MXPA01005457A - Nuevos agentes de transferencia de los acidos nucleicos composiciones que los contienen y sus usos - Google Patents

Abstract

La presente invenci6n se refiere a agentes de transferencia novedosos, a las composiciones que los contienen y a sus usos para la transferencia in vitro, in vivo o ex vivo de losácidos nucléicos en las células. De manera más precisa, la presente invención se refiere a los agentes de transferencia novedosos de losácidos nucléicos que comprenden un espaciador hidrófobo unido químicamente por una parte a un policatión y por la otra parte a al menos un substituyente hidrófilo.

Description

NUEVOS AGENTES DE TRANSFERENCIA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS, COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN Y SUS USOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a nuevos agentes de transferencia, a las composiciones que los contienen y a sus usos para la transferencia in vitro, in vivo o ex vivo de los ácidos nucleicos en las células.

Antecedentes de la Técnica Con el desarrollo de las biotecnologías, la posibilidad de -transferir eficazmente los ácidos nucleicos en las células se ha vuelto una técnica básica con numerosas aplicaciones biotecnológicas . Se puede tratar de transferir los ácidos nucleicos en las células in vitro, por ejemplo para la producción de proteínas recombinantes, o en el laboratorio para el estudio de la regulación de la expresión de los genes, la clonación de los genes o cualquier otra manipulación que implique el ADN. Se puede tratar igualmente de transferir los ácidos nucleicos en las células in vivo, por ejemplo para la realización de las vacunas, en los estudios de marcación o igualmente en los enfoques Ref.128857 terapéuticos. Se puede aún tratar de la transferencia de los genes en las células tomadas de un organismo, con el objeto de su readministración posterior, por ejemplo para la creación de animales transgénicos. Actualmente, el medio más generalizado para transferir los genes en las células es la utilización de vectores virales. Pero este no está exento completamente de riesgos, varios otros métodos basados en el empleo de los vectores sintéticos han sido propuestos. Estos vectores sintéticos tienen dos funciones principales: formar complejos y compactar el ácido nucleico que se va a transfectar, y promover su paso a través de la membrana plásmica y eventualmente a través de las dos membranas nucleares. Varias familias de vectores sintéticos han sido desarrolladas, como por ejemplo los polímeros o aún los vectores bioquímicos (constituidos de una proteína catiónica asociada con un receptor celular) , pero un progreso importante ha sido sobre todo efectuar la transfección no viral con el desarrollo de los lipofectantes, y más particularmente de los lípidos catiónicos. También se ha puesto en evidencia que los lípidos catiónicos, debido a su carga global positiva, que interfiere espontáneamente con el ADN globalmente negativo, que forma complejos nucleolipídicos capaces de fusionarse con las membranas celulares, y que permite así la liberación intracelular del ADN.

Se han sintetizado así diferentes clases de lípidos catiónicos: los lípidos que llevan un grupo de amonio cuaternario (por ejemplo el DOTMA, DOTAP, DMRIE, DLRIE...), las lipopolia inas como por ejemplo las DOGS, la DC-Chol o aún las lipopoliaminas divulgadas en la solicitud de patente WO 97/18185, los lípidos que asocian a la vez un grupo de amonio cuaternario y una poliamina como la DOSPA, o aún los lípidos que llevan diversas otras entidades catiónicas, especialmente los grupos de amidinio (por ejemplo el ADPDE, el ADODE o los lípidos de la solicitud de patente WO 97/31935) . En efecto, la diversidad estructural de los lípidos catiónicos refleja en parte la observación de la relación de la estructura-actividad. Sin embargo, el empleo de estos vectores sintéticos posee aún numerosas dificultades, y su eficacia todavía tiene que mejorar. Especialmente, sería deseable poder disponer de vectores no catiónicos o menos catiónicos, y esto por diferentes razones: los complejos formados entre el ácido nucleico y los agentes de transferencia, debido a su carga positiva global, tienen la tendencia a ser captados por el sistema reticuloendotelial, lo que induce su eliminación, debido a la carga global positiva de los complejos formados, las proteínas del plasma tienen la tendencia a adsorberse sobre su superficie, y esto conduce a una pérdida de poder de transfección, en un contexto de inyección local, la presencia de una carga global positiva importante impide la difusión de los complejos de los ácidos nucleicos fuera del sitio de administración, porque los complejos se adsorben sobre las matrices extracelulares. Los complejos ya no pueden lograr o llegar así más las células de blanco u objetivo, lo que, como una consecuencia, ocasiona una disminución de la eficacia de la transferencia con respecto a la cantidad de los complejos inyectada, - y por último, numerosos actores del dominio de la transfección no viral de los genes han señalado que los lípidos o los polímeros catiónicos tienen un efecto inflamatorio. Por otra parte, la formulación estable de los vectores sintéticos desarrollados hasta nuestros días de relaciones reducidas de las cargas es generalmente difícil, si no es que imposible, y se ha constatado además que a una relación reducida de las cargas, la eficacia de la transferencia es frecuentemente reducida (Pitard y colaboradores, PNAS USA, 94, pp. 14412-14417, 1997). En todo lo que sigue, "relación de la carga" significa la relación de las cargas positivas del agente de transferencia sobre las cargas negativas del ADN. Esta relación es expresada frecuentemente en nmoles del agente de transferencia por µg del ADN. Son estos problemas a los que los nuevos agentes transfectantes están dirigidos por la solicitante, y que son el objeto que la presente invención se propone resolver. En efecto, su estructura particular forma una ancla hidrófoba conectada por una parte a un policatión que permite la formación de complejos con los ácidos nucleicos y por otra parte al menos una cabeza o extremo hidrófilo que permite disminuir la densidad de la carga global aparente de estos agentes transfectantes con respecto a los lípidos o a los polímeros catiónicos utilizados clásicamente en la transfección no viral. La presencia de al menos una cabeza o extremo hidrófilo crea una clase de «ancla de cargas» por la disminución del potencial zeta de los complejos formados con el ácido nucleico. Así, dichos complejos parecen menos catiónicos en el organismo, con las consecuencias benéficas que se originan de esto. Además, se ha mostrado que los agentes transfectantes según la presente invención son particularmente ventajosos desde el punto de vista fisicoquímico porque los mismos son estables particularmente en el momento de su puesta en contacto con los ácidos nucleicos de relaciones reducidas de la carga.

Descripción Detallada de la Invención Así, un primer objeto de la invención se refiere a los agentes novedosos de transferencia de los ácidos nucleicos que comprenden un espacio hidrófobo unido químicamente por una parte a un policatión y por la otra parte a al menos un substituyente hidrófilo. El policatión permite formar los complejos con los ácidos nucleicos por las interacciones con las cargas catiónicas de los ácidos nucleicos. El espaciador hidrófobo tiene una doble función. El mismo permite que una parte pase a través de las membranas celulares, y por la otra parte, hace viables o disponibles a los complejos formados con los ácidos en el medio biológico. En efecto, el espaciador hidrófobo crea una restricción física sobre los complejos, lo que permite proteger los ácidos nucleicos del medio exterior. La hidrofobicidad necesaria para que los complejos sean viables o estén disponibles puede ser determinada fácilmente por el experto en el arte, por la aplicación de los métodos de búsqueda ordinarios o por el método habitual de los tanteos. Por último, la presencia del o de los substituyentes hidrófilos permite disminuir el potencial zeta de los complejos formados, lo que hace parecer a dichos complejos menos catiónicos en el medio exterior.

En el sentido de la invención, el policatión es una molécula lineal o ramificada policatiónica susceptible de asociarse con los ácidos nucleicos. Se entiende en el sentido de la invención por la asociación con el ácido nucleico, cualquier tipo de enlaces como por ejemplo los enlaces covalentes, las interacciones electrostáticas, las iónicas, los puentes de hidrógeno, etc. De preferencia, el policatión es una poliamina lineal o ramificada, cada grupo amino está separado por uno o varios grupos de metileno. Eventualmente, la poliamina puede estar substituida además por otras funciones catiónicas, por ejemplo por los grupos de amidinio o guanidinio, las guanidinas cíclicas, etc. Se puede tratar especialmente de un policatión tal como el definido en las solicitudes de patente WO 96/17823, WO 97/18185, WO 97/31935, WO 98/54130 o aún WO 99/51585, y más generalmente en toda la literatura que se refiere a las estructuras de los lípidos catiónicos conocidas por el experto en el arte. Según un aspecto preferido de la invención, el policatión representa una poliamina de la fórmula general (II): en la cual: Ri, R2 y R3 representan independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo (CH2)qNR'R" con q que es un número entero que puede variar entre l y ß, esto de manera independiente entre los diferentes grupos Ri, R2 y R3, sobreentendiéndose que al menos uno de Ri, R2 y R3 es diferente de un átomo de hidrógeno, R' y R' ' representan independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo (CH2)qNH2 con q definido como anteriormente, - m representa un número entero comprendido entre 1 y 6, y - n y p representan independientemente entre sí números enteros comprendidos entre 0 y 6, con la condición de que cuando n es superior o igual a 2, m puede tomar valores diferentes y R3 significados diferentes en el seno de la fórmula general (II), y cuando n es igual a 0, al menos uno de los substituyentes Ri y R2 es diferente de un átomo de hidrógeno. Otros policationes posibles pueden ser elegidos igualmente entre la espermina, la espermidina, la cadaverina, la putrescina, la hexametilentetramina (hexamina) , el cloruro de metacrilamidopropil-trimetilamonio (AMBTAC) , el cloruro de 3-acrilamido-3-metilbutiltrimetilamonio (AMBTAC) , las polivinilaminas, las polietileniminas, o aún los ionenos. (Referencias: Barton y colaboradores, Comprehensive Organi c Chemistry, Vol. 2, Ed. Pergamon Press, p. 90; Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, 2/a. Edición, Ed. Wiley Interscience, Vol. 11, p. 489; Mahler y Cordes, Biological Chemistry, Hasper International Edition, p. 124). El espaciador hidrófobo puede tomar estructuras muy variadas desde el momento en que el mismo aporta una hidrofobicidad suficiente para permitir la protección de los ácidos nucleicos y el paso a través de las membranas. Esta hidrofobicidad suficiente puede ser determinada por el experto en la técnica aplicando los métodos de búsqueda ordinarios. Según una variante preferida de la invención, el espaciador hidrófobo está constituido de 2 o 3 cadenas grasas lineales hidrocarbonadas (es decir de entre 10 y 20 átomos de carbono por cadena, y de preferencia de 12, 14, 15, 16, 17, o 18 átomos de carbono por cadena, cada cadena puede ser de longitud diferente) . Según otra variante, el espaciador hidrófobo está constituido de una cadena grasa muy larga lineal hidrocarbo'nada, es decir que comprende entre 20 y 50 átomos de carbono, y de preferencia entre 40 y 50 átomos de carbono y aún más preferentemente entre 44 y 50 átomos de carbono) . Los substituyentes hidrófilos convenientes son elegidos por ejemplo entre los substituyentes de hidroxi, amino, los polioles, los azúcares, o aún los péptidos hidrófilos. Se entiende por poliol cualesquiera moléculas hidrocarbonadas lineales, ramificadas o delicias que comprenden al menos dos funciones hidroxi. Se pueden citar a título de ejemplo el glicerol, el etilenglicol, el propilenglicol, los tetritoles, los pentitoles, los pentitoles cíclicos (o quercitoles) , los hexitoles como el manitol, el sorbitol, los dulcitoles, los hexitoles cíclicos o inositoles etc. (Stanek y colaboradores, The Monosaccharidess Academic Press, pp. 621-655 y pp. 778-855) . Según una variante ventajosa, los agentes de transferencia según la invención comprenden al menos un substituyente hidrófilo que es un azúcar. Se entiende en el sentido de la invención por "azúcar", cualquier molécula constituida de uno o varios sacáridos. Se pueden citar a título de ejemplos los azúcares tales como las piranosas y las furanosas, por ejemplo la glucosa, la mañosa, la rhamnosa, la galactosa, la fructosa, o aún la maltosa, la lactosa, la sacarosa, la sucrosa, la fucosa, la celobiosa, la alosa, la laminarabiosa, la gentiobiosa, la soforosa, la elibiosa, etc. De preferencia, el o los azúcares son elegidos entre la glucosa, la mañosa, la rhamnosa, la galactosa, la fructosa, la lactosa, la sacarosa y la celobiosa. Además, se puede tratar igualmente de los azúcares llamados "complejos", es decir de varios azúcares acoplados covalentemente entre sí, cada azúcar es elegido de preferencia de la lista citada precedentemente. A título de polisacáridos convenientes, se pueden citar el dextrano, la a-amilosa, la amilopectina, los fructanos, los mananos, los xilanos y los arabinanos. Ciertos azúcares preferidos pueden interactuar además con los receptores celulares, como por ejemplo ciertos tipos de lectinas. Más particularmente, los agentes de transferencia según la invención pueden estar representados por la fórmula general (I) : para la cual: - R representa un policatión, - Z representa un átomo de hidrógeno o un átomo de flúor, las diferentes Z son independientes entre sí, y ya sea x e y, independientemente entre sí, representan números enteros comprendidos entre 10 y 22 inclusive, y X e Y, independientemente entre sí, representan un átomo de hidrógeno, un grupo -OAlq o Alq representa un alquilo recto o ramificado que contiene 1 a 4 átomos de carbono, un grupo hidroxi, un grupo amino, un poliol, un azúcar, un péptido hidrófilo o no hidrófilo, o un oligonucleótido, se sobreentiende que al menos uno de los substituyentes X e Y representa un grupo hidrófilo elegido entre los hidroxi, los amino, los polioles, los azúcares, o los péptidos hidrófilos, o x es igual a 0 o 1, y es un número entero comprendido entre 20 y 50, X es ya sea un átomo de hidrógeno o un grupo -OAlq o Alq representa un alquilo recto o ramificado que contiene 1 a 4 átomos de carbono, e Y es un grupo hidrófilo elegido entre los hidroxi, los amino, los polioles, los azúcares, o los péptidos hidrófilos.

