WO2024024892A1 - 凍結保存用の組成物、凍結保存方法、及び凍結した細胞又は生体組織 - Google Patents

凍結保存用の組成物、凍結保存方法、及び凍結した細胞又は生体組織 Download PDF

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WO2024024892A1
WO2024024892A1 PCT/JP2023/027582 JP2023027582W WO2024024892A1 WO 2024024892 A1 WO2024024892 A1 WO 2024024892A1 JP 2023027582 W JP2023027582 W JP 2023027582W WO 2024024892 A1 WO2024024892 A1 WO 2024024892A1
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cryopreservation
cells
nanoparticles
cell
composition
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PCT/JP2023/027582
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Inventor
堀口 道子 原
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公立大学法人山陽小野田市立山口東京理科大学
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to compositions for cryopreservation, cryopreservation methods, and frozen cells or biological tissues.
  • Regenerative medicine is a treatment method that uses cells, etc. to treat diseases, trauma, etc.
  • Regenerative medicine has recently been adopted as a treatment for various diseases such as myocardial infarction, chronic arterial occlusion disease, and leukemia, as well as trauma such as spinal cord injury and traumatic cartilage defect.
  • cells and the like used in regenerative medicine have been cryopreserved from the viewpoints of transportability, long-term storage, convenience, and the like.
  • phenomena such as a decrease in cell survival rate, cell dysfunction (for example, a decrease in the proportion of stem cells in the case of stem cells), and growth inhibition (hereinafter, these phenomena are collectively referred to as "cell damage") can occur.
  • cell damage phenomena
  • a possible cause is a change in the shape of the cells.
  • the problem to be solved by one embodiment of the present invention is to provide a composition for cryopreservation of cells or living tissues that reduces cell damage caused by cryopreservation.
  • Another problem to be solved by another embodiment of the present invention is to provide a method for cryopreservation of cells or biological tissues that reduces cell damage caused by cryopreservation.
  • a composition for cryopreservation of cells or biological tissues which contains amphipathic molecules as a constituent, and the amphipathic molecules include single-layer or double-layer nanoparticles.
  • ⁇ 4> The cryopreservation composition according to ⁇ 1> or ⁇ 2> above, wherein the nanoparticles have a zeta potential of 10 mV or more and 50 mV or less.
  • ⁇ 5> The cryopreservation composition according to ⁇ 1> or ⁇ 2> above, wherein the nanoparticles have a volume average particle diameter of 30 nm or more and 300 nm or less.
  • ⁇ 6> The cryopreservation composition according to ⁇ 1> or ⁇ 2> above, wherein the nanoparticles include ferulic acid or activated vitamin C.
  • ⁇ 7> A step of mixing cells or biological tissues with the cryopreservation composition described in any one of ⁇ 1> to ⁇ 6> above and introducing nanoparticles into the cells or biological tissues; freezing the cells or biological tissue into which the nanoparticles have been introduced; A method for cryopreservation of cells or biological tissues, including ⁇ 8> Frozen cells or biological tissue containing amphipathic molecules as a constituent, and the amphiphilic molecules containing single-layer or double-layer nanoparticles.
  • a composition for cryopreservation of cells or living tissue is provided, which reduces damage to cells or living tissue due to cryopreservation.
  • a method for cryopreservation of cells or living tissue is provided that reduces damage to cells or living tissue due to cryopreservation.
  • FIG. 3 is a diagram showing the particle size distribution of nanoparticles contained in the composition of Example 3 in Test Example 1.
  • FIG. FIG. 3 is a diagram showing the results of observing nanoparticles introduced into cells using a transmission electron microscope in Test Example 3.
  • composition for cryopreservation contains amphipathic molecules as a component, and the amphipathic molecules are formed in a single layer or in two layers.
  • layer nanoparticles hereinafter also referred to as “the subject nanoparticles”.
  • Cells or biological tissues that are frozen with the nanoparticles introduced into the cells can be absorbed by the nanoparticles by exhibiting a cushioning function (buffering function) against external forces and temperature changes applied to the cells. Crystallization and crystal growth of contained water are suppressed, and cell walls, cell organelles, etc. are less likely to be damaged. Further, even when cells that are frozen with the present nanoparticles introduced therein are thawed, the shape of the cells is likely to be maintained due to the presence of the present nanoparticles. As a result, it is thought that damage caused by cryopreservation will be reduced.
  • cushioning function buffering function
  • nanoparticles such as liposomes and micelles have conventionally been used as a technology for introducing pharmacological components into target sites, such as in drug delivery systems.
  • the invention according to the present disclosure focuses on the buffering function of the nanoparticles themselves for cells, and the physical properties of the nanoparticles are effective in reducing cell damage caused by cryopreservation of cells. This is based on the knowledge that it works effectively.
  • the cryopreservation composition of the present invention includes amphipathic molecules as a constituent component, and the amphipathic molecules include nanoparticles in which the amphipathic molecules have a single layer or a double layer.
  • the composition for cryopreservation may contain only single-layer nanoparticles, only bi-layer nanoparticles, or both single-layer nanoparticles and bi-layer nanoparticles.
  • the above-mentioned single-layer nanoparticles refer to nanoparticles in which amphiphilic molecules are assembled to form a single layer.
  • Specific examples of single-layer nanoparticles include micelles.
  • the above-mentioned two-layer nanoparticle means a nanoparticle containing a double membrane formed by two layers of amphiphilic molecules.
  • the two-layered nanoparticles mentioned above include (1) liposomes, which are vesicles that contain lipids as a constituent and contain a double membrane of the lipids, and (2) liposomes, which have surfactants other than lipids as constituents. , vesicles containing a double membrane of that surfactant.
  • vesicles containing double membranes have two or more double membranes, even if they are small unilamellar liposomes (SUVs) or large unilamellar liposomes (LUVs), which have one double membrane.
  • SUVs small unilamellar liposomes
  • LUVs large unilamellar liposomes
  • MDLs Multilamellar liposomes
  • the micelles are preferably micelles in which hydrophilic groups are gathered on the outside and hydrophobic groups are gathered on the inside.
  • the volume average particle diameter of the present nanoparticles can be 10 nm or more and 300 nm or less, and may be 20 nm or more and 200 nm or less, or 30 nm or more and 150 nm or less.
  • the smaller the volume average particle diameter of the nanoparticles the easier it is to be distributed in every corner of the cell, and the easier it is for the cell shape to be maintained when the cells are frozen.
  • the volume average particle diameter of the nanoparticles is 300 nm or less, the nanoparticles can be more efficiently introduced into cells.
  • the method for controlling the volume average particle diameter of the present nanoparticles is not particularly limited, and examples thereof include methods such as sizing, which is adjusted by the pore size of the filter used during the production of the present nanoparticles.
  • extrusion treatment may be used, in which the nanoparticles are passed through a filter having pores under pressure, and the particle diameter is made uniform by physical shearing force.
  • the present nanoparticles may be cationic nanoparticles, neutral nanoparticles, or anionic nanoparticles, but cationic nanoparticles are more preferable.
  • the inside of a cell is at a negative potential relative to the outside of the cell. Therefore, when the present nanoparticle is a cationic nanoparticle, the present nanoparticle is likely to be efficiently introduced into a wide area within the cell due to the interaction between ions. As a result, cell damage caused by cryopreservation is further reduced.
  • Cationic nanoparticles refer to nanoparticles with a zeta potential of more than 10 mV.
  • Neutral nanoparticles refer to nanoparticles with a zeta potential of ⁇ 10 mV or more and 10 mV or less.
  • Anionic nanoparticles refer to nanoparticles with a zeta potential of less than -10 mV.
  • the zeta potential of the nanoparticles is preferably 10 mV or more and 80 mV or less, more preferably 15 mV or more and 70 mV or less, even more preferably 20 mV or more and 60 mV or less, and particularly preferably 25 mV or more and 50 mV or less.
  • the zeta potential of the present nanoparticle is 10 mV or more, the membrane of the present nanoparticle is appropriately positively charged. Therefore, the present nanoparticles are more easily introduced into cells efficiently, and cell damage caused by cryopreservation is further reduced.
  • the zeta potential and volume average particle diameter of the present nanoparticles can be measured, for example, as follows. 1 mL of the cryopreservation composition diluted 100 times with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) is collected and filled into a 1 mL cell for measurement. Then, this is measured at room temperature (25° C.) using a particle size/zeta potential measuring device (ZETASIZER PRO, manufactured by Malvern).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the surface charge of the present nanoparticles that is, the value of the zeta potential, is affected by the charge of the amphiphilic molecules that constitute the present nanoparticles. Therefore, when preparing nanoparticles with a desired zeta potential, a method for preparing the nanoparticles of the present invention can be mentioned by appropriately selecting or changing amphiphilic molecules according to the zeta potential.
  • amphipathic molecules examples include surfactants, which may be synthetic surfactants or natural or biologically derived surfactants.
  • Examples of synthetic surfactants include Gemini type surfactants.
  • Gemini-type surfactants have a hydrophilic group and a hydrophobic group in one molecule, and are connected to each other via the hydrophilic groups by a spacer group, and are dimeric surfactants with two surfactant units or three surfactants. It is a trimeric surfactant with surface active units.
  • the hydrophobic group constituting the Gemini type surfactant can include a straight hydrocarbon chain having 8 to 24 carbon atoms, preferably 12 to 18 carbon atoms, and more preferably 12 or 16 carbon atoms.
  • a saturated hydrocarbon chain is preferred from the viewpoint of nanoparticle stability.
  • the straight hydrocarbon chains constituting the two or three hydrophobic groups may be the same or different, but are preferably the same.
