DE60117583T2

DE60117583T2 - Liposomen welche antikanzeröse wirkstoffe verkapseln und deren verwendung zur behandlung von malignen tumoren

Info

Publication number: DE60117583T2
Application number: DE60117583T
Authority: DE
Inventors: Antonio Parente Duena; Ferran Pons Lambiez; Angels Fabra Fres; Maria Dolores Polo Trasancos; Josep Garces Garces; Francesca Reig Isart
Original assignee: Lipotec SA
Current assignee: GP Pharm SA
Priority date: 2000-10-10
Filing date: 2001-10-03
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2021-10-04
Also published as: AU9190401A; ATE318582T1; US20050100590A1; CA2425271A1; AU2001291904B2; ES2186484B1; MXPA03003125A; ES2186484A1; WO2002030397A9; JP2004510811A; BR0113552A; JP4286535B2; EP1325739A1; WO2002030397A1; PT1325739E; DE60117583D1; DK1325739T3; EP1325739B1; ES2259674T3; US7153490B2

Description

Beschreibung
Die Erfindung bezieht sich auf die Bereitstellung eines Systems zur antikanzerösen Behandlung, welches in der Lage ist, Krebszellen in einem Lebewesen selektiv zu zerstören ohne die übrigen Zellen in dem behandelten Organismus anzugreifen. Genauer bezieht sich die Erfindung auf Liposome, welche antikanzerös wirkende Arzneistoffe zur vorgenannten Behandlung enthalten.
STAND DER TECHNIK
Krebs ist eine der verbreitetsten Krankheiten in entwickelten Ländern und besonders Tumormetastasen sind Hauptursache der Sterblichkeit von Patienten mit soliden malignen Tumoren. In ihrem Erscheinungsbild bestehen Sie aus einem neuen kanzerösen Zentrum, das von einem Primärtumor ausgeht und in andere Organe oder unterschiedliche Gewebe übergeht. Dieser Vorgang der Metastasierung schließt eine Reihe nacheinander zu durchlaufender Stadien ein, in welchen die Tumorzellen mit den Zellkomponenten und dem Gewebe des Wirtes interagieren müssen. Diese Stadien sind wie folgt: Abspaltung der Tumorzellen vom Primärtumor; Eintritt in den intravaskulären Raum; Wanderung durch das Gefäß- oder Lymphsystem zu anderen Geweben; die Adhäsion an das vaskuläre Endothel; Austritt aus dem Gefäßsystem und Invasion neuen Gewebes unter Bildung des sekundären Tumors.
Während dieses ganzen Vorganges interagieren die metastasierenden Tumorzellen mit den Komponenten der extracellulären Matrix, und speziell mit den Basalmembranen, indem sie sich dort anheften und über die Wirksamkeit proteolytischer Enzyme deren Zerstörung provozieren, welche, durch sie selbst und/oder durch die anderen von den Tumorzellen stimulierten eigentlichen Wirtszellen produziert werden. So ist die Veränderung hin zu den Adhäsionseigenschaften ein unverzichtbares Element für das Auftreten der Metastasierung, denn es ist ein Prozess, der an die Freisetzung von Zellen aus dem ursprünglichen Tumor, an deren Migration und an ihre Fähigkeit zur Einnistung in neues Gewebe gebunden ist.
Die Hauptadhäsionsmoleküle, welche bei dieser Wechselwirkung eingreifen sind die Integrine. Die Integrine sind eine Familie von transmembranen Glykoproteinen, die durch zwei über covalente (hydrophobe) α- und β- gebundene Ketten gebildet werden. Unter anderen Funktionen verhalten sich die Integrine als Rezeptoren von determinierten Proteinen der extrazellulären Matrix wie das Laminin, das Fibronectin, das Vitronectin und das Collagen (Ruoslahti, E., Giancotti,F.G., Cancer Cells (1989),1, 4, 119–126). Vor kurzem wurde eine Veränderung bei der Expression von Intergrinen in Tumorzellen demonstriert, wobei deren Anwesenheit bei diesen Zelltypen erhöht wurde (Dedhar,S., Saulmier,R., Cell Biol. (1990), 11, 481–489). Diese Erhöhung ist der verantwortliche Faktor für die Adhäsion an der extrazellulären Matrix und für den Erwerb des Metastasepotenzials.
Die Hauptbehandlung, welche für das Entfernen von Tumoren angewandt wird, ist die endovenöse Verabreichung von Zytostatika, insbesondere derjenigen, welche der Anthracyclinfamilie zugehören (Young, R.C., Ozols, R.F., Myers, C.E., N. Eng. J. Med. (1981), 305, 139–153). Jedoch liefert diese Therapieform im Hinblick auf ihre fehlende Selektivität gegenüber Tumorzellen, wegen der Entwicklung von Resistenz gegenüber diesen Verbindungen durch maligne Zellen und wegen der unterschiedlichen Response von Primärtumoren und Metastasen Gründe für das Auftreten ernsthafter Sekundäreffekte, von denen einige chronischer oder irreversibler Natur sind.
Folglich ist es eine Hauptaufgabe gegenwärtiger Chemotherapiezentren eine verbesserte antitumorale Wirksamkeit zu erzielen und die Toxizität dieser Verbindungen zu reduzieren. Ein Weg dies zu erreichen besteht darin, das Zytostatikum in ausreichender Konzentration zu erhalten, um die Zielzellen zu erreichen, was in einer selektiven Zerstörung primärer Tumoren oder von Metastasen resultiert ohne gesunde Zellen anzugreifen. Auf diese Art würde ein erhöhter therapeutischer Index des Wirkstoffs erzielt und eine effektivere Therapie erreicht werden.
Bei diesen Systemen wird der Wirkstoff in die wässrigen Zwischenräume der Liposome eingearbeitet, sofern dieser hydrophil ist oder er wird zwischen diesen und den lipiden Doppelschichten verteilt sofern er einen eher lipophilen Charakter aufweist. Sobald der Wirkstoff eingekapselt ist, kann er dem unter Behandlung stehenden Patienten verabreicht werden.
Eine Reihe von Forschern haben gezeigt, dass die Verwendung von Liposomen zur Verabreichung von Antineoplastica die traditionellen Verabreichungsmethoden oft übertrifft, vgl. z. B.: Gabizon et aL:Cancer Res.(1982) 42, 4734–4739 and Van Hossel et al.: Cancer Res. (1984) 44, 3698–3705.
Es wurde beobachtet, dass die Verkapselung von Doxyrubicin in Liposome unter Anwendung verschiedener Tiermodelle die sekundären Effekte sowohl der chronischen als auch der akuten Toxizität signifikant reduziert. Siehe z. B.: Rahman et al.: Cancer Res.(1980) 40, 1532–1537, Forssen et al.: Proc.Natl. Acad. Sci.USE (1981) 78,1873–1877, Olson et al.: Eur. J. Cancer Clin. Oncol. (1982)18167–176, Rahman et al.: Cancer Res. (1985) 45, 796–803 und Gabizon et al.: J. Natl. Cancer Inst. (1986) 77, 459–467. Mit der Verabreichung von Doxorubicin in Liposomen können zusätzlich andere Toxizitätsindikatoren wie z. B. Alopezie, Gewichtsverlust, Übelkeit, Erbrechen und durch Extravasation verursachte Nekrosen der Haut in erheblichem Maße reduziert werden. Forssen et al.: Cancer Treat. Rep. (1983) 67, 481–484; vgl. auch die in diesem Absatz oben angegebenen Zitate.
Es wurde ebenso in verschiedenen Tumormodellen festgestellt, dass die signifikante Toxizitätsminderung nicht auf Kosten einer Verschlechterung der antitumoralen Wirksamkeit erzielt wird. Zudem bereits oben zitierten Arbeiten vgl. auch Rahman et al.: Chemother. Pharmacol. (1986) 16, 22–27, Gabizon et al.: Cancer Res. (1983) 43, 4730–4735 und Br. J. cancer (1985) 51, 681–689, Mayhew et al.: J. Natl. Cancer Inst. (1987) 78, 707–713, Forssen et al.: Cancer Res. (1983) 43, 546–550, und Storm et al.: Cancer Res. (1987) 47, 3366–3372.
Angesichts des Vorkommens und der speziellen Charakteristika der Krebsmetastasen ist eine gegen die Metastasen gerichtete Therapie eines derjenigen Gebiete, bei denen bei der Suche nach neuen Alternativen zu den konventionellen Behandlungsmethoden am meisten Aufwand getrieben wurde. Auf Grund ihres Wirkmechanismen, ihrer erwiesenen hohen Wirksamkeit und ihrer hohen Toxizität stellen die Anthracycline die Form der Zytostatikafamilie dar, die auf dem Gebiet der Verkapselung in Systemen für eine kontrollierte Wirkstofffreisetzung wie die Liposomen, am intensivsten untersucht wurde, was an der wachsenden Anzahl von auf diesem Gebiet veröffentlichten Patenten abzuschätzen ist, welche 80 % derjenigen Patente umfassen, die in unter diesem Titel auf Liposome gerichtet und veröffentlicht sind und die Verabreichung von Zytostatika betreffen.
Die erste Generation der Liposome, welche Anthracycline enthielten entsprachen Hohlkügelchen aus PC, PG und Cholesterin, wobei der Wirkstoff in dem wässrigen Innenraum eingekapselt war. Diese Liposome zeigten eine Verringerung der Toxizität des Wirkstoffs. Obwohl ihre Wirksamkeit gegen Tumoren nicht größer war, als diejenige des freien Wirkstoffs, verbesserten sie die Wirksamkeit des Wirkstoffs nur im Fall von Tumormodellen, bei denen die Zellmetastasen durch die Leber gestreut waren, welche das am besten zugängliche Organ für Liposome darstellt, nicht aber bei lokalem Tumorwachstum. (Mayhew, E. Rustum,Y., Biol.Cell (1983) 47, 81–86). Zusätzlich wurde deren Verweildauer im Organismus nach der intravenösen Injektion auf wenige Stunden reduziert, weil sie durch Makrophagen des endoplasmatischen Reticulums rasch abgefangen wurden. Aus diesem Grunde und trotz der intensiv durchgeführten Forschungsarbeiten waren die Erwartungen, die man ursprünglich auf Liposomformulierungen als Transportmittel für Cytostatica gesetzt hatte, nicht befriedigend. Während der achtziger Jahre änderte sich die Situation mit dem Erscheinen der ersten Publikationen bei denen Liposome beschrieben wurden, die auf ihrer Oberfläche Glycolipide (Allen, T.M.,Hansan, c., Rutledge, L.,Biochem Biophys. Acta (1989), 981, 27.35; Mori, a., Klivanov,A.L., Torchilin, V.P., Hunang, L.,FEBS Lett. (1991), 284, 263–266) oder hydrophile Polymere wie Polyethylenglykol (PEG) (Blume,G.,Ceve, C., Biochem Biophys Acta(1990),1029, 91–97, Allen, T.M., Hansen, C., Martin, F., Redemann,C., Yau-Young, A., Biochem Biophys. Acta (1991),1066, 29–36) zu dem Zweck enthielten, die Dauer ihrer Verweildauer im Blutkreislauf zu unterstützen und dadurch Liposome der so genannten „zweiten Generation" oder „Stealth-Liposome" zu erhalten. Es scheint, dass dieser Stabilisierungseffekt des PEG und der Glykolipide auf ihren hydrophilen Eigenschaften beruht, welche sie da vor bewahrt, Aggregate auf der Oberfläche der Liposome zu bilden und es ermöglichen, dass sie nicht als Ligand eines Zellrezeptors oder irgend eines Plasmaproteins erkannt werden. Darüber hinaus erzeugt ihre Anwesenheit auf der Oberfläche der Liposome einen sterischen Effekt, wodurch er die Wirkungen der Opsonine und anderer Blutproteine verhindert und den Zugang der Makrophagenrezeptoren zu den Phosphatgruppen der Phosphorlipide reduziert, was zu einer erhöhten Verweildauer im Blutkreislauf führt.
Anschließend fanden einige Autoren, dass es möglich war, die Stabilität und Wirksamkeitscharakteristika dieser Liposome durch die Einarbeitung von Zusätzen, die die Peroxidation von Lipiden verhinderten, wie Vitamin E-acetat, BHT oder solche, die von Chromanen abgeleitet sind (EP-0274174, WO-8500968, WO-9202208 und US-5605703) zu verbessern.
Trotz der Tatsache, dass diese galenischen Formen eine Reihe von Vorteilen gegenüber konventionellen Formen boten, bleibt die Möglichkeit offen die Kügelchen zu den Zielzellen zu steuern um die Wirksamkeit mit kleineren Wirkstoffdosen zu verbessern und Nebeneffekte zu unterdrücken oder zu reduzieren.
Die Grundidee besteht darin, in die Oberfläche eines Liposomen einen chemischen Körper einzuarbeiten, der in der Lage ist, von den Zielzellen selektiv erkannt zu werden. Der Erfolg Liposome zu den Zielzellen zu steuern, hängt von der richtigen Wahl des Übertragungsmoleküls ab.
Das Verfahren der Auswahl einer chemischen Struktur, welche in der Lage ist, Liposome zu den Tumorzellen zu leiten, ist keineswegs trivial, weil speziell im Falle von Tumorzellen eine große Vielfalt von Membranproteinen ebenso wie von Antigenen und Oberflächenrezeptoren existiert, die entsprechend dem metastatischen Potenzial die Vermehrungsaktivität und das in Frage stehende Gewebe in einer solchen Weise variieren, dass, obwohl sie als Grundlage zur Auswahl von Erkennungsstrukturen genutzt werden könnten, die Auswahl in der Praxis nicht unmittelbar zu erreichen ist. Außerdem ist in vielen Fällen die wirkliche Situation so, dass die Vermehrungs- und/oder die Tumorzellen über ein differenzierendes Mittel nämlich die Überexpression von vorbestimmten Strukturen im Hinblick auf normale Zellen verfügen.
Das zusammengefasste heutige Wissen lässt darauf schließen, dass die Adhäsionsprozesse und die davon betroffenen Proteine eine ausschlaggebende Rolle bei der Entwicklung des metastatischen Prozesses und für die nötige Vaskularisation der Zellvermehrung bilden.
Laminin, das unter den Proteinen am meisten mit diese Mechanismen verwoben ist, hat sich als ein guter Kandidat erwiesen, Liposome zu leiten, weil schlüssig dargelegt worden ist, dass dessen Rezeptoren in den Tumorzellen überexprimiert werden.
Nach Collagen ist Laminin die überwiegende Komponente der Basalmembran von Zellen. Es ist ein aus drei Polypeptidketten: α (440 kDa), β (200 kDa) und γ (220 kDa) gebildetes Glykoprotein, die mit zwei kurzen und einem langen Arm kreuzförmig angeordnet sind. Die Bindung zwischen den Ketten wird durch Disulfidbindungen und durch Interaktionen des nicht-kovalenten Typs unter Bildung eines asymmetrischen Moleküls gebildet, in welchen unterschiedliche strukturelle Bereiche lokalisiert sind.
Die Zellen besitzen unterschiedliche spezifische Membranenrezeptoren, welche Peptidsequenzen und/oder funktionale Bereiche im Molekül des Laminins erkennen. Diese Rezeptoren können in zwei Gruppen eingeteilt werden: Integrine und Nicht-intergrine.
Die Intergrine werden durch zwei transmembrane Polypeptidketten α und β in nichtkovalenter Assoziation gebildet. Diese Moleküle sind die Rezeptoren durch welche die Zellen an den Komponenten der extrazellulären Matrix haften. Einige von ihnen greifen auch durch Zelle zu Zelle Erkennung ein. Eine jede von ihnen erkennt spezifische, Peptidsequenzen, die in den Molekülen der Matrix vorhanden sind, wie z. B. Laminin.
Unter dem Typ der Nicht-Integrinrezeptoren ist der Rezeptor 67 kDa der für Laminin am besten untersuchte und er wurde ausgehend von verschiedenen Zellgeweben, unter anderem Karzinomen isoliert und identifiziert. Darüber hinaus wurde verifiziert, dass die metastatischen Tumorzellen auf ihrer Zelloberfläche mehr Rezeptoren für Laminin exprimieren als normale Zellen, was die Überlegung erlaubt, dass dieser Rezeptor ein Marker für das Fortschreiten der Tumorentwicklung und ein Indikator für die Aggressivität vieler Tumortypen ist.
Laminin zeigt verschiedene metastatische Aktivitäten an wie z. B.:

– Das Verursachen von Zelladhäsion, -wachstum und -ausdehnung;
– Die Differenzierung zwischen Epithelial- – und Tumorzellen zu stimulieren;
– Die Zellmigration zu provozieren;
– Die Bösartigkeit von Tumorzellen durch ihre Gegenwart auf der Oberfläche zu verstärken, was ihre Invasivität und metastatische Aktivität erhöht.

Bestimmte Studien haben aufgezeigt, dass die unterschiedlichen Funktionen von Laminin durch spezifische Peptidsequenzen im Lamininmolekül vermittelt werden wie z. B. die Sequenz: von fünf Aminosäuren SIKVAVS, welche im Fragment PA22-2 der Laminin α- Kette lokalisiert zu finden ist. Speziell die aktivste Zone dieser Region ist das Pentapeptid SIKVAVS.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Zur Zeit richten sich die Studien an Liposomen darauf, sie durch Einlagerung in die Oberfläche der Ligandenteilchen, welche z. B. Antikörper, Peptide und Proteine sein können, die in der Lage sind, speziell diese Zelltypen zu erkennen , an sich zu binden und in Richtung oder direkt auf die Tumorzellen zu leiten (Allen T.M., Austin,G.A., Chonn, A.,Lin,L.,Lee,,K.C., Biochem. Biophys. Acta (1991) 1061, 56–63).
Demnach besteht der Gegenstand der vorliegende Erfindung in einer neuen Anwendung von in Liposome eingekapselten antikanzerösen Wirkstoffen, welche als Haupteigenschaft eine Bedeckung durch Lipopeptide aufweisen welche aus der Struktur von Lamininen – speziell der SIKVAVS-Sequenz- auf eine Weise hervorgehen, dass die so hergestellten Liposome eine hohe Selektivität im Hinblick auf Tumorzellen aufweisen und daher die Wirksamkeit des in Kapseln eingeschlossenen antikanzerösen Wirkstoffs erhöhen.
BEDEUTUNG DER IN DER ERFINDUNG VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN

DXR:

Doxorubicin

PC:

Phosphatidylcholin

PL:

Phospholipide aus hydriertem Ovulum (egg)

PG:

Phosphatidylglycerin

CHOL:

Cholesterin

CROM:

Chroman-6

Lam2M:

Myristoyl-PEGAD

Lam9:

Myristoyl-YESIKVAVS

Lam9Cys:

Myristoyl-CYESIKVAVS

Lam9Cys-b-Ala:

Myristoyl-AAAAACYESIKVAVS

AG10:

GYSRARKEAASIKVAVSARKE

(E8)-2-4-G:

NPWHSIYITRFG

mir:

myristoyl

COX:

Doxorubicin

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung und die Verwendung von Liposomen, welche antikanzeröse Wirkstoffe enthalten.
Die Haupteigenschaft der Liposome der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie mit Fragmenten von hydrophob derivatisierten Peptiden (overlaid lipopeptides) so beschichtet sind, dass die so hergestellten Liposome ein hohes Ziel- vermögen (targeting ability) in Bezug auf Tumorzellen aufweisen und dadurch die Wirksamkeit der Verkapselung antikanzeröser Wirkstoffe steigern.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt,- dass die aktiv beschichteten Lipopeptide in vitro vor der Einarbeitung in Liposome ihr Zielvermögen vollständig verlieren, wenn sie in Liposome eingearbeitet werden. Aus diesem Grund wurden erfindungsgemäß Zwischenstücke (spacer) entwickelt, welche, wenn sie zwischen die Sequenz und die lipophile Kette des beschichteten Lipopeptids eingeschoben werden, es eigenarti gerweise ermöglichen, das Zielvermögen der aktiven Peptidsequenz beizubehalten.
Folglich ist die Struktur des beschichteten Lipopeptids (des hydrophob derivatisierten Peptids) wie folgt:
Lipidfragment – Zwischenstück – Aktive Sequenz.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Herstellung und der Verwendung von Liposomen mit einem Gehalt an antikanzerösen Wirkstoffen, welche auf ihrer Oberfläche Peptidfragmenten enthalten, die von Laminin abgeleitet sind (beschichtete Lipopeptide), die durch die folgenden drei Bausteinen (blocks) strukturiert sind: einem Lipidfragment, einem aktiven Oligopeptid und einem Oligopeptid-Zwischenstück neben anderen Fragmenten.
Die Lipidfragmente sind Fettsäuren mit einer Kohlenstoffkettenlänge zwischen C6 und C20. Speziell Decanoyl, Myristoyl und Stearoyl.
Das Abstandsfragment besteht aus Oligopeptiden, die im Hinblick auf Laminin nicht aktiv sind und eine Länge aufweisen die zwischen 5 und 10 Aminosäureresten liegt. Genauer bei einer Länge von sieben bis neun Aminosäureresten, und noch spezifischer sind es die Sequenzen AAAAACYE, SSAAACYE und RKERKECYE:
Die aktive Sequenz besteht aus dem Oligopeptid SIKVAVS
Die die Liposome bildenden Lipide sind gut bekannt. Allgemein werden Phosphorlipide mit rein neutraler oder negativer Ladung und einem Sterin wie Cholesterin umfasst. Die Auswahl der Lipide wird auf Basis der Erfordernisse im Hinblick auf die endgültige Größe der Liposome, auf den Wirkstoff der eingekapselt werden soll und auf die erwünschte Stabilität für die Herstellung getroffen. Üblicherweise ist die größte Lipidkomponente der Liposome das Phosphatidylcholin (PC). Die PCs unterscheiden sich voneinander in der Länge und im Grad der (Wasserstoff)sättigung der Acylketten und können aus natürlichen oder synthetischen Quellen isoliert werden.
Der Einschluss eines negativ geladenen Phospholipids unterstützt die Stabilität der Liposomenlösung und verhindert eine spontane Aggregation der Liposome.
Die am häufigsten verwendeten negativ geladenen Phosphorlipide sind unter anderen das Phosphatidyl-glycerin (PG), das Phosphatidyl-serin (PDS) und das Phosphatidyl-inositol (PI). Das Verhältnis der verwendeten neutralen Phosphorlipide zu negativ geladenen Phosphorlipiden reicht jeweil von 10:2 bis 10:10. Der Einschluss von Cholesterin begünstigt allgemein die Stabilität der Liposomen in dem er die Permeabilität der Membranen im Hinblick auf Ionen und kleine polare Moleküle vermindert und ebenso die Penetrationskapazität einer Reihe von Proteinen zwischen den Doppelschichten reduziert die zu größeren Funktionsstörungen unter diesen führen könnte. Typischerweise beträgt das Verhältnis des verwendeten Cholesterins zu den Gesamtlipiden 0 bis 50 %.
Falls gewünscht können die Liposome, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, Zusatzstoffe enthalten, die eine Verbesserung ihrer Stabilitätseigenschaften erlauben oder die Toxizität der verkapselten Wirkstoffe reduzieren. Hier können zum Beispiel Hemmstoffe der Lipidoxidation, wie sie z. B. in den Patenten US 5605703 , EP 0274174 , WO-8500968 und WO 9202208 beschrieben sind, Erwähnung finden. Die antikanzerösen Wirkstoffe die erfindungsgemäß in Liposome eingekapselt werden können, schließen ein aber sind nicht beschränkt auf:
Nitrierte Senfölanaloge wie Cyclophosphamid; Melphalan; Iphosphamid; oder Trophosphamid;
Ethylenimine wie Thiotepa;
Nitrosoharnstoffe wie Carmustin;
Freigesetzte Wirkstoffe wie Temozolomid oder Dacarbazin;
Analoga von Antimetaboliten von Folsäure wie Methotrexat oder Raltitrexed;
Analoga von Purinen wie Thioguanin, Cladribin oder Fludarabin;
Analoga von Pyrimidinen wie Fluorouracil, Tegafur oder Gemcitabin;
Vincaalkaloide und Analoga wie Vinblastin, Vincristin oder Vinorelbin;
Derivate von Podophyllotoxin wie Etoposid, Taxanen, Docetaxel oder Paclitaxel;
Anthracycline und ähnliche wie Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin and Mitoxantron;
Andere cytotoxische Antibiotica wie Bleomycin and Mitomycin;
Platinverbindungen wie Cisplatin, Carboplatin und Oxaliplatin;
Monoclonale Antikörper wie Rituximab;
Andere antineoplastische Wirkstoffe wie Pentostatin, Miltefosin, Estramustin, Topotecan, Irinotecan und Bicalutamid.
In Übereinstimmung mit der obigen Beschreibung zeigen die Liposome der vorgeschriebenen Erfindung die folgenden Eigenschaften:

a) Eine Lipidkonzentration von 1 und 100 mg/ml, und bevorzugt etwa 10 mg/ml.
b) Die Lipidkomponenten sind Phospholipide, sowohl natürlichen als auch synthetischen Ursprungs, und Cholesterin.
c) Das Verhältnis von Cholesterin zur Menge der Gesamtlipide, liegt zwischen 0 und 50%, vorzugsweise zwischen 35 and 50%.
d) Die vorhandenen Phospholipide sind Phosphatidylcholin, das keine Ladung trägt und gewünschtenfalls ein anderes negativ geladenes Phosphorlipid, vorzugsweise Phosphatidylglycerin.
e) Das Verhältnis der neutralen Phosphorlipide zu denjenigen mit negativer Ladung liegt dazwischen 10:2 und 10:10 und vorzugsweise jeweils etwa zwischen 10:7 and 10:10.
f) Gewünschtenfalls können die Liposome andere Zusätze enthalten wie zum Beispiel Oxidationsinhibitoren für Lipide wie sie in den Patenten US 5605703 , EP 0274174 , WO-8500968 und WO-9202208 beschrieben sind.
g) Die Peptidkonzentration würde zwischen 0.1 and 1 mg/ml, und vorzugsweise um 0.5 mg/ml schwanken.
h) Die Liposome werden in wässriger Lösung gebildet, und je nachdem physiologisch z.B. auf 0,9 % NaCl isotonisch gestellt oder nicht.
i) Die Größe der Liposome soll auf jeden Fall weniger sein als 500 nm, und vorzugsweise weniger als 300 nm und noch mehr bevorzugt zwischen 50 nm und 250 nm.