En el sentido de la invención, el policatión, los polioles y los azúcares de la fórmula general (I) son tales co o los definidos precedentemente. Los términos x e y están definidos en la fórmula general (I) de manera que tomen cualquier valor comprendido entre 10 y 22 inclusive o entre 20 y 50 inclusive según el caso. De preferencia, x y e, independientemente entre sí, están comprendidos entre 12 y 18 inclusive. Más preferentemente, x e y valen, independientemente entre sí, 14, 15, 16, 17 o 18. Cuando x es igual a 0 o 1, entonces y está comprendido de preferencia entre 30 y 50, o entre 40 y 50. Más preferentemente, y está comprendido entre 44 y 50. Se entiende en el sentido de la invención por "oligonucleótido" las cadenas que contienen uno o varios nucleótidos, desoxinucleótidos, ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos que son unidades monoméricas que se diferencian entre sí por la presencia de las bases que pueden ser elegidas entre la adenina, la guanina, la citosina, la timidina o el uracilo [Véase Lehninger Biochimie, Flammarion Medecine Sciences, 2/a. edición, p. 305-329] . Debido a su propiedad para formar pares de bases, los oligonucleótidos son ampliamente utilizados en biología molecular, por ejemplo como enlazadores (moléculas de enlace) o como sondas. Por otra parte, los oligonucleótidos también pueden ser utilizados bajo la forma de conjugados, es decir unidos o acoplados a una o varias de otras moléculas que tienen propiedades distintas. En calidad de ejemplo, se pueden citar el acoplamiento o unión de un nucleótido con un grupo químico reactivo, con los grupos fluorescentes o quimioluminiscentes, o aún con los grupos susceptibles a favorecer las interacciones intermoleculares de manera que se promueva la entrada en las células. Tales conjugados, descritos en Bioconjugate Chemistry [John Goodchild, Conjugates of Oligonucleotides and modified Oligonucleotides: a Review of their Synthesis and properties, Vol. 1, No. 3, 1990, pp. 165-187], poseen numerosas utilizaciones y ventajas como por ejemplo la capacidad de mejorar la entrada de los complejos en las células, de reducir la tasa de degradación por las nucleasas, de aumentar la estabilidad del complejo relacionado, de seguir desarrollando los oligonucleótidos en un organismo, etc. Así, el o los oligonucleótidos, cuando son injertados sobre los agentes de transferencia según la presente invención, permiten aportar una propiedad suplementaria a dichos agentes de transferencia (por ejemplo propiedades de ubicación como blanco, de marcación, etc.). Los oligonucleótidos pueden ser obtenidos según los métodos clásicos conocidos por el experto en la técnica, e igualmente es posible sintetizar los oligonucleótidos modificados según los métodos descritos en Bioconjugate Chemistry John Goodchild, Conjuga tes of Oligonucleotides and modified Oligonucleotides : a Review of their Synthesis and Properties, Vol. 1, No. 3, 1990, pp. 165-187, o en Tetrahedron, Beaucage y colaboradores, The Synthesis of Modifies Oligonucleotides by the Phosphoramidi teb Approach and Their Applica tion, Vol. 49, No. 28, pp. 6123-6149, 1993. Se entiende en el sentido de la invención por "péptido" las cadenas que contienen uno o varios ácidos aminados unidos entre ellos por los enlaces de naturaleza peptídica [Lehninger Biochimie, Flammarion Medecine Sciences, 2/a. edición] . Se puede tratar de 20 aminoácidos "clásicos", es decir aquellos encontrados habitualmente en la composición de las proteínas (Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina, Prolina, Fenilalanina, Triptófano, Metionina, Acido Aspártico, Glutamina, Lisina, Arginina, Histidina, Glicina, Serina, Treonina, Cisteína, Tirosina, Asparagina, Acido Glutámico) , o bien se puede tratar de los ácidos aminados llamados "raros" como por ejemplo la 4-hidroxiprolina, la desmosina, la 5-hidroxilisina, la N-metil-lisina, la 3-metilhistidina, la isodesmosina, etc. Por último, se puede tratar igualmente de aminoácidos que aparecen en las diferentes células o diversos tejidos bajo la forma libre o combinada y que se derivan en general de los ácidos a-aminados (por ejemplo la ß-alanina, el ácido ?-aminobutírico, la homocisteína, la ornitina, la canavanina, el ácido jenkálico, la ß-cianoalanina, etc.). Tales péptidos pueden permitir por ejemplo, la ubicación como blanco de ciertos tipos celulares. En este contexto, se pueden citar por ejemplo los péptidos RGD o NLS . Se puede tratar igualmente de las secuencias peptídicas que tienen las propiedades de marcación, es decir que permiten la identificación, por ejemplo por las técnicas de análisis como la espectrometría de fluorescencia, la espectrometría infrarroja, la resonancia magnética nuclear (RMN), etc. Se pueden citar por ejemplo a este título las secuencias peptídicas o seudopeptídicas lineales o cíclicas que llevan el epítope Arg-Gly-Asp (Arginina-Glicina-Acido Aspártico) de reconocimiento de los receptores primarios y/o secundarios de las proteínas de adhesión del tipo de las integrinas. Los péptidos según la invención pueden estar substituidos además al nivel de uno o varios de sus grupos funcionales, por ejemplo al nivel del carbóxilo en a, de la función amina en a y/o al nivel de los grupos funcionales de la cadena lateral de cada uno de los aminoácidos. En calidad de ejemplo, se pueden citar las substituciones por los grupos alifáticos saturados o insaturados, lineales, ramificados o cíclicos que contienen 1 a 24 átomos de carbono, tales como por ejemplo los radicales de colesterilo, el araquidonilo o el retinoilo, o aún los grupos mono- o poliaromáticos tales como por ejemplo los derivados de benciloxicarbonilo, el éster bencílico o el dodaminilo substituidos o no. El interés de tales substituciones está dentro del marco de la modificación de las propiedades químicas y eventualmente biológicas de dichos péptidos, por ejemplo con el fin de marcarlos. Cuando dichos péptidos son utilizados en calidad del substituyente hidrófilo, los mismos son elegidos entre los péptidos hidrófilos, es decir los péptidos constituidos únicamente de ácidos aminados hidrófilos o aún aquellos compuestos parcialmente de aminoácidos hidrófilos y cuya composición los hace globalmente hidrófilos. Según una variante preferida de la invención, los grupos Z representan todos átomos de hidrógeno. Según un aspecto más ventajoso particularmente de la invención, los agentes de transferencia son de la fórmula general (III) : para la cual: - R representa un policatión, y - ya sea x e y, independientemente entre sí, representan números enteros comprendidos entre 10 y 22 inclusive, y X e Y, independientemente entre sí, representan un átomo de hidrógeno o un azúcar, se sobreentiende que al menos uno de los substituyentes X e Y representa un azúcar, o x es igual a 0 o 1, y es un número entero comprendido entre 20 y 50, X es un átomo de hidrógeno e Y es un azúcar. En el sentido de la invención, el policatión, los azúcares y x e y en la fórmula general (II) son tales como los definidos precedentemente para la fórmula general (I) . Los agentes de transferencia preferidos más particularmente son de la fórmula general (II) y x e y, independientemente entre sí, representan números enteros comprendidos entre 10 y 22 inclusive, y uno de X e Y representa un átomo de hidrógeno y el otro un azúcar. Según otra variante ventajosa, los agentes de transferencia según la invención son de la fórmula general (III) y x es igual a O, y es un número entero comprendido entre 40 y 50, X representa un átomo de hidrógeno, e Y es un azúcar. Se entiende que la presente invención se refiere igualmente a los isómeros de los productos de la fórmula general (I) cuando los mismos existen, así como a sus mezclas, o sus sales. Especialmente, los compuestos de la invención pueden presentarse bajo la forma de las sales no tóxicas y aceptables farmacéuticamente. Estas sales no tóxicas comprenden las sales con los ácidos minerales (por ejemplo el ácido clorhídrico, sulfúrico, bromhídrico, fosfórico, nítrico) , con los ácidos orgánicos (ácido acético, propiónico, succínico, maléico, hidroximaléico, benzoico, fumárico, metansulfónico u oxálico) , con las bases minerales (sosa, potasa, litina, cal), o con las bases orgánicas (aminas terciarias como la trietilamina, la piperidina, la bencilamina) . Según la invención, la preparación de los productos de la fórmula general (I) se efectúa poniendo en funcionamiento las siguientes etapas: 1) Se prepara en un primer tiempo una cadena de alquilo con x átomos de carbono (x está definido como precedentemente) , que lleva una función hidroxi y una función éster, por la abertura de una lactona correspondiente. La reacción se efectúa generalmente en un alcohol, a pH básico y a una temperatura comprendida entre -10 °C y la temperatura ambiente. A título de ejemplo, el alcohol puede ser el metanol o el etanol. 2) Luego, se fija el grupo X sobre la cadena de alquilo bifuncional obtenido en la etapa precedente. Cuando X representa un azúcar, se efectúa una condensación en un solvente clorado, como por ejemplo el diclorometano o el cloroformo, y en la presencia de un ácido de Lewis, a una temperatura comprendida entre -5 °C y 10 °C. El ácido de Lewis puede ser elegido por ejemplo entre el cloruro de estaño, el cloruro de fierro, el ácido p-toluen sulfónico (tsOH), el trimetilsililtrifluorometan sulfónico (TMStf) , el trifluoruro de boro eterato etc. [Kazunobu Toshima y colaboradores, Recent Progress in O-glicosila tion Methods and i ts Aplica tion to Na tural Products Synthesis, Chem. Rev. 1993, Vol. 93, pp. 1503-1531]. Cuando X representa un grupo peptídico hidrófilo o no, se efectúa una unión peptídica según los métodos clásicos (Bodanski M., Principies and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlarg) o por cualquier método análogo conocido por el experto en la técnica. Especialmente, la reacción se efectúa generalmente en la presencia de una base no nucleófila en los solventes apróticos convenientes, a una temperatura comprendida entre 0 y 100 °C, el pH es ajustado entre 9 y 11. A título de ejemplo, el cloroformo, la dimetilformamida, la metilpirrolidona, el acetonitrilo, el diclorometano, el tolueno o el benceno pueden ser utilizados como el solvente. Las bases no nucleófilas empleadas son preferentemente las aminas terciarias, del carbonato de calcio o del dicarbonato de sodio. Aún más preferentemente, las bases utilizadas son las aminas terciarias como por ejemplo la trietilamina (TEA) o la N-etildiisopropilamina. Ventajosamente, la unión peptídica es efectuada entre 0 y 50 °C, y de preferencia entre 10 y 30 °C. Cuando se desea que X represente un grupo hidroxi, esta etapa no es efectuada. Cuando X representa un grupo amino, la reacción es efectuada por la substitución nucleófila según los métodos clásicos conocidos por el experto en la técnica que permiten obtener una amina a partir de un alcohol. Cuando X representa un grupo -OAlq, se efectúa una alquilación de la función de alcohol según los métodos clásicos conocidos por el experto en la técnica o según los métodos análogos. Por ejemplo, se puede hacer reaccionar un compuesto diazo de la fórmula general Alq-N2 eventualmente en la presencia de un catalizador tal como el HBF4 o del gel de sílice. Se puede operar igualmente en las condiciones de la Reacción de Williamson que consiste en hacer reaccionar en un medio básico un compuesto de la fórmula general Alq-Hal en donde Hai representa un átomo de halógeno tal como el cloro, el bromo o el yodo, sobre la cadena que lleva una función de alcohol. La misma reacción del tipo de Williamson puede ser llevada a cabo igualmente cuando se desea que X represente un poliol. Por último, cuando X representa un oligonucleótido, el mismo es acoplado a la cadena bifuncional según los métodos clásicos conocidos para injertar covalentemente un oligonucleótido. Por ejemplo, dicho oligonucleótido puede ser injertado por la intermediación de un enlazador (molécula de enlace) conveniente. 3) En un tercer tiempo, la función éster presente sobre la cadena bifuncional es hidrolizada en la función acida según los métodos conocidos. Por ejemplo, se puede operar en un medio básico en un alcohol de punto de ebullición elevado, a una temperatura comprendida entre 50 °C y la temperatura de reflujo de la mezcla de la reacción. 4) Luego, una cadena de alquilamina substituida o no de la fórmula general (IV) : H2N-(CH2)y-Y (IV) en la cual y e Y son como se definieron precedentemente, es acoplada o unida al compuesto obtenido en la etapa precedente, según los métodos de unión peptídica clásicos (Bodanski M., Principies of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag) o por cualquier método análogo conocido por el experto en la técnica. Especialmente, la reacción se efectúa generalmente en la presencia de una base no nucleófila en los solventes apróticos convenientes, a las temperaturas comprendidas entre 0 y 100 °C, el pH es ajustado a entre 9 y 11. A título de ejemplo, el cloroformo, la dimetilformamida, el acetonitrilo, el diclorometano, el tolueno o el benceno pueden ser utilizados como el solvente. Las bases no nucleófilas empleadas son preferentemente las aminas terciarias, del carbonato de calcio o del dicarbonato de sodio. Aún más preferentemente, las bases utilizadas son las aminas terciarias como por ejemplo la trietilamina (TEA) o la N-etildiisopropilamina. Ventajosamente, el acoplamiento peptídico es efectuado entre 0 y 50 °C, y de preferencia entre 10 y 30 °C. El grupo de la formula general (IV) está ya sea disponible en el comercio, o puede ser obtenido por la condensación de Y sobre la alquilamina no substituida correspondiente según un método análogo a aquel descrito precedentemente en 2) .

) La amida obtenida en la etapa precedente es reducida en seguida en la amina. Se opera para esto según los métodos clásicos conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, se opera en un solvente orgánico anhidro como el tetrahidrofurano anhidro, por la acción del hidruro de litio y aluminio LiAlH . Otros agentes reductores que pueden ser utilizados son por ejemplo el borano, el borano en el dimetiisulfuro (BH3-SMe2) , el borohidruro de sodio/tetracloruro de titanio (NaBH4, TiCl4), el cloruro de óxido de fósforo sobre Zinc (P0Cl3/Zn), el pentasulfuro de fósforo (PS?o) sobre níquel de Raney, etc. [Richard C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VHC Publishers Inc., 1989]. Se puede operar igualmente por hidrogenación catalítica. Ventajosamente, la reducción se efectúa por la acción del hidruro de litio y aluminio LiAlH4, en el tetrahidrofurano anhidro, a la temperatura de reflujo de la mezcla. Se obtiene así un compuesto de la fórmula general (V) : para la cual X, Y, x e y son como se definieron precedentemente . 6) Por último, en una última etapa, el derivado ácido correspondiente al polication R tal como el definido precedentemente, es unido al compuesto de la fórmula general (IV) obtenido en la etapa precedente, según los métodos de unión peptídica clásicos (Bodanski M. , Principies and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag) o por cualquier método análogo conocido por el experto en la técnica. Especialmente, la reacción se efectúa generalmente en la presencia de una base no nucleófila en los solventes apróticos convenientes, a una temperatura comprendida entre 0 y 100 °C, el pH es ajustado a entre 9 y 11. A título de ejemplo, el cloroformo, la dimetilformamida, la metilpirrolidona, el acetonitrilo, el diclorometano, el tolueno o el benceno pueden ser utilizados como el solvente. Las bases no nucleófilas empleadas son preferentemente las aminas terciarias, el carbonato de calcio o el dicarbonato de sodio. Aún más preferentemente, las bases utilizadas son las aminas terciarias como por ejemplo la trietilamina (TEA) o la N-etildiisopropilamina. Ventajosamente, la unión peptídica es efectuada a entre 0 y 50 °C, y de preferencia a entre 10 y 30 °C. Los derivados ácidos que corresponden al policatión están disponibles comercialmente.

Según otra variante, los agentes transfectantes según la presente invención pueden ser preparados operando de la siguiente manera: 1) Se prepara en un primer tiempo una cadena de alquilo de x átomos de carbono (x está definido como precedentemente), que lleva una función hidroxi y una función éster, por la abertura de una lactona correspondiente. La reacción se efectúa generalmente en un alcohol, a pH básico y a una temperatura comprendida entre -10 °C y la temperatura ambiente. A título de ejemplo, el alcohol puede ser el metanol o el etanol. 2) Luego, se efectúa sobre esta cadena de alquilo bifuncional la unión de una cadena de alquilamina substituida o no de la fórmula general (IV) : H2N-(CH2)y-Y (IV) en la cual y e Y son como se definieron precedentemente en la fórmula general (I). La reacción se efectúa a una temperatura superior al punto de fusión de cada producto, con o sin vacío. La reacción se puede hacer funcionar igualmente a la temperatura de reflujo en la presencia de un solvente alcohólico. A título de ejemplo, el solvente puede ser el metanol o el etanol. Se opera por ejemplo a la temperatura comprendida entre 45 °C y 60 °C. La reacción puede ser llevada igualmente a la temperatura de reflujo de la mezcla en la presencia de un alcohol tal como el metanol en calidad del solvente. Otra alternativa consiste en efectuar la unión del compuesto de la fórmula general (IV) directamente con la lactona (en este caso, la primera etapa de abertura de la lactona no es efectuada) . El grupo de la fórmula general (IV) está ya sea disponible en el comercio, o puede ser obtenida por condensación de Y sobre la alquilamina no substituida correspondiente según un método análogo a aquel descrito anteriormente. 3) la amida bicatenaria bifuncional obtenida es reducida en seguida en la amina. Se opera para esto según los métodos clásicos. Por ejemplo, se opera en un solvente orgánico anhidro como el tetrahidrofurano anhidro, por la acción del hidruro de litio y de aluminio (LiAlH4) . Otros agentes reductores que pueden ser utilizados son por ejemplo el borano, el dimetilo de sulfuro de hidruro de boro (BH3- SMe2) , el borohidruro de sodio/tetracloruro de titanio (NaBH4, TiCl4), el cloruro de óxido de fósforo sobre Zinc (POCl3/Zn), el pentasulfuro de fósforo (P4S?0) sobre níquel de Raney, etc. [Richard C. Larock, Comprehensive Organic Transfor ations, VCH Publishers Inc., 1989]. Se puede operar igualmente por hidrogenación catalítica. Ventajosamente, la reducción es efectuada por la acción del hidruro de litio y aluminio LiAlH4, en el tetrahidrofurano anhidro, a la temperatura de reflujo de la mezcla. Se obtiene así un compuesto de la formula general (VI) : para la cual Y, x e y están definidos como precedentemente, 4) Luego, se condensa el grupo X sobre la amina de la fórmula general (VI) obtenida en la etapa precedente. La condensación es efectuada según los métodos análogos a aquellos descritos precedentemente para la primera vía de síntesis.

