JP2002535349A

JP2002535349A - 改良されたミセル組成物を生成するための材料および方法

Info

Publication number: JP2002535349A
Application number: JP2000595652A
Authority: JP
Inventors: ハイアットアルカン−オニウクセル，; イスラエルルービンスタイン，
Original assignee: ザ、ボード、オブ、トラスティーズ、オブ、ザ、ユニバシティー、オブ、イリノイ
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2002-10-22
Also published as: ATE309784T1; WO2000044348A3; DE60024054D1; EP1146857A2; EP1146857B1; US6217886B1; WO2000044348A2; CA2355269C; CA2355269A1; EP1661557A1; DE60024054T2

Abstract

(57)【要約】ミセルまたは結晶生成物と会合状態にある生物学的に活性な両親媒性物質を含む、改良された生物学的に活性なミセルおよび結晶生成物を調製するための方法が提供される。ミセルまたは結晶生成物を生成するための方法だけでなく、治療用、診断用、及び化粧品用での、ミセルまたは結晶生成物を使用する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

本願は、１９９７年７月１４日にファイルされた米国仮特許出願第６０／０５
２，０７８号に対する優先権の利益を、３７Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づい
て主張して、１９９８年７月９日にファイルされた、国際特許出願第ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９８／１４３１６号の一部継続出願である。

【０００１】

【発明の背景】

本発明は、広義には生物学的に活性な化合物に関し、特に、両親媒性である（
すなわち親水性の部分と疎水性の部分の両方を有する）、化合物、ペプチド、タ
ンパク質、その断片、類似体、モジュレーターに関する。具体的には、本発明は
、ミセルを用いた診断、治療、化粧品での用途の他、臓器、組織および細胞を保
存する用途に関連して、両親媒性のペプチド、タンパク質、その断片、類似体、
モジュレーターを送達および提供するための改良された方法に関する。また、本
発明は、水溶液に不溶性の化合物を送達するための方法も提供するものである。
具体的には、本発明によれば、脂質で表面コーティングされた不溶性の結晶化合
物で構成される立体的に安定化された結晶生成物の生成方法が得られる。

【０００２】本発明で特に重要視しているのは、血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、成長
ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、ペプチドヒスチジンイソロイシン（ＰＨＩ）、ペ
プチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ）、下垂体のアデニルシクラーゼ活性化ポ
リペプチド（ＰＡＣＡＰ）、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、ヘモデルミン（ｈｅｍ
ｏｄｅｒｍｉｎ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ソーバジンおよび
ウロテンシン１、セクレチン、グルカゴン、ガラニン、エンドセリン、カルシト
ニン、α₁−プロテイナーゼインヒビター、アンジオテンシンＩＩ、副腎皮質刺
激ホルモン放出因子、抗菌ペプチドおよびタンパク質全般、表面活性ペプチドお
よびタンパク質、α−ＭＳＨ、アドレノメデュリン、ＡＮＦ、ＩＧＦ−１、α２
アミリン、オルファニン、オレキシンを含むがこれに限定されるものではないペ
プチド化合物のファミリーのメンバーである生物学的に活性な両親媒性ペプチド
である。特に、本発明は、ＶＩＰ／ＧＲＦペプチドファミリー（両親媒性ペプチ
ド全般）、タンパク質およびその生物学的に活性な類似体、断片およびモジュレ
ーターのメンバーを含む、改良されたミセル組成物を用いて、ＶＩＰ／ＧＲＦフ
ァミリーのペプチドならびに他の両親媒性で標的組織までペプチドを送達するた
めの改良された治療方法に関する。

【０００３】ＶＩＰは、生物学的作用のプロファイルが広範囲にわたり、複数のシグナル伝
達経路を活性化することで知られている、２８アミノ酸長の神経ペプチドである
。たとえば、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ５（Ｓｕｐｐｌ．１）：１４９〜１５０（１９
８４）およびＰａｕｌおよびＥｂａｄｉ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２３：
１９７〜２１４（１９９３）を参照のこと。π−ヘリックス構造を持つＶＩＰで
は非極性基と極性基とが分離してヘリックスの反対側の面に結合しているが、こ
のような両親媒特性はＶＩＰを無秩序なα−ヘリックスとしてモデル化しても顕
著に認められることが、ＶＩＰのシッファー・エドマンドソン投影図から明らか
になっている（Ｍｕｓｓｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７：８１４７〜８
１８１（１９８８））。Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｃｈｅｍ．
３：１３３〜１４０（１９７４）には、ＶＩＰ類似体のヘリックス形成傾向とそ
の生理活性との相関について説明されている。純水中では、ＶＩＰのスペクトル
特性がランダムコイルのスペクトル特性と一致する。しかしながら、この分子で
は有機溶媒およびアニオン性脂質によってヘリカル情報が導出される。たとえば
、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ２１：１２１７〜１２２８（
１９８３）、Ｈａｍｅｄら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ２２：１００３〜１０２
１（１９８３）、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃＣｈｅｍ．３
：１３３〜１４０（１９７４）を参照のこと。

【０００４】両親媒性ヘリックスを形成できる短鎖ペプチドが脂質二重膜と結合したり脂質
二重膜を貫通したりすることは周知である。ＫａｉｓｅｒおよびＫｅｚｄｙ、Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＣｈｅｍ．１５：５
６１〜５８１（１９８７）およびＳａｎｓｏｍ、Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍ
ｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５５：１３９〜２３５（１９９１）を参照のこと。一例と
して、ＤｅＧｒａｄｏおよびＬｅａｒ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：
７６８４〜７６８９（１９８５）に開示されている（ＬＫＫＬＬＫＬ−）のよう
なモデルペプチドや、ＷａｔａｔａおよびＧｗｏｚｄｚｉｎｓｋｉ、Ｃｈｅｍ−
Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ８２：１３５〜１４９（１９９２）に開
示されている２６残基のハチ毒ペプチドであるメリチンがあげられる。考えられ
る結合機序として、極性アミノ酸とリン脂質極性基との間の静電相互作用によっ
て二重層面と平行にペプチドモノマーが配置されることや、疎水性作用によって
多少なりとも安定化された無極性の二重層コアにペプチド集合体が挿入されるこ
とがあげられる。Ｓａｎｓｏｍ、Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉ
ｏｌ．５５：１３９〜２３５（１９９１）を参照のこと。

【０００５】ＶＩＰはホモペプチドファミリーに属し、同じファミリーの他のメンバーとし
ては、ペプチドヒスチジンイソロイシン（ＰＨＩ）、ペプチドヒスチジンメチオ
ニン（ＰＨＭ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、下垂体のアデニルシクラー
ゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、ヘモデルミ
ン、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ソーバジンおよびウロテンシン１
、セクレチンおよびグルカゴンがあげられる。ＶＩＰ同様に、ＶＩＰ／ＧＲＦペ
プチドファミリーの他のメンバーならびにその生物学的に活性な類似体は、脂質
二重膜を結合できる両親媒性ヘリックスを形成することができる。ＶＩＰ／ＧＲ
Ｆペプチドファミリーのメンバーの生物学的作用は細胞表面で発現されるタンパ
ク質受容体や細胞内受容体によって媒介されると考えられており、最近になって
カルモジュリンがＶＩＰに対する細胞内受容体である可能性が高いことが示され
た［Ｓｔａｌｌｗｏｏｄら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９６１７〜１９
６２１（１９９２）およびＳｔａｌｌｗｏｏｄら、ＦＡＳＥＢＪ．７：１０５
４（１９９３）］。

【０００６】旋光分散および円二色性スペクトルによってＶＩＰのコンホメーションを研究
調査したのはＢｏｄａｎｓｚｋｙらが最初であった（Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｃｈｅ
ｍ．３：１３３〜１４０（１９７４））。彼らはＶＩＰを溶解した溶媒の疎水度
次第でＶＩＰの構造が異なることを示した。ＶＩＰの水中でのスペクトルから、
ほとんど（約８０％）はランダムコイル構造であることが明らかになった。しか
しながら、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）またはメタノールなどの有機溶媒
を添加すると、たとえ低濃度であったとしても明らかにヘリカル構造に変化して
いた。著者らは、有機溶媒がペプチドの構造に及ぼす上記のような作用が受容体
の状態に合っているため、ＶＩＰのヘリカルコンホメーションがその生理活性に
必要な「アクティブアーキテクチャ」に相当するのであろうとの見解を打ち出し
た。これらの初期の研究調査は、ＶＩＰならびにそのファミリーメンバーのうち
の２つであるセクレチンおよびグルカゴンの水中でのコンホメーション、アニオ
ン性洗剤およびアニオン性脂質（ＰＡおよびホスファチジルグリセロール（ＰＧ
））のコンホメーションを解析した、Ｒｏｂｉｎｓｏｎらによる所見（Ｂｉｏｐ
ｏｌｙｍｅｒｓ２１：１２１７〜１２２８（１９８２））と一致していた。彼
らは、アルギニル残基、ヒスチジル残基、リシル残基（これらの３種類のペプチ
ドすべてにおいて、その１３〜２０アミノ酸領域に相当）によって、ヘリックス
形成率が高くなることを示した。ここでも両性イオン性脂質および水系溶媒中の
ＶＩＰに目立って無秩序な構造が見られることから、極性頭部基の電荷がヘリッ
クス形成に重要な役割を果たしているであろうと思われた。４０％ＨＦＩＰ／Ｈ ₂ Ｏ混合物を用いる円二色性（ＣＤ）スペクトル解析と¹Ｈ−ＮＭＲ解析とを利用
して、Ｆｏｕｒｎｉｅｒらは、有機溶剤の存在下でＶＩＰのセグメント１５〜２
８がα−ヘリックスを形成する（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ５：１６０〜１７７（１９
８４））ことを示した。また、Ｔｈｅｒｉａｕｌｔらは、二次元¹Ｈ−ＮＭＲ分
光法を利用して４０％ＴＦＥ中での未変性ＶＩＰの完全構造解析を実施した（Ｂ
ｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ３１：４５９〜４６４（１９９１））。これらの解析の
結果は、ＶＩＰを２５％メタノール／水中にて調査したＦｒｙらによって得られ
たもの（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：２３９９〜２４０９（１９８９））
と同様であった。彼らは、アミノ酸７〜１５と１９〜２７との間の２つのヘリカ
ルセグメントが、分子に易動性を与えるランダムコイルのペプチド鎖部分によっ
て結合されていると説明していた。

【０００７】最後に、未変性ペプチドは生体移行性が極めて低いため、いくつかのグループ
がＶＩＰのさらに有効な類似体を潜在的治療薬として開発することに取り組んだ
。興味深いことに、どのグループでもＶＩＰの配列を修飾してそのヘリシティと
両親媒性を高めた。Ｂｏｌｉｎと彼の同僚の手によってＶＩＰ構造活性関係が徹
底的に研究調査された（Ｆｒｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：２３９９
〜２４０９（１９８９）、Ｂｏｌｉｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ３７：５７
〜６６（１９９５））。これらの結果のうち、アミノ酸残基を特定の形で置換し
てヘリカル構造を強化することが薬効増大と比例的に関係していた。また、ＶＩ
Ｐの薬剤活性官能基がペプチド配列全体にわたって複数の結合部位からなるもの
であることが明らかになった。Ｍｕｓｓｏらによって、受容体との間で一層強い
相互作用を示すＶＩＰのヘリックスベースの類似体も開発された（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ２７：８１７４〜８１８１（１９８８））。インポテンツの非侵
襲治療用（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３４：２１２１〜２１２５（１９９
４））および神経変性疾患用（Ｇｏｚｅｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ
．Ｔｈｅｒ．２７３：１６１〜１６７（１９９６））に、Ｇｏｚｅｓらによって
薬効の１００倍高いステアリル−ノルロイシン−ＶＩＰ類似体が設計された。脂
肪酸部分を加えてアミノ酸を置換するとペプチドの親油性が高まったが、これに
よって生物膜に対する貫通性が改善されると思われた。

【０００８】要するに、ＶＩＰは有機溶媒が与えられると疎水性環境でヘリカルコンホメー
ションをとり、環境の疎水性が強まるにつれてＶＩＰのヘリカル構造も増すこと
が明らかになっている。このペプチドは塩基性かつ疎水性の残基を多く含むもの
であるが、その中央部分に見られるヘリカルモチーフによって、受容体との結合
を容易にして膜脂質との直接的な相互作用を促進し、生理活性の増加を引き起こ
し得る両親媒性構造が形成される。さらに、タンパク質分解が特に発生しやすい
特定の部位を保護することで、ＶＩＰのヘリカル構造が安定性を高める一助とな
っている可能性もある。

【０００９】Ｇｏｚｅｓらが述べている（Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３：２０１〜２３
６（１９８９））ように、免疫蛍光法およびラジオイムノアッセイ法によって、
ＶＩＰの中枢神経系および末梢神経系での分布が広範囲にわたると同時に選択的
あることが明らかになった。脳ではＶＩＰを豊富に含むニューロンの密度が視床
下部（特に視交叉上核および室傍核ならびに大脳皮質）で最大になる。末梢血よ
りも下垂体門脈血の方がＶＩＰ濃度が高いことから、このペプチドが視床下部に
よって分泌され、腺下垂体に輸送されることが分かる。末梢神経系では、多くの
臓器で、血管、非血管平滑筋、腺胞および導管をなすＶＩＰ免疫陽性神経が、線
維および終末に認められる。コリン作動性ニューロンでＶＩＰとアセチルコリン
が共存していることも、さまざまな文献に記載されている。ＶＩＰ神経のなかに
は、自律神経系の構成要素であることが最近になって認められたものもある。さ
らに、Ｍｕｌｌｅｒら（Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１０：１１５〜１３４
（１９９５））によって、血小板、肥満細胞、皮膚細胞、好中球、網膜アマクリ
ン細胞などの特定の細胞群はＶＩＰを合成および放出できるであろうことが示さ
れた。

【００１０】ＶＩＰの生理作用は、特定の細胞受容体に対する結合によって主に生じるもの
である。Ｈｉｒａｔａらは、ラット大動脈由来の培養血管平滑筋細胞に見られ、
β−アドレナリン作動性受容体とは異なる、ＶＩＰに対する２つの特定の受容体
結合部位（一方が低親和度で他方は高親和度である）について述べた（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３２：１０７９〜１０８７（１
９８５））。分子的な面からみると、ｃＤＮＡのクローニング後に２種類の多価
ＶＩＰ受容体が識別された。第１の受容体であるＶＩＰ₁受容体は、ＰＡＣＡＰ
ＩＩ受容体とも呼ばれるセクレチン受容体と類似のものであり、腸、肺、肝臓
、筋肉細胞、卵巣の他、さまざまな脳領域で発現される（Ｓｒｅｅｄｈａｒａｎ
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０３：１４１〜１
４８（１９９４））。第２の受容体であるＶＩＰ₂受容体は、ＧＲＦ結合部位に
近いものであり、中枢神経系にその分布がはっきりと認められる（Ｌｕｔｚら、
ＦＥＢＳＬｅｔ．３３４：３〜８（１９９３））。最近の研究調査から、ＶＩ
Ｐの作用が受容体によるものではない可能性があることも分かっている（Ｓｅｊ
ｏｕｒｎｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７３：Ｒ２８７〜Ｒ２９２（１９
９７））。

【００１１】何年にもわたって研究調査されてきているが、ＶＩＰの細胞内シグナル伝達カ
スケードのほとんどはいまだ解明されないままである。多くの細胞で観察される
最も一般的な細胞作用が、アデニルシクラーゼの刺激による細胞内での環状アデ
ノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の産生増大である。ｃＡＭＰ誘導経路の以後のステ
ップは依然として仮説の域を全く出ていない。逆に、ｃＡＭＰ非依存性のシグナ
ル形質導入カスケードの存在を明らかにしている観察結果もいくつかある。Ｓｒ
ｅｅｄｈａｒａｎらは、ＶＩＰ₁受容体が、２つの異なる経路すなわちアデニル
シクラーゼの活性化と細胞内Ｃａ²⁺の増加をひとつの細胞型で誘導することを最
近になって見出した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２
０３：１４１〜１４８（１９９４））。副腎髄質および頚神経節がＶＩＰによっ
て刺激されると、イノシトール１，４，５三リン酸（ＩＰ₃）および細胞内Ｃａ² ⁺ の生成量が増えることが明らかになった（Ｍａｌｈｏｔｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６３：２１２３〜２１２６（１９８８））。さらに、内在化され
たＶＩＰは核受容体と結合してタンパク質キナーゼＣを賦活できる可能性も示さ
れた（Ｏｍａｒｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１５７８〜１５８０（１９８７
）、Ｚｏｒｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：２６８９〜２６
９４（１９９０））。

【００１２】ＶＩＰの多彩な分布は広範囲にわたる生理活性スペクトルを生んでいることと
関係があり、次第に増えていく証拠からみて、ＶＩＰは多くの臓器で重要なさま
ざまな機能の調節に重要な役割を果たしているのではないかと考えられる。ＶＩ
Ｐの生理作用は、心臓血管系、呼吸器系、生殖系、消化系、免疫系、中枢神経系
ならびに代謝機能、内分泌機能および神経内分泌機能で報告されている（論評に
ついては、ＴｒｅｎｄｓＥｎｄｏｃｒｉｍｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２：１０７〜１
１２（１９９１）などを参照のこと）。多くの場合、ＶＩＰは神経伝達物質また
は神経修飾物質として作用し、小さな集合体で局所循環系に放出される。血管緊
張の調節に関連のある、大脳血管、冠状動脈血管、末梢血管、肺血管の血管拡張
；胃腸平滑筋、子宮平滑筋、気管支平滑筋の弛緩；腸、呼吸器、膵上皮による外
分泌液、水およびアニオン；男性および女性の活性と応答の刺激；神経内分泌機
能の放出および調節（レニン放出、メラトニン分泌）；免疫系の阻害（血小板凝
集の阻害）；神経細胞の刺激と保護が、いずれもＶＩＰによって媒介または促進
されると考えられている機能である（たとえば、ＴｒｅｎｄｓＥｎｄｏｃｒｉ
ｍｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２：１０７〜１１２（１９９１）、Ｐａｕｌら、Ｎｅｕｒ
ｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２３：１９７〜２１４（１９９３）などを参照のこと）。