  • Hydrophilic groups constituting the Gemini surfactant include polar groups and ionic groups. Elements that generate counterions in hydrophilic groups can be adjusted as appropriate depending on the aqueous solution used, but include bromine (Br), chlorine (Cl), nitrogen (N), sodium (Na), phosphorus (P), and boron. (B), iodine (I), fluorine (F), sulfur (S), oxygen (O), carbon (C), beryllium (Be), iron (Fe), calcium (Ca), magnesium (Mg) These can also be used in appropriate combinations.
  • the spacer is usually a hydrocarbon chain and preferably has a length to provide sufficient distance so that the hydrophobic groups can act independently of each other.
  • the number of carbon atoms in the spacer is not particularly limited, but may be 2 to 12, preferably 2 to 8, more preferably 2 to 4, and most preferably 2 or 3.
  • amphipathic lipids examples include amphipathic lipids.
  • the amphipathic lipid may be a phosphorus-free lipid or a phospholipid. Moreover, it may be a cationic lipid, a neutral lipid, an anionic lipid, or a combination thereof.
  • Phosphorus-free lipids include N-(2,3-dioleoyloxy-1-propyl)trimethylammonium methylsulfate (DOTAP), N-[1-(2,3-oleyloxy)propyl]-N,N , N-trimethylammonium chloride (DOTMA), dioctadecylamide-glycylspermine (DOGS), and the like.
  • DOTAP N-(2,3-dioleoyloxy-1-propyl)trimethylammonium methylsulfate
  • DOTMA N-[1-(2,3-oleyloxy)propyl]-N,N
  • DOGS dioctadecylamide-glycylspermine
  • phospholipids include 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE), 1,2- Phosphoethanolamines such as dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) and diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPhPE), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), diphthanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ( Phosphocholine such as DPhPC) can be mentioned.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • the amphipathic molecule may be composed of a surfactant into which a labeling substance (for example, coumarin, a fluorescent molecule such as FITC (fluorescein isothiocyanate), a maleimide group, a PEG group, etc.) is introduced into the molecule.
  • a labeling substance for example, coumarin, a fluorescent molecule such as FITC (fluorescein isothiocyanate), a maleimide group, a PEG group, etc.
  • the present nanoparticle preferably contains cholesterol, and it is more preferable that the membrane of the present nanoparticle contains cholesterol.
  • the membrane fluidity of the nanoparticles is improved compared to membranes that do not contain cholesterol.
  • composition for cryopreservation may further contain other components (hereinafter also simply referred to as "other components") other than the present nanoparticles.
  • other components include, for example, encapsulated components contained in the nanoparticles; dispersion medium, amphipathic molecules that did not form a single layer or two layers during the production process of the nanoparticles, or aggregates thereof, etc. can be mentioned.
  • Encapsulated component refers to a component that is incorporated into the membrane of the nanoparticle, a surfactant that makes up the nanoparticle, or a component that is included in the internal aqueous phase.
  • Inclusion components include labeling substances (e.g. fluorescent substances such as coumarin), fat-soluble drugs, water-soluble drugs, nucleic acids, proteins, antibodies, crystalline drugs, biologically derived components, water-soluble vitamins, water-soluble vitamin derivatives, and fat-soluble drugs.
  • Ingredients include vitamins, fat-soluble vitamin derivatives, and the like.
  • Specific encapsulated components include, for example, active vitamin C and active vitamin A, which have a cell-protecting effect; ferulic acid and hyaluronic acid, which are water-retaining components.
  • the nanoparticles preferably contain at least one selected from the group consisting of water-soluble vitamins, water-soluble vitamin derivatives, and ferulic acid, and more preferably contain at least one of ferulic acid and activated vitamin C. preferable.
  • ferulic acid and active vitamin C have excellent antioxidant ability and water retention ability, so by including at least one of these in the nanoparticles of the present invention, cell damage caused by cell cryopreservation is further suppressed.
  • the nanoparticles of the present invention are preferably dispersed in a dispersion medium.
  • the dispersion medium include water, buffer solutions, water-soluble solvents, liquid media, and the like.
  • the dispersion medium may be used alone or in combination of two or more.
  • water examples include distilled water, ion-exchanged water, ultrafiltrated water, and pure water.
  • the content of water is preferably 70% by mass or more, more preferably 80% by mass or more and 90% by mass or less, and even more preferably 90% by mass or more and 100% by mass or less, based on the total amount of the dispersion medium.
  • the buffer examples include phosphate buffer (PBS), trishydroxymethylaminomethane buffer (TRIS), hydroxyethylpiperazine ethanesulfonic acid buffer (HEPES), borate buffer, acetate buffer, etc. .
  • the concentration of the buffer solution is preferably used in a range comparable to the human plasma osmotic pressure of 285 ⁇ 5 m0sm/L according to the osmotic pressure value.
  • the pH of the buffer is not particularly limited, for example, from the viewpoint of cell viability, it is preferably pH 5 or more and pH 10 or less, and more preferably pH 6 or more and pH 9 or less. pH is a value measured at 25°C using a pH meter (the same applies below).
  • Water-soluble solvent means a solvent that is miscible with water.
  • water-soluble solvents examples include alcohols such as methanol and ethanol from the viewpoint of lipid solubility.
  • the water-soluble solvent for example, the water-soluble solvent used to dissolve amphipathic molecules such as lipids prepared in the manufacturing process of the present nanoparticles may be used as is.
  • liquid media examples include known media used for culturing stem cells. More specifically, liquid media include, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM:F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12), EMEM (Eagle's minimal essential medium), and these media.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • DMEM:F-12 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12
  • EMEM Eagle's minimal essential medium
  • PDGF Platelet-derived growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • nerve growth Examples include a liquid medium to which a cell growth factor such as NGF is added.
  • the liquid medium may be a commercially available product.
  • the pH of the liquid medium may be, for example, pH 7.0 to 8.0, or pH 7.3 to 7.4.
  • the pH of the composition for cell cryopreservation is not particularly limited, but for example, from the viewpoint of cell viability, it is preferably pH 4 or more and pH 12 or less, more preferably pH 5 or more and pH 11 or less. preferable.
  • the method for producing the composition for cryopreservation is not particularly limited, and known methods can be applied.
  • the method for producing the composition for cryopreservation includes, for example, the components constituting the film of the nanoparticles (materials such as surfactants (including the encapsulated components if there are any encapsulated components to be encapsulated in the nanoparticles)).
  • a manufacturing method comprising: a first step of mixing a solution dissolved in a water-soluble solvent with water or a buffer solution to obtain a dispersion containing the nanoparticles; and a second step of filtering the dispersion. It's okay.
  • the particle size of the nanoparticles is adjusted.
  • a dispersion containing at least one of the present nanoparticles is obtained.
  • This dispersion liquid is prepared by mixing a solution in which the components constituting the film of the nanoparticles are dissolved in a water-soluble solvent (e.g., alcohol) and water or a buffer solution, and controlling the conditions (e.g., pH, temperature).
  • a water-soluble solvent e.g., alcohol
  • water or a buffer solution e.g., water or a buffer solution
  • the conditions e.g., pH, temperature
  • a dispersion containing liposomes can be prepared by mixing ethanol and lipids to dissolve the lipids, and mixing and stirring the mixture in water while adjusting the pH.
  • excess amphiphilic molecules such as cholesterol and phospholipids that do not contribute to the formation of the nanoparticles, and if there are components to be encapsulated, unencapsulated components may be removed using a dialysis membrane, etc. .
  • the dispersion obtained in the first step is subjected to extrusion treatment using a filter.
  • a filter By extrusion treatment, the size of the nanoparticles can be adjusted (sizing).
  • the filter may be appropriately selected from commercially available products by selecting a desired pore size depending on the purpose and the like.
  • the cryopreservation method consists of a step of mixing cells or biological tissues with the cryopreservation composition and introducing the nanoparticles into the cells (hereinafter referred to as the "introduction step”);
  • the method includes a step of freezing the cells or living tissue (hereinafter also referred to as “freezing step”).
  • freezing a living tissue the above-mentioned "introduction into a cell” means “introduction into a cell constituting a living tissue.” According to the present cryopreservation method, cell damage caused by cryopreservation is reduced.
  • the cells to be frozen in the present cryopreservation method are not particularly limited, and known cells that are cryopreserved can be employed.
  • the cells include human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hAD-MSC), human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC-BM), neural stem cells, skin stem cells, hematopoietic stem cells, dental pulp stem cells, Somatic stem cells such as liver stem cells, muscle stem cells, and adipose stem cells; Pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells); Blood cells such as lymphocytes and neutrophils; Organs of epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), smooth muscle cells, melanocytes, hair cells, hepatocytes, gastric mucosal cells, intestinal cells, splenocytes, pancreatic cells (pancreatic exocrine cells,
  • the cells or biological tissue and the composition for cryopreservation are mixed and the nanoparticles are introduced into the cells (in the case of freezing a biological tissue, cells constituting the biological tissue, hereinafter the same).
  • the medium is not particularly limited, and includes known media used for culturing stem cells.
  • the medium includes the liquid medium described above.
  • the means for introducing the nanoparticles into cells is not particularly limited, and examples include the following methods (I) to (IV): (I) Method of adding the cryopreservation composition to a medium containing cells (II) Method of centrifuging the cell-containing medium and removing the supernatant before adding the cryopreservation composition (III) Culture A method of adding cells detached from a container to the composition for cryopreservation. (IV) A method of introducing into cells using voltage by electroporation.
  • the means for freezing cells or biological tissues is not particularly limited, and any known freezing method can be employed.
  • the temperature at which cells or biological tissues are frozen is preferably within the range of -30°C to -196°C (preferably -80°C to -196°C).