) Por último, en una última etapa, el derivado ácido correspondiente al policatión R tal como el definido precedentemente, es unido al compuesto de la fórmula general (VI) obtenido en la etapa precedente, según los métodos de acoplamiento o unión peptídica clásicos (Bodanski M., Principies and Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag) o por cualquier método análogo conocido por el experto en la técnica. Especialmente, la reacción se efectúa generalmente en la presencia de una base no nucleófila en los solventes apróticos convenientes, a una temperatura comprendida entre 0 y 100 °C, el pH es ajustado a entre 9 y 11. A título de ejemplo, el cloroformo, la dimetilformamida, la metilpirrolidona, el acetonitrilo, el diclorometano, el tolueno o el benceno pueden ser utilizados como el solvente. Las bases no nucleófilas empleadas son preferentemente las aminas terciarias, el carbonato de calcio o el dicarbonato de sodio. Aún más preferentemente, las bases utilizadas son de las aminas terciarias como por ejemplo la trietilamina (TEA) o la N-etildiisopropilamina. Venta osamente, la unión peptídica es efectuada a entre 0 y 50 °C, y de preferencia entre 10 y 30 °C. Los derivados ácidos correspondientes al policatión están disponibles comercialmente.

Naturalmente, cuando los substituyentes de X, Y y/o del policatión pueden interferir con la reacción, es preferible protegerlos previamente con los radicales compatibles y pueden ser puestos en su lugar y eliminados sin tocar el resto de la molécula. Se opera para esto según los métodos clásicos conocidos por el experto en la técnica, y especialmente según los métodos descritos en T. W. GREENE, Protective Groups in Organic Synthesis, 2/a. Edición, Wiley-Interscience, en McOMIE, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press (1973), o en Philip J Kocieski, Protecting Groups, Thieme. Por otra parte, cada etapa del procedimiento de preparación puede ser seguido, llegado el caso, de las etapas de separación y de purificación del compuesto obtenido según los métodos conocidos por el experto en la técnica. A título de ejemplo ilustrativo de los agentes de transferencia de los ácidos nucleicos ventajosos según la invención, se pueden citar los compuestos siguientes: OH Otro objeto de la invención se refiere a las composiciones que comprenden un agente de transferencia de los ácidos nucleicos tales como los definidos anteriormente, y de un ácido nucleico. Las cantidades respectivas de cada compuesto pueden ser ajustadas fácilmente por el experto en la técnica en función del agente de transferencia utilizado, del ácido nucleico, y de las aplicaciones deseadas (especialmente del tipo de las células que se van a transfectar) . Se entiende en el sentido de la invención por el "ácido nucleico" tanto un ácido desoxirribonucléico como un ácido ribonucleico. Se puede tratar de secuencias naturales o artificiales, y especialmente del ADN genómico (ADNg) , del ADN complementario (ADNc) , del ARN mensajero (ARNm) , del ARN de transferencia (ARNt), del ARN ribosómico (ARNr) , de las secuencias híbridas o de las secuencias sintéticas o semisintéticas, de los oligonucleótidos modificados o no. Estos ácidos nucleicos pueden ser de origen humano, animal, vegetal, bacteriano, viral, etc. Los mismos pueden ser obtenidos por cualquier técnica conocida por el experto en la técnica, y especialmente por el cernido de los bancos, por la síntesis química, o aún por los métodos mixtos que incluyen la modificación química o enzimáticá de las secuencias obtenidas por el cernido de los bancos. Los mismos pueden ser modificados químicamente.

Cuando se hace referencia más particularmente a los ácidos desoxirribonucléicos, los mismos pueden ser de hebra simple o doble, los mismo que los oligonucleótidos cortos o de las secuencias más largas. En particular, los ácidos nucleicos están constituidos ventajosamente por los plásmidos, los vectores, los episomas, los casetes de expresión, etc. Estos ácidos desoxirribonucléicos pueden llevar un origen de replicación funcional o no en la célula de blanco, uno o varios genes marcadores, secuencias reguladoras de la transcripción o de la replicación, los genes de interés terapéutico, las secuencias antisentido modificadas o no, las regiones de enlace a otros componentes celulares, etc. De preferencia, el ácido nucleico comprende uno o varios genes de interés terapéutico bajo el control de las secuencias de regulación, por ejemplo uno o varios promotores y un terminador transcripcional activo en las células de blanco u objetivo. En el sentido de la invención, se entiende por el gen de interés terapéutico especialmente cualquier gen que codifica para un producto proteico que tiene un efecto terapéutico. El producto proteico así codificado puede ser especialmente una proteína o un péptido. Este producto proteico puede ser exógeno homólogo o endógeno frente a la célula de blanco, es decir un producto que normalmente es expresado en la célula de blanco cuando la misma no presenta ninguna patología. En este caso, la expresión de una proteína permite por ejemplo reducir el efecto de una expresión insuficiente en la célula o la expresión de una proteína inactiva o activa de manera reducida en razón de una modificación, o aún de sobreexpresar dicha proteína. El gen de interés terapéutico puede así codificar para un mutante de una proteína celular, que tiene una estabilidad aumentada, una actividad modificada, etc. El producto proteico puede igualmente ser heterólogo frente a la célula de blanco. En este caso, una proteína expresada puede completar o aportar por ejemplo una actividad deficiente en la célula, lo que permite luchar contra una patología, o estimular una respuesta inmunitaria. Entre los productos terapéuticos en el sentido de la presente invención, se pueden citar más particularmente las enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfocínas; las interleucinas, las interferonas, el TNF, etc. (FR 92/03120), los factores de crecimiento, los neurotransmisores o sus precursores o las enzimas de síntesis, los factores tróficos (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofina, etc.), las apolipoproteínas (ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc., FR 93/05125), la distrofina o una minidistrofina (FR 91/11947), la proteína CTFR asociada a la mucoviscidosa, los genes supresores de los tumores (p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc., FR 93/04745), los genes que codifican los factores implicados en la coagulación (Factores VII, VIII, IX), los genes que intervienen en la reparación del ADN, los genes suicidas (timidina cinasa, citosina desaminasa) , los genes de la hemoglobina u otros transportadores proteicos, las enzimas del metabolismo, el catabolismo, etc. El ácido nucleico de interés terapéutico puede ser igualmente un gen o una secuencia antisentido, cuya expresión en la célula de blanco permite controlar la expresión de los genes o la transcripción de los ARNm celulares. Tales secuencias, por ejemplo, pueden ser transcritas en la célula de blanco en los ARN complementarios del ARNm celulares y bloquear así su traducción en proteína, según la técnica descrita en la patente EP 140 308. Los genes terapéuticos comprenden igualmente las secuencias que codifican las ribozimas, que son capaces de destruir selectivamente los ARN de blanco (EP 321 '201). Como se indicó anteriormente, el ácido nucleico puede llevar igualmente uno o varios genes que codifican para un péptido antigénico, capaz de generar en el hombre o en el animal una respuesta inmunitaria. En este modo particular de puesta en funcionamiento, la invención permite la realización ya sea de vacunas o de tratamientos inmunoterapéuticos aplicados al hombre o al animal, especialmente contra los microorganismos, de los virus o de los cánceres. Se puede tratar especialmente de los péptidos antigénicos específicos del virus de Epstein Barr, del virus de VIH, del virus de la hepatitis B (EP 185 573), del virus de la seudo-rabia, del "virus formador de sincitios", de otros virus o aún de péptidos antigénicos específicos de los tumores (EP 259 212) . Preferentemente, el ácido nucleico comprende igualmente las secuencias que permiten la expresión del gen de interés terapéutico y/o del gen que codifica el péptido antigénico en la célula o el órgano deseado. Se puede tratar de secuencias que son responsables de manera natural de la expresión del gen considerado cuando estas secuencias son susceptibles de funcionar en la célula infectada. Se puede tratar igualmente de las secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o también sintéticas) . Especialmente, se puede tratar de secuencias promotoras de los genes eucariotas o virales. Por ejemplo, se puede tratar de secuencias promotoras salidas del genoma de la célula que se desea infectar. De la misma manera, se puede tratar de secuencias promotoras salidas del genoma de un virus. A este respecto, se pueden citar por ejemplo los promotores de los genes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. Además, estas secuencias de la expresión pueden ser modificadas por la adición de secuencias de activación, de regulación, etc. Se puede tratar también del promotor, inducible o represible.

Por otra parte, el ácido nucleico puede llevar igualmente, en particular río arriba del gen de interés terapéutico, una secuencia de la señal que dirige el producto terapéutico sintetizado en las vías de secreción de la célula de blanco. Esta secuencia de la señal puede ser la secuencia dé la señal natural del producto terapéutico, se puede tratar igualmente de cualquier otra secuencia de la señal funcional, o de una secuencia de la señal artificial. El ácido nucleico puede llevar igualmente una secuencia de la señal que dirige el producto terapéutico sintetizado hacia un comportamiento particular de la célula. Las composiciones según la invención pueden llevar además uno o varios auxiliares capaces de asociarse a los complejos del agente de transferencia/ácido nucleico y de mejorar el poder transfectante. En otro modo de puesta en funcionamiento, la presente invención se refiere así a las composiciones que comprenden un ácido nucleico, un agente de transferencia de los ácidos nucleicos tal como el definido anteriormente y al menos un auxiliar capaz de asociarse a los complejos del agente de transferencia/ácido nucleico y de mejorar el poder transfectante. La presencia de este tipo de auxiliar (los lípidos, los péptidos o las proteínas por ejemplo) puede permitir aumentar venta osamente el poder transfectante de los compuestos. Desde este punto de vista, las composiciones de la invención pueden comprender a título de auxiliar, uno o varios lípidos neutros. Mas preferentemente, los lípidos neutros utilizados en el marco de la presente invención, son los lípidos de dos cadenas grasas. De manera particularmente ventajosa, se utilizan los lípidos naturales o sintéticos, zwitteriónicos o desprovistos de carga iónica en las condiciones fisiológicas. Los mismos pueden ser elegidos más particularmente entre la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) , la oleoilpalmitoilfosfatidiletanolamina (POPE), la distearoil, -palmitoil, -miristoilfosfatidiletanolaminas así como sus derivados N-metilados 1 a 3 veces, los fosfatidilgliceroles, los diacilgliceroles, los glicosildiacilgliceroles, las cerebrosidas (tales como especialmente las galactocerebrosidas) , los esfingolípidos (tales como especialmente las esfingomielinas) o aún las asialogangliosidas (tales como especialmente las asialoGMl y GM2) . Estos diferentes lípidos pueden ser obtenidos ya sea por síntesis, o por la extracción a partir de los órganos (ejemplo: el cerebro) o los huevos, por las técnicas clásicas bien conocidas por el experto en la técnica. En particular, la extracción de los lípidos naturales puede ser realizada por medio de los solventes orgánicos (véase igualmente Lehninger, Biochemistry) .

Más recientemente, la solicitante ha demostrado que es igualmente ventajoso de manera particular emplear en calidad de auxiliar, un compuesto que interviene o no directamente al nivel de la condensación de dicho ácido nucleico, tales como aquellos descritos en la solicitud de patente WO 96/25508. La presencia de tal compuesto, en el seno de una composición según la invención, permite reducir la cantidad del agente transfectante, con las consecuencias benéficas que se derivan sobre el plano toxicológico, sin llevar algún prejuicio contra la actividad transfectante. Por el compuesto que interviene al nivel de la condensación del ácido nucleico, se entiende definir un compuesto compactante, directamente o no, del ácido nucleico. De manera más precisa, este compuesto puede hacerse reaccionar directamente al nivel del ácido nucleico que se va a transfectar ya sea para intervenir al nivel de un compuesto anexo que está implicado directamente en la condensación de este ácido nucleico. De preferencia, se trata directamente al nivel del ácido nucleico. Especialmente, el agente precompactante puede ser cualquier policatión, por ejemplo la polilisina. Según un modo de realización preferido, el agente que interviene al nivel de la condensación del ácido nucleico derivado totalmente o en parte de una protamina, de una histona, o de una nucleolina y/o de uno de sus derivados. Uno de tales agentes puede estar constituido igualmente, de manera total o parcial, de las porciones peptídicas (KTPKKAKKP) y/o (ATPAKKAA) , el número de las porciones puede variar entre 2 y 10. En la estructura del compuesto según la invención, estas porciones pueden ser repetidas de manera continua o no. Es así que los mismos pueden ser separados por las ligaduras o enlaces de naturaleza bioquímica, por ejemplo por uno o varios aminoácidos, o de naturaleza química. Preferentemente, las composiciones de la invención comprenden de 0.01 a 20 equivalentes del auxiliar para un equivalente del ácido nucleico en mol/mol y, más preferentemente, de 0.5 a 5. En un modo de realización particularmente ventajoso, las composiciones según la presente invención comprenden además un elemento de ubicación como blanco que permite orientar la transferencia del ácido nucleico. Este elemento de ubicación como blanco puede ser un elemento de ubicación como blanco extracelular que permite orientar la transferencia del ADN hacia ciertos tipos celulares o ciertos tejidos deseados (células tumorígenas, células hepáticas, células hematopoyéticas) . Se puede tratar igualmente de un elemento de ubicación como blanco intracelular que permite orientar la transferencia del ácido nucleico hacia ciertos compartimientos celulares privilegiados (mitocondrias, anillos, etc.). El elemento de ubicación como blanco puede estar unido al agente de transferencia de los ácidos nucleicos según la invención, o igualmente al ácido nucleico como ya ha sido precisado precedentemente. Cuando el elemento de ubicación como blanco está unido al agente de transferencia de los ácidos nucleicos de la fórmula general (I), el mismo constituye de preferencia uno de los substituyentes X o Y.- Entre los elementos de ubicación como blanco que se pueden utilizar en el marco de la invención, se pueden citar los azúcares, los péptidos, las proteínas, los oligonucleótidos, los lípidos, los neuromediadores, las hormonas, las vitaminas o sus derivados. Preferentemente, se trata de los azúcares, de los péptidos o de las proteínas tales como los anticuerpos o los fragmentos de los anticuerpos, los ligandos de los receptores celulares o los fragmentos de los mismos, de los receptores o de los fragmentos de los receptores, etc. En particular, se pude tratar de ligandos de los receptores de los factores de crecimiento, de ' los receptores de citocinas, de los receptores del tipo de las lectinas celulares, o de los ligandos" de la secuencia RGD con una afinidad hacia los receptores de las proteínas de adhesión como las integrinas. Se pueden citar igualmente los receptores de la transferrina, de los HDL y de los LDL, o el transportador del folato. El elemento de ubicación como blanco puede ser igualmente un azúcar que permite ubicar como blanco las lectinas tales como los receptores a las asialoglicoproteínas o a los compuestos sialilados tales como el sialilo de Lewis X, o aún un fragmento Fab de los anticuerpos, o uno de los anticuerpos de cadena simple (ScFv) . La asociación de los elementos de ubicación como blanco a los complejos nucleolipídicos puede ser efectuada por cualquier técnica conocida por el experto en el arte, por ejemplo por la unión a una parte hidrófoba o a una parte que interactúa con el ácido nucleico del agente de transferencia según la invención, o aún a un grupo que interactúa con el agente de transferencia según la invención o con el ácido nucleico. Las interacciones en cuestión pueden ser, según un modo preferido, de naturaleza iónica o covalente. La invención tiene igualmente por objeto la utilización de los compuestos tales como los definidos anteriormente para la transferencia de los polinucleótidos (y más generalmente de los polianiones) en las células in vi tro, in vivo o ex vivo. De manera más precisa, la presente invención tiene por objeto la utilización de los compuestos tales como los definidos anteriormente para la preparación de un medicamento destinado a tratar las enfermedades, en particular las enfermedades que resultan de una deficiencia en un producto proteico o nucleico. El polinucleótido contenido en dicho medicamento codifica dicho producto proteico o nucleico, o constituye dicho producto nucleico, apto para corregir dichas enfermedades in vivo o ex vivo. Para las utilizaciones in vivo, por ejemplo en terapia o para el estudio de la regulación de los genes o de la creación de los modelos animales de las patologías, las composiciones según la invención pueden ser formuladas con el objeto de las administraciones por la vía tópica, cutánea, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, infraocular, transdérmica, intratraqueal, intraperitoneal, etc. De preferencia, las composiciones de la invención contienen un vehículo aceptable farmacéuticamente para una formulación inyectable, especialmente para una inyección directa al nivel del órgano deseado, o para una administración por la vía tópica (sobre la piel y/o la mucosa) . Se puede tratar en particular de soluciones estériles, isotónicas, o de las composiciones secas, especialmente liofilizadas, las que, por la adición según el caso de agua esterilizada o del suero fisiológico, permiten la constitución de solutos inyectables. Las dosis de ácidos nucleicos utilizados para la inyección así como el número de las administraciones pueden ser adaptadas en función de diferentes parámetros, y especialmente en función del modo de administración utilizado, de la patología relacionada, del gen que se va a expresar, o aún de la duración del tratamiento deseado. En lo que se refiere más particularmente al modo de administración, se puede tratar ya sea de una inyección directa en los tejidos, por ejemplo al nivel de los tumores, o en las vías circulatorias, o de un tratamiento de las células en el cultivo seguido de su reimplante in vivo, por inyección o injerto. Los tejidos relacionados en el marco de la presente invención son por ejemplos los músculos, la piel, el cerebro, los pulmones, la piel, el bazo, la médula ósea, el timo, el corazón, la linfa, la sangre, los huesos, los cartílagos, el páncreas, los ríñones, la vejiga, el estómago, los intestinos, los testículos, los ovarios, el recto, el sistema nervioso, los ojos, el glande, los tejidos conjuntivos, etc. Otro objeto de la presente invención se refiere a un método de tratamiento del cuerpo de un ser humano o animal que comprende las siguientes etapas: (1) poner en contacto el ácido nucleico con una agente de transferencia tal como el definido anteriormente, para formar un complejo, y (2) la puesta en contacto de las células del cuerpo humano o del animal con el complejo formado en (1) .

