ES2299749T3 - Compuestos que se unen a p-selectina. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto con afinidad a P-selectina humana, que es un derivado de un péptido representado por la secuencia X(Ax)mA3A1A2A1Y, en donde: - A1 es una D- o L-cisteína (C) o una D- o L-valina (V); - A 2 es un ácido D- o L-aspártico (D); - A3 es una D- o L-fenilalanina (F) o un D-triptofano (W); - A x es un D- o L-aminoácido seleccionado del grupo consistente en ácido glutámico (E), ácido aspártico (D), glicina (G) y cisteína (C); - X marca el lado N-terminal de dicha secuencia y es hidrógeno o un residuo que comprende de 1 a 6 D- o L-aminoácidos o análogos de los mismos; - Y marca el lado C-terminal de dicha secuencia y es -OH o un residuo que comprende de 1 a 11 D- o L-aminoácidos o análogos de los mismos; en donde X e Y juntos pueden formar un sistema cíclico; caracterizado porque al menos uno de X e Y o X + Y están sustituidos con el grupo: - R 1 -(Z)n- en donde: - Z es -CO- y en donde - R 1 se elige entre: - un grupo alquilo (C 2-C 8) en donde al menos un átomo de C está reemplazado por un átomo de nitrógeno; - un grupo arilo (C6-C14) que puede estar sustituido con al menos un grupo seleccionado entre -OH o -COOH; y en donde m y n representan enteros elegidos independientemente entre 0 y 1.
Description
Compuestos que se unen a
P-selectina.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención se refiere a compuestos
que se unen selectivamente a la molécula de adhesión
P-selectina humana, a métodos para la preparación
de dichos compuestos, al uso de tales compuestos en métodos
terapéuticos o de diagnosis y en composiciones farmacéuticas, a
moléculas de unión que se unen a dichos compuestos y a un método
para determinar si un compuesto es capaz o no de unirse a
P-selectina.
En los últimos años, las moléculas de adhesión a
la superficie de las células han llegado a ser reconocidas como
mediadores clave en numerosos procesos celulares incluyendo el
crecimiento de células, la diferenciación, la transmigración y
respuesta de células inmunes y la metástasis de cáncer.
Han sido identificadas cuatro categorías
principales de moléculas de adhesión: las moléculas de adhesión
celular de la superfamilia de las inmunoglobulinas (CAMs),
cadherinas, integrinas y selectinas.
Las selectinas representan una familia de
actualmente tres glicoproteínas transmembranosas que se unen a
carbohidratos: E-selectina de "endoteliales",
L-selectina de "leucocitos" y
P-selectina de "plaquetas". Todas estas tres
selectinas son dependientes de cationes divalentes (por ejemplo,
calcio) y poseen un dominio extracelular con un motivo de
reconocimiento de carbohidratos, un motivo similar al factor de
crecimiento epidérmico y algunos dominios más pequeños relacionados
con proteínas reguladoras-complemento.
La P-selectina humana (referida
también como GMP-140, LECAM-3,
PADGEM, CD62 y CD62P) es expresada por plaquetas y células
endoteliales. Cuando se expresa sobre las superficies de estas
células, su efecto más notable es la deceleración de leucocitos a
medida que estos dejan los capilares y entran en las vénulas
post-capilares, representando estas últimas el
principal sitio de adhesión leucocito-endotelio. El
proceso de deceleración se observa como rodamiento leucocitario,
significando ello una adhesión inicial con una afinidad
relativamente baja. La firme adhesión de los leucocitos rodantes es
mediada principalmente por integrinas.
En las células endoteliales, la
P-selectina está almacenada en cuerpos
Weibel-Palade; en plaquetas, se encuentra en los
gránulos \alpha. Después de la activación, la
P-selectina se moviliza hacia las superficies
celulares en el plazo de unos pocos minutos en respuesta a una
variedad de agentes inflamatorios o trombogénicos. La función
principal de la P-selectina endotelial es la de
reclutar leucocitos al interior de las vénulas
post-capilares, mientras que la
P-selectina de plaquetas da lugar también a la
formación de trombos. Uno de los ligandos naturales de
P-selectina actualmente conocidos es
PSGL-1 (ligando-1 de glicoproteína
de P-selectina), una sialoproteína de 120 kDa
expresada sobre la superficie de leucocitos en donde queda
concentrada en el urópodo. Descripciones más detalladas de la
estructura y funciones de la P-selectina pueden
encontrarse en numerosas publicaciones (por ejemplo, J. Panes,
Pathophysiology 5: 271 (1999); F. Chamoun et al., e103 (Nov.
2000) y S.I. Hayachi, Circulation 102: 1710 (2000)).
La inflamación y los procesos inflamatorios
juegan un papel principal en la patofisiología de numerosas
enfermedades y estados. Estados del cerebro en donde se encontraron
niveles incrementados de selectina y que, por tanto, implican
eventos patofisiológicos mediados por selectina, incluyen daño
cerebral traumático severo, esclerosis múltiple,
recidiva-remitiva, oclusión de arterias cerebrales,
isquemia y apoplejía. Estados del corazón en donde se sugiere que
las selectinas juegan un papel incluyen infarto de miocardio agudo,
daño arterial, tal como el producido por angioplastia, e isquemia.
Similarmente, las selectinas están involucradas en estados de los
riñones, tales como daño renal derivado de isquemia y reperfusión,
y fallo renal. Además, las selectinas parecen jugar un papel en el
rechazo de transplantes de órganos, isquemia fría, shock
hemorrágico, shock séptico, metástasis tumoral, inflamación crónica,
artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino,
aterosclerosis, restenosis, angiogénesis, coagulación intravascular
diseminada, síndrome de molestia respiratoria en adultos y shock
circulatorio.
De este modo, parecería factible mejorar estos
y otros estados que implican la activación de células endoteliales y
leucocitos y, concretamente, la movilización y expresión de
P-selectina mediante la interrupción específica de
las cascadas de P-selectina. Esto puede realizarse,
por ejemplo, mediante la administración de ligandos que se unen
selectivamente a P-selectina humana, pero que no
poseen su bioactividad. Mediante este método, la
P-selectina movilizada podría ser inactivada
evitándose así el daño en tejidos inducido por leucocitos.
Potencialmente, podría conseguirse el mismo efecto mediante terapia
génica, siempre que el ligando o antagonista de
P-selectina sea un péptido o un péptido modificado.
De acuerdo con este método, las células somáticas de una persona
necesitada de la terapia serían transfectadas con un vector de
expresión que porta una secuencia de DNA que codifica un antagonista
de P-selectina.
Los ligandos o antagonistas de
P-selectina pueden también utilizarse para la
prevención de enfermedades y estados como las expuestas
anteriormente. Además, dichos ligandos pueden también ser útiles en
la diagnosis in vivo o in vitro de dichas
enfermedades.
En los últimos años se han realizado varios
intentos para identificar o crear dichos ligandos selectivos a
P-selectina. Hasta ahora, han sido ensayadas varias
sustancias, pero ningún estudio clínico ha aportado todavía una
evidencia conclusiva de que cualquiera de estos compuestos produzca
los efectos clínicos deseados al tiempo que sean tolerables en
términos de efectos secundarios.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo, se encontraron anticuerpos a
P-selectina que eran producidos y ensayados en
modelos con animales, para proteger los riñones frente al daño por
isquemia-reperfusión (H.C. Rabb et al., JASN
5: 907 (1997) y US-A-6.033.667). En
otro estudio, se utilizó una forma soluble recombinante de
ligando-1 de glicoproteína de
P-selectina (rPSGL-Ig) para inhibir
la trombosis en gatos (M.J. Eppihimer et al.,
Arteriosclerosis, Thrombosis, y Vascular Biology 20: 2483 (2000)).
La WO-96/039309 describe estructuras de
oligosacáridos que son ligandos a E- y P-selectina.
La WO-99/41363 describe proteínas de tipo
podocalixina que se unen a selectinas. La
WO-00/41711 describe varios péptidos o secuencias
de péptidos más pequeñas que se unen a miembros de la familia de
selectinas humanas; la mayoría de las secuencias comprenden una o
más unidades de leucina o isoleucina.
Como otra medida para inhibir la cascada de
P-selectina, se encontraron varios péptidos
derivados del dominio de lectina de la familia de selectinas que
inhibía la adhesión de neutrófilos a P-selectina
(por ejemplo, US-A-6.111.065 y
US-A-5.916.876); estos péptidos se
unen probablemente a receptores de P-selectina en
leucocitos.
En WO-94/05269 se describen
péptidos que inhiben la unión de selectina tales como
P-selectina, E-selectina y
L-selectina. Estos péptidos contienen, como su
región de núcleo, porciones de la secuencia de 11-18
aminoácidos de P-selectina,
E-selectina o L-selectina. Además,
la WO-95/31210 se refiere a péptidos y compuestos
que unen selectinas incluyendo la molécula de adhesión 1
endotelio-leucocito (ELAM-1). Estos
péptidos se utilizan para bloquear la adhesión de leucocitos a las
selectinas, es decir, especialmente E-selectina,
pero también P-selectina o
L-selectina, con la finalidad de inhibir la
inflamación.
\vskip1.000000\baselineskip
En la solicitud de Patente Europea no
pre-publicada No. 01203314.8 se han descrito
compuestos que comprenden la secuencia peptídica
XA_{x}A_{3}A_{1}A_{2}A_{1}Y o un equivalente funcional de
la misma y que tienen afinidad selectiva a
P-selectina humana, en donde:
A_{1} es una D- o L-cisteína
(C), D- o L-metionina (M), D- o
L-valina (V) o un análogo de las mismas;
A_{2} es un ácido D- o
L-aspártico (D) o un análogo de los mismos;
A_{3} es una D- o
L-fenilalanina (F), D- o L-tirosina
(Y) o D- o L-triptofano (W) o un análogo de las
mismas;
A_{x} es un D- o
L-aminoácido;
X marca el lado N-terminal de
dicha secuencia; e
Y marca el lado C-terminal de
dicha secuencia o
X e Y juntos pueden formar un sistema
cíclico.
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto EWVDV descrito en la solicitud
antes mencionada tiene afinidad por P-selectina, tal
como expresa por un valor IC_{50} de alrededor de 2 \muM. Su
tetrámero sobre estreptavidina tiene un valor IC_{50} de alrededor
de 2 \muM.
Una descripción similar se ofrece en Molenaar
et al., 2002, Blood 100, pp. 3570-3577.
A pesar de los esfuerzos antes mencionados,
existe todavía la necesidad de disponer de sustancias con afinidad
selectiva a P-selectina, que puedan utilizarse en la
preparación de composiciones farmacéuticas para la diagnosis,
prevención y tratamiento de varias enfermedades y estados que
implican la adherencia de leucocitos a células endoteliales
vasculares o a plaquetas. Para su uso in vivo sería altamente
conveniente disponer de compuestos relativamente simples con una
afinidad muy alta por P-selectina. También existe la
necesidad de ligandos de P-selectina, que puedan
utilizarse como moléculas o mitades de reconocimiento en
composiciones farmacéuticas para dirigir fármacos o material
genético a tejidos que expresan P-selectina.
Por tanto, un objeto de la invención consiste en
proporcionar compuestos con afinidad selectiva a
P-selectina humana.
En particular, un objeto de la invención
consiste en proporcionar compuestos que actúan como antagonistas o
antagonistas parciales de P-selectina.
Otro objeto de la invención consiste en
proporcionar compuestos que actúan como ligandos de reconocimiento
con la capacidad de dirigir fármacos y material genético a células
y tejidos que expresan P-selectina.
Un objeto más de la invención consiste en
proporcionar métodos para la preparación de dichos compuestos.
Otro objeto más es la presentación de usos de
dichos compuestos y de composiciones que contienen los
compuestos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La figura 1 muestra las estructuras químicas de
las mitades acilo 1-7 introducidas en el compuesto 8
de la secuencia de núcleo.
La figura 2 es una representación esquemática de
la síntesis en fase sólida de la biblioteca de compuestos 10. El
compuesto de la secuencia de núcleo S fue sintetizado empleando la
química Fmoc estándar sobre resina Tentagle S-NH2
con enlazador de HMPA. El péptido de núcleo fue derivado entonces en
el terminal N (después de la separación de Fmoc) o en el terminal C
(después de la separación selectiva del grupo DDE con hidrazina al
2%) con 7 ácidos carboxílicos diferentes (véase figura 1). Los
péptidos fueron liberados de la resina mediante escisión con TFA
para obtener la librería de compuestos 10. Fmoc,
N-(9-fluorenil)metoxi-carbonilo;
HMPA, ácido 4-hidroximetilfenoxiacético;
Boc, N-(t-butoxicarbonilo); tBu,
terc-butilo; TFA, ácido trifluoracético;
DDE,
4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo.
La figura 3 es una representación gráfica de la
capacidad de los péptidos derivados HP10-HP77 para
inhibir la unión de ligandos a P-selectina humana.
Los péptidos derivados en bruto fueron ensayados en un ensayo de
competición respecto a su capacidad para desplazar la unión de
TM11-PO a P-selectina humana. Cada
barra representa la unión de TM11-PO en presencia
del péptido derivado (5 \muM, n = 3-5). Los
péptidos son HPij codificados en donde i y j se refieren a la mitad
acilo 1-7, como se muestra en la figura 1 y unida al
terminal N y C, respectivamente. Los grupos amino
N/C-sin modificar vienen indicados por O.
Las figuras 4-6 muestran la
estructura química (figura 4A) y la actividad biológica de la
biblioteca de compuestos 14 (figuras 4B, 5C y 6D). La biblioteca de
péptidos en bruto 14 (1 \muM) fue ensayada en un ensayo de
competición de la unión de TM11-PO a
P-selectina humana. Se emplearon tres separadores
diferentes entre la mitad acilo y la secuencia de núcleo WVDV
(R_{1}): sin separador (barras blancas), un separador glicilo
(barras grises) y un separador aminobutírico (barras negras). Por
debajo de estas barras se muestra la estructura química de la
modificación acilo introducida (R_{2}).
La figura 7 muestra una representación gráfica
de la competición de la unión de
biotina-PAA-Le^{a}-SO_{3}
a P-selectina humana (\blacksquare),
P-selectina de ratón (\Box),
L-selectina humana (\ding{115}) y
E-selectina humana (\ding{116}) por el péptido 28.
Se revistieron pocillos con cada selectina (0,3 \mug/ml) y se
incubó con 0,33 \mug/ml de
biotina-PAA-Le^{a}-SO_{3}
con o sin péptido 28 como se describe en el ejemplo 3.
La figura 8 es una representación gráfica de la
competición de la unión de células HL-60 respecto a
células CHO-P por el péptido 28 (\blacksquare) o
EWVDV (\bullet). Las células CHO-P nucleadas en 96
pocillos fueron incubadas con células HL-60 marcadas
con calceína en presencia del péptido 28 o EWVDV. Los puntos de
datos son promedios de 12 puntos de datos por cuadruplicado.
Los compuestos de la presente invención tienen
afinidad selectiva a P-selectina humana y son
derivados de péptidos representados por
X(A_{x})_{m}A_{3}A_{1}A_{2}A_{1}Y, en
donde:
- -
- A_{1} es una D- o L-cisteína (C) o una D- o L-valina (V);
- -
- A_{2} es un ácido D- o L-aspártico (D);
- -
- A_{3} es una D- o L-fenilalanina (F) o un D-triptofano (W);
- -
- A_{x} es un D- o L-aminoácido seleccionado del grupo consistente en ácido glutámico (E), ácido aspártico (D), glicina (G) y cisteína (C);
- -
- X marca el lado N-terminal de dicha secuencia y es hidrógeno o un residuo que comprende de 1 a 6 D- o L-aminoácidos o análogos de los mismos;
- -
- Y marca el lado C-terminal de dicha secuencia y es -OH o un residuo que comprende de 1 a 11 D- o L-aminoácidos o análogos de los mismos; en donde X e Y juntos pueden formar un sistema cíclico; caracterizados porque cualquiera de X o Y o ambos X e Y, están sustituidos con el grupo:
- -
- R^{1}-(Z)_{n}- en donde:
- -
- Z es -CO- y en donde
- -
- R^{1} se elige entre:
- -
- un grupo alquilo (C_{2}-C_{8}) en donde al menos un átomo de C está reemplazado por un átomo de nitrógeno;
- -
- un grupo arilo (C_{6}-C_{14}) que puede estar sustituido con al menos un grupo seleccionado entre -OH o -COOH;
y en donde m y n representan
enteros elegidos independientemente entre 0 y
1.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los péptidos se definen como amidas que se
derivan de dos o más aminoácidos por combinación del grupo amino de
un ácido por el grupo carboxilo del otro (Merriam Webster Medical
Dictionary ©2001). Tal y como aquí se emplea, un péptido puede
referirse también a una estructura peptídica dentro de una molécula.
Habitualmente, los péptidos están constituidos por
L-\alpha-aminoácidos de origen
natural, que son alanina (Ala o A), arginina (Arg o R), asparagina
(Asn o N), ácido aspártico (Asp o D), cisteína (Cys o C), glutamina
(Gln o Q), ácido glutámico (Glu o E), glicina (Gly o G), histidina
(His o H), isoleucina (Ile o I), leucina (Leu o L), lisina (Lys o
K), metionina (Met o M); fenilalanina (Phe o F), prolina (Pro o P),
serina (Ser o S), treonina (Thr o T), triptofano (Trp o W), tirosina
(Tyr o Y) y valina
(Val o V).
(Val o V).
De acuerdo con la invención, las dos unidades de
A_{1} dentro de la secuencia se eligen independientemente y pueden
ser idénticas o diferentes entre sí. Con preferencia, al menos una
de las unidades de A_{1} representa valina (V). Más
preferentemente, ambas unidades de A_{1} son valina (V). En otra
modalidad, A_{1} es D- o L-cisteína (C) o valina
(V).
En particular, la invención también abarca un
método para determinar si un compuesto es capaz o no de unirse a
P-selectina humana, que comprende, sustituir en un
compuesto de acuerdo con la invención, un aminoácido por un
aminoácido conservador y determinar si el compuesto resultante es
capaz o no de unirse a dicha P-selectina. De acuerdo
con la invención, A_{2} es un ácido D- o
L-aspártico con una cadena lateral expuesta a
disolvente que porta una carga negativa a pH fisiológico.
A_{3} es un D- o L-aminoácido
con una cadena lateral aromática seleccionada del grupo consistente
en fenilalanina (F) y triptofano (W). Más preferentemente, A_{3}
es un L-aminoácido seleccionado entre este grupo.
Con suma preferencia es triptofano (W).
A_{x} es un D- o L-aminoácido,
como se ha definido anteriormente, seleccionado del grupo
consistente en ácido glutámico (E), ácido aspártico (D), glicina
(G) y cisteína (C). En una de las modalidades preferidas, A_{x} es
un ácido D- o L-glutámico (E).
Ha de observarse que las dos unidades de A_{1}
se eligen de manera independiente, es decir, pueden ser idénticas o
diferentes entre sí.
X marca el grupo N-terminal. X
puede ser simplemente un hidrógeno. En otra modalidad, X es una
secuencia de hasta 6 D- o L-aminoácidos o análogos
de los mismos. El tipo de aminoácido o aminoácidos no deberá
afectar, como es lógico, por ejemplo, cambiando la configuración del
péptido o cambiando la orientación espacial del ácido carboxílico
terminal con respecto al péptido de núcleo, al reconocimiento por
P-selectina de tal manera que deje de obtenerse ya
el efecto perseguido. Análogos adecuados incluyen ácidos
carboxílicos amino-sustituidos, por ejemplo ácido
aminociclohexanoico, ácido aminobenzoico y ácido aminocaproico.
Y marca el grupo C-terminal. Y
puede ser un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, Y es un
residuo que comprende de 1 a 11 D- o L-aminoácidos
que portan un grupo hidroxilo terminal. El reconocimiento por
P-selectina es más tolerante a sustituyentes en el
terminal C. También es preferible que en Y esté presente al menos un
aminoácido con una cadena lateral cargada negativamente, con
preferencia separado del resto de la secuencia de
X(A_{x})_{m}A_{3}A_{1}A_{2}A_{1} por 1 a 3
aminoácidos. En una modalidad particularmente preferida de la
invención, Y es D- o L-lisina (K) o comprende D- o
L-lisina (K).
El compuesto de la invención puede poseer una
espina dorsal cíclica o constreñida de otro modo. En ese caso, X+Y
juntos pueden estar enlazados adecuadamente a través de un enlace
S-S, aunque, como es lógico, también pueden estar
presentes otros tipos de enlaces (químicos), tal como un enlace
amida, un enlace tioéter, un enlace carbamato o un enlace éster.
La longitud del grupo X+Y no resulta
particularmente crítica en tanto en cuanto que la secuencia de
núcleo sea reconocida por P-selectina. En general,
la longitud mínima de X+Y se corresponde con la longitud de
5-6 aminoácidos.
El grupo R^{1}-(Z)_{n}- con el cual X
o Y o ambos X e Y independientemente, están sustituidos, se puede
seleccionar entre grupos R-CO en donde R es un grupo
arilo o heteroalquilo. El grupo heteroalquilo tiene preferentemente
de 2 a 8 átomos de carbono, al menos uno de los cuales está
reemplazado por un átomo de nitrógeno. Un grupo arilo tiene
preferentemente de 6 a 14 átomos de carbono y el grupo puede estar
sustituido con al menos un grupo seleccionado entre OH o COOH.
Ejemplos de compuestos son aquellos en donde Z
es -CO- y R^{1} representa los siguientes grupos:
4-hidroxifenilcarbonilo,
3,5-dihidroxifenilcarbonilo,
3-hidroxi-5-carboniloxifenilcarbonilo,
3,4,5-tri-metoxifenilcarbonilo,
4-carboxifenilcarbonilo, ácido
3-carbonilbutírico,
3-carboxifenilcarbonilo. Sin embargo, los grupos
especialmente preferidos son grupos acilo y más particularmente
grupos 3,5-dicarboxifenilcarbonilo y
3,4,5-trihidroxifenilcarbonilo.
Además, también se prefieren modificaciones
basadas en ácido tánico, ácido cafeínico, grupos oligohidroxiarilo y
grupos oligocarboxiarilo, así como derivados de los mismos,
especialmente en el grupo X. Sin embargo, el grupo
3,4,5-trihidroxifenilcarbonilo se puede emplear
convenientemente tanto en el grupo X como en el grupo Y.
\newpage
Se asume que la modificación con
R^{1}-(Z)_{n} confiere una interacción adicional del
compuesto péptido con la cavidad de unión existente en
P-selectina, posiblemente por interacción
electrostática o formación de puentes H. Esto conduce a una ganancia
de afinidad por P-selectina.
Se obtienen muy buenos resultados para aquellos
compuestos que tienen una función amida N-terminal.
También se obtienen muy buenos resultados cuando se emplea un
enlazador entre el grupo sustituyente N-terminal y
el aminoácido A_{x} o A_{3} en la secuencia de aminoácidos de
los compuestos de la invención. Enlazadores o separadores adecuados
son glicina y ácido aminobutírico.
Los compuestos de la invención poseen espinas
dorsales lineales, ramificadas, cíclicas o constreñidas. Por
ejemplo, los péptidos con al menos dos unidades cisteína (C) pueden
ser ciclados por oxidación. Si un compuesto es ciclado por vía de
dicho enlace disulfuro, es preferible que las unidades cisteína
participantes sean miembros de X e Y, respectivamente. Las
estructuras cíclicas son, de hecho, un ejemplo de espinas dorsales
constreñidas de manera conformacional. También se pueden introducir
otros tipos de estructuras constreñidas para disminuir la
flexibilidad conformacional del compuesto. Especialmente, para esta
finalidad sirve la presencia de enlaces olefínicos o pequeñas
estructuras de anillo en la espina dorsal. Ejemplos de tales
constricciones se ofrecen en Pharmaceutical Biotechnology, Ed.
D.J.A. Crommelin y R.D. Sindelar, Harwood Academia Publishers, 1997,
p. 139f.
En una de las modalidades preferidas, los
compuestos de la invención se proporcionan como multímeros de los
péptidos derivados.
En otro tipo de multímero que puede ser creado
para formar los compuestos de la invención, se acoplan cadenas
péptidas derivadas individuales de acuerdo con la invención a una
proteína biocompatible, tal como albúmina de suero humano,
anticuerpos humanizados, liposomas, micelas, polímeros sintéticos,
nanopartículas y fagos. Los multímeros pueden también representar
péptidos derivados que están acoplados en serie entre sí por vía de
separadores, es decir, concatámeros o dentrímeros o racimos.
Los compuestos se pueden preparar en general por
los métodos ya conocidos para la preparación de péptidos y sus
derivados. Los compuestos más pequeños que solo contienen unos
cuantos aminoácidos y preferentemente no más de
30-50 unidades, se pueden preparar mediante técnicas
de ligación química y/o enzimática, utilizando la técnica clásica
en donde las reacciones tienen lugar en solución o suspensión, o
bien empleando la técnica más moderna de fase sólida, en donde el
péptido se ensambla mientras es anclado en una superficie sólida,
tal como una perla polimérica. Los compuestos más grandes se
sintetizan habitualmente mediante sintetizadores automáticos de
péptidos en fase sólida. Los compuestos obtenidos son entonces
modificados por reacción con una fuente adecuada de
R^{1}(Z)_{n}-, preferentemente un grupo
R^{1}(Z)_{n}-OH. Dicha fuente
reacciona con un grupo amino primario del compuesto péptido.
Cuando la secuencia péptida de los compuestos de
acuerdo con la invención se prepara mediante la química Fmoc
estándar y se separa el grupo Fmoc protector, el terminal N queda
inmediatamente disponible para la reacción que introduce el grupo
R^{1}(Z)_{n}-.
Cuando el terminal C no dispone de amina libre,
dicha fuente se puede hacer reaccionar con una lisina añadida, cuya
lisina puede añadirse adecuadamente como su derivado DDE. DDE es
4,4-dimetil-2,6-dioxocicloex-1-iliden)-etilo;
se puede separar de manera selectiva con hidrazina al 2% sin
afectar a los grupos protectores de cadena lateral lábiles a los
ácidos.
Algunos resúmenes más comprensivos de métodos
que pueden aplicarse en la preparación de los compuestos se
describen en: W.F. Anderson, Nature 392 Supp., 30 Abril 1998, p.
25-30; Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D.J.A.
Crommelin y R.D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p.
53-70,167-180,
123-152, 8-20; Protein Synthesis;
Methods and Protocols, Ed. R. Martin, Humana Press, 1998, p.
1-442; Solid-Phase Peptide
Synthesis, Ed. G.B. Fields, Academic Press, 1997, p.
1-780; Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford
University Press, 1997, p. 1-89.
Las sales de los derivados de los péptidos se
preparan por métodos conocidos, los cuales pueden implicar
habitualmente la mezcla del derivado del péptido con un ácido
farmacéuticamente aceptable para formar una sal de adición de
ácido, o bien con una base farmacéuticamente aceptable para formar
una sal de adición de base. Dependiendo del uso proyectado, los
ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos orgánicos e
inorgánicos, tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido
propiónico, ácido láctico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido
pirúvico, ácido succínico, ácido maleico, ácido malónico, ácido
cinámico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico,
ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico y ácido tiociánico,
que forman sales amónicas con un grupos amino libres de los
péptidos derivados. Las bases farmacéuticamente aceptables, que
forman sales carboxilato con grupos carboxílicos libres de los
péptidos derivados, incluyen etilamina, metilamina, dimetilamina,
trietilamina, isopropilamina, diisopropilamina y otras mono-, di- y
trialquilaminas, así como arilaminas.
Además, también quedan incluidos los solvatos
farmacéuticamente aceptables.
Los multímeros de los péptidos derivados de
acuerdo con la invención se pueden preparar, por ejemplo, de manera
similar a multímeros de péptidos, por ejemplo, por biotinilación de
las cadenas N-terminales y posterior complejamiento
con estreptavidina, ajustando si es necesario el método a los
compuestos específicos. Dado que la estreptavidina es capaz de unir
cuatro moléculas o conjugados de biotina con alta afinidad, mediante
este método se pueden formar complejos de péptidos tetrámeros muy
estables. Los multímeros pueden estar constituidos por péptidos
derivados idénticos o diferentes. Con preferencia, sin embargo, los
multímeros de la invención están constituidos por dos o más péptidos
derivados idénticos.
Los compuestos de la invención presentan
afinidad hacia P-selectina humana, una glicoproteína
de membrana expresada por células endoteliales vasculares y
plaquetas, que está involucrada en la adhesión de leucocitos al
endotelio y plaquetas. Las características de afinidad o unión de
los compuestos a P-selectina se puede cuantificar,
por ejemplo, en términos del valor IC_{50}. Habitualmente, un
valor IC_{50} de alrededor de 50-100 \muM o
menos sería considerado como evidencia de la afinidad y unión. Más
deseables para los ligandos son sustancias con valores IC_{50} de
alrededor de 10 \muM o menos. El valor IC_{50} más bajo
obtenible para los enlaces de tipo no covalente que juegan un papel
en las interacciones o uniones de acuerdo con la presente invención
es de alrededor de 10^{-15} M. En general, sin embargo, los
valores IC_{50} son mayores de alrededor de 10^{-12} M y en la
mayoría de los casos mayores de alrededor de 10^{-9} M.
Los compuestos de la invención presentan valores
IC_{50} que van desde valores bajos micromolares a valores bajo
nanomolares hacia P-selectina, lo cual les hace
igual de potentes aproximadamente que el ligando natural,
ligando-1 de glicoproteína de
P-selectina.
Se comprobó que los compuestos
N-terminalmente modificados de la invención eran más
eficaces (potentes y/o específicos) que los correspondientes
compuestos C-terminalmente modificados que
contienen las mismas modificaciones. Se obtuvieron resultados muy
buenos con la modificación mediante ácido
1,3,5-tricarboxílico o ácido gálico.
Además de lo anterior, los compuestos de acuerdo
con la invención pueden hacer que los péptidos sean más estables
contra proteasas, en particular contra
N-exopeptidasas, debido a la derivación. Los
compuestos pueden tener además una especificidad acentuada para
P-selectina y, por tanto, modulan una acción
farmacológica tal como la interacción entre monocitos y plaquetas,
que entre monocitos y células endoteliales y que entre células de
plaquetas y células de plaquetas. De este modo, también se pueden
disminuir los efectos secundarios potenciales. Los compuestos serán
de reactividad cruzada en muchas especies.
Otro aspecto de la invención se refiere a los
usos de los compuestos descritos. Dado que los compuestos se unen
selectivamente a P-selectina, los mismos pueden,
dependiendo de su tipo de interacción con
P-selectina después de la unión, funcionar como
antagonistas, antagonistas parcial o como simples medios de
reconocimiento para dirigir las sustancias conjugadas hacia células
y tejidos que expresan P-selectina. De este modo,
los compuestos se pueden emplear convenientemente en composiciones
farmacéuticas.
Las composiciones farmacéuticas que contienen
los compuestos de la invención pueden estar adaptadas a diversas
vías de administración, tales como parenteral, oral, transmucosal,
nasal o pulmonar. Además pueden contener agentes de direccionamiento
de fármacos, agentes mejoradores de la biodisponibilidad o
ingredientes activos distintos de los compuestos de la invención y
que proporcionan una liberación inmediata o modificada.
Tal como aquí se emplea, el término
"composición farmacéutica" se refiere a composiciones
terapéuticas y de diagnosis, así como a medicamentos y productos de
diagnosis que contienen tales composiciones. Las composiciones
terapéuticas y medicamentos se emplean para la prevención o
tratamiento de enfermedades y otros estados en mamíferos en donde es
conveniente una mejora de tales estados. Los productos de diagnosis
y composiciones de diagnosis se emplean para la diagnosis de dichas
enfermedades in vivo e in vitro.
Un uso preferido de los compuestos reside en la
preparación de composiciones terapéuticas o medicamentos para
prevenir o mejorar enfermedades y estados que involucran la
adhesión de leucocitos, tales como monocitos y neutrófilos, al
endotelio vascular y a plaquetas. Los compuestos también se pueden
emplear en composiciones para el tratamiento de enfermedades en
donde es conveniente la inhibición de la señalización intracelular
mediada por P-selectina.
Por ejemplo, las composiciones que contienen uno
o más compuestos de la invención pueden contribuir al control de
procesos inflamatorios mediados por leucocitos. Se sabe que los
leucocitos activados liberan moléculas tóxicas que pueden dañar el
tejido normal. Estas respuestas inflamatorias, alguna de las cuales
implican también la activación de plaquetas mediada por
P-selectina, forman parte de varios estados
patológicos, tales como rechazo de transplantes, isquemia fría,
shock hemorrágico, shock séptico, metástasis tumoral, trombosis,
inflamación crónica, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria
del intestino, aterosclerosis, restenosis, angiogénesis, coagulación
intravascular diseminada, síndrome de molestia respiratoria en
adultos, shock circulatorio, daño cerebral traumático severo,
esclerosis múltiple recidiva-remitiva, oclusión de
arterias cerebrales, isquemia, apoplejía, infarto de miocardio
agudo, trombosis profunda en venas, daño arterial, tal como el
producido por angioplastia, isquemia miocardial, daño renal
procedente de isquemia y reperfusión, y fallo renal.
En otra modalidad, los compuestos se emplean en
la preparación de composiciones o productos de diagnosis. Dichas
composiciones se pueden emplear en ensayos in vitro para
cuantificar concentraciones de P-selectina en
fluidos corporales, como marcadores para las enfermedades y estados
que anteriormente se han descrito. También se pueden utilizar en
procedimientos de diagnosis por formación de imágenes in
vivo para controlar aterosclerosis mediada por
P-selectina, aneurismas, restenosis después de
angioplastia coronaria transluminal percutánea (restenosis
post-PTCA) y otros estados seleccionados entre
aquellos en donde se moviliza P-selectina. Como una
opción para este uso, se puede conjugar un compuesto de acuerdo con
la invención con un quelante, el cual se compleja posteriormente con
un marcador isotrópico que es detectable mediante el sistema de
control elegido.
Otro uso de los compuestos es como una
herramienta en investigación. Por ejemplo, se pueden emplear para
ensayar la afinidad de unión de moléculas a
P-selectina. Para realizar este método de ensayo,
la P-selectina deberá ponerse en contacto e
incubarse con una molécula a ensayar respecto a la afinidad de
unión y con un compuesto de la invención. Una menor unión del
compuesto de la invención indicaría una afinidad de la molécula a
P-selectina.
Los compuestos se pueden emplear también como
moléculas o conjugados de reconocimiento en composiciones
farmacéuticas para dirigir fármacos o material genético a tejidos
que expresan P-selectina. Como conjugados, los
compuestos se pueden acoplar directamente con moléculas activas o
ácidos nucleicos que han de suministrarse a dichos tejidos.
Alternativamente, se pueden incorporar en o anclar sobre la
superficie de liposomas u otras vesículas lípidas, gotitas en
emulsión, polímeros, nano- o micropartículas para obtener vehículos
dirigidos para fármacos o material genético que ha de suministrarse
a tejidos que expresan P-selectina.
Las composiciones farmacéuticas contienen
preferentemente uno o más compuestos con afinidad para
P-selectina como aquí se describe y al menos un
vehículo o excipiente. Tal como aquí se emplea, un vehículo o
excipiente es cualquier sustancia o mezcla de sustancias
farmacéuticamente aceptables que no presentan actividad
farmacológica sustancial y que pueden utilizarse como un vehículo o
como una sustancia auxiliar para formular un compuesto en una forma
de dosificación que es estable y de fácil administración. Ejemplos
de excipientes farmacéuticamente aceptables pueden encontrarse en
las monografías de todas las farmacopeas principales.
En una modalidad, la composición se formula y
elabora para inyección parenteral, preferentemente para inyección
intravascular, tal como intravenosa o
intra-arterial, pero también para administración
intramuscular, subcutánea, intralesional, intraperitoneal u otras
vías de administración parenteral. Los mismos principios que
gobiernan la formulación de otros fármacos para estas vías de
administración, indicarán también a los expertos en la materia la
forma en la cual preparar dichas composiciones. Por ejemplo, uno de
los requisitos de las formas de dosificación parenteral es su
esterilidad. Otros requisitos pueden encontrarse en todas las
farmacopeas principales, tal como en USP 24, en la monografía
"General Requirements for Tests and Assays. 1. Injections", p.
1775-1777. Para aumentar la estabilidad de una
formulación parenteral, puede ser necesario proporcionar una forma
de dosificación en seco que debe ser reconstituida antes de que
pueda ser administrada. Un ejemplo de dicha forma de dosificación
es una formulación secada por congelación o liofilizada.
Puede ser deseable administrar un compuesto de
la invención como una forma de dosificación parenteral de liberación
controlada para evitar frecuentes inyecciones y para mejorar la
eficacia y conveniencia de la terapia. Se conocen varios métodos de
preparación de tales formulaciones depot. La liberación prolongada
puede ser conseguida mediante implantes sólidos, nanopartículas,
nanocápsulas, micropartículas, microcápsulas, emulsiones,
suspensiones, soluciones oleosas, liposomas o estructuras
similares.
Los excipientes que resultan particularmente
útiles para la preparación de formulaciones parenterales son
disolventes, codisolventes y vehículos líquidos o semisólidos,
tales como agua estéril, etanol, glicerol, propilenglicol,
polietilenglico, butanodiol, aceites grasos, triglicéridos de
cadena corta y media, lecitina, derivados de
polioxietileno-aceite de ricino; sustancias para
ajustar la osmolalidad y pH, tales como azúcares, en especial
glucosa, alcoholes de azúcares, en especial manitol, cloruro
sódico, carbonato sódico, ácido cítrico, acetato, fosfato, ácido
fosfórico, ácido clorhídrico, hidróxido sódico, etc;
estabilizantes, antioxidantes y conservantes, tales como ácido
ascórbico, sulfito sódico o hidrosulfito sódico, EDTA, alcohol
bencílico, etc; otros excipientes y auxiliares de la liofilización,
tales como albúmina, dextrano, etc.
Alternativamente, las composiciones
farmacéuticas pueden ser diseñadas para administración oral y
elaboradas en consecuencia. Las formas de dosificación oral
adecuadas incluyen comprimidos, cápsulas duras, cápsulas blandas,
polvos, gránulos, formas de dosificación que se desintegran por vía
oral, jarabes, gotas, suspensiones, comprimidos efervescentes,
comprimidos masticables, películas orales, formas de dosificación
liofilizadas, formas de dosificación de liberación sostenida y
formas de dosificación de liberación controlada. En una de las
modalidades preferidas, la forma de dosificación oral es una forma
de dosificación sólida revestida entéricamente para proporcionar
protección del compuesto frente al entorno ácido y proteolítico del
estómago.
También puede ser conveniente administrar un
compuesto de la invención en una forma de dosificación transmucosal.
Esta vía de administración es no invasiva y respetuosa con el
paciente; al mismo tiempo, puede conducir a una biodisponibilidad
mejorada del compuesto en comparación con la administración oral,
especialmente si el compuesto no es estable en los fluidos del
sistema digestivo o si es demasiado grande para ser absorbido del
intestino de un modo eficaz. La administración transmucosal es
posible, por ejemplo, por medio de formas de dosificación nasal,
bucal, sublingual, gingival o vaginal. Estas formas de dosificación
se pueden preparar por técnicas conocidas; se pueden formular para
representar gotas o pulverizaciones nasales, insertos, películas,
parches, geles, ungüentos o comprimidos. Con preferencia, los
excipientes usados para una forma de dosificación transmucosal
incluyen una o más sustancias que proporcionan mucoadhesión,
prolongando así el tiempo de contacto de la forma de dosificación
con el sitio de absorción y aumentando con ello potencialmente el
grado de absorción.
En otra modalidad, los compuestos se administran
por vía pulmonar empleando un inhalador de dosis medidas, un
nebulizador, una pulverización en aerosol o un inhalador de polvo
seco. Se pueden preparar formulaciones adecuadas mediante métodos y
técnicas conocidos. En ciertos casos, también puede ser factible la
administración transdérmica, rectal u ocular.
Puede resultar ventajoso utilizar métodos
avanzados de suministro o direccionamiento de fármacos para
administrar un compuesto de la invención de un modo más eficaz. Por
ejemplo, si se elige una vía de administración no parenteral, una
forma de dosificación adecuada puede contener un agente que mejora
la biodisponibilidad, el cual puede ser cualquier sustancia o mezcla
de sustancias que aumentan la disponibilidad del compuesto. Esto se
puede lograr, por ejemplo, mediante la protección del compuesto
frente a la degradación, tal como por un inhibidor de enzimas o un
antioxidante. Más preferentemente, el agente mejorador aumenta la
biodisponibilidad del compuesto al incrementar la permeabilidad de
la barrera de absorción que habitualmente es una mucosa. Los
realzadores de la penetración pueden actuar por vía de varios
mecanismos; algunos aumentan la fluidez de las membranas mucosas,
mientras que otros abren o amplían las uniones de separación entre
las células mucosales. Todavía, otros reducen la viscosidad de la
mucosa que recubre la capa de células mucosales. Entre los
realzadores de la biodisponibilidad preferidos se encuentran las
sustancias anfífilas tales como derivados de ácido cólico,
fosfolípidos, etanol, ácidos grasos, ácido oleico, derivados de
ácidos grasos, EDTA, carbómeros, policarbófilos y quitosano.
Según otro aspecto, las moléculas capaces de
unirse a los compuestos descritos anteriormente se encuentran dentro
del alcance de la invención. Por ejemplo, se puede aplicar la
tecnología de hibridación convencional para preparar anticuerpos
monoclonales específicos a un compuesto. Se dispone de otras
técnicas para diseñar y preparar moléculas más pequeñas capaces de
unirse a un compuesto de la invención.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente
la invención, pero ha de entenderse que los mismos no limitan de
manera alguna el alcance de las modalidades aquí ofrecidas.
El compuesto de secuencia de núcleo 9
(FmocHN-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Val-Asp(OtBu)-Val-Lys(DDE)-GABA-HMPA-resina;
véase figura 1) fue sintetizado en un sintetizador de péptidos
Applied Biosystems 9050 (Warrington, UK) usando la química Fmoc
convencional. En términos resumidos, se proporcionó Tentagel
S-NH2 (carga 0,26 mmol/g) con ácido
4-hidroximetilfenoxiacético (HMPA) como enlazador,
dando como resultando el compuesto 8 (véase figura 1). Se unió
Fmoc-GABA-OH (10 eq.) a la
HMPA-resina 8 con la intervención de
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 5 eq.) y
4-dimeitlaminopiridina (DMPA, 0,5 eq.). Todos los
otros aminoácidos, con protección de la cadena lateral lábil a los
ácidos si es necesario, se unieron por acoplamiento en presencia de
HOBt/TBTU/Dipea (4/4/8 eq.). Después del acoplamiento, la resina se
lavó con DMF, isopropanol y dietiléter y luego se secó.
La síntesis en fase sólida de la biblioteca del
compuesto 10 (véase figura 1) se llevó a cabo empleando un sistema
Flexchem® (Robbins Scientific, Sunnyvale U.S.A.). Después de la
separación del grupo Fmoc N-terminal del compuesto
9 mediante piperidina al 20% en DMF, la resina se lavó (DMF) y se
secó. La resina fue distribuida en cantidades de 10 mg sobre una
placa de filtración de 48 pocillos resistente a los disolventes.
Después de lavar con DMF, se añadió una mezcla del ácido
carboxílico deseado (40 eq.), BOP (20 eq.), HOBt (20 eq.) y NMM
(100 eq.) (volumen total 300 ml) y la resina suspendida se incubó
durante 3 horas bajo transpiración continua con N_{2}. A
continuación, la resina se lavó con DMF y se incubó tres veces
durante 3 minutos con hidrazina monohidratada (2% en DMF) para
separar el grupo DDE
(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo).
Después de lavar con DMF, se añadió una mezcla del segundo ácido
carboxílico, BOP, HOBt y NMM (las mismas cantidades que las
descritas anteriormente) y se incubó una vez más de nuevo durante 3
horas. Los péptidos derivados, que únicamente fueron modificados en
la lisina C-terminal (HP01-HP07
véase a continuación), se N-bocularon con
dicarbonato de di-t-butilo
((t-Boc)_{2}O; 0,25 M) y Dipea (0,125 M en
NMP) antes de la reacción para proteger la función amina
N-terminal. Después de la separación del disolvente,
los péptidos se escindieron de la resina con una mezcla de ácido
trifluoracético (TFA), triisopropilsilano (TIS) y agua (95:2,5:2,5
v/v/v). Cada muestra fue liofilizada y guardada a -20ºC hasta su
uso.
Los péptidos derivados 11-13,
biblioteca del compuesto 14 y péptidos derivados
27-33 se prepararon de la misma manera que la
descrita para la biblioteca 10 a partir de la secuencia de núcleo
unida a resina
FmocHN-Trp(Boc)-Val-Asp(OtBu)-Val-HMPA-resina.
El péptido derivado 11 fue acetilado empleando anhídrido acético
(0,25 M) y Dipea (0,125 M) en NMP.
Los compuestos de acuerdo con la invención,
preparados como en los ejemplos 1, 2 y 3 y algunos compuestos
péptidos de referencia, fueron ensayados respecto a su capacidad
para inhibir la unión de TM11-PO a
P-selectina. En primer lugar, se preparó
TM11-PO, un complejo tetrámero de TM11/estrepPO, que
previamente se había comprobado que se unía con alta afinidad y
especificidad a P-selectina humana (Molenaar et
al., Blood 2002, 100, 3570-3577), mediante
incubación de estreptavidina-peroxidasa
(estrep-PO (Amersham Life Science, Little Chalfont,
United Kingdom), 8,4 ml, 2,0 mM) y TM11-biotina
(biotina-CDVEWVDVSSEWDLPC (sintetizado por Dr. Van
der Zee, Department of Immunology, University of Utrecht, Utrecht,
the Netherlands), 1,5 ml, 190 mM) durante 2 horas a temperatura
ambiente en un tampón de ensayo (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM
CaCl_{2}, pH 7,4). Para los estudios de competición, una placa de
microvaloración de 96 pocillos (alta unión, fondo plano, Costar,
Coming, U.S.A.) se revistió durante la noche a 4ºC con 10 mg/ml de
IgG de cabra antihumana (específica a Fc)
(Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, the Netherlands) en
tampón de revestimiento (50 mM NaHCO_{3}, pH 9,6). A continuación,
los pocillos fueron lavados con tampón de ensayo e incubados
durante 1 hora a 37ºC con tampón de bloqueo (3% BSA en tampón de
ensayo). Después de lavar con tampón de ensayo, los pocillos se
incubaron durante 2 horas a 37ºC con quimera IgG-Fc
de P-selectina humana (R&D Systems Europe Ltd.,
Abingdon, United Kingdom) (0,3 mg/ml). A continuación, los pocillos
se lavaron con tampón de ensayo y se incubaron durante 1 hora a 4ºC
con el complejo de TM11-PO. Los pocillos se lavaron
seis veces con tampón de lavado (0,1% Tween 20 en tampón de
ensayo). Se añadió 3,3',5,5'-tetrametilbenzamidina
(TMB)/peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) (Pierce, Rochford,
U.S.A.) y los pocillos se incubaron a temperatura
ambiente durante 15 minutos. La reacción se detuvo por adición de 2 M H_{2}SO_{4} y se midió la absorbancia a 450 nm.
ambiente durante 15 minutos. La reacción se detuvo por adición de 2 M H_{2}SO_{4} y se midió la absorbancia a 450 nm.
Respecto a los resultados véase las tablas
siguientes y la figura 3.
Los péptidos derivados son HPij
codificado en donde i y j se refieren a las mitades
acilo R^{1} y R^{2} unidas al terminal N y terminal C,
respectivamente, de fórmula 10 (figura 1). El grupo amino sin
modificar viene indicado por 0. Las mitades acilo 1 a 7 se muestran
en la figura 2.
La afinidad de los compuestos fue confirmada
mediante un ensayo de adhesión celular en donde células de ovario de
hámster chino que expresan P-selectina humana fueron
incubadas con células HL60 que expresan PSGL-1 en
presencia de cantidades valoradas de los compuestos.
Para poder ensayar la unión de los compuestos de
acuerdo con la invención también a otros miembros de la familia de
selectinas (es decir, E- y L-selectina), se utilizó,
como ligando en el ensayo de competición,
biotina-PAA-Le^{a}-SO_{3}H
(Synthesone, Munich, Germany) en lugar de TM11-PO.
Este polímero a base de poliacrilamida (PAA) con grupos
sulfo-lewis A unidos, es un ligando de selectina ya
establecido.
Experimentalmente, se utilizó el mismo
procedimiento que en el ejemplo 1, pero con las siguientes
diferencias. Después del lavado con el tampón de ensayo, los
pocillos se incubaron durante 2 horas a 37ºC con quimera
IgG-Fc de P-selectina humana,
quimera IgG-Fc de P-selectina de
ratón, quimera IgG-Fc de L-selectina
humana y quimera IgG-Fc de
E-selectina humana respectivamente (todas ellas de
R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, United Kingdom) (0,3 mg/ml).
A continuación, los pocillos de la placa de microvaloración se
incubaron con
biotina-PAA-Le^{a}-SO_{3}H
(0,33 mg/ml) durante 2 horas a 37ºC, en lugar de con el complejo
TM11-PO.
Respecto a los resultados, véase la figura
7.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células de ovario de hámster chino (CHO),
transfectadas de forma estable con P-selectina
humana (CHO-P), fueron donadas por el Dr. Modderman
(University of Amsterdam, Amsterdam, the Netherlands). Las células
se hicieron crecer en DMEM (Bio Whittaker Europe, Verviers,
Belgium) conteniendo 10% de suero vacuno fetal (FCS) (Bio
Whittaker), 5 mM de L-glutamina, 20.000 unidades de
penicilina/estreptomicina (Bio Whittaker) y 5 mM de aminoácidos no
esenciales (Gibco, Paisley, United Kingdom). Los matraces con
células fueron incubados a 37ºC en 5% de CO_{2} durante 3 o 4 días
hasta que las células habían crecido casi hasta la confluencia.
Las células HL60 procedían de ATCC y se hicieron
crecer en medio RPMI 1640 (Bio Whittaker) con 10% de FCS, 5 mM de
L-glutamina y 20.000 unidades de
penicilina/estreptomicina.
Las células HL-60 fueron
marcadas de forma fluorescente por incubación durante 30 minutos a
37ºC con 5 mM de calceína-AM (Molecular Probes,
Leiden, The Netherlands) en RPMI. Estas células (50.000/pocillo) se
añadieron a células CHO cultivadas que expresan
P-selectina (células CHO-P,
cultivadas en DMEM con 10% de FCS, 5 mM de aminoácidos no
esenciales, 5 mM de L-glutamina y 20.000 unidades
de penicilina/estreptomicina), tras lo cual se germinaron en placas
de 96 pocillos en presencia o ausencia de los antagonistas de
P-selectina (1 h, 4ºC). Después de un lavado suave
con RPMI, se midió la fluorescencia asociada con
CHO-P (\lambda_{exc} 485/ \lambda_{cm} 530
nm).
Respecto a los resultados, véase la figura
8.
Claims (25)
1. Un compuesto con afinidad a
P-selectina humana, que es un derivado de un péptido
representado por la secuencia
X(A_{x})_{m}A_{3}A_{1}A_{2}A_{1}Y, en
donde:
- -
- A_{1} es una D- o L-cisteína (C) o una D- o L-valina (V);
- -
- A_{2} es un ácido D- o L-aspártico (D);
- -
- A_{3} es una D- o L-fenilalanina (F) o un D-triptofano (W);
- -
- A_{x} es un D- o L-aminoácido seleccionado del grupo consistente en ácido glutámico (E), ácido aspártico (D), glicina (G) y cisteína (C);
- -
- X marca el lado N-terminal de dicha secuencia y es hidrógeno o un residuo que comprende de 1 a 6 D- o L-aminoácidos o análogos de los mismos;
- -
- Y marca el lado C-terminal de dicha secuencia y es -OH o un residuo que comprende de 1 a 11 D- o L-aminoácidos o análogos de los mismos;
en donde X e Y juntos pueden formar un sistema
cíclico; caracterizado porque al menos uno de X e Y o X + Y
están sustituidos con el grupo:
- -
- R^{1}-(Z)_{n}- en donde:
- -
- Z es -CO- y en donde
- -
- R^{1} se elige entre:
- -
- un grupo alquilo (C_{2}-C_{8}) en donde al menos un átomo de C está reemplazado por un átomo de nitrógeno;
- -
- un grupo arilo (C_{6}-C_{14}) que puede estar sustituido con al menos un grupo seleccionado entre -OH o -COOH;
y en donde m y n representan
enteros elegidos independientemente entre 0 y
1.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un compuesto según la reivindicación 1 en
donde A_{x} representa ácido D- o L-glutámico (E)
o ácido D- o L-aspártico.
3. Un compuesto según la reivindicación 1 o 2,
en donde A_{1} representa D- o L-valina (V).
4. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde A_{3} es D- o
L-triptofano (W).
5. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde Y es un residuo que comprende
D- o L-lisina.
6. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde R^{1} es fenilo insustituido
o fenilo sustituido con al menos un sustituyente como se ha definido
en la reivindicación 1.
7. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde n es 0 y R^{1} es
3,4,5-trihidroxifenilcarbonilo o
3,5-dicarboxifenilcarbonilo.
8. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde X no comprende aminoácidos e Y
comprende D- o L-lisina.
9. Un compuesto según la reivindicación 8, en
donde n es 0 y R^{1} es
3,4,5-trihidroxifenilcarbonilo o
3,5-dicarboxifenilcarbonilo.
10. Un compuesto según la reivindicación 1, en
donde m es 0, en donde Z es -CO- y en donde Z está unido a Y por vía
de un separador de D- o L-glicina o de ácido
aminobutírico.
11. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende una estructura de espina
dorsal cíclica o constreñida.
12. Una composición que comprende uno o más
compuestos según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
\newpage
13. Un método para la preparación de un
compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que
comprende una secuencia de etapas en donde monómeros de aminoácidos,
oligómeros de aminoácidos o mono- u oligómeros de análogos o
productos miméticos de aminoácidos se ensamblan mediante ligación
química o enzimática, y en donde dichas etapas se llevan a cabo en
fase líquida y/o en la interfase respecto a una fase sólida
funcionalizada.
14. Un método según la reivindicación 13, que
comprende reaccionar el enlazador HMPA de fórmula 8 (figura 1)
mediante la química Fmoc convencional, para producir un compuesto de
la secuencia
X(A_{x})_{m}A_{3}A_{1}A_{2}A_{1}Y en donde
X, A_{x}, A_{3}, A_{1}, A_{2}, Y y m se definen como en la
reivindicación 1, y en donde los grupos amino están inicialmente
protegidos mediante grupos protectores, y se introduce
R-CO mediante reemplazamiento de los grupos
protectores mediante el uso de métodos convencionales.
15. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 para su uso en terapia o diagnosis.
16. Uso de un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 en la preparación de un medicamento para
inhibir la unión de leucocitos a plaquetas y/o células
endoteliales.
17. Uso según la reivindicación 15 o 16 en la
preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención o
diagnosis de trastornos inflamatorios crónicos, artritis reumatoide,
enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple,
aterosclerosis, restenosis, isquemia, daño por reperfusión
incluyendo fallo renal, metástasis tumoral, sepsis bacteriana,
coagulación intravascular diseminada, síndrome de molestia
respiratoria en adultos, apoplejía, angiogénesis, rechace de
transplantes, trombosis o shock circulatorio.
18. Composición farmacéutica que comprende un
compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y uno o
más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
19. Composición farmacéutica según la
reivindicación 18, formulada y elaborada para administración
parenteral, preferentemente para inyección intravascular,
intramuscular, subcutánea o intralesional.
20. Composición farmacéutica según la
reivindicación 18, formulada y elaborada para administración oral,
preferentemente en forma de un comprimido, una cápsula, gránulos,
una forma de dosificación sólida entérica, una forma de dosificación
sólida que aporta una liberación sostenida o controlada o una forma
de dosificación que se desintegra por vía oral.
21. Composición farmacéutica según la
reivindicación 18, formulada y elaborada para administración
transmucosal, tal como administración nasal, bucal, sublingual o
vaginal.
22. Composición farmacéutica según la
reivindicación 18, formulada y elaborada para administración
pulmonar a través de un inhalador de dosis medidas, un nebulizador,
un dispensador de pulverización en aerosol o un inhalador de polvo
seco.
23. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 18 a 22, que comprende además un agente para
dirigir fármacos y/o un agente que mejora la biodisponibilidad.
24. Un método para determinar si una molécula
comprende o no afinidad de unión para P-selectina,
que comprende poner en contacto P-selectina con
dicha molécula y con un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, y determinar si la unión de dicho compuesto
a dicha P-selectina se reduce o no.
25. Una molécula de unión capaz de unir
específicamente un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, que comprende un anticuerpo o una parte
funcional del mismo.
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