【００１３】血管平滑筋細胞成長の阻害、培養したヒトケラチノサイトの増殖、細胞の分化
と個体発生に関与する神経栄養因子および成長因子の放出、抗酸化特性などの新
たなＶＩＰ機能が最近になって報告されたが、依然としてさらに研究調査を行う
必要がある（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１０：１１５〜１
３４（１９９５）、たとえば、ＴｒｅｎｄｓＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａ
ｂ．２：１０７〜１１２（１９９１））。

【００１４】今日のヒトの疾患のなかには、ＶＩＰの放出不足と関連していることが知られ
ているものがある。ＶＩＰ欠乏は、嚢胞性線維症、糖尿病性インポテンツ、ハー
シュスプルング病の先天性巨大結腸症、食道アカラジアなどのいくつかの疾患の
病因と関連している。さらに、ＶＩＰは人間で気道弛緩を引き起こすことが知ら
れているため、ＶＩＰ不足は喘息気道における気管支過敏の原因となり得る。ま
た、喘息患者の肺組織にはＶＩＰ神経の選択的な欠如が認められた（Ｏｌｌｅｒ
ｅｎｓｈａｗら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２０：１２４４〜１２４８（１
９８９））。最後に、Ａｖｉｄｏｒらによって、本態性高血圧自然発症ラットで
脳のＶＩＰ遺伝子発現の増加が観察され、この疾患の病理生理と関連していると
考えられた（ＢｒａｉｎＲｅｓ．５０３：３０４〜３０７（１９８９））。

【００１５】一方、ＶＩＰの過剰放出が病因に関連している疾患はほとんどない。その病理
症候群のひとつが膵性コレラすなわち、水様性下痢−低Ｋ血症−無酸症状態であ
る（Ｋｒｅｊｓ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５２７：５０１〜５０７
（１９８８））。特定の腫瘍、特に膵臓腫瘍、気管支原性腫瘍、神経原性腫瘍は
、ＶＩＰの循環レベルの上昇と関連している。

【００１６】ＶＩＰの多数の生理作用がゆえに、ＶＩＰを医薬品として使用することに対す
る感心は次第に高まっている。ＶＩＰの開発内容で治療効果が上がる可能性があ
るものとして、局所血流が阻害される疾患の治療があげられる。これには、全身
の血管過負荷の低減による高血圧治療、左心不全、鬱血性心不全、冠状動脈また
は末梢血管での虚血の治療を含む。人間に１０時間ＶＩＰを注入すると、総末梢
抵抗が３０％小さくなり、前腕血流が２７０％増加することが明らかになった（
Ｆｒａｓｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．６０：１３５６〜１３６１（１９８
７））。さらに、同様にＡｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３０４：３１９〜３３３（
１９９２）には強皮症患者では皮膚のＶＩＰ−免疫陽性神経と血漿ＶＩＰ濃度が
低いことが分かったとあるため、ＶＩＰを用いての治療によってこの障害状態か
ら回復する可能性がある。ＶＩＰを投与することで治療できるであろう他の疾患
としては、喘息の気管支痙攣の治療があげられる。ＶＩＰは喘息患者で気管支収
縮に対する保護に役立ち、気道平滑筋の弛緩薬として作用することが明らかにな
っている（Ｍｏｒｉｃｅら、Ｌａｎｃｅｔ２６２（８３６１）：１２２５〜
１２２７（１９８３））。その抗炎症特性によって喘息での治療効果をさらに高
められる可能性もある（たとえば、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．１３（Ｓｕｐｐｌ．
２）：２５７〜２６２（１９９２））。また、組織傷害の予防および／または軽
減にもＶＩＰの投与を利用できる。このペプチドは、ヒト免疫不全ウイルスの外
部エンベロープタンパク質ｇｐ１２０によって生じる神経細胞死をインビトロに
て妨害すると説明されている（Ｇｏｚｅｓら、Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３
：２０１〜２３６（１９８９）、Ｈｏｋｆｅｌｔ、Ｎｅｕｒｏｎ．７：８６７
〜８７９（１９９１））が、これはＡＩＤＳ痴呆に対する潜在的な治療法ならび
にアルツハイマー病の治療につながる可能性がある。同様に、酸化ストレスを含
むさまざまな成因によって引き起こされる感染性の急性肺傷害がＶＩＰの存在に
よって軽減した（Ｂｅｒｉｓｈａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５９：Ｌ１
５１〜Ｌ１５５（１９９０））。ＶＩＰを特定の肺麻痺液に添加して使用すると
移植前のラット肺保存が改善されることが明らかになった（Ａｌｅｓｓａｎｄｒ
ｉｎｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ５６：９６４〜９７３（１９９３
））。

【００１７】ＶＩＰのインビボ投与を制限している主な要因のひとつが、主にタンパク質分
解、加水分解および／またはこのペプチドのとるコンホメーションの多様性によ
る標的組織での生体移行性の低さであった。ＶＩＰ単独および／またはＶＩＰ−
カルモジュリン混合物の細胞内送達によって、このペプチドの細胞表面結合に必
要な要件をバイパスし、これによってペプチドの生物学的作用を高められるので
はないかと考えられてきた。リポソームの脂質二重膜は細胞のプラズマ膜と融合
し、捕捉した内容物を細胞内区画まで送達することが知られているため、このペ
プチドがリポソーム内およびリポソーム表面で発現されれば細胞内送達が可能に
なるかもしれない。

【００１８】リポソームとはリン脂質で構成された非常に小さな球状構造物であり、１９６
０年代に入って初めて発見された（Ｂａｎｇｈａｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１３：２３８（１９６５））。水性媒体中では、両親媒性のリン脂質分子が親水
性相互作用および疎水性相互作用の結果として二重層として閉じた形状で本態的
に自己集合する。このようにして形成される小胞はリポソームと呼ばれ、生物学
的に活性な親水性分子および薬物に対するインビボでの潜在的なキャリアとなり
得る特性のひとつとして、懸濁された水性媒体の内部に封入される。親油性の薬
剤を輸送し、リポソーム膜の中に取り込むことも可能である。しかしながら、リ
ポソームは細網内皮系（ＲＥＳ）に急速に捕獲されてしまうため、医療用途でリ
ポソームを活用して成果が得られるのは非常に限られた場合であった。リポソー
ムのＲＥＳによる貪食を低減しようと尽力したところ、１９８０年代後半になっ
て、循環半減期が大幅に延長されたリポソーム（立体的に安定化されたリポソー
ム）（ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙｓｔａｂｉｌｉｚｅｄｌｉｐｏｓｏｍｅ；ＳＳ
Ｌ）が開発され、リポソームの薬物送達系としての開発に再び希望をなげかけた
。独立した２つの研究所で、赤血球細胞のバイオロジーを研究調査している過程
で、赤血球膜上にシアル酸が存在することが滞留時間を極めて長くしている一因
であることつきとめた。特に、ガングリオシドＧＭ₁などのシアル酸を含む糖脂
質をホスファチジルコリン（ＰＣ）：コレステロール（Ｃｈｏｌ）リポソームに
取り込むと、小胞の滞留時間が効率よく延長された（Ａｌｌｅｎら、ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔｅｒ２２３：４２〜４６（１９８７）、１９９０年４月４日付けでＡ
ｌｌｅｎらに付与された、米国特許第４，９２０，０１６号（１９８７年１２月
１８日に第１３２，１３６号として出願、第２４頁）、Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８：６９４９（１９８８））。こ
れらの初期の頃の結果から、特に化学療法の分野でリポソームを薬剤キャリアと
して用いることへの新たな展望が得られた。というのは、半減期が延長されるこ
とは、マウスに移植した腫瘍による取り込み量が多くなることと十分に相関して
いたためである（Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ８：６９４９（１９８８））。

【００１９】１９９０年代には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の脂質誘導体を含有す
る第二世代のＳＳＬについて、さまざまな研究調査によってほぼ同時期に開発が
なされ、さらなる改良へとつながった（Ｋｌｉｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳＬｅｔ
ｔｅｒ２６８（１）：２３５〜２３７（１９９０）、Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０６６：２９〜３６（１９９１））。Ｋ
ｌｉｂａｎｏｖらは、ＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＰＥ（１：１：０．１５）小胞
について、マウスでのＰＣ／Ｃｈｏｌ（１：１）リポソームの血中半減期が３０
分ｖｓ．５時間であることを示した（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒ２６８（１）：
２３５〜２３７（１９９０））。この他にも、複合リン脂質ＰＥＧ−ジ−ステロ
イル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）の調製法が迅速かつ単純で
あることが報告され（Ｋｌｉｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒ２６８（
１）：２３５〜２３７（１９９０）、Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ１０６６：２９〜３６（１９９１））、ＰＥＧは製剤として
の用途ですでに承認を受けた（ＰＥＧ−ＡＤＡ、Ｒｈｉｎａｒｉｓ（登録商標）
）。

【００２０】本発明では、タンパク質の水溶性ポリマーとの接合によって循環タンパク質の
半減期が延長されるという観察結果に注目している［Ｎｕｃｃｉら、Ａｄｖ．Ｄ
ｒｕｇＤｅｌ．Ｒｅｖ．６：１３３〜１５１（１９９１）、Ｗｏｏｄｌｅら、
Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．
Ｍａｔｅｒ．１７：７７〜７８（１９９０）］。この観察結果から、循環による
リポソームの急速な排除の発生を有意に最低限に抑える改良された薬物送達系と
して、立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）（「ＰＥＧ−リポソーム」と
しても知られている）が開発された［ＬａｓｉｃおよびＭａｒｔｉｎ、Ｓｔｅａ
ｌｔｈＬｉｐｏｓｏｍｅｓ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＢｏｃａＲａ
ｔｏｎ、ＦＬ（１９９５）］。ＳＳＬは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が
好ましいポリマーでコーティングされたリポソームであり、リン脂質のうちの１
つと共有結合的に接合され、その小胞の二重層の外には親水性の被膜が形成され
ている。このような立体障壁によって、オプソニンによる認識を遅らせて従来の
リポソームよりもかなり長い時間ＳＳＬを循環系にとどめることができるように
なり［ＬａｓｉｃおよびＭａｒｔｉｎ、ＳｔｅａｌｔｈＬｉｐｏｓｏｍｅｓ、
ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、ＦＬ（１９９５）、Ｗ
ｏｏｄｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１０５：１９３
〜２００（１９９２）、Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ１１９０：９９〜１０７（１９９４）、ＢｅｄｕＡｄｄｏら、
Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：７１８〜７２４（１９９６）］、いくつかの化学治
療薬および抗感染薬で封入された薬剤の薬効が高まる［ＬａｓｉｃおよびＭａｒ
ｔｉｎ、ＳｔｅａｌｔｈＬｉｐｏｓｏｍｅｓ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．
、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、ＦＬ（１９９５）］のである。この分野での研究調査
から、さまざまな要因がＳＳＬの循環半減期に影響するため、平均小胞径は２０
０ｎｍ未満で、ＰＥＧの分子量約２,０００Ｄａ、濃度５％（９〜１２）とする
のが理想であることが明らかになっている［ＬａｓｉｃおよびＭａｒｔｉｎ、Ｓ
ｔｅａｌｔｈＬｉｐｏｓｏｍｅｓ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９９５）、Ｗｏｏｄｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ１１０５：１９３〜２００（１９９２）、Ｌｉｔｚｉｎｇｅ
ｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１９０：９９〜１０７（
１９９４）、ＢｅｄｕＡｄｄｏら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：７１８〜７２
４（１９９６）］。

【００２１】ＳＳＬがマクロファージを回避して血液中に長時間滞留する機序には、結合し
たＰＥＧ分子によるリポソーム周囲への「立体障壁」の形成が関与していると考
えられている。Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎらは、ＳｔｅａｌｔｈＬｉｐｏｓｏｍｅｓ
、Ｄ．ＬａｓｉｃおよびＦ．Ｍａｒｔｉｎ（編）、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、Ｂｏｃ
ａＲａｔｏｎ、ＦＬ、第５１〜６２頁（１９９５）にて、ＰＥＧがリポソーム
のオプソニン化を妨害する能力は、比較的低いポリマー濃度であっても小胞表面
への親水性被膜の形成を伴う、ＰＥＧの溶媒中での挙動によって決まるのだと主
張した。この負の親水性コーティングが保護シールドとして作用するため、正に
荷電した脂質表面に結合することの多いオプソニンがリポソームと結合するのが
遅れるのであろうと思われる。

【００２２】リポソームのサイズ、ＰＥＧ分子量、鎖長および濃度の選択の仕方と脂質組成
物の選択の仕方によって、立体的に安定化されたリポソームの滞留時間を制御す
ることができる。Ｍａｒｕｙａｍａらは、一定のサイズ（１８０〜２００ｎｍ）
および組成（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（１：１）中６％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）でＰＥＧ
分子量の異なる（１，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、１２，０
００Ｄａ）ＳＳＬを試験した（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３９：１６２
０〜１６２２（１９９１））。マウスでは、６時間後に注射用量の４７．１％が
依然として血中に滞留していたＰＥＧ_2,000-リポソームが最も長く持続する組成
であるように思われた。Ｋｌｉｂａｎｏｖらは、直径２００ｎｍのＰＣ／Ｃｈｏ
ｌ／ＰＥＧ−ＰＥ（１０：５：１）押出リポソームを用いて、ＰＥＧ₇₅₀、ＰＥ
Ｇ_2,000およびＰＥＧ_5,000で、マウスにて同様の研究調査を行った（ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔｅｒ２６８（１）：２３５〜２３７（１９９０））。著者らはリポソ
ーム表面に生成される「立体障壁の度合い」を評価し、この度合いがＰＥＧの鎖
長と直接相関した濃度依存性のものであるという結論に至った。また、ＳＳＬの
延長はＰＥＧ鎖長に直接比例し、これ自体が立体障壁に対応することを示唆した
。最後に、他のグループ（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ１０６６：２９〜３６（１９９１）、Ｗｏｏｄｌｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１０５：１９３〜２００（１９９２））では、
ＰＥＧ鎖長を２，０００Ｄａから５，０００Ｄａに伸長してもＲＥＳの取り込み
に対してさらに抑制作用が働くわけではないことを示す、多少なりとも相反する
結果を見出した。分子量１，９００、２，０００および５，０００のＰＥＧは近
年、さまざまな用途に利用されている。

【００２３】Ｈｕａｎｇのグループ（Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ１０６２：１４２〜１４８（１９９１）、Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒら
、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１９０：９９〜１０７（１９
９４））は、生物分布の研究調査においてリポソームのサイズがいかに重要かを
指摘し、小さな小胞（＜１００ｎｍ）は肝臓に取り込まれるが、大きめのもの（
３００ｎｍ＜直径＜５００ｎｍ）になると脾臓の特に赤脾髄および辺縁帯に蓄積
されるという観察結果を得た。特に、脾臓の主な機能は老化赤血球や損傷赤血球
を濾過することであり、リポソームの取り込みにもこれと同じ濾過の機序が利用
され、次いで脾臓のマクロファージによるエンドサイトーシスが起こるように見
えた。しかしながら、このような取り込みが起こる理由は明らかになっていない
。彼らの研究調査から、最適な滞留時間は直径１５０〜２００ｎｍのＳＳＬを用
いる場合に得られることが分かった。Ｇｈｏｓｈらはこの成果を確認し、ＳＳＬ
の延長作用が得られるのは直径７０〜２００ｎｍという狭い範囲のサイズのとき
に限られることを示した（ＳｔｅａｌｔｈＬｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｄ．Ｌａｓｉ
ｃおよびＦ．Ｍａｒｔｉｎ（編）、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ＢｏｃａＲａｔｏｎ
、ＦＬ、第１３〜２４頁（１９９５））。ＳＳＬの用途のほとんどは、リポソー
ムの調製方法にサイズを低減する工程を含むものであるように思われる。

【００２４】Ｋｌｉｂａｎｏｖらは脂質組成物がＳＳＬの血中滞留時間に対して及ぼす影響
について研究調査し、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を添加した場合以外は、Ｓ
ＳＬが異なっても半減期はいずれも極めて近いことを見出した（Ｂｉｏｃｈｉｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０６２：１４２〜１４８（１９９１））。Ｗｏ
ｏｄｌｅらも脂質組成の異なるＳＳＬを用いてマウスおよびラットで生物分布の
研究調査を行った（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１０５：１
９３〜２００（１９９２））。彼らも同様に、ＰＣの水素化量の増加（すなわち
バルク脂質の転移温度の上昇）、アニオン性脂質であるＰＧの添加、コレステロ
ール濃度の違いは、延長作用に何ら影響しないことを示した。リン脂質の相転移
、コレステロール含量または中性／負の電荷とは無関係に、血中クリアランスに
ついては首尾一貫して半減期で約１５時間が観察された。