La invención se refiere además a un método de transferencia de los ácidos nucleicos en las células que comprende las siguientes etapas: (1) poner en contacto el ácido nucleico con una agente de transferencia tal como el definido anteriormente, para formar un complejo, y (2) la puesta en contacto de las células con el complejo formado en (1) .

La puesta en contacto de las células con el complejo puede ser realizada por la incubación de las células con dicho complejo (para las utilizaciones in vitro o ex vivo) , o por la inyección del complejo en un organismo (para las utilizaciones in vivo) . La incubación es realizada de preferencia en la presencia por ejemplo de 0.01 a 1000 µg del ácido nucleico para 106 células. Para la administración in vivo, las dosis del ácido nucleico que tienen de 0.01 a 10 mg pueden ser utilizadas por ejemplo. En el caso en donde las composiciones de la invención contienen además uno o varios auxiliares tales como los definidos precedentemente, el o los auxiliares son mezclados previamente con el agente de transferencia según la invención y/o con el ácido nucleico. La presente invención proporciona así un método particularmente ventajoso para la transferencia de los ácidos nucleicos in vivo, especialmente para el tratamiento de las enfermedades, que comprende la administración in vivo o in vitro de un ácido nucleico que codifica una proteína o que • puede ser transcrita en un ácido nucleico apto para corregir dicha enfermedad, el ácido nucleico está asociado a un compuesto de la fórmula general (I) en las condiciones definidas anteriormente. Los agentes de transferencia de los ácidos nucleicos de la invención son particularmente útiles para la transferencia de los ácidos nucleicos en las células primarias o en las descendencias establecidas. Se puede tratar de células fibroblásticas, musculares, nerviosas (neuronas, astrocitos, células guales), hepáticas, hematopoyéticas (linfocitos, CD34, dendríticas, etc.), epiteliales etc., bajo las formas diferenciadas o pluripotentes (precursores) . Además de las disposiciones precedentes, la presente invención comprende igualmente otras características y ventajas que resultarán de los ejemplos y las Figuras que siguen, y que deben ser consideradas como ilustrativas de la invención sin limitar el alcance. Especialmente, la solicitante propone a título no limitativo diversos protocolos operativos así como los intermediarios de la reacción susceptibles de ser utilizados para preparar los agentes de transferencia de la fórmula general (I). Por supuesto, está al alcance del experto en la técnica inspirar estos protocolos o productos intermedios para poner a punto los procedimientos análogos para conducir a estos mismos compuestos. Corresponde igualmente al experto en la técnica inspirar los procedimientos de síntesis descritos en las diferentes solicitudes de patente citadas precedentemente para la síntesis del policatión R comprendido en la fórmula general (I) (WO 96/17823, WO 97/18185, WO 97/31935, etc.).

Breve descripción de las Figuras Figura 1 : la representación esquemática del plésmido pXL2774 utilizado en las experiencias de transferencia del ADN en las células .

Figura 2: la actividad de transferencia del gen in vitro en las células HeLa de los complejos formados a partir del compuesto 2 según la invención sin el co-lípido, o bien en la presencia del colesterol y en la presencia del DOPE como los co-lípidos. El eje de las ordenadas representa la expresión de la luciferasa en pg/cavidad. El eje de las abcisas indica la relación del agente transfectante/ADN en nmoles/µg del ADN .

Figura 3: actividad de transferencia del gen in vivo después de la inyección directa en el músculo anterior de las tibias de los ratones de los complejos formados a partir del compuesto 2 según la presente invención en la presencia de DOPE (1 : 1) . El eje de las ordenadas indica la expresión de la luciferasa en pg/músculo. El eje de las abcisas indica la relación del compuesto 2/ADN en nmoles/µg del ADN.

EJEMPLOS A/MATERIAL Y MÉTODOS A) Material U las poliaminas de partida, como la espermidina, la espermina, la tris- (2-aminoetil) amina, la fenilendiamina, los diaminoalcanos, etc., están disponibles comercialmente o las mismas pueden ser sintetizadas por los métodos clásicos (por ejemplo por cianoetilación de las aminas disponibles en el comercio para obtener las aminas ramificadas) numerosos compuestos como por ejemplo la trietilamina, el hexafluorofostato de benzotriazol-1- iloxitris (dimetilamino) fosfonio (BOP), el cloroformiato de bencilo, el 11-bromoundecanol, etc., son igualmente productos comerciales. B La Amberlita IR 120 es una resina intercambiadora de iones comercial (catálogo BDH) . B El sulfóxido de dimetilo (DMSO) , tratado previamente con el hidróxido de potasio, ha sido destilado sobre hidruro de calcio luego almacenado sobre los tamices moleculares de 4 Á. El diclorometano ha sido destilado sobre el pentóxido de fósforo luego almacenado sobre los tamices moleculares de 4 Á. El tetrahidrofurano (THF) ha sido destilado sobre el sodio en la presencia de la benzofenona. Para las reacciones que necesitan las condiciones anhidras, todo el material de vidrio es secado a la flama bajo corriente de nitrógeno. b) Métodos - Análisis espectroscópicos Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) han sido registrados sobre un espectrómetro Brucker MSL 30 a la frecuencia de 300 MHz para el protón y 75 MHz para el carbono. Todos los desplazamientos químicos son reportados en ppm ya sea con relación a la frecuencia del tetrametilsilano (TMS), o con relación al solvente. Los espectros han sido registrados utilizando ya sea el TMS o la señal residual del solvente como referencia interna. La multiplicidad de las señales está designada por las abreviaturas siguientes: s (singlete), d (doblete), t (triplete), q (cuadruplete) y m (multiplete) .

- Técnicas de cromatografía B La cinética de las reacciones ha sido seguida por cromatografía sobre capa delgada (CCM) con un gel de sílice que contiene un indicador fluorescente (Merck Silicagel 60 F254) como soporte. Los cromatogramas han sido revelados por la pulverización de una solución alcohólica del anisaldehído.

Todas las cromatografías sobre la columna han sido realizadas bajo presión de aire comprimido con silicagel 60 como la fase estacionaria (0.05-0.02 mm) . La fase móvil empleada difiere según el tipo de la síntesis (cromatografía de presión intermedia) .

B Los análisis de CLAR (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) son realizados sobre un aparato Waters LC 4000 equipado de una columna analítica . del tipo C4 comercializada por Applied Biosystem ("Brownlee Columns" de acero inoxidable de 3 cm de longitud y 0.46 cm de diámetro) y de un detector "Waters 486" a 220 nm. La fase estacionaria es de aquapore butilo de 7 mieras, y las fases móviles son de agua desmineralizada (2500 cm ) o de acetonitrilo (2500 cm3) adicionadas con ácido trifluoroacético (2.5 cm3) . El caudal es de 1 mi por minuto.

B/SINTESIS DE LOS AGENTES DE TRANSFECCION Ejemplo 1: sintesis de la a-D-ptanopiranosida del (3-[4-(3-amino-propil-amino) -butil-amino] -metilen-carbamoil) -15-per?tadecanil-16-octadecilo (Compuesto 1) a) Sintesis del ácido 3- [4- (3-tßr-butoxicarbonil-amino- propil-ter-b toxicarbonil-amino) -butil-ter-butoxicarbonil- amino] acético (FM 375) A una solución de espermina (5 g; 24.96 mmoles) en metanol (125 mi), se agrega cianoborohidruro de sodio NaBH3CN (0.548 g; 8.74 mmoles). La solución es sometida en seguida a una agitación vigorosa. Por la intermediación de una ampolla isóbara, se agrega durante 100 minutos una solución del ácido glioxílico (2.34 g; 25.46 mmoles) en metanol (80 mi). Después de una noche, se agrega a la mezcla la trietilamina (3.86 mi; 27.71 mmoles) y el dicarbonato de di-ter-butilo (27.67 g; 129.79 mmoles) solubilizado en tetrahidrofurano (55 mi). Después de una noche, se concentra en el evaporador giratorio luego se recibe en acetato de etilo (63 mi) y se efectúa un lavado con sulfato ácido de potasio y salmuera. Luego se seca sobre sulfato de magnesio y se concentra. El producto obtenido es purificado por cromatografía (CH2Cl2/MeOH 9:1). El rendimiento es del 30%.

XH RMN (CDC13) : d (ppm) 1.42 (s, 36H, C(CH3)3), 1.45 (m, 4H, CH2), 1.60 (m, 4H, CH2) , 3.04-3.33 (m, 12H, CH2) , 3.91 (s, 2H, NCH2COO) . b) Sintesis del 15-hidroxipentadecanoato de metilo A 10 g de la pentadecalactona (41.60 mmoles) en 41.60 cm3 de metanol, se agregan 6.66 cm3 de metilato de sodio 2N (13.31 mmoles) a 0 °C. Después de 9 horas, se agregan 9.24 cm3 de ácido acético y se deja reaccionar durante 15 minutos. Luego se evapora la solución bajo vacío en seco, se recibe en seguida en diclorometano, y se efectúa un lavado con bicarbonato de sodio. Se seca la fase orgánica obtenida con sulfato de magnesio y se evapora el solvente en el evaporador giratorio. La purificación se hace en una mezcla de hexano/acetato de etilo 6:4. Se obtiene el l-ol-pentadecanoato de metilo con un rendimiento del 80 %. lH RMN (CDCI3) : d (ppm) 1.26 (m, 12H, (CH2)?o), 1.5-1.6 (m, 4H. H-2 y H-l3). 2.30 (t, 2H, J= 7.60 Hz, H-l4), 3.64 (t, ÍH, J= 5.84 Hz, H-l), 3.67 (s, 3H, H-l6). c) Sintesis de la 2 ,3,4 , 6-tetra-O-acetil-a-D-manopiranosida del pentadecanoato de metilo A 0 °C, se agregan 5.26 cm3 del cloruro de estaño (44.94 mmoles) a 8.72 g de mañosa pentaacetilada (22.47 mmoles) en 56 cm3 de diclorometano durante 30 minutos. Luego se agregan 7.34 g de l-ol pentadecanoato de metilo obtenido precedentemente en a) (26.96 mmoles). Después de 2 horas, la mezcla de la reacción es diluida con éter etílico y se vierte en una solución de fosfato ácido de sodio (NaHP04) . Las frases acuosas son extraídas con éter dietílico y las fases orgánicas son lavadas sucesivamente con una solución de carbonato de potasio, de salmuera, luego se secan sobre sulfato de magnesio. El producto obtenido después de la evaporación bajo vacío en seco es purificado por cromatografía de presión intermedia en una mezcla de heptano/acetato de etilo 7:3. El rendimiento es del 53%.

!H RMN (CDC13) : d (ppm) 1.26 (m, 20H, (CH2)?o), 1.59 (m, 4H, OCH7CH7 y H-13), 2.01, 2.05, 2.12 y 2.17 (s, 3H, OCOCH3), 2.29 (t, 2H, J= 7.62 Hz, H-l 4), 3.40 (m, ÍH, J= 7.89 Hz, OCHaCH2), 3,66 (m, ÍH, J= 7.89 Hz, OCHDCH2), 3,67 (s, 3H, COOCH3), 4.05 (ddd, ÍH, J= 9.56 Hz y 5.57 Hz, H-5), 4.1 (dd, ÍH, J= 5.57 Hz y 12.32 Hz, H-6a), 4.29 (dd, ÍH, J= 5.57 Hz y 12.32 Hz, H-6b), 4.8 (d, ÍH, J= 1.85 Hz, H-l), 5.23 (dd, ÍH, J= 1.85 Hz y 3,23 Hz. H-2), 5.27 (dd, ÍH, J= 9.97 Hz y 9.56 Hz, H-4), 5,35 (dd, ÍH, J= 9.97 Hz y 3.23 Hz, H-3). d) Sintesis de la a-D-manopiranosida del pentadecanoato de metilo Se tratan 3.63 g del producto obtenido en la etapa precedente (6.01 mmoles) en solución en 12 cm3 de metanol con 3 cm3 de metilato de sodio 2N (6.01 mmoles). Cuando se termina la reacción, se neutraliza esta última con la Amberlita IR120 (1 equivalente en peso/volumen), se filtra y se evapora en seco bajo vacío. lH RMN (CDC13) : d (ppm) 1.28 (m, 20H, (CH2)10), 1.59 (m, 4H, OCH CH y H-13), 2.34 (t, 2H, J= 7.62 Hz, H-14), 3.41 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHaCH2), 3.74 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHbCH2), 3.67 (s, 3H, CH3OCO), 3.5-3,82 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5 Y H-6), 4.75 (d, ÍH, J= 1.82 Hz, H-l). e) Sintesis de la 2,3,4,6-tetra-O-bencil-a-D-manopiranosida del pentadecanoato de metilo A 2 g (4.56 mmoles) del producto obtenido en la etapa precedente d) en solución en 20 cm3 de dimetilformamida anhidra (DMF), se agregan sucesivamente 4.54 g de yoduro de potasio (27.36 mmoles), 1.09 g de hidruro de sodio al 60% (27.36 mmoles) y 3.25 cm3 de bromuro de bencilo (27.36 mmoles). Después de 12 horas, se agregan 18.24 cm3 de una solución saturada de cloruro de amonio, y se deja agitar durante 10 minutos. Luego, se diluye con agua y se extrae la fase orgánica con acetato de etilo. La misma es lavada en seguida con agua y salmuera, y finalmente se seca con sulfato de magnesio. Se efectúa por otra parte un lavado suplementario con una solución saturada de tiosulfato de sodio a fin de eliminar los iones yoduro. Se evapora bajo vacío y se purifica el aceite restante en una mezcla de heptano/acetato de etilo 9:1. El producto es obtenido con un rendimiento del 60%.

*H RMN (CDC13) : d (ppm) 1.28 (m, 20H, (CH2)10), 1,49 (m, 2H, OCH?CH?), 1.59 (m, 2H, H-13), 2.31 (t, 2H, J= 7.62 Hz, H-14), 3.34 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHaCH2), 3.63 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHbCH2), 3.67 (s, 3H, CH3OCO), 3.75 (m, ÍH, J= 8.97 Hz y 6.21 Hz, H-5), 3.78 (s, 2H, CH^Phe), 3.90 (dd, 1H, J= 6.21 Hz y J= 11.82 Hz, H-6a), 3.97 (dd, 1H, J= 6.21 Hz y J= 11.82 Hz, H-6b), 4.07 (s, 2H, CH?Phe), 4.52 (dd, J= 2.91 Hz y 7,83 Hz, H-3), 4.57 (s, 2H, CH^Phe), 4.63 (s, 2H, CH^Phe), 4.69 (dd, ÍH, J= 2.52 Hz y 2.91 Hz, H-2), 4.74 (1H, J= 2.52 Hz, H-l), 4.85 (dd, ÍH, J= 7.83 Hz y 8.97 Hz, H-4), 7.35 (m, 20H, Phe). f) Sintesis de la 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O-bencil-a-D-manopiranosida del ácido pentadecanóico A 0.50 g (0.73 mmoles) del producto obtenido en la etapa precedente e) en solución en 7 cm3 de metanol, se agregan 4.68 cm3 de una solución de sosa al 25%. La mezcla de la reacción se calienta a reflujo durante 30 minutos. Luego, se neutraliza la mezcla en frío con una solución del ácido clorhídrico al 5 % . Se extrae la fase orgánica con acetato de etilo, y se evapora en seco bajo vacío. La purificación se hace en una mezcla de heptano/acetato de etilo 4:6. El producto es obtenido con un rendimiento del 62 % .

