome dienen als geeignete Abgabevehikel für biologisch aktive Moleküle. Hydrophile Arzneimittel können in dem inneren wässrigen Kompartiment verkapselt werden, während hydrophobe Arzneimittel an die Lipid-Doppelschichten binden oder in diese eingebracht werden können. In diesem Experiment wurden liposomale diastereomere Peptide hergestellt, um die Toxizität des Peptids herabzusetzen und deren Selektivität zu erhöhen.
Die Liposome, die aus verschiedenen Verhältnissen von Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidylglycerol (PG) (9:1; 4:1; 1:1 w/w) oder Phosphatidylethanolamin (PE)/PG (9:1; 4:1; 1:1 w/w) bestanden, wurden hergestellt. In Kürze, die trockenen Lipidgemische wurden in CHCl₃/MeOH (2/1, v/v) gelöst. Die Lösungsmittel wurden unter einem Stickstoffstrom verdampft, und die Lipidgemische wurden in den vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen in PBS durch Vortex-Mischen resuspendiert. Die Lipidsuspension wurde durch 3 verschiedene Polycarbonatfilter (Filter: 1 μm, 0,2 μm und 0,1 μm Porengröße, jeweils 15-mal) extrudiert. Schließlich wurden die so erhaltenen Suspensionen von großen unilamellaren Vesikeln (LUV) zu den verschiedenen Konzentrationen von Peptid 9 gegeben, um Lipid/Peptid Verhältnisse von 50:1; 30:1 beziehungsweise 10:1 w/w zu ergeben. Die Gemische wurden für 2 Minuten beschallt, und die Liposome wurden bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.
Die antibakterielle Aktivität der so erhaltenen liposomalen diastereomeren Peptidpräparate wurde wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben, untersucht. Die MICs des liposomalen Peptids 9 in verschiedenen Lipidzusammensetzungen und Peptid/Lipidverhältnissen (wie vorstehend beschrieben) oder von Liposomen in Lipidzusammensetzungen äquivalent zu den beladenen Liposomen (nicht gezeigt) oder Peptid 9 allein, wurden unter Verwendung der folgenden Bakterien: Acinetobacter baumannii ATCC 19606 und Staphylococcus aureus ATCC 6538P bestimmt.
Die in Tabelle 9 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass das liposomale Peptid 9, das aus den Lipiden PC/PG (9:1 w/w) in einem 10:1 w/w Lipid/Peptidverhältnis besteht, MIC-Ergebnisse ähnlich zu jenen von Peptid 9 allein zeigt. Daher kann das in den Liposomen eingeschlossene Peptid 9 seine antibakterielle Aktivität beibehalten, jedoch hängt diese Aktivität von der Liposomen-Lipidzusammensetzung und von dem Lipid/Peptidverhältnis ab.
Tabelle 9 MIC (μg/ml) des liposomalen Peptids 9 für Bakterien
Die in vivo Toxizität des liposomalen Peptid 9 Präparats, das aus den Lipiden PC/PG (9:1 w/w) in einem 10:1 w/w Lipid/Peptidverhältnis besteht, wurde untersucht. Gruppen von 5 männlichen CD1-Mäusen, die 24-27 g wogen (5-Wochen alt), die in einem Tierisolator (IVC Ständer) unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen bei 24 ± 1°C gezüchtet wurden, wurden verwendet. Zwölf mg/kg liposomales Peptid 9 oder Peptid 9 allein, die in PBS in einem Dosiervolumen von 10 ml/kg gelöst waren, wurden durch eine einzelne i.v. Bolus-Injektion über die Schwanzvene der Mäuse verabreicht. Parallel dazu erhielten die Kontrollgruppen i.v. Injektionen von äquivalenten Liposomen allein oder PBS in einem Dosiervolumen von 10 ml/kg.
Die Ergebnisse in Tabelle 10 zeigen, dass 12 mg/kg i.v. injiziertes Peptid 9 80% Mortalität verursacht, während das liposomale Peptid 9 in derselben Konzentration nur 20% Mortalität hervorrief. Keine Sterblichkeitsrate trat nach der i.v. Injektion von PBS oder den Liposomen allein auf. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Einschließen der erfindungsmäßigen diastereomeren Peptide in Liposomen deren Toxizität herabsetzen kann, während deren Aktivität beibehalten wird. Tabelle 10 Sterblichkeitsrate bei Mäusen nach einer einzelnen i.v. Injektion von liposomalem Peptid 9, Peptid 9, Liposomen oder PBS

nz. der betroffenen Tiere/Anz. der Tiere pro Gruppe.