【００２５】それにもかかわらず、最近になって、Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏらが、延長後の滞留
時間に適したほとんどの組成では、短鎖ＰＥＧ−ＰＥの濃度を低く抑えて（＜１
０％）コレステロールを最低でも３０ｍｏｌ％含有すべきであると主張し、リポ
ソームを安定化させる上でのコレステロールの役割に光明を投じた（Ｐｈａｒｍ
．Ｒｅｓ．１３：７１８〜７２４（１９９６））。著者らは、蛍光エネルギー移
動法を用いてインビトロでの表面保護効率を調査した。コレステロールを添加す
ると、二重層の結合強度の増加により表面保護性が改善された。これによって、
リポソームの二重層にＰＥＧ−ＰＥ量の少ない「むき出しの点」が形成されにく
くなり、相分離や血中リポタンパク質との間の脂質交換が防止される。しかしな
がら、インビボでは、長時間にわたって維持されるＳＳＬ循環のほとんどがＰＥ
Ｇコーティングに左右され、リポソームの二重層の組成に依存する面は少ないの
ではないかと思われる。

【００２６】わずか５％のＰＥＧ−ＰＥで小胞に最適な立体障壁作用が得られるとの報告が
さまざまな研究者からなされた（Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０６２：１４２〜１４８（１９９１）、Ｗｏｏｄｌｅら
、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１０５：１９３〜２００（１
９９２）、ＭｃＩｎｔｏｓｈら、ＳｔｅａｌｔｈＬｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｄ．Ｌ
ａｓｉｃおよびＦ．Ｍａｒｔｉｎ（編）、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ＢｏｃａＲａ
ｔｏｎ、ＦＬ、第６３〜７１頁（１９９５））。インビトロでの研究調査で十分
な結果を得るためのＰＥＧの最大値は１０ｍｏｌ％であり、これより高い濃度に
なるとＰＥＧ−ＰＥのミセルが自然に形成されてしまうことが、極めて最近にな
って報告された（Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：７１８〜
７２４（１９９６））。

【００２７】また、本願では、立体的に安定化されたリポソームの改良ならびにこれを用い
た音響診断法を含む治療方法および診断方法とに関するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９７／０５１６１号の開示内容にも注目している。

【００２８】本発明では「ミセル」と呼ばれる分子の集合体に関して得られた成果にも注目
している。ミセルは、両親媒性化合物によって水中で自発的に形成されるコロイ
ド状の集合体のうち、臨界溶質濃度すなわち臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を上回り
、溶液温度が臨界ミセル温度（ＣＭＴ）よりも高いものとして定義される。ミセ
ルを構成している分子は、未会合の分子との間で急速に動的平衡状態になる。濃
度がＣＭＣよりも高くなるとミセルのサイズが変わらないままミセルの数だけが
増えるが、場合によっては、リン脂質混合ミセルで球状のミセルが大きくなって
棒状ミセルになることもある（Ｃａｒｅｙら、Ａｒｃｈ．ＩｎｔｅｒＭｅｄ．
１３０：５０６〜５２７（１９７２）、Ｈｊｅｌｍ，Ｊｒ．ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．
Ｃｈｅｍ．９６（２１）：８６５３〜８６６１（１９９２））。ＣＭＣは温度依
存性が高く、特定の濃度では広い温度範囲でモノマーからミセルへの変化が徐々
に起こる（Ａｌｍｇｒｅｎら、ＣｏｌｌｏｉｄＰｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２７３：
２〜１５（１９９５））。温度が上昇すると集合体の数は増えるが、流体力学的
半径は一定のままである（Ｎｉｖａｇｇｉｏｌｌら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．１１（
３）：７３０〜７３７（１９９５）、Ａｌｅｘａｎｄｒｉｄｉｓら、Ｌａｎｇｍ
ｕｉｒ．１１：１４６８〜１４７６（１９９５））。一般に、温度の上昇は疎水
性相互作用の増加につながり、イオンの反発力が強くなって水の比誘電率が小さ
くなる。両親媒性化合物のＣＭＣを判定するための方法にはさまざまなものがあ
る（表面張力測定値による方法、水不溶性染料または蛍光プローブの可溶化によ
る方法、導電率測定値による方法、光の散乱による方法など）。好ましい方法に
よれば、表面張力測定値を用いてＰＥＧ−ＤＳＰＥミセルのＣＭＣを室温にて判
定することができる。

【００２９】薬学技術の多くの分野で、界面活性剤ミセルがアジュバントおよび薬物キャリ
ア系として利用されている。ミセルは生体移行性の亢進または薬物による副作用
の低減の目的で用いられてきた（Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら、Ａｄｖａｎ．Ｄｒｕ
ｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｖｉｅｗｓ１６：３１１〜３２０（１９９５））。また
、小さなサイズのミセルは血液脳関門を含む膜を通しての輸送に重要な役割を果
たしている（Ｍｕｒａｎｕｓｈｉら、ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｙｓｉ
ｃｓｏｆＬｉｐｉｄｓ２８：２６９〜２７９（１９８１）、Ｓａｌｅｔｕ
ら、Ｉｎｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：２８７〜３２３
（１９８８））。界面活性剤ミセルは水性媒体中において熱力学的に不安定であ
り、希釈時に解離される。Ｙｏｋｏｙａｍａらは、水溶液中で一層安定したポリ
マーミセルを形成することが知られているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）な
どの両親媒性ポリマーを提案した（ＭａｋｒｏｍｏｌＣｈｅｍ．Ｒａｐｉｄ
Ｃｏｍｍｕｎ．８：４３１〜４３５（１９８７））。ポリマーミセルには、小さ
なサイズであっても生理学的なバリアの貫通を制御できる、インビボで半減期が
延長される、特定の組織に対してミセルを標的化できるなど、など利点が多い。

【００３０】ＰＥと接合されたＰＥＧなどのポリマー接合脂質ミセルに関する研究調査が行
われるようになったのは、ごく最近になってからである。このような研究調査の
ひとつに、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）をＰＥと接合させて水性媒体に溶解
し、ミセルを形成するものがある。Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙらによってなされた研
究調査（Ａｃａｄ．Ｒａｄｉｏｌ．３：２３２〜２３８（１９９６））では、Ｐ
ＥＯ−ＰＥ接合脂質を用いて、核磁気共鳴撮影（ＭＲＩ）トポグラフィを用いる
経皮リンパ管造影用の造影剤としてインジウム−ＩＩＩキレートおよびガドリニ
ウムキレートを封入している。この研究調査では、ＰＥＯ−ＰＥミセルは両親媒
性の薬剤を取り込み、ＲＥＳを回避して薬剤の作用時間をインビボにて延長する
ことができ、滞留時間を延長することができるのだという結論に至った。

【００３１】両親媒性ミセルの安定性は、ファンデルワールス相互作用の強度によって左右
される。ミセル表面に存在するポリマーがマクロファージの疎水性に対する親水
層の反発作用による立体保護の一助となるため、細網内皮系（ＲＥＳ）による取
り込み量が少なくなる。さらに、ポリマーが持つ負の電荷によってインビボにて
反発的な立体作用が発生し、ＲＥＳによる取り込みを容易にするプラズマタンパ
ク質であるオプソニンの結合が妨害される（Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら、Ｐｒｏｃ
ｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍ
ａｔｅｒ．２２：４５２〜４５３（１９９５））。このように、インビボでのリ
ン脂質ミセルの立体安定化は、インビボ環境に対するポリマーの極性相互作用お
よび静電相互作用によって達成されるのである。

【００３２】立体安定化されたリン脂質ミセル（ＳＳＭ）を形成するためには、疎水部と親
水部の量が正しい最適な両親媒性化合物が必要である。ポリマーの分子量および
鎖長、サイズ、脂質濃度、ポリマー濃度などの要因が、最適なミセル組成を得る
上で極めて重要な役割を果たす場合がある。しかしながら、現在までのところ、
最適な組成および活性を得るためのパラメータを評価するリン脂質ミセルについ
ての研究調査は行われていなかった。

【００３３】一方、ブロックコポリマー、両親媒性ポリマー、ミセルに関する研究調査は、
数多く行われてきた。Ｎｉｖａｇｇｉｏｌｉらは、一定の温度および濃度で、数
種類のプルロニックコポリマー（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）のブロックコポリマ
ーミセルを試験した（Ｌａｎｇｍｕｉｒ．１１（３）：７３０〜７３７（１９９
５））。著者らは、コポリマーの分子量が増加すると流体力学的なサイズが大き
くなることを見出したため、疎水性コアのサイズも大きくなるのではないかと考
えた。このように、分子量および鎖長に応じてミセルのサイズが大きくなると、
ＲＥＳによる取り込み量も多くなると思われる。したがって、高い分子量および
鎖長で滞留時間が短くなり、よってＳＳＭの半減期も短くなる。全体として、著
者らは、ＳＳＭの安定性を得るにはＰＥＯが最も有望なコポリマーであることを
見出した。さらに、Ｃａｒｅｙと同僚らは、ポリマー濃度がＣＭＣを超えて大幅
に上昇すると、棒状ミセルが形成されて溶液の粘度が増すことを突き止めた（Ｃ
ａｒｅｙら、Ａｒｃｈ．ＩｎｔｅｒＭｅｄ．１３０：５０６〜５２７（１９７
２）、Ａｌｍｇｒｅｎら、ＣｏｌｌｏｉｄＰｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２７３：２〜
１５（１９９５））。したがって、ミセルが細長くなることでミセルの疎水性が
高まり、さらに多くの非極性の薬物を封入できる可能性がある。

【００３４】これらのブロックコポリマーすなわち両親媒性化合物から、リン脂質ミセル安
定性の組成と活性を最適化するパラメータについて研究調査するのは極めて適切
なことであり、将来的に検討していくべきものであると判断することができる。

【００３５】ＳＳＭを薬物送達系として利用することは、特に治療薬および診断薬としての
極めて新しい用途である。Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙらが指摘した（Ｐｒｏｃｅｅｄ
Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅ
ｒ．２１：４５２〜４５３（１９９５））ように、ミセル薬物が形成されること
で、考え得るほとんどすべての薬物投与経路が生体移行性の増大または副作用の
低減という点で何らかの利益を得ているのである。サイズの小さなミセル組成物
は血液脳関門を貫通することができるため、アルツハイマー病などのＣＮＳ疾患
を治療するための理想的なキャリアとなる。最近になって、ＳＳＭはＭＲＩ法お
よびＳＴＭ法を用いる診断用の薬剤として利用されてきている（Ｔｒｕｂｅｔｓ
ｋｏｙら、Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｅｓ
ｔ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２２：４５２〜４５３（１９９５）、Ｚａｒ
ｅｉｅら、ＣｏｌｌｉｄｓａｎｄＳｕｒａｃｅｓＡ：Ｐｈｙｓｉｏｃｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＡｓｐｅｃｔｓ．１１２
：１９〜２４（１９９６））。いずれの場合もＳＳＭは染料または常磁性薬剤の
いずれかを含む混和物（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）であり、これを非経口投
与および可視化していた。いずれの場合も、ＳＳＭの半減期は少なくとも２時間
であった。

【００３６】また、本発明では、血管作用性腸管ペプチド類似体を含む生理活性ペプチドを
送達するためのサブミクロンエマルジョンに関する、Ｆｒｉｅｄｍａｎらによる
米国特許第５，５１４，６７０号の開示内容にも注目している。サブミクロン粒
子は、加重平均値から求めた直径が１０〜６００ｎｍ、より好ましくは３０〜５
００ｎｍ、最も好ましくは３００ｎｍであると言われている。

【００３７】さらに、本発明では、体内の至る所に見出され、多くの機能を有する、１７ｋ
ｄの遍在タンパク質であるカルモジュリン（ＣａＭ）に注目している。カルモジ
ュリンは主に調節タンパク質として機能し、カルシウムイオンに対するセンサと
して作用する。カルシウムイオン（Ｃａ⁺²）がカルモジュリンの４カ所の結合部
位に結合するとα−ヘリックスが形成されるとともに、コンホメーションに変化
が生じてカルモジュリンは不活性型から活性型へと変わる。次に、活性化された
カルモジュリンが細胞内の多くの酵素やタンパク質と結合され、その活性を変え
ていくことになる。タンパク質の疎水性の結合部位はＣａＭの球状構造内に埋没
しているが、ＣａＭとＣａ⁺²イオンおよび／または膜リン脂質が相互作用すると
埋没した結合部位が露出する（Ｃｈｉｂａら、ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ４
７：９５３〜９６０（１９９０）、Ｄａｍｒｏｎｇｅｈａｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅＣｈｅｍ．６：２６４〜２６８（１９９５））。Ｂｏｌｉｎは、Ｖ
ＩＰがカルモジュリンに対するＣａ⁺²結合の潜在的な賦活薬であることを見出し
、ＶＩＰのＣａＭとの相互作用と特定の細胞調節活性との間に何らかの相関があ
るのではないかと考えた（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２３：１９７〜２１４
（１９９３））。

【００３８】Ｐａｕｌらはまた、内部移行したＶＩＰはカルモジュリン（ＣａＭ）を直接結
合でき、ホスホジエステラーゼ依存性ならびにカルモジュリン依存性のミオシン
軽鎖キナーゼ活性がいずれも阻害されると報告した（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎ
ｔ．２３：１９７〜２１４（１９９３））。この観察結果はＶＩＰ−ＣａＭ複合
体の機能的な役割（Ｓｔａｌｌｗｏｏｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：
１９６１７〜１９６２１（１９９２）、Ｓｈｉｒａｇａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ
．３００：９０１〜９０５（１９９４））を裏付けるものであるため、多種多様
なシグナル伝達酵素の調節に必要な多機能タンパク質であるカルモジュリンがＶ
ＩＰの細胞内受容体である可能性が考えられる（Ｐａｕｌら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅ
ｍ．Ｉｎｔ．２３：１９７〜２１４（１９９３））。したがって、ＶＩＰがＣａ
Ｍとの会合によってシグナル形質導入を調節できる可能性がある。さらに、Ｃａ
Ｍも細胞外液および脳脊髄液に存在し、細胞によって積極的に分泌されることが
明らかになっている（Ｐａｕｌら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２３：１９７
〜２１４（１９９３））ため、ＶＩＰ−ＣａＭ複合体によってプロテアーゼによ
る消化からペプチドを保護できる可能性がある。Ｃａ⁺²イオンと脂質はペプチド
−ＣａＭ相互作用に影響することが知られている。ＣａＭによるＶＩＰとＣａ⁺² との結合は、受容体に対するカルシウムイオン結合がＶＩＰのＣａＭに対する結
合を容易にしたり、あるいはその逆であったりする点で、協同的なものである。
ホスホリパーゼ治療を用いることで、無傷の膜においてＶＩＰ結合が阻害され、
ＶＩＰ結合タンパク質画分の可溶化によって結合が調節されることが明らかにな
っている（Ｐａｕｌら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５２７：２８２〜
２９５（１９８８））。このため、ＶＩＰ−ＣａＭ結合によってどのような生化
学的な結果が得られるかは、ＣａＭ結合部位の同一性とＶＩＰ−ＣａＭ結合によ
って引き起こされるコンホメーションの変化とに左右される。

【００３９】したがって、従来技術においては、生理活性分子を治療および診断目的で投与
するためにミセル技術を使用する方法をさらに改善する必要性がある。具体的に
は、従来技術においては、さらに長期間にわたって持続する有効な治療効果を達
成すべく、リン脂質に関連のあるＶＩＰ／ＧＲＦペプチドファミリーのメンバー
を含むがこれに限定されるものではない両親媒性ペプチドを投与するための改良
された方法に需要がある。

【００４０】

【発明の要約】

本発明は、ミセルと会合状態にある１種またはそれ以上の生物学的に活性な両
親媒性化合物を含む生物学的に活性なミセル生成物を調製するための改良された
方法を提供するものである。本願明細書において使用する化合物とは、ペプチド
、タンパク質、酵素全般を包含し、さらには、これらの断片、類似体、モジュレ
ーターも包含する。タンパク質について見ると、本発明はＬ体とＤ体の両方を使
用することを企図したものである。本発明の化合物がシスとトランスの両方のコ
ンホメーションで存在する場合、本発明ではいずれか一方の形態のみまたは両方
の形態の組み合わせを用いることを理解されたい。本発明のミセル製剤は、関連
するペプチドの生物学的作用の有効性および持続時間を改善する方法で、生物学
的に活性なペプチドの生理活性を送達および増強する。生物学的作用の有効性が
高まってその持続時間が長くなるのは、少なくともある程度は、化合物が活性型
のコンホメーションを達成するか、あるいは、水性環境中での化合物のコンホメ
ーションより活性の高いコンホメーションを達成してこれが維持されるような方
法で、化合物とミセルとが相互作用することによるものであると考えられている
。したがって、本発明は、細網内皮系による取り込み、不活性型のコンホメーシ
ョンでの化合物の分解または化合物の送達などであるがこれに限定されるもので
はない、従来のリポソーム製剤に関連した問題を解決するものである。本発明の
一態様によれば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をＤＳＰＥと共有結合的に
接合してポリマーミセルの形成に利用し、これをＶＩＰに受動的に含有させる。
ＰＥＧ−ＤＳＰＥは、ＰＥＧポリマーによって形成される親水性の「殻」で囲ま
れたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）脂肪酸鎖から
なる疎水性コアを有するミセルを形成する。