*H RMN (CDC13) : d (ppm) 1.28 (m, 20H, (CH2)10), 1.49 (m, 2H, OCH2CH?), 1.59 (m, 2H, H-13), 2.34 (t, 2H, J= 7.62 Hz, H-14), 3.34 (m, ÍH, 6.71 Hz, OCHaCH2), 3.63 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHbCH2), 3.75 (m, ÍH, J= 8.97 Hz y 6.21 Hz, H-5), 3.78 (s, 2H, CT^Phe), 3.90 (dd, ÍH, J= 6.21 Hz y J= 11,82 Hz, H-6a), 3.97 (dd, ÍH, J= 6.21 Hz yJ= 11.82 Hz, H-6b), 4.07 (s, 2H, CH^Phe), 4.52 (dd, J= 2.9.1 Hz y 7.83 Hz, H-3), 4.57 (s, 2H, CH^Phe), 4.63 (s, 2H, Cl^Phe), 4.69 (dd, 1H, J= 2.52 Hz y 2.91 Hz, H-2), 4.74 (ÍH, J= 2.52 Hz, H-l), 4.85 (dd, 1H, J= 7.83 Hz y 8.97 Hz, H-4), 7.35 (m, 20H, Phe). g) Sintesis del 2 ,3,4, 6-tetra-O-bencil-a-D-manopiranosida del N-octadecil-15-carbamoil-pentadecanilo A 0.29 g (0.37 mmoles) de una solución del producto obtenido en la etapa precedente f) , en solución en 5 cm3 de cloroformo, se agregan sucesivamente 0.23 g del BOP (0.52 mmoles), 0.21 cm3 de la diisopropiletilamina (1.48 mmoles) y 0.12 g de la octadecilamina (0.44 mmoles). Cuando la reacción es terminada, se diluye con diclorometano y se efectúa un lavado con agua. Luego, se seca sobre sulfato de magnesio y se evapora en seco bajo vacío. El producto obtenido es purificado por cromatografía de presión intermedia en una mezcla de heptano/acetato de etilo 6:4. El producto es obtenido con un rendimiento del 98%. lH RMN (CDClj) : d (ppm) 0.88 (t, 3H, J= 6.36 Hz, H-33), 1.27 (m, 50H, (CH ) 5), 1,47 (m, 4H, OCH7CH7 y H-17), 1.58 (m, 2H, H-13), 2.13 (t, 2H, J= 7.92 Hz, H- 14), 3.23 (m, 2H, H-16), 3.34 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHaCH2), 3.63 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHhCH ), 3.75 (m, ÍH, J= 8.97 Hz y 6.21 Hz, H-5), 3.78 (s, 2H, CHoPhe), 3.90 (dd, ÍH, J= 6.21 Hz y J= 11.82 Hz, H-6a), 3.97 (dd, ÍH, J= 6.21 Hz y J= 11.82 Hz, H-6b), 4.07 (s, 2H, CH^Phe), 4.52 (dd, J= 2.91 Hz y 7.83 Hz, H-3), 4.57 (s, 2H, CH?Phe), 4.63 (s, 2H, CH Phe), 4.69 (dd, ÍH, J= 2.52 Hz y 2.91 Hz, H-2), 4.74 (ÍH, J= 2.52 Hz, H-l), 4.85 (dd, 1H, J= 7.83 Hz y 8.97 Hz, H-4), 5.37 (banda 1H, HNCO).7,35 (m, 20H, Phe). h) Sintesis de la 2 ,3,4 , 6-tetra-O-bencil-a-D-manopiranosida del 15-octadecilamino-pentadecanilo A 0.77 g (0.75 mmoles) del producto obtenido en la etapa precedente g), en 15 cm3 de tetrahidrofurano (THF) anhidro, se agregan 0.056 g del hidruro de litio y aluminio AlLiH4 (1.50 mmoles). Se calienta a reflujo durante 10 horas. Luego, la mezcla de la reacción es enfriada en un baño de hielo y se agregan 56 µl de agua, luego 112 µl de sosa 2N después de 10 minutos, y por último todavía 56 µl de agua 10 minutos más tarde. Se filtra y se evapora a sequedad bajo vacío. El producto obtenido es purificado en una mezcla de diclorometano/metanol/amoníaco al 28% 9:2:0.5. El producto es obtenido con un rendimiento del 86%.

Hi RMN (CDC13) d (ppm) 0.88 (t, 3H, J= 6.36 Hz, H-33), 1.27 (m, 50H, (CH2)25), 1.4-1.6 (m, 9H, OC^CH^, H-17, H-14, H-17 y NH), 2.57 (t, 4H, J= 7.92 Hz, H-15 y H-16), 3.34 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHaCH2), 3.63 (m, 1H, J= 6.71 Hz, OCHbCH2), 3.75 (m, ÍH, J= 8.97 Hz y 6,21 Hz, H-5), 3.78 (s, 2H, CH?Phe), 3.90 (dd, ÍH, J= 6.21 Hz y J= 11.82 Hz, H-6a), 3.97 (dd, ÍH, J= 6.21 Hz y J= 11.82 Hz, H-6b), 4.07 (s, 2H, CHjPhe), 4.52 (dd, 2,91 Hz y 7.83 Hz, H-3), 4.57 (s, 2H, CH^Phe), 4.63 (s, 2H, O^Phe), 4.69 (dd, ÍH, J= 2.52 Hz y 2.91 Hz, H-2), 4.74 (ÍH, J= 2.52 Hz, H-l), 4.85 (dd, ÍH, J= 7.83 Hz y 8.97 Hz, H-4), 7.35 (m, 20H, Phe). i) Sintesis de la 2 ,3,4 , 6-tetra-O-bencil-a-D-manopiranosida del (3-[4-(3-ter-butoxicarbonil-amino-propil-ter- butoxicarbonil-amino) -butil-ter-butoxicarbonil-amino] - metilen-carbamoil) -15-pentadecanil-16-octadecilo A 0.63 g (0.61 mmoles) de una solución del producto obtenido precedentemente en la etapa h) , en 10 cm3 de cloroformo, se agregan sucesivamente 0.38 g de BOP (0.85 mmoles), 0.425 cm3 de diisopropiletilamina (2.44 mmoles) y 0.48 g del ácido 3- [4- (3-ter-butoxicarbonil-amino-propil-ter-butoxicarbonil-amino) -butil-ter-butoxicarbonil-amino] acético (FRM 375) (0.73 mmoles) obtenido en la etapa a). Al cabo de 4 horas, se diluye con diclorometano y se efectúa un lavado con agua. Se seca con sulfato de magnesio y se evapora en seco bajo vacío. El producto obtenido es purificado por cromatografía de presión intermedia en una mezcla de heptano/acetato de etilo 6:4. El producto es obtenido con un rendimiento del 80%. *H RMN (CDC13) : d (ppm) 0.88 (t, 3H, J= 6.36 Hz, H-33), 1.27 (m, 50H, (CH ) 5), 1,4-1.6 (m, 17H, OCH3CH7. H-l7, H-l4, H-l7, H-37, H-40, H-41 y H-44),l,46 (m, 36H, Boc), 2,8-2,9 (m, 6H, H-15, H-16 y H-35), 3.09-3.33 (m, 12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43 y H-45), 3.34 (m, ÍH, J= 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3.63 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHbCH2), 3.75 (m, ÍH, J= 8.97 Hz y 6.21 Hz, H-5), 3.78 (s, 2H, CH?Phe), 3.90 (dd, ÍH, J= 6,21 Hz y J= 11,82 Hz, H-6a), 3.97 (dd, ÍH, J= 6.21 Hz y J= 11.82 Hz, H-6b), 4.07 (s, 2H, CH^Phe), 4.52 (dd, J= 2.91 Hz y 7.83 Hz, H-3), 4.57 (s, 2H, CHpPhe), 4.63 (s, 2H, CH^Phe), 4.69 (dd, ÍH, J= 2.52 Hz y 2.91 Hz, H-2), 4.74 (ÍH, J= 2.52 Hz, H-l), 4.85 (dd, ÍH, J= 7.83 Hz y 8.97 Hz, H-4), 7.35 (m, 18H, Phe). j) Sintesis de la a-D-manopiranosida de (3-[4-(3-ter- butoxicarbonil-amino-propil-ter-butoxicarbonil-amino) - butil-ter-butoxicarbonil-amino] -metilen-carba oil) -15- pentadecanil-16-octadecilo A 0.63 g (0.38 mmoles) del producto obtenido en la etapa i) precedente, en 5 cm3 de metanol, se agrega 10% de paladio sobre carbón (0.027 g) . La solución es agitada bajo presión de hidrógeno a temperatura ambiente. Al cabo de 6 horas, se filtra luego se evapora en seco bajo vacío. La reacción es cuantitativa.

*H RMN (CD3OD) : d (ppm) 0.88 (t, 3H, J= 6.36 Hz, H-33), 1.27 (m, 50H, (CH2)25), 1.4-1.6 (m, 17H, OCH7CH7, H-l7, H-l4, H-l7, H-37, H-40, H-41 y H- 44),1.46 (m, 36H, Boc), 2.8-2.9 (m, 6H, H-l5, H-l6 y H-35), 3.09-3.33 (m, 12H, H- 36, H-38, H-39, H-42, H-43 y H-45), 3.34 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHaCH2), 3.5-3.82 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5 y H-6), 3.63 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHbCH2), 4.72 (ÍH, J= 2.52 Hz, H-l). k) Sintesis de la a-D-manopiranosida del (3- [4- (3-amino-propil-amino) -butil-amino] -metilen-carbamoil) -15-pentadecanil-16-octadecilo (Compuesto 1) A 0.37 g (0.28 mmoles) del producto obtenido en la etapa precedente j), se agregan 21.50 cm3 de tetrahidrofurano (TFA) destilado. Después de 1 hora, la mezcla de la reacción es concentrada en frío y liofilizada. Se verifica el grado de pureza del producto en solución en metanol por CLAR como se describe en la parte de "Materiales y Métodos".

JH RMN (CD3OD) : 0.88 (t, 3H, J= 6.36 Hz, H-33), 1.27 (m, 14H, (CH2) 5), 1.4- 1.6 (m, 17H, OCH7CH9, H-17, H-14, H-17, H-37, H-40, H-41 y H-44), 2,8-2.9 (m, 6H, H-15, H-16 y H-35), 2.92 (m, 2H, H-45), 2.92-3,17 (m, 12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43), 3.34 (m, ÍH, J= 6, 71 Hz, OCHaCH?,), 3.5-3.82 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5 y H-6), 3.63 (m, 1H,J= 6,71 Hz, OCHbCH2), 4,72 (1H, J= 2,02 Hz, H-l).

Ejepflo 2 : sintesis de la 6-desoxi-a-L-manopiranosida del (3- [4- (3-amino-propil-amino) -butil-amino] -metilen-carbamoil) -15-pentadecanil-16-octadecilo (compuesto 2) a) Sintesis del ácido 3- [4- (3-ter-butoxicarboni1-a ino- propil-ter-butoxicarbonil-amino) -butil-ter-butoxicarbonil- amino] acético (FRM 375) A una solución de espermina (5 g; 24.96 mmoles) en metanol (125 mi), se agrega cianoborohidruro de sodio NaBH3CN (0.548 g; 8.74 mmoles). La solución es sometida en seguida a una agitación vigorosa. Por la intermediación de una ampolla isóbara, se agrega durante 100 minutos una solución del ácido glioxílico (2.34 g; 25.46 mmoles) en metanol (80 mi). Después de una noche, se agrega a la mezcla la trietilamina (3.86 mi; 27.71 mmoles) y el dicarbonato de di-ter-butilo (27.67 g; 129.79 mmoles) solubilizado en tetrahidrofurano (55 mi) . Después de una noche, se concentra en el evaporador giratorio luego se recibe en acetato de etilo (63 mi) y se efectúa un lavado con sulfato ácido de potasio y salmuera. Luego se seca sobre sulfato de magnesio y se concentra. El producto obtenido es purificado por cromatografía (CH2Cl2/MeOH 9:1) . El rendimiento es del 30%.

*H RMN (CDC13) : d (ppm) 1.42 (s, 36H, C(CH3)3), 1.45 (m, 4H, CH2), 1.60 (m, 4H, CH2) , 3.04-3.33 (m, 12H, CH2), 3.91 (s, 2H, NCH2C00) . b) Sintesis del 15-hidroxipentadecanoato de metilo A 10 g de la pentadecalactona (41.60 mmoles) en 41.60 cm3 de metanol, se agregan 6.66 cm3 de metilato de sodio 2N (13.31 mmoles) a 0 °C. Después de 9 horas, se agregan 9.24 cm3 de ácido acético y se deja reaccionar durante 15 minutos. Luego se evapora la solución bajo vacío en seco, se recibe en seguida en diclorometano, y se efectúa un lavado con bicarbonato de sodio. Se seca la fase orgánica obtenida con sulfato de magnesio y se evapora el solvente en el evaporador giratorio. La purificación se hace en una mezcla de hexano/acetato de etilo 6:4. Se obtiene el l-ol-pentadecanoato de metilo con un rendimiento del 80 %. lH RMN (CDCI3) : d (ppm) 1.26 (m, 12H, (CH2)10), 1.5-1.6 (m, 4H, H-2 y H-l3), 2.30 (t, 2H, J= 7.60 Hz, H-14), 3.64 (t, ÍH, J= 5.84 Hz, H-l), 3.67 (s, 3H, H-16). c) Sintesis del 2,3,4-tri-0-acetil-6-desoxi-a-L- manopiranosida del pentadecanoato de metilo A 0 °C, se agregan 2.49 cm3 del cloruro de estaño (21.30 mmoles) a 3.55 g de rhamnosa tetraacetilada (10.65 mmoles) en 27 cm3 de diclorometano durante 30 minutos. Luego se agregan 3.48 g del l-ol pentadecanoato de metilo obtenido precedentemente (12.78 mmoles) . Después de 2 horas, la mezcla de la reacción es diluida con éter etílico y se vierte en una solución de fosfato ácido de sodio (Na2P04) . Las frases acuosas son extraídas con éter dietílico y las fases orgánicas son lavadas sucesivamente con una solución de carbonato de potasio, de salmuera, luego se secan sobre sulfato de magnesio. Después de la evaporación bajo vacío en seco se purifica por cromatografía de presión intermedia en una mezcla de heptano/acetato de etilo 7:3. El producto es obtenido con un rendimiento del 60%. lH RMN (CDC13) : d (ppm) 1.20 (d, 3H, J= 6.45 Hz, H-6), 1,26 (m, 20H, (CH2)10), 1.59 (m, 4H, OC^CH^ y H-l3), 1.98, 2,04 y 2.16 (s, 3H, OCOCH3), 2.29 (t, 2H, J= 7.62 Hz, H-14), 3,40 (m, 1H, J= 6.71 Hz, OCHaCH ), 3.66 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHbCH2), 3.67 (s, 3H, COOCH3), 3.88 (m, ÍH, J= 6.45 Hz y 9.97 Hz, H-5), 4.70 (d, ÍH, J= 1, 72 Hz, H-l), 5.06 (dd, 1H, J= 9.97 Hz y 9.97 Hz, H-4), 5.22 (dd, ÍH, J= 1.72 Hz y 3,52 Hz, H-2), 5.30 (dd, ÍH, J= 3.52 Hz y 9.97Hz, H-3). d) Sintesis de la a-desoxi-L-6-manopiranosida del pentadecanoato de metilo Se tratan 5.08 g del producto obtenido en la etapa c) (9.34 mmoles) en solución en 20 cm3 de metanol con 9.34 mi de metilato de sodio 2N (18.68 mmoles). Cuando la reacción se terminada, se neutraliza la mezcla de la reacción con la Amberlita IR120, se filtra y se evapora a sequedad bajo vacío. lH RMN (CDC13) : d (ppm) 1.20 (d, 3H, J= 645 Hz, H-6), 1.26 (m, 20H, (CH2)10), 1.59 (m, 4H, OCH?CH2 y H-13), 2.29 (t, 2H, J= 7.62 Hz, H-14), 3.40 (m, 1H, J= 6.71 Hz, OCHbCH2), 3.66 (m, ÍH, J= 6 1 Hz, OCHbCH2), 3.67 (s, 3H, CH3OCO), 3,6-3.9 (m, 4H, H-2, H-3, H-4 y H-5), 4.70 (d, ÍH, J= 1.72 Hz, H-l). e) Sintesis de la 2 ,3,4-tri-0-bensil-6-desoxi-a-L- manopiranosida del pentadecanoato de metilo A 2.09 g (5.00 mmoles) del producto obtenido en la etapa d) precedente, en 30 cm3 de la dimetilformamida (DMF) anhidra, se agregan sucesivamente 3.32 g del yoduro de potasio (20.00 mmoles), 0.80 g del hidruro de sodio al 60% (20.00 mmoles) y 2.38 cm3 del bromuro de bencilo (20.00 mmoles) . Después de 12 horas, se agregan 20 cm3 de una solución saturada del cloruro de amonio y se deja reaccionar durante 10 minutos. Luego, se diluye con agua y se extrae la fase orgánica con acetato de etilo. La misma es lavada en seguida con agua y salmuera, antes de ser secada finalmente con sulfato de magnesio. Por otra parte, el lavado suplementario con una solución saturada de tiosulfato de sodio es efectuada por último para eliminar los iones yoduro. Se evapora a sequedad bajo vacío y se purifica el aceite restante en una mezcla de heptano/acetato de etilo 9:1. El producto es obtenido con un rendimiento del 60%. *H RMN (CDC13) : d (ppm) 1.28 (m, 20H, (CH2)10), 1.33 (d, 3H, J= 6.21 Hz, H-6), 1.59 (m, 4H, OCH2CH2 y H-l3), 2.31 (t, 2H, J= 7,62 Hz, H-l4), 3.40 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHaCH2), 3.61 (dd, ÍH, J= 8.96 Hz y 9.5 Hz, H-4), 3.66 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHbCH2), 3.67 (s, 3H, CH3OCO), 3.68 (m, ÍH, J= 9.5 Hz y 6.21 Hz, H-5), 3.75 (dd, ÍH, 2.01 Hz y 3.02 Hz, H-2), 3.88 (dd, J= 3.02 Hz y 8.96 Hz, H-3), 4.64 " (s, 6H, CT^Phe), 4.73 (ÍH, J= 2,01 Hz, H-l), 7.35 (m, 15H, Phe). f) Sintesis de la 2,3,4-tri-0-bencil-6-desoxi-a-L- anopiranosida del ácido pentadecanóico A 0.50 g (0.73 mmoles) de una solución del producto obtenido en la etapa e) precedente, en 7 cm3 de metanol, se agregan 4.68 mi de sosa al 25%. La mezcla de la reacción es calentada a reflujo durante 30 minutos. Luego, se neutraliza la mezcla en frío con una solución de ácido clorhídrico al 5%. Se extrae la fase orgánica con acetato de etilo y se evapora en seco bajo vacío. La purificación se hace en una mezcla de heptano/acetato de etilo 4:6. El producto es obtenido con un rendimiento del 72 %.