Herstellung der Liposome und Einarbeitung des Wirkstoffs:
Eine bevorzugte Methode ist die von Bangham et al. beschriebene, bei der vielschichtige Liposome (MLVs) heterogener Größe erhalten werden. Bei dieser Methode werden die sich bildenden Lipide in einem brauchbaren organischen Lösungsmittel gelöst, das anschließend am Rotationsverdampfer unter Vakuum abgezogen wird. Der sich bildenden Film wird in einem adäquaten wässrige Medium, welches den Wirkstoff enthält, durch manuelles oder mechanisches Schütteln hydratisiert (hydrated), die heterogene Suspension von MLVs wird einer beliebigen bekannten Methode zur Teilchenverkleinerung und Homogenisierung unterworfen. So sind zum Beispiel zwei bevorzugte Verfahren jene der Ultraschallbehandlung mit einer Titanprobe, um des SUW Liposome zu erhalten, und die Extrusion der MLV Lösungen durch Polycarbonatfilter um VET Liposome zu erhalten.
Herstellung von Peptidfragmenten:
Die Synthese von Peptiden wird unter Verwendung des Verfahrens der Festphasenmethode nach Merrifield (1962) mit Fmoc/tBu durchgeführt.
Einarbeitung des Lipopeptids:
Die verwendeten Lipopeptide waren Acyl-oligopeptide, wobei Acylgruppen mit linearen gesättigten Kohlenwasserstoffketten einer Länge von C6 bis C20, vor allem die Decanoyl, Myristoyl oder Stearoylreste bevorzugt waren. Die Lipopeptide wurden mit den Rest der Komponenten vermischt um Liposome zu bilden, oder die Lipopeptide und Globuli wurden alternativ durch Inkubation bei 60°C in die Liposome eingearbeitet, weil die Doppelschichten in einem gelartigen Zustand waren und die Einarbeitung des hydrophilen Teils dieser Derivate in ihr Inneres ermöglichten. In beiden Fällen sollte die hydrophobe Zone der Derivate weiterhin die Doppelschicht bilden, während die Peptidsequenz auf der hydrophilen Außenseite bleiben sollte.
Zur Erläuterung, aber nicht in beschränkender Form, soll die im Einzelnen dargestellte Verfahrensweise des vorliegenden Patentes im folgenden durch einige praktische Beispiele beschrieben werden:
BEISPIEL 1: Synthese aktiver Peptide mit endständiger Carboxylgruppe.
Die Synthese von Peptiden, die sich von Laminin ableiten, wird nach der Festphasenmethode von Merrifield (1962) mit Fmoc/tBu ausgeführt.
Um eine Sequenz mit endständiger Carboxylgruppe für eine Feststoffsynthese zu erhalten, wird als Basis ein Wang Harz mit einem Funktionalisolationsgrad von 0,72 meq/g eingesetzt, welches der in der unten stehenden Tabelle dargestellten Behandlung zugeführt wurde:
Tabelle 1: Protokoll des Waschvorgangs des Peptidylharzes
Im allgemeinen ging man von einem Gramm des Wang-Harzes in einer mit einem Filter ausgestatteten Spritze aus, die mit einem Vakuumssystem verbunden war, und es wurde 30 Minuten lang Dimethylformamid (DMF) eingeleitet. Parallel dazu wurde über eine Filterwaage die erforderliche Menge der ersten Fmoc-Aminosäure gewogen und in Dimethylformamid gelöst, dann wurden zu dieser Lösung als Kupplungsreagenzien 4-Dimethylaminopyridin (4-DMAP) und Diisopropyl-carbodiimid (DIPCDI) (0,3:1, molar) zugegeben. Alle diese Reagenzien wurden in einem fünffachen Über schuss in Bezug auf die für die vollständige Reaktion notwendige Menge verwendet. Danach wurde dieses Gemisch zu vorher getrocknetem Harz gegeben und dort bei Raumtemperatur und gelegentlichem Rühren zwei Stunden reagieren gelassen. Danach wurde das Harz mit verschiedenen Lösungsmitteln gewaschen und vollständig getrocknet.
Schließlich wurden die vereinigten Mengen der Aminosäure ausgewogen. In Fällen, wo die Reaktion nicht vollständig abgelaufen war, wurde zusätzliche Reagenzien in einer Menge die der Hälfte der ursprünglich zugegebenen Menge entsprach zugesetzt und das Gemisch für weitere zwei Stunden sich selbst überlassen, wonach der gleiche Prozess der Trocknung des Harzes und der Mengenbestimmung der Aminosäure eingeschlagen wurde.
Die Vereinigung der verbliebenen Fmoc-Aminosäuren wurde durch aufeinanderfolgende Schritte der Freisetzung der Aminosäure und Bildung einer Amidbindung durchgeführt.
So wurde zur Unterdrückung der Fmoc-Aminoschutzgruppe der Peptidylrest einmal eine Minute lang mit DMF/Piperidin 20% behandelt, und diese Behandlung ein zweites Mal fünf Minuten lang wiederholt. Danach wurde das Piperidin durch verschiedene Waschvorgänge mittels DMF entfernt und der Ninhydrintest ausgeführt, um festzustellen, ob die Elimination der Fmoc-Gruppe (blaue Färbung) vollständig war. Ich einigen Fällen wurde die Entfernung der Schutzgruppe mit dem Reagenz 1,8-Diazabicyclo [5.4.0.]-undec-7-enol (DBU) im Gemisch mit DMF/Piperidin/DBU (48:2:2, v/v/v) verwendet in dem man das Harz noch einmal etwa sieben Minuten behandelte. Nach Ablauf dieser Zeit wurde das Harz mehrfach mit Dimethylformamid gewaschen und der Ninhydrintest wie im vorhergehenden Fall wiederholt.
Sobald das Peptidylharz ungeschützt war, wurde die passende Fmoc-Aminosäure mit den Kupplungsreagenzien zugegeben. Abhängig von der Schwierigkeit der Synthese, welche die eingesetzte Sequenz bot, wurden zwei verschiedene der Reagenzkombinationen verwendet:
HOBt und DIPCDI in molarem Verhältnis 1:1 mit der Fmoc-Aminosäure.
HOBt, DIEA und 2-(1H-Benzotriazol1-il)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluoroborat (TBTU)im molaren Verhältnis 1:2:1.
Alle Reagenzien wurden im Bezug auf die benötigten Mengen in 2,5 fachem Überschuss eingesetzt.
In beiden Fällen wurde das Reaktionsgemisch über eine Stunde sich selbst überlassen und die Beendigung mittels des Ninhydrintests zum Nachweis freier Aminogruppen (gelbe Färbung) kontrolliert. Wenn die Reaktion nicht abgeschlossen war, wurde das Gemisch eine weitere Stunde mit dem Harz in Kontakt gehalten; danach wurde der Ninhydrintest noch einmal ausgeführt. Für den Fall, dass im Harz immer noch freie Aminogruppen vorhanden waren, wurde letzteres einige Male mit DMF gewaschen und die Reagenzien in Vergleich zum Beginn noch einmal in halber Menge eingesetzt. Gelegentlich wurde trotz einer Wiederholung der Reaktionen eine unvollständige Kopplung erreicht. Um in der Lage zu sein, diese Synthese ohne anomale Kettenbildung weiterzuführen, war es notwendig, die unvollständigen Ketten durch Acetylierung derjenigen Aminogruppen, die noch frei geblieben waren, zu blockieren. Aus diesem Grund wurde das Harz 30 Minuten mit zwei milliäquivalenten Acetanhydrid und einem Milliäquivalent 4-DMAP für jedes Milliäquivalent Peptidylharz behandelt. Als Nächstes wurde es mit DMF gewaschen und ein Ninhydrintest durchgeführt um das vollständige Verschwinden der Aminogruppen (gelbe Färbung) zu überprüfen.
Der Ninhydrintest wurde in den Fällen durch den Chloranilin Test ersetzt, wo sekundäre Aminogruppen von Aminosäuren wie Prolin gefunden wurden, da Ninhydrin mit den besagten Gruppen nicht reagiert.
BEISPIEL 2: Synthese von Peptiden mit endständigen Aminogruppen.