【００４１】本発明の一態様によれば、ミセルと会合状態にある１種またはそれ以上の生物
学的に活性な両親媒性化合物を含む生物学的に活性なミセル生成物を調製するた
めの方法が得られる。前記方法は、ａ）水溶性ポリマーと共有結合した少なくと
も１種の脂質成分を含む脂質１種またはそれ以上の配合物を混合する工程と、ｂ
）前記脂質の配合物から立体的に安定化されたミセルを形成する工程と、ｃ）水
溶液中の化合物よりも生物学的活性の高い活性型のコンホメーションで、１種ま
たはそれ以上の生物学的に活性な両親媒性化合物と工程ｂ）で得られる前記ミセ
ルとが会合するような条件下にて、工程ｂ）で得られるミセルを前記化合物と共
にインキュベートする工程と、を含む。本発明のさらに他の態様によれば、生物
学的に活性な両親媒性化合物と脂質とを共沈させてミセルを形成し、インキュベ
ーションを必要とせずに生物学的に活性なミセル生成物を生成することができる
。具体的には、ミセルと会合状態にある１種またはそれ以上の生物学的に活性な
両親媒性化合物を含む生物学的に活性なミセル生成物を調製するための方法が得
られる。前記方法は、ａ）生物学的に活性な両親媒性化合物と共に、水溶性ポリ
マーと共有結合した少なくとも１種の脂質成分を含む脂質１種またはそれ以上を
混合する工程と、ｂ）活性型のコンホメーションで前記化合物と前記ミセルとが
会合するような条件下にて、工程（ａ）で得られる混合物から立体的に安定化さ
れたミセルを形成する工程と、を含む。

【００４２】本発明の一態様として、ミセルは、水溶性ポリマーに共有結合した少なくとも
１種の脂質成分を含む脂質配合物から生成される立体的に安定化されたミセル（
ＳＳＭ）である。このポリマー結合リン脂質がミセル形成成分である。他の脂質
が実際にこのミセルに可溶化されて混合ミセルが形成されている。水溶性ポリマ
ーは、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、この水溶性ポリマ
ーによって脂質の可溶性を高めて水性媒体中で小胞ではなくミセルが形成されて
いる。また、水溶性ポリマーは、上記のようにして得られるミセルを細網内皮系
の成分に取り込ませることなく立体的に安定化させるよう作用する。

【００４３】もう１つの態様では、本発明は、１種またはそれ以上の生物学的に活性な両親
媒性化合物を含む生物学的に活性な立体的に安定化されたミセル生成物を調製す
るための方法であって、ａ）水溶性ポリマーと接合された１種またはそれ以上の
脂質と水溶液との混合物を調製する工程と、ｂ）立体的に安定化されたミセルを
形成する工程と、ｃ）前記ミセルを１種またはそれ以上の両親媒性化合物と混合
する工程と、ｄ）前記ミセルとの会合時に、水溶液中の化合物と比較して両親媒
性化合物が一層望ましい生物学的に活性なコンホメーションをとると仮定される
条件下で、前記ミセルおよび前記両親媒性化合物をインキュベートする工程と、
を含む方法を提供するものである。

【００４４】別の態様では、本発明は、１種またはそれ以上の生物学的に活性な両親媒性化
合物を含む生物学的に活性な立体的に安定化されたミセル生成物を調製するため
の方法であって、ａ）水溶性ポリマーと接合された１種またはそれ以上の脂質を
有機溶媒に溶解する工程と、ｂ）有機溶媒を除去して乾燥した脂質膜を残す工程
と、ｃ）乾燥した脂質膜を、水溶液を用いて水和させる工程と、ｄ）立体的に安
定化されたミセルを形成する工程と、ｅ）前記ミセルと１種またはそれ以上の両
親媒性化合物とを混合する工程と、ｆ）前記ミセルとの会合時に、水溶液中の化
合物と比較して両親媒性化合物が一層望ましい生物学的に活性なコンホメーショ
ンをとると仮定される条件下で、前記ミセルおよび前記両親媒性化合物をインキ
ュベートする工程と、を含む方法を提供するものである。

【００４５】もう１つの態様では、本発明は、１種またはそれ以上の生物学的に活性な化合
物と、１種またはそれ以上のターゲティング化合物と、を含む生物学的に活性な
立体的に安定化されたミセル生成物を調製するための方法であって、ａ）前記生
物学的に活性な化合物と、水溶性ポリマーと接合された１種またはそれ以上の脂
質とを有機溶媒に溶解する工程と、ｂ）有機溶媒を除去して乾燥膜を形成する工
程と、ｃ）水溶液を用いて乾燥膜を水和させる工程と、ｄ）立体的に安定化され
たミセル生成物を形成する工程と、ｅ）前記ミセル生成物と１種またはそれ以上
のターゲティング化合物とを混合する工程と、ｆ）ターゲティング化合物が前記
ミセル生成物と会合する条件下で前記ミセル生成物をインキュベートする工程と
、を含む方法を提供するものである。一態様では、ターゲティング化合物がミセ
ルの１種またはそれ以上の脂質成分に結合される。好ましくは、ターゲティング
化合物と脂質との間の結合は、ターゲティング化合物が、その同族受容体、リガ
ンドまたは結合パートナーと相互作用し、ミセルをごく近くに配置できるような
方法で共有結合的な手段で行われる。

【００４６】本発明の方法は、生物学的に活性などのような両親媒性化合物、ペプチド、タ
ンパク質またはその断片、類似体またはモジュレーターでも有用であり、本発明
の方法によって、これらの両親媒性化合物、ペプチド、タンパク質またはその断
片、類似体またはモジュレーターを、ミセルの脂質コアと会合状態または脂質コ
ア内で、活性型のコンホメーションで安定して維持することができる。好ましい
両親媒性化合物としては、各々の生物学的に活性なコンホメーションで１種また
はそれ以上のα−ヘリカルドメインまたはπ−ヘリカルドメインを有することが
特徴である化合物、特に、極性基と無極性基がヘリックスの対向する側に分かれ
た化合物があげられる。本発明で有用な特に好ましい両親媒性化合物としては、
血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）／成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）ペプチド
ファミリーのメンバー（その生物学的に活性な類似体を含む）があげられる。哺
乳動物および非哺乳動物のＶＩＰ／ＧＲＦペプチドファミリーとしては、ＶＩＰ
およびＧＲＦ、ペプチドヒスチジンイソロイシン（ＰＨＩ）、ペプチドヒスチジ
ンメチオニン（ＰＨＭ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、下垂体のアデニル
シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、セクレチン、グルカゴンのそれ
ぞれの機能性類似体があげられる。ＶＩＰと同様に、ＶＩＰ／ＧＲＦペプチドフ
ァミリーおよびその生物学的に活性な類似体の他のメンバーも、ペプチドの疎水
性ドメインと親水性ドメインが分離され、疎水性ドメインが脂質コアを結合でき
る、両親媒性ヘリックスを形成することが可能である。また、本発明は、本発明
の方法によって調製されるミセルと会合した状態で生理活性が高まるモジュレー
ターも企図している。本発明によって使用するのに特に好ましいペプチドがＶＩ
Ｐである。本発明による好ましいミセルは、平均直径が約２０ｎｍ未満であるこ
とが特徴である。本発明の一態様によれば、ミセルはさらにカルモジュリンを含
む。治療用、診断用、化粧品用の他、臓器、組織および細胞を保存するなど、高
濃度の生物学的に活性な化合物を送達したり、後述するようにミセル生成物の標
的した送達を検出すると望ましいさまざまな用途で、本発明の生物学的に活性な
ペプチド生成物を利用することができる。

【００４７】もう１つの態様では、本発明は、水溶液に不溶である１種またはそれ以上の生
物学的に活性な化合物を含む生物学的に活性な立体的に安定化された結晶生成物
を調製するための方法であって、ａ）前記生物学的に活性な化合物と、水溶性ポ
リマーと接合された１種またはそれ以上の脂質と、を有機溶媒に溶解する工程と
、ｂ）有機溶媒を除去して乾燥膜を残す工程と、ｃ）水溶液を用いて乾燥膜を水
和させる工程と、ｄ）立体的に安定化された結晶生成物を形成する工程と、を含
む方法を提供するものである。本願明細書および後述する本発明の結晶生成物に
おいて、「不溶性」とは、溶質１部あたり溶媒１０，０００部以上が要件である
、米国薬局方国民医薬品集［ＵＳＰ２３、１９９５、第１０頁］に従って定義
される。この方法の結晶生成物は、本質的には、密に集合して結晶化された不溶
性化合物のミセル封入集合体である。

【００４８】さらに他の態様では、本発明は、水溶液に不溶である１種またはそれ以上の生
物学的に活性な化合物を含む生物学的に活性な立体的に安定化された結晶生成物
を調製するための方法であって、ａ）前記生物学的に活性な化合物と、水溶性ポ
リマーと接合された１種またはそれ以上の脂質と、を有機溶媒に溶解する工程と
、ｂ）フリーズドライによって有機溶媒を除去する工程と、ｃ）水溶液を用いて
水和させる工程と、ｄ）立体的に安定化された結晶生成物を形成する工程と、を
含む方法を提供するものである。

【００４９】さらに別の態様では、本発明は、水溶液に不溶な１種またはそれ以上の生物学
的に活性な化合物と、１種またはそれ以上の両親媒性ターゲティング化合物と、
を含む生物学的に活性な立体的に安定化された結晶生成物を調製するための方法
であって、ａ）前記生物学的に活性な化合物と、水溶性ポリマーと接合された１
種またはそれ以上の脂質と、を有機溶媒に溶解する工程と、ｂ）有機溶媒を除去
して乾燥膜を残す工程と、ｃ）水溶液を用いて乾燥膜を水和させる工程と、ｄ）
立体的に安定化された結晶生成物を形成する工程と、ｅ）前記結晶生成物と１種
またはそれ以上のターゲティング化合物とを混合する工程と、ｆ）ミセルの脂質
と接合されるターゲティング化合物が前記結晶生成物と会合する条件下で、前記
結晶生成物をインキュベートする工程と、を含む方法を提供するものである。

【００５０】立体的に安定化された結晶生成物を生成するための本発明の方法では、水溶液
に不溶であればどのような化合物でも使用することができる。好ましい不溶性化
合物としては、プロゲステロン、テストステロン、エストロゲン、プレドニゾロ
ン、プレドニソン、２，３メルカプトプロパノール、アムホテリシンＢ、ベツリ
ン酸、カンプトセシン、ジアゼパム、ナイスタチン、プロポフォル、シクロスポ
リンＡ、ドキソルビシン、Ｔａｘｏｌ（登録商標）があげられるが、これに限定
されるものではない。１種またはそれ以上のターゲティング化合物をさらに含む
、立体的に安定化された結晶生成物を生成するための本発明の方法では、立体的
に安定化された結晶生成物と会合したときに生物学的に活性なコンホメーション
が想定できるまたはこのようなコンホメーションが維持される化合物であれば、
どのようなターゲティング化合物でも使用することができる。好ましい実施形態
では、上述したような両親媒性化合物のうちいずれかを使用する。最も好ましい
実施形態では、ターゲティング化合物は、ＶＩＰまたはＶＩＰ／ＧＲＹファミリ
ーまたはタンパク質の他のメンバーである。

【００５１】本発明の生物学的に活性なミセル生成物を含む組成物としては、生物学的に活
性な両親媒性ペプチド、タンパク質、その断片、類似体またはモジュレーターが
、抗酸化活性と、抗痛活性と、抗炎症活性と、創傷治癒活性と、抗菌活性と、抗
気管支痙攣活性と、代謝活性と、抗癌活性と、心臓血管活性と、抗緑内障活性と
、抗アポトーシス活性と、抗皺活性と、凍結保存活性と、抗老化活性よりなる群
から選択される活性を有する組成物があげられる。本発明の組成物は、化粧品用
、治療用および診断用の組成物を含む。診断用組成物の場合、ミセル生成物はさ
らに、蛍光標識と、放射性標識と、染料と、ガス、ならびに放射線撮像、磁気共
鳴撮像、および超音波撮像での画質を高める化合物よりなる群から選択される検
出可能な標識を含む。

【００５２】

【発明の実施の形態】本発明は、ミセルと会合状態にある生物学的に活性な両親媒性化合物を含む生
物学的に活性なミセル生成物を調製するための改良された方法を提供するもので
ある。また、本発明は、水溶液に不溶な化合物を含む立体的に安定化された結晶
生成物を調製するための方法を提供するものである。本発明の結晶生成物は、単
独でまたはターゲティング化合物との配合物で調製される。ターゲティング化合
物が、結晶生成物と会合した状態で一層望ましい生物学的コンホメーションを想
定できる両親媒性化合物であると好ましい。好ましい両親媒性化合物は、疎水性
ドメインがミセルのコア内で会合できる程度に親水性ドメインと疎水性ドメイン
とが分離されていることを特徴とする化合物である。本発明の化合物は、ミセル
のコアと会合状態またはミセルのコア内で生物学的に活性なコンホメーションを
達成するものであると好ましい。生物学的活性がさらに高いコンホメーションは
、たとえば受容体またはリガンドの認識および結合によって、所望の化合物がほ
とんどその通常の生物学的活性に作用できるコンホメーションであり、生物学的
活性の比較は、水溶液中または環境中の化合物との対比で、本発明のミセルまた
は結晶生成物と会合した化合物に対してなされる。本発明の化合物は、疎水性ド
メインと親水性ドメインとを分離する、１種またはそれ以上の異なるπ−ヘリカ
ルドメインまたはα−ヘリカルドメインを有することが特徴のものであってもよ
い。本発明の好ましい化合物は、ＶＩＰ／ＧＲＦペプチドファミリーのメンバー
である。本発明の最も好ましい化合物はＶＩＰである。生物学的に活性な化合物
はミセルのコアと会合するが、会合は不可逆的ではなく、ミセルおよび化合物の
特性に応じて、ミセルとの会合後すみやかにまたは時間をかけて化合物を放出す
ることができる。

【００５３】立体的に安定化された結晶生成物を調製するための本発明の方法では、水溶液
に不溶であればどのような化合物を結晶生成物に封入してもよい。本発明の方法
では、不溶性化合物が結晶化される程度に被会合脂質の疎水性コアで不溶性化合
物が会合する。本発明では、結晶生成物を生成するものであればどのような不溶
性化合物を使用してもよいが、好ましい化合物は、通常不溶性である抗癌抗癌剤
、抗真菌剤、鎮静剤、ステロイド性化合物である。最も好ましくは、不溶性化合
物は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）と、ベツリン酸と、ドキソルビシンと、アムホテ
リシンＢと、ジアゼパムと、ナイスタチンと、プロポフォルと、テストステロン
と、エストロゲンと、プレドニゾロンと、プレドニソンと、２，３メルカプトプ
ロパノールと、プロゲステロンと、からなる群から選択される。

【００５４】本発明によるミセルは、ミセル製造分野で通常用いられており、水溶性ポリマ
ーと共有結合した少なくとも１種の脂質成分を含む、周知の脂質物質の配合物か
ら生成できる。脂質は、スフィンゴミエリンなどの比較的硬い変種や不飽和アシ
ル鎖を有するリン脂質などの流体型を含むものであってもよい。脂質物質は、ミ
セルの滞留時間が薬物の放出速度とバランスするように当業者が選択できるもの
である。これらのミセルの効力を薬物送達で十分に活用するため上で取り組むべ
き重要な課題のひとつが、ミセルからの薬物の漏出を血漿中での分布速度よりも
かなり低いレベルまで妨害することである。しかしながら、この点はおそらくＳ
ＳＬとＳＳＭを得る上で基本的な要件である。というのは、ＳＳＬやＳＳＭの送
達を制御するのは困難であり、その送達が封入された薬剤の生物学的利用能に対
応するためである。ＳＳＭはリポソームよりも動的であり、薬物の放出という点
ではＳＳＬを上回ることがある。したがって、本発明のポリマーは、ポリビニル
アルコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン、ポリアクリ
ルアミド、ポリグリセロール、ポリアキソズリン（ｐｏｌｙａｘｏｚｌｉｎｅ）
またはポリマー頭部基との合成脂質など、タンパク質の循環半減期を延ばす上で
有用な、立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）技術の分野で通常用いられ
る周知の化合物であれば、どのような化合物を含むものであってもよい。本発明
の最も好ましいポリマーは、分子量１０００〜５０００のＰＥＧである。本発明
によるミセルを生成する上で好ましい脂質としては、ＰＥＧと共有結合したジス
テアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）単独、ある
いは、これをさらにホスファチジルコリン（ＰＣ）と併用したもの、ホスファチ
ジルグリセロール（ＰＧ）をさらにコレステロール（Ｃｈｏｌ）および／または
カルモジュリンと併用したものがあげられる。

【００５５】立体的に安定化されたミセル生成物または立体的に安定化された結晶生成物を
調製するための本発明の方法は、さまざまな技法を用いて実施可能なものである
。一態様では、有機溶媒中でミセル成分を混合し、蒸発または凍結乾燥のいずれ
かを用いて溶媒を除去する。有機溶媒を除去することで、脂質膜またはケークが
形成され、次いで水溶液を用いてこれを水和し、ミセルが形成できるようにする
。このようにして得られるミセルを本発明の両親媒性化合物と混合する。これに
よって、両親媒性化合物がミセルと会合し、一層望ましい生物学的に活性なコン
ホメーションをとると想定される。

【００５６】さらに単純な調製法では、１種またはそれ以上の脂質を水溶液中で混合すると
、脂質が自発的にミセルを形成する。得られるミセルを、ミセル生成物と会合し
て一層望ましい生物学的に活性なコンホメーションをとると想定される両親媒性
化合物と混合する。この方法でミセル生成物を調製することは、特に大規模かつ
安全な調製に馴染みやすく、上述した方法よりも必要な時間枠がかなり短くてす
む。この方法は有機溶媒を使用しないという点でそもそも安全性の高いものであ
る。