!H RMN (CDC13) : d (ppm) 1.28 (m, 20H, (CH2)10), 1.33 (d, 3H, J= 6.21 Hz, H-6), 1.59 (m, 4H, OCH7CH7 y H-13), 2.34 (t, 2H, J= 7.62 Hz, H-14), 3.40 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHaCH2), 3.61 (dd, ÍH, J= 8,96 Hz y 9,5 Hz, H-4), 3.66 (m, ÍH, J= 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3.68 (m, ÍH, J= 9.5 Hz y 6.21 Hz, H-5), 3.75 (dd, ÍH, J= 2.01 Hz y 3.02 Hz, H-2), 3.88 (dd, J= 3 02 Hz y 5.95 Hz, H-3), 4.64 (s, 6H, CH^Phe), 4.73 (ÍH, = 2.01 Hz, H-l), 7.35 (m, 20H, Phe). g) Sintesis de la 2,3,4-tri-0-bensil-6-desoxi-a-L- manopiranosida de N-octadecil-15-carbamoil-pentadecanilo A 0.70 g (1.04 mmoles) de una solución del producto obtenido precedentemente en la etapa f) , en 13 cm3 de cloroformo, se agregan sucesivamente 0,69 g de BOP (1.56 mmoles), 0.73 cm3 de diisopropiletilamina (4.16 mmoles) y 0.34 g de octadecilamina (1.25 mmoles). Cuando la reacción es terminada, se diluye con el diclorometano, se efectúa un lavado con agua, se seca sobre sulfato de magnesio, y se evapora a sequedad bajo vacío. El producto obtenido es purificado por cromatografía a presión intermedia en una mezcla de heptano/acetato de etilo 6:4. El producto es obtenido con un rendimiento del 84%.

? RMN (CDCI3) : d (ppm 0.88 (t, 3H, J= 6.36 Hz, H-33), 1.27 (m, 50H, (CH2)25), 1.33 (d, 3H, J= 6.21 Hz, H-6), 1.47 (m, 4H, OCH?CH? y H-l 7), 1.58 (m, 2H, H-13), 2.13 (t, 2H, J= 7.92 Hz, H-14), 3.23 (m, 2H, H-16), 3.40 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHaCH?), 3.61 (dd, ÍH, J= 8.96 Hz y 9.5 Hz, H-4), 3.66 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHbCH2), 3.68 (m, ÍH, J= 9.5 Hz y 6.21 Hz, H-5), 3.75 (dd, ÍH, J= 2.01 Hz y 3.02 Hz, H-2), 3.88 (dd, J= 3.02 Hz y 8.96 Hz, H-3), 4.64 (s, 6H, CHoPhe), 4.73 (ÍH, J= 2.01 Hz, H-l), 5.37 (banda ÍH, HNCO), 7,35 (m, 15H, Phe). h) Sintesis de la 2,3,4-tri-0-bencil-6-desoxi-a-L- manopiranosida del 15-octadecil-amino-pentadecanilo A 0.81 g (0.86 mmoles) del producto obtenido en la etapa g) precedente, en 15 cm3 de tetrahidrofurano (THF) anhidro, se agregan 0.065 g de hidruro de litio y aluminio AlLiH4 (1.72 mmoles), y se calienta a reflujo durante 10 horas. Luego, la mezcla de la reacción se enfría en un baño de hielo y se agregan 65 µl de agua, luego 130 µl de sosa 2N al cabo de 10 minutos, y por último de nuevo 65 µl de agua después de 10 minutos. Se filtra y se evapora en seco bajo vacío. La purificación se hace en una mezcla de diclorometano/metanol/amoníaco al 28% 9:2:0.5. El producto es obtenido con un rendimiento del 93%. 2H RMN (CDC13) : d (ppm) 0.88 (t, 3H, J= 6.36 Hz, H-33), 1.27 (m, 50H, (CH2)25), 1.33 (d, 3H, J= 6.21 Hz, H-6), 1.4-1.6 (m, 9H, OCH?CH?, H-17, H-14, H-17 y NH), 2.57 (t, 4H, J= 7.92 Hz, H-15 y H-16), 3.40 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHaCH2), 3.61 (dd, ÍH, J= 8.96 Hz y 9,5 Hz, H-4), 3.66 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHbCH2), 3.68 (m, ÍH, J= 9.5 Hz y 6,21 Hz, H-5), 3.75 (dd, ÍH, J= 2.01 Hz y 3,02 Hz, H-2), 3.88 (dd, J= 3.02 Hz y 8.96 Hz, H-3), 4.64 (s, 6H, CH^Phe), 4.73 (ÍH, J= 2.01 Hz, H-l), 7,35 (m, 15H, Phe). i) Sintesis de la 2,3,4-tri-0-bencil-6-desoxi-a-L- manopiranosida del (3- [4- (3-ter-butoxicarbonil-amino- propil-ter-butoxicarbonil-amino) -butil-ter-butoxicarbonil- amino] -metilen-carbamoil) -15-pentadecanil-16-octadecilo A 0.78 g (0.86 mmoles) de una solución obtenida en la etapa h) precedente, en solución en 7 cm3 de cloroformo, se agregan sucesivamente 0.53 g de BOP (1.20 mmoles), 0.30 cm3 de la diisopropiletilamina (1.72 mmoles) y 0.62 g de FRM 375 obtenido en la etapa a) (0.95 mmoles). Después de 4 horas, se diluye con diclorometano, se efectúa un lavado con agua, se seca sobre sulfato de magnesio, y se evapora a sequedad bajo vacío. El producto obtenido es purificado por cromatografía "instantánea" en una mezcla de heptano/acetato de etilo 6:4. El producto es obtenido con un rendimiento del 72%.

? RMN (CDC13) : d (ppm) 0.88 (t, 3H, J= 6.36 Hz, H-33), 1.27 (m, 50H, (CH2)25), 1,33 (d, 3H, J= 6,21 Hz, H-6), 1,4-1,6 (m, 17H, OCH?CH?, H-17, H-14, H-I7, H-37, H-40, H-41 y H-44),1.46 (m, 36H, Boc), 2.8-2.9 (m, 6H, H-15, H-16 y H-35), 3.09- 3 .33 (m, 12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43 y H-45), 3.40 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHaCH2), 3.65 (s, 2H, CH^Phe), 3.66 (m, ÍH, J= 6,71 Hz, OCHbCH2), 3.68 (m, ÍH, J= 9.5 Hz y 6.21 Hz, H-5), 3.99 (s, 2H, CH^Phe), 4.02 (dd, ÍH, J= 8.96 Hz y 9.5 Hz, H-4), 4.32 (s, 2H, CH^Phe), 4.57 (dd, ÍH, J= 2.01 Hz y 3.02 Hz, H-2), 4.73 (ÍH, J= 2.01 Hz, H-l), 4.82 (dd, J= 3.02 Hz y 8.96 Hz, H-3), 7.35 (m, 18H, Phe). j) Sintesis de la 6-desoxi-a-L-manopiranosida del (3- [4- (3- ter-butoxicarbonil-amino-propil-ter-butoxicarbonil-amino) - butil-ter-butoxicarbonil-amino] -metilen-carbamoil) -15- ?entadecanil-16-octadecilo A 0.74 g (0.48 mmoles) del producto obtenido en la etapa precedente i), en solución en 10 cm3 de metanol, se agregan 10 % (0.034 g) del paladio sobre carbón. La solución es agitada bajo presión de hidrógeno a temperatura ambiente. Después de 4 horas, se filtra luego se evapora en seco bajo vacío. La reacción es cuantitativa.

'H RMN (CD3OD) : d (ppm) 0.88 (t, 3H, J= 6.36 Hz, H-33), 1.20 (d, 3H, J= 6.45 Hz, H-6), 1.27 (m, 14H, (CH2) 5), 1.4-1.6 (m, 17H, OCHoCH?, H-17, H-14, H-l7, H-37, H-40, H-41 y H-44),1.46 (m, 36H, Boc), 2.8-2.9 (m, 6H, H-15, H-16 y H-35), 3.09-3.33 (m, 12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43 y H-45), 3.40 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHaCH2), 3.66 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHbCH2), 3.6-3.9 (m, 4H, H-2, H-3, H-4 y H-5), 4.73 (1H, J= 2.01 Hz, H-l). k) Sintesis de la 6-desoxi-a-L-manopiranosida del (3- [4- (3- amino-propil-amino) -butil-ami.no] -metilen-carbamoil) -15- pentadecanil-16-octadecilo (compuesto 2) A 0.40 g (0.31 mmoles) del producto obtenido en la etapa j) precedente, se agregan 24 cm3 del tetrahidrofurano (TFA) destilado. Después de 1 hora, la mezcla de la reacción es evaporada bajo vacío en frío y a sequedad, luego es liofilizado. Se verifica el grado de pureza del producto en solución en metanol por CLAR.

? RMN (CD3OD) : d (ppm) 0.88 (t, 3H, J= 6.36 Hz, H-33), 1.20 (d, 3H, J= 6.45 Hz, H-6'), 1,27 (m, 14H, (CH2)25), 1.4-1.6 (m, 17H, OCH7CH?, H-l7, H-l4, H-l7, H- 37, H-40, H-41 y H-44), 2.8-2.9 (m, 6H, H-15, H-16 y H-35), 2.92 (m, 2H, H-45), 2.92-3.17 (m, 12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43), 3.40 (m, ÍH, J= 6.71 Hz, OCHaCH2), 3.66 (m, ÍH, J= 6, 71 Hz, OCHbCH ), 3.6-3.9 (m, 4H, H-2, H-3, H-4 y H-5), 4.73 (ÍH, J= 2,01 Hz, H-l).

Ejemplo 3 : Sintesis de la 6-desoxi-ß-L-galactopiranosida del 1- [- (3- [4- (3-amino-propil-amino) -butil-amino-propil-amino] -mefcilen-carbamoil) -15-pentadecanilo-16-octadecanilo (compuesto 3) a) Sintesis del ácido {3- [4- (3-benciloxicarbonil-amino- propil-benciloxicarbonil-amino) -butil-benciloxicarbonil- imino] -propilamino} acético A una solución de espermina (10 g ; 49.91 mmoles) en metanol (200 mi), se agrega el cianoborohidruro de sodio NaBH3CN (1.10 g ; 17.47 mmoles). La solución es sometida en seguida a una agitación vigorosa. Por la intermediación de una ampolla isóbara, se agregan durante 100 minutos una solución del ácido glioxílico (4.59 g ; 49.91 mmoles) en metanol (120 mi) . Después de una noche, se coloca la mezcla de la reacción en un baño de hielo y se agregan sucesivamente la sosa 2N (34 mi) y el cloroformiato de bencilo (14.25 mi; 99.82 mmoles) en 10 porciones. Se mezcla vigorosamente y se mantiene el baño a entre 5 °C y 10 °C. Al cabo de 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla es extraída con éter y se neutraliza con una solución del ácido clorhídrico 5N. La fase orgánica es secada en seguida sobre sulfato de magnesio, y se concentra en el evaporador rotatorio. El producto obtenido es purificado por cromatografía (100 % de CH2C12 luego CH2Cl2/MeOH 9:1). El rendimiento es del 52%.

*H RMN (CDC13) : d (ppm) 1.28 (t, 4H, CH2), 1-60 (m, 4H, CH2), , 3.04-3.33 (m, 12H, CH2), 3.49 (s, 2H, NCH2COO); 5.07 (s, 8H, CH2), 7.27 (m, 20H, Phe). b) Sintesis del 15-hidroxipentadecanoato de metilo La pentadecalactona (10 g ; 41.6 mmoles) en solución en metanol (41.6 mi) es tratada con el metilato de sodio 2N (6.656 mi ; 13.31 mmoles) a 0 °C. Después de 9 horas, se agregan 9.24 mi del ácido acético y se deja reaccionar durante 15 minutos. Luego se concentra la solución y el aceite resultante se disuelve en diclorometano y se lava con bicarbonato de sodio. Después de la decantación, la fase orgánica es secada sobre sulfato de magnesio y se evapora. La purificación se hace en una mezcla 6 : 4 de hexano/acetato de etilo (AcOEt) para dar el 15-hidroxipentadecanoato de metilo con un rendimiento del 80%.

!H RMN (CDC13) : d (ppm) 1.29 (m, 20H, (CH2)?o), 1.5-1.6 (m, 4H, H-2 y H-13), 2.30 (t, 2H, J= 7.60 Hz, H-14), 3.64 (t, ÍH, J= 5,84 Hz, H-l), 3.67 (s, 3H, H-16).