  • the means for freezing cells or living tissues for example, from the viewpoint of further reducing cell damage caused by cryopreservation, it is preferable to freeze cells or living tissues using a deep freezer or liquid nitrogen.
  • the freezing period is not particularly limited, and examples include 0.5 days to 50 years, 1 day to 10 years, 1 week to 5 years, and 1 month to 1 year.
  • the present cryopreservation method may further include steps other than the introduction step and freezing step.
  • steps other than the introduction step and freezing step examples include a storage step in which frozen cells are stored at an appropriate temperature.
  • the frozen cells or living tissue according to this embodiment are frozen cells or living tissue containing the nanoparticles.
  • This frozen cell or biological tissue can be produced by the present cryopreservation method described above.
  • Example 1 Preparation of composition for cryopreservation
  • double membrane vesicles containing DOTAP as a constituent were prepared by an organic solvent injection method according to the following procedure.
  • (1) 5.3 ml of PBS (pH at 25°C 7.4) was placed in a beaker and stirred at 25°C.
  • the obtained nanoparticle solution was set in the LF-STB Liposophasto Stabilizer manufactured by Avestin, and the filter pore sizes used were set to 1000 nm, 800 nm, 400 nm, 200 nm, 100 nm, and 50 nm in this order while applying pressure. Sizing was done by passing it through.
  • the obtained liquid composition containing nanoparticles was used as the cryopreservation composition of Example 1.
  • the pH of the cell cryopreservation composition (under 25°C conditions) was 7.2.
  • Examples 2 to 5 Cryopreservation compositions of Examples 2 to 5 were obtained using the same specifications as in Example 1, except that the type of amphipathic molecule was changed from DOTAP to DOPE, Gemini type, DPPC, and DSPE.
  • "Gemini type” means “Gemini type surfactant”.
  • the molecular structure of the Gemini surfactant used in Example 3 and Examples 8 and 13 described below is shown below. It is a dimeric surfactant with two surface-active units, the hydrophobic group consists of a hydrocarbon chain with 12 carbon atoms, the spacer group consists of 3 carbon atoms, and the elements that generate counterions are bromine and nitrogen. Consisting of
  • Example 6 to 15 The cryopreservation compositions of Examples 6 to 15 were prepared by the same method as Examples 1 to 5, except that the operation (1) for preparing the cryopreservation composition of Example 1 was changed to the operation (1') shown below. I got something.
  • Examples 6 to 10 are compositions for cryopreservation containing ferulic acid-containing nanoparticles containing DOTAP, DOPE, Gemini type, DPPC, and DSPE as constituent components
  • Examples 11 to 15 are compositions for cryopreservation containing nanoparticles containing ferulic acid. , Gemini type, DPPC, and DSPE as constituent components, and is a cryopreservation composition containing nanoparticles containing active vitamin C.
  • the active vitamin C used in Examples 11 to 15 is a compound having the following molecular structure.
  • Comparative example 1 In Comparative Example 1, 1 mL of a mixed solution of 10% by volume dimethyl sulfoxide (DMSO), 40% by volume fetal bovine serum (FBS), and 50% by volume stem cell medium was used as a cryopreservation composition.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • FBS fetal bovine serum
  • stem cell medium 50% by volume
  • Example 1 ⁇ Volume average particle diameter and zeta potential> The volume average particle diameter and zeta potential of the cryopreservation composition of each example were measured. Specifically, 1 mL of a solution obtained by diluting the cryopreservation compositions of Examples 1 to 5 100 times with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) was collected and filled into a 1 mL cell for measurement. . Then, this was measured at room temperature (25° C.) using a particle size/zeta potential measuring device (ZETASIZER PRO, manufactured by Malvern). The results are shown in Table 1. Furthermore, the particle size distribution of the nanoparticles contained in the cryopreservation composition of Example 1 is shown in FIG.
  • PBS phosphate buffered saline
  • cryopreservation compositions of Examples 1 to 5 were evaluated according to the following procedure. (1) Freeze-thawed human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hAD-MSCs) were seeded at 2000 cells/well on a collagen-coated 8-well chamber slide. (2) The cryopreservation compositions of Examples 1 to 5 labeled with the fluorescent dye coumarin were added to the wells and incubated at 37°C for 30 minutes.
  • DAPI solution (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride solution) was used to stain cell nuclei.
  • DAPI solution 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride solution
  • Example 3 ⁇ Transmission electron microscope> Nanoparticles introduced into cells by the method of Test Example 2 were observed using a transmission electron microscope.
  • the cryopreservation composition of Example 3 (Gemini type) was labeled using gold nanoparticles (Cytodiagnostics). The labeled cryopreservation composition was exposed to ADSC for 30 minutes.
  • ADSCs were fixed overnight at 4°C using phosphate buffer containing 2% glutaraldehyde as prefixation. After washing the fixed sample with a phosphate buffer, it was post-fixed using a 2% osmium aqueous solution at 4°C for 2 hours. For dehydration, the concentration of ethanol was increased stepwise from 30% to 100%, and treatment was performed for 15 minutes each. The samples were embedded in epoxy resin at 60°C for 48 hours, ultrathin sections of 80-90 nm were prepared using an ultramicrotome, and mounted on Cu 200 mesh. Observation was performed using a transmission electron microscope H-7600 at 100 kV. The results are shown in Figure 2.
  • the nanoparticles contained in the cryopreservation composition of Example 3 were incorporated into the cytoplasm. Furthermore, some of the smaller nanoparticles were also incorporated into the nucleus.
  • cryopreservation and thawing treatment of cells using cryopreservation composition > - Cryopreservation of cells (1) 70% to 90% confluent human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hAD-MSCs) were treated with trypsin, detached from the culture container, and centrifuged to obtain cell pellets. (2) To about 5 ⁇ 10 6 cells described above, 10 ⁇ L of the cryopreservation composition of each Example was added and introduced into the cells, and 990 ⁇ L of the cell culture medium was added to obtain a cell suspension. In the case of a comparative example, 1 mL of the cryopreservation composition of each example was added to obtain a cell suspension. (3) The above cell suspension was dispensed into cryotubes and stored frozen in a -80°C deep freezer.
  • hAD-MSCs human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells
  • the absorbance A of the dye at an absorption wavelength of 570 nm was measured.
  • the absorbance B of the dye at an absorption wavelength of 570 nm was measured using a microplate absorbance reader.
  • the ratio of the absorbance A after thawing obtained in (4) above to the absorbance B before cryopreservation was defined as the cell survival rate. The results are shown in Tables 3 and 4.
  • cryopreservation of Comparative Example As shown in Tables 3 and 4, when frozen using the cryopreservation composition of Example 3 or the cryopreservation compositions 6 to 15 containing ferulic acid or active vitamin C, the cryopreservation of Comparative Example It was found that the cell survival rate was higher, that is, the cell damage caused by cryopreservation was reduced compared to the case of freezing using the composition for cryopreservation.
  • Table 7 shows that a high survival rate was maintained even when frozen with a cryopreservation composition containing nanoparticles composed of Gemini-type surfactants with not only 12 but also 16 carbon atoms in the hydrocarbon chain. Ta. Furthermore, a high survival rate was maintained even when chlorine instead of bromine was used as the element that generates the counter ion in the Gemini type surfactant. Furthermore, both 2 and 3 spacer carbon atoms in the Gemini type surfactant maintained a high survival rate.
  • Example 8 ⁇ Excretion of composition to extracellular space>
  • the cryopreservation composition of Example 3 was introduced into cells in the same manner as in Test Example 2, frozen, and introduced by quantifying the fluorescence intensity containing the cytoplasm and nucleus 0, 1, 7, and 14 days after thawing.
  • the excretion of the cryopreservation composition to the outside of cells was investigated. The results are shown in Table 9.
  • Example 10 ⁇ Survival rate of embryos, sperm, blood cells, and 3D organoids after freezing> The cryopreservation composition of Example 3 was introduced into cells in the same manner as in Test Example 4. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, embryos, sperm, blood cells, and 3D organoids were used as cell types. Table 11 shows the results of examining the survival rate after freezing using the same method as Test Example 4. The cells used are as follows.
  • ⁇ Embryos (species: mouse, strain: C57BL/6J Jcl, stage: 2cell, number of embryos: 30, purchased from: National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition)
  • ⁇ Sperm (species: mouse, strain: C57BL/6NCr Slc, number: 1 straw, purchased from: National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition)
  • ⁇ Blood cells (species: human, origin: acute monocytic leukemia patient peripheral blood, type: monocytes, purchase source: ATCC)
  • ⁇ 3D organoids (species: human, origin: healthy adipose tissue, type: mesenchymal stem cells, organoid culture using Corning (registered trademark) Matrigel basement membrane matrix for organoid formation, purchased from: LONZA)
  • Table 11 shows that if the cryopreservation composition of Example 3 is used, a high survival rate can be maintained even when freezing not only mesenchymal stem cells but also cells such as embryos, sperm, blood cells, and 3D organoids. It was confirmed that it can be done.
  • Example 11 ⁇ Evaluation of transplantation efficiency in immunodeficient mice> The composition for cryopreservation of Example 8 was introduced into cells in the same manner as in Test Example 4, and the transplantation efficiency in immunodeficient mice was evaluated using frozen and thawed mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells (ADSC) derived from adipose tissue of a healthy individual were cultured in a spheroid form one week before transplantation by adding growth factors attached to Matrigel for spheroid culture and a dedicated medium. Stem cell spheroids were mixed at a 1:1 ratio into Matrigel for transplantation.