Die Peptide mit einer endständigen Carboxamidgruppe werden aus dem Harz p-Methylbenzhydrylamin (MBHM) erhalten. Dieses Harz benötigt anfangs eine spezielle Behandlung, welche verschiedene Waschprozesse mit einem sauren Gemisch von DCM/TFA bei 40 % umfasst, das schließlich mit dem Harz 20 Minuten in Kontakt bleibt. Danach wurde es zur Entfernung der Säure 5 mal je 1 Minute mit DCM gewaschen, und zu seiner Neutralisation wurde das Harz mit der basischen Mischung DCM/Diisopropyl-ethylamin (DIEA) bei 5 % Prozent behandelt, bis festgestellt wurde, dass der pH-Wert des Harzes basisch war. Schließlich wurde es noch verschiedene Male mit DCM gewaschen, um das DIEA zu entfernen.
Als Nächstes wurde die Kupplung des sauren Zwischenstücks p-[(R,S)-α[1-9H-Fluor-9-yl)-methoxy-formamid]-2,4-dimethoxybenzyl]-phenoxyessigsäure (AM), mit der geschützten Fmoc-Gruppe durchgeführt, was dazu führte, dass die Sequenz mit der endständigen Aminogruppe versehen wurde. Hierfür wurde das Fmoc-AM in einem 1,5 fachen Überschuss der benötigten Menge eingewogen und zusammen mit den Reagenzien Hydroxybenztriazol (HOBt) und DIPCTI (1:1 molar), ebenfalls im Überschuss zum Harz gegeben und die Reaktion 90 Minuten von selbst ablaufen gelassen. Der Abschluss der Reaktion wurde durch den Kaiser Test oder den Ninhydrintest festgestellt, wobei überprüft wurde, ob die freien Aminogruppe nun vom Harz verschwunden waren. Für den Fall, dass nicht das gesamte Zwischenstück gebunden war, wurde die Reaktion noch einmal durchgeführt, indem die Hälfte der ursprünglichen Mengen an Reagenzien zugefügt wurde. Nachdem sich das Zwischenstück vollständig gebunden war, wurde das Harz mehrere Male mit DMF gewaschen, um überflüssige Reagenzien zu entfernen.
Die Kupplung der verbleibenden Fmoc-Aminosäuren wurde, wie bereits in Beispiel 1 beschrieben, in aufeinander folgenden Schritten der Entfernung der Schutzgruppe von der Aminogruppe und der Amidbindungsformation durchgeführt.
BEISPIEL 3: Entfernung der Schutzgruppe und Freisetzung und des Peptids.
Zur Entfernung der Schutzgruppe von der freien Peptidsequenz, wird zunächst die Fmoc-Gruppe gemäß dem folgenden, in der Tabelle 2 dargestellten Protokoll von der endständigen Aminogruppe befreit.
Tabelle 2: Abspaltung der Schutzgruppe und Freisetzung des Peptids
Bei einigen Synthesen ist das DMF/Piperidin bei 20 % durch das Gemisch DMF/Piperidin/DBU (48:2:2, v/v/v), ersetzt, welches mit dem Peptidylharz sieben Minuten in Kontakt gehalten wird.
Als Nächstes wurden das Peptid vom Harz abgelöst und die Schutzgruppen von den funktionellen Ketten der Aminosäure in einem Schritt entfernt. Um dies zu erreichen, wurden je nach der vorhandenen Schutzgruppe verschiedene TFA-Gemische mit unterschiedlichen Radikalfängern (scavenger) wie Anisol, Thioanisol, Phenol, Mercaptoethanol und Wasser hergestellt. Ein Aliquot des Peptidylharzes wurde in eine mit einem Filter versehene und an ein Vakuumsystem angeschlossene Injektionsspritze eingewogen und das saure Radikalfängergemisch zugegeben und mit dem Harz zwei bis drei Stunden bei Zimmertemperatur unter gelegentlichem Rühren in Kontakt gehalten. Nach Ablauf dieser Zeit wurde das Harz abfiltriert, dreimal mit TFA gewaschen, und das Filtrat und die Waschflüssigkeit in einem Reagenzglas gesammelt. Zuerst wurde das TFA unter Stickstoff evaporiert und dann nach Zusatz von kaltem Diethylether einen weißer Niederschlag erhalten (freies Peptid). Der Nieder schlag wurde bei 3000 UpM 15 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand abgezogen und der Vorgang noch fünfmal wiederholt. Schließlich wurden die Reste von ETA Mittels Stickstoff aus dem Feststoff vertrieben, der dann abhängig von der Löslichkeit des Peptids in Wasser oder zehnprozentiger Essigsäure wieder gelöst und lyophilisiert wurde, um so das rohe, freie Peptidprodukt vollkommen trocken zu erhalten.
BEISPIEL 4: Herstellung hydrophober Derivate der Peptidsequenzen in fester Phase.
Die Fettsäuren wurden durch Ausbildung eines Amids mit der Carboxylgruppe der Fettsäuren in der gleichen Art wie die Fmoc-Aminosäuren an die Sequenzen angekoppelt.
So wurde ein Aliquot des Peptidylharzes in eine mit einem Filter ausgestatteten und an eine Vakuumpumpe angeschlossene Injektionsspritze eingewogen und mit Dimethylformamid gequollen. Dann wurden die Schutzgruppen von der Fmoc-Gruppe entfernt. Nach dem Entfernen der Schutzgruppen wurden zusammen mit den Synthesereagenzien DPCD/HOBI oder, TBTU/DIEA/HOBt je nach der in Frage k_ommenden Peptidsequenz die in jedem Einzelfall verwendeten Fettsäuren in 2,5 fachem Überschuss zugegeben. Die Beendigung der Reaktion wurde durch den Ninhydrintest auf das Verschwinden freier Aminogruppen ebenso festgestellt wie während der Synthese.
Um die freien hydrophoben Derivate zu erhalten, wurde das Peptidylharz mit dem selben sauren Gemisch von TFA und Radikalfängern unter denselben Bedingungen behandelt wie sie anfänglich bei der Abspaltung der Peptidsequenz verwendet wurden.
BEISPIEL 5: Erhalt der Doxorubicin enthaltenden Liposome mit einer lipopeptidbeschichteten Oberfläche des Liposoms:
Ursprünglich und in allen Fällen wurden große mehrschichtige Liposome (MLV), nach der Methode wie sie von Bangham beschrieben worden ist, hergestellt. Aus diesen wurden durch Ultraschallbehandlung die kleinen einschichtigen Liposome (SUV) erhalten.
Das gesamte Material und die angewandten Lösungen waren steril, und die Arbeit wurde während des gesamten Prozesses unter einem Abzug mit laminarer Strömung durchgeführt um den Erhalt der Sterilität zu gewährleisten.
Die mit den hydrophoben Derivaten der zwei aktiven Sequenzen hergestellten Liposome hatten in ihrer Zusammensetzung: Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylglyzerin (PE), Cholesterin und Chroman – 6. Um sie zu erhalten wurden folgende Verfahrensbedingungen übernommen:
So wurden an erster Stelle SUV-Liposome hergestellt. Das PC, PG, Cholesterin, und Chroman-6 wurde gewogen, in Chloroform gelöst und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer abgezogen, um einen flüssigen Film zu erhalten. Irgendwelche noch vorhandeneSpuren des Lösungsmittels wurden durch einstündige Lyophilisation entfernt.
Nach Ablauf dieser Zeit wurde der Film mit 1 ml NaCl von 0,9% hydratisiert, wobei der Klumpen (ball) 1 Stunde in einem Bad von 60 °C gehalten wurde. Zu den erhaltenen MLV-Liposomen wurde eine Lösung mit 1,2 ml Doxorubicin mit einer Konzentration von 2 mg/ml (2,4mg) gegeben. Die Zubereitung wurde in einem Bad von 60°C 15 Minuten ruhen gelassen; dann wurde der Klumpen (ball) in einem Rotationsverdampfer ohne Anlegen eines Vakuums langsam 20 Minuten rotieren gelassen.
Um SUV Liposome zu erhalten, wurden die MLV einer Ultraschallbehandlung in einem Ultraschallbad von acht Zyklen zu jeweils 2 Minuten und durch 5 Minuten dauernde Ruhepausen in einem Bad von 60°C abgetrennt.
Die Einarbeitung der Lipopeptide wurde durch Mischung eines Aliquots und von 200 μl Liposomen, 200 μl NaCl von 0,9% und 12 μl einer Lösung von Lipopeptid in DMSO (c = 10 mg/ml) durchgeführt. Die Mischung wurde bei 60°C eine Stunde und danach bei Raumtemperatur 30 weitere Minuten ruhen gelassen.