C) Sintesis de la N-octadeci1-15-hidroxipentadecana ida Se ponen 10 g del 15-hidroxipentadecanoato de metilo obtenido en la etapa b) precedente (36.85 mmoles) y 19.86 g de octadecilamina (73.70 mmoles) a 150 °C bajo vacío. Al cabo de 24 horas, la mezcla es enfriada y diluida con diclorometano. Se obtiene un precipitado que es filtrado sobre un embudo de Büchner. El sólido obtenido es recristalizado en seguida en metanol para dar la N-octadecil-5-hidroxipentadecanamida con un rendimiento del 100%. lH RMN (CDCI3) : d (ppm) 0.88 (t, 3H, J= 6.96 Hz, H-33), 1.26 (m, 54H, (CH2)27), 1.4-1.6 (m, 6H, H-2, H-13 y H-17), 2.30 (t, 2H, J= 7.60 Hz, H-14), 3.25 (m, 2H, H-16), 3.64 (t, 2H, J= 5.84 Hz, H-l), 5.39 (banda NHCO). 1 C RMN (CDCI3) : d (ppm) 14.48 (C-33), 25.3 y 26.3 (C-2 y C-13), 29,72 ((CH2)27)), 36.7 y 34,8 (C-14 y C-16), 63,6 (C-l), 174.31 (CO). d) Sintesis del 15-octadecilamino-pentadecanol A una solución de 20 g de la N-octadecil-15-hidroxipentadecanamida obtenida en la etapa c) precedente (39.22 mmoles) en tetrahidrofurano anhidro (250 mi), se agregan 2.98 g de hidruro de litio y aluminio LiAlH4 (78.44 mmoles) . La reacción se hace a reflujo durante 10 horas. Después de haber enfriado la mezcla de la reacción, se agregan sucesivamente agua (2.98 mi) y la sosa 2N (2.98 mi). Después de 10 minutos, se vuelve a agregar el agua (2.98 mi). El precipitado formado es filtrado sobre un embudo Büchner y el filtrado es concentrado en el evaporador rotatorio para dar el 15-octadecilamino-?entadecanol .

!H RMN (CDCI3) : d (ppm) 0.88 (t, 3H, J= 6.96 Hz, H-33), 1.26 (m, 54H, (CH2)27), 1.43-1.59 (m, 7H, H-2, H-l4, H-l7 y banda NH), 1.5-1.6 (m, 4H, H-2 y H-13), 2.60 (t, 4H, J= 6.50 Hz, H-15 y H-16), 3.64 (t, 2H, J= 5.84 Hz, H-l). 13C RMN (CDC13) : d (ppm) 14.48 (C-33), 25.3 y - 26.3 (C-2 y C-14), 29.72 ((CH2)27)), 51.7 (C-15 y C-16), 63.6 (C-l). e) Síntesis del N- [benciloxicarbonil] -15-octadecilamino- pentadecanol Se agregan gota a gota 7.89 mi del cloroformiato de bencilo (55.26 mmoles) a una solución enfriada a 0 °C del 15-octadecilamino-pentadecanol obtenido en la etapa d) precedente (13.71 g ; 27.63 mmoles) y tietilamina (7.7 mi ; 55.26 mmoles) en diclorometano seco (150 mi) . Después de 10 minutos, se verifica el pH de la mezcla. La mezcla de la reacción es dejada en seguida a la temperatura ambiente durante una noche. Luego la solución es lavada con agua, secada sobre sulfato de magnesio (MgS04) y se concentra. La mezcla de la reacción es purificada por cromatografía (heptano/AcOEt 6:4). Se obtiene el N- [benciloxicarbonil] -15-octadecilamino-pentadecanol con un rendimiento del 70%.

*H RMN (CDCI3) : d (ppm) 0.88 (t, 3H, J= 6.96 Hz, H-33), 1.26 (m, 54H, (CH2)27), 1.43-1.59 (m, 6H, H-2, H-14, H-17), 3.20-3.22 (m, 4H, H-15 y H-16), 3.64 (t, 2H, J= 5.84 Hz, H-l), 5.12 (s, 2H, OCH2Phe), 7.34 (m, 5H, Phe). 13c RMN (CDCI3) : d (ppm) 14.48 (C-33), 25.8, 26.9 y 31.94 (C-2, C-14 y C-17), 29.72 ((CH2)27)), 47.26-48.04 (C-15 y C-16), 63.08 (C-l), 66.79 (OCH2), 128.40 (Phe). f) Sintesis de la 2,3,4-tri-0-acetil-6-desoxi-ß-L- galactopiranosida del 15- [N- (benciloxicarbonil) - octadecilamino-pentadecanilo 1.5 g de la fucosa tetraacetilada (4.52 mmoles) se ponen a reaccionar con 0.634 mi de tetracloruro de estaño (5.42 mmoles) en acetonitrilo seco (50 mi) durante 30 minutos. Luego se agregan 3.132 g del N- [benciloxicarbonil] ] -15-octadecilamino-pentadecanol obtenido en la etapa e) precedente (4.97 mmoles). Después de 5 horas, la reacción es extraída y el producto obtenido es purificado entonces por cromatografía (heptano/acetato de etilo 6 : 4). El rendimiento es del 69%.

*H RMN : d (ppm) 0.87 (t, 3H, J= 6.96 Hz, H-33), 1.2 (d, 3H, J= 6.51 Hz, H-6), 1.25 (m, 54H, (CH2)27), 1.52 (m, 6H, OCH7CH7, H-l 4 y H-l 7), 1.95, 2.05 y 2.15 (s, 3H, OCOCH3), 3.14-3.25 (m, 4H, H-15 y H-16), 3.44 (m, ÍH, OCHaCH2), 3.63 (m, ÍH, OCHbCH2), 3.79 (m, ÍH, H-5), 4.41 (d, ÍH, J= 7.98 Hz, H-l), 4.99 (dd, 1H, J= 3.52 Hz y 10.46 Hz, H-3), 5.09 (s, 2H, OCH?Phe), 5.16 (dd, ÍH, J= 7.98 Hz y 10.46 Hz, H-2), 5.23 (dd, J= 3.52 Hz y 3.31Hz, H-4), 7.32 (m, 5H, Phe). 13C RMN (CDCI3) : d (ppm) 14.68 (C-33), 17.31 (C-2), 20.75 (CH3COO), 27.29 (C-6), 29.72 ((CH2)27)), 25.89-31.98 (OCH7CH7, C-14, C-17), 47.25-48.04 (C-15 y C-16), 66.91 (Cj^Phe), 69,63 (OCH9CH9), 69.45 (C-2), 70.57 (C-5), 70.85 (C-4), 71.44 (C-3), 96.25 (C-l), 128.43 (Phe), 156.21 y 171,30 (CO). g) Síntesis de la 2,3,4-tri-0-acßtil-6-desoxi-ß-L- galactopiranosida del 15-octadecilamino-pentadecanilo A una solución de la 2, 3, 4-tri-0-acetil-6-desoxi-ß-L-galactopiranosida del 15- [N- (benciloxicarbonil) -octadecilamino] -pentadecanilo obtenida en la etapa f) precedente (2.72 g ; 4.23 mmoles) en metanol (100 mi), se agrega paladio sobre carbón activo al 10% (0.5 g) bajo presión de hidrógeno. La reacción es cuantitativa.

!H RMN : d (ppm) 0.87 (t, 3H, J= 6.96 Hz, H-33), 1.2 (d, 3H, J= 6.51 Hz, H-6), 1.25 (m, 54H, (CH )27), 1.52 (m, 6H, OCH7CH7, H-14 y H-l 7), 1.88-1.93 (banda NH),1.95, 2.05 y 2.15 (s, 3H, OCOCH3), 2.64 (m, 4H, H-l 5 y H-l 6), 3.46 (m, ÍH, OCHaCH2), 3.63 (m, ÍH, OCHbCH2), 3.79 (m, ÍH, H-5), 4.41 (d, ÍH, J= 7.98 Hz, H-l), 4.99 (dd, ÍH, J= 3.52 Hz y 10.46 Hz, H-3), 5.16 (dd, ÍH, J= 7.95 Hz y 10.46 Hz, H-2), 5,23 (dd, J= 3.52 Hz y 3.31Hz, H-4). 13C RMN (CDCI3) : d (ppm) 14.68 (C-33), 17.31 (C-2), 20.75 (CH3COO), 27,29 (C-6), 29.72 ((CH2)27)), 25.89-31.98 (OCH7CH7, C-14, C-l 7), 47.75-48.04 (C-15 y C-16), 69.63 (OCH2CH2), 69.45 (C-2), 70.57 (C-5), 70.85 (C-4), 71.44 (C-3) 96 ^5 (C-l), 171.30 (CO). h) Síntesis de la 2,3,4-tri-0-acetil-6-desoxi-ß-L- galactopiranosida del (3- [4- (3-amino-propil-amino) -butil- amino-propil-benciloxicarbonil-amino] -metilen-carbamoil) - 15-pentadecanil-16-octadecanilo A una solución de 0.60 g del compuesto obtenido en la etapa g) precedente (0.94 mmoles) en cloroformo (15 mi), se agregan sucesivamente la diisopropiletilamina (0.491 mi ; 2.82 mmoles), el BOP (0.457 g ; 1.03 mmoles) y el ácido {3-[4- (3-benciloxicarbonil-amino-propil-benciloxicarbonil-amino) -butil-benciloxicarbonil-a ino] -propilamino}-acético obtenido en la etapa a) (0.748 g ; 0.94 mmoles). El aceite resultante es purificado por cromatografía (heptano/acetato de etilo 4 : 6) . Se obtiene la 2, 3, 4-tri-0-acetil-6-desoxi-ß-L-galactopiranosida del (3- [4- ( 3-amino-propil-amino) -butil-amino-propil-benciloxicarbonil-amino] -metilen-carbamoil) -15-pentadecanil-16-octadecanilo con un rendimiento del 45%. lH RMN : d (ppm) 0.87 (t, 3H, J= 6.96 Hz, H-33), 1.2 (d, 3H, J= 6.51 Hz, H-6), 1,24 (m, 54H, (CH2)27), 1.39-1.67 (m, 15H, OCH7CH7, H-14, H-17, NH, CH2), 1.95, 2.05 y 2.15 (s, 3H, OCOCH3), 3.05-3.35 (m, 18H, H-15, H-16 y CH N), 3.43 (m, ÍH, OCHaCH2), 3.67 (m, ÍH, J= 6 74 Hz, OCHbCH2), 3.79 (m, ÍH, H-5), 4.41 (d, ÍH, J= 7.98 Hz, H-l), 4.99 (dd, ÍH, J= 3.52 Hz y 10.46 Hz, H-3), 5.05 (s, 8H, CH7.Phe), 5.16 (dd, ÍH, J= 7.98 Hz y 10.46 Hz, H-2), 5.23 (dd, J= 3.52 Hz y 3.31Hz, H-4), 5.47 (banda CONH, ÍH), 7.32 (m, 20H, Phe). 13C RMN (CDCI3) : d (ppm) 14.84 (C-33), 20.75 (CH3COO), 27.29 (C-6'), 29.72 ((CH2)27))> 25.89-31.98 (OCH7CH7, C-14, C-17 y CH2), 37.87-46.87 (C-15, C-16 y C-N), 66.84 (CH^Phe), 68.63 (OCH7CH7), 69.45 (C-2), 70.57 (C-5), 70.85 (C-4), 71.44 (C-3), 96.25 (C-l), 128.31 (Phe), 157.01 y 171.30 (CO). i) Síntesis de la 6-desoxi-ß-L-galactopiranosida del l-[-(3- [4- (3-amino-propilamino) -butil-amino-propil- benciloxicarbonil-amino] -metilen-carbamoil) -15- pentadecanil-16-octadecanilo A una solución metanólica (3 mi) que contiene el producto obtenido en la etapa h) precedente (0.60 g ; 0.94 mmoles) se agrega una solución metanólica (1 mi) saturada de amoníaco. Después de una hora, se concentra.

!H RMN : d (ppm) 0.87 (t, 3H, J= 6.96 Hz, H-33), 1.2 (d, 2H, J= 6.51 Hz, H-6), 1.24 (m, 54H, (CH2)27), 1.39-1.67 (m, 15H, OCH7CH7, H-14, H-17, NH, CH2), 3.05- 3,35 (m, 18H, H-l 5, H-l 6 y Cí^N), 3.4-3,7 (m, 6H, OCH7CH7, H-3, H-4, H-5, H-2), 4.73 (d, ÍH, J= 7.98 Hz, H-l), 5.05 (s, 8H, CH^Phe), 5.47 (banda CONH, ÍH), 7.32 (m, 20H, Phe). j) Síntesis de la 6-desoxi-ß-L-galactopiranosida del l-[-(3- [4- (3-amino-propil-amino) -butil-amino-propil-amino] -metilen-carbamoil) -15-pentadecanil-16-octadecanilo (compuesto 3) A una solución del producto obtenido en la etapa i) precedente (0.072 g ; 0.05 mmoles), se agrega paladio sobre carbón al 10% (0.032 g) en metanol. Después de una noche, se filtra sobre papel de vidrio y se concentra en el evaporador giratorio. El producto es purificado en seguida sobre una columna preparativa del tipo C-4. lH RMN : d (ppm) 0.87 (t, 3H, J= 6.96 Hz, H-33), 1.2 (d, 2H, J= 6,51 Hz, H-6), 1.24 (m, 54H, (CH2)27), 1.39-1.67 (m, 15H, OCH7CH7, H-14, H-17, CH2), 2.92-3.19 (m, 18H, H-l 5, H-l 6 y CH7N), 3.4-3.7 (m, 6H, OCH?CH7, H-3, H-4, H-5, H-2), 4,73 (d, 1H, J= 7.95 Hz, H-l).

C/ÜTILIZACION DE LOS AGENTES DE TRANSFERENCIA SEGÚN LA INVENCIÓN Ejep lo 4 : preparación de los complejos del agente de transferencia/ácido nucleico con el compuesto 2 y medida de su tamaño Este ejemplo ilustra la preparación de los complejos entre un agente de transferencia según la invención y un ácido nucleico, su tamaño que ha sido medido en seguida. El glicolípido utilizado en este ejemplo y en los ejemplos que siguen es el compuesto 2, en solución en coloroformo, a una concentración de 10 mg/ml. En cierto caso, un co-lípido neutro, el colesterol o el DOPE, ha sido mezclado previamente con el compuesto 2. La solución lipídica es preparada de la siguiente manera: una muestra de la cantidad deseada es tomada, el solvente es evaporado bajo flujo de argón y se deja secar durante 1 hora. Luego, el lípido es rehidratado con una solución que contiene 5% de dextrosa y 10 mM de cloruro de sodio durante toda una noche a 4 °C. El día siguiente, las soluciones lipídicas son calentadas a 60 °C durante 5 minutos luego pasadas a ultrasonido durante 1 minuto. La operación es repetida hasta que el tamaño de las partículas lipídicas sea estable. El ADN utilizado es el plásmido pXL3031 (Figura 1) en solución en una mezcla de dextrosa al 5% y de cloruro de sodio 10 mM a una concentración de 0.5 mg/ml o de 1.0 mg/ml. Este plásmido contiene el gen que codifica para la luciferasa bajo el control del promotor de P/E CMV del citomegalovirus. Su tamaño es de 3671 pb. El esquema de este plásmido está representado en la Figura 1. El plásmido pXL3031 ha sido purificado según los métodos descritos en la solicitud de patente WO 97/35002. Los complejos del compuesto 2/ADN son preparados mezclando rápidamente los volúmenes apropiados de la solución del ADN plasmídico y del compuesto 2 (según la relación de las cargas deseadas), a la temperatura ambiente. La cantidad del agente transfectante varía entre 0.25 nmoles/µg y 12 nmoles/µg de ADN. El tamaño de los complejos ha sido analizado midiendo el diámetro hidrodinámico por la difusión dinámica de la luz (Dynamic Láser Ligth Scattering) con la ayuda de un aparato Coulter N4Plus. Las muestras son diluidas 20 veces en una solución que contiene 5 % de dextrosa y 20 mm de cloruro de sodio para evitar las difusiones múltiples. A una relación de 3 nmoles del lípido/µg del ADN, se han obtenido los siguientes resultados: El término "micelas" indica que el compuesto 2 ha sido utilizado solo, es decir sin agregar el co-lípido neutro, y se forma así una solución micelar. Esta tabla muestra que los complejos obtenidos tienen un tamaño comprendido entre 130 y 150 nm, aproximadamente, lo que es compatible con una utilización farmacéutica, especialmente en inyección.