  • a mixture for transplantation containing 1 ⁇ 10 7 cells of ADSC was filled into a syringe on ice and subcutaneously transplanted into the back of an immunodeficient mouse. Two weeks after transplantation, the length and width of the transplanted site were measured using calipers, and the volume (mm 3 ) was calculated. Furthermore, the weight (mg) of the transplanted graft, which was extracted 3 weeks after transplanting ADSC, was measured using a precision electronic balance. As a control, ADSCs frozen without the composition of Example 8 were used. The results are shown in Table 12.
  • Table 12 shows that the cells treated with the cryopreservation composition of Example 8 maintained physiological activity even when transplanted into mice, and an increase in the number of transplants was confirmed.
  • a well-kept bottom mix and 1.8% agar solution were mixed in a sterilized reagent bottle or tube at a ratio of 1.4 vol:1 vol (2.5 ml x required number of sheets + ⁇ ), and kept warm in a water bath at 45°C ( Final 0.75% agra).
  • the above bottom agar was poured in 2.5 ml portions into a 35 mm dish or 6-well plate using a disposable pipette, allowed to stand at 4° C. for 8 minutes to solidify, and then kept warm in an incubator. Sufficiently warmed top mix (upper layer: 2x DMEM 37.5ml, serum 9ml, 2.8% NaHCO 3 5.25ml, 10x penicillin/streptomycin 0.9ml, sterile water 19.5ml) and 1.8% agar.
  • the solution was mixed in a sterilized reagent bottle or tube at a ratio of 4 vol: 1 vol, 1.5 ml x the required number of sheets + ⁇ , and kept warm in a water bath at 45° C. (Final 0.36% agra).
  • Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells were peeled off using a normal procedure, and then passed through a cell strainer to obtain single cells, and the cell density was adjusted to 2 ⁇ 10 5 cells/ml. 100 ⁇ l of the cell suspension was transferred to a 15 ml tube, and using a disposable pipette, 3 ml/tube of top agar was added, pipetted to prevent bubbles, and 1.5 ml each was seeded onto the bottom agar. After standing at 4°C for 8 minutes to solidify, the mixture was kept warm in an incubator. Colonies were stained and counted after two weeks. The results are shown in Table 13.

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Abstract

本発明の課題は、凍結保存による細胞障害を低減する凍結保存用の組成物を提供することや、凍結保存による細胞障害を低減する凍結保存方法を提供することである。両親媒性分子を構成成分とし、前記両親媒性分子が単層又は二層のナノ粒子を含む、細胞若しくは生体組織の凍結保存用組成物を作製する。

Description

凍結保存用の組成物、凍結保存方法、及び凍結した細胞又は生体組織
　本発明は、凍結保存用の組成物や、凍結保存方法や、凍結した細胞又は生体組織に関する。
　再生医療とは、細胞等を用いて疾患や外傷等を治療する治療法である。再生医療は、近年、心筋梗塞、慢性動脈閉塞症、白血病等の様々な疾患や、脊髄損傷、外傷性軟骨欠損症等の外傷の治療法として採用されている。従来、再生医療に用いる細胞等は、輸送性、長期保存性、利便性等の観点から、凍結保存したものが用いられている。しかしながら、細胞を凍結保存すると、細胞生存率の低下、細胞の機能障害（例えば、幹細胞の場合は幹細胞の割合の低下）、増殖阻害等の現象（以下、これらの現象を総じて「細胞障害」とも称す。）が生じやすい。これは、細胞が凍結された際に細胞内に含まれる水分が結晶化して結晶により細胞壁や細胞小器官等が損傷したり、細胞が解凍された際に細胞内の水分が一部失われて細胞の形状が変化したりすることが要因として考えられる。
　細胞を凍結して保存する細胞凍結保存法の一つとして、特許文献１に記載されているように、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの低分子化合物を含む緩衝溶液中で細胞を凍結する手法が知られている。
特許第５７７３３４７号公報
　しかし、ＤＭＳＯを用いた手法は、細胞解凍後の細胞生存率が低く、改善の余地がある。本発明は、このような状況下でなされたものである。
　本発明の一実施形態が解決しようとする課題は、凍結保存による細胞障害を低減する細胞又は生体組織の凍結保存用の組成物を提供することである。
　本発明の他の一実施形態が解決しようとする課題は、凍結保存による細胞障害を低減する細胞又は生体組織の凍結保存方法を提供することである。
　前記課題を解決するための具体的手段には、下記の態様が含まれる。
＜１＞両親媒性分子を構成成分とし、前記両親媒性分子が単層又は二層のナノ粒子を含む、細胞若しくは生体組織の凍結保存用組成物。
＜２＞前記ナノ粒子が、カチオン性ナノ粒子である、上記＜１＞に記載の凍結保存用組成物。
＜３＞前記両親媒性分子が、Ｇｅｍｉｎｉ型界面活性剤であることを特徴とする、上記＜１＞又は＜２＞に記載の凍結保存用組成物。
＜４＞前記ナノ粒子のゼータ電位が、１０ｍＶ以上５０ｍＶ以下である、上記＜１＞又は＜２＞に記載の凍結保存用組成物。
＜５＞前記ナノ粒子の体積平均粒子径が、３０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、上記＜１＞又は＜２＞に記載の凍結保存用組成物。
＜６＞前記ナノ粒子が、フェルラ酸又は活性化ビタミンＣを内包する、上記＜１＞又は＜２＞に記載の凍結保存用組成物。
＜７＞細胞若しくは生体組織と上記＜１＞～＜６＞のいずれか１つに記載の凍結保存用組成物とを混合してナノ粒子を細胞若しくは生体組織内に導入する工程と、
　前記ナノ粒子が導入された細胞又は生体組織を凍結する工程と、
を含む、細胞又は生体組織の凍結保存方法。
＜８＞両親媒性分子を構成成分とし、前記両親媒性分子が単層又は二層のナノ粒子を含む、凍結した細胞又は生体組織。
　本発明の一実施形態によれば、凍結保存による細胞若しくは生体組織の障害を低減する、細胞若しくは生体組織の凍結保存用の組成物が提供される。
　本発明の他の一実施形態によれば、凍結保存による細胞若しくは生体組織の障害を低減する、細胞若しくは生体組織の凍結保存方法が提供される。
試験例１において、実施例３の組成物に含まれるナノ粒子の粒子径の分布を示す図である。 試験例３において、細胞内に導入されたナノ粒子を透過型電子顕微鏡で観察した結果を示す図である。
　以下、本発明を実施するための形態について説明する。これらの説明及び実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
　本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
＜細胞凍結保存用組成物＞
　本実施形態に係る細胞若しくは生体組織の凍結保存用組成物（以下、「本件凍結保存用組成物」ともいう）は、両親媒性分子を構成成分とし、前記両親媒性分子が単層又は二層のナノ粒子（以下、「本件ナノ粒子」ともいう）を含む。
　本件凍結保存用組成物を細胞若しくは生体組織と混合すると、本件ナノ粒子が細胞若しくは生体組織を構成する細胞内に導入される。つまり、細胞内には、本件ナノ粒子が導入される。
　本件ナノ粒子が細胞内に導入された状態で凍結された細胞若しくは生体組織は、本件ナノ粒子が細胞に加わる外力や温度変化に対してクッションの機能（緩衝機能）を示すことにより、細胞内に含まれる水分の結晶化及び結晶成長が抑えられ、かつ、細胞壁及び細胞小器官等が損傷されにくくなる。また、本件ナノ粒子が細胞内に導入された状態で凍結された細胞は、解凍された際にも、本件ナノ粒子の介在により細胞の形状が維持されやすくなる。その結果、凍結保存による障害が低減されると考えられる。