【００５７】立体的に安定化された結晶生成物を調製するための本発明の方法では、有機溶
媒中で１種またはそれ以上の脂質化合物と１種またはそれ以上の不溶性化合物と
を混合するのが好ましい。蒸発または凍結乾燥によって有機溶媒を除去し、膜ま
たはケークを得る。次に、このようにして得られた膜またはケークを、水溶液の
導入によって水和させる。結果として、不溶性化合物が脂質構造物の疎水性コア
内で会合し、可溶化または再結晶化される。本発明の一態様では、可溶化された
化合物または結晶生成物を、本発明のミセル生成物の調製で上述したように一層
望ましい生物学的に活性なコンホメーションで結晶生成物と会合するターゲティ
ング化合物と混合する。本発明の結晶生成物は、立体的に安定化されたミセル生
成物と同様に、ＲＥＳを回避できるという点が優れている。さらに重要なことと
して、本発明の結晶生成物を用いることで、好ましくは３００ｎｍ未満のサイズ
という少量で、さらに高濃度の不溶性化合物を投与することが可能になる。また
、この結晶生成物によって、固有の不溶性がゆえに通常であれば効果的に投与す
ることが困難な不溶性化合物を、かかる化合物が必要な哺乳動物に効果的に投与
することが可能な方法が得られる。

【００５８】本発明の方法によって生成されるミセルおよび結晶生成物は、改良された安定
性および生物学的活性を有することが特徴であり、治療用、診断用および／また
は化粧品用などのさまざまな用途において有用である。一実施形態によれば、本
発明は、生物学的に活性なミセル生成物を含む組成物を包含し、前記生物学的に
活性な両親媒性化合物が、抗酸化活性、抗老化能、抗皺形能または創傷治癒能を
有する。このタイプの組成物が化粧品用または治療用の性質を有する場合がある
。化粧用の好ましい組成物としては生物学的に活性なＶＩＰがあげられる。また
、本発明は、胃腸病の治療用の経口徐放製剤を提供するものであって、前記調製
方法が、生物学的に活性なミセルまたは結晶生成物を腸溶カプセルに封入する工
程をさらに含む。あるいは、ミセルまたは結晶生成物をゼラチンカプセルに封入
してもよい。この経口徐放製剤は、炎症性腸疾患と、慢性便秘と、ヒルシュスプ
ルング病と、アカラジアと、乳児肥厚性幽門狭窄と、潰瘍と、からなる群から選
択されるものをはじめとする、さまざまな胃腸病において有用である。本発明の
ミセル、特にＶＩＰ／ＧＲＦファミリーのタンパク質、ペプチドおよびその断片
、類似体、モジュレーターのメンバーを含むミセルの有用性を示す目安になるも
のとしては、他に、喘息、慢性肺閉塞症、関節炎、紅斑性狼瘡、アルツハイマー
病、緑内障、急性食物圧入（ａｃｕｔｅｆｏｏｄｉｍｐａｃｔｉｏｎ）、強
皮症、鼻炎、全身高血圧および肺高血圧、乾癬、禿髪症およびインポテンツがあ
げられる。好ましい経口製剤としては生物学的に活性なＶＩＰがあげられる。生
物学的に活性なＶＩＰを含むミセル製剤も、喘息、慢性肺閉塞症、全身高血圧お
よび肺高血圧、強皮症、嚢胞性線維症、気管支拡張症、心筋虚血、インポテンツ
および禿髪症などの症状に対する有望な治療薬である。さらに他の目安としては
、精子／卵子の運動性の低下、粘膜毛様体クリアランスの低下、カルタゲナー症
候群、炎症細胞遊走および炎症細胞活性化の亢進、ムチン分泌量の増加、塩化物
イオン分泌量の減少（嚢胞性線維症と関連することが多い）、血管収縮、臓器ま
たは組織への血管の閉塞（鎌状赤血球性クリーゼと関連することが多い）、便秘
症、インポテンツ、女性の冷感症があげられる。本発明はさらに、化粧品用とし
て使用するための方法と、ＶＩＰを含むミセル組成物で、体の臓器、組織または
細胞をインキュベートする工程を含む、前記臓器、組織または細胞型を保管およ
び輸送またはレシピエントでの受精用に保存するための方法と、を提供するもの
である。

【００５９】本発明のさらに他の態様では、会合する両親媒性化合物と共に調製されるミセ
ル生成物または両親媒性化合物のない状態で調製されるミセル生成物を用いて、
凍結保存した細胞、組織および臓器の生存度を改善することが可能である。この
態様では、細胞を単独で、あるいは、この分野で通常用いられている周知の他の
保存用化合物（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スクロース、グリセロール
またはエチレングリコールなど）の存在下で、凍結保存前に本発明のミセル生成
物と接触させる。

【００６０】本発明はさらに、生物学的に活性な両親媒性化合物を標的組織に投与するため
の方法であって、本発明の方法によるミセルまたは結晶生成物と会合状態で生物
学的に活性な両親媒性化合物を含む生物学的に活性なミセルまたは結晶生成物を
調製する工程と、治療的に有効な量のミセルまたは結晶生成物を前記標的組織に
投与する工程と、を含む方法を提供するものである。本発明のミセル生成物は、
静脈内投与、動脈内投与、鼻腔内投与（エアロゾル投与、噴霧、吸入または通気
法などによる）、気管内投与、関節内投与、経口投与、経皮投与、皮下投与、粘
膜への局所投与（口腔粘膜、下部消化管粘膜および結膜などであるがこれに限定
されるものではない）したり、あるいは標的組織に直接塗布することが可能なも
のである。両親媒性化合物の投与方法は、水溶液に不要な化合物の投与でも同様
に容易に適用可能である。

【００６１】治療方法では、特に循環系における化合物の半減期がとりわけ短い場合または
生理活性が低い場合に、化合物単独での投与と比較して有意に低い用量レベルで
生物学的に活性な化合物を投与することが可能である。たとえば、ＳＳＭと会合
したＶＩＰは、単独で投与されるＶＩＰよりも生理活性が強くかつ長時間持続す
るであろうと思われる。どの生理活性化合物をＳＳＭと会合させるかとは無関係
に、ミセル生成物を試験して、従来の手段で投与される化合物によって得られる
効果と同一の効果を得るのに必要な生物学的に有効な量を求めなければならない
。従来の手段で送達された場合の特定化合物の生物学的に有効な量がＳＳＭでの
化合物の有効量を求める際の開始点になるであろうことは、当業者であれば理解
できよう。したがって、従来と同一用量以下のＳＳＭで同程度に有効であり、上
記の作業が所望の生物学的作用を達成するのに必要な最低用量を求めるための単
なる機械的な作業であることは極めて容易に想像できるであろう。たとえばＶＩ
Ｐを投与する場合であれば、従来の投与方法を用いる場合に必要な用量が２０ｍ
ｇであるとすると、同一の効果を得るためにＳＳＭに内封したＶＩＰで必要な用
量はかなり少なくなる可能性が高い。立体的に安定化されたミセル生成物と会合
状態の両親媒性化合物を投与する場合と同様に、立体的に安定化された結晶（Ｓ
ＳＣ）生成物を用いることで、水溶液中で不溶な化合物を一層有効な用量で投与
することが可能になる。

【００６２】生物学的に活性な両親媒性化合物または不溶性化合物と、それぞれ本発明のＳ
ＳＭ生成物またはＳＳＣ生成物との会合によって、化合物単独で投与した後に認
められる効果と比べて、化合物の生物学的作用の強さが約５０％から１００％増
すものと思われる。同様に、本発明のＳＳＭまたはＳＳＣとの会合によって、生
物学的作用がさらに長時間継続するようになるものと思われる。

【００６３】本発明はさらに、生物学的に活性なミセル生成物を含む改良された診断用組成
物と、その使用方法とを提供するものである。かかる方法は、本発明の方法によ
って調製されたミセルと会合状態で生物学的に活性な両親媒性化合物を含む生物
学的に活性なミセル生成物を調製する工程と、診断的に有効な量のミセル生成物
を標的組織または臓器に投与する工程と、標的組織または臓器においてミセル生
成物の取り込みまたは相互作用を検出する工程と、を含む。本発明の一態様によ
れば、標的組織は腫瘍である。この方法の一態様では、放射性標識と、蛍光標識
と、非蛍光標識と、染料と、Ｘ線撮影、磁気共鳴、超音波撮像（ＭＲＩ）での画
質を高めるガスまたは化合物と、を含む群から選択される標識を用いて、ミセル
生成物を検出可能に標識し、この標識が標的組織で検出されるようにする。

【００６４】また、本発明は、生物学的に活性な両親媒性化合物を含み、本発明の方法によ
って生成される、生物学的に活性なミセル生成物を、炎症、慢性肺閉塞症、ムチ
ン分泌量の増加、急性食餌閉塞、鼻炎、カルタゲナー症候群、嚢胞性線維症、気
管支拡張症、高血圧、アレルギー、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症
、炎症性腸疾患、慢性便秘、ヒルシュスプルング病、アカラジア、乳児肥厚性幽
門狭窄、潰瘍の治療に使用し、細胞増殖を亢進または抑制し、アポトーシスを妨
害し、体の臓器または組織での創傷治癒を促進し、細胞、臓器、組織による拒絶
を妨害するための方法を提供するものである。

【００６５】本発明の立体的に安定化された結晶生成物は、抗癌剤を投与する上で特に有用
である。たとえば、健常な乳房細胞よりも高いレベルのＶＩＰ受容体を発現する
か、ＶＩＰに対する結合親和性の高い受容体を発現することが知られている乳癌
細胞に、Ｔａｘｏｌ（登録商標）を不溶性化合物として含み、かつ、ＶＩＰをタ
ーゲティング剤として含む本発明の結晶生成物を標的することが可能である。Ｔ
ａｘｏｌ（登録商標）は乳癌細胞を選択的に殺すことが明らかになっている。

【００６６】本発明のミセルおよび結晶生成物での化粧品としての用途には、抗老化活性、
抗皺活性、抗酸化活性を得る他、サンスクリーン剤としての用途がある。

【００６７】

【実施例】

以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例では、
次の物質を使用した。脂質：Ｌ−α−卵黄ホスファチジルコリンＶ−Ｅ型のクロ
ロホルム：メタノール（９：１）溶液（ロット番号３４Ｈ８３９５および７５Ｈ
８３６８）、Ｌ−α−卵黄ホスファチジル−Ｄ−α−グリセロールのクロロホル
ム：メタノール（９８：２）溶液（ロット番号７２Ｈ８４３１および８５Ｈ８３
９５）、コレステロール（ロット番号６０Ｈ０４７６）（いずれもミズーリ州セ
ントルイスのＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．から入手）。ジ−パルミト
イルホスファチジルコリン（ロット番号ＬＰ−０４−０１−１１２−１８７）（
スイスのＳｙｇｅｎａｌＬｔｄ．から入手）。凍結乾燥粉末形態のＰＥＧ−Ｄ
ＳＰＥ（ロット番号１８０ＰＨＧ２ＰＫ−２６）（アラバマ州アルバスターのＡ
ｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓＩｎｃ．から入手）。ペプチド：ＶＩ
Ｐ（ロット番号Ｋ０２０１２Ａ１、Ｆ０２０１８Ａ１、Ｋ０２０１８Ａ１）、Ｖ
ＩＰフラグメント１〜１２（ロット番号Ｈ０５００９Ｔ１）、ＶＩＰフラグメン
ト１０〜２８（ロット番号ＮＢ０２２２）、バソプレッシン（ロット番号ＳＤ１
０５１Ａ）（カリフォルニア州サニーベールのＡｍｅｒｉｃａｎＰｅｐｔｉｄ
ｅＣｏ．から入手）。その他のバイオ製品：ウシ脳カルモジュリン（ロット番
号Ｂ１０５３７）（カリフォルニア州ラホーヤのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＩｎｔ
ｌ．から入手）。ＥＬＩＳＡアッセイキット（ロット番号９７６６０５）（カリ
フォルニア州ベルモントのＰｅｎｉｎｓｕｌａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから
入手）。さまざまな化学薬品：トレハロース（ロット番号４３Ｈ７０６０）、２
，４−ジアミノフェノール（アミドール、ロット番号７４Ｈ３６５２）、モリブ
デン酸アンモニウム（ロット番号４２Ｈ３５０６）、亜硫酸水素ナトリウム（ロ
ット番号４１Ｈ０９４３２）、ＨＥＰＥＳ（ロット番号４３Ｈ５７２０）、塩化
ナトリウム（ロット番号２２Ｈ０７２４）（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍ
ａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．から入手）。ドデシル硫酸ナトリウム（ロット番
号１１１２０ＫＸ）（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．Ｉｎｃ．から
入手可能）。過塩素酸７０％（ロット番号９４５５６７）、クロロホルムＨＰＬ
Ｃグレード（ロット番号９０２５２１）、リン酸二水素カリウム（ロット番号９
１４７２３）（ペンシルベニア州ピッツバーグのＦｉｓｈｅｒＳｃｉ．から入
手）。

【００６８】［実施例１］本実施例では、以下の方法で立体的に安定化されたミセルにＶＩＰを取り込ん
だ。ミセルの調製に必要なＰＥＧ−ＤＳＰＥ濃度を求めるために、ＰＥＧ−ＤＳ
ＰＥ水溶液の表面張力について研究調査を行った。臨界ミセル濃度は０．５〜１
．０μｌであることが明らかになったため、１．０μＭのＰＥＧ−ＤＳＰＥを用
いて確実にミセルが形成されるようにした（図１）。ＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質（１
μｍｏｌ／ｍｌ）をクロロホルムに溶解し、丸底フラスコで混合した。ｒｏｔｏ
ｅｖａｐｏｒａｔｅｒを浴水温度４５℃で用いて用いて有機溶媒を蒸発させた（
ミズーリ州カンサスシティ、Ｌａｂｃｏｎｃｏ）。一晩の減圧乾燥によって完全
に乾燥させた。乾燥した脂質膜を生理食塩水（０．１５Ｎ、ｐＨ６．８）または
ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で水和させた。この溶液をヒトＶＩ
Ｐ（１３μｇ／ｍｌ）と共に３０分間インキュベートした後、円二色性で使用し
た。リン脂質ミセル懸濁液にヒトＶＩＰ（０．１ｎｍｏｌ／ｍｌ）を添加し、室
温にて２時間インキュベートした後、頬袋で研究調査を行った。

【００６９】［実施例２］本実施例では、ＶＩＰおよびカルモジュリンを含む立体的に安定化されたミセ
ルを実施例１の方法で調製した。実施例１の方法に従ってＳＳＭ懸濁液を調製し
、インキュベーション段階でＶＩＰ−ミセル９００μｌに１０^-9ＭのＣａＭを１
００μｌ添加（全体のＣａＭ濃度が１０^-10Ｍになるように）し、４℃にて２時
間インキュベートした後に円二色性で使用した。リン脂質ミセル９００μｌにヒ
トＶＩＰ（０．１ｎｍｏｌ／ｍｌ）と１０^-9ＭのＣａＭを１００μｌとを添加（
全体のＣａＭ濃度が１０^-10Ｍになるように）し、室温にて２時間インキュベー
トした後、頬袋で研究調査を行った。ＶＩＰ濃度を０．１ｎｍｏｌとし、立体的
に安定化されたミセル組成でＶＩＰを用いた場合の結果を比較できるようにした
。

【００７０】［実施例３］本実施例では、準弾性光散乱（ＮＩＣＯＭＰ２７０型ＳｕｂｍｉｃｒｏｎＰ
ａｒｔｉｃｌｅＳｉｚｅｒ、カリフォルニア州メンローパーク、Ｐａｃｉｆｉ
ｃＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて小胞のサイズを求めた。この装置には、
６４チャネルでの自己相関関数のある励起波長６２３．８ｎｍの５ｍＷヘリウム
ネオンレーザと、温度制御式遊走細胞ホルダと、溶液中での粒子の拡散によって
生じる散乱光強度のゆらぎを解析するためのＡＤＭ１１ビデオ表示端末コンピ
ュータ（ｌｅａｒｒＳｉｅｇｌｅｒＩｎｃ．）が含まれている。３０分間積
算した自己相関関数を解析して得た測定拡散係数を用いて、ストークス−アイン
シュタインの関係から流体力学的な平均粒径ｄ_hを得た。機器の設定値は以下の
とおりとした。温度２３℃、粘度０．９３２５ｃｐ、屈折率１．３３３、散乱角
９０°。血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）が封入された立体的に安定化された
リン脂質ミセル（ＳＳＭ）の最終平均サイズは−１７．９±０．６ｎｍであった
。

【００７１】［実施例４］本実施例では、円二色性（ＣＤ）実験を行い、リン脂質ミセルに内封したＶＩ
Ｐおよび水溶液中のＶＩＰのコンホメーションの変化、ｐＨおよび温度の変化を
求めた。経路長１ｃｍの溶融石英セルを用いて、ＪＡＳＣＯＪ−７００分光偏
光計でＣＤスペクトルを記録した。ペプチド濃度４μＭおよび脂質濃度１ｍＭで
、０．１５Ｎ生理食塩水（ｐＨ６．８）および５ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４
）中でのスペクトルを測定した。ＣａＭ、ｐＨ（６．８または７．４）、温度（
２５℃または３７℃）がＶＩＰのコンホメーションに対して及ぼす影響について
も研究調査を行った。ＶＩＰフラグメントのコンホメーションについても同様に
調べた。特に明記しない限り、測定はいずれも室温（〜２５℃）にて行った。帯
域幅を１．０ｎｍ、ステップレゾリューションを０．５ｎｍとし、近紫外域（波
長２００〜２６０ｎｍ）にて試料１つあたり平均で９枚の走査画像を得た。緩衝
液中でペプチドのスペクトルにバックグラウンドバンドが認められたため、内封
物のない小胞（ｅｍｐｔｙｖｅｓｉｃｌｅ）のバンドを差し引き、ノイズリダ
クション機能を用いてスムージングを行った。溶融石英ＣＤセルを囲むジャケッ
トに取り付けた循環水浴を用いて、スペクトル解析時の温度を維持した。Ｈａｇ
ｈｊｏｏらの方法（ＰｅｐｔｉｄｅＲｅｓｅａｒｃｈ９（６）：３２７〜３
３１（１９９６））によってＶＩＰのヘリカル特性の比率すなわちヘリシティ（
％）＝［−θ₂₀₈＋４０００）／２９０００］×１００を求め、結果を表１に
示す。