Referenzen

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Claims

Diastereomeres Peptid mit einer positiven Gesamtladung von größer als +1 und mit mindestens 15 Aminosäureresten, wobei die Reste ausgewählt sind aus: (i) Leucin und Lysin; (ii) Leucin, Lysin und Arginin; (iii) den Resten aus (i) oder (ii) und Glycin, Serin, Asparagin, Threonin oder Glutamin am N-Terminus; oder (iv) den Resten aus (i), (ii) oder (iii) und Lysin, Arginin, Glycin oder Serin am C-Terminus; und (v) cyclischen Analoga von (i), (ii), (iii) oder (iv).
Diastereomeres Peptid gemäß Anspruch 1, bestehend aus Leucin- und Lysinresten.
Diastereomeres Peptid gemäß Anspruch 2, ausgewählt aus den Peptiden der Sequenzen:
Diastereomeres Peptid gemäß Anspruch 1, bestehend aus Leucin-, Lysin- und Argininresten.
Diastereomeres Peptid gemäß Anspruch 4, ausgewählt aus den Peptiden der Sequenzen:
Diastereomeres Peptid gemäß Anspruch 1, bestehend aus Leucin- und Lysin- oder aus Leucin-, Lysin- und Argininresten und mit einer Aminosäure, ausgewählt aus Glycin, Serin, Asparagin, Threonin oder Glutamin, am N-Terminus.
Diastereomeres Peptid gemäß Anspruch 6, wobei die Aminosäure am N-Terminus Glycin ist.
Diastereomeres Peptid gemäß Anspruch 7, ausgewählt aus den Peptiden der Sequenzen:
Diastereomeres Peptid gemäß Anspruch 1, wobei das Peptid ein cyclisches Analogon des diastereomeren Peptids aus (i), (ii), (iii) oder (iv) ist.
Diastereomeres Peptid gemäß Anspruch 9, ausgewählt aus den Peptiden der Sequenzen:
Arzneimittel, umfassend ein diastereomeres Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Arzneimittel gemäß Anspruch 11 zur topischen Verabreichung.
Arzneimittel gemäß Anspruch 12 zur topischen Behandlung von Akne; topischen Infektionen, die durch pathogene Organismen verursacht werden, wie bakterielle Infektionen, einschließlich chronischem Befall der Magenschleimhaut durch Helicobacter pylori, bakteriellen Darminfektionen, Infektionen, die durch gegen Antibiotika resistente Bakterien, z.B. Streptococcus pyogenes, und die durch gegen Methicilin resistente Staphylococcus aureus verursacht werden; Pilzinfektionen einschließlich Nagelpilze; durch Hefen, wie Candida albicans, verursachten Infektionen; Pilzinfektionen der Kopfhaut; mit chirurgischen oder traumatischen Wunden in Verbindung stehenden Pilz- oder bakteriellen Infektionen; chronischen oder schlecht heilenden Hautverletzungen wie Fußgeschwür bei Patienten mit Diabetes mellitus; vaginalen Infektionen (Vaginitis); Augen- und Ohrinfektionen; Brandwunden; Infektionen des Mundes und Halses; und lokalisierten Infektionen wie chronischen Lungeninfektionen bei Mukoviszidose, Emphysemen und Asthma.
Arzneimittel gemäß Anspruch 13 zur Behandlung von bakteriellen Infektionen, umfassend ein diastereomeres Peptid, ausgewählt aus den Peptiden der Sequenzen:
Arzneimittel gemäß Anspruch 13 oder 14 zur Behandlung von durch gegen Antibiotika resistente Bakterien verursachten Infektionen, umfassend ein diastereomeres Peptid, ausgewählt aus den Peptiden der Sequenzen:
Arzneimittel gemäß Anspruch 13 zur Behandlung von Pilzinfektionen, umfassend ein diastereomeres Peptid, ausgewählt aus den Peptiden der Sequenzen:
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 11 bis 16 in Form einer Lösung, einer kolloidalen Dispersion, Creme, Lotion, eines Gels, Schaums, Mousse, Sprays, Aerosols oder anderen Formulierung für die nasale Anwendung oder die Anwendung in der Lunge.
Arzneimittel gemäß Anspruch 11 zur Behandlung von Krebs.
Arzneimittel gegen Krebs gemäß Anspruch 18, umfassend ein diastereomeres Peptid, ausgewählt aus den Peptiden der Sequenzen:
Arzneimittel gemäß Anspruch 18 oder 19 zur Behandlung von Melanom-, Basal- oder Plattenepithelzellenkarzinomen oder zur Behandlung von Brust-, Darm-, Lungen- oder Prostatatumoren.
Arzneimittel gemäß Anspruch 20 zur Behandlung von Brust-, Darm-, Lungenmelanomen oder Prostatatumoren, umfassend ein diastereomeres Peptid, ausgewählt aus den Peptiden der Sequenzen:
Zusammensetzung, umfassend ein diastereomeres Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Steuerung einer Mycoplasmainfektion in einer Zellkultur, zur Nahrungsmittelkonservierung oder zur Verwendung als Nahrungsergänzungsmittel.
Veterinärmedizinische Zusammensetzung, umfassend ein diastereomeres Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.