　なお、従来から、リポソーム及びミセル等のナノ粒子は、ドラッグデリバリーシステムなど薬理成分を対象部位に導入するための技術として用いられている。これに対して、本開示に係る発明は、本件ナノ粒子自体の細胞に対する緩衝機能に着目したものであり、本件ナノ粒子の持つ物理的性質が、細胞の凍結保存によって引き起こされる細胞障害の低減に有効に作用するという知見に基づくものである。
［ナノ粒子］
　本件凍結保存用組成物は、両親媒性分子を構成成分とし、前記両親媒性分子が単層又は二層のナノ粒子を含む。本件凍結保存用組成物は、単層のナノ粒子だけ含んでいても、二層のナノ粒子だけ含んでいてても、単層のナノ粒子と二層のナノ粒子を両方含んでいてもよい。
　上記単層のナノ粒子とは、両親媒性分子が単層を形成するように集まったナノ粒子を意味する。単層のナノ粒子としては、具体的にはミセルを挙げることができる。また、上記二層のナノ粒子とは、両親媒性分子が二層となり形成された二重膜を含むナノ粒子を意味する。上記二層のナノ粒子としては、具体的には（1）脂質を構成成分とし、その脂質の二重膜を含む小胞であるリポソームや、（2）脂質以外の界面活性剤を構成成分とし、その界面活性剤の二重膜を含む小胞を挙げることができる。上記二重膜を含む小胞は、二重膜を１つ有している小型一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）や大型一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）であっても、二重膜を２以上有している多重膜リポソーム（ＭＶＬｓ）であってもよい。
　また、本件ナノ粒子にミセルを含む場合は、そのミセルは親水基が外側、疎水基が内側に集合したミセルであることが好ましい。
　本件ナノ粒子の体積平均粒子径は、１０ｎｍ以上３００ｎｍ以下を挙げることができ、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であっても、３０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下であってもよい。
　本件ナノ粒子の体積平均粒子径は、小さいほど細胞の隅々に分布しやすく、細胞を凍結した際に細胞の形状がより維持されやすい。
　本件ナノ粒子の体積平均粒子径が３００ｎｍ以下であると、本件ナノ粒子が細胞内により効率的に導入されやすい。
　本件ナノ粒子の体積平均粒子径を制御する手法は、特に制限されないが、例えば、本件ナノ粒子の製造の際に用いるフィルターの孔径で調整するサイジングなどの手法等が挙げられる。具体的には、細孔を有するフィルターに本件ナノ粒子を加圧して通過させ、物理的なせん断力により粒子径を均一化するエクストリュージョン処理を挙げることができる。
　本件ナノ粒子は、カチオン性ナノ粒子であっても、中性ナノ粒子であっても、アニオン性ナノ粒子であってもよいが、カチオン性ナノ粒子であることがより好ましい。通常、細胞内は細胞外に対して負(陰性)の電位にある。そのため、本件ナノ粒子がカチオン性ナノ粒子であると、イオン間相互作用により本件ナノ粒子が細胞内の広域に効率的に導入されやすい。その結果、凍結保存による細胞障害をより低減する。
　カチオン性ナノ粒子とは、ゼータ電位が１０ｍＶ超のナノ粒子のことをいう。
　中性ナノ粒子とは、ゼータ電位が－１０ｍＶ以上１０ｍＶ以下のナノ粒子のことをいう。
　アニオン性ナノ粒子とは、ゼータ電位が－１０ｍＶ未満のナノ粒子のことをいう。
　本件ナノ粒子のゼータ電位は、１０ｍＶ以上８０ｍＶ以下であることが好ましく、１５ｍＶ以上７０ｍＶ以下であることがより好ましく、２０ｍＶ以上６０ｍＶ以下であることがさらに好ましく、２５ｍＶ以上５０ｍＶ以下であることが特に好ましい。
　本件ナノ粒子のゼータ電位が１０ｍＶ以上であると、本件ナノ粒子の膜が適度に正電荷を帯びる。そのため、細胞内に効率的に本件ナノ粒子がより導入されやすく、凍結保存による細胞障害をより低減する。
　本件ナノ粒子のゼータ電位及び体積平均粒子径の測定は、たとえば以下のとおり行うことができる。
　本件凍結保存用組成物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１００倍に希釈した溶液を１ｍＬ採取し、測定用１ｍＬセルに充填する。そして、これを粒子径・ゼータ電位測定装置（ZETASIZER PRO、Malvern社製）により、室温（２５℃）で測定する。
　本件ナノ粒子の表面電荷、つまり、ゼータ電位の値は、本件ナノ粒子を構成する両親媒性分子の電荷の影響を受ける。そのため、所望のゼータ電位のナノ粒子を調製する際には、そのゼータ電位に応じて両親媒性分子を適宜選択若しくは変更して用い、本件ナノ粒子を調製する方法が挙げられる。
　両親媒性分子としては、界面活性剤を挙げることができ、合成の界面活性剤でもあっても天然若しくは生体由来の界面活性剤でもよい。
　合成の界面活性剤としては、Ｇｅｍｉｎｉ型界面活性剤を挙げることができる。Ｇｅｍｉｎｉ型界面活性剤は、１つの分子中に親水基と疎水基をもち、スペーサー基により親水基を介して互いに連結しており、２つの界面活性単位を有する二量体界面活性剤又は３つの界面活性単位を有する三量体界面活性剤である。
　Ｇｅｍｉｎｉ型界面活性剤を構成する疎水基としては、炭素数８～２４、好ましくは炭素数１２～１８、より好ましくは炭素数１２又は１６の直鎖炭化水素鎖を挙げることができ、直鎖の飽和炭化水素鎖であることがナノ粒子の安定性の観点から好ましい。また、２つ又は３つの疎水基を構成する直鎖炭化水素鎖は同じでも異なってもよいが、同じであることが好ましい。
　Ｇｅｍｉｎｉ型界面活性剤を構成する親水基としては、極性基、イオン性基が挙げられる。親水基における対イオンを生じさせる元素としては、用いる水溶液に応じて適宜調整可能であるが、臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、窒素（Ｎ）、ナトリウム（Ｎａ）、リン（Ｐ）、ホウ素（Ｂ）、ヨウ素（Ｉ）、フッ素（Ｆ）、硫黄（Ｓ）、酸素（Ｏ）、炭素（Ｃ）、ベリリウム（Ｂｅ）、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）を挙げることができ、これらを適宜組み合わせて用いることもできる。
　上記スペーサーは通常炭化水素鎖であり、疎水基が互いに独立して作用できるように十分な距離を与えるための長さを有することが好ましい。上記スペーサーの炭素数としては特に限定されないが、２～１２、好ましくは２～８、更に好ましくは２～４、最も好ましくは２若しくは３を挙げることができる。
　天然及び生体由来の界面活性剤としては、両親媒性の脂質を挙げることができる。両親媒性の脂質としては、リン非含有脂質でもリン脂質でもよい。また、カチオン性脂質であっても、中性脂質であっても、アニオン性脂質であってもよく、これらの組み合わせでもよい。
　リン非含有脂質としては、Ｎ－（２，３－ジオレオイロキシ－１－プロピル）トリメチルアンモニウムメチルサルフェ－ト（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－〔１－（２，３－オレイルオキシ）プロピル〕－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、ジオクタデシルアミド－グリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）等を挙げることができる。また、リン脂質としては、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）等のホスホエタノールアミン、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ジフタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）等のホスホコリンを挙げることができる。
　両親媒性分子は標識物質（例えばクマリン、ＦＩＴＣ（Fluorescein Isothiocyanate）等の蛍光分子、マレイミド基、ＰＥＧ基など）を分子内に導入した界面活性剤で構成されていてもよい。
　本件ナノ粒子は、コレステロールを含むことが好ましく、本件ナノ粒子の膜にコレステロールを含有することがより好ましい。コレステロールを膜に含むように本件ナノ粒子が構成されると、コレステロールを含まない膜に比べて、本件ナノ粒子における膜の流動性が向上する。
［その他の成分］
　本実施形態に係る凍結保存用組成物は、本件ナノ粒子以外のその他の成分（以下、単に「その他の成分」とも称す。）をさらに含んでいてもよい。
　その他の成分としては、例えば、本件ナノ粒子に内包される内包成分；分散媒や、本件ナノ粒子を作製する過程で単層又は二層を形成しなかった両親媒性分子若しくはそれらの凝集体などが挙げられる。
・内包成分
　内包成分は、本件ナノ粒子の膜内や、本件ナノ粒子を構成する界面活性剤に取り込まれる成分や内水相に内包される成分のことを指す。
　内包成分としては、標識物質（例えばクマリン等の蛍光物質など）、脂溶性薬物、水溶性薬物、核酸、タンパク質、抗体、結晶性薬物、生体由来成分、水溶性ビタミン、水溶性ビタミン誘導体、脂溶性ビタミン、脂溶性ビタミン誘導体等の成分が挙げられる。
　具体的な内包成分としては、例えば、細胞の保護効果を有する活性型ビタミンＣ、活性型ビタミンＡ；保水成分であるフェルラ酸、ヒアルロン酸などが挙げられる。
　本件ナノ粒子は、水溶性ビタミン、水溶性ビタミン誘導体、及びフェルラ酸からなる群から選択される少なくとも１種を内包することが好ましく、フェルラ酸及び活性型ビタミンＣの少なくとも一方を内包することがより好ましい。
　特に、フェルラ酸及び活性型ビタミンＣは、酸化防止能、水分保持性に優れることから、本件ナノ粒子がこれらの少なくとも一方を内包することで、細胞凍結保存による細胞障害がより抑制される。
・分散媒
　本件ナノ粒子は、分散媒中に分散されて存在することが好ましい。
　分散媒としては、水、緩衝液、水溶性溶剤、液体培地等が挙げられる。分散媒は、１種単独の使用であっても、２種以上の併用であってもよい。
　水としては、例えば、蒸留水、イオン交換水、限外濾過水、純水等が挙げられる。
　水の含有量は、分散媒の全量に対して、７０質量％以上であることが好ましく、８０質量％以上９０質量％以下がより好ましく、９０質量％以上１００質量％以下がさらに好ましい。水の含有量を上記数値範囲内とすることで、本件ナノ粒子がより安定に存在する。
　緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液（ＴＲＩＳ）、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸緩衝液（ＨＥＰＥＳ）、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液等が挙げられる。
　緩衝液の濃度は浸透圧値に準じて、ヒトの血漿浸透圧である２８５±５ｍ０ｓｍ／Ｌと同程度の範囲で用いるのが好ましい。
　緩衝液のｐＨは特に制限されないが、例えば、細胞生存性等の観点からは、ｐＨ５以上ｐＨ１０以下であることが好ましく、ｐＨ６以上ｐＨ９以下であることがより好ましい。
　ｐＨは、ｐＨメーターを用いて２５℃で測定される値である（以下同様）。
　水溶性溶剤とは、水と混和する溶剤を意味する。
　水溶性溶剤としては、例えば、脂質の溶解性等の観点から、メタノール、エタノール等のアルコールが挙げられる。
　水溶性溶剤は、例えば、本件ナノ粒子の製造工程で準備される脂質等の両親媒性分子を溶解する際に用いた水溶性溶剤をそのまま利用してもよい。
　液体培地としては、例えば、幹細胞の培養に用いられる公知の培地が挙げられる。より具体的には液体培地としては、例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、ＤＭＥＭ：Ｆ－１２（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F－12）、ＥＭＥＭ（Eagle's minimal essential medium）及びこれらの培地に血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）等の細胞増殖因子を添加した液体培地などが挙げられる。
　液体培地は、市販品であってもよい。市販品としては、例えば、ロンザ株式会社製のADSC-BulletKit（登録商標）PT-4505等が挙げられる。
　液体培地のｐＨ（２５℃条件下）は、例えば、ｐＨ７．０～８．０であってもよく、ｐＨ７．３～７．４であってもよい。
　細胞凍結保存用組成物のｐＨ（２５℃条件下）は特に制限されないが、例えば、細胞生存性等の観点からは、ｐＨ４以上ｐＨ１２以下であることが好ましく、ｐＨ５以上ｐＨ１１以下であることがより好ましい。
・凍結保存用組成物の製造方法
　本件凍結保存用組成物の製造方法は、特に制限されず、公知の手法が適用できる。
　凍結保存用組成物の製造方法は、例えば、本件ナノ粒子の膜等を構成する成分（界面活性剤等の材料（本件ナノ粒子に内包させる内包成分がある場合は内包成分を含む。））と水溶性溶剤に溶解させた溶液を水又は緩衝液とを混合し、本件ナノ粒子を含む分散液を得る第１工程と、前記分散液をフィルター処理する第２工程と、を含む製造方法であってもよい。
　特に、第２工程を含むと、本件ナノ粒子の粒子径が調整される。
（第１工程）
　第１工程では、本件ナノ粒子の少なくとも一方を含む分散液を得る。この分散液は、本件ナノ粒子の膜を構成する成分を水溶性溶剤（例えばアルコール等）に溶解させた溶液と、水又は緩衝液と、を混合し、条件（例えばｐＨ、温度）を制御して調製することができる。なお、本件ナノ粒子を構成する両親媒性分子については、上述の通りであるので、ここでの説明を省略する。
　例えばリポソームを含む分散液は、エタノールと脂質とを混合して脂質を溶解し、ｐＨを調整しながら水に混合、撹拌することで調製できる。
　第１工程では、本件ナノ粒子の形成に寄与していない余剰のコレステロールやリン脂質等の両親媒性分子、さらに内包させる成分がある場合は、未封入の成分を透析膜等により取り除いてもよい。
　第２工程では、第１工程で得られた分散液をフィルターによりエクストリュージョン処理する。
　エクストリュージョン処理することで、本件ナノ粒子のサイズ調整（サイジング）をすることができる。フィルターは、上市されている市販品を、目的等に応じて所望の孔径を選定して適宜選択すればよい。
＜凍結保存方法＞
　本件凍結保存方法は、細胞又は生体組織と本件凍結保存用組成物とを混合して本件ナノ粒子を細胞内に導入する工程（以下、「導入工程」と称す。）と、本件ナノ粒子が導入された細胞又は生体組織を凍結する工程（以下、「凍結工程」とも称す。）と、を含む。なお、生体組織を凍結する場合においては、上記「細胞内に導入」は「生体組織を構成する細胞内に導入」の意味である。
　本件凍結保存方法によれば、凍結保存による細胞障害が低減される。
　本件凍結保存方法の凍結対象となる細胞は、特に制限されず、凍結保存される公知の細胞が採用できる。例えば、細胞としては、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（hAD-MSC）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hMSC-BM）の間葉系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、造血幹細胞、歯髄幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、脂肪幹細胞等の体性幹細胞；誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、等の多能性幹細胞；リンパ球、好中球等の血液細胞；上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、平滑筋細胞、メラノサイト、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)の臓器固有の細胞；脳細胞、肺細胞、腎細胞及び脂肪細胞等の分化した細胞；胚、受精卵、精子などの生殖細胞が挙げられる。また、本件凍結保存方法の凍結対象として、オルガノイド、スフェロイド、細胞シート、上記細胞で構成される生体組織も挙げることができる。
［導入工程］
　導入工程では、細胞又は生体組織と本件凍結保存用組成物とを混合して本件ナノ粒子を細胞（生体組織を凍結する場合は生体組織を構成する細胞、以下同様）内に導入する。
　培地は、特に制限されず、幹細胞の培養に用いられる公知の培地が挙げられる。例えば、培地としては、先述の液体培地が挙げられる。
　本件ナノ粒子を細胞内に導入する手段は、特に制限されず、例えば、下記（Ｉ）～（ＩＶ）等の方法が挙げられる：
（Ｉ）細胞を含む培地に本件凍結保存用組成物を添加する方法
（ＩＩ）細胞を含む培地を遠心分離して上清を除いてから本件凍結保存用組成物を添加する方法
（ＩＩＩ）培養容器から剥離した細胞を本件凍結保存用組成物に添加する方法。
（ＩＶ）エレクトロポレーションにより電圧を利用して細胞内に導入する方法。
［凍結工程］
　凍結工程では、本件ナノ粒子が導入された細胞又は生体組織を凍結する。
　細胞又は生体組織を凍結する手段は、特に制限されず、公知の凍結方法が採用できる。
　細胞又は生体組織を凍結する温度としては、－３０℃～－１９６℃（好ましくは－８０℃～－１９６℃）の範囲内であることが好ましい。細胞又は生体組織を凍結する手段は、例えば、凍結保存による細胞障害をより低減する観点からは、ディープフリーザーもしくは液体窒素を用いて細胞又は生体組織を凍結することが好ましい。凍結期間は特に制限されず、０．５日以上５０年以下、１日以上１０年以下、１週間以上５年以下、１ヶ月以上１年以下を挙げることができる。
［その他の工程］
　本件凍結保存方法は、上記導入工程及び凍結工程以外のその他の工程をさらに含んでいてもよい。前記その他の工程としては、例えば、凍結した細胞を適切な温度下に保存する保存工程等が挙げられる。
［凍結細胞］
　本実施形態にかかる凍結した細胞又は生体組織は、本件ナノ粒子を含む凍結細胞又は生体組織である。この凍結した細胞又は生体組織は、上述の本件凍結保存方法によって作製することができる。
　以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるものではない。
＜実施例１＞
・凍結保存用組成物の作製
　以下の手順に従って実施例１としてＤＯＴＡＰを構成成分とする二重膜小胞を有機溶媒注入法により作製した。
（１）ビーカーにＰＢＳ（２５℃でのｐＨ＝７．４）を５．３ｍｌ入れ、２５℃で攪拌した。
（２）遠心管の中に、エタノール１９９０μＬと、コレステロール３８．７ｍｇと、両親媒性分子として脂質であるＤＯＴＡＰ１１．１ｍｇとを混合し、この混合液の温度を、前記脂質の相転移温度以上の７５℃としコレステロールと前記脂質を完全に溶解した。なお、後述の細胞導入性の評価を行う場合には、さらに蛍光標識クマリンも加え、減衰を防ぐために遮光条件下で調整や試験を実施した。なお、クマリンは疎水性のため、主に形成されるナノ粒子における膜に取り込まれる。
（３）前記混合液をシリンジで全量取り、前記ＰＢＳ中に急速に混合した。
（４）ビーカーを遮光して、２５℃で１時間攪拌した。
（５）透析膜（Spectra/Por RC Biotech Dialysis Membrane MWCO:8－10）を用いて、ＰＢＳ中で４時間以上、室温で透析を行った。これにより、ナノ粒子の溶液を得た。
（６）得られたナノ粒子の溶液を、Avestin社製のＬＦ－ＳＴＢリポソファストスタビライザーにセットし、使用するフィルター孔径を１０００ｎｍ、８００ｎｍ、４００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ及び５０ｎｍのこの順で順次加圧しながら通過させることでサイジングした。得られたナノ粒子を含有する液体組成物を、実施例１の凍結保存用組成物とした。細胞凍結保存用組成物のｐＨ（２５℃条件下）は７．２であった。
＜実施例２～５＞
　両親媒性分子の種類を、ＤＯＴＡＰから、ＤＯＰＥ、Ｇｅｍｉｎｉ型、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＥへと変更した以外は、実施例１と同様の仕様とし、実施例２～５の凍結保存用組成物を得た。「Ｇｅｍｉｎｉ型」は「Ｇｅｍｉｎｉ型界面活性剤」を意味する。なお、実施例３、後述の実施例８及び１３で用いたＧｅｍｉｎｉ型界面活性剤の分子構造を下記に示す。２つの界面活性単位を有する二量体界面活性剤であり、疎水基は炭素数１２の炭化水素鎖からなり、スペーサー基の炭素数が３からなり、対イオンを生じさせる元素としては臭素及び窒素からなる。
＜実施例６～１５＞
　実施例１の凍結保存用組成物を作製する操作（１）を、下記に示す操作（１’）とした以外は、実施例１～５と同じ手法により実施例６～１５の凍結保存用組成物を得た。実施例６～１０は順にＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、Ｇｅｍｉｎｉ型、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＥを構成成分とし、フェルラ酸を含有したナノ粒子を含有する凍結保存用組成物であり、実施例１１～１５は順にＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、Ｇｅｍｉｎｉ型、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＥを構成成分とし、活性型ビタミンＣを含有したナノ粒子を含有する凍結保存用組成物である。
（１’）ビーカーにＰＢＳ（２５℃でのｐＨ＝７．４）を５．３ｍｌ入れて、内包成分としてフェルラ酸又は活性型ビタミンＣを１０μＭ溶解し２５℃で攪拌した。
　実施例１１～１５にて使用した活性型ビタミンＣとは、下記の分子構造を有する化合物である。
＜比較例１＞
　比較例１では、１０体積％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、４０体積％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び５０体積％幹細胞培地の混合液１ｍＬを凍結保存用組成物とした。
＜比較例２＞
　比較例２では、ナノ粒子を含まないＺＮＱ社製のＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）１（１ｍＬ）を、凍結保存用組成物とした。
〔試験例１〕
＜体積平均粒子径及びゼータ電位＞
　各実施例の凍結保存用組成物について、体積平均粒子径及びゼータ電位を測定した。具体的には、実施例１～５の凍結保存用組成物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１００倍に希釈した溶液を１ｍＬ採取し、測定用１ｍＬセルに充填した。そして、これを粒子径・ゼータ電位測定装置（ZETASIZER PRO、Malvern社製）により、室温（２５℃）で測定した。その結果を表１に示す。また実施例１の凍結保存用組成物に含まれるナノ粒子の粒子径の分布を図１に示す。
〔試験例２〕
＜細胞導入性の評価＞
　実施例１～５の凍結保存用組成物について、凍結保存用組成物に含まれるナノ粒子の細胞導入性を下記の手順で評価した。
（１）コラーゲンコートされた８ｗｅｌｌチャンバースライドに凍結融解後のヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ）を２０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種した。
（２）ｗｅｌｌ内に、蛍光色素クマリンを標識した実施例１～５の凍結保存用組成物を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。
（３）細胞核の染色にはＤＡＰＩ溶液（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール二塩酸塩溶液）用いた。
（４）蛍光顕微鏡（KEYENCE Japan社製、BZ-9000）で２０倍に拡大し、露光時間１／２秒、ブラックバランスを４２としたときに観測される細胞質及び細胞核の蛍光強度をそれぞれ測定した。細胞質内であり且つ細胞核外の領域に存在するナノ粒子に内包されるクマリン蛍光強度ＯＵＴに対する、細胞核内に存在するナノ粒子に内包されるクマリン蛍光強度ＩＮの比（ＩＮ／ＯＵＴ）の値を、表２における細胞導入性の評価の項目［蛍光強度比（細胞核／細胞質）］に示す。
　表２に示すように、蛍光強度比（細胞核／細胞質）の値が正数であることから、実施例１～５の凍結保存用組成物に含まれるナノ粒子の一部は、細胞質に留まらず細胞核内にまで導入されていることがわかった。
〔試験例３〕
＜透過型電子顕微鏡＞
　試験例２の方法で細胞内に導入されたナノ粒子を透過型電子顕微鏡で観察した。健常者の脂肪組織由来間葉系幹細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ）は、増殖因子含有の専用培地５ｍＬを用いて約５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で３．５ｃｍ２シャーレに播種した。金ナノ粒子（Cytodiagnostics社）を用いて実施例３（Ｇｅｍｉｎｉ型）の凍結保存用組成物を標識した。標識した凍結保存用組成物をＡＤＳＣに３０分間曝露した。透過型電子顕微鏡用のサンプル調製のため、前固定として２％グルタールアルデヒド含有リン酸緩衝液を用いてＡＤＳＣを４℃で一晩固定した。固定したサンプルをリン酸緩衝液で洗浄後、後固定として２％オスミウム水溶液を用いて４℃で２時間固定した。脱水としてエタノールの濃度を３０％から１００％へ段階的に上昇させそれぞれ１５分間処理を行った。サンプルをエポキシ樹脂に６０℃で４８時間かけて包埋し、ウルトラミクロトームを用いて８０－９０ｎｍの超薄切片を作製し、Ｃｕ　２００メッシュに積載した。透過型電子顕微鏡Ｈ－７６００を用いて、１００ｋＶで観察を行った。結果を図２に示す。
　図２に示すように実施例３の凍結保存用組成物に含まれるナノ粒子が細胞質内に取り込まれていた。さらに、粒子径が小さいナノ粒子の一部は核内にも取り込まれていた。
〔試験例４〕
＜凍結保存用組成物を用いた細胞の凍結保存と解凍処理＞
・細胞の凍結保存
（１）７０％～９０％コンフルエントのヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ）をトリプシン処理し、培養容器から剥離し遠心して細胞ペレットを得た。
（２）上記の約５×１０６個の細胞に対し、各実施例の凍結保存用組成物を１０μＬ加えて細胞に導入し、細胞培養液９９０μＬを添加し細胞懸濁液を得た。比較例の場合は各実施例の凍結保存用組成物１ｍＬを添加し細胞懸濁液を得た。
（３）上記細胞懸濁液をクライオチューブに分注し、－８０℃のディープフリーザーで凍結保存した。
・凍結保存された細胞の解凍
（１）上記凍結保存（１ヶ月以内）された細胞を含むクライオチューブを３７℃の温浴で振りながら細胞を迅速に解凍した。
（２）解凍後の細胞懸濁液を、幹細胞専用培地１０ｍＬと混合し、混合液を得た。
（３）上記混合液を遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分、４℃）し、アスピレーターで上清を取り除いた後、適量の上記培地で懸濁した。
＜細胞生存率の評価＞
　細胞凍結保存前後における細胞生存率は、細胞増殖アッセイキット（MTT Cell Viability Assay Kit, AR1156、BTI：コスモ・バイオ社製）を用いて、下記の手順で評価した。
（１）９６ｗｅｌｌプレートに、実施例３、６～１５の凍結保存用組成物を用いて凍結保存した後に解凍処理された細胞を、２０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種した。
（２）各ｗｅｌｌに、前記キット中のＭＴＴ標準試薬１０μＬを加え、３７℃で４時間インキュベートした。
（３）各ｗｅｌｌにホルマザン溶液を１００μＬ加え、３７℃で１８時間インキュベートした。
（４）マイクロプレート吸光度リーダーを用いて、吸収波長５７０ｎｍにおける色素の吸光度Ａを測定した。
（５）上記（１）～（３）の操作を、細胞凍結する前のｈＭＳＣ－ＡＴを用いて行った後、マイクロプレート吸光度リーダーを用いて、吸収波長５７０ｎｍにおける色素の吸光度Ｂを測定した。
（６）凍結保存前の吸光度Ｂに対する、上記（４）で得られた解凍後の吸光度Ａの割合（＝Ａ／Ｂ×１００％）を、細胞生存率とした。結果を表３、４に示す。
　表３、４に示すように、実施例３の凍結保存用組成物や、フェルラ酸又は活性型ビタミンＣを内包する６～１５の凍結保存用組成物を用いて凍結すると、比較例の凍結保存用組成物を用いて凍結した場合に比べて、細胞生存率が高い、つまり、凍結保存による細胞障害が低減されることがわかった。
〔試験例５〕
＜幹細胞の割合の評価＞
　実施例３、６～１５の凍結保存用組成物を用いて細胞を凍結保存し、下記の手順で、Human Mesenchymal Stem Cell Multi-Color Flow Kit（FMC020、R&D systems社製）を用いて幹細胞率を評価した。当該キットは、ＣＤ９０を陽性マーカーとし、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９Ａ及びＨＬＡ－ＤＲを陰性マーカーとする。
（１）実施例３、６～１５の凍結保存用組成物を用いて凍結保存した後に解凍処理された５×１０６cellsの細胞を、上記キットに付属するフローサイトメトリー用染色緩衝液１００μＬと混合し、これをフローサイト用チューブにうつして、細胞懸濁液とした。
（２）上記細胞懸濁液に、上記キットに付属する２種の蛍光色素標識抗体の溶液（陽性マーカーの抗体液１種と陰性マーカーを混合した抗体液１種）を１０μＬずつ加え、これを室温（２５℃）暗所にて４５分間インキュベートした。
（３）インキュベート後の細胞懸濁液を上記フローサイトメトリー用染色緩衝液２ｍＬで洗浄した。
（４）フローサイトメーターを用いてフローサイトメトリー分析し、細胞凍結保存後におけるＣＤ９０（＋）、ＣＤ４５（－）、ＣＤ３４（－）、ＣＤ１１ｂ（－）、ＣＤ７９Ａ（－）及びＨＬＡ－ＤＲ（－）の形質を示す細胞を定量した。実施例３、６～１５の凍結保存用組成物を用いて凍結保存した場合における当該細胞の割合を「幹細胞の割合」として表５、６に示す。
　表５、６より、実施例３、６～１５のナノ粒子を含む凍結保存用組成物を用いて凍結保存した場合は、比較例の凍結保存用組成物を用いた場合に比べて幹細胞の割合が高い、つまり、凍結保存による幹細胞機能の保持に有用であることがわかった。
〔試験例６〕
＜Ｇｅｍｉｎｉ型界面活性剤の比較＞
　上記試験では実施例３、８、１３の凍結保存用組成物、すなわちＧｅｍｉｎｉ型界面活性剤として疎水基の炭化水素鎖の炭素数が１２、スペーサー基の炭素数が３からなり、対イオンを形成する元素が臭素及び窒素からなるＧｅｍｉｎｉ型界面活性剤を用いた。そこで、Ｇｅｍｉｎｉ型界面活性剤として、２つのアルキル鎖の炭素数、スペーサーの炭素数、及び対イオンを形成する元素を変えて、実施例１と同様の方法で実施例１６～１９の凍結保存用組成物を作製して、実施例３の凍結保存用組成物と共に試験例４と同じ方法で凍結後の生存率を調べた。結果を表７に示す。表７中、１２－３－１２＿Ｂｒは、それぞれ２つの炭化水素鎖の炭素数が１２、スペーサーの炭素数３、対イオンを生じさせる元素が臭素と窒素であることを、１６－３－１６＿Ｃｌは、それぞれ２つの炭化水素鎖の炭素数が１６、スペーサーの炭素数が３、対イオンが塩素と窒素であることを意味する。
　表７より、炭化水素鎖の炭素数として１２だけでなく１６のＧｅｍｉｎｉ型界面活性剤で構成されるナノ粒子を含む凍結保存用組成物で凍結した場合であっても高い生存率を維持していた。また、Ｇｅｍｉｎｉ型界面活性剤における対イオンを生じさせる元素として臭素ではなく塩素を用いても高い生存率を維持していた。さらに、Ｇｅｍｉｎｉ型界面活性剤におけるスペーサーの炭素数も２、３いずれも高い生存率を維持していた。
〔試験例７〕
＜長期の凍結保存＞
　実施例３の凍結保存用組成物を試験例４と同様の方法で細胞に導入して凍結処理し、３、６、１２ヶ月凍結保存した場合の、解凍後の生存率を試験例４と同様の方法で調べた結果を表８に示す。
　表８より、実施例３の凍結保存用組成物を細胞に導入して１２ヶ月凍結保存しても凍結解凍後の生存率は８７．８％も維持していた。
〔試験例８〕
＜組成物の細胞外への排出＞
　実施例３の凍結保存用組成物を試験例２と同様の方法で細胞に導入して凍結し、解凍後０、１、７、１４日後の細胞質と核を含む蛍光強度を定量することで導入した凍結保存用組成物の細胞外への排出を調べた。結果を表９に示す。
　表９より、解凍後７日では蛍光強度が１０分の１以下になり、解凍後１４日ではほとんど検出されないレベルまで低下していた。したがって、実施例３の凍結保存用組成物で凍結した場合は、解凍後にその凍結保存用組成物が細胞外に排出されることが確認された。
〔試験例９〕
＜解凍後の細胞の倍加時間＞
　実施例３の凍結保存用組成物を、試験例４と同様の方法で細胞に導入して凍結し、解凍後０、７日後の細胞が増殖して総数が２倍に増加する時間（細胞の倍加時間：PDT（Population Doubling Time））を測定した結果を表１０に示す。
倍加時間は以下の式で算出した。
PDT （Population Doubling Time）の計算方式：
１）対数的増殖期にある２点において細胞の計測を行った。
２）第１点における細胞密度の測定値をＮ０とし、第２点における測定値をＮとした。
また培養開始から第１点までの時間をｔ０とし、第２点までの時間をｔとした。
PDT= （t-ｔ０）log2 /（ logN-logＮ０）
　表１０より、解凍から７日経過しても、細胞の倍加時間は維持されていた。したがって、実施例３の凍結保存用組成物で凍結しても、細胞の増殖活性は凍結保存による影響を受けていないことが確認された。
〔試験例１０〕
＜胚、精子、血液細胞、３Ｄオルガノイドの凍結後の生存率＞
　実施例３の凍結保存用組成物を、試験例４と同様の方法で細胞に導入した。細胞種としてヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞と共に胚、精子、血液細胞、３Ｄオルガノイドを用いた。そして、試験例４と同様の方法で凍結後の生存率を調べた結果を表１１に示す。
　使用した細胞は下記のとおりである。
・胚（種：マウス、系統：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ　Ｊｃｌ、ステージ：２ｃｅｌｌ、胚の個数：３０個、購入元：国立研究開発法人　医薬基盤・健康・栄養研究所）
・精子（種：マウス、系統：Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒ　Ｓｌｃ、個数：１ストロー、購入元：国立研究開発法人　医薬基盤・健康・栄養研究所）
・血液細胞（種：ヒト、由来：急性単球性白血病患者末梢血、種類：単球、購入元：ＡＴＣＣ）
・３Ｄオルガノイド（種：ヒト、由来：健常脂肪組織、種類：間葉系幹細胞、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）　マトリゲル基底膜マトリックス　オルガノイド形成用を用いたオルガノイド培養、購入元：LONZA社）
　表１１より、実施例３の凍結保存用組成物を用いれば間葉系幹細胞だけでなく、胚、精子、血液細胞等の細胞や３Ｄオルガノイドを凍結した場合であっても、生存率を高く維持できることが確認された。
〔試験例１１〕
＜免疫不全マウスにおける移植効率の評価＞
　実施例８の凍結保存用組成物を、試験例４と同様の方法で細胞に導入し、凍結及び解凍した間葉系幹細胞用いて、免疫不全マウスにおける移植効率の評価を行った。
　健常者脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）は、スフェロイド培養用マトリゲル及び専用培地に付属する増殖因子を添加して、移植１週間前からスフェロイド状に培養した。幹細胞スフェロイドを、移植用のマトリゲルに１対１の割合で混合した。１×１０７ｃｅｌｌｓのＡＤＳＣを含む移植用の混合液を氷上でシリンジに充填し、免疫不全マウスの背部皮下に移植した。移植し２週間後の移植部位の縦横高さをノギスで計測し、体積（ｍｍ３）を算出した。また、ＡＤＳＣを移植し３週間後に摘出した移植片の重量（ｍｇ）を精密電子天秤を用いて量った。コントロールとして、実施例８の組成物なしで凍結したＡＤＳＣを用いた。結果を表１２に示す。
　表１２より、実施例８の凍結保存用組成物を処置した細胞はマウスに移植した場合であっても生理活性を維持しており、移植片の増大が確認された。
〔試験例１２〕
＜がん原性のin vitro評価＞
　実施例３の凍結保存用組成物を用いて、安全性の指標としてがん原性のin vitro評価 soft-agar colony formation assayを行った。
　１．８　％　ａｇａｒ溶液をオートクレーブにて滅菌して溶解し、４５℃のｗａｔｅｒ　ｂａｔｈで保温した。
　ｂｏｔｔｏｍ　ｍｉｘ（２×ＤＭＥＭ　３７．５ｍｌ、血清９ｍｌ、２．８％ＮａＨＣＯ３　５．２５ｍｌ、１０×ペニシリン／ストレプトマイシン０．９ｍｌ）を作製し、４５℃のｗａｔｅｒ　ｂａｔｈで保温した。
　十分に保温したｂｏｔｔｏｍ　ｍｉｘと１．８％　ａｇａｒ溶液を滅菌した試薬ビンまたはチューブ中で１．４ｖｏｌ：１ｖｏｌの割合で２．５ｍｌ×必要枚数分＋α混和し、４５℃のｗａｔｅｒ　ｂａｔｈで保温した（Ｆｉｎａｌ　０．７５％　ａｇｒａ）。
　３５ｍｍディッシュ又は６ウェルプレートにディスポのピペットを用いて２．５ｍｌずつ上記のｂｏｔｔｏｍ　ａｇａｒを注ぎ、４℃で８分間静置し固めた後インキュベーターにて保温した。
　十分に保温したｔｏｐ　ｍｉｘ（上層：２×ＤＭＥＭ　３７．５ｍｌ、血清９ｍｌ、２．８％ＮａＨＣＯ３　５．２５ｍｌ、１０×ペニシリン／ストレプトマイシン０．９ｍｌ、滅菌水１９．５ｍｌ）と１．８％　ａｇａｒ溶液を滅菌した試薬ビンまたはチューブ中で４ｖｏｌ：１ｖｏｌの割合で１．５ｍｌ×必要枚数分＋α混和し、４５℃のｗａｔｅｒ　ｂａｔｈで保温した（Ｆｉｎａｌ　０．３６％ａｇｒａ）。
　ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を通常の手順ではがした後、セルストレイナーを通すことでシングルセルとし、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。
　細胞懸濁液　１００μｌを　１５　ｍｌチューブに移し、ディスポのピペットを用いてｔｏｐ　ａｇａｒを　３ｍｌ／ｔｕｂｅ加えて泡立たないようにピペッティングし、１．５　ｍｌずつｂｏｔｔｏｍ　ａｇａｒの上に播いた。
　４℃で８分間静置し固めた後、インキュベーターにて保温した。
　２週間後にコロニーを染色し、カウントした。結果を表１３に示す。
　表１３より、保存期間が０、３、６ヶ月のいずれもコロニーは生じず、実施例３の凍結保存用組成物を細胞に導入することによるがん原性は確認されなかった。

Claims (8)

  1. 　両親媒性分子を構成成分とし、前記両親媒性分子が単層又は二層のナノ粒子を含む、細胞若しくは生体組織の凍結保存用組成物。
  2. 　前記ナノ粒子が、カチオン性ナノ粒子である、請求項１に記載の凍結保存用組成物。
  3. 　前記両親媒性分子が、Ｇｅｍｉｎｉ型界面活性剤であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の凍結保存用組成物。
  4. 　前記ナノ粒子のゼータ電位が、１０ｍＶ以上５０ｍＶ以下である、請求項１又は２に記載の凍結保存用組成物。
  5. 　前記ナノ粒子の体積平均粒子径が、３０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項１又は２に記載の凍結保存用組成物。
  6. 　前記ナノ粒子が、フェルラ酸又は活性化ビタミンＣを内包する、請求項１又は２に記載の凍結保存用組成物。
  7. 　細胞若しくは生体組織と請求項１～６のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物とを混合してナノ粒子を細胞若しくは生体組織内に導入する工程と、
    　前記ナノ粒子が導入された細胞又は生体組織を凍結する工程と、
    を含む、細胞又は生体組織の凍結保存方法。
  8. 両親媒性分子を構成成分とし、前記両親媒性分子が単層又は二層のナノ粒子を含む、凍結した細胞又は生体組織。

     
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TAOUZINET LAMIA, FATMI SOFIANE, KHELLOUF ALLAEDDINE, SKIBA MOHAMED, IGUER-OUADA MOKRANE: "Alpha Tocopherol Loaded in Liposome: Preparation, Optimization, Characterization and Sperm Motility Protection", DRUG DELIVERY LETTERS, BENTHAM SCIENCE, vol. 10, no. 3, 10 September 2020 (2020-09-10), pages 228 - 236, XP009552256, ISSN: 2210-304X, DOI: 10.2174/2210303110666200302113209 *

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