Alternativ wurden die Liposome durch Einarbeitung des Lipopeptids von Anfang an zubereitet. Auf diese Weise wurden die PC, PG, Cholesterin und Chroman-6-Lipide im selben Molverhältnis, wie im vorhergehenden Fall, mit einem Aliquot von in Chloroform/Methanol gelöstem Lipopeptid gemischt. Das übrige Verfahren ist mit dem vorhergehenden Verfahren identisch.
Schließlich wurde die Probe in eine PD 10 Säule (Sephadex G-25) gegeben, um das nicht verkapselte Doxorubicin und das nicht eingearbeitete Lipoprotein zu entfernen. Hierfür wurde die Säule zuerst mit 0,9%iger NaCl-Lösung eingefahren. Nach dem Einfahren, wurde die Probe zugegeben, die ebenfalls mit 0,9-%iger NaCl-Lösung bis zum Überlauf der Säule eluiert wurde. Das Volumen der erhaltenen Liposome erreichte bis zu 2 ml.
Nach diesem Verfahren wurden die folgenden Typen von Liposomen durch Einarbeitung von Doxorubicin hergestellt:
BEISPIELE: Erhalt der Paclitaxel enthaltenden Liposome und eine Lipopeptidbeschichtung der Oberfläche des Liposoms:
Ursprünglich und in allen Fällen wurden große mehrschichtige Liposome (MLV), nach der Methode, wie sie von Bangham beschrieben worden ist, hergestellt. Aus diesen wurden durch Ultraschallbehandlung die kleinen einschichtigen Liposome (SUV) erhalten.
Das gesamte Material und die angewandten Lösungen waren steril, und die Arbeit wurde während des gesamten Prozesses unter einem Abzug mit laminarer Strömung durchgeführt um den Erhalt der Sterilität zu gewährleisten.
Die mit den hydrophoben Derivaten der aktiven Sequenzen hergestellten Liposome hatten in ihrer Zusammensetzung: Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylglyzerin (PG),und Cholesterin. Um sie zu erhalten wurden folgende Verfahrensbedingungen übernommen:
So wurden an erster Stelle SUV-Liposome hergestellt. Das PC und das, Cholesterin wurden gewogen, in Chloroform gelöst und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer abgezogen, um einen Lipidfilm zu erhalten. Irgendwelche noch vorhandene Spuren des Lösungsmittels wurden durch einstündige Lyophilisation entfernt.
Nach Ablauf dieser Zeit wurde der Film mit 1 ml 0,9%igem NaCl hydratisiert, wobei der Klumpen (ball) 1 Stunde in einem Bad von 60 °C gehalten wurde. Zu den erhaltenen MLV-Liposomen wurde eine Lösung mit 1,2 ml Paclitaxel mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml (0,6mg) gegeben. Die Zubereitung wurde in einem Bad von 60°C 15 Minuten ruhen gelassen, dann wurde der Bolus (ball) in einem Rotationsverdampfer ohne Anlegen eines Vakuums langsam 20 Minuten rotieren gelassen.
Um SUV Liposome zu erhalten, wurden die MLV einer Ultraschallbehandlung einem Ultraschallbad von acht Zyklen zu jeweils 2 Minuten getrennt durch 5 Minuten dauernde Ruhepausen in einem Bad von 60°C unterworfen.
Die Einarbeitung der Lipopeptide wurde durch Mischung eines Aliquots und von 200 μl Liposomen, 200 μl NaCl von 0,9% und 12 μl einer Lösung von Lipopeptid in DMSO (c = 10 mg/ml) durchgeführt. Die Mischung wurde bei 60°C eine Stunde und danach bei Raumtemperatur 30 weitere Minuten ruhen gelassen.
Alternativ wurden die Liposome durch Einarbeitung des Lipopeptids von Anfang an zubereitet. Auf diese Weise wurden die PC, PG, und Cholesterin Lipide im selben Molverhältnis wie im vorhergehenden Verfahren in Chloroform/Methanol gelöst und mit einem Aliquot des Lipopeptids gemischt. Das übrige Verfahren ist mit dem vorhergehenden Verfahren identisch.
Schließlich wurde die Probe in eine PD-10 Säule (Sephadex G-25) gegeben, um das nicht verkapselte Paclitaxel und das nicht eingearbeitete Lipoprotein zu entfernen. Hierfür wurde die Säule zuerst mit 0,9%iger NaCl-Lösung eingefahren. Nach dem Einfahren, wurde die Probe zugegeben, die ebenfalls mit 0,9-%iger NaCl-Lösung bis zum Überlauf der Säule eluiert wurde. Das Volumen der erhaltenen Liposome erreichte bis zu 2 ml.
Nach diesem Verfahren wurden die folgenden Typen von Liposomen unter Einarbeitung von Paclitaxel hergestellt:
BEISPIEL 7: Versuche zur Zelladhäsion
Lösungen von Laminin-1 und synthetischen Peptiden (50 mg/Well) wurden in Wells einer 96-Well Gewebekulturplatte von TPP (Schweiz) fixiert. Die Wells wurde bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet. Vor deren Gebrauch wurden die Wells dann mit gepufterter (tamponed) Kalzium- und Magnesiumionen-freier Salzlösung gewaschen. Die verbleibenden freien Radikale der Polystyrole wurden unter Verwendung einer 1%igen BSA Lösung geblockt.
Sie wurden kultiviert und mit ⁵¹Cr Zellen eines menschlichen Fibrosarkoms HT 1080 markiert. Die markierten Zellen wurden (1 cpm/Well) in den das Laminin und die synthetischen Peptide enthaltenden Wells gebracht.
Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei 37 °C wurden die nicht gebundenen Zellen durch Waschen entfernt. Die gebundnenen Zellen wurden geglättet und deren Radioaktivität gemessen. Die spezifischen Prozentsätze der ermittelten Bindung wurden in der anliegenden 1 wiedergegeben.
BEISPIEL 8: Die in-vitro Inhibierung der zellularen Bindung an Laminin (Gesamtmolekül) durch Peptide des Laminins.
Gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden HT 1080 mit ⁵¹Cr markierte Zellen (0,32 cm²) cpm/Well) an mit 1 μg Laminin überzogene Wells gebunden. Die gebundenen Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von synthetischen Peptidfragmenten des Laminins inkubiert. Die erhaltenen Ergebnisse werden in der beigefügten 2 dargestellt.
BEISPIEL 9: Der antiproliferative Effekt von Doxorubicinliposomen, der sich gegen die spezifischen Rezeptoren von Lamininpeptiden in Tumorzellen richtet.
Der antiproliverative Effekt von Doxorubicin wurde durch das folgende MTT Verfahren analysiert: Aus exponentiellen Kulturen erhaltene HT 080 Zellen wurden in 0.36 cm²/Well (96-Well Gewebekulturplatten von TPP, Schweiz) mit einer Dichte von 5000 Zellen pro Well ausgesät. Einen Tag später wurden die Zellen gewaschen und rund zwei Stunden mit Liposomen enthaltendem Doxorubicin inkubiert. Die unterschiedlichen Liposomenformulierungen wurden an die gleichen Wirkstoffkonzentrationen angeglichen und der Test wurde in parallelen Wells durchgeführt (wobei die Konzentrationen des Doxorubicins von 0.01 μg/ml bis 10 μg/ml gesteigert wurde). Nach der Inkubation wurden die Zellen fünfmal mit PBS gewaschen und drei Tage in einem vollständigen Medium inkubiert. Nach dieser Zeit wurde zu jedem Well 50 μl PBS mit einem Gehalt von 1 mg/ml von dem TT (Tetrazoliumsalz, Sigma) und sie wurden weitere 4 Stunden inkubiert. Die intrazellularen Kristalle von Fromazan, die aus der Reduktion der Tetrazoliumsalze resultierten und nur in aktiven Zellen vorhanden sind, wurden in DMSO gelöst. Die Anzahl der metabolisch aktiven Zellen wurde durch Messung der Absorption dieser Lösungen in DMSO bei 540 nm geschätzt.
Der Prozentsatz cytostatischer Aktivität wurde gemäß der Formel (A – B)/A × 100, bestimmt, worin A die Absorption von in einem Kontrollmedium inkubierten Tumorzellen und B die Absorption von in Liposomenzubereitungen inkubierten Tumorzellen darstellt.
Die Ergebnisse der resultierenden Cytostase sind in der beigefügten 3 dargestellt, in der:

– die Ergebnisse für die mittlere +/– Standardentwässerung dreier unabhängig und dreifach durchgeführter Experimente wiedergibt;
– Der IC⁵⁰-Wert als Wirkstoffkonzentration, bei der 50%der Zellen im Vergleich zur Kontrollcharge überleben, definiert ist und
– P > 0,05; Student-Test t bedeutet

BEISPIEL 10:
Die Biodistribution von Doxorubicin, welches als freier Wirkstoff oder als Liposomenzubereitung (PC/PG/Chol/Myristoyl-AAAAACYESIKVAVS/Doxorubicin) an tumorbehaftete Tiere verabreicht wurde.
Tiere:
Die Versuche wurden an immunsupprimierten BALB/c-Nacktmäusen der Tierproduktionsfirma IFFA CREDO (Lyons, Frankreich) durchgeführt. Die Tiere wurden in Käfigen mit gleichmäßigem Luftstrom unter pathogenfeien Bedingungen gehalten und wurden im Alter von 8 Wochen für die Versuche eingesetzt.
Bedingungen der Zellkultivierung:
Zellen aus dem menschlichen HT 1080 Fibrosarkom wurden in Ham's F-12 Medium (GIBCO, Grand Island, New York), das mit 10%igem foetalen und mit Natriumpyruvat, nicht-essentiellen Aminosäuren, L-Glutamin und einer Vitaminlösung von GIBCO, Grand Island, NY,angereicherten Rinderserum zum wachsen gebracht. Die Kulturen wurden in Plastikbehältern gehalten und in 5% CO₂/25% Luft bei 37 °C in mit Feuchtigkeit versorgten Behältern inkubiert. Die Zelllinie wurde überprüft um die Abwesenheeit von Mycoplasma sicherzustellen.
Die Tumorzellen wurden aus konfluierenden Kulturen (50 bis 70% Konfluenz) durch Behandlung mit Trypsin (0,25%) und EDTA (0,02%) gewonnen. Die Zellen wurden in einem angereicherten Medium gewaschen und danach in einer Hank Balanced Saline Lösung (HBSS) zur nachfolgenden Injektion resuspendiert. Nur monozelluläre Suspensionen mit einer Lebensfähigkeit von mehr als 90% (ermittelt durch Färbung mit Trypanblau) und wurden für die in-vivo Studien verwendet.
Nachweis der Biodistribution:
HT 108-Zellen mit einer Konzentration von 1 × 107 Zellen/ml HBBS wurden mit dem einem gleichen Volumen von flüssigem Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Bedford,MA) 10 mg/ml vorgemischt. Von der erhaltenen Suspension wurden 0,02 ml unter die Haut der linken Flanke der Mäuse subkutan injiziert. Das Wachstum des Tumors wurde zweimal wöchentlich überwacht. Wenn der Tumor ein Volumen von 1 cm³ (am 25. Tag nach der Injektion der Zellen) erreicht hatte, erhielten die Mäuse eine intravenöse Einzeldosis von Doxorubicin (5 mg/kg) entweder als Liposomen Zubereitungen oder als freie Wirkstoffform. Zu Zeitpunkten nach 30 Minuten, 5 Stunden und 24 Stunden nach der Verabreichung des Wirkstoffs, wurden die Mäuse getötet, und es wurden Proben aus dem Tumor gewebe und dem Plasma entnommen. Die Ergebnisse werden in den nachfolgenden 4 und 5 wiedergegeben.

Claims

Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel, dadurch gekennzeich net, dass diese mit einem Lipopeptid beschichtet sind, das drei Unterstrukturen umfasst: ein Lipidfragment, ein aktives Oligopeptid und ein Oligopeptidzwischenstück zwischen den beiden anderen Fragmenten.
Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipidfragment des beschichtenden Lipopeptids aus Fettsäuren mit einer Kohlenstoffkettenlänge zwischen C6 und C20 besteht.
Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipidfragment des beschichtenden Lipopeptids vorzugsweise Decanoyl, Myristoyl oder Stearoyl ist.
Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das aktive Sequenzfragment des beschichtenden Lipopeptids SIKVAVS ist.
Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligopeptidzwischenstück zwischen dem aktiven Sequenzfragment und dem Lipidfragment des beschichtenden Lipopeptids ein Oligopeptid mit einer Länge zwischen fünf und zehn Aminosäureresten ist.
Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligopeptidzwischenstück zwischen dem aktiven Sequenzfragment und dem Lipidfragment des beschichtenden Lipopeptids eine der folgenden Sequenzen aufweist: AAAAACYE, SSAAACYE oder RKERKECYE.
Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von allen Liposomen ausbildenden Lipiden zu den Arzneimitteln zwischen 20:1 und 2:1 liegt und vorzugsweise 10:1 beträgt.
Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipidbestandteile der Liposomen Phospholipide, die einen sowohl natürlichen als auch synthetischen Ursprung aufweisen, und Cholesterol sind.
Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die vorliegenden Phospholipide vorzugsweise Phosphatidylcholin umfassen, das keine Nettoladung aufweist, wobei ein anderes Phospholipid negativ geladen und vorzugsweise Phosphatidylglycerol ist.
Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis des neutralen zum negativ geladenen Phospholipid zwischen 10:2 und 10:10 und vorzugsweise zwischen 10:7 und 10:10 liegt.
Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Cholesterol bezogen auf die Gesamtmenge an Lipiden zwischen 0 und 50% und vorzugsweise zwischen 35 und 50% liegt.
Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass diese bedarfsweise ein Additiv zur Hemmung der Lipidperoxidation aufweisen.
Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Additive zur Hemmung der Lipidperoxidation Vitamine und deren Derivate wie Vitamin E oder Vitamin-E-acetat, ein für den pharmazeutischen Gebrauch freigegebenes Antioxidationsmittel wie BHT oder Chroman oder Chromen wie 3,4-Dihydrid-2,2-dimethyl-6-hydroxy-7-methoxy-2H-1-benzopyran sind.
Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil des beschichtenden Lipopeptids bezogen auf die Gesamtmenge an Lipiden zwischen 0,1% und 30% und vorzugsweise zwischen 1 % und 15% liegt.
Liposomen einkapselnde antikanzeröse Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass diese eine mittlere Größe zwischen 50 nm und 250 nm aufweisen.
Liposomen nach den Ansprüchen 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die eingekapselten antikanzerösen Arzneimittel nitrierte Senfanaloge wie Cyclophosphamid, Melphalan, Iphosphamid oder Trophosphamid; Ethylenimine wie Thiotepa; Nitrosoharnstoffe wie Carmustin; freigegebene Wirkstoffe wie Temozolomid oder Dacarbazin; Analoga der Antimetaboliten der Folsäure wie Methotrxat oder Raltitrexed; Analoga der Purine wie Thioguanin, Cladribin oder Fludarabin; Analoga der Pyrimidine wie Fluorouracil, Tegafur oder Gemcitabin; Alkaloide von Vinca and Analoga wie Vinblastin, Vincristin oder Vinorelbin; Derivate von Podophyllotoxin wie Etoposid, Texan, Docotaxel oder Paclitaxel; Anthracyclin oder dergleichen wie Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin und Mitoxantron; andere cytotoxische Antibiotika wie Bleomycin und Mitomycin; Platinverbindungen wie Cisplatin, Carboplatin und Oxaliplatin; monoklonale Antikörper wie Rituximab; andere antineoplastische Wirkstoffe wie Pentostatin, Miltefosin, Estramustin, Topotecan, Irinotecan und Bicalutamid.
Verwendung von Liposomen einkapselnden antikanzerösen Arzneimitteln nach den Ansprüchen 1 bis 16 zur Herstellung eines Medikaments zur intravenösen Verabreichung an Menschen oder an andere Säugetiere für die Behandlung von bösartigen Tumoren.