【００７２】

【表１】

【００７３】この実施例では、生理食塩水およびヘペス緩衝液中のＶＩＰとリン脂質ミセル
に内封したＶＩＰのコンホメーションを、室温および３７℃にてＣＤを用いて求
めた。予備的な研究調査で求めたようにして、１３μｇのヒトＶＩＰを１ｍｌの
ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（１μｍｏｌ）ミセルと共に室温にて３０分間インキュベート
した後、ＣＤスペクトル解析を行った。帯域幅を１．０ｎｍ、ステップレゾリュ
ーションを０．５ｎｍとし、近紫外域（２００〜２６０ｎｍ）にて試料１つあた
り平均で９枚の走査画像を得た。スペクトル解析を行っている間、溶融石英ＣＤ
セルを囲むジャケットに取り付けた循環水浴を用いて温度を維持した。円二色性
によってＳＳＭに内封したＶＩＰ分子のコンホメーションを評価したところ、Ｓ
ＳＭはサイズが小さく均一な小胞構造をとっているため球状粒子によって生じる
歪みがなく、正しく評価することができた。また、ミセルの動的な性質によって
ＶＩＰとリン脂質との相互作用も大きくなった。ＶＩＰのコンホメーションにつ
いての本願発明者らの研究調査では、ＳＳＬのリン脂質二重膜と類似の疎水性コ
アが得られるという点でリン脂質ミセルが理想的であった。さらに、負の電荷と
ＰＥＧによって得られる親水性の層のいずれも本願発明者らのＳＳＬの状態に近
く、ＶＩＰコンホメーションがどのようなものであるか推測することができた。

【００７４】ＶＩＰは純水中でランダムコイル構造をとることがスペクトル特性から明らか
になったが、有機溶媒中でのＶＩＰはα−ヘリックス状であった（Ｆｏｕｒｎｉ
ｅｒら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ５：１６０〜１７７（１９８４）、Ｆｒｙら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：２３９９〜２４０９（１９８９）、Ｔｈｅｒｉａ
ｕｌｔら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ３１：４５９〜４６４（１９９１））。さ
らに、両親媒性ヘリックスを形成できる短鎖ペプチドが脂質二重膜と結合された
りこれを貫通したりすることが分かっている（Ｎｏｄａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１９１：３２４〜３３０（１９９４））。これらの
情報に基づいて、ＶＩＰはミセルと会合するとヘリカル構造をとるのではないか
と思われる。

【００７５】ヒトＶＩＰの生理食塩水（ｐＨ６．８）中でのＣＤスペクトルならびにリン脂
質ミセルの存在下でのＣＤスペクトルを図２に示す。これらの研究調査から、ペ
プチドのコンホメーションは環境に極めて影響されやすいものであることが明ら
かになった。ＶＩＰは生理食塩水中では２０３ｎｍで極小であり、主にランダム
コイル構造であることが明らかになった。リン脂質ミセルの存在下では、主にα
−ヘリックスコンホメーションで構成され、２０８ｎｍと２２２ｎｍの２回極小
が認められた（表１）。

【００７６】ヒトＶＩＰのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）中でのＣＤスペクトルならびにリン
脂質ミセルの存在下でのＣＤスペクトルを図２に示す。（生理食塩水中およびヘ
ペス緩衝液中（点線）でのＶＩＰのＣＤスペクトル解析結果をリン脂質の存在下
（実線）でのＶＩＰの場合と対比してある。いずれも試料１つあたり９枚の走査
画像から得た平均スペクトルである。）これらの研究調査から、ペプチドはヘペ
ス緩衝液中では２０３ｎｍで極小であり、主にランダムコイル構造であることが
明らかになった。リン脂質ミセルの存在下では、主にα−ヘリックスコンホメー
ションで構成され、２０８ｎｍと２２２ｎｍの二回極小が認められた（表１）。
これらの結果は生理食塩水（ｐＨ６．８）中でのＶＩＰの場合と同様である。

【００７７】血管作用性腸管ペプチドの生理食塩水中でのＣＤスペクトルとＳＳＭの存在下
でのＣＤスペクトルとについて研究調査を行ったところ、ＶＩＰは生理食塩水で
はほとんどランダムコイル状のコンホメーションをとるが、ＳＳＭの存在下では
α−ヘリックスコンホメーションが優勢であることが明らかになった。このこと
から、ＰＥＧによる立体障害の可能性とは無関係にＶＩＰがある程度は疎水性コ
アに侵入し、一層安定したα−ヘリックスコンホメーションへと変化することが
分かる。多くの両親媒性分子とは異なり、ｐＨを変えてもＶＩＰコンホメーショ
ンには有意な変化は認められなかったことから、ＶＩＰは研究調査を行った範囲
でのイオン環境には影響されないものと思われる。

【００７８】３７℃におけるヒトＶＩＰの生理食塩水中でのＣＤスペクトルならびにリン脂
質ミセルの存在下でのＣＤスペクトルを図３に示す。（生理食塩水中でのＶＩＰ
の室温（破線、灰色）でのＣＤスペクトル解析結果と３７℃（実線、灰色）での
結果を、リン脂質の存在下でＶＩＰの室温（点線、黒）および３７℃（実線、黒
）での結果と対比してある。いずれも試料１つあたり９枚の走査画像から得た平
均スペクトルである。）これらの研究調査から、スペクトルの形状には何ら変化
のない状態で、室温の場合よりも３７℃の場合の方がペプチドのミセルでの吸収
強度が増大することが明らかになった。吸収強度が増大することから、α−ヘリ
ックスコンホメーションが増幅されていることが分かる。これは、ＶＩＰのヘリ
カル含有量（％）が３倍になっていることからも明らかである（表１）。

【００７９】ＳＳＭに内封したＶＩＰのコンホメーションに対する温度上昇による影響は、
ほとんどが臨界ミセル温度（ＣＭＴ）の影響によるものである。ここで、ＣＭＴ
は、ミセルが形成される温度である。このような温度の上昇に伴って、ミセルの
数も増加していくことが明らかになっている（Ｎｉｖａｇｇｉｏｌｉら、Ｌａｎ
ｇｍｕｉｒ．１１（３）：７３０〜７３７（１９９５））。ミセルの数が増加す
ると、ミセル懸濁液の疎水性が高まる。したがって、一層多くのＶＩＰ分子がミ
セルまたはミセルコアと相互作用することになり、ＶＩＰ分子のα−ヘリックス
構造の増幅が認められる。

【００８０】［実施例５］本実施例では、実施例４の方法を繰り返し、生理食塩水でのＶＩＰのコンホメ
ーションと、リン脂質ミセルにカルモジュリン（ＣａＭ）を加えた中でのコンホ
メーションを求めた。１３μｇ／ｍｌのＶＩＰをリン脂質ミセル１．０μｍｏｌ
／ｍｌと共に３０分間インキュベートした後、１０^-10ＭのＣａＭをリン脂質ミ
セルに内封してＶＩＰと共に４℃で２時間インキュベート（ｃｏｎｊｕｇａｔｉ
ｏｎｐａｐｅｒ）し、その後ＣＤスペクトルを測定した。帯域幅を１．０ｎｍ
、ステップレゾリューションを０．５ｎｍとし、近紫外域（２００〜２６０ｎｍ
）にて試料１つあたり平均で９枚の走査画像を得た。

【００８１】ヒトＶＩＰの生理食塩水中でのＣＤスペクトルと、リン脂質の存在下でミセル
にＣａＭを加えた中でのＣＤスペクトルを、図４に示す。（ＣＤスペクトル解析
結果については、生理食塩水中でＶＩＰ＋ＣａＭ（点線、黒）、生理食塩水でＣ
ａＭ（点線、灰色）をリン脂質の存在下でのＶＩＰ（実線、灰色）およびＶＩＰ
＋ＣａＭ（実線、黒）と対比してある。いずれも試料１つあたり９枚の走査画像
から得た平均スペクトルである。）これらの研究調査から、スペクトルの形状に
は何ら変化のない状態で、リン脂質ミセルに内封されたＶＩＰの吸収強度がＣａ
Ｍによって高まることが明らかになった。このような吸収の増大が認められるこ
とから、α−ヘリックスコンホメーションが増幅されていることが分かる。これ
は、ＶＩＰのヘリカル含有量（％）が２倍になっていることからも明らかである
（表１）。ＣａＭ単独では生理食塩水中のＶＩＰのコンホメーションには何ら影
響しなかった（図４）。

【００８２】リン脂質の存在下でＶＩＰのα−ヘリックス構造が増幅するのはＣａＭが原因
であるように見える。ＣａＭはリン脂質と相互作用することが知られており（Ｃ
ｈｉｂａら、ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ４７：９５３〜９６０（１９９０）
、Ｈｏｕｂｒｅら、ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（１１）：７１２１７１３
１（１９９１）、Ｓｔａｌｌｗｏｏｄら、ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１
９６１７〜１９６２１（１９９２）、Ｂｏｌｉｎ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ
．２３：１９７〜２１４（１９９３）、Ｐａｕｌら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎ
ｔ．２３：１９７〜２１４（１９９３））、この相互作用によってＣａＭの疎水
性領域が露出し、ＶＩＰのα−ヘリックス構造が増える可能性が最も高い。さら
に、ＣａＭを添加することでＣＭＣが低下してミセル数の増加につながり、これ
がさらに溶液の疎水性を高めてα−ヘリックス構造の増幅を引き起こしている可
能性がある。

【００８３】［実施例６］本実施例では、実施例４の方法を繰り返してＶＩＰフラグメントの生理食塩水
中とリン脂質ミセルに内封された場合のコンホメーションを求めた。ＶＩＰと等
しいモル濃度（すなわちＶＩＰ₁₀〜₂₈フラグメントで９μｇ／ｍｌ、ＶＩＰ₁〜₁ ₂ フラグメントで６μｇ／ｍｌ）にて３０分間ＶＩＰフラグメントをリン脂質ミ
セルと共にインキュベートした後、ＣＤスペクトルを測定した。帯域幅を１．０
ｎｍ、ステップレゾリューションを０．５ｎｍとし、近紫外域（２００〜２６０
ｎｍ）にて試料１つあたり平均で９枚の走査画像を得た。具体的には、リン脂質
ミセルの存在下でのヒトＶＩＰフラグメント（１〜１２）および（１０〜２８）
のＣＤスペクトルを図５に示す。（ＣＤスペクトル解析については、生理食塩水
中でのＶＩＰ（破線、灰色）、ＶＩＰ₁〜₁₂（二点鎖線、灰色）およびＶＩＰ₁₀
〜₂₈（破線、灰色）を、リン脂質の存在下でのＶＩＰ（実線、黒）、ＶＩＰ₁〜₁ ₂ （一点鎖線、灰色）およびＶＩＰ₁₀〜₂₈（実線、灰色）と対比してある。いず
れも試料１つあたり９枚の走査画像から得た平均スペクトルである。）ＶＩＰ₁
〜₁₂フラグメントのスペクトルは生理食塩水でＳＳＭの存在下では２０３ｎｍで
極小であり、主にランダムコイル構造であることが分かる。一方、ＳＳＭの存在
下でのＶＩＰ₁₀〜₂₈のスペクトルには２０８ｎｍと２２５ｎｍの２回極小が認め
られることから、α−ヘリックス構造が優勢であると思われる。ＶＩＰ₁₀〜₂₈の
生理食塩水でのスペクトルは２０３ｎｍで極小であり、主にランダムコイル状の
コンホメーションであることが分かる。これらの作用は、生理食塩水中およびリ
ン脂質の存在下で求めたＶＩＰフラグメントのヘリシティ（％）と十分に相関が
ある（表１）。

【００８４】ＶＩＰフラグメントのＣＤスペクトルから、ペプチドのα−ヘリックス領域が
ＶＩＰの１０〜２８アミノ酸配列にあることが明らかに分かる。本願発明者ら以
外にも、有機溶媒中でＶＩＰのＣＤスペクトルを用いてこの現象を観察した人が
いる。ＶＩＰ₁₀〜₂₈でα−ヘリックスが形成されることから、このペプチドのイ
ンビボにおけるアンタゴニストとしての生理活性を説明しやすくなる。かつて本
願発明者らの実験室で観察したハムスターの頬袋での微小循環において、ＶＩＰ ₁₀ 〜₂₈フラグメントから本来のＶＩＰ応答が完全に失われ、ＳＳＬ応答における
ＶＩＰの作用が弱くなったことがあった（Ｓｅｊｏｕｒｎｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｒ
ｅｓ．１４（３）：３６２〜３６５（１９９７））。この機序はＶＩＰ₁₀〜₂₈の
α−ヘリックス構造によって説明可能なものであり、これによってフラグメント
をＶＩＰ−受容体部位と結合させて受容体のＶＩＰとの相互作用を阻害できる。
ＶＩＰ₁₀〜₂₈は、平滑筋上で１種類のＶＩＰと結合することが報告されている（
Ｒｏｒｓｔａｄら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７：９７１〜９７７（１９
９０））。

【００８５】［実施例７］実施例４の方法を繰り返し、室温および３７℃にてバソプレッシン（ＶＰ）の
生理食塩水中とリン脂質ミセルに内封した場合のコンホメーションを求めた。Ｖ
ＩＰに等しいモル濃度（すなわちリン脂質１．０μｍｏｌ／ｍｌ中に４μｇ／ｍ
ｌのＶＰ）で３０分間ＶＰをリン脂質ミセルと共にインキュベートした後、ＣＤ
スペクトルを測定した。帯域幅を１．０ｎｍ、ステップレゾリューションを０．
５ｎｍとし、近紫外域（２００〜２６０ｎｍ）にて試料１つあたり平均で９枚の
走査画像を得た。溶融石英ＣＤセルを囲むジャケットに取り付けた循環水浴を用
いて、スペクトル解析時の温度を維持した。

【００８６】ＳＳＬとして投与した後に長い滞留時間と活性についてバソプレッシン（ＶＰ
）が試験されてきている。したがって、この研究調査では、ＶＰもリポソームの
二重層との会合によって作用するのか否かを判断することを意図していた。ＶＰ
をＳＳＭと共にインキュベートし、ＣＤスペクトルの旋光解析を行った。図６（
ＶＰ（点線、灰色）およびＶＩＰ（点線、黒）の生理食塩水中でのＣＤスペクト
ル解析結果をＶＰ（実線、灰色）およびＶＩＰ（実線、黒）のミセル存在下での
結果と対比してある。いずれも試料１つあたり９枚の走査画像から得た平均スペ
クトルである。）は、バソプレッシンの生理食塩水中およびＳＳＭの存在下での
ＣＤスペクトルをＶＩＰスペクトルと対比して示す図である。このスペクトルか
ら、生理食塩水中およびＳＳＭの存在下でのＶＰは２０４ｎｍに極小のある同様
のスペクトルを有し、いずれの場合も主にランダムコイル状のコンホメーション
をとっていることが分かる。

【００８７】予想通り、リン脂質ミセルの存在（脂質環境よりも水性媒体に対する親和性が
高いことおよび／または非可撓性でミセルコアへの嵌入または貫通ができないこ
とが最も可能性のある要因）がゆえにバソプレッシンのコンホメーションには何
ら有意な変化は認められなかった。

【００８８】したがって、コンホメーションについての研究調査から、ミセルコアまたは脂
質二重膜を貫通するために、ペプチド分子はコンホメーションが変化するよう可
撓性で、かつ、疎水性環境に対する親和性を有するものでなければならないこと
が分かる。さらに、ペプチド−リン脂質間の相互作用が起こりやすくなるのは、
ＰＥＧ−ＤＳＰＥの負の電荷によって静電引力が発生することが原因である可能
性が最も高い。したがって、ＣＤスペクトル解析から、まず静電引力、次いで安
定したα−ヘリックスコンホメーションによって、ＶＩＰが疎水性のミセルコア
またはリポソーム二重層に侵入し、これによってインビボ活性が得られるアクテ
ィブ型のコンホメーションをとるＶＩＰとなる可能性が最も高いことが分かる。

【００８９】［実施例８］本実施例では、ＳＳＭに内封したＶＩＰの血管弛緩作用を次のような方法で求
めた。具体的には、オスのゴールデンシリアンハムスターの成体をＳａｓｃｏ（
ネブラスカ州オマハ）から購入した。正常血圧を制御したオスの本態性高血圧自
然発症成体ハムスターをＣａｎａｄｉａｎＨｙｂｒｉｄＦａｒｍｓ（カナダ
、ノバスコシア州ＨａｌｌｓＨａｒｂｏｕｒ）から購入した。

【００９０】ハムスターを遺伝性心筋症のゴールデンシリアンハムスターおよび健常なゴー
ルデンシリアンハムスターと交配した後、高血圧症の動物を同定した。本願発明
者らの研究室では、かつてこれらのアルビノ動物を使用したことがある（Ｒｕｂ
ｉｎｓｔｅｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．
１８３：１１１７〜１１２３（１９９２）、Ａｒｔｗｏｈｌら、ＦＡＳＥＢＪ
．１０：Ａ６２９（１９９６））。ペントバルビタールナトリウム（体重１００
ｇあたり６ｍｇ、ｉ．ｐ．）で動物を麻酔した。気管を切開し、自発呼吸を容易
にした。大腿静脈にカニューレを挿入し、実験の間追加の麻酔薬を注入した（体
重１００ｇあたり２〜４ｍｇ／時）。体温を一定（３７〜３８℃）に維持し、実
験が終わるまで加熱用パッドとフィードバックコントローラとを介してモニタリ
ングした。

【００９１】ＶＩＰをｉｎｓｉｔｕにて拡散させることによって得られる、ＳＳＭに内封
した場合の生理活性を、ハムスターの頬袋での微小循環を可視化することによっ
て求めた。本願発明者らの研究室で過去に開発した方法によって、頬袋での微小
循環を局所的に可視化した（Ｓｕｚｕｋｉら、ＬｉｆｅＳｃｉ．５７：１４５
１〜１４５７（１９９５）、Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７
１：Ｒ３９３〜Ｒ３９７（１９９６）、Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．２７１：Ｈ２８２〜Ｈ２８７（１９９６））。簡単に説明すると、左側の
頬袋を小さなプラスチック製のベースプレートに拡げ、外側の皮膚を切開して頬
袋の膜を露出させた。無血管性結合組織層を除去し、ベースプレートにプラスチ
ック製のチャンバをかぶせ、皮膚を上側のチャンバの周囲に縫合して適所に固定
した。これによって、ベースプレートと、露出した頬袋の膜と、上側のチャンバ
との三層で構成される複合体が得られる。上述したような最初の作業の後、加熱
した顕微鏡のステージにハムスターを移した。温めた重炭酸緩衝液（３７〜３８
℃）が入った容器にチャンバを連結し、頬袋を連続的に灌流（ｓｕｆｆｕｓｉｏ
ｎ）できるようにした。９５％Ｎ₂−５％ＣＯ₂（ｐＨ７．４）を用いて緩衝液に
連続して気泡を導入した。また、三方操作弁を介して、灌流緩衝液（ｓｕｆｆｕ
ｓｉｏｎｂｕｆｆｅｒ）への薬物の定量投与を可能にするインフュージョンポ
ンプ（マサチューセッツ州ケンブリッジ、ＳａｇｅＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）
にもチャンバを連結した。

【００９２】１００Ｗの水銀光源を用いて頬袋の微小循環を落射照明し、倍率を×４０とし
た顕微鏡（日本の東京の株式会社ニコン）で観察した。低光量対応のＴＶカメラ
と、モニタと、ビデオテープレコーダ（日本の横浜のパナソニック）で構成され
る閉回路テレビシステムに、顕微鏡を介して画像を投影した。ビデオマイクロメ
ータ（ＶＩＡ１００、アリゾナ州トゥーソン、ＢｏｅｃｋｅｌｅｒＩｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、顕微鏡画像のビデオ映像から、頬袋での血管抵抗を
調節する第二次細動脈の内壁直径（４４〜６２ｍｍ）（Ｒａｕｄ、ＡｃｔａＰ
ｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．（Ｓｕｐｐｌ．）５７８：１〜５８（１９８９）、
Ｓｕｚｕｋｉら、ＬｉｆｅＳｃｉ．５７：１４５１〜１４５７（１９９５）、
Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｒ３９３〜Ｒ３９７（１
９９６））を測定した。顕微鏡のステージでのマイクロメータを用いてビデオシ
ステムの倍率を較正し、マイクロメータで微小循環系のディメンションが得られ
るようにした。ビデオモニタ画面の明瞭度と頬袋の細動脈分枝パターン内での位
置をパラメータとして用いて、観察用として選択した血管を判定した。いくつか
の実験では、過去の実験時に得られた細動脈径測定値を基線に戻した後、２以上
の処理群で動物を使用した（実験プロトコルを参照のこと）。

【００９３】立体的に安定化されたリン脂質ミセル（ＳＳＭ）でＶＩＰを０．１ｎｍｏｌお
よび１．０ｎｍｏｌの量で７分ずつ灌流すると、ハムスター頬袋の微小循環にお
ける細動脈で、温度依存性かつ長時間にわたる有意な血管拡張が誘発された。細
動脈径は基線値（図７；平均±ＳＥＭ、各群ｎ＝３、ｐ＜０．０５）からそれぞ
れ２０．２±２．４％および２４．５±１％増加した。灌流開始から２分以内に
有意な血管拡張が認められ、４分以内に血管拡張が最大になった。細動脈径は、
ＶＩＰ−ＳＳＭの灌流を停止した後７分（０．１ｎｍｏｌ）および１１分（１．
０ｎｍｏｌ）で基線値に戻った。内封物のないＳＳＭと未変性のＶＩＰのみ、細
動脈径に対する有意な影響が認められなかった（図７：０．１ｎｍｏｌ（三角形
）および１．０ｎｍｏｌ（四角形）のＶＩＰ−ＳＳＭならびに内封物のないＳＳ
Ｍ（丸形）を灌流している間（７分間）と灌流後の細動脈径の変化を示す。白い
横棒は灌流継続時間。値はいずれも平均±ＳＥＭ、各群、ｎ＝４、＊ｐ＜０．０
５、基線と比較）。

【００９４】血管弛緩についての研究調査の結果から、ｉｎｓｉｔｕにてＳＳＭに内封し
てＶＩＰをハムスターの頬袋に灌流することが、温度依存性かつ長時間にわたる
有意な血管拡張と関連していることが明らかになった。ミセルは動的で灌流時に
崩壊するであろうと思われるため、このようにＳＳＭに内封するとＶＩＰの活性
が長時間持続するというのは驚くべきことである。したがって、活性の持続時間
が延長されることから、おそらくＶＩＰが存在することで、疎水性の相互作用に
よってＶＩＰ−リン脂質複合体を形成することができ、これによってミセルが長
時間にわたって無傷のまま維持され、ミセルが安定しているのであろうというこ
とが分かる。キャリアの滞留時間を延ばすことに成功し、ペプチドを安定してロ
ーディングすることで生成物の徐放が可能になったことで、ＶＩＰ−ＳＳＭの活
性が長時間持続するようになった可能性がある。さらに、ＳＳＬよりもＳＳＭの
方がサイズが小さいため、滞留時間がさらに延長され、作用の持続時間がさらに
延長された可能性もある。また、ＳＳＭのサイズは小さいため、リポソームが侵
入できない領域にも移行でき、これによってその生物分布が大きくなっている。

【００９５】血管収縮薬ペプチドであるアンギオテンシンＩＩおよびガラニンを用いて実施
した実験では、ペプチドを実施例１１で後述するようにして調製した「ＳＩ」ミ
セルと会合させた場合に、生物学的活性に同じタイプの増加が検出された。ミセ
ル製剤中０．０６ｎｍｏｌの用量でアンジオテンシンＩＩを用いると、生理食塩
水の緩衝液のみでのアンジオテンシンＩＩと比べて血管収縮が２倍から４倍にな
った。ＳＩ（実施例１１）ミセル製剤中ガラニンを０．１ｎｍｏｌの用量で用い
ると、緩衝液中のガラニンの場合と比べて血管収縮は約２倍であった。さらに高
い用量（１．０ｎｍｏｌ）で、ミセルに内封したガラニンによる効果は緩衝液中
のガラニンよりも依然として有意に高かった（約３３％）。

【００９６】［実施例９］本実施例では、ＳＳＭに内封したＶＩＰの血管弛緩作用に対するカルモジュリ
ン（ＣａＭ）の役割を実施例７の方法に従って求めた。具体的には、ＳＳＭに内
封したＶＩＰ＋ＣａＭ０．１ｎｍｏｌを７分間灌流すると、ハムスター頬袋の
微小循環で細動脈に対するＶＩＰ−ＳＳＭ誘導血管拡張の効能が有意に延長され
た。細動脈径は基線値から４０±１％増加した（図８；平均±ＳＥＭ、各群、ｎ
＝４、ｐ＜０．０５）。灌流開始から２分以内に有意な血管拡張が認められ、５
分以内に血管拡張が最大になった。細動脈径は、ＶＩＰ＋ＣａＭ−ＳＳＭの灌流
を停止した後８分で基線値に戻った。内封物のないＣａＭ−ＳＳＭと未変性のＶ
ＩＰのみ、細動脈径に対する有意な影響が認められなかった（図８：ＶＩＰ−Ｓ
ＳＭを０．１ｎｍｏｌ（三角形）、ＶＩＰ＋ＣａＭ−ＳＳＭを０．１ｎｍｏｌ（
四角形）、ＣａＭ−ＳＳＬ（丸形）を灌流している間（７分間）と灌流後の細動
脈径の変化を示す。ＣａＭ濃度は１０^-10Ｍとした。白い横棒は灌流継続時間。
値はいずれも平均±ＳＥＭ、各群、ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５、基線と比較）。

【００９７】これらの研究調査の結果から、ＳＳＭに内封してＶＩＰ＋ＣａＭを灌流すると
、ＳＳＭに内封したＶＩＰによって頬袋循環で温度依存性かつ長時間にわたる有
意な血管拡張が助長されることが明らかになった。このような助長効果は、ある
程度はリン脂質との間でのカルモジュリンの相互作用によってその疎水性−タン
パク質結合領域が露出することに起因している可能性がある。また、この疎水性
領域は、ＳＳＭの疎水性環境の増加によってＶＩＰのα−ヘリックスコンホメー
ションを促進する。α−ヘリックス構造のＶＩＰの増幅によって、受容体反応性
複合体の誘導が亢進され、膜と膜結合タンパク質との間の直接的な接触が促進さ
れてＶＩＰの第２メッセンジャー作用が高まる可能性がある。さらに、ＣａＭを
添加することでＣＭＣが低下してミセル数の増加につながり、これがさらに溶液
の疎水性を高めてα−ヘリックス構造の増幅を引き起こしている可能性がある。
このように利用できる活性ＶＩＰ量が増加することが、ＳＳＭに内封したＶＩＰ
の血管拡張がＣａＭによって助長される機序である可能性がある。

【００９８】［実施例１０］本実施例では、上記の実施例におけるＳＳＭが平均動脈圧に対して及ぼす降圧
作用を求める。

【００９９】平均動脈圧を求めるために、ハムスターの左大腿動脈にカテーテルを挿入し、
圧力トランスデューサおよびストリップチャートレコーダ（オハイオ州バレービ
ュー、ＧｏｕｌｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．、モデル
２６０）を使用して全身動脈圧および心拍数を記録する。動物の麻酔維持のため
平均動脈圧のモニタリングを６時間に制限した。カニューレを挿入した大腿静脈
を用いて生成物を静脈注射した。高血圧症ハムスターに、ＳＳＭに内封したＶＩ
Ｐ（０．１ｎｍｏｌ）を０．５ｍｌ／分の速度で１分間静脈（ｉ．ｖ．）注射す
る。ＶＩＰのみ（０．１ｎｍｏｌ）と内封物のないＳＳＭ（ＶＩＰが内封されて
いる場合は濃度０．１ｎｍｏｌに等しいすなわち、〜１８ｎｍｏｌリン脂質）も
高血圧症のハムスターに注射した。平均動脈圧（ＭＡＰ）を５分ごとに６時間の
あいだ算出した。麻酔薬の注射に関連した変動については考慮しなかった。

【０１００】本実施例の一態様では、正常血圧のハムスターで静脈内に投与した場合のＶＩ
Ｐ−ＳＳＭの作用について研究調査を実施する。ＶＩＰＳＳＬ（０．１ｎｍｏ
ｌ）、内封物のないＳＳＬ、ＶＩＰのみ（０．１ｎｍｏｌ）を高血圧症ハムスタ
ーの場合と同一速度で正常血圧のハムスターに注射する。ハムスターの下に敷い
た温水パッドを用いてハムスターの体温を維持する。本態性高血圧自然発症ハム
スターにＶＩＰ−ＳＳＭを静脈内投与すると、有意な降圧作用が長時間にわたっ
て得られるものと思われる。

【０１０１】［実施例１１］本実施例では、両親媒性化合物を含むミセルを生成するための別の方法を設計
した。この別の調製方法は、実施例１で説明した方法と比べて、本発明のミセル
の安全かつ大規模な製造に一層容易に適用可能なものである。この方法を、ほと
んどが阻害性で過分極型の生物学的活性を有する３０アミノ酸長の神経ペプチド
であるヒトガラニンを用いて、以下のようにして実証する。

【０１０２】ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（１６．５ｍｇ、分子量２７４８．０１）を２０ｍｌのガラ
ス製バイアルに入れ、生理食塩水の緩衝液６ｍｌを添加して最終ＤＳＰＥ−ＰＥ
Ｇ濃度１．０μｍｏｌ／ｍｌを得た。この混合物を、溶液が透明になるまで１分
間ボルテックスした後、バイアルをアルゴンでパージしてパラフィンで密封した
。この混合物を室温にて１時間放置するか混合物から気泡が抜けるまで放置した
。このようにして得られるミセル溶液を「ＳＩ」とした。ヒトガラニン（分子量
３１５８．１）１２μｇをポリプロピレンチューブに入れ、ＳＩミセル製剤５ｍ
ｌをチューブに加えて最終ガラニン濃度１ｎｍｏｌ／１．４ｍｌを得た。この混
合物を１０秒間ボルテックスし、室温にて２時間インキュベートした。このよう
にして得られるガラニン含有ミセルのサイズを実施例３で説明したようにしてＱ
ＥＬＳで測定したところ、１７〜２０ｎｍであった。

【０１０３】［実施例１２］本実施例では、通常であれば水不溶性である化合物の可溶性を高める上で最適
な系を判定すべく、２種類の組成物からなるミセルを調製し、特徴付けした。第
１の系では、ミセルはＤＳＰＥ−ＰＥＧおよびＰＣからなるものであった。ＤＳ
ＰＥ−ＰＥＧを水性媒体中でホスファチジルコリン（ＰＣ）と混合すると、リポ
ソーム二重層ではなく混合ミセルが形成される。第２の系では、ＰＣを代表的な
胆汁酸塩であるタウロコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を併用してミセルを形
成した。胆汁酸塩などの小分子量の界面活性剤をＤＳＰＥ−ＰＥＧと混合すると
、球状の混合ミセルが形成されるのを検出することが可能である。この研究調査
の目的は、（ｉ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）が混合ミセルを形成する能力に
対してＤＳＰＥ−ＰＥＧおよび胆汁酸塩が及ぼす作用を比較すること、（ｉｉ）
希釈時のミセルから小胞への遷移をはじめとして、得られる混合ミセルの特性に
ついて検討しこれを比較すること、（ｉｉｉ）２種類のミセル系の可溶化性を比
較することである。

【０１０４】両方の組成物について、共沈によって水性洗剤−リン脂質混合ミセルストック
溶液を調製した［ＡｌｋａｎＯｎｙｕｋｓｅｌら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１
：２０６〜２１２（１９９４）］。簡単に説明すると、卵Ｌ−α−ホスファチジ
ルコリンＸＩＩＩ−Ｅ型（Ｓｉｇｍａ）を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（Ａｖ
ａｎｔｉ）またはタウロコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｎｉａ）のいずれか一方と
、ＰＣ／洗剤モル比をそれぞれ０．７および０．８として混合した。準電光（ｑ
ｕａｓｉ−ｅｌｅｃｔｒｉｃｌｉｇｈｔ）散乱（実施例３を参照のこと）およ
び小角中性子散乱（ＳＡＮＳ）を用いて、ミセルの流体力学的平均直径を測定し
た［Ｈｊｅｌｍら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９６：８６５３〜８６６１（１９
９２）］。ミセルから小胞への遷移を評価するにあたり、２種類のストック溶液
を一工程ですみやかに希釈し、室温にて対イオンの存在下または非存在下で、水
溶液での希釈時の集合体サイズの変化に基づき、ミセルから小胞への遷移曲線を
求めた。

【０１０５】ＤＳＰＥ−ＰＣミセルの平均サイズは一貫して胆汁酸塩含有ミセルの場合（３
〜５ｎｍ）よりも大きかった（１７〜２２ｎｍ）。胆汁酸塩混合ミセルの希釈液
では、ミセルから小胞への検出可能な遷移が認められたが、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／
ＰＣ混合ミセルでは同様の条件下でも遷移は何ら観察されなかった。胆汁酸塩を
使用する場合、あらかじめ生成しておいたＰＣリポソーム分散液に添加すると、
すでに存在していたリポソームから混合ミセルが形成されたが、ＤＳＰＥ−ＰＥ
ＧをＰＣリポソームに添加しても小胞からミセルへの遷移は認められなかった。
これらの結果から、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ分子の親水性ＰＥＧ成分がミセル／ミセル
または二重層／ミセル相互作用を妨害しているのではないかと思われる。ＤＳＰ
Ｅ−ＰＥＧはリポソームを可溶化しなかったため、プラズマ膜も可溶化されない
であろうと予測できる。この結果から、胆汁酸塩よりもＤＳＰＥ−ＰＥＧの方が
プラズマ膜毒性が低い可能性が示された。

【０１０６】取り込まれなかった薬物を分離した後、モデル薬としての両方のミセル組成物
の可溶化性をＨＰＬＣで測定した。この一連の実験を行う目的で、水性環境に対
して事実上不溶であるプロゲステロンをモデル薬として選択した。

【０１０７】また、全体の脂質濃度を同一にした場合、プロゲステロンのＤＳＰＥ−ＰＥＧ
ミセルでの可溶性は、胆汁酸塩ミセルの場合の約５〜１０倍であった（２１μｇ
／ｍｌ〜１９８±７μｇ／ｍｌ）ことから、ＤＳＰＥ−ＰＥＧミセルの方が不溶
性の薬物に対する有用なビヒクルとして使用できる可能性が高いと思われる。し
かしながら、この分散液には、ＳＳＭ（約１７ｎｍ）とＳＳＣ（約１５０ｎｍ）
の両方が含まれていた。

【０１０８】［実施例１３］本実施例では、ＤＳＰＥ−ＰＥＧミセル組成物を用いて、通常であれば水不溶
性の化合物の可溶性の増大についてさらに調査を行った。また、封入された水不
溶性化合物に加えてターゲティング剤を含むミセルを調製するための方法も設計
した。薬物の可溶性については以下のようにして求めた。

【０１０９】過剰量の薬物を粉末形態で加えることで、実施例１において上述したような成
膜方法を用いて調製したＰＣ／胆汁酸塩またはＤＳＰＥ−ＰＥＧの入ったポリエ
チレン製マイクロチューブに活性薬を仕込んだ。余分な薬物を遠心分離によって
除去し、上澄みをＨＰＬＣによって解析した。プロゲステロンの場合、ＨＰＬＣ
条件にＹＭＣ−ＣＮ（Ａ−５０３、２５０×内径４．６）カラム、アセトニトリ
ルと水（４０：６０）とを含む移動相、流量１．５ｍｌ／分を含めた。ＨＰＬＣ
溶離剤を測定したところ、２５４ｎｍに吸収が認められた。ＰＣ／胆汁酸塩混合
ミセルでプロゲステロン対脂質の比率を求めたところ、０．０１５６であった。
ＤＳＰＥ−ＰＥＧミセルでは、プロゲステロン対脂質の比率は０．１７であるこ
とが分かった。

【０１１０】これらの結果から、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０ｍｇ／ｍｌでプロゲステロン（上
述したように本質的に水に不溶である）が最大１９８．５μｇ／ｍｌまで可溶で
あることが明らかになった。この結果は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０ｍｇ／ｍｌで
水に難溶であるベツリン酸を用いた場合に最大で２００μｇ／ｍｌまで可溶であ
った結果と一致した（メルクインデックス第１２版、第１２１３頁を参照のこと
）。ベツリン酸（ＵＳＰに定義されているように不溶性である）を用いる同様の
実験で可溶性を算出したところ、ＳＳＭまたはＳＳＣで２５０μｇ／ｍｌであっ
た。

【０１１１】ミセルを含む標的薬物送達系を設計するにあたり、所望の化合物を上述したよ
うにしてミセル組成物に取り込む。実施例１で説明したように、このようにして
得られるミセル組成物を両親媒性化合物と共にインキュベートし、ミセル表面に
化合物が取り込まれるようにする。このような構成の膜関連化合物は、膜関連タ
ンパク質に対する受容体などに送達されるミセル組成物全体に対するターゲティ
ング剤として作用する。別の方法では、ａｍｐｈｉｌｉｃな化合物を、好ましく
は共有結合的な修飾によって、ミセルの脂質成分のうちのひとつまたは複数と結
合させる。これらの機序のうちどちらを利用するにしても、ミセルに取り込んだ
薬物をミセルで担持し、同族の受容体を発現する標的細胞または組織型に送達す
ることが可能である。

【０１１２】たとえば、乳癌細胞は健常な乳房細胞よりも高レベルでＶＩＰ受容体を発現す
る。したがって、膜関連ＶＩＰを含むミセルは、健常な細胞よりも乳癌細胞を優
先的に結合する。Ｔａｘｏｌ（登録商標）は乳癌細胞を死滅させることが明らか
になっているため、Ｔａｘｏｌ（登録商標）をＶＩＰ／ミセルに取り込むことで
、腫瘍細胞型を選択的に死滅させるべく標的薬物を送達することができる。

【０１１３】［実施例１４］本発明のこの態様では、エンセリン（ｅｎｔｈｅｌｉｎ）−１（ＥＴ−１）単
独またはＳＳＭ組成での輸液が、麻酔下のラットで、平均動脈圧（ＭＡＰ）、心
拍出量（ＣＯ）、全末梢抵抗（ＴＰＲ）、局所的血液循環に対して及ぼす影響に
ついて、放射性のマイクロスフェアによる手法を用いて検討した。実施例１１で
説明した方法に従って、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを生理食塩水中で用いてＥＴ−１を含
むＳＳＭまたは含まないＳＳＭを調製した。各群ごとの処置は以下のとおりであ
る。（ｉ）対照、ＳＳＭ２．７ｍｇ／ｍｌ（ｎ=６）、（ｉｉ）５０ｎｇ／ｋ
ｇ／分（ｎ=５）でＥＴ−１輸液、（ｉｉｉ）５０ｎｇ／ｋｇ／分でＳＳＭに内
封してＥＴ−１を輸液（ｎ=８）。０．１ｍｌ／分の速度で３０分かけて薬物を
輸液した。

【０１１４】これらの結果から、ＭＡＰ、ＣＯ、ＴＰＲまたは消化管（ＧＩＴ）への血流に
ＳＳＭが影響することはないが、基線に対し腎臓への血流増加（約２５％）と脳
への血流増加（約１９％）が観察された。腎臓、ＧＩＴ、脳では血流が減少して
血管抵抗が大きくなった。ＳＳＭに内封したＥＴ−１を使用すると、ＥＴ−１単
独の場合と比べて有意に顕著な心臓血管作用が得られた。ＴＰＲの増加はＥＴ−
１群で１０２％、ＳＳＭに内封したＥＴ−１を用いて処理した群では２２７％で
あった。腎臓の血管抵抗はＥＴ−１群で７６％、ＳＳＭに内封したＥＴ−１を用
いて処理した群では２８１％であった。しかしながら、脳では、血管抵抗はＥＴ
−１群で６２％、ＳＳＭに内封したＥＴ−１を用いて処理した群では２０％であ
った。これらの結果から、ＭＡＰ、ＴＰＲおよび局所血管抵抗の変化はＳＳＭに
内封したＥＴ−１によって助長されることが明らかになった。

【０１１５】［実施例１５］本発明のこの態様では、本発明のミセル生成物が凍結保存後に細胞生存度を高
める能力について検討した。この実験では、ＤＭＳＯ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧミセル
生成物またはＶＩＰ含有ＤＳＰＥ−ＰＥＧミセル生成物のいずれかと共に細胞を
３０分間インキュベートした上で、液体窒素中にて４８時間保管した。液体窒素
から取り出した後、細胞を解凍し、トリパンブルーを用いて標準的な染色法で細
胞の生存度を測定した。

【０１１６】これらの結果から、ＶＩＰが会合したミセルまたは未会合のミセルでの処理後
の細胞の生存度は、ＤＭＳＯで処理した後の細胞の生存度以上であることが明ら
かになった。ＤＭＳＯは周知であり、細胞の凍結保存分野において定常的に用い
られているため、これらの結果からミセルを用いることで現状と同程度またはそ
れ以上の保護性を得ることができ、よって細胞保存用の別の保護剤になることが
分かる。

【０１１７】一例として上記にて説明した本発明に対し、当業者であればさまざまな修正お
よび変更を施すことが可能であろう。したがって、本発明を限定できるのは添付
の特許請求の範囲に記載の内容のみである。

【図面の簡単な説明】

【図１】室温にて臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を求めるためのＰＥＧ−ＤＳ
ＰＥ水溶液の表面張力測定値を示す図である。

【図２】室温にて、生理食塩水、ヘペス緩衝液、リン脂質中で得たＶＩＰ
のＣＤスペクトル解析結果を示す図である。

【図３】室温および３７度で得たＶＩＰのＣＤスペクトル解析結果を示す
図である。

【図４】生理食塩水およびリン脂質中で、ＶＩＰのＣＤスペクトル解析結
果に対してカルモジュリンがどのような影響を及ぼすかを示した図である。

【図５】生理食塩水およびリン脂質中で得た、ＶＩＰフラグメントのＣＤ
スペクトル解析結果を示す図である。

【図６】生理食塩水およびリン脂質中で得た、ＶＩＰおよびバソプレッシ
ン（ＶＰ）のＣＤスペクトル解析結果を示す図である。

【図７】ＶＩＰ−ＳＳＭが血管拡張に対して及ぼす影響について示す図で
ある。

【図８】カルモジュリンがＶＩＰ−ＳＳＭ誘導血管拡張に対して及ぼす影
響について示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/34 Ａ６１Ｐ 1/00 49/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ａ６１Ｐ 1/00 37/43 (72)発明者ルービンスタイン，イスラエルアメリカ合衆国 60035 イリノイハイランドパークレクシントンレーン 2999 Ｆターム(参考） 4C076 AA17 AA94 BB01 CC16 DD01 DD63 EE23 FF16 4C083 AD111 AD571 BB03 BB07 EE12 FF05 4C084 AA02 BA44 DB14 MA22 MA52 NA02 ZA66 4C085 HH01 JJ03 KA16 KA26 LL05 4H011 BB19 BC19 CA01 CB04 CB05 CB08 CD03 DH11 DH25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ミセルと会合状態にある１種またはそれ以上の生物学的に活
性な両親媒性化合物を含む、生物学的に活性なミセル生成物を調製する方法であ
って、該方法は、ａ）水溶性ポリマーと共有結合した少なくとも１種の脂質成分を含む脂質１種
またはそれ以上を混合し；ｂ）前記脂質の配合物から立体的に安定化されたミセルを形成し；およびｃ）より生物学的活性の高いコンホメーションで、１種またはそれ以上の生物
学的に活性な両親媒性化合物と前記ミセルとが会合するような条件下にて、工程
ｂ）で得られるミセルを前記化合物（１種以上）と共にインキュベートする、工程を含む方法。
【請求項２】工程（ａ）における混合が有機溶媒中で行われ、工程（ｂ）
における立体的に安定化されたミセルの形成が、（ｉ）有機溶媒を除去して乾燥
膜を残し、そして（ｉｉ）その乾燥膜を水溶液で水和することを含む工程にて行
われる請求項１記載の方法。
【請求項３】前記有機溶媒が、蒸発または凍結乾燥によって除去される請
求項２記載の方法。
【請求項４】工程（ａ）における混合が、水溶液中で行われる請求項１記
載の方法。
【請求項５】ミセルと会合状態にある１種またはそれ以上の生物学的に活
性な両親媒性化合物を含む、生物学的に活性なミセル生成物を調製する方法であ
って、該方法は、ａ）生物学的に活性な両親媒性化合物と共に、水溶性ポリマーと共有結合した
少なくとも１種の脂質成分を含む脂質１種またはそれ以上を混合し；およびｂ）より生物学的活性の高いコンホメーションで前記化合物（１種以上）と前
記ミセルとが会合するような条件下にて、工程（ａ）で得られる混合物から立体
的に安定化されたミセルを形成する、工程を含む方法。
【請求項６】工程（ａ）における混合が有機溶媒中で行われ、そして少な
くとも１種の脂質は少なくとも１種のターゲティング化合物に接合されており、
工程（ｂ）におけるミセルの形成が、（ｉ）有機溶媒を除去して乾燥膜を残し、
そして（ｉｉ）その乾燥膜を水溶液で水和する工程を含むプロセスにて行われ、該方法はさらに、（ｃ）活性なコンホメーションで前記ターゲティング化合物
（１種以上）と前記ミセル生成物とが会合するような条件下にて、該ミセル生成
物をインキュベートする工程を含む請求項５記載の方法。
【請求項７】水溶液に不溶である１種またはそれ以上の生物学的に活性な
化合物を含む生物学的に活性な立体的に安定化された結晶生成物を調製するため
の方法であって、該方法は、ａ）前記生物学的に活性な化合物（１種以上）と、水溶性ポリマーと接合され
た１種またはそれ以上の脂質とを混合し；およびｂ）立体的に安定化された結晶生成物を形成する、工程を含む方法。
【請求項８】工程（ａ）における混合が有機溶媒中で行われ、そして、工
程（ｂ）における結晶生成物の形成が、（ｉ）有機溶媒を除去して乾燥膜を残し
、そして（ｉｉ）その乾燥膜を水溶液で水和する工程を含むプロセスにて行われ
、該方法はさらに、（ｃ）前記結晶生成物を１種またはそれ以上のターゲティン
グ化合物と接触させ、および（ｄ）前記ターゲティング化合物（１種以上）と前
記結晶生成物とが会合するような条件下にて、該結晶生成物をインキュベートす
る工程を含む請求項７記載の方法。
【請求項９】工程（ｂ）における形成が、（ｉ）有機溶媒を除去して乾燥
膜を残し、そして（ｉｉ）その乾燥膜を水溶液で水和することを含む工程にて行
われる請求項７記載の方法。
【請求項１０】前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）である請求項１、５または７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】前記両親媒性化合物が、その生物学的に活性なコンホメー
ションにおいて、１以上のα−またはπ−ヘリカルドメインを有することによっ
て特徴付けられる、請求項１、５または７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】前記化合物が、ペプチドの血管作用性腸管ペプチド（ＶＩ
Ｐ）／成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）ファミリーのメンバーである、請求項１
１記載の方法。
【請求項１３】前記ペプチドが、ＶＩＰ、ガラニン、エンドセリン、アン
ギオテンシンＩＩ、カルモジュリン、ならびにこれらの断片、類似体、およびモ
ジュレーターよりなる群から選択される請求項１１記載の方法。
【請求項１４】前記ミセルが、約２５ｎｍ未満の平均直径を有する請求項
１、５または７のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】前記脂質の組み合わせが、ＰＥＧに共有結合したジステア
ロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）からなる請求項
１、５または７のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】請求項１、５または７のいずれかに記載の方法によって製
造された、生物学的に活性なミセル生成物。
【請求項１７】請求項１６記載の生物学的に活性なミセル生成物を含む組
成物であって、前記生物学的に活性な両親媒性ペプチド、タンパク質、その断片
、類似体、またはモジュレーターが、抗酸化活性、抗痛活性、抗炎症活性、創傷
治癒活性、抗菌活性、抗気管支痙攣活性、代謝活性、抗癌活性、心臓血管活性、
抗緑内障活性、抗アポトーシス活性、抗皺活性、凍結保存活性、および抗老化活
性よりなる群から選択される活性を有する組成物。
【請求項１８】前記組成物が化粧品である請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】前記組成物が治療剤である請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】請求項１７記載のミセル組成物を含み、さらに検出可能な
標識を含む診断用組成物。
【請求項２１】前記標識が、蛍光標識、放射性標識、染料、ガス、ならび
に放射線撮像、磁気共鳴撮像、および超音波撮像での画質を高める化合物よりな
る群から選択される請求項２０記載の診断用組成物。
【請求項２２】診断方法であって、ａ）請求項２０記載の診断用組成物を調製し；ｂ）標的組織または臓器に該組成物の診断上有効な量を投与し；およびｃ）標的組織または臓器における標識の存在を検出することにより、該標的組
織または臓器での組成物の取り込みを検出する、工程を含む方法。
【請求項２３】前記標識が、蛍光標識、放射性標識、染料、ガス、ならび
に放射線撮像、磁気共鳴撮像、および超音波撮像での画質を高める化合物よりな
る群から選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】請求項１２記載の方法によって製造された、胃腸病の治療
用の経口徐放製剤であって、該方法が、生物学的に活性なミセル生成物をカプセ
ルに封入する工程をさらに含む方法。
【請求項２５】前記胃腸病が、炎症性腸疾患、急性食物圧入、慢性便秘、
ヒルシュスプルング病、アカラジア、乳児肥厚性幽門狭窄、および潰瘍よりなる
群から選択される請求項２４記載の経口徐放製剤。
【請求項２６】標的組織または臓器に、生物学的に活性な両親媒性化合物
を投与する方法であって、ａ）請求項１、５または７のいずれかに記載の方法に従う、ミセルと会合した
生物学的に活性な両親媒性を含む生物学的に活性なミセル生成物；およびｂ）該標的組織または臓器に、該ミセル生成物の治療上有効な量を投与する、工程を含む方法。
【請求項２７】生物学的に活性なコンホメーションにある前記両親媒性化
合物が、１以上のα−またはπ−ヘリカルドメインを有することによって特徴付
けられる請求項２６記載の方法。
【請求項２８】前記ペプチドが、ペプチドの血管作用性腸管ペプチド（Ｖ
ＩＰ）／成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）ファミリーのメンバーである請求項２
７記載の方法。
【請求項２９】前記ペプチドが、ＶＩＰ、ガラニン、エンドセリン、およ
びアンギオテンシンＩＩ、ならびにこれらの断片、類似体、およびモジュレータ
ーよりなる群から選択される請求項２７記載の方法。
【請求項３０】移植または受精のために体臓器、組織または細胞型を保存
するための方法であって、請求項１２に従って製造されたミセル組成物中で、該
臓器、組織、または細胞型をインキュベートする工程を含む方法。
【請求項３１】前記可溶性化合物が、プロゲステロン、エストロゲン、プ
レドニゾロン、プレドニソン、２，３メルカプトプロパノール、テストステロン
、ベツリン酸、ドキソルビシン、アムホテリシンＢ、ジアゼパム、ナイスタチン
、プロポフォル、およびＴａｘｏｌ（登録商標）よりなる群から選択される請求
項７記載の方法。
【請求項３２】請求項７記載の方法によって製造された結晶生成物を含む
医薬組成物。
【請求項３３】治療用、診断用、または化粧品用である請求項３２記載の
組成物。
【請求項３４】標的組織に、不溶性化合物を投与する方法であって、ａ）請求項８記載の方法に従って調製された、ミセルと会合した生物学的に活
性な両親媒性を含む生物学的に活性なミセル生成物を調製し；およびｂ）該標的組織に、該ミセル生成物の治療上有効な量を投与する、工程を含む方法。