Ejemplo 5 : Comportamiento de los complejos formados a partir del compuesto 2 de diferentes relaciones de la carga Este ejemplo ilustra el comportamiento de los complejos del agente de transferencia según la ' invención/ácido nucleico cuando se hace variar la relación de la carga. El impacto de agregar un co-lípido (colesterol o DOPE) es ilustrado igualmente. De manera clásica, se distinguen 3 fases físico- químicas cuando se aumenta la relación de las cargas de los agentes de transferencia/ADN (B. Pitard y colaboradores, Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer, PNAS, Vol. 94, pp. 14412-14417, 1997). Estas tres fases determinan el potencial terapéutico del agente de transferencia. A una relación reducida de la carga, el ADN no es saturado por el agente de transferencia. Permanece todavía el ADN que no formó un complejo, y los complejos son globalmente cargados negativamente y de tamaño pequeño. Esta fase, estable, es llamada la "Fase A". El hecho de que el ADN no sea saturado completamente por el agente de transferencia significa que el ADN no está protegido completamente. El ADN puede ser sometido así a las degradaciones por las nucleasas. Por otra parte, los complejos son globalmente negativos, el paso de las membranas celulares es difícil. Por estas razones, los complejos nucleolipídicos de la fase A son relativamente inactivos. A la relación de la carga intermedia, el ADN es saturado completamente por el agente de transferencia, y los complejos con globalmente neutros o ligeramente positivos. Esta fase es inestable porque las repulsiones iónicas son mínimas y un fenómeno de agregación puede producirse. El tamaño de las partículas está bien arriba del límite de detección por la difusión dinámica de la luz (muy superior a 3 µm) . Esta fase inestable es llamada la "fase B". Uno de tales tamaños de los complejos no está adaptado para las utilizaciones en inyección, aunque esto no significa que los complejos sean inactivos en la fase B: los mismos están solamente bajo una formulación que no es apropiada para su inyección en un blanco farmacéutico. A una relación de la carga más elevada, el ADN es sobresaturado po'r el agente de la transferencia, y los complejos con globalmente positivos. Debido a las repulsiones fuertes entre las cargas positivas, esta fase es estable. La misma está designada bajo el nombre de la "fase C". Contrariamente a la fase A, los complejos obtenidos están bajo una forma tal que el ADN está bien protegido frente a las nucleasas, y la carga globalmente positiva de estos complejos facilita la fijación sobre la membrana celular de naturaleza iónica y el paso de esta membrana. Los complejos de la fase C están particularmente adaptados así a una utilización para la transferencia de los ácidos nucleicos en las células. Estas 3 zonas A, B y C han sido igualmente puestas al día con el compuesto 2 según la invención como el agente de transferencia: Como lo muestra la tabla de arriba, la zona B, que es la zona de inestabilidad, es particularmente pequeña y se sitúa a las relaciones de carga que son muy reducidas. La zona C comienza desde los 2 nmoles del lípido/µg del ADN cuando el compuesto 2 es utilizado conjuntamente con un co- lípido (colesterol o DOPE), y a partir de 3 nmoles del lípido/µg del ADN cuando el compuesto es utilizado solo. Como ya ha sido precisado anteriormente, es en esta zona que es particularmente ventajoso colocarse para una utilización farmacéutica.

A título de comparación, se ha mostrado con uno de los lípidos catiónicos divulgados en la solicitud WO 97/18185 que la zona C comienza a formarse a las relaciones de la carga al menos iguales a 2 según la concentración de cloruro de sodio de la solución (ver la Figura 3a en B. Pitard y colaboradores, PNAS USA, 94, pp. 14412-14417, 1997). Así, el compuesto 2 es un agente de transferencia particularmente ventajoso porque el mismo es estable a relaciones reducidas de la carga, lo que permite formar complejos estables con cantidades reducidas de los glicolípidos, con consecuencias benéficas que se originan sobre el plano de la toxicidad.

Ejepflo 6 : utilización del compuesto 2 para la transferencia in vitro del ADN Este ejemplo ilustra la capacidad de los agentes de transferencia según la invención para transfectar el ADN en las células in vitro, a diferentes relaciones de la carga, en la ausencia y en la presencia de un co-lípido neutro (colesterol o DOPE) . Las microplacas de 24 cavidades son sembradas con 60000 células de HeLa por cavidad, y son puestas en crecimiento una noche. El número de células después de una noche, y así en el momento de la transfección, es de 10000 células por cavidad. Cada cavidad se pone en contacto con los complejos formados con el compuesto 2 y que contienen 1 µg del ADN plasmídico en 0.5 mi del medio de cultivo DMEM (Gibco/BRL sin el suero). Las células son incubadas a 37 °C durante 5 horas.

El medio que contiene los complejos es retirado en seguida y reemplazado por un medio de cultivo DMEM y 10 % de suero de bovino fetal. Luego, las células son puestas de nuevo en cultivo durante 24 horas. Por último, las células son lisadas y probadas utilizando un juego o conjunto de prueba de la luciferasa (Promega) y un luminómetro Dynex MLX. Los resultados obtenidos están indicados sobre el histograma de la Figura 2. La eficacia de la transferencia está representada por la expresión de la luciferasa en pg/cavidad. Se constata que la transfección máxima es de 500 pg/cavidad aproximadamente. En conclusión, este ejemplo muestra claramente que es posible utilizar el compuesto 2 según la invención para formar complejos susceptibles de promover la transferencia del ADN en las células in vitro.

Ejepflo 7 : utilización del copfuesto 2 para la transferencia in vivo del ADN Este ejemplo ilustra la capacidad de los agentes de transferencia según la invención para transfectar el ADN en las células in vivo. La transferencia del gen in vivo ha sido efectuada sobre los ratones Balb/C para la administración intratraqueal, intravenosa o intramuscular. En el caso de las inyecciones intramusculares, cada ratón ha recibido 30 µl de la formulación que contiene 15 µg del ADN plasmídico en el músculo anterior de la tibia. Los tejidos son recuperados 7 días después de la inyección, los mismos son congelados y almacenados a -80 °C mientras que se efectúan las pruebas de actividad de la luciferasa. En el caso de las inyecciones por la vía intravenosa, cada ratón ha recibido 200 µl de la formulación que contiene 50 µg del ADN plasmídico. Los tejidos son recuperados 24 horas después de la inyección, luego son congelados y almacenados de la misma manera que precedentemente. La Figura 3 ilustra la actividad de los complejos formados con el compuesto 2 para la transferencia del gen in vivo por la vía intramuscular. Estos resultados muestran claramente que la formación de complejos con el compuesto 2 según la invención y del ADN permite promover la transferencia de dicho ADN en las células in vivo. De la misma manera, se puede utilizar cualquier agente de transferencia tal como el definido en la presente invención para promover la transferencia del ADN en las Células de cualquier tipo de tejido.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (33)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Agentes de transferencia de los ácidos nucleicos, caracterizados porque los mismos comprenden un espaciador hidrófobo unido químicamente por una parte a un policatión y por otra parte a al menos un substituyente hidrófilo.
2. 2. Agentes de transferencia de los ácidos nucleicos ' de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque dicho espaciador hidrófobo está constituido de 2 o 3 cadenas grasas lineales hidrocarbonadas que comprenden entre 10 y 20 átomos de carbono por cadena, cada cadena puede ser de longitud diferente, o bien dicho espaciador hidrófobo está constituido de una cadena grasa muy larga lineal hidrocarbonada, que comprende entre 20 y 50 átomos de carbono.'
3. 3. Agentes de transferencia de los ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque el o los substituyentes hidrófilos son elegidos entre los substituyentes hidroxi, amino, los polioles, los azúcares, o aún los péptidos hidrófilos.
4. 4. Los agentes de transferencia de los ácidos nucleicos de conformidad con las reivindicaciones 1 o 3, caracterizados porque al menos uno de los substituyentes hidrófilos es un azúcar.
5. 5. Los agentes de transferencia de los ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 1, de la fórmula general (I) : caracterizados porque: R representa un policatión, Z representa un átomo de hidrógeno o un átomo de flúor, las diferentes Z son independientes entre sí, y ya sea x e y, independientemente entre sí, representan números enteros comprendidos entre 10 y 22 inclusive, y X e Y, independientemente entre sí, representan un átomo de hidrógeno, un grupo -OAlq o Alq representa un alquilo recto o ramificado que contiene 1 a 4 átomos de carbono, un grupo hidroxi, un grupo amino, un poliol, un azúcar, un péptido hidrófilo o no hidrófilo, o un oligonucleótido, se sobreentiende que al menos uno de los substituyentes X e Y representa un grupo hidrófilo elegido entre los hidroxi, los amino, los polioles, los azúcares, o los péptidos hidrófilos, o x es igual a 0 o 1, y es un número entero comprendido entre 20 y 50, X es ya sea un átomo de hidrógeno o un grupo -OAlq o Alq representa un alquilo recto o ramificado que contiene 1 a 4 átomos de carbono, e Y es un grupo hidrófilo elegido entre los hidroxi, los amino, los polioles, los azúcares, o los péptidos hidrófilos, llegado el caso bajo sus formas isómeras, así como sus mezclas, o sus sales cuando las mismas existan.
6. 6. Los agentes de transferencia de los ácidos nucleicos de conformidad con las reivindicaciones 1 o 5 de la fórmula general (III) : caracterizados porque: - R representa un policatión, y ya sea x e y, independientemente entre sí, representan números enteros comprendidos entre 10 y 22 inclusive, y X e Y, independientemente entre sí, representan un átomo de hidrógeno o un azúcar, se sobreentiende que al menos uno de los substituyentes X e Y representa un azúcar, - o x es igual a 0 o 1, y es un número entero comprendido entre 20 y 50, X es un átomo de hidrógeno e Y es un azúcar, llegado el caso bajo sus formas isómeras, así como sus mezclas, o sus sales cuando las mismas existan.
7. 7. Agentes de transferencia de los ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 6, caracterizados porque x e y, independientemente entre sí, representan números enteros comprendidos entre 10 y 22 inclusive, y uno de X e ' representa un átomo de hidrógeno y el otro un azúcar.
8. 8. Agentes de transferencia de los ácidos nucleicos de conformidad con una de las reivindicaciones 1 y 5 a 7, caracterizados porque dicho policatión es una poliamina lineal o ramificada, cada grupo amino está separado por uno o varios grupos metileno.
9. 9. Agentes de transferencia de los ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 8, caracterizados porque dicho policatión tiene la fórmula general (II) : en la cual: Ri, R2 y R3 representan independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo (CH2)qNR'R'' con q que es un número entero que puede variar de 1 a 6, esto de manera independiente entre los diferentes grupos Ri, R2 y R3, sobreentendiéndose que al menos uno de Rlf R2 y R3 es diferente de un átomo de hidrógeno, - R' y R' ' representan independientemente entre sí un átomo de hidrogeno o un grupo (CH2)qNH2 con q definido como precedentemente, m representa un número entero comprendido entre 1 y 6, y n y p representan independientemente entre sí los números enteros comprendidos entre 0 y 6, cuando n es superior o igual a 2, con m que puede tomar valores diferentes y R3 significados diferentes en el seno de la fórmula general (II), y cuando n es igual a 0, al menos uno de los substituyentes Ri y R2 es diferente de un átomo de hidrógeno.
10. 10. Los agentes de transferencia de los ácidos nucleicos de conformidad con una de las reivindicaciones 1 y 5 a 7, caracterizados porque dicho policatión es elegido entre la espermina, la espermidina, la cadaverina, la putrecina, la hexametilentetramina (hexamina) , el cloruro de metacrilamidopropil-trimetilamonio (AMBTAC) , el cloruro de 3-acrilamido-3-metilbutiltrimetilamonio (AMBTAC) , las polivinilaminas, las polietileniminas, o los ionenos.
11. 11. Agentes de transferencia de los ácidos nucleicos de conformidad con una de las reivindicaciones 3 a 7, caracterizados porque el o los azúcares son las moléculas de mono-, oligo- o polisacáridos.
12. 12. Agentes de transferencia de los ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 11, caracterizados porque dicho o dichos azúcares son elegidos entre la glucosa, la mañosa, la rhamnosa, la galactosa, la fructosa, la maltosa, la lactosa, la sacarosa, la sucrosa, la fucosa, la celobiosa, la alosa, la laminarabiosa, la gentibiosa, la soforosa, la melibiosa, el dextrano, la a-amilosa, la amilopectina, los fructanos, los mananos, los xilanos y los arabinanos.
13. 13. Agentes de transferencia de los ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 5, caracterizados porque dicho oligonucleótido es cualquier cadena que contiene uno o varios nucleótidos, desoxinucleótidos, ribonucleótidos y/o desoxiribonucleótidos, eventualmente unida o acoplada a una o varias moléculas que tienen distintas propiedades.
14. 14. Agentes de transferencia de los ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 5, caracterizados porque dicho péptido es cualquier cadena que contiene uno o varios aminoácidos unidos entre ellos por enlaces de naturaleza peptídica, eventualmente substituidos por uno o varios grupos alifáticos que pueden ser saturados o insaturados, y lineales, ramificados o cíclicos.
15. 15. El agente de transferencia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene la fórmula:
16. 16. El agente de transferencia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene la fórmula:
17. 17. El agente de transferencia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene la fórmula:
18. 18. Una composición, caracterizada porque la misma contiene un agente de transferencia de los ácidos nucleicos tal como el definido en las reivindicaciones 1 a 17 y un ácido nucleico.
19. 19. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el ácido nucleico es un ácido desoxirribonucléico o bien un ácido ribonucleico.
20. 20. La composición de conformidad con las reivindicaciones 18 o 19, caracterizada porque dicho ácido nucleico comprende uno o varios genes de interés terapéutico bajo el control de las secuencias de regulación.
21. 21. La composición de conformidad con las reivindicaciones 18 a 20, caracterizada porque dicho ácido nucleico es un gen o una secuencia antisentido.
22. 22. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la misma contiene además uno o varios auxiliares.
23. 23. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el auxiliar es uno o varios lípidos neutros.
24. 24. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque los lípidos neutros son los lípidos de dos cadenas grasas.
25. 25. La composición de conformidad con las reivindicaciones 23 y 24, caracterizada porque los lípidos neutros son los lípidos naturales o sintéticos, zwitteriónicos o desprovistos de carga iónica en las condiciones fisiológicas, elegidos por ejemplo entre la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) , oleiolpalmitoilfosfatidiletanolanima (POPE), las do-estearoil, 1-pamitoil, -miristoilfosfatidiletanolaminas así como sus derivados N-metilados 1 a 3 veces, los fosfatidilgliceroles, los diacilgllceroles, los glicosildiacilgliceroles, las cerebrosidas (tales como especialmente los galactocerebrosidas) , los esfingolípidos (tales como especialmente las esfingomielinas) o aún las asialogangliosidas (tales como especialmente las asialoGMl y GM2) .
26. 26. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el auxiliar es un compuesto que interviene directamente o no al nivel de la condensación del ácido nucleico.
27. 27. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el auxiliar se deriva totalmente o en parte de una protamina, de una histona, o de una nucleolina y/o de uno de sus derivados, o bien está constituida, totalmente o en parte, de porciones peptídicas (KTPKKAKKP) y/o (ATPAKKAA) , el número de las porciones puede variar entre 2 y 10, y pueden ser repetidos de manera continua o no.
28. 28. La composición de conformidad con las reivindicaciones 18 a 27, caracterizada porque la misma comprende un vehículo aceptable farmacéuticamente para una formulación inyectable.
29. 29. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 27, caracterizada porque la misma comprende un vehículo aceptable farmacéuticamente para una aplicación sobre la piel y/o sobre las mucosas.
30. 30. La utilización de un agente de transferencia tal como el definido en las reivindicaciones 1 a 17 para la fabricación de un medicamento destinado a tratar las enfermedades .
31. 31. Un método de tratamiento del cuerpo humano de un ser humano o animal, caracterizado porque comprende las etapas siguientes: (1) la puesta en contacto del ácido nucleico con un agente de transferencia tal como el definido en las reivindicaciones 1 a 17, para formar un complejo, y (2) la puesta en contacto de las células del cuerpo humano o animal con el complejo formado en (1).
32. 32. El método de transferencia de los ácidos nucleicos en las células, caracterizado porque el mismo comprende las siguientes etapas: (1) la puesta en contacto del ácido nucleico con una agente de transferencia tal como el definido, para formar un complejo, y (2) la puesta en contacto de las células, con el complejo formado en (1) .
33. 33. El método de transferencia de los ácidos nucleicos en las células según las reivindicaciones 31 o 32, caracterizado porque dicho agente de transferencia y/o dicho ácido nucleico son mezclados previamente con uno o varios auxiliar (es) tales como los definidos en las reivindicaciones 22 a 27.