CZ20003592A3 - Nové sloučeniny vhodné jako činidla pro přenos nukleové kyseliny do buňky, způsob jejich přípravy a farmaceutické přípravky obsahující tyto sloučeniny - Google Patents

Abstract

Řešení se týká nových sloučenin užitečných jako činidla pro přenos nukleóvých kyselin do buněk. Tyto nové sloučeniny zvláště patří do rodiny lipopolyaminových sloučenin a obsahují přinejmenšímjednu cyklickou amidinovou skupinu. Nová činidla podle vynálezu lze použít k přenosu požadované nukleové kyseliny do buněk různých typů in vitro, in vivo nebo ex vivo.

Description

Nové sloučeniny vhodné jako činidla pro přenos nukleové kyseliny do buňky, způsob jejich přípravy a farmaceutické přípravky obsahující tyto sloučeniny

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových sloučenin užitečných jako činidla pro přenos nukleových kyselin do buněk. Tyto /nové sloučeniny zvláště· patří do rodiny lípopolyaminových sloučenin a obsahují přinejmenším, jednu cyklickou amidinovou skupinu. Nová činidla podle vynálezu lze. použít k přenosu požadované.· nukleové kyseliny do¹ buněk různých typů. (transfekci) in vitro, in vivo nebo ex vivo.

Dosavadní stav techniky ' - .

S rozvojem biotechnologie se stává nezbytností· možnost účinného přenosů nukleových kyselin do buněk. To . se týkájednak přenosu nukleových kyselin'- in vitro, např. pro přípravu· rěkombinantních ^proteinů, . tak i pro výzkumné účely pro studium· regulace genové exprese, klonování genů. nebo mnohé další manipulace s DNA. Týká se' to i přenosu nukleových kyselin in vivo, např. při vytváření transgenních zvířat, pro přípravu vakcín, značící studie a také při' terapeutických postupech. A ťýká se to i přenosu nukleových kyselin ex vivo, a sice . při transplantacích kostní dřeně, imunoterapii a dalších metodách, při kterých se přenáší nukleová kyselina do buněk odebraných z organismu ,s^-cílem jejich opětovného podání do organismu., ^f .

vektorů : lze

Lipofectin®) , lipopolyaminy,

Různé druhy syntetických vektorů. byly vyvinuty ke zlepšení přenosu nukleových kyselin do buněk. Mezi dosud známými, syntetickými vektory zaujímají ' pro své' výhodné vlastnosti významné místo kationtové lipidy. Tyto- vektory obsahují ·'kationtovou . polární část, ‘.která vstupuje do ' interakce s nukleovou kyselinou, a- hydrofobní lipidovou část, která usnadňuje průnik do - buňky. Jako příklady takových uvést: mono kat iontové ‘ lipidy. (DOTMA:.

některé kationtové detergenty . (DDAB) , .

zejména ..dioktadecylamidogiycylspěrmin '(DOGS) nebo 5-karboxy-spermylamíd. palmitoylfosfatidyleťanolaminu . (DPPES) , jejichž příprava byla. popsána např. v. patentové přihlášce EP 394 111. - Další kationtové lipidy jsou reprezentovány - sloučeninami ' popsanými . v patentové přihlášce WO 97/18185 (která je zde’ zahrnuta formou odkazu) a jsou-, ilustrovány obr-· 1. '

Kž dosud byly injekce do. tkání, zejména svalů, prováděny . užitím, čisté neformulované DNA, aby , se usnadnil vstup . DNA. do . buněk, neboť . kombinace' se syntetickými vektory vedla často ke vzniku komplexů, které byly příliš· velké na to, aby se mohly dostat do buňky. · · . .

A to je jeden z hlavních problémů, který' je. řešen· předkládaným vynálezem.. Skutečně sloučeniny podle vynálezu mají neočekávanou výhodu v tom, že' dosahují účinnosti transfekce in vivo. do svalu .přinejmenším stejné jako neformulovaná DNA a v každém případě dosahují velmi dobré účinnosti transfekce do jiných tkání. Smíchání DNA se. sloučeninou prostředky pro výpočet ochraňuje DNA před degradací způsobenou nukleázami a/nebo poškozením způsobeným lyofilizací,' což přispívá výrazně ke zlepšení stability nukleolipidových přípravků. Navíc takové směsi dovolují pomalé řízené uvolňování nukleových kyselin.

Podstata vynálezu . Sloučeniny podle předkládaného vynálezu patří do rodiny kationtových'. .lipidů a nesou nový kationtový úsek, který těmto sloučeninám dává zlepšené vlastnosti, jako je zejména snížen cytotoxicita ve srovnání s kationtovými . vektory , dle dosavadního stavu techniky. Tento kationtový úsek je představován jedním nebo .několika polyaminy, nesoucími jednu nebo několik cyklických amidinových skupin, ' které s největší pravděpodobností způsobují delokalizaci pozitivních nábojů, čímž činí charakter sloučeniny celkově méně- 'kationtový, což má prospěšný účinek z toxikolog-ického hlediska.

První předmět předkládaného vynálezu se týká nových sloučenin, v D a L nebo DL formě, které' mají obecný“, vzorec

d); \ ' : '

CA—Rep-—R (I) kde , © CA, představuje cykloamidinovou skupinu a její mezomerní formy obecného, vzorce (II) :

kde - ..

• man jsou celá čísla, navzájem nezávislá, 0 až 3 včetně, přičemž m+n je rovno nebo větší 1, • Ri je skupina obecného vzorce (III):

•(CH,)— YJq (*) (III) kde p a q jsou celá čísla, navzájem, nezávislá, Ó až 10 včetně, Y je . karbonvlová skupina,. aminoskupina, metylaminoskupina nebo - metylenová skupina, přičemž Z může mít různé· významy v různých skupinách [(CH₂)_P-Y], a (*) je buďto atom vodíku nebo je t.o místo prnavázání skupiny Rep,' , přičemž Rf se muže vázat ké . kterémukoliv ' atomu ve vzorci II včetně Z a ve vzorci II je jediná skupina Ri, • X je 'skupina NR₂ nebo CHR₂, přičemž R₂ buďto atom vodíku nebo je. to místo,pro navázání skupiny R₂ definované výše, .-lb-·.

je.

• Skupina —_w i ' ' *1. případ: skupinu podle obecného vzorce (IV):

NH .

i I (IV) kde· W' představuje CHR nebo NR, a R a R jsou, navzájem nezávisle, _atom vodíku, metylová skupina nebo místo' vazby skupiny Ri definované výše, nebo *2. případ:·skupina podle obecného vzorce (V):

NHR' (V) kde W' představuje CHR nebo' NR, a R' a R jsou, navzájem nezávisle, . atom vodíku,, metylová skupina nebo místo vazby skupiny R_xdefinované výše,

- 5 i* ® Rep buďto chybí nebo je to můstek ('spacer). obecného vzorce (VI) • 0

R« R₃ jehož atom dusíku je navázán na·atomy X, V, W nebo Z nebo na substituent Y skupiny Ri v závislosti ně·případu, a přitom • t je celé číslo 0 až 8 včetně, , . .....

• r je celé číslo 0 až 10 včetně,· přičemž R může mít různý význam v různých skupinách -NR₄-(CH) _r-, '' • *R₃, která : může mít různý význam v různých skupinách

NR₄-(ČH)_rR₃, jé atom vodíku, metylová skupina nebo· skupiny podle obecného vzorce (VII): .

kde· u je celé číslo, 1 až 10 včetně-/ s je celé číslo 2 až 8· včetně přičemž, může/· mít různý význam v různých /skupinách - (CH₂) 3-NR5, a Bs. je atom vodíku, skupina. CA definovaná výše, přičemž skupiny CA jsou navzájem, nezávislé a mohou být různé, nebo skupina / obecného vzorce (VII), · přičemž skupiny podle vzorce (Vii) jsou navzájem nezávislé a mohou být různé, • R₄ je definován stejně jako R₃ nebo je to skupina CA definovaná výše., a ^: Θ R. se váže na karbonylovou' skupinu skupiny'Rep obecného vzorce (VI), nebo jestliže Rep chybí, R se váže přímo na skupinu'CA a představuje:

* buďto skupinu vzorce NR₆R₇, kde R₆ a R₇ představují, navzájem nezávisle, atom vodíků,, nebo alifatickou skupinu ·· · · · · · · · · · . · ··· · · · ··· · · ·· * « ·'······· ···· ·· ·· <* · .·· ·« . ,. - 6 obsahující 1 až 22 'atomů uhlíku, která je lineární nebo rozvětvená, nasycená nebo nenasycená, případně fluorovaná, přičemž alespoň jedna ze skupin Rg nebo R7 není vodík a druhá obsahuje 10 až 22. atomů uhlíku-,, * nebo steroidní derivát, ' .

* nebo skupina obecného'vzorce (VIII) φπ—-αφ) (Vlit) kde x je celé číslo 1 až 8 včetně, y je celé číslo 1 až 10 včetně,, a Q buďto' představuje .skupinu C(O.)NR_SR- , kde R₆ a.Ř7 ' jsou jak byly definovány výše, nebo Q představuje skupinu C(G)R₃ kde Rg je skupina podle, vzorce (IX):

kde z je. celé číslo 2 až -8 včetně, a Rg je nasycená nebo nenasycená alifatická skupiny' obsahující 8 až 2.2 atomů uhlíku, případně fluorovaná, nebo steroidní derivát, a dva substituenty R₆ jsou, navzájem nezávisle, 'jak' byly definovány výše, ''' nebo Rg představuje skupinu -O-Rg kde. R_g·. je definováno výše.

Podle jednoho' provedení předkládaného vynálezu je x skupina Ri navázána na Z nebo V, n.a jedné', straně, a 'na skupinu Rep, na druhé straně, prostřednitvím Y.

ý Výhodně cykloamidinová skupina CA podle vzorce (II) obsahuje 5, 6, 7 nebo 8 členů.

Kromě toho v j iné variantě vynálezu Rep jemůstek s 1, 2 nebo 3 rameny.

Jako příklad lze uvést následující můstky:

Podle druhé varianty předkládaného vynálezu R₃ je atom vodíku, -nebo metylová skupina a R₄, je jak byla definována výše,, nebo R₃ a. R₄ přítomné ve vzorci. (VI) přestavují atomy, nebo R₄ je atom vodíku a R₃ je.skupina podle vzorce (VII), kde R₅ je skupina CA.

Výhodně jsou ve vzorci (V) p a q vybrány, navzájem nezávisle, z 2, 3 a 4.

Obecně skupina R obsahuje alespoň jeden hydrofobní segment. Termín hydrofobní segment v předkládané přihlášce znamená jakoukoliv skupinu lipidového typu, která usnadňuje • · /

v

průnik do. buňky.- Zejména skupina R obsahuje alespoň jeden alifatický řetězec nebo alespoň jeden steroidní derivát. .

Ve výhodném provedení vynálezu skupina R je skupina vzorce NRgR₇, kde R₆. a R₇ jsou jak byly definovány výše, nebo je to skupina obecného vzorce .(VIII),' kde Q je skupina C(O)NR₆R.7z kde R₅. a R₇ .jsou.jak byly definovány výše.

Výhodně R_s a/nebo R₇ jsou, navzájem nezávisle, nasycené nebo nenasycené .lineární alifatické řetězce obsahující 10 až 22 atomů uhlíku, výhodně obsahující.12, 14, 16, 17, . 18 nebo atomů uhlíku.’ například to jsou ’ skupiny (CH₂} 1.1.CH3, (CH₂)i3CH₃, (CH₂)₁₅CH₃, (CH₂) 17CH3 nebo oleylová skupina . apod.

Ve. specifickém provedení vynálezu jsou skupiny R_s a R₇ shodné nebo různé a každá z nich 'je alifatická skupina obsahující 10 až 22 atomů uhlíku, · která je’ lineární nebo ' rozvětvená,.'nasycená , nebo nenasycená, případně ’ fluorovaná, jak' byla definována v předchozích odstavcích.

Jestliže R je steroidní derivát, pak je výhodně vybrán . ze skupiny obsahující .cholesterol, cholestanol,. 3-cc-5-cyklo5-á-cholestan-6-fl-ol, kyselinu cholovou, cholesterylformiát, chotestanylformiát, 3g,5-cyclo-5a-cholestan-6p-yÍformiát, cholesterylamin, 6-(1,5-dimetylhexyl)-3a,5a-dimetylhexadekahydrocyklopenta [a] cyklopropa [2,3 J.cyklopenta [1,2-f ] naf tai en10-ylamin.nebo cholestanylamin.

Předkládaný vynález poskytuje 'nové sloučeniny, podle vzorce (I) ve formě netoxických a farmaceuticky přijatelných solí. K těmto netoxickým solím patří např; soli anorganických kyselin (chlorovodíková,. sírová, bromovodíková, fosforečná, dusičná) nebo organických kyselin . (octová, propionová, jantarová, jablečná, hydroxyjablečná, benzoová, fumarová, metansulfonová nebo šťavelová) nebo s anorganickými bázemi (hydroxid sodný, draselný, lithný nebo vápenatý) a nebo φφφφ · φ φ * · φ φ φ • Φ · Φ Φ · · Φ · Φ φ ·

Φ · . Φ · · · φ · Φ φ ·

W · Φ.Φ· Φ Φ Φ ΦΦ< φ φ Φ · ·

- · · ΦΦ · ΦΦφΦ

ΦΦΦΦ φφ φ· φφ φφ »φ s organickými bázemi (terciární , aminy jako. .. je nápř. trietylamin, · piperidin nebo benzylamin).

Jako příklad pro ilustraci výhodných sloučenin podle vynálezu lze uvést následující:.

Sloučenina (1) '

N-dioktadécylkarbamoylmetyl-2- {3- [4-(2-imihotetra.hydropyrimidin-l-yl)butylamino]propylamino}acetamid

Sloučenina (2)

N-ditetradecylkarbamoylitietyl-2-{.3-[4-(2.-iminotetrahydropyrimidin-l-yl)butylamino]propylamino}acetamid _ f Η Η Η η Ό'Χ/Χ/Ν/ΧΧν'Χ

H ,Sloučenina 7(3) . ·. . .

2-(3-{4-[3-(4,5-dihydro-lH-imidazol-2-ylamino)- , propylamino]butylamino}-N-ditetradecylkarbamoylmetylacetamid *ý

- 10 r~\

ΝγΝΜ HN

,. Sloučenina (4) : ', .

$' 2-(3-{'bis [ 3-(4, 5-dihydro-lH-imidazol-2-ylamino) propyl ]. amino}propylamiho)-N-ditetradecylkarbamoylmetylacetamid

Sloučenina (5)

N-ditetradecylkarbamoylmetyl-2-{3-[3-(1,4,.5,6-tetrahydropyrimidÍn-2-ylamino)propylamino]propylamino}- . acetamid

. Sloučenina (6) '

·. N-dioktadecylkarbamoylmetyl-2-( 3-[ 3-(1, 4,5, 6-tetra.£ hydrop.yrimidin-2-ylamino)propylamino]propylamino}• acetamid , ' ·

Sloučeniny podle vynálezu mohou -být připraveny · různými způsoby. Podle prvního způsobu se . sloučeniny podle * předkládaného vynálezu připraví . syntézou .analogických »9 ·· . ·· ·· .-99 99 • · 9 9 9 · 9 9 9 9 9

9.9'' 9 · φ 9 ' 9 9 9 '·'

99999 · 99999 9 9 9 » 9 99 9 9999

- 11 lipoplyaminů- (tj. se stejnou . strukturou,/ ale bez cýkloamidinové , skupiny), kdy se v druhém kroku provede čyklizace na cykloamidinovou skupinu. · Analogické lipopplyaminy mohou být získány jakoukoliv metodou, která je odborníkům _; známa, zejména metodou popsanou v mezinárodní přihlášce WO 9.7/18185. nebo podobnou metodou. Cyklizaci amidinových konců lze provést 'nap.ř. reakcí mezi jedním a/nebo několika primárními skupinami lipopolyaminů aminovými a·činidly jako je hydrogensulfát sulfát O-metylisomočoviny. [J. Med·. Chem·. , 1995', , 38(16), pp . -3053-3061] nebo hemisulfát

S-metylisothiomočoviny [Int. J. Pept. -Proť. Res., 1992, 40, pp. 119-126] . Výhodně se' postup provádí ve 'vodném /prostředív přítomnosti báze za tepla ' [J. Med. Chem. ,· 1985, pp. 694-698 and . J. Med., . Chem., 1996, pp. 669-672]. K. výhodným rozpouštědlům patří směsi voda/alkohol nebo dimetyl formamid.· Jako bázi/ lze··'· užít· : tuietylamin, · N-eťyldiisopropylamin, hydroxid sodný, hydroxid draselný a další. Teplota je výhodně .40 až 60 °C,' výhodněji se reakce provádí při 50 °C.

Jiná . metoda spočívá v tom, že se syntetizují stavební bloky nesoucí cykloamidinovou funkční skupinu, které jsou pak roubovány na lipidy vybavené můstky. Tato metoda má výhodu., že. umožňuje přístup k velkému počtu produktů. Pro, účely předkládaného vynálezu- termín bloky' nebo „stavební, bloky znamená ’ jakékoliv . funkční .segmenty -molekuly. Např. cykloamidihová skupina CA,; jak je definována'obecným vzorcem (II), ' Rep nebo R- představují, každý samostatný blok ve smyslu definice v popisu předkládaného vynálezu.

- - Postup lze např. provádět'následujícím způsobem:

44 *· 4·- ·· ·· • · 4 · · 4 · 4 4 4 4 4

4 -· · ·· « · 44 e

444»· · 4 4 4 *4 4« · • · 44 · 4 4··

4444 44 ·· ·* 44 ·«

1) Syntéza stavebního bloku R:

a) jestliže R je -NR_SR₇, pak je buďto komerčně dostupný nebo může být syntetizován jednou z následujících metod:

• alkylační redukcí mezi aminem nesoucím' skupinu R₆ a aldehydem nesoucím, skupinu. R₇. Reakce se provádí . výhodně v chlorovaném rozpouštědle (jako je např chloroform, . 1,2-dichloretan apod. [J. Org.

dichlormetán, Chem., 1-996, pp. '384 9—38 62] ) nebo v jakémkoliv organickém rozpouštědle, . ( ' · · ' ' ' ' ‘- které, je s reakcí kompatibilní., (např. tetrahydrofuran), v přítomnosti triaceto.xyborohydridu sodíku, kyanoboróhydridu sodíku nebo jejich derivátů, (např. kyanoborohydridu lithia, Chem. Soc., - 1971, pp. 289.7-2904)- a kyseliny viz J. Am octové.

• nebo substitucí odstupující skupiny nesené skupinou R_Sz aminem nesoucím, skupinu R₇. Jako příklad odstupující skupiny lze uvéstatomy'halogenových prvků (Br, Cl, .I) nebo tosylové nebo mesylové 'substituenty apod. Reakce se výhodně provádí v přítomnosti bazického činidla, např. uhličitanu sodného, hydroxidu draselného., .trietyláminu apod., v .alkoholu (např. etanolu) -pod refluxem (varem, pod zpětným chladičem) [J. Am. Chem. Soc. , 1996, pp. 8524-8.530].

• kondenzací . mezi mastnou., kyselinou (nebo jejími deriváty Jako jsou chloridy mastných'kyselin) mastným aminem.’ Získaný amid: je pak redukován.· hybridem, např. lithiumaluminiumhydridem, nebo jakýmkoliv jiným hydridem odborníkovi známým, v éteru (např.’ tetrahydrofuranu (THF), t-butylmetyl.éteru (TBME), dimětoxye.tanu (DME)..

b) Jestliže R je skupina podle obecného vzorce (VIII)., provádí se peptidové kondenzace mezi skupinou . Q a H- [NH- (CH'₂) _x] yCOOH. Kondenzace peptidů 'se provádí ·* • 4 ' ··

9 94 9 ·· 9 9 9 4

9 4 9 4

4944 44 99 94

ϊ' Z'

- 13 metodami' odborníkovi známými (Bodanski M., Principles and Practices of peptide Synthesis, Ed. Springe-Verlag) nebo jakoukoliv jinou obdobnou metodou, provádí v přítomnosti, nenukleofilní aprotickém rozpouštědle (jako - je dimetylformamid, . metýlpyrrolidon, reakce se zejména báze vé vhodném např.. chloroform, acetonitril, dichlorometan apod.), v teplotě 0 až 100°C, a pH upraveném na 9.až 11. ' ./

Q je buďto komerčně dostupná, nebo jestliže' Q jeskupina· C(O)R₃ se skupinou R_a podle vzorce (IX), lze ji syntetizovat reakcí chloroformiáťu, který je komerčně ..dostupný (např. cholesterylchloroformiát) nebo získaný způsobem odborníkovi známým z komerčně dostupného chloroformiáťu, a diaminu, .který je komerčně dostupný, (např. N-etylenediamin). nebo je získán obvyklým . způsobem odborníkovi známým. .Reakce se . výhodně provádí v chlorovaném ¹ rozpouštědle (např. dichlo.řmetan, chloroform, 1,2-dichloretan apod.) nebo v jakémkoliv jiném organickém rozpouštědle kompatibilním s reakcí, jako je např. dimetylformamid, dimetylsulfoxid, acetonitrilapod..

Skupina H-[NH-(CH2) x]y-CÓOH je .komerčně dostupní aminokyselina, když y se rovná 1, nebo se získá pomocí jedné nebo několika ky-anