DE60024054T2 - Materialien und verfahren zum herstellen von verbesserten mizellenzusammensetzungen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen biologisch aktive Verbindungen und insbesondere Verbindungen, Peptide, Proteine, Fragmente, Analoga und Modulatoren derselben, die amphipathisch sind, d. h. sowohl hydrophile als auch hydrophobe Bereiche aufweisen. Speziell werden verbesserte Verfahren für die Lieferung und Darbietung von amphipathischen Peptiden, Proteinen, Fragmenten, Analoga und Modulatoren derselben in Assoziation mit Micellen für diagnostische, therapeutische, kosmetische und organische Gewebe- und Zellkonservierungsverwendungen bereitgestellt. Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren für die Lieferung von Verbindungen bereit, die in einer wässrigen Lösung unlöslich sind. Insbesondere werden die Verfahren bereitgestellt, um sterisch stabilisierte, kristalline Produkte herzustellen, die von einer kristallisierten unlöslichen Verbindung, beschichtet mit einer Lipidoberfläche, umfaßt sind.
  • Von besonderem Interesse sind die biologisch aktiven, amphipathischen Peptide, die Mitglieder der Familie der Peptidverbindungen sind, die einschließt, jedoch nicht begrenzt ist auf vasoaktives Intestinalpeptid (VIP), Wachstumshormonfreisetzungsfaktor (GRF), Peptidhistidinisoleucin (PHI), Peptidhistidinmethionin (PHM), Hypophysenadenylatcyclase aktivierendes Peptid (PACAP), Mageninhibitionshormon (GIP), Hemodermin, das Wachstumshormonfreisetzungshormon (GHRH), Sauvagin und Urotensin I, Secretin, Glucagon, Galanin, Endothelin, Calcitonin, α1-Proteinaseinhibitor, Angiotensin II, Corticotropinfreisetzungsfaktor, antibakterielle Peptide und Proteine im allgemeinen, oberflächenaktive Peptide und Proteine, α-MSH, Adrenolmedullin, ANF, IGF-1, α2-Amylin, Orphanin und Orexin. Insbesondere betrifft die Erfindung verbesserte therapeutische Verfahren zum Liefern von Peptiden der VIP/GRF-Familie von Peptiden, ebenso wie anderen amphipathischen Peptiden, zu gezielten Geweben durch Verwendung von verbesserten Micellenzusammensetzungen, die ein Mitglied der VIP/GRF-Familie von Peptiden, amphipathischen Peptiden im allgemeinen, Proteinen und biologisch aktiven Analoga, Fragmenten und Modulatoren derselben umfassen.
  • VIP ist ein 28-Aminosäure-Neuropeptid, das bekannt ist, ein breites Profil an biologischen Wirkungen zu zeigen und mehrere Signalumwandlungswege zu aktivieren. Siehe Said, Peptides 5 (Ergänzung 1): 149–150 (1984) und Paul und Ebadi, Neurochem. Int. 23.197–214 (1993). Eine Schiff-Edmundson-Projektion von VIP als eine π-Helix zeigt eine Segregation von apolaren und polaren Resten auf den gegenüberliegenden Flächen der Helix, und daß dieser amphipathische Charakter ebenfalls erwiesen ist, wenn VIP als eine verdrehte α-Helix modeliert wird, was in Musso et al., Biochemistry 27:8147–8181 (1988) berichtet wird. Eine Korrelation zwischen der helixbildenden Tendenz von VIP-Analoga und deren biologischer Aktivität wird in Bodanszky et al., Bioorgan. Chem. 3:133–140 (1974) beschrieben. In reinem Wasser sind die spektralen Eigenschaften von VIP mit denjenigen einer zufälligen Wicklung konsistent. Jedoch induzieren organische Lösungsmittel und anionische Lipide eine helicale Information im Molekül. Siehe Robinson et at., Biopolymers 21:1217–1228 (1983); Hamed et. al., Biopolymers 22:1003–1021 (1983); und Bodanszky et al., Bioorganic Chem. 3:133–140 (1974).
  • Von kurzen Peptiden, die amphipathische Helices bilden können, ist bekannt, daß sie Lipiddoppelschichten binden und diese penetrieren. Siehe Kaiser und Kezdy, Ann. Rev. Biophys. Biophysical Chem. 15:561–581 (1987) und Sansom, Prog. Biophys. Molec. Biol. 55:139–235 (1991). Beispiele schließen Modellpeptide wie (LKKLLKL-) ein, welche in DeGrado und Lear, J. Am. Chem. Soc. 107:7684–7689 (1985) offenbart werden, und das 26-Rest-Bienenvenompeptid, Melittin, das in Watata und Gwozdzinski, Chem-Biol. Interactions 82:135–149 (1992) offenbart wird. Mögliche Mechanismen für die Bindung schließen eine Ausrichtung von Peptidmonomeren parallel zu der Oberfläche der Doppelschicht ein, vermittelt durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen polaren Aminosäuren und Phospholipidkopfgruppen, und eine Insertion von Peptidaggregaten in den apolaren Doppelschichtkern, teilweise stabilisiert, durch den hydrophoben Effekt. Siehe Sansom, Prog. Biophys. Molec. Biol. 55:139–235 (1991).
  • VIP gehört zu einer Familie von homologen Peptiden, von welcher andere Mitglieder Peptidhistidinisoleucin (PHI), Peptidhistidinmethionin (PHM), Wachstumshormonfreisetzungsfaktor (GRF), Hypophysenadenylatcyclase aktivierendes Peptid (PACAP), Mageninhibitionshormon (GIP), Hemodermin, das Wachstumshormonfreisetzungshormon (GHRH), Sauvagin und Utotensin I, Secretin und Glucagon einschließen. Wie VIP können die anderen Mitglieder der VIP/GRF-Familie von Peptiden, und biologisch aktive Analoga derselben, amphiphathische Helices bilden, die Lipiddoppelschichten binden können. Für die biologische Wirkung von Mitgliedern der VIP/GRF-Familie von Peptiden wird angenommen, durch Proteinrezeptoren, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, und intrazelluläre Rezeptoren vermittelt zu werden, und es ist kürzlich gezeigt worden, daß Calmodulin wahrscheinlich der intrazelluläre Rezeptor für VIP ist [Stallwood, et al., J. Bio. Chem. 267:19617–19621 (1992); und Stallwood et al., FASEB J. 7:1054 (1993)].
  • Bodanszky et al., Bioorgan. Chem. 3:133–140 (1974) waren die ersten, die die Konformation von VIP durch optische Rotationsdispersion und ein Zirkulardichroismusspektrum untersucht haben. Sie zeigten strukturelle Unterschiede in VIP, abhängig von der Hydrophobie des Lösungsmittels, in welchem VIP gelöst wurde. Das Spektrum von VIP in Wasser zeigte eine überwiegend zufällige Wicklungsstruktur (etwa 80 %). Jedoch induzierte die Zugabe von organischen Lösungsmitteln, wie Trifluorethanol (TFE) oder Methanol, sogar bei geringer Konzentration eine ausgesprochene Verschiebung zu einer Helixstruktur. Die Autoren schlugen vor, daß diese Effekte der organischen Lösungsmittel auf die Struktur des Peptids mit Rezeptorbedingungen zusammenfallen würden, und daher würde die Helixkonformation von VIP mit einer "aktiven Architektur" korrespondieren, die für seine biologische Aktivität benötigt wird. Diese frühen Studien waren in Übereinstimmung mit den Erkenntnissen von Robinson et at., Biopolymers 21:1217–1228 (1982), die die Konformation von VIP analysierten, und von zwei seiner Familienmitglieder, Sekretin und Glucagon, in Wasser, anionischen Detergentien und anionischen Lipiden (PA und Phosphatidylglycerol (PG)). Sie zeigten eine Zunahme der Helixformationwahrscheinlichkeit durch Arginyl-, Histidyl- und Lysilreste, entsprechend in allen drei Peptiden ihrem 13–20-Aminosäurebereich. Eine vorherrschend fehlgeordnete Struktur wurde wiederum für VIP in wässrigen Lösungsmitteln und zwitterionischen Lipiden beobachtet, was nahelegt, daß die Ladung der polaren Kopfgruppe eine wichtige Rolle bei der Helixbildung spielt. Unter Verwendung von Zirkulardichroismusspektraluntersuchungen (CD) mit 40 % HFIP/H2O-Mischung und 1H-NMR Untersuchungen, Fournier et at., Peptides 5:160–177 (1984), wurde gezeigt, daß der 15–28-Bereich des VIP-Segments eine α-Helix in der Gegenwart von organischem Lösungsmittel bildet. Eine vollständige Strukturstudie des nativen VIP in 40 % TFE wurde von Theriault et al., Biopolymers 31:459–464 (1991) unter Verwendung zweidimensionaler 1H-NMR-Sektruskopie durchgeführt. Deren Ergebnisse waren ähnlich zu denjenigen, die von Fry et al., Biochemistry 28:2399–2409 (1989) erhalten wurden, der VIP in 25 % Methanol/Wasser untersuchte. Sie beschrieben zwei Helixsegmente zwischen den Aminosäuren 7–15 und 19–27, die durch einen Zufallswicklungspeptidkettenbereich verknüpft waren, der Beweglichkeit für das Molekül gestattete.
  • Schließlich arbeiteten mehrere Gruppen an der Entwicklung von wirksameren Analoga von VIP als potentielle therapeutische Agentien, da das native Peptid eine sehr geringe Bioverfügbarkeit aufwies. Interessanterweise modifizierten alle die Sequenz von VIP, um seine Helixförmigkeit und Amphiphilie zu verbessern. Die VIP-Struktur-Aktivitäts-Beziehung wurde ausführlich von Bolin und seinen Mitarbeitern (Fry et al., Biochemistry 28:2399–2409 (1989); Bolin et. al., Biopolymers 37:57–66 (1995)) untersucht. In ihren Untersuchungen war die Verbesserung der Helixstruktur durch spezifische Substitutionen der Aminosäurereste proportional mit einer Zunahme der Wirksamkeit verbunden, und für die pharmacoaktive funktionelle Gruppe des VIP wurde gefunden, aus mehreren Bindungsstellen über die gesamte Peptidsequenz zu bestehen. Analoga von VIP auf einer Helixbasis wurden ebenfalls von Musso et al., Biochemistry 27:8171–8181 (1988) entwickelt, die größere Wechselwirkungen mit Rezeptoren zeigten. Ein Stearyl-Norleucin-VIP-Analogon, das eine 100-fach größere Wirksamkeit aufweist, wurde von Gozes et al., Endocrinology 134:2121–2125 (1994) für nicht-invasive Impotenzbehandlung und neurodegenerative Erkrankungen entwickelt, Gozes et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 273:161–167 (1996). Die Zugabe einer Fettsäureeinheit und die Aminosäuresubstitutionen steigerten die Lipophilie des Peptids, von welcher angenommen wird, die biologische Membranpenetration zu verbessern.
  • Zusammenfassend ist für VIP gezeigt worden, eine Helixkonformation in hydrophoben Umgebungen, bereitgestellt durch organisches Lösungsmittel, anzunehmen, und die Helixstruktur des VIP nimmt mit einer Zunahme der Hydrophobie der Umgebung zu. Dieses Helixmotiv, das im zentralen Teil des Peptids gefunden wird, welcher reich an basischen, hydrophoben Resten ist, bildet eine amphiphile Struktur, die das Binden an Rezeptoren erleichtern kann und direkte Wechselwirkungen mit Membranlipiden fördert, was eine Zunahme der Bioaktivität bewirkt. Ferner ist es möglich, daß die Helixstruktur von VIP ebenfalls zu einer erhöhten Stabilität beiträgt, durch Schützen spezifischer Stellen, die insbesondere gegenüber einem proteolytischen Abbau empfindlich sind.
  • Wie von Gozes et al., Mol. Neurobiol. 3:201–236 (1989) besprochen, zeigten Immunofluoreszenz- und Radioimmunoassaymethoden die breite, jedoch selektive Verteilung von VIP in den zentralen- und peripheren Nervensystemen. Im Gehirn trat die höchste Dichte an VIP-reichen Neuronen im Hypothalamus auf, insbesondere in den suprachiasmatischen und paraventriculären Kernen und in der Hirnrinde. VIP-Konzentrationen sind im hypophysealen Pfortaderblut höher als im peripheren Blut, was eine Sekretion des Peptids durch den Hypothalamus und seinen Transport zur Adenohypophyse anzeigt. Im peripheren Nervensystem werden VIP-immunoreaktive Nerven in Fasern und Enden gefunden, die Blutgefäße, nicht vaskuläre Glattmuskel und beerenförmige Drüsenendstücke und Gänge (ducts) in vielen Organen versorgen. Eine Koexistenz von VIP mit Acetylcholin in cholinergischen Neuronen ist ebenfalls gut dokumentiert. Für einige VIP-Nerven ist kürzlich anerkannt worden, Komponenten des autonomen Nervensystems zu sein. Ferner zeigten Muller et al., Mol. Neurobiol. 10:115–134 (1995), daß eine bestimmte Gruppe von Zellen, wie Blutplättchen, Mastzellen, Hautzellen, Neutrophile und Retinalamacrinzellen erscheinen, um in der Lage zu sein, VIP zu synthetisieren und freizusetzen.
  • Die physiologischen Wirkungen von VIP werden durch seine Bindung an spezifische Zellrezeptoren im großen Umfang vermittelt. Hirata et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 132:1079–1087 (1985) beschrieb zwei spezifische Rezeptorbindungsstellen für VIP, eine von geringer, eine von hoher Affinität, auf gezüchteten vaskulären Glattmuskelzellen von einer Rattenaorta, die sich von β-adrenergischen Rezeptoren unterschieden. Aus einer molekularen Sicht heraus wurden zwei unterschiedliche polyvalente VIP-Rezeptoren nach dem Klonen von cDNAs unterschieden. Der erste Rezeptor, VIP1, ist ähnlich zum Sekretinrezeptor, der ebenfalls PACAP-Typ-II-Rezeptor genannt wird, und wird im Darm, Leber, Muskelzellen, Eierstöcken und verschiedenen Gehirnbereichen exprimiert (Sreedharan et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 203:141–148 (1994)). Der zweite Rezeptor, VIP2, ist näher an der GRF-Bindungsstelle und weist eine ausgeprägte Verteilung im zentralen Nervensystem auf (Lutz et al., FEBS Let. 334:3–8 (1993)). Kürzliche Studien haben ebenfalls gezeigt, daß eine VIP-Wirkung nicht-rezeptorvermittelt sein kann (Séjourne et al., Am. Physiol. 273:R287–R292 (1997)).
  • Obwohl für viele Jahre untersucht, verbleiben die meisten der intrazellulären Signalgebungskaskaden von VIP, um aufgeklärt zu werden. Die üblichste zelluläre Wirkung, die in vielen Zellen beobachtet wird, ist die erhöhte Produktion von intrazellulärem cyclischen Adenosinmonophosphat (cAMP), über die Stimulierung der Adenylatcyclase. Die folgenden Schritte der cAMP-induzierten Wege sind noch hoch spekulativ. Umgekehrt zeigen mehrere Beobachtungen die Existenz von cAMP-unabhängigen Signalumwandlungskaskaden an. Sreedharan et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 203:141–148 (1994) hat kürzlich gefunden, daß der VIP1-Rezeptor zwei getrennte Wege in einem Zelltyp induzierte, d. h. eine Aktivierung von Adenylatcyklase und eine Zunahme an intrazellulärem Ca2+. Eine Stimulation des Adrenalmarks und des Cervikalganglions durch VIP wurde gezeigt, um die Bildung von Inositol-1,4,5-triphosphat (IF3) und intrazellulärem Ca2+ zu erhöhen (Malhotra et al., J. Biol. Chem. 263:2123–2126 (1988)). Ferner ist vorgeschlagen worden, daß nukleare Rezeptoren binden und Proteinkinase C aktivieren könnte (Omary et al., Science 238:1578–1580 (1987); Zorn et al., Biochem. Pharmacol. 40:2689–2694 (1990)).
  • Die pleiotrope Verteilung von VIP ist mit seiner Involvierung in einem breitem Spektrum biologischer Aktivitäten verbunden, und zunehmender Nachweis legt nahe, daß VIP eine Hauptrolle beim Regulieren einer Vielzahl wichtiger Funktionen in vielen Organen spielt. Physiologische Wirkungen von VIP sind für kardiovaskuläre, Atem-, Reproduktions-, Verdauungs-, Immun- und Zentralnervensysteme berichtet worden, ebenso wie metabolische, endokrine und neuroendokrine Funktionen (zur Übersicht, Said, Trends Endocrinol. Metab. 2:107–112 (1991)). In vielen Fällen wirkt VIP als ein Neurotransmitter oder Neuromodulator und wird in den lokalen Kreislauf in kleinen Konzentrationen freigesetzt. Unter den Funktionen, von denen angenommen wird, daß VIP sie vermittelt oder fördert (Said, Trends Endocrinol. Metab. 2:107–112 (1991), Paul et. al., Neurochem. Int. 23:197–214 (1993)) sind Vasodilatation von cerebralen, koronaren, peripheren und Lungenblutgefäßen, verknüpft mit der Regulation des Gefäßtonus; die Relaxation von Magen- Darm-, Gebärmutter- und Tracheobronchialglattmuskeln; exocrine Sekretion, Wasser und Anionen durch Intestinal-, Atmungs- und Bauchspeicheldrüsenepithelgewebe; Stimulation der männlichen und weiblichen Aktivität und Ansprechungen; Freisetzung und Regulation von Neuroendokrinfunktionen (Reninfreisetzng, Melatoninsekretion); Inhibierung des Immunsystems (Inhibierung der Blutplättchenaggregation); und Stimulation und Schutz neuronaler Zellen.
  • Neue VIP-Funktionen, wie eine Inhibierung von vaskulärem Glattmuskelzellwachstum, Proliferation von gezüchtetem menschlichen Keratinocyten, die Freisetzung von Neutrophilen und Wachstumsfaktoren, die in der Zelldifferenzierung und Ontogenese eingeschlossen sind, und Antioxidationseigenschaften sind kürzlich vorgeschlagen worden, benötigen jedoch noch zusätzliche Untersuchungen (Muller et al., Mol. Neurobiol. 10:115–134 (1995); Said, Trends Endocrinol. Metab. 2:107–112 (1991)).
  • Für einige menschliche Erkrankungen ist heutzutage bekannt, daß sie mit dem Mangel der Freisetzung von VIP verbunden sind. Der Mangel an VIP ist mit der Pathogenese mehrerer Erkrankungen, wie cystische Vibrose, diabetische Impotenz, kongenitales Mengacolon in Hirschsprung'scher Krankheit und Erschlaffungsunfähigkeit der Speiseröhre, verknüpft worden. Ferner kann eine VIP-Insuffizienz eine bronchiale Hyperaktivität in asthmatischen Luftwegen bewirken, da VIP dafür bekannt ist, Luftwegerelaxation bei Menschen zu vermitteln, und Lungengewebe von Asthmapatienten zeigte eine selektive Abwesenheit von VIP-Nerven (Ollerenshaw et al., N. Engl. J. Med. 320:1244–1248 (1989)). Schließlich beobachteten Avidor et. al., Brain Res. 503:304–307 (1989) eine Zunahme der VIP-Gengehirnexpression bei einem Rattenmodell für spontane Blutdruckerhöhung, von der angenommen wird, daß sie mit der Pathophysiologie der Erkrankung in Verbindung steht.
  • Auf der anderen Seite ist die übermäßige Freisetzung von VIP mit der Pathogenese weniger Erkrankungen verknüpft worden. Eines der pathologischen Syndrome ist Bauspeicheldrüsencholera, ein wäßriger Diarrhö-Hypocholaremie-Hypochloridrie-Zustand (Krejs, Anm. N. Y. Acad. Sci. 527:501–507 (1988)). Bestimmte Tumore, insbesondere der Bauchspeicheldrüse, der Bronchien und des Neurogenen sind mit erhöhten Kreislaufgehalten von VIP in Verbindung gebracht worden.
  • Aufgrund der zahlreichen physiologischen Wirkungen von VIP ist die Verwendung von VIP als ein Arzneimittel von wachsendem Interesse gewesen. Die potentiellen therapeutischen Entwicklungen von VIP schließen eine Behandlung von Erkrankungen ein, wo ein regionaler Blutfluß entzogen ist. Diese schließen Blutdruckerhöhung durch Verminderung systemischer vaskulärer Überlastung, Linksherzversagen, kongestiver Herzfehler und Koronar- oder Peripherischämie ein. Bei einer VIP-Infusion bei einem Mann für 10 Stunden wurde gezeigt, daß dies den Gesamtperipherwiderstand um 30 % vermindert und den Unterarmblutfluß um 270 % erhöht (Frase et al., Am. J. Cardiol. 60:1356–1361 (1987)). Ferner zeigte Smiley, Am. J. Med. Sci. 304:319–333 (1992) VIP-immunoreaktive Nerven in der Haut, und für Plasmagehalte an VIP wurde gefunden, daß sie bei Patienten mit Sklerodermie niedrig sind, damit kann eine Behandlung mit VIP diese beeinträchtigte Ansprechung wieder herstellen.
  • Andere Erkrankungen, welche durch Verabreichung von VIP behandelt werden könnten, schließen eine Behandlung eines asthmatischen Bronchospasmus ein. Für VIP ist gezeigt worden, asthmatische Patienten gegenüber Bronchokonstriktion und als ein Relaxant von Tracheobronchialglattmuskel zu schützen (Morice et al., Lancet 26 2(8361):1225–1227 (1983)). Seine entzündungshemmenden Eigenschaften könnten ferner seinen therapeutischen Wert bei Asthma verbessern (Said, Biomed. Res. 13 (Ergänzung 2):257–262 (1992)). Eine Verabreichung von VIP könnte ebenfalls bei der Vorbeugung und/oder Reduktion von Gewebeverletzung verwendet werden. Das Peptid ist beschrieben worden, um neuronalen Zelltod zu vermeiden, der durch das äußere Umhüllungsprotein gp 120 des menschlichen Immunodefizitvirus in vitro (Gozes et al., Mol. Neurobiol. 3:201–236 (1989); Hökfelt, Neuron. 7:867–879 (1991)) erzeugt wird, was zu einer möglichen Therapie für AIDS-Demenz ebenso wie zur Behandlung der Alzheimer-Erkrankung führen kann. Ebenfalls wurde die akute Lungenentzündungserkrankung, die durch eine Vielzahl von Anfällen induziert wird, einschließlich oxidativem Streß, durch die Gegenwart von VIP abgeschwächt. (Berisha et al., Am. J. Physiol. 259:L151–L155 (1990)). Für zu bestimmten pneumoplegischen Lösungen zugefügtes VIP wurde ebenfalls gezeigt, eine Rattenlungenkonservierung vor einer Transplantation zu verbessern (Alessandrini et al., Transplantation 56:964:973 (1993)).
  • Ein Hauptfaktor, der die in vivo-Verabreichung von VIP begrenzt, ist seine verminderte Bioverfügbarkeit bei Zielgeweben gewesen, hauptsächlich aufgrund des proteolytischen Abbaus, Hydrolyse und/oder einer Multiplizität der Konformationen, die vom Peptid eingenommen werden. Es ist spekuliert worden, daß eine intrazelluläre Lieferung von VIP alleine und/oder VIP-Calmodulin-Mischungen die Erfordernis zur Zelloberflächenbindung des Peptids umgehen könnte und somit die biologischen Wirkungen des Peptids verbessern könnte. Eine Bereitstellung der Peptide, exprimiert in und auf Liposomen, würde möglicherweise eine intrazelluläre Lieferung ermöglichen, da Lipiddoppelschichten von Liposomen dafür bekannt sind, mit der Plasmamembran der Zellen zu verschmelzen und eingeschlossene Inhalte in die intrazellulären Räume zu liefern.
  • Liposome sind mikroskopische kugelförmige Strukturen, die aus Phospholipiden zusammengesetzt sind, welche zuerst in den frühen 60iger Jahren entdeckt worden sind (Bangham et al., J. Mol. Biol. 13:238 (1965)). In wässrigen Medien organisieren sich Phospholipidmoleküle, die amphiphil sind, spontan selbst in selbstgeschlossenen Doppelschichten als ein Ergebnis der hydrophilen und hydrophoben Wechselwirkungen. Die resultierenden Vesikel, Liposome genannt, kapseln daher in ihrem Inneren einen Teil des wässrigen Mediums ein, in welchem sie suspendiert sind, eine Eigenschaft, die sie zu potentiellen Trägern für biologisch aktive hydrophile Moleküle und Arzneimittel in vivo macht. Liphophile Agentien könnten ebenfalls, eingebettet in der liposomalen Membran, transportiert werden. Jedoch ist der Erfolg von Liposomen bei medizinischen Anwendungen im großen Maße durch ihre schnelle Absonderung im Reticuloendothelialsystem (RES) begrenzt gewesen. Anstrengungen, die RES-Aufnahme von Liposomen zu reduzieren, führten in den späten 80iger Jahren zu der Entwicklung von Lipsomen mit einer beträchtlichen Zunahme in ihren Kreislaufhalbwertszeiten (sterisch stabilisierte Liposome) (SSL), und belebten Hoffnungen für ihre Entwicklung als Arzneimittelliefersysteme neu. Zwei unabhängige Laboratorien identifizierten aus Studien der Biologie der roten Blutzellen, daß die Gegenwart von Sialsäure (sialic acid) auf der Membran von Erythrocyten teilweise verantwortlich ist für deren sehr lange Kreislaufzeiten. Tatsächlich erhöhte die Integration von sialierten Glycolipiden, wie dem Gangliosid GM1 in Phosphatidylcholin (PC): Cholesterol (Chol)-Liposomen effektiv die Kreislaufzeit der Vesikel (Allen et al., FEBS Letter 223:42–46 (1987); Allen et al., US 4,920,016 , Anmeldung 132,136, 18. Dezember 1987; 24 pp, 24. April 1990; Gabizon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:6949 (1988)). Diese ersten Ergebnisse haben neue Perspektiven für Liposome als Arzneimittelträger aufgezeigt, insbesondere auf dem Gebiet der Chemotherapie, da längere Halbwertszeiten gut mit höherer Aufnahme von implantierten Tumoren in Mäusen korrelierten (Gabizon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:6949 (1988)).
  • In den 90iger Jahren resultierte die von mehreren Forschern nahezu gleichzeitige Entwicklung der zweiten Generation von SSL, enthaltend Lipidderivate von Polyethylenglykol (PEG), in weiteren Verbesserungen (Klibanov et al., FEBS Letter 268 (1): 235–237, (1990); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1066:29–36 (1991)). Klibanov et al., FEBS Letter 286 (1): 235–237 (1990) zeigte, daß die Blutclearance-Halbwertszeit von PC/Chol (1:1)-Liposomen in Mäusen 30 Min. vs. 5 Std. für Vesikel war, die aus PC/Chol/PEG-PE (1:1:0,15) zusammengesetzt waren. Daneben wurden Herstellungsverfahren für das konjugierte Phospholipid PEG-disteroyl-phophatidylethanolamin (DSPE) berichtet, schnell und einfach zu sein (Klibanov et al., FEBS Letter 268 (1):235–237 (1990); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1066:29–36 (1991), und PEG hatte bereits eine Genehmigung zur pharmazeutischen Verwendung erhalten (PEG-ADA, Rhinaris®).
  • Von Interesse ist die Beobachtung der erhöhten Halbwertzeit von zirkulierendem Protein durch Konjugation des Proteins mit einem wasserlöslichen Polymer [Nucci, et al., Adv. Drug Del. Rev. 6:133–151 (1991); Woodle et al., Prog. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 17:77–78 (1990)]. Diese Beobachtung führte zu der Entwicklung von sterisch stabilisierten Liposomen (SSL) (ebenfalls als "PEG-Liposome" bekannt) als ein verbessertes Arzneimittelliefersystem, welches beträchtlich das Auftreten einer schnellen Clearance von Liposomen aus dem Kreislauf minimiert [Lasic und Martin, Stealth Liposomes, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL (1995)]. SSL sind Polymer beschichtete Liposome, wobei das Polymer, bevorzugt Polyethylenglykol (PEG), kovalent mit einem der Phospholipide konjugiert, ist und eine hydrophile Wolke außerhalb der Vesikeldoppelschicht bereitstellt. Diese sterische Barriere verzögert die Erkennung durch Opsonine, was es SSL ermöglicht, im Kreislauf viel länger als herkömmliche Liposome zu verbleiben [Lasic und Martin, Stealth Liposomes, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL (1995); Woodle et al., Biochem. Biophys. Acta 1105:193–200 (1992); Litzinger, et al., Biochem. Biophys. Acta 1190:99–107 (1994); Bedu Addo, et al., Pharm. Res. 13:718–724 (1996)] und erhöht die pharmakologische Wirksamkeit eingekapselter Agentien, wie für einige chemotherapeutische und Antiinfektionsarzneimittel gezeigt wird [Lasic und Martin, Stealth Liposomes, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL (1995)]. Untersuchungen in diesem Bereich haben gezeigt, daß unterschiedliche Faktoren Kreislaufhalbwertszeiten von SSL beeinflussen, und idealerweise sollte der mittlere Vesikeldurchmesser unter 200 nm sein, mit PEG mit einem Molekulargewicht von etwa 2.000 Da in einer Konzentration von 5 % (9–12) [Lasic und Martin, Stealth Liposomes, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL (1995); Woodle, et al., Biochem. Biophys. Acta 1105:193–200 (1992); Litzinger et al., Biochem. Biophys. Acta 1190:99–107 (1994); Bedu Addo et al. Pharm. Res. 13:718–724 (1996)].
  • Vom Mechanismus, durch den SSL Makrophagen vermeiden und länger im Blut zirkulieren, wird angenommen, die Bildung einer "sterischen Barriere" um die Liposomen durch die angefügten PEG-Moleküle einzuschließen. Torchilin et. al., Stealth Liposomes, D. Lasic und F. Martin (Herausgeber), CRC Press, Boca Raton, FL, S. 51–62 (1995), beanspruchten, daß die Fähigkeit von PEG, um eine Liposomopsonisation zu vermeiden, bestimmt wird durch sein Verhalten im Lösungsmittel, welches die Bildung einer hydrophilen Wolke über die Vesikeloberfläche sogar bei verhältnismäßig geringen Polymerkonzentrationen verursacht. Dieser negative hydrophile Überzug würde als ein Schutzschild wirken und die Bindung von Opsoninen verzögern, die häufig durch die positiv geladenen Lipidoberflächen angezogen werden.
  • Die Zirkulationszeit von sterisch stabilisierten Liposomen kann durch Auswahl ihrer Größe, des PEG-Molekulargewichts, der Kettenlänge und der Konzentration und Auswahl der Lipidzusammensetzung gesteuert werden. Maruyama et al., Chem. Pharm. Bull. 39:1620–1622 (1991), testeten SSL mit unterschiedlichen PEG-Molekulargewichten (1.000, 2.000, 5.000 und 12.000 Da) mit einer konstanten Größe (180 bis 200 nm) und Zusammensetzung (6 % DSPE-PEG in DSPC/Chol (1:1)). Die PEG2.000-Liposomen waren die langanhaltenste Formulierung bei Mäusen, wobei 47,1 % der injizierten Dosis noch nach 6 Std. im Blut waren. Klibanov et al., FEBS Letter 268 (1):235–237 (1990) führten ähnliche Untersuchungen bei Mäusen mit PC/Chol/PEG-PE (10:5:1) extrudierten Liposomen von 200 nm Durchmesser unter Verwendung von PEG750, PEG2.000 und PEG5.000 durch. Die Autoren schätzten den "Grad an sterischer Barriere", der auf der Liposomenoberfläche erzeugt wurde, ein und schlossen daraus, daß er unmittelbar mit der Kettenlänge von PEG in Beziehung stand und konzentrationsabhängig war. Sie legten nahe, daß die SSL-Prolongation unmittelbar proportional zur PEG-Kettenlänge war, welche selbst mit der sterischen Barriere korrespondierte. Schließlich fanden andere Gruppen (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1066:29–36 (1991); Woddle et al., Biochim Biophys. Acta 1105:193–200 (1992)) etwas widersprüchliche Ergebnisse, die zeigten, daß die Verlängerung der PEG-Kettenlänge von 2.000 auf 5.000 Da keine zusätzliche Suppressionswirkung auf die RES-Aufnahme aufwies. PEG mit Molekulargewichten von 1.900, 2.000 und 5.000 sind kürzlich in verschiedenen Anwendungen eingesetzt worden.
  • Die Gruppe von Huang (Klibanov et al., Biochim. Biophys. Acta 1062:142–148 (1991); Litzinger et al., Biochim. Biophys. Acta 1190:99–107 (1994) wies auf die Bedeutung der Größe der Liposomen in Biodistributionsstudien hin und beobachtete, daß kleine Vesikel (< 100 nm) durch die Leber aufgenommen wurden, während größere (300 nm < Durchmesser < 500 nm) in der Milz angesammelt wurden, insbesondere in der roten Pulpa- und Marginalzone. Tatsächlich besteht die Hauptfunktion der Milz darin, die gealterten oder beschädigten roten Blutzellen zu filtern, und für die Liposomenaufnahme wurde gezeigt, daß sie den gleichen Filtrationsmechanismus verwendet, gefolgt von einer Milzmakrophagenendozytose. Der Grund für eine solche Aufnahme ist jedoch unbekannt. Ihre Untersuchungen zeigten eine optimierte Zirkulationszeit für SSL von 150–200 nm Durchmesser. Gosh et al., Stealth Liposomes, D. Lasic und F. Martin (Herausgeber) CRC Press, Boca Raton, FL, S. 13–24 (1995) bestätigte diese Arbeit und zeigte die Begrenzung der Verlängerungswirkung von SSL auf einen engen Größenbereich zwischen 70 und 200 nm Durchmesser. Die meisten SSL-Anwendungen erscheinen tatsächlich einen Größenreduktionsschritt in ihren Liposomherstellungsverfahren einzuschließen.
  • Klibanov et al., Biochim. Biophys. Acta 1062:142–148 (1991) untersuchte den Effekt der Lipidzusammensetzung auf die Blutzirkulationszeit von SSL und fand, daß die Halbwertszeiten unterschiedlicher SSL alle sehr nahe waren, außer wenn Phosphatidylserin (PS) zugegeben wurde. Woodle et al., Biochim. Biophys. Acta 1105:193–200 (1992) führten ebenfalls Biodistributionsuntersuchungen an Mäusen und Ratten mit SSL verschiedener Lipidzusammensetzungen durch. Sie zeigten in ähnlicher Weise, daß eine Zunahme der Hydrierung (hydrogenation) von PC (d. h. Rohlipidübergangstemperatur (bulk lipid transition temperature), die Zugabe des anionischen Lipids PG und unterschiedliche Gehalte an Cholesterol keinen Einfluß auf die Verlängerungswirkung hatten. Eine konsistente Halbwertszeit von etwa 15 Std. zur Blutclearance wurde beobachtet, unabhängig von dem Phasenübergang des Phospholipids, des Cholesterolgehalts oder neutraler/negativer Ladungen.
  • Nichtstestotrotz warfen kürzlich Bedu-Addo et al., Pharm. Res. 13:718–724 (1996) Licht auf die Rolle von Cholesterol bei der Stabilisierung von Liposomen, behauptend, daß die geeignetste Formulierung für verlängerte Zirkulationszeiten ein Minimum von 30 mol % Cholesterol enthalten sollte, mit geringen Konzentrationen an kurzkettigem PEG-PE (< 10 %). Die Autoren untersuchten die Effizienz des Oberflächenschutzes in vitro unter Verwendung eines Fluoreszenzenergieübertragungsverfahrens. Die Zugabe von Cholesterol verbesserte den Oberflächenschutz aufgrund der Zunahme der Doppelschichtkohäsivfestigkeit. Es würde die Bildung von "kahlen Spots", die weniger mit PG-PE in der liposomalen Doppelschicht angereichert sind, begrenzen, wodurch eine Phasenseparation und ein Lipidaustausch mit Blutlipoproteinen inhibiert wird. In vivo wurde jedoch gezeigt, daß die lang andauernde Zirkulation von SSL hauptsächlich von der PEG-Beschichtung und weniger von der Liposomendoppelschichtzusammensetzung abhängig ist.
  • Verschiedene Forscher berichteten, daß lediglich 5 % PEG-PE einen optimierten sterischen Barriereeffekt für die Vesikel geben würde (Klibanov et al., Biochim. Biophys. Acta 1062:142–148 (1991); Woodle et al., Biochim. Biophys. Acta 1105:194–200 (1992); McIntosh et al., Stealth Liposomes, D. Lasic und F. Martin (Herausgeber), CRC Press, Boca Raton, FL, S. 63–71 (1995)). Eine maximale Grenze von 10 mol % PEG wurde vor kurzem vorgeschlagen, um adäquate Ergebnisse aus in vitro-Untersuchungen zu erhalten, aufgrund der spontanen Bildung von Micellen des PEG-PE bei höheren Konzentrationen (Bedu-Addo et al., Pharm. Res. 13:718–724 (1996)).
  • Ebenfalls von Interesse für die vorliegende Anmeldung ist die Offenbarung der PCT-Anmeldung PCT/US97/05161, die Verbesserungen für sterisch stabilisierte Liposome und therapeutische und diagnostische, einschließlich akustische diagnostische Verfahren zur Verwendung derselben betrifft.
  • Von Interesse ist eine Arbeit bezüglich molekularer Aggregate, die "Micellen" genannt werden, die als kolloidale Aggregate definiert werden, die spontan durch amphiphile Verbindungen in Wasser oberhalb einer kritischen Konzentration des gelösten Stoffs, die kritische Micellenkonzentration (CMC), und bei Lösungstemperaturen über der kritischen Micellentemperatur (CMT) gebildet werden. Die Moleküle, die die Micellen bilden, sind in schnellem dynamischem Gleichgewicht mit den nicht assoziierten Molekülen. Die Zunahme der Konzentration über die CMC führt gewöhnlicherweise zu einer Zunahme der Anzahl an Micellen ohne irgendeine Veränderung der Micellengröße; jedoch vergrößern sich in bestimmten Fällen mit Phospholipid gemischten Micellen die kugelförmigen Micellen zu stabförmigen Micellen (Carey et al., Arch. Inter Med. 130:506–527 (1972); Hjelm, Jr. et al., J. Phys. Chem. 96 (21):8653–8661 (1992)). Die CMC ist stark temperaturabhängig, und bei einer gegebenen Konzentration findet der Monomer-Micellen-Übergang allmählich über einen breiten Temperaturbereich statt (Almgren et al., Colloid Polym. Sci. 273:2–15 (1995)). Eine Zunahme der Temperatur führt zu einer Zunahme der Anzahl an Aggregaten, während der hydrodynamische Radius konstant bleibt (Nivaggiloi et al., Langmuir 11 (3):730–737 (1995); Alexandridis et al., Langmuir. 11:1468–1476 (1995)). Im allgemeinen führt die Zunahme der Temperatur zu einer Zunahme der hydrophoben Wechselwirkungen, und die Wasserdielektrizitätskonstante wird vermindert, unter Vergrößerung der ionischen Abstoßungskräfte. Es gibt viele Wege, die CMC einer amphiphilen Verbindung zu bestimmen (Oberflächenspannungsmessungen, Löslichmachung von in Wasser unlöslichem Farbstoff, oder einer Fluoreszenzsonde, Leitfähigkeitsmessungen, Lichtstreuung und dergleichen). Gemäß einem bevorzugten Verfahren können Oberflächenspannungsmessungen verwendet werden, um die CMC von PEG-DSPE-Micellen bei Raumtemperatur zu bestimmen.
  • Micellen von oberflächenaktiven Mitteln werden als Hilfsstoffe und Arzneimittelträgersysteme in vielen Bereichen der pharmazeutischen Technologie verwendet. Für Micellen ist gefunden worden, eine Bioverfügbarkeit der Arzneimittel zu erhöhen oder deren nachteiligen Wirkungen zu vermindern (Trubetskoy et al., Advan. Drug Deliv. Reviews 16:311–320 (1995). Zusätzlich spielt die kleine Größe der Micellen eine Hauptrolle beim Transport über Membrane, einschließend der Blut-Hirn-Schranke (Muranushi et al., Chemistry and Physics of Lipids 28:269–279 (1981); Saletu et al., Int. Clin. Psychopharmacol. 3:287–323 (1988). Die Micellen von oberflächenaktiven Mitteln sind thermodynamisch in wäßrigen Medien instabil und unterliegen einer Dissoziation bei Verdünnung. Yokoyama at al., Makromol Chem. Rapid Commun. 8:431–435 (1987) schlugen eine Klasse von amphiphilen Polymeren, wie Polyethylenglycol (PEG), vor, die dafür bekannt sind, stabilere polymere Micellen in wäßrigen Lösungen zu bilden. Es gibt viele Vorteile für polymere Micellen, wie daß beispielsweise eine kleine Größe eine Penetration über physiologische Barrieren steuern kann, die Halbwirtszeit in vivo erhöhen und es ermöglichen kann, Micellen an spezifische Gewebe zu richten.
  • Untersuchungen, die polymerkonjugierte Lipidmicellen einschließen, wie PEG, das mit PE konjugiert ist, sind sehr neu. In einer solchen Untersuchung, wo Polyethylenoxid (PEO) mit PE konjugiert und in wäßrigen Medien aufgelöst wird, werden Micellen gebildet. Die Studie, die von Trubetskoy et al., Acad. Radiol. 3:232–238 (1996) durchgeführt wurde, verwendete PEO-PE-konjugiertes Lipid, um Indium-111 und Gadoliniumchelate als Kontrastmedien für prekutane Lymphographie unter Verwendung einer Magnetresonanzbildgebungstomographie (MRI) einzukapseln. Die Untersuchung schloß, daß PEO-PE-Micellen amphiphile Agentien einbetten können und deren Wirkungen in vivo durch Vermeidung des RES verlängern und die Zirkulationsdauer verlängern.
  • Die Stabilität der amphiphilen Micellen hängt von der Stärke der Van-der-Waals-Wechselwirkungen ab. Die Polymergegenwart auf der Micellenoberfläche trägt zu ihrem sterischen Schutz durch Abstoßungswirkung der hydrophilen Schicht von der Hydrophobie der Macrophagen bei, wodurch die Aufnahme durch das Reticuloendothelialsystem (RES) abgesenkt wird. Ferner erzeugt die negative Ladung des Polymers einen abstoßenden sterischen Effekt in vivo, der die Bindung von Opsoninen verhindert, Plasmaprotein, das eine RES-Aufnahme erleichtert (Trubetskoy et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22:452–453 (1995)). Somit sind die polaren und elektrostatischen Wechselwirkungen des Polymers mit der in vivo-Umgebung für die sterische Stabilisierung von Phospholipidmicellen in vivo verantwortlich.
  • Für eine sterisch stabilisierte Phospholipidmicellenbildung (SSM) wird eine optimale amphiphile Verbindung benötigt, eine mit dem richtigen Maß an Hydrophobie und Hydrophilie. Faktoren, wie Molekulargewicht und Kettenlänge des Polymers, Größe, Lipidkonzentration und Polymerkonzentrationen können eine sehr wichtige Rolle bei der Bestimmung der optimalen Micellenbildung spielen. Jedoch sind bislang keine Phospholipidmicellenuntersuchungen durchgeführt worden, die die Parameter für eine optimale Bildung und Aktivität einschätzen.
  • Umgekehrt sind viele Untersuchungen von Blockcopolymer-Micellen, amphiphilen Polymeren, Micellen durchgeführt worden. Nivaggioli et al., Langmuir. 11(3):730–737 (1995) testeten Blockcopolymermicellen unterschiedlicher pluronischer Copolymere (PEO-PPO-PEO) bei einer konstanten Temperatur und Konzentrationen. Die Autoren fanden, daß die Zunahme des Molekulargewichts des Copolymers zu einer Zunahme der hydrodynamischen Größe führt, was eine Zunahme der hydrophoben Kerngröße nahelegt. Somit würde die Zunahme der Micellengröße aufgrund des Molekulargewichts und der Kettenlänge zu einer Zunahme der Aufnahme durch RES führen. Daher senken ein hohes Molekulargewicht und Kettenlänge die Zirkulationszeit und somit die Halbwertszeit der SSM ab. Insgesamt fanden die Autoren, daß PEO das vielversprechendste Copolymer für die SSM-Stabilität ist. Ferner haben Carey und Mitarbeiter bestimmt, daß eine beträchtliche Zunahme der Polymerkonzentration über die CMC zu der Bildung von stabartigen Micellen führt, was eine Zunahme der Viskosität der Lösung bewirkt (Carey et al., Arch. Inter Med. 130:506–527 (1972); Ahngren et al., Colloid Polym. Sci. 273:2–15 (1995)). Daher erhöhen die länglichen Micellen die Hydrophobie der Micellen und ermöglichen, daß mehr des nicht polaren Arzneimittels eingekapselt werden kann.
  • Von diesen Block-Copolymeren, amphiphilen Verbindungen, kann man folgern, daß das Studium der Parameter, die die Bildung und Aktivierung der Phospholipidmicellenstabilität optimieren, sehr relevant sein kann und in der Zukunft berücksichtigt werden sollte.
  • Der Einsatz von SSM als ein Arzneimittelliefersystem ist eine verhältnismäßig neue Anwendung, insbesondere für therapeutische und diagnostische Agentien. Wie Trubetskoy et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Tel. Bioact. Mater. 22:452–453 (1995) hingewiesen haben, hat beinahe jede mögliche Arzneimittelverabreichungsroute von der Verwendung einer micellenartigen Arzneimittelzubereitung bezüglich einer erhöhten Bioverfügbarkeit oder verminderter nachteiliger Wirkungen profitiert. Die kleine Größe der Micellenzubereitung ermöglicht deren Penetration der Blut-Hirn-Schranke, was es zu einem idealen Träger zur Behandlung von CNS-Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit, macht. Kürzlich sind SSM als diagnostische Agentien unter Verwendung von MRI- und STM-Methoden verwendet worden (Trubetskoy et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Tel. Bioact. Mater. 22:452–453 (1995); Zareie et al., Collids and Suraces A: Physiocochemical and Engineering Aspects. 112:19–24 (1996)). In beiden Fällen wurden SSM mit entweder einem Farbstoff oder einem paramagnetischen Agens, gefolgt von einer parenteralen Verabreichung und Visualisierung, integriert. In beiden Fällen betrug die Halbwertszeit der SSM wenigstens 2 Stunden.
  • Ebenfalls von Interesse ist die Offenbarung von Friedman et al., US 5,514,670 , welche die Submikrometeremulsionen zur Lieferung von bioaktiven Peptiden, einschließlich eines vasoaktiven Intestinalpeptidanalogas, betrifft. Von den Submikrometerpartikeln wird gesagt, daß sie einen gewichteten Durchschnittsmesser von 10 bis 600 nm, bevorzugter 30 bis 500 nm und am bevorzugtesten 70 bis 300 nm, aufweisen.
  • Von weiterem Interesse ist Calmodulin (CaM), das ein ubiquitäres 17 kd Protein ist, das weitläufig im Körper gefunden wird und viele Funktionen aufweist. Calmodulin fungiert hauptsächlich als ein Regulationsprotein und dient als ein Sensor für Calciumionen. Die Bindung an Calciumionen (Ca+2) an vier Stellen in Calmodulin induziert die Bildung einer α- Helix und anderer Konformationsänderungen, die es von einer inaktiven in eine aktive Form umwandeln. Das aktivierte Calmodulin bindet wiederum an viele Enzyme und Proteine in der Zelle und modifiziert deren Aktivität. Die globuläre Struktur von CaM verbirgt hydrophobe Bindungsstellen für Proteine, die bei CaM-Wechselwirkungen mit Ca+2-Ionen und/oder Membranphospholipiden exponiert werden (Chiba et al., Life Sciences 47:953–960 (1990); Damrongehai et. al., Bioconjugate Chem, 6:264–268 (1995)). Bolin, Neurochem. Int. 23:197–214 (1993) fand, daß VIP ein wirksames Stimulanz einer Ca+2-Bindung an Calmodulin ist, vorschlagend eine Korrelation von VIP-Wechselwirkungen mit CaM und spezifischen Zellregulationsaktivitäten.
  • Paul et al., Neurochem. Int. 23:197–214 (1993) berichteten ebenfalls, daß internalisiertes VIP die Fähigkeit aufweis, sich direkt an Calmodulin (CaM) anzubinden, und daß es sowohl Phosphodiesterase als auch die Calmodulin abhängige Myosinleichtkettenkinaseaktivität inhibiert. Diese Beobachtung stützt eine funktionelle Rolle für den VIP-CaM-Komplex (Stallwood at al., J. Biol. Chem. 267:19617–19621 (1992); Shiraga et al., Biochem. J. 300:901–905 (1994), daher vorschlagend, daß Calmodulin, ein multifunktionelles Protein, das für die Regulation vieler unterschiedlicher Signalbildungsenzyme verantwortlich ist, ein intrazellulärer Rezeptor für VIP sein könnte (Paul et al., Neurochem. Int. 23:197–214 (1993)). Somit kann VIP eine Signalweitergabe durch eine CaM-Assoziierung regulieren. Ferner wird CaM ebenfalls in extrazellulärem Fluid und cerebrospinalem Fluid gefunden, und daß es aktiv durch Zellen sekretiert wird (Paul et al., Neurochem. Int. 23:197–214 (1993)), somit kann der VIP-CaM-Komplex das Peptid gegenüber einer Proteaseverdauung schützen. Für Ca+2-Ionen und Lipide ist es bekannt, die Peptid-CaM-Wechselwirkungen zu bewirken. VIP- und Ca+2-Bindung durch CaM ist kooperativ, indem eine Calciumionenbindung an Rezeptoren eine VIP-Bindung an CaM und umgekehrt erleichtert. Für eine Phospolipasebehandlung ist gezeigt worden, daß sie eine VIP-Bindung in intakten Membranen inhibiert und die Bindung durch Löslichmachung von VIP-Bindungsproteinfraktionen moduliert (Paul et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 527:282–295 (1988)). Somit hängen die biochemischen Konsequenzen einer VIP-CaM-Bindung von der Identität der CaM-Bindungsstelle ab, und von Konformationsänderungen, die durch eine VIP-CaM-Bindung induziert werden.
  • Somit besteht eine Notwendigkeit auf dem Fachgebiet, weitere Verbesserungen für die Verwendung der Micellentechnologie für die therapeutische und diagnostische Verabreichung von bioaktiven Molekülen bereitzustellen. Insbesondere verbleibt ein Wunsch auf dem Fachgebiet für verbesserte Verfahren zur Verabreichung von amphipathischen Peptiden, einschließend, jedoch nicht begrenzt auf Mitglieder der VIP/GRF-Familie von Peptiden, die mit Phospolipiden assoziiert sind, um eine längere und effektivere therapeutische Wirkung zu erzielen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt verbesserte Verfahren zum Herstellen biologisch aktiver Micellenprodukte bereit, wie sie in den Ansprüchen definiert sind, umfassend eine oder mehrere biologisch aktive amphipathische Verbindung(en) in Verbindung mit einer Micelle. Wenn hierin verwendet, umfassen Verbindungen Peptide, Proteine, Enzyme im allgemeinen, ebenso wie Fragmente, Analoga und Modulatoren derselben. In bezug auf Proteine zieht die Erfindung die Verwendung sowohl der L- als auch der D-Formen in Erwägung. Wo Verbindungen sowohl in cis als auch trans-Konformationen vorliegen, umfaßt das Verfahren die Verwendung jeder Form alleine oder eine Kombination beider Formen. Die Micellenzubereitungen liefern und erhöhen eine Bioaktivität der biologisch aktiven Peptide auf eine Weise, welche Verbesserungen der Effizienz und Dauer der biologischen Wirkungen der assoziierten Peptide bereitstellt. Von einer erhöhten Effizienz und Dauer der biologischen Wirkung wird angenommen, zumindest teilweise aus einer Wechselwirkung der Verbindung mit der Micelle auf eine solche Weise zu resultieren, daß die Verbindung eine aktive oder aktivere Konformation als die Verbindung in einer wässrigen Umgebung erlangt und bewahrt. Das Verfahren überwindet somit die Probleme, die mit vorherigen liposomalen Formulierungen verbunden waren, wie beispielsweise, jedoch nicht begrenzt auf eine Aufnahme durch das Retikuloendothelialsystem, ein Abbau der Verbindung oder eine Lieferung der Verbindung in einer inaktiven Konformation. Gemäß einer Erscheinung wird Polyethylenglykol (PEG) kovalent mit DSPE zusammengesetzt (konjugiert) und verwendet, um polymere Micellen zu bilden, die dann passiv mit VIP beladen werden. Das PEG-DSPE bildet Zellen mit einem hydrophoben Kern bestehend aus Fettsäureketten aus Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE), welcher von einer hydrophilen "Schale" umgeben ist, die durch das PEG-Polymer gebildet wird.
  • Gemäß einer Erscheinung wird ein Verfahren zum Herstellen eines biologisch aktiven Micellenprodukts bereitgestellt, umfassend eine oder mehrere biologisch aktive amphipathische Verbindung(en) in Verbindung mit einer Micelle; wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Mischen einer Kombination eines oder mehrerer Lipide, wobei die Kombination wenigstens eine Lipidkomponente einschließt, die kovalent an ein wasserlösliches Polymer gebunden ist; b) Bilden von sterisch stabilisierten Micellen aus der Kombination von Lipiden; und c) Inkubieren der Micellen aus Schritt b) mit einer oder mehreren biologisch aktiven, amphipathischen Verbindungen unter Bedingungen, bei denen die Verbindung mit den Micellen aus Schritt b) in einer biologisch aktiveren Konformation verglichen mit der Verbindung in einer wässrigen Lösung assoziiert wird. Gemäß einer weiteren Erscheinung kann ein biologisch aktives Micellenprodukt durch die Co-Ausfällung einer biologisch aktiven, amphipathischen Verbindung mit Lipiden hergestellt werden, um Micellen zu bilden, bei denen eine Inkubation nicht erforderlich ist. Insbesondere wird ein Verfahren zum Herstellen eines biologisch aktiven Micellenprodukts bereitgestellt, umfassend eine oder mehrere biologisch aktive, amphipathische Verbindungen in Verbindung mit einer Micelle; wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Mischen eines oder mehrerer Lipide, wobei die Kombination wenigstens eine Lipidkomponente, die kovalent mit einem wasserlöslichen Polymer gebunden ist, mit einer biologisch aktiven, amphipathischen Verbindung einschließt; b) Bilden von sterisch stabilisierten Micellen aus der Mischung nach Schritt a) unter Bedingungen, bei denen die Verbindung mit den Micellen in einer aktiven Konformation assoziiert wird.
  • Als eine Erscheinung sind die Micellen sterisch stabilisierte Micellen (SSM), die aus einer Kombination von Lipiden hergestellt werden, die wenigstens eine Lipidkomponente einschließen, die kovalent mit einem wasserlöslichen Polymer verbunden ist. Dieses Polymergebundene Phospholipid ist die die Micelle bildende Komponente. Andere Lipide werden praktisch löslich gemacht in dieser Micelle, um gemischte Micellen zu bilden. Das wasserlösliche Polymer, welches bevorzugt Polyethylenglykol (PEG) ist, erhöht die Lipidlöslichkeit, um Micellen anstelle von Vesikeln in wässrigen Medien zu bilden. Es dient ebenfalls dazu, die resultierende Micelle sterisch gegen die Aufnahme durch Komponenten des Retikuloendothelialsystems zu stabilisieren.
  • In einer weiteren Erscheinung wird ein Verfahren zum Herstellen eines biologisch aktiven, sterisch stabilisierten Micellenprodukts bereitgestellt, umfassend eine oder mehrere biologisch aktive, amphipathische Verbindung(en), wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Herstellen einer Mischung einer wässrigen Lösung mit einem oder mehreren Lipiden, wobei wenigstens ein Lipid mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiert ist; b) Bilden von sterisch stabilisierten Micellen; c) Mischen der Micellen mit einer oder mehreren amphipathischen Verbindung(en); d) Inkubieren der Micellen und der amphipathischen Verbindung(en) unter Bedinungen, bei denen die amphipathische(n) Verbindung(en) eine günstigere biologisch aktive Konformation bei Assoziation mit der Micelle verglichen mit der Verbindung in einer wässrigen Lösung einnimmt.
  • In einer weiteren Erscheinung wird ein Verfahren zum Herstellen eines biologisch aktiven, sterisch stabilisierten Micellenprodukts bereitgestellt, umfassend eine oder mehrere biologisch aktive, amphipathische Verbindung(en), wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Auflösen in einem organischen Lösungsmittel eines oder mehrere Lipide, wobei wenigstens ein Lipid mit einem wasserlöslichen Polymer zusammengesetzt ist; b) Entfernen des organischen Lösungsmittels, um einen trockenen Lipidfilm zu belassen; c) Hydratisieren des trockenen Lipidfilms mit einer wässrigen Lösung; d) Bilden von sterisch stabilisierten Micellen; e) Kombinieren der Micellen mit einer oder mehreren amphipathischen Verbindung(en); und f) Inkubieren der Micellen und der amphipathische(n) Verbindung(en) unter Bedingungen, wo die amphipathische(n) Verbindung(en) eine günstigere biologisch aktive Konformation bei Assoziation mit der Micelle verglichen mit der Verbindung in einer wässrigen Lösung einnimmt.
  • In einer weiteren Erscheinung wird ein Verfahren zum Herstellen eines biologisch aktiven, sterisch stabilisierten Micellenprodukts bereitgestellt, umfassend eine oder mehrere biologische aktive Verbindungen und eine oder mehrere zielende Verbindungen; wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Auflösen in einem organischen Lösungsmittel der biologisch aktiven Verbindung(en) und eines oder mehrere Lipide, wobei wenigstens ein Lipid mit einem wasserlöslichen Polymer zusammengesetzt ist; b) Entfernen des organischen Lösungsmittels, um einen trockenen Film zu belassen; c) Hydratisieren des trockenen Films mit einer wässrigen Lösung; d) Bilden von sterisch stabilisierten Micellenprodukten; e) Kombinieren der Micellenprodukte mit einer oder mehreren zielenden Verbindungen; und f) Inkubieren der Micellenprodukte unter Bedingungen, wo die zielende(n) Verbindung(en) sich mit den Micellenprodukten assoziieren. In einer Erscheinung ist die zielende Verbindung mit einer oder mehreren Lipidkomponenten der Micelle verknüpft. Bevorzugt wird eine Verknüpfung zwischen der zielenden Verbindung und dem Lipid durch kovalente Mittel auf eine Weise bewirkt, die es der zielenden Verbindung ermöglicht, mit ihrem verwandten Rezeptor, Ligand oder Bindungspartner zu wechselwirken und die Micelle in enger Nähe zu positionieren.
  • Die Verfahren sind mit irgendeiner biologisch aktiven, amphipathischen Verbindung, Peptid, Protein, oder Fragment, Analogon oder Modulator derselben, verwendbar, die dadurch in einer aktiven Konformation in Assoziation mit oder ohne den Lipidkern der Micelle stabil gehalten werden können. Bevorzugte amphipathische Verbindungen schließen solche ein, die durch das Vorliegen einer oder mehrerer α- oder π-Helixdomänen in ihrer biologisch aktiven Konformation gekennzeichnet sind, und insbesondere solche, bei denen polare und apolare Reste auf gegenüberliegenden Seiten der Helix getrennt sind. Besonders bevorzugte amphipathische Verbindungen, die mit der Erfindung verwendbar sind, schließen jegliches Mitglied der Peptidfamilie von vasoaktiven Intestinalpeptid (VIP)/Wachstumshormonfreisetzungsfaktor (GRF) ein, welche biologisch aktive Analoga derselben einschließen. Die VIP/GRF-Peptidfamilie für Säugetiere und Nicht-Säugetiere schließt funktionelle Analoga von VIP und GRF, Peptidhistidinisoleucin (PHI), Peptidhistidinmethionin (PHM), Wachstumshormonfreisetzungsfaktor (GRF), Hypophysenadenylatcyclaseaktivierungspeptid (PACAP), Secretin und Glucagon ein. Wie VIP können andere Mitglieder der VIP/GRF-Peptidfamilie und biologisch aktive Analoga derselben, amphipatische Helices bilden, wobei hydrophobe und hydrophile Domänen des Peptids getrennt sind und die hydrophoben Domäne(n) in der Lage ist bzw. sind, einen Lipidkern zu binden. Das Verfahren zieht ebenfalls Modulatoren mit erhöhter Bioaktivität in Assoziation mit Micellen in Erwägung, die durch ein Verfahren der Erfindung hergestellt werden. Ein besonders bevorzugtes Peptid zur Verwendung gemäß der Erfindung ist VIP. Bevorzugte Micellen werden durch einen durchschnittlichen Durchmesser von weniger als etwa 20 nm gekennzeichnet. Gemäß einer Erscheinung umfassen die Micellen weiter Calmodulin. Die biologisch aktiven Peptidprodukte können in einer großen Anzahl therapeutischer, diagnostischer, kosmetischer und organischer Gewebe- und Zellbewahrungsverwendungen angesetzt werden, wobei es erwünscht ist, einen hohen Gehalt an biologisch aktiver Verbindung zu liefern oder eine gezielte Lieferung des Micellenprodukts zu detektieren, wie es unten beschrieben wird.
  • In einer weiteren Erscheinung werden Verfahren zum Herstellen eines biologisch aktiven, sterisch stabilisierten, kristallinen Produkts bereitgestellt, umfassend eine oder mehrere biologische aktive Verbindung(en), die in einer wässrigen Lösung unlöslich ist bzw. sind; wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Auflösen in einem organischen Lösungsmittel der biologisch aktiven Verbindung(en) und eines oder mehrerer Lipide, wobei wenigstens ein Lipid mit einem wasserlöslichen Polymer zusammengesetzt ist; b) Entfernen des organischen Lösungsmittels, um einen trockenen Film zu belassen; c) Hydratisieren des trockenen Films mit einer wässrigen Lösung; und d) Bilden eines sterisch stabilisierten, kristallinen Produkts. Wenn hierin verwendet und in folgenden beschrieben kristallinen Produkten der Erfindung wird "unlöslich" gemäß der US-Pharmacopeia National Formulary [USP 23, 1995, Seite 10] als benötigend 10.000 oder mehr Teile an Lösungsmittel für 1 Teil des gelösten Stoffes definiert. Das kristalline Produkt des Verfahrens ist im wesentlichen ein durch eine Micelle umhülltes Aggregat der unlöslichen Verbindung, die dichtgepackt und kristallisiert ist.
  • In einer noch weiteren Erscheinung werden Verfahren zum Herstellen eines biologisch aktiven, sterisch stabilisierten, kristallinen Produkts bereitgestellt, umfassend eine oder mehrere biologisch aktive Verbindung(en), die in einer wässrigen Lösung unlöslich ist bzw. sind; wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Auflösen in einem organischen Lösungsmittel der biologisch aktiven Verbindung und eines oder mehrerer Lipide, wobei wenigstens ein Lipid mit einem wasserlöslichen Polymer zusammengesetzt ist; b) Gefriertrocknen, um das organische Lösungsmittel zu entfernen; c) Hydratisieren mit einer wässrigen Lösung; und d) Bilden eines sterisch stabilisierten, kristallinen Produkts.
  • In einer noch weiteren Erscheinung werden Verfahren zum Herstellen eines biologisch aktiven, sterisch stabilisierten, kristallinen Produkts bereitgestellt, umfassend eine oder mehrere biologisch aktive Verbindung(en), die in wäßriger Lösung unlöslich ist bzw. sind, und eine oder mehrere amphipathische zielende Verbindungen; wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Auflösen in einem organischen Lösungsmittel der biologisch aktiven Verbindung(en) und eines oder mehrerer Lipide, wobei wenigstens ein Lipid mit einem wasserlöslichen Polymer zusammengesetzt ist; b) Entfernen des organischen Lösungsmittels, um einen trockenen Film zu belassen; c) Hydratisieren des trockenen Films mit einer wässrigen Lösung; und d) Bilden von sterisch stabilisierten, kristallinen Produkten; e) Kombinieren der kristallinen Produkte mit einer oder mehreren zielenden Verbindungen; und f) Inkubieren der kristallinen Produkte unter Bedingungen, wobei die zielende(n) Verbindung(en) sich mit den kristallinen Produkten assoziiert bzw. assoziieren, wobei die zielende Verbindung mit einem Lipid der Micelle konjugiert ist.
  • Verfahren zum Herstellen sterisch stabilisierter, kristalliner Produkte sind zugänglich für die Verwendung irgendeiner Verbindung, die in einer wässrigen Lösung unlöslich ist. Bevorzugte unlösliche Verbindungen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Progesteron, Testosteron, Östrogen, Prednisolon, Prednison, 2,3-Mercaptopropanol, Amphotericin B, Betulinsäure (betulinic acid), Camptothecin, Diazepam, Nystatin, Propofol, Cyclosporin A, Doxorubicin und Taxol®. In Verfahren zum Herstellen eines sterisch stabilisierten, kristallinen Produkts weiter umfassend eine oder mehrere zielende Verbindung, kann irgendeine zielende Verbindung, die eine biologisch aktive Konformation einnimmt oder bewahrt, wenn sie in Verbindung mit dem sterisch stabilisierten, kristallinen Produkt ist, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann irgendeine der amphipathischen Verbindungen, die oben beschrieben wurden, eingesetzt werden. In einer bevorzugtesten Ausführungsform ist die zielende Verbindung VIP oder ein anderes Mitglied der VIP/GRF-Familie oder Proteine.
  • Zusammensetzungen umfassend das biologisch aktive Micellenprodukt schließen solche ein, bei denen das biologisch aktive, amphipathische Peptid, Protein, Fragment, Analogon oder Modulatoren derselben eine Aktivität aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Antioxidanzaktivität, Antischmerz-, Entzündungshemmungs- und Wundheilungsaktivität, antimikrobielle, Antibronchospasmus-, metabolische Aktivität, Antikrebsaktivität, cardiovaskuläre Aktivität, Antiglaucomaaktivität, Antiapoptose, Antifaltenaktivität, Cyropreservation und Antialterungsaktivität. Zusammensetzungen schließen kosmetische, therapeutische und diagnostische Zusammensetzungen ein. Im Falle von diagnostischen Zusammensetzungen umfaßt das Micellenprodukt ferner eine detektierbare Markierung, die ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Fluoreszenzmarkierung, einer radioaktiven Markierung, einem Farbstoff, einem Gas und einer Verbindung, welche eine radiographische, Magnetresonanz- und Ultraschallbildgebung verbessert.
  • BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt Oberflächenspannungsmessungen einer wässrigen Lösung von PEG-DSPE, um die kritische Micellenkonzentration (CMC) bei Raumtemperatur zu bestimmen;
  • 2 zeigt die CD-Spektralanalyse von VIP in Salzlösung, Hepes-Puffer und Phospholipiden bei Raumtemperatur;
  • 3 zeigt die CD-Spektralanalyse von VIP bei Raumtemperatur und bei 37°C;
  • 4 zeigt die Wirkung von Calmodulin auf die CD-Spektralanalyse von VIP in Salzlösung und Phospholipide;
  • 5 zeigt die CD-Spektralanalyse von VIP-Fragmenten in Salzlösung und Phospholipiden;
  • 6 zeigt die CD-Spektralanalyse von VIP und Vasopressin (VP) in Salzlösung und Phospholipiden;
  • 7 zeigt die Wirkung von VIP-SSM auf Vasodilation; und
  • 8 zeigt die Wirkung von Calmodulin auf VIP-SSM-induzierte Vasodilation.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung liefert verbesserte Verfahren zum Herstellen biologisch aktiver Micellenprodukte, wie sie in den Ansprüchen definiert sind, umfassend biologisch aktive, amphipathische Verbindungen in Verbindung mit einer Micelle. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen von sterisch stabilisierten, kristallinen Produkten bereit, umfassend Verbindungen, die in einer wässrigen Lösung unlöslich sind. Die kristallinen Produkte der Erfindung werden alleine oder in Kombination mit einer zielenden Verbindung hergestellt. Es ist bevorzugt, daß die zielende Verbindung eine amphipathische Verbindung ist, die eine günstigerere biologische Konformation in Verbindung mit dem kristallinen Produkt einnimmt. Die bevorzugten amphipathischen Verbindungen sind gekennzeichnet dadurch, daß sie hydrophile und hydrophobe Domänen aufweisen, die zu dem Ausmaß isoliert sind, wie die hydrophobe Domäne sich mit dem Micellenkern verbinden kann. Verbindungen erlangen bevorzugt eine biologisch aktive Konformation in Verbindung mit dem oder innerhalb des Micellenkerns. Biologisch aktivere Konformationen sind solche, in denen die gewünschte Verbindung am ehesten ihre normale biologische Aktivität bewirken kann, beispielsweise durch Rezeptor- oder Ligandenerkennung und -bindung, und ein Vergleich der biologischen Aktivität wird in bezug auf die Verbindung in Assoziation mit der Micelle oder dem kristallinen Produkt verglichen mit der Verbindung in einer wässrigen Lösung oder Umgebung geführt. Verbindungen können gekennzeichnet werden dadurch, daß sie eine oder mehrere einzelne α- oder π-Helixdomänen aufweisen, die die hydrophoben und hydrophilen Domänen isolieren. Bevorzugte Verbindungen sind Mitglieder der VIP/GRF-Peptidfamilie. Die bevorzugteste Verbindung ist VIP. Während biologisch aktive Verbindungen mit dem Micellenkern verbunden sind, ist die Assoziation nicht irreversibel, und die Verbindung kann entweder schnell oder mit der Zeit aus der Assoziation mit der Micelle freigegeben werden, abhängig von Eigenschaften der Micelle und der Verbindung.
  • Bei Verfahren, um sterisch stabilisierte kristalline Produkte herzustellen, kann jede Verbindung, die in einer wässrigen Lösung unlöslich ist, in ein kristallines Produkt integriert werden. Bei Verfahren der Erfindung assoziieren die unlöslichen Verbindungen im hydrophoben Kern der assoziierten Lipide in dem Ausmaß, wie die unlösliche Verbindung kristallisiert. Während das Verfahren die Verwendung irgendeiner unlöslichen Verbindung in Erwägung zieht, um die kristallinen Produkte herzustellen, sind bevorzugte Verbindungen normalerweise unlösliche Antikrebsagentien, Antipilzagentien, Sedativa und Steroidverbindungen. Am bevorzugtesten werden die unlöslichen Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Taxol®, Betulinsäure, Doxorubicin, Amphotericin B, Diazepam, Nystatin, Propofol, Testosteron, Östrogen, Prednisolon, Prednison, 2,3-Mercaptopropanol und Progesteron.
  • Micellen können aus Kombinationen von Lipidmaterialien hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt und routinemäßig eingesetzt werden, um Micellen herzustellen, und einschließend wenigstens eine Lipidkomponente, die kovalent mit einem wasserlöslichen Polymer verbunden ist. Lipide können verhältnismäßig starre Sorten einschließen, wie Sphingomyelin, oder fluide Sorten, wie Phospolipide mit ungesättigten Acylketten. Die Lipidmaterialien können von Fachleuten auf dem Gebiet ausgewählt werden, damit die Zirkulationszeit der Micellen mit der Arzneimittelfreisetzungsgeschwindigkeit ausgeglichen wird. Um von der Stärke dieser Micellen bei der Arzneimittellieferung vollen Nutzen ziehen zu können, besteht eine Schlüsselherausforderung darin, das Ausströmen des Arzneimittels aus der Micelle auf ein Niveau, das beträchtlich geringer ist als die Plasmaverteilungsrate, zu verhindern. Jedoch ist dieser Punkt wahrscheinlich die fundamentelle Basis von SSL und SSM, da deren Lieferung, die schwierig zu kontrollieren ist, mit der Bioverfügbarkeit des eingekapselten Agens korrespondiert. SSM, die dynamischer als Liposome ist, kann eine Überlegenheit gegenüber SSL in bezug auf die Arzneimittelfreisetzung zeigen. Polymere können somit irgendwelche Verbindungen einschließen, die auf dem Fachgebiet der sterisch stabilisierten Liposomentechnologie (SSL) und in Technologien bekannt und routinemäßig eingesetzt werden, die verwendbar sind zum Erhöhen der Zirkulationshalbwertszeit für Proteine, einschließend beispielsweise Polyvinylalkohol, Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid, Polyglycerol, Polyaxozline oder synthetische Lipide mit polymeren Kopfgruppen. Das bevorzugteste Polymer der Erfindung ist PEG mit einem Molekulargewicht zwischen 1.000 und 5.000. Bevorzugte Lipide zum Herstellen von Micellen gemäß der Erfindung schließen Di-Stearoyl-Phophatidylethanolamin, das kovalent an PEG gebunden ist (PEG-DSPE), alleine oder in weiterer Kombination mit Phosphatidylcholin (PC), und Phophatidylglycerol (PG) in weiterer Kombination mit Cholesterol (Chol) und/oder Calmodulin, ein.
  • Verfahren zur Herstellung sterisch stabilisierter Micellenprodukte oder sterisch stabilisierter, kristalliner Produkte können unter Verwendung verschiedener Methoden durchgeführt werden. In einer Erscheinung werden Micellenkomponenten in einem organischen Lösungsmittel gemischt, und das Lösungsmittel wird unter Verwendung entweder einer Verdampfung oder einer Lyophilisierung entfernt. Das Entfernen des organischen Lösungsmittels resultiert in einem Lipidfilm, oder einem Kuchen, der anschließend unter Verwendung einer wässrigen Lösung hydratisiert wird, um die Bildung von Micellen zu ermöglichen. Die resultierenden Micellen werden mit einer amphipathischen Verbindung der Erfindung gemischt, wodurch die amphipathische Verbindung mit der Micelle assoziiert und eine günstigere biologisch aktive Konformation einnimmt.
  • In einem vereinfachteren Herstellungsverfahren werden ein oder mehrere Lipide in einer wässrigen Lösung gemischt, woraufhin die Lipide spontan Micellen bilden. Die resultierenden Micellen werden mit einer amphipathischen Verbindung gemischt, welche mit den Micellenprodukten assoziiert und eine günstigerere biologisch aktive Konformation einnimmt. Das Herstellen von Micellenprodukten durch dieses Verfahren ist insbesondere zugänglich für einen großen Maßstab und eine sichere Herstellung und erfordert einen beträchtlich kürzeren Zeitrahmen als die zuvor beschiebenen Verfahren. Die Vorgehensweise ist inhärent sicher, indem die Verwendung organischer Lösungsmittel eliminiert wird.
  • Bei Verfahren zum Herstellen sterisch stabilisierter, kristalliner Produkte ist es bevorzugt, daß eine oder mehrere Lipidverbindungen in einem organischen Lösungsmittel mit einer oder mehreren unlöslichen Verbindungen gemischt wird bzw. werden. Das organische Lösungsmittel wird entweder durch Verdampfung oder Lyophilisierung entfernt, um einen Film oder einen Kuchen bereitzustellen. Der resultierende Film oder Kuchen wird dann durch Einführen einer wässrigen Lösung hydratisiert. Als ein Ergebnis assoziiert die unlösliche Verbindung innerhalb des hydrophoben Kerns der Lipidstruktur und wird löslich gemacht oder kristallisiert um. In einer Erscheinung wird die löslich gemachte Verbindung oder das kristalline Produkt mit einer zielenden Verbindung gemischt, welche, wie oben für die Herstellung der Micellenprodukte der Erfindung beschrieben, mit dem kristallinen Produkt in einer günstigereren biologisch aktiven Konformation assoziiert. Kristalline Produkte stellen Vorteile dadurch bereit, daß sie, wie sterisch stabilisierte Micellenprodukte, in der Lage sind, dem RES zu entweichen. Wichtiger ermöglichen die kristallinen Produkte eine Verabreichung höherer Konzentrationen der unlöslichen Verbindung in einem kleinen Volumen, bevorzugt in einer Größe von weniger als 300 nm. Die kristallinen Produkte stellen ebenfalls ein Verfahren bereit, wobei unlösliche Verbindungen, die normalerweise schwierig wirksam zu verabreichen sind aufgrund ihrer inhärenten Unlöslichkeit, wirksam einem diese benötigenden Säugetier verabreicht werden können.
  • Die Micellen und kristallinen Produkte, die gemäß der Verfahren hergestellt werden, werden gekennzeichnet durch eine verbesserte Stabilität und biologische Aktivität und sind verwendbar in einer Vielzahl von therapeutischen, diagnostischen und/oder kosmetischen Anwendungen. Gemäß einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren eine Zusammensetzung umfassend ein biologisch aktives Micellenprodukt, wobei die biologisch aktive, amphipathische Verbindung Antioxidanzaktivität, Antialterungs-, Antifaltenbildungs- oder Wundheilungskapazität aufweist. Zusammensetzungen dieses Typs können von kosmetischer oder therapeutischer Natur sein. Die bevorzugte kosmetische Zusammensetzung schließt biologisch aktives VIP ein. Die Erfindung stellt ebenfalls eine oralgesteuerte Freisetzungszubereitung für die Behandlung einer Magen-Darm-Störung bereit, wobei das präparative Verfahren weiter den Schritt des Einkapselns der biologisch aktiven Micelle oder des kristallinen Produkts in eine enterisch beschichtete Kapsel umfaßt. Alternativ kann die Micelle oder das kristalline Produkt in einer Gelatinekapsel eingekapselt werden. Die oralgesteuerte Freisetzungszubereitung ist für eine Vielzahl von Magen-Darm-Störungen verwendbar, einschließlich solcher, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus entzündlicher Darmerkrankung, chronischer Konstipation, Hirschsprung'scher Krankheit, Achalasie, infantile hypertrophe pylorische Stenose und Geschwüre. Andere Indikationen zur Verwendung der Micellen, insbesondere solcher Micellen, die ein Mitglied der VIP/GRF-Familie von Proteinen, Peptiden und Fragmenten, Analoga und Modulatoren enthalten, schließen Asthma, chronische Obstruktionslungenerkrankung, Arthritis, Lupus erythematodis, Alzheimererkrankung, Glaukom, akute Fußstauchung, Sklerodermie, Rhinitis, systemischer und Lungenbluthochdruck, Psoriasis, Kahlköpfigkeit und Impotenz ein. Die bevorzugte orale Zubereitung schließt biologisch aktives VIP ein. Micellenzubereitungen umfassend biologisch aktives VIP sind ebenfalls ein vielversprechendes therapeutisches Agens für Zustände wie Asthma, chronische Obstruktionslungenerkrankung, systemischer und Lungenbluthochdruck, Sklerodermie, cystische Fibrose, Bronchiektasie, myokardiale Ischämie, Impotenz und Kahlköpfigkeit. Andere Indikationen schließen verminderte Sperma-Ei-Motilität, verminderte mukociliäre Clearance, Kartagener'sches Syndrom, erhöhte Entzündungzellenmigration und Aktivierung, erhöhte Sekretion von Mucin, verminderte Chloridionensekretion (häufig verbunden mit cystischer Fibrose), Vasokonstriktion, vasculäre Obstruktion an einem Organ oder Gewebe (häufig verbunden mit vasookklusivem Sichelanfall), Konstipation, Impotenz und weibliche Sexualweckdisfunktion ein. Die Erfindung stellt ferner Verfahren für eine kosmetische Verwendung und Konservierung eines Körperorgans, Gewebes oder eines Zelltyps zur Lagerung und Transplantation oder Fertilizierung in einem Empfänger ein, umfassend den Schritt eines Inkubierens des Organs, Gewebes oder der Zelle in einer Micellenzusammensetzung umfassend VIP.
  • In einer noch weiteren Erscheinung können Micellenprodukte, hergestellt mit oder ohne assoziierte amphipathische Verbindungen, verwendet werden, um die Lebensfähigkeit von Zellen, Geweben und Organen, die kryogenisch gelagert werden, zu verbessern. In dieser Erscheinung werden Zellen mit einem Micellenprodukt der Erfindung vor der kryogenischen Lagerung entweder allein oder in der Gegenwart anderer Lagerverbindungen, z. B. Dimethylsulfoxid (DMSO), Sucrose, Glycerol oder Ethylenglykol, die auf dem Fachgebiet gut bekannt und routinemäßig verwendet werden, in Kontakt gebracht.
  • Die Erfindung stellt ferner eine Verwendung zur Verabreichung einer biologisch aktiven, amphipathischen Verbindung für ein Zielgewebe bereit, umfassend die Schritte: Herstellen einer biologisch aktiven Micelle oder eines kristallinen Produkts umfassend eine biologisch aktive, amphipathische in Assoziation mit einer Micelle oder einem kristallinen Produkt und Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge der Micelle oder des kristallinen Produkts an das Zielgewebe. Die Micellenprodukte können intravenös, intraarteriell, intranasal, wie durch Aerosolverabreichung, Zerstäubung, Inhalation oder Einblasung, intratracheal, intraartikulär, oral, transdermal, subkutan, tropisch auf Muskelmembranen, wie, jedoch nicht begrenzt auf Mundschleimhaut, untere Magen-Darm-Schleimhaut und Bindehaut, und direkt auf Zielgewebe verabreicht werden. Verfahren zur Verfahren zur Verabreichung für amphipathische Verbindungen sind gleichermaßen zugänglich zur Verabreichung von Verbindungen, die in wässrigen Lösungen unlöslich sind.
  • Biologisch aktive Verbindungen zu therapeutischen Verwendungen können mit beträchtlich verminderten Dosisgehalten verglichen mit der Verabreichung der Verbindung alleine verabreicht werden, insbesondere wo die Verbindung eine besonders kurze Halbwertszeit oder erniedrigte Bioaktivität in der Zirkulation aufweist. Beispielsweise kann von VIP in Assoziation mit SSM erwartet werden, eine verbesserte und verlängerte Bioaktivität im Vergleich zum alleinigen Verabreichen von VIP zu zeigen. Unabhängig davon, welche bioaktive Verbindung mit SSM verbunden ist, muß das Micellenprodukt getestet werden, um eine biologisch effektive Menge zu bestimmen, die benötigt wird, um das gleiche Ergebnis zu erzielen, das durch die durch herkömmliche Mittel verabreichte Verbindung bewirkt wird. Fachleute auf dem Gebiet würden realisieren, daß die biologisch effektive Menge einer bestimmten Verbindung, wenn sie durch herkömmliche Mittel geliefert wird, als ein Ausgangspunkt für die Bestimmung einer effektiven Menge der Verbindung in SSM dienen würde. Es wäre daher sehr voraussagend, daß die gleichen oder geringeren Dosierungen in SSM ebenfalls effektiv wären und es lediglich Routine wäre, die minimale Dosis zu bestimmen, die erforderlich ist, um einen gewünschten biologischen Effekt zu erzielen. Im Falle der VIP-Verabreichung würde, wenn beispielsweise eine herkömmliche Verabreichung eine Dosis von 20 mg erfordern würde, VIP in SSM wahrscheinlich beträchtlich weniger erfordern, um den gleichen Effekt zu erzielen. Wie bei der Verabreichung von amphipathischen Verbindungen in Assoziation mit sterisch stabilisierten Micellenprodukten erlauben sterisch stabilisierte kristalline Produkte (SSC) eine Verabreichung effektiverer Dosierungen der Verbindungen, die in wässrigen Lösungen unlöslich sind.
  • Von einer Assoziation einer biologisch aktiven, amphipathischen oder unlöslichen Verbindung mit SSM- bzw. SSC-Produkt würde erwartet, die Größenordnung der biologischen Effekte der Verbindung von etwa 50 bis 100 % über die Effekte zu erhöhen, die folgend einer Verabreichung der Verbindung alleine beobachtet werden. Ebenfalls würde bei einer Assoziation mit SSM oder SSC der Erfindung erwartet werden, einen länger dauernden biologischen Effekt zu bewerkstelligen.
  • Das Verfahren liefert ferner verbessern diagnostische Zusammensetzungen umfassend biologisch aktive Micellenprodukte und Verfahren für deren Verwendung umfassend die Schritte: Herstellen eines biologisch aktiven Micellenprodukts umfassend eine biologisch aktive, amphipathische Verbindung in Assoziation mit einer Micelle, die gemäß den Verfahren der Erfindung hergestellt wird; Verabreichen einer diagnostisch wirksamen Menge des Micellenprodukts an ein Zielgewebe oder -organ; und Detektieren der Aufnahme oder Wechselwirkung des Micellenprodukts an Zielgewebe oder -organ. Gemäß einer Erscheinung ist das Zielgewebe ein Tumor. In einer Erscheinung der Erfindung ist das Micellenprodukt detektierbar mit einer Markierung markiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe einschließend eine radioaktive Markierung, eine Fluoreszenzmarkierung, eine Nicht-Fluoreszenzmarkierung, einen Farbstoff, ein Gas oder eine Verbindung, die eine radiographische, Magnetresonanz- und Ultraschallbildgebung (MRI) verbessert, welche Markierung am Zielgewebe detektiert wird.
  • Das Verfahren stellt ebenfalls eine Verwendung eines biologisch aktiven Micellenprodukts bereit, umfassend eine biologisch aktive, amphipathische Verbindung und hergestellt gemäß den Verfahren der Erfindung, für die Behandlung einer Entzündung, chronischer Obstruktionslungenerkrankung, erhöhter Sekretion von Mucin, akute Fußverstauchung, Rhinitis, Kartagener'schem Syndrom, cystischer Fibrose, Bronchiektasie, Bluthochdruck, Allergie, Alzheimererkrankung, Atherosklerose, entzündlicher Darmfehlstörung, chronische Konstipation, Hirschsprung'scher Krankheit, Achalasie, infantiler hypertropher pylorischer Stenose, Geschwüren, um Zellproliferation zu verbessern oder abzusenken, Apoptose zu verhindern, um Wundheilung in einem Körperorgan oder -gewebe zu fördern und um Zell-, Organ- und Gewebeabstoßung zu vermeiden.
  • Sterisch stabilisierte kristalline Produkte sind insbesondere zur Verabreichung als Antikrebsagentien verwendbar. Beispielsweise können kristalline Produkte der Erfindung, die Taxol® als die unlösliche Verbindung und VIP als das zielende Agens umfassen, auf Brutkrebszellen zielen, die dafür bekannt sind, höhere Gehalte an VIP-Rezeptor als normale Brustzellen zu exprimieren oder Rezeptoren mit höherer Affinität zur Bindung für VIP zu expremieren. Für Taxol® ist gezeigt worden, Brustkrebszellen selektiv zu töten.
  • Kosmetische Verwendungen für die Micellen- und kristallinen Produkte der Erfindung schließen Antialterungs-, Antifalten- und Antioxidantaktivitäten ebenso wie die Verwendung als ein Sonnenschutz ein.
  • Das vorliegende Verfahren wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche die folgenden Materialien verwendeten: Lipide: L-α-Eidotter-Phosphatidylcholin-Typ V-E in Chloroform: Methanol (9:1)(Lieferungsnr. 34H8395 und 75H8368), L-α-Eidotter-Phophatidyl-D-α-Glycerol in Chloroform: Methanol (98:2) (Lieferungsnr. 72H8431 und 85H3895), und Cholesterol (Lieferungsnr. 60H0476) von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Di-Palmitoyl-phosphatidylcholin (Lieferungsnr. LP-04-01-112-187) von Sygenal Ltd. (Schweiz). PEG-DSPE in lyophilisierter Pulverform (Liefernr. 180PHG2PK-26) von Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL). Peptide: VIP (Liefernr. K02012A1, F02018A1 und K02018A1; VIP-Fragment 1–12 (Liefernr. H05009T1), VIP-Fragment 10–28 (Liefernr. NB0222) und Vasopressin (Liefernr. SD1051A) von American Peptide Co. (Sunnyvale, CA). Andere Bioprodukte: Rindergehirncalmodulin (Liefernr: B10537) von Calbiochem Intl. (La Jolla, CA) ELISA-Untersuchungskit (Liefernr. 976605) von Peninsula Laboratories (Belmont, CA). Verschiedene Chemikalien: Trehalose (Liefernr. 43H7060), 2,4-Diaminophenol/(Amidol, Liefernr: 74H3652), Ammoniummolybdat (Liefernr. 42H3506), Natriumbisulfit (Liefernr. 41H09432), HEPES (Liefernr. 43H5720) und Natriumchlorid (Liefernr. 22H0724) von Sigma Chemicals Co. (St. Lous, MO). Natriumdodecylsulfat (Liefernr. 11120KX) von Aldrich Chemical Co., Inc. Perchlorsäure 70 % (Liefernr. 945567), Chloroform mit HPLC-Reinheit (Liefernr. 902521) und Kaliumphosphat, monobasisch (Liefernr. 914723) von Fisher Sci. (Pittsburgh, PA).
  • Bezugsbeispiel 1
  • Gemäß diesem Beispiel wurde VIP in sterisch stabilisierte Micellen gemäß der folgenden Vorgehensweise integriert. Um die Konzentration an PEG-DSPE zu bestimmen, die benötigt wird, um Micellen herzustellen, wurden Oberflächenspannungsstudien an wässrigen Lösungen von PEG-DSPE durchgeführt. Die kritische Micellenkonzentration wurde auf 0,5 bis 1,0 μM bestimmt, so daß 1,0 μM an PEG-DSPE verwendet wurden, um eine Micellenbildung zu gewährleisten (1). PEG-DSPE-Lipid (1 μmol/ml) wurde in Chloroform gelöst und in einem Rundkolben gemischt. Das organische Lösungsmittel wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei einer Wasserbadtemperatur von 45°C (Labconco, Kansas City, MO) verdampft. Vollständige Trocknung wurde durch Entwässerung unter Vakuum über Nacht erreicht. Der trockene Lipidfilm wurde mit Salzlösung (0,15 N, pH 6,8) oder HEPES-Puffer (10 mM, pH 7,4) hydratisiert. Die Lösung wurde mit menschlichem VIP (13 μg/ml) für 30 Min. vor der Verwendung in einem Zirkulardichroismus inkubiert. Menschliches VIP (0,1 nmol/ml) wurde zu der Phospolipidmicellensuspension zugegeben und für 2 Std. bei Raumtemperatur vor Verwendung in Wangentaschenuntersuchungen inkubiert.
  • Beispiel 2
  • Gemäß diesem Beispiel wurden sterisch stabilisierte Micellen, die VIP und Calmodulin umfassen, gemäß der Vorgehensweise nach Beispiel 1 hergestellt, wobei dem Verfahren dieses Beispiels gefolgt wurde, um die SSM-Suspension herzustellen, und während der Inkubationsstufe wurden 100 μl von 10–9 M CaM zu 900 μl an VIP-Micellen (ergebend eine CaM-Gesamtkonzentration von 10–10 M) zugegeben und für 2 Std. bei 4°C vor Verwendung in einem Zirkulardichroismus inkubiert. Menschliches VIP (0,1 nmol/ml) und 100 μl of 10–9 M CaM wurden zu 900 μl Phospholipidmicellen (ergebend eine CaM-Gesamtkonzentration von 10–10 M) zugegeben und für 2 Std. bei Raumtemperatur vor Verwendung in Wangentaschenuntersuchungen inkubiert. Eine VIP-Konzentration von 0,1 nmol wurde verwendet, um einen Vergleich der Ergebnisse mit VIP in einer sterisch stabilisierten Micellenzubereitung zu ermöglichen.
  • Beispiel 3
  • Gemäß diesem Beispiel wurde die Größe der Vesikel durch quasi-elastische Lichtstreuung (NICOMP Modell 270 submicron particle sizer, Pacific Scientific, Menlo Park, CA) bestimmt. Diese Vorrichtung enthält einen 5 mW Helium-Neon-Laser mit einer Anregungswellenlänge von 623,8 nm und mit einer 64-Kanalautokorrelationsfunktion, einem temperaturgesteuerten Streuzellenhalter und einem ADM 11-Videodisplayterminalcomputer (learr Siegler Inc.) zur Analyse der Fluktuationen der Streulichtintensität, die durch die Diffusion der Teilchen in Lösung erzeugt wird. Der mittlere hydrodynamische Teilchendurchmesser, dh, wurde aus der Stokes-Einstein-Beziehung unter Verwendung des gemessenen Diffusionskoeffizienten erhalten, der aus einer Analyse der Autokorrelationsfunktionen erhalten wurde, die für 30 Minuten gesammelt wurden. Die folgenden Instrumenteneinstellungen wurden verwendet; Temperatur 23°C; Viskosität 0,9325 cp; Brechungsindex 1,333; und Streuwinkel 90°. Die sterisch stabilisierten Phospholipidmicellen (SSM), die mit vasoaktivem Intestinalpeptid (VIP) beladen waren, wiesen eine endgültige mittlere Größe von ~ 17,9 ± 0,6 nm auf.
  • Beispiel 4
  • Gemäß diesem Besipiel wurden Zirkulardichroismusexperimente (CD) durchgeführt, um die Konformationsänderungen von VIP in Phospholipidmicellen, pH- und Temperaturänderungen und in wässrigen Lösungen zu bestimmen. CD-Spektren wurden auf einem JASCO J-700 Spektropolarimeter unter Verwendung einer eingegossenen Quarzzelle mit einer Weglänge von 1 cm aufgenommen. Spektren in 0,15 N Salzlösung (pH 6,8) und 5 mM Hepes-Puffer (pH 7,4) wurden mit einer Peptidkonzentration von 4 μM und einer Lipidkonzentration von 1 mM gemessen. Die Wirkungen von CaM, pH (6,8 oder 7,4) und Temperatur (25°C oder 37°C) auf die VIP-Konformation wurden ebenfalls untersucht. Die Konformation der VIP-Fragmente wurde ebenfalls untersucht. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur (~ 25°C) durchgeführt, sofern es nicht anderweitig erwähnt wird. Eine Bandbreite von 1,0 nm und eine Stufenauflösung von 0,5 nm wurden verwendet, um einen Durschnitt von 9 Akkumulationen/Probe im nahen UV-Bereich (200–260 nm Wellenlänge) zu sammeln. Die gezeigten Peptidspektren weisen die Hintergrundpufferscans und die abgezogenen leeren Vesikelscans auf und wurden unter Verwendung der Rauschreduktionsfunktion geglättet. Die Temperatur während der Spektralanalyse wurde durch Verwendung eines zirkulierenden Wasserbads gehalten, das an einem Mantel umgebend die eingegossene Quarz-CD-Zelle angefügt war. Die prozentuale Helixcharakterisierung von VIP wurde durch ein Verfahren nach Haghjoo et al., Peptide Research 9 (6):327–331 (1996) bestimmt: %-Helizität = [-(θ208 + 4.000/29.000] 100 und sind in Tabelle 1 aufgeführt.
  • Figure 00380001
    Tabelle 1: Prozentuale Helixcharakterisierung des Peptids, erhalten durch Dekonvolution unter Verwendung einer CD-Analyse.
  • Gemäß dem Beispiel wurde CD verwendet, um die Konformation von VIP in Salzlösung, Hepes-Puffer und Phospholipidmicellen bei Raumtemperatur und bei 37°C zu bestimmen. Die CD-Spektralanalyse wurde nach Inkubation von 13 μg menschlichem VIP mit 1 ml PEG-DSPE-Micellen (1 μmol) für 30 Min. bei Raumtemperatur, wie bestimmt durch vorhergehende Untersuchungen, durchgeführt. Eine Bandbreite von 1,0 nm und eine Stufenauflösung von 0,5 nm wurden verwendet, um einen Durchschnitt von 9 Akkumulationen/Probe bei nahem UV-Bereich (200–260 nm) zu sammeln. Die Temperatur wurde während der Spektralanalyse durch ein zirkulierendes Wasserbad, das an einem Mantel umgebend die eingegossene Quarz-CD-Zelle angefügt war, gehalten. Die Einstufung der VIP-Molekülkonformation in der SSM durch Verwendung von Zirkulardichroismus war erfolgreich, da die Verzerrung, die durch kugelförmige Partikel bewirkt wurde, aufgrund der kleinen Größe und der univesikulären Struktur der SSM eliminiert wurde. Die dynamische Natur der Micellen vergrößerte ebenfalls die VIP-Wechselwirkungen mit Phospholipiden. Die Phospholipidmicellen waren in unserer Untersuchung der VIP-Konformation ideal, da sie einen hydrophoben Kern ähnlich zu der Phospolipiddoppelschicht der SSL bereitstellten. Ferner ahmten sowohl die negative Ladung als auch die hydrophile Schicht, die durch das PEG bereitgestellt werden, die Bedingungen unseren SSL nach und machen es möglich, auf die VIP-Konformationsergebnisse zu schließen.
  • Für Spektraleigenschaften von VIP in reinem Wasser ist gezeigt worden, eine zufällige Wicklung zu sein, jedoch ist in organischen Lösungsmitteln für VIP gezeigt worden, eine α-Helix-Formation aufzuweisen (Fournier et al., Peptides 5:160–177 (1984); Fry et al, Biochemistry 28:2399–2409 (1989); Theriault et al., Biopolymers 31:459–464 (1991)). Ferner sind kurze Peptide, die amphipathische Helices bilden können, bekannt, um Lipiddoppelschichten zu binden und zu penetrieren (Noda et al., Biochem. Biophys. Acta. 1191:324–330 (1994)). Auf der Grundlage dieser Informationen wird von VIP erwartet, eine Helixstruktur zu bilden, wenn es mit der Micelle assoziiert ist.
  • CD-Spektren von menschlichem VIP in Salzlösung (pH 6,8) und in der Gegenwart von Phospholipidmicellen sind in 2 gezeigt. Die Studien zeigten, daß das Peptid eine beträchtliche Konformationsempfindlichkeit gegenüber seiner Umgebung aufweist. In der Salzlösung zeigte VIP ein Minimum bei 203 nm, was anzeigt, daß es hauptsächlich eine zufällige Wicklungsstruktur aufweist. In der Gegenwart von Phospholipidmicellen wies es ein Doppelminimum bei 208 nm und 222 nm auf, die charakteristisch sind für eine vorherrschende α-Helix-Konformation (Tabelle 1).
  • CD-Spektren von menschlichem VIP in Hepes-Puffer (pH 7,4) und in der Gegenwart von Phospholipidmicellen sind ebenfalls in 2 gezeigt. (CD-Spektralanalyse von VIP in Salzlösung und Hepes-Puffer (gepunktete Linie) verglichen mit VIP in der Gegenwart von Phospholipiden (durchgezogene Linie). Spektren sind Mittel von 9 Akkumulationen/Probe). Diese Studien zeigten, daß das Peptid im Hepes-Puffer ein Minimum bei 203 nm zeigte, was angibt, daß es hauptsächlich eine zufällige Wicklungsstruktur aufweist. In der Gegenwart von Phospholipidmicellen wies es ein Doppelminimum bei 208 nm und 222 nm auf, was charakteristisch ist für eine vorherrschende α-Helix-Konformation (Tabeale 1). Diese Ergebnisse sind ähnlich zu VIP in Salzlösung (pH 6,8).
  • Eine Untersuchung der CD-Spektren von vasoaktivem Intestinalpeptid in Salzlösung und in der Gegenwart von SSM haben gezeigt, daß VIP in einer zumeist zufälligen Wicklungskonfiguration in Salzlösung ist, jedoch vorherrschend in einer α-Helix-Konformation in der Gegenwart von SSM. Dies gibt an, daß VIP zum Teil tatsächlich in den hydrophoben Kern eintritt, trotz der potentiellen sterischen Hinderung von PEG, und zu seiner stabileren α-Helix-Konformation wechselt. Im Gegensatz zu vielen amphiphilen Molekülen zeigte der Wechsel des pH-Werts keine beträchtlichen Veränderungen der VIP-Konformation, was nahelegt, daß VIP nicht durch ionische Umgebung im untersuchten Bereich beeinflußt wird.
  • CD-Spektren von menschlichem VIP in Salzlösung und in der Gegenwart von Phospholipidmicellen bei 37°C sind in 3 gezeigt. (CD-Spektralanalyse von VIP in Salzlösung bei Raumtemperatur (gestrichelte Linie, grau) und bei 37°C (durchgezogene Linie, grau) verglichen mit VIP in der Gegenwart von Phospolipiden bei Raumtemperatur (gepunktete Linie, scharz) und 37°C (durchgezogene Linie, schwarz). Spektren sind Mittel von 9 Akkumulationen/Probe. Die Untersuchungen zeigten, daß die Absorptionsvermögensintensität des Peptids in Micellen bei 37°C verglichen mit Raumtemperatur mit keiner Veränderung der Spektralform zunahm. Diese Zunahme der Absorptionsvermögensintensität zeigt eine Verstärkung der α-Helix-Konformation an, wie es durch die Verdreifachung des prozentualen Helixgehalts von VIP gezeigt wird (Tabelle 1).
  • Dieser Effekt der Temperaturzunahme auf die VIP-Konformation in SSM ist am wahrscheinlichsten begründet in den kritischen Micellentemperatureffekten (CMT), wo CMT die Temperatur ist, bei welcher Micellen gebildet werden. Diese Zunahme der Temperatur ist gezeigt worden, um durch eine Zunahme der Anzahl an Micellen begleitet zu werden (Nivaggioli et al., Langmuir. 11(3):730–737 (1995)). Die Zunahme der Anzahl an Micellen führt zu einer Zunahme der Hydrophobie der Micellensuspension. Somit wird eine Verstärkung der α-Helix-Struktur von VIP-Molekülen erkannt, da mehrere der VIP-Moleküle mit der Micelle oder dem Micellenkern wechselwirken.
  • Beispiel 5
  • Gemäß diesem Beispiel wurde das Verfahren nach Beispiel 4 wiederholt, um die Konformation von VIP in Salzlösung und Phospholipidmicellen plus Calmodulin (CaM) zu bestimmen. CD-Spektralmessungen wurden durchgeführt, nachdem 13 μg/ml VIP mit 1,0 μmol/ml Phospholipidmicellen für 30 Min. inkubiert wurden, gefolgt von 10–10 M CaM inkubiert mit VIP in Phospholipidmicellen für 2 Std. bei 4°C (Konjugationspapier). Eine Bandbreite von 1,0 nm und eine Stufenauflösung von 0,5 mit wurden verwendet, um das Mittel von 9 Akkumulationen/Probe im nahen UV-Bereich (200–260 nm) zu sammeln.
  • CD-Spektren von menschlichem VIP in Salzlösung und in der Gegenwart von Phospholipid in Micellen plus CaM sind in 4 gezeigt. (CD-Spektralanalyse von VIP + CaM in Salzlösung (gepunktete Linie, schwarz), CaM in Salzlösung (gepunktete Linie, grau) verglichen mit VIP (durchgezogene Linie, grau) und VIP + CaM (durchgezogene Linie, schwarz) in der Gegenwart von Phospholipiden. Die Spektren sind ein Mittel von 9 Akkumulationen/Probe. Die Untersuchungen zeigten, daß CaM die Absorptionsvermögensintensität von VIP in Phospholipidmicellen ohne Änderung der Spektralform erhöht. Diese Zunahme des Absorptionsvermögens zeigt eine Verstärkung einer α-Helix-Konformation an, wie sie durch die Verdopplung des prozentualen Helixgehalt von VIP (Tabelle 1) erkannt wird. CaM alleine wies keine beträchtlichen Wirkungen auf die VIP-Konformation in Salzlösung (4) auf.
  • CaM erscheint eine Verstärkung der α-Helix-Struktur des VIP in der Gegenwart von Phospholipiden auszulösen. CaM ist dafür bekannt mit Phospholipiden wechselzuwirken (Chiba et al., Life Sciences 47:953–960 (1990); Houbre et al., J. Biol. Chem. 266(11):71217131 (1991); Stallwood et al., J. Biol. Chem. 267:19617–19621 (1992); Bolin, Neurochem. Int. 23:197–214 (1993); Paul et al., Neurochem. Int. 23:197–214 (1993)) und diese Wechselwirkung exponiert am wahrscheinlichsten die hydrophoben Bereiche von CaM, welche eine Zunahme der α-Helix-Struktur des VIP induzieren. Ferner kann die Zugabe von CaM die CMC absenken, was die Zunahme der Micellenanzahl bewirkt, was ferner die Hydrophobie der Lösung erhöht und zu einer Verstärkung der α-Helix-Struktur führt.
  • Beispiel 6
  • Gemäß diesem Beispiel wurde das Verfahren nach Beispiel 4 wiederholt, um die Konformation von VIP-Fragmenten in Salzlösung und Phospholipidmicellen zu bestimmen. CD-Spektralmessungen wurden durchgeführt nach Inkubation von VIP-Fragmenten mit Phospholipidmicellen mit einer molaren Konzentration äquivalent zu VIP (d. h. 9 μg/ml für VIP10–28-Fragment und 6 μg/ml für VIP1–12-Fragment) für 30 Min. Eine Bandbreite von 1,0 nm und eine Stufenauflösung von 0,5 nm wurden verwendet, um das Mittel von 9 Akkumulationen/Probe im nahen UV-Bereich (200–260 nm) zu sammeln. Spezifisch sind CD-Spektren von menschlichem VIP-Fragment (1–12) und (10–28) in der Gegenwart von Phospholipidmicellen in 5 gezeigt. (CD-Spektralanalyse von VIP (gestrichelte Linie, grau), VIP1–12 (gestrichelt-gepunktete-gepunktete-Linie, grau) und VIP10–28 (gestrichelte Linie, grau) in Salzlösung verglichen mit VIP (durchgezogene Linie, schwarz), VIP1–12 (gestricheltegepunktete Linie, grau) und VIP10–28 (durchgezogene Linie, grau) in der Gegenwart von Phospholipiden. Spektren sind ein Mittel von 9 Akkumulationen/Probe). Das Spektrum von VIP1–12-Fragment wies ein Minimum bei 203 nm in Salzlösung und in der Gegenwart von SSM auf, was eine vorherrschend zufällige Wicklungsstruktur anzeigt. Im Gegensatz dazu weist das Spektrum von VIP10–28 in der Gegenwart von SSM ein Doppelminimum bei 208 nm und 225 nm auf, was eine vorherrschende α-Helix-Struktur nahelegt. Das Spektrum von VIP10–28 in Salzlösung weist in Minimum bei 203 nm auf, was eine hauptsächlich zufällige Wicklungskonformation anzeigt. Diese Effekte korrelieren gut mit der prozentualen Helizität von VIP-Fragmenten, die in Salzlösung und in der Gegenwart von Phospholipiden bestimmt werden (Tabelle 1).
  • Die CD-Spektren von VIP-Fragmenten zeigen klar, daß der α-Helix-Bereich des Peptids in der 10–28-Aminosäuresequenz des VIP liegt. Andere haben ebenfalls dieses Phänomen unter Verwendung von CD-Spektren von VIP in organischen Lösungsmitteln beobachtet. Die α-Helix-Bildung in VIP10–28 hilft bei der Erklärung seiner antagonistischen Bioaktivität in vivo. Zuvor wurde im Labor der Erfinder gezeigt, daß das VIP10–28-Fragment vollständig native VIP-Ansprechung und gedämpfte VIP in SSL-Ansprechung in der Hamsterwangenbeutelmikrozirkulation abbaut (Sejourne et al., Pharm. Res. 14(3):362–365 (1997). Dieser Mechanismus kann durch die α-Helix-Struktur von VIP10–28 erklärt werden, was ermöglicht, daß das Fragment an die VIP-Rezeptorstelle bindet, welche die Rezeptorwechselwirkung mit VIP blockiert. Für VIP10–28 ist berichtet worden, eine Art von VIP-Rezeptoren auf Glattmuskeln zu binden (Rorstad et al., Mol. Pharmacol. 37:971–977 (1990)).
  • Beispiel 7
  • Das Verfahren nach Beispiel 4 wurde ebenfalls wiederholt, um die Konformation von Vasopressin (VP) in Salzlösung und Phospholipidmicellen bei Raumtemperatur und bei 37°C zu bestimmen. CD-Spektralmessungen wurden nach Inkubation von VIP mit Phospholipidmicellen bei einer molaren Konzentration äquivalent zu VIP (d. h. 4 μg/ml VP in 1,0 μmol/ml Phospholipide) für 30 Minuten durchgeführt. Eine Bandbreite von 1,0 nm und eine Stufenauflösung von 0,5 nm wurden verwendet, um das Mittel von 9 Akkumulationen/Probe im nahen UV-Bereich (200–260 nm) zu sammeln. Die Temperatur während der Spektralanalyse wurde gehalten durch Verwendung eines zirkulierenden Wasserbads, das an einem Mantel umgebend die eingegossene Quarz-CD-Zelle angefügt war.
  • Vasopressin (VP) ist über lange Zirkulationsstunden und bezüglich der Aktivität nach Verabreichung als SSL getestet worden. Daher wurde in dieser Untersuchung versucht zu bestimmen, ob VP ebenfalls durch Assoziation mit der liposomalen Doppelschicht agiert. VP wurde mit SSM inkubiert und CD-spektralpolarimetrische Untersuchungen wurden durchgeführt. 6 (CD-Spektralanalyse von VP (gepunktete Linie, grau) und VIP (gepunktete Linie, schwarz) in Salzlösung verglichen mit VP (durchgezogene Linie, grau) und VIP (durchgezogene Linie, schwarz) in der Gegenwart von Micellen. Spektren sind ein Mittel von 9 Akkumulationen/Probe) zeigt die CD-Spektren von Vasopressin in Salzlösung und in der Gegenwart von SSM in Vergleich mit VIP-Spektren. Die Spektren zeigen an, daß das VP in Salzlösung und in der Gegenwart von SSM ein ähnliches Spektrum mit einem Minimum bei 204 mit aufweist, was eine vorherrschend zufällige Wicklungskonformation in beiden Fällen nahelegt.
  • Wie angenommen, wies Vasopressin keine beträchtlichen Veränderungen seiner Konformation aufgrund der Gegenwart von Phospholipidmicellen auf, am wahrscheinlichsten aufgrund seiner höheren Affinität für wäßriges Medium als für Lipidumgebung und/oder seine Inflexibilität, welche eine Insertion oder Penetration in den Micellenkern verhindert.
  • Daher zeigen die Konformationsuntersuchungen, daß Peptidmoleküle flexibel sein müssen, um ihre Konformation zu ändern und eine Affinität für hydrophobe Umgebung aufzuweisen, um in den Micellenkern oder die Lipiddoppelschicht einzudringen. Ferner erleichtert wahrscheinlich die negative Ladung auf dem PEG-DSPE die Peptid-Phospholipid-Wechselwirkung durch Bereitstellung elektrostatischer Anziehung. Somit zeigen die CD-Spektraluntersuchungen, daß das VIP am wahrscheinlichsten in den hydrophoben Micellenkern oder die liposomale Doppelschicht anfänglich aufgrund der elektrostatischen Anziehung gefolgt von der stabilen α-Helix-Konformation eintritt, was bewirkt, daß das VIP in seiner aktiven Konformation für eine in vivo-Aktivität vorliegt.
  • Beispiel 8
  • Gemäß diesem Beispiel wurden die vasorelaxanten Wirkungen von VIP in einer SSM gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt. Spezifisch wurden männliche erwachsene Golden-Syrian-Hamster von Sasco (Omaha, NE) erworben. Erwachsene männliche Hamser mit spontanem Bluthochdruck und ihren normotensiven Steuerungen wurden von der Canadian Hybrid Farms (Halls Harbour, NS, Canada) erworben. Hypertensive Tiere sind nach Querzüchtung von Hamstern mit angeborener Kardiomyopathie und normalen Golden-Syrian-Hamstern identifiziert worden. Diese Albinotiere sind zuvor in unserem Labor verwendet worden (Rubinstein et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 183:1117–1123 (1992); Artwohl et al. FASEB J. 10:A629 (1996)). Die Tiere wurden anästhesiert mit Pentobarbitalnatrium (6 mg/100 g Körpergewicht, i. p.). Eine Tracheotomie wurde durchgeführt, um ein spontanes Atmen zu ermöglichen. Eine Oberschenkelvene wurde mit einer Kanüle versehen, um ergänzendes Anästhetikum während des Experiments zu injizieren (2–4 mg/100 g Körpergewicht/h). Die Körpertemperatur wurde konstant gehalten (37–38°C) und über eine Wärmauflage und eine Rückmeldungssteuereinrichtung während des Experiments überwacht.
  • Die Bioaktivität des VIP in SSM durch Diffusion desselben in situ wurde bestimmt durch Visualisierung der Mikrozirkulation des Hamsterwangenbeutels. Die Mikrozirkulation des Wangenbeutels wurde lokal durch ein Verfahren visualisiert, das zuvor in unserem Labor entwickelt worden ist (Suzuku et al., Life Sci. 57:1451–1457 (1995); Suzuku et al., Am. J. Physiol. 271:R393–R397 (1996); und Suzuku et al., Am. J. Pyisiol.271:H282–287 (1996)). Kurz gesagt wurde der linke Wangenbeutel über eine kleine Kunststoffgrundplatte ausgebreitet, und ein Schnitt wurde in der äußeren Haut gemacht, um die Wangenbeutelmembran zu exponieren. Die avaskuläre Bindegewebeschicht wurde entfernt und eine Kunststoffkammer wurde über der Grundplatte angeordnet und an Ort und Stelle durch Annähen der Haut um die obere Kammer befestigt. Dies bildet einen dreischichtigen Komplex: Die Grundplatte, die exponierte Wangenbeutelmembran und die obere Kammer. Nach diesen anfänglichen Vorgehensweisen wurde der Hamster zu einem erwärmten Mikroskoptisch überführt. Die Kammer wurde mit einem Reservoir verbunden, das erwärmten Bicarbonatpuffer (27–38°C) enthielt, der eine kontinuierliche Suffusion des Wangenbeutels ermöglichte. Der Puffer wurde kontinuierlich mit 95 % N2-5 % CO2 (pH 7,4) durchspült. Die Kammer wurde ebenfalls über ein Dreiwegeventil an eine Infusionspumpe (Sage Instruments, Cambridge, MA) angeschlossen, die eine konstante Verabreichung von Arzneimitteln in den Suffusionspuffer ermöglichte.
  • Die Wangenbeutelmikrozirkulation wurde epi-illuminiert mit einer 100-W Quecksilberlichtquelle und durch ein Mikroskop (Nikon Tokyo, Japan) mit einer 40-fachen Vergrößerung betrachtet. Das Bild wurde durch das Mikroskop und in ein Televisionssystem mit geschlossenem Stromkreis projiziert, das aus einer Niedriglicht-TV-Kamera, Monitor und Videoaufnahmerekorder (Panasonic, Yokohama, Japan) bestand. Der Innenwanddurchmesser von Arteriolen zweiter Ordner (44–62 mm), welche vaskuläre Resistenz in dem Wangenbeutel modulieren (Raud, Acta Physiol. Scand. (Suppl.) 578:1–58 (1989); Suzuki et al., Life Sci. 57:1451–1457 (1995); Suzuki et al., Am. J. Physiol. 271:R393–R397 (1996)), wurde aus der Videoanzeige des Mikroskopbilds unter Verwendung eines Videomikrometers (VIA 100; Boeckeler Instruments, Tucson, AZ) gemessen. Eine Vergrößerungskalibration des Videosystems wurde mit einem Mikroskoptischmikrometer durchgeführt, um mikrovaskuläre Abmessungen in Mikrometern anzugeben. Klarheit auf dem Videoüberwachungsschirm und eine Anordnung innerhalb des arteriolären Verzweigungsmusters im Wangenbeutel waren die Parameter, die verwendet wurden, um die zur Beobachtung ausgewählten Gefäße zu bestimmen. In einigen Experimenten wurden Tiere in mehr als einer Behandlungsgruppe verwendet, sobald Messungen des arteriolären Durchmessers von vorangehenden Interventionen zur Grundlinie zurückkehrten (siehe Experimentprotokolle).
  • Eine Suffusion von 0,1 nmol und 1,0 nmol VIP in sterisch stabilisierten Phospholipidmicellen (SSM) für 7 Min. induzierte eine beträchtliche, konzentrationsabhängige und verlängerte Vasodilatation auf den Arteriolen der Hamsterwangenbeutelmikrozirkulation. Es gab eine Zunahme des arteriolären Durchmessers von 20,2 + 2,4 % bzw. 24,5 + 1 % von den Grundlinienwerten (7; Mittel + SEM, jede Gruppe, n = 3; p < 0,05). Eine beträchtliche Vasodilatation wurde innerhalb von 2 Min. vom Start der Suffusion beobachtet und war innerhalb von 4 Minuten maximal. Ein arteriolärer Durchmesser kehrte zur Grundlinie 7 Min. (0,1 nmol) und 11 Min. (1,0 nmol) zurück, nachdem eine VIP-SSM-Suffusion beendet worden war. Leeres SSM und naives VIP alleine zeigten keine beträchtlichen Wirkungen auf den arteriolären Durchmesser (7: Veränderungen des arteriolären Durchmessers während einer und anschließend an eine Suffusion von 0,1 nmol (Dreiecke) und 1,0 nmol (Quadrate) VIP-SSM, und leeres SSM (Kreise) für 7 Min. Offene Leiste, Dauer der Suffusion. Werte sind Mittel ± SEM; jede Gruppe, n = 4; * p < 0,05 verglichen zur Basislinie).
  • Die Ergebnisse der vasorelaxanten Untersuchung zeigten, daß die Suffusion von VIP in SSM auf den insitu-Hamsterwangenbeutel mit einer beträchtlichen, konzentrationsabhängigen und verlängerten Vasodilation assoziiert war. Diese verlängerte Aktivität von VIP in SSM ist überraschend, da Micellen dynamisch sind und sich bei Suffusion auflösen würden. Somit zeigt die verlängerte Aktivität eine Stabilisierung der Micellen an, möglicherweise durch die Gegenwart von VIP, was zu einer Bildung eines VIP-Phospholipid-Komplexes durch hydrophobe Wechselwirkungen führen kann, der die Micellen für eine längere Zeitdauer intakt hält. Die langanhaltende Aktivität von VIP-SSM kann der erfolgreichen verlängerten Zirkulation des Trägers, kombiniert mit einer stabilen Beladung des Peptids, zugeordnet werden, was zu der gesteuerten Freisetzung des Produkts führt. Ferner kann die kleinere Größe des SSM verglichen mit SSM zusätzlich die Zirkulationszeit erhöhen und eine längere Wirkungsdauer bereitstellen. Aufgrund der kleinen Größe von SSM sind sie zusätzlich in der Lage, in Bereiche zu migrieren, die für Liposomen nicht zugänglich sind, wodurch deren Bioverteilung erhöht wird.
  • In Experimenten, die mit den Vasokonstriktorpeptiden Angiotensin II und Galanin durchgeführt wurden, wurde die gleiche Art einer Zunahme der biologischen Aktivität detektiert, wenn die Peptide mit "S1"-Micellen, hergestellt wie unten in Beispiel 11 beschrieben, assoziiert wurden. Mit Angiotensin II in einer Dosis von 0,06 nmol in Micellenzubereitungen reichte eine Vasokonstriktion vom 2- bis 4-fachen über derjejenigen von Angiotensin II in Salzlösungspuffer alleine. Mit Galanin in einer Dosis von 0,1 nmol in einer S1-Micellenzubereitung (Beispiel 11) war eine Vasokonstriktion etwa zweimal größer als für Galanin in Puffer. Mit einer höheren Dosis (1,0 nmol) wurde die Wirkung von Galanin in Micellen noch beträchtlich größer (etwa 33 %) als für Galanin in Puffer.
  • Beispiel 9
  • Gemäß diesem Beispiel wurde die Rolle von Calmodulin (CaM) auf die vasorelaxanten Wirkungen von VIP in einem SSM gemäß der Verfahren nach Beispiel 7 bestimmt. Spezifisch löste eine Suffusion von 0,1 nmol VIP + CaM in SSM für 7 Min. eine beträchtliche und verlängerte Potenzierung von VIP-SSM induzierter Vasodilation auf die Arteriolen der Hamsterwangenbeutelmikrozirkulation aus. Es gab eine Zunahme des arteriolären Durchmessers von 40 ± 1 % von Grundlinienwerten (8; Mittel ± SEM; jede Gruppe, n = 4; p < 0,05). Eine beträchtliche Vasodilation wurde innerhalb von 2 Min. nach Beginn der Suffusion beobachtet und war innerhalb von 5 Min. maximal. Ein arteriolärer Durchmesser kehrte zur Grundlinie 8 Min., nachdem die VIP + CaM-SSM-Suffusion beendet worden war, zurück. Leeres CaM-SSM und natives VIP alleine zeigten keine beträchtlichen Wirkungen auf den arteriolären Durchmesser (8: Veränderungen des arteriolären Durchmessers während und folgend einer Suffusion von 0,1 nmol (Dreiecke) VIP-SSM, 0,1 nmol (Quadrate) VIP + CaM-SSM und CaM-SSL (Kreise) für 7 Min. Die CaM-Konzentration betrug 10–10 M, Offene Leiste, Dauer der Suffusion. Werte sind Mittel ± SEM; jede Gruppe n = 4; * p < 0,05 verglichen mit der Grundlinie).
  • Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, daß eine Suffusion von VIP + CaM in SSM die beträchtliche, konzentrationsabhängige und verlängerte Vasodilatation der Wangenbeutelzirkulation, induziert durch VIP in SSM, potenzierte. Diese potenzierenden Wirkungen beruhen teilweise auf den Calmodulinwechselwirkungen mit Phospholipid, und somit exponierend ihre hydrophoben Proteinbindungsbereichs. Ferner fördert dieser hydrophobe Bereich die α-Helix-Konformation des VIP aufgrund einer Zunahme der hydrophoben Umgebung des SSM. Die Verstärkung von VIP in der α-Helix-Struktur würde eine verbesserte Induktion des Rezeptor-reaktiven Komplexes bereitstellen und kann ebenfalls zweite Messengerwirkungen von VIP durch Fördern eines direkten Kontakts mit Membranen und membrangebundenen Proteinen erhöhen. Ferner kann die Zugabe von CaM die CMC erniedrigen, was die Zunahme der Micellenanzahl bewirkt, was ferner die Hydrophobie der Lösung erhöht und zu einer Verstärkung der α-Helix-Struktur führt. Diese Zunahme der Menge an aktivem verfügbaren VIP kann der Mechanismus sein, durch den CaM die Vasodilatation von VIP in SSM potenziert.
  • Beispiel 10
  • Gemäß diesem Beispiel werden die hypotensiven Effekte der SSMs der vorangehenden Beispiele auf den mittleren Arteriendruck bestimmt.
  • Um den mittleren Arteriendruck zu bestimmen, wird ein Katheter in die linke Oberschenkelarterie des Hamsters eingeführt, um den systemischen Arteriendruck und die Herzrate unter Verwendung eines Druckumwandlers und eines Strip-Chart-Rekorders (Model 260, Gould Instrument Systems Inc., Velley View, OH) aufzuzeichnen. Eine kontinuierliche Anästhesie der Tiere begrenzte das Überwachen des mittleren Arteriendrucks auf 6 Std. Die mit einer Kanüle versehene Oberschenkelvene wurde verwendet, um die injizierten Produkte intravenös zu verabreichen. VIP in SSM (0,1 nmol) wird intravenös (i.v.) in hypertensive Hamster für 1 Min. mit einer Rate von 0,5 ml/min. injiziert. VIP alleine (0,1 nmol) und leeres SSM (Konzentration äquivalent zu 0,1 nmol, wenn VIP eingekapselt worden war, d. h. ~ 18 nmol Phospholipide) werden ebenfalls in hypertensive Hamster injiziert. Der mittlere Arteriendruck (MAP) wurde alle 5 Min. über 6 Std. berechnet, und Variationen, die mit der Injektion von Anästhetika in Verbindung standen, wurden nicht berücksichtigt.
  • Gemäß einer Erscheinung des Beispiels werden die Wirkungen von VIP-SSM, wenn es intravenös in normotensive Hamster verabreicht wird, untersucht. VIP-SSL (0,1 nmol), leeres SSL und VIP alleine (0,1 nmol) werden in normotensive Hamster mit der gleichen Rate wie für hypertensive Hamster injiziert. Die Temperatur des Hamsters wird durch Verwendung eines Heißwasserpolsters, das unter dem Hamster angeordnet ist, gehalten. Eine intravenöse Verabreichung des VIP-SSM in Hamster mit spontaner Hypertension wird erwartet, um beträchtliche und verlängerte hypertensive Wirkungen auszulösen.
  • Beispiel 11
  • Gemäß dem vorliegenden Beispiel wird ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Micellen umfassend amphiphile Verbindungen entwickelt. Dieses alternative Verfahren zur Herstellung, im Vergleich zu dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, ist leichter zugänglich für eine sichere Herstellung in großem Maßstab von Micellen der Erfindung. Das Verfahren wird wie folgt unter Verwendung von menschlichem Galanin, einem 30-Aminosäureneuropeptid mit zumeist inhibitorischer, hyperpolarisierender, biologischer Aktivität veranschaulicht.
  • DSPE-PEG (16,5 mg, Molekulargewicht 2.748,01) wurde in einem 20 ml Glasröhrchen angeordnet und 6 ml Salzlösungspuffer wurden zu einer endgültigen DSPE-PEG-Konzentration von 1,0 μmol/ml zugegeben. Die Mischung wurde für 1 Min. gevortext, bis die Lösung klar war, woraufhin das Röhrchen mit Argon versehen und mit Parafilm versiegelt wurde. Die Mischung konnte bei Raumtemperatur für 1 Std. stehen oder bis die Bläschen aus der Mischung aufstiegen. Die resultierende Micellenlösung wurde als "S1" bezeichnet. 12 μg menschliches Galanin (Molekulargewicht 3.158,1) wurde in ein Polypropylenröhrchen gegeben und 5 ml der S1-Micellenzubereitung wurden zu dem Röhrchen ergebend eine Endgalaninkonzentration von 1/nmol/1,4 ml zugefügt. Die Mischung wurde für 10 Sek. gevortext und bei Raumtemperatur für 2 Std. inkubiert. Die Größe der resultierenden, Galanin enthaltenden Micellen, 17 bis 20 nm, wurde durch QELS, wie in Beispiel 3 beschrieben, gemessen.
  • Beispiel 12
  • Gemäß dem vorliegenden Beispiel wurden Micellen, zusammengesetzt aus zwei unterschiedlichen Zusammensetzungen, hergestellt und gekennzeichnet, um ein optimales System zur Erhöhung der Löslichkeit von normalerweise wasserunlöslichen Verbindungen zu bestimmen. Im ersten System waren Micellen aus DSPE-PEG und PC zusammengesetzt. Wenn DSPE-PEG mit Phosphatidylcholin (PC) in wäßrigem Medium gemischt wird, werden gemischte Micellen anstelle von Liposomdoppelschichten gebildet. Im zweiten System wurden Micellen unter Verwendung von PC in Kombination mit einem repräsentativen Gallesalz, Natriumtaurocholat (Sigma), gebildet. Wenn oberflächenaktive Mittel mit kleinem Molekulargewicht, wie Gallesalze, mit DSPE-PEG gemischt werden, kann ebenfalls die Bildung von kugelförmigen gemischten Micellen detektiert werden. Der Zweck dieser Studie war (i) den Effekt von DSPE-PEG und Gallesalzen auf die Phosphatidylcholinkapazität (PC), gemischte Micellen zu bilden, zu vergleichen; (ii) Eigenschaften der resultierenden gemischten Micellen, einschließlich eines Micellen-zu-Vesikel-Übergangs durch Verdünnung, zu untersuchen und zu vergleichen; und (iii) ein Löslichmachungspotential der zwei Micellensysteme zu vergleichen.
  • Für beide Zusammensetzungen wurden gemischte Micellenstammlösungen aus Detergenz-Phospholipid durch Co-Ausfällung hergestellt [Alkan-Önyüksel, et al., Pharm. Res. 11:206–212 (1994)]. Kurz gesagt wurde Eier-L-alpha-Phosphatidylcholin vom Typ XIII-E (Sigma) mit entweder DSPE-PEG 2000 (Avanti) oder Natriumtaurocholat (Sigma) mit einem PC/Detergenz-Molverhältnis von 0,7 bzw. 0,8 kombiniert. Der mittlere hydrodynamische Durchmesser der Micellen wurde durch quasi-elektrische Lichtstreuung (siehe Beispiel 3) und Kleinwinkelneutronenstreuung (SANS) gemessen [Hjelm, et al., J. Phys. Chem. 96:8653–8661 (1992)]. Bei der Einstufung des Micellen-zu-Vesikel-Übergangs wurden die zwei Stammlösungen schnell in einem Schritt verdünnt, und Micellen-zu-Vesikel-Übergangskurven wurden bestimmt durch Verfolgung der Veränderung der Aggregatgröße bei wäßriger Verdünnung bei Raumtemperatur in der Gegenwart oder Abwesenheit von Gegenionen.
  • Die mittlere Größe der DSPE-PC-Micellen war durchweg größer (17 bis 22 nm) als bei Micellen, die Gallesalze enthielten (3 bis 5 nm). Wässrige Verdünnungen von mit Gallesalz gemischten Micellen resultierten in einem detektierbaren Micellen-zu-Vesikel-Übergang, jedoch wurde kein Übergang unter ähnlichen Bedingungen mit den mit DSPE-PEG/PC gemischten Micellen beobachtet. Gallesalze, wenn sie zu vorgeformten PC-Liposomdispersionen zugefügt wurden, resultierten in der Bildung von gemischten Micellen aus den vorexistierenden Liposomen, wohingegen die Zugabe von DSPE-PEG zu PC-Liposomen keinen Vesikel-zu-Micellen-Übergang zeigte. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die hydrophile PEG-Komponente der DSPE-PEG-Moleküle Micellen/Micellen- oder Doppelschicht/Micellenwechselwirkungen verhindert. Da DSPE-PEG Liposome nicht löslich machte, wird angenommen, daß es eine Plasmamembran nicht löslich machen wird. Dieses Ergebnis zeigte das Potential für eine geringere Plasmamembrantoxizität von DSPE-PEG gegenüber Gallesalzen.
  • Ein Löslichmachungspotential beider Micellenzusammensetzungen für ein Modellarzneimittel wurde durch HPLC nach Separation des nicht integrierten Arzneimittels gemessen. Zu Zwecken dieser Reihe von Experimenten wurde Progesteron, praktisch unlöslich in einer wässerigen Umgebung, als das Modellarzneimittel ausgewählt.
  • Zusätzlich war die Löslichkeit von Progesteron in DSPE-PEG-Micellen etwa 5-mal größer als für Gallesalzmicellen (von 21 μg/ml). bis 198 ± 7 μm/ml) für die gleiche Gesamtlipidkonzentration, wodurch nahegelegt wird, daß die DSPE-PEG-Micellen ein größeres Potential als ein effizientes Vehikel für unlösliche Arzneimittel aufweisen. Jedoch enthielt diese Dispersion sowohl SSM (mit etwa 17 nm) und SSC (mit etwa 150 nm).
  • Beispiel 13
  • Gemäß dem vorliegenden Beispiel wurde eine verbesserte Löslichkeit von normalerweise wasserunlöslichen Verbindungen weiter untersucht unter Verwendung einer DSPE-PEG-Micellenzusammensetzung. Zusätzlich wurde ein Verfahren zum Herstellen von Micellen umfassend ein zielendes Agens zusätzlich zu einer eingekapselten, wasserunlöslichen Verbindung entwickelt. Die Arzneimittellöslichkeit wurde wie folgt bestimmt.
  • Eine aktive Arzneimittelbeladung wurde durch Zufügen eines Überschusses des Arzneimittels in Pulverform zu einem Polyethylenmikrofugröhrchen enthaltend PC/Gallesalz oder DSPE-PEG hergestellt unter Verwendung des Filmverfahrens wie zuvor in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Überschüssiges Arzneimittel wurde durch Zentrifugation entfernt und die überstehende Flüssigkeit wurde durch HPLC analysiert. Im Falle von Progesteron schlossen HPLC-Bedingungen eine YMC-CN-Säule (A-503, 250 × 4,6 mm innerer Durchmesser), eine mobile Phase umfassend Acetonitril und Wasser (40:60) und eine Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 ml/Min. ein. HPLC-Eluent wurde mit Adsorption bei 254 nm gemessen. Für PC/Gallesalz-gemischte Micellen wurde das Progesteron-zu-Lipid-Verhältnis auf 0,0156 bestimmt. Für DSPE-PEG-Micellen wurde für das Progesteron-zu-Lipid-Verhältnis 0,17 gefunden.
  • Ergebnisse zeigten, daß Progesteron (im wesentlichen unlöslich in Wasser, wie oben diskutiert) in 10 mg/ml DSPE-PEG bis zu 198,5 μg/ml löslich war. Dieses Ergebnis war mit Ergebnissen unter Verwendung von Betulinsäure (betulinic acid), sparsam löslich in Wasser (siehe Merck Index, 12. Auflage, S. 1213), konsistent, welche bis zu 200 μg/ml in 10 mg/ml DSPE-PEG löslich war. In ähnlichen Experimenten mit Betulinsäure (betulinic acid), (ebenfalls unlöslich, wie in der USP definiert) wurde eine Löslichkeit von 250 μg/ml in entweder SSM oder SSC berechnet.
  • Bei der Entwicklung eines Zielarzneimittelliefersystems umfassend Micellen wird eine gewünschte Verbindung in Micellenzusammensetzungen, wie oben beschrieben, integriert. Die resultierenden Micellenzusammensetzungen werden dann mit einer amphiphilen Verbindung inkubiert, um eine Integration der Verbindung auf und in die Micellenfläche, wie in Beispiel 1 beschrieben, zu ermöglichen. Die mit einer Membran assoziierte Verbindung wirkt in dieser Anordnung als ein zielendes Agens für die gesamte zu liefernde Micellenzusammensetzung, die beispielsweise an einen Rezeptor für die mit einer Membran assoziierte Verbindung zu liefern ist. In einem alternativen Ansatz wird die amphile Verbindung, bevorzugt durch kovalente Modifikation, an eine der Lipidkomponenten der Micelle angeknüpft. Durch beide dieser Mechanismen können die Micellen das integrierte Arzneimittel zu einer Zielzelle oder Gewebeart, die den verwandten Rezeptor exprimiert, tragen und liefern.
  • Beispielsweise exprimieren Brustkrebszellen höhere Gehalte an VIP-Rezeptor als normale Brustzellen. Micellen, die membranassoziiertes VIP umfassen, werden daher bevorzugt an Brustkrebszellen als an normale Zellen anbinden. Da für Taxol® gezeigt worden ist, Brustkrebszellen zu töten, zeigt die Integration von Taxol® in eine VIP/Micelle eine Zielarzneimittellieferung für das selektive Töten des karzinomartigen Zelltyps.
  • Beispiel 14
  • Gemäß dieser Erscheinung wurde die Wirkung einer Infusion von Enthelin-1 (ET-1) alleine oder in einer SSM-Zubereitung auf den mittleren Arteriendruck (MAP), Herzförderleistung pro Minute (CO), Gesamtperipheralresistenz (TPR) und regionale Blutzirkulation bei anästhesierten Ratten unter Verwendung einer radioaktiven Mikrokügelchenmethode untersucht. SSM mit oder ohne ET-1 wurden gemäß dem in Beispiel 11 beschriebenen Verfahren unter Verwendung von DSPE-PEG in Salzlösung hergestellt. Behandlungen für einzelne Gruppen bestanden aus: (i) Kontrolle, SSM mit 2,7 mg/ml (n = 6); (ii) ET-1-Infusion mit 50 ng/kg/min (n = 5) und (iii) ET-1 mit 50 ng/kg/min in SSM (n = 8). Arzneimittel wurden mit 0,1 ml/min für 30 Min. per Infusion gegeben.
  • Die Ergebnisse zeigten, daß SSM nicht MAP, CO, TPR oder Magen-Darmtrakt-Blutfluß (GIT) beeinflußt, jedoch wurde eine Zunahme des Blutflusses zu den Nieren (etwa 25 %) und zum Gehirn (etwa 19 %) verglichen zur Grundlinie beobachtet. Der Blutfluß nahm ab und vaskuläre Resistenz nahm in der Niere, GIT und dem Gehirn zu. ET-1 in SSM erzeugte einen beträchtlich markanten kardiovaskulären Effekt verglichen mit ET-1 alleine. Die Zunahme in TPR war eine 102 % in der ET-1-Gruppe und 227 % in der Gruppe, die mit ET-1 in SSM behandelt worden war. Renale vaskuläre Resistenz war 76 % in der ET-1-Gruppe und 281 % in der Gruppe, die mit ET-1 in SSM behandelt worden war. Jedoch war im Gehirn die vaskuläre Resistenz 62 % in der ET-1-Gruppe und 20 % in der Gruppe, die mit ET-1 in SSM behandelt worden war. Diese Ergebnisse zeigten, daß Veränderungen bezüglich MAP, TPR und regionaler vaskulärer Resistenz durch ET-1 in SSM potenziert werden.
  • Beispiel 15
  • Gemäß dieser Erscheinung wurde die Fähigkeit der Micellenprodukte der Erfindung untersucht, um eine zelluläre Lebensfähigkeit folgend einer Kryokonservierung zu verbessern. In diesem Experiment wurden Zellen mit entweder DMSO, DSPE-PEG-Micellenprodukten oder DSPE-PEG-Micellenprodukten einschließend VIP für 30 Min. vor einer Lagerung für 48 Std. in flüssigem Stickstoff inkubiert. Folgend dem Entfernen aus dem flüssigen Stickstoff wurden die Zellen aufgetaut und die Lebensfähigkeit wurde unter Verwendung von Trypanblue unter Verwendung von Standardmethoden gemessen.
  • Die Ergebnisse zeigten, daß die Zellebensfähigkeit folgend der Behandlung mit Micellen, mit oder ohne assoziiertem VIP, gleich oder größer war als die Zellebensfähigkeit folgend einer Behandlung mit DMSO. Da DMSO auf dem Fachgebiet für Zellkryokonservierung gut bekannt und routinemäßig verwendet wird, zeigen diese Ergebnisse, daß Micellen gleichen oder besseren Schutz leisten können, wodurch ein alternatives schützendes Agens zur Zellagerung bereitgestellt wird.
  • Zahlreiche Modifikationen und Variationen der Erfindung, wie sie in den obigen veranschaulichenden Beispielen dargelegt wurden, können Fachleuten auf dem Gebiet ersichtlich sein. Folglich sollten lediglich solche Begrenzungen, wie sie in den beigefügten Ansprüchen erscheinen, für die Erfindung beachtet werden.

Claims (23)

  1. Verfahren zum Herstellen eines biologisch aktiven, sterisch stabilisierten Micellenprodukts, umfassend eine oder mehrere biologisch aktive Verbindungen und eine oder mehrere zielende Verbindungen, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Auflösen in einem organischen Lösungsmittel der biologisch aktiven Verbindung(en) und eines oder mehrerer Lipide, wobei wenigstens ein Lipid mit einem wasserlöslichen Polymer zusammengesetzt ist; b) Entfernen des organischen Lösungsmittels, um einen trockenen Film zu belassen; c) Hydratisieren des trockenen Films mit einer wäßrigen Lösung; d) Bilden von sterisch stabilisierten Micellenprodukten; und e) Inkubieren der Micellenprodukte mit einer oder mehreren zielenden Verbindungen unter Bedingungen, wo die zielende(n) Verbindung(en) mit den Micellenprodukten assoziiert ist bzw. sind.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine oder mehrere zielende Verbindung(en) kovalent mit wenigstens einem Lipid in einer Weise assoziiert ist bzw. sind, die es der bzw. den zielenden Verbindung(en) ermöglicht, mit einem Bindungspartner der zielenden Verbindung(en) wechselzuwirken.
  3. Verfahren zum Herstellen eines biologisch aktiven, sterisch stabilisierten, kristallinen Produkts umfassend eine oder mehrere biologisch aktive Verbindungen, die in einer wäßrigen Lösung unlöslich ist bzw. sind, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Auflösen in einem organischen Lösungsmittel der biologisch aktiven Verbindung(en) und eines oder mehrerer Lipide, wobei wenigstens ein Lipid mit einem wasserlöslichen Polymer zusammengesetzt ist; b) Entfernen des organischen Lösungsmittels, um einen trockenen Film zu belassen; c) Hydratisieren des trockenen Films mit einer wäßrigen Lösung; und d) Bilden eines sterisch stabilisierten kristallinen Produkts.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das organische Lösungsmittel durch Gefriertrocknung entfernt wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, weiter umfassend den Schritt eines Inkubierens der kristallinen Produkte mit einer oder mehreren zielenden Verbindung(en) unter Bedingungen, wo die zielende(n) Verbindung(en) mit den kristallinen Produkten assoziiert bzw. assoziieren.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei eine oder mehrere zielende Verbindung(en) kovalent mit wenigstens einem Lipid in einer Weise assoziiert ist bzw. sind, die es der bzw. den zielenden Verbindung(en) ermöglicht, mit einem Bindungspartner der zielenden Verbindung(en) wechselzuwirken.
  7. Produkt, erhältlich mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend das Produkt nach Anspruch 7.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die unlösliche Verbindung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Progesteron, Testosteron, Östrogen, Prednisolon, Prednison, 2,3-Mercaptopropanol, Amphotericin B, Betulinsäure, Camptothecin, Diazepam, Nystatin, Propofol, Cyclosporin A, Doxorubicin und Taxol®.
  10. Produkt erhältlich mit dem Verfahren nach Anspruch 9.
  11. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend das Produkt nach Anspruch 10.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die unlösliche Verbindung ein Fragment, Analogon oder Modulator einer Verbindung ist, die ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Progesteron, Testosteron, Östrogen, Prednisolon, Prednison, 2,3-Mercaptopropanol, Amphotericin B, Betulinsäure, Camptothecin, Diazepam, Nystatin, Propofol, Cyclosporin A, Doxorubicin und Taxol®.
  13. Produkt erhältlich mit dem Verfahren nach Anspruch 12.
  14. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend das Produkt nach Anspruch 13.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 5 oder 6, wobei die zielende Verbindung ein Mitglied der VIP/GRF-Familie von Proteinen ist.
  16. Produkt erhältlich mit dem Verfahren nach Anspruch 15.
  17. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend das Produkt nach Anspruch 16.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 5 oder 6, wobei die zielende Verbindung ein Fragment, Analogon oder Modulator von Protein der VIP/GRF-Familie von Proteinen ist.
  19. Produkt erhältlich mit dem Verfahren nach Anspruch 18.
  20. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend das Produkt nach Anspruch 19.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei das kristalline Produkt eine Größe von kleiner als 300 nm aufweist.
  22. Produkt erhältlich mit dem Verfahren nach Anspruch 21.
  23. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend das Produkt nach Anspruch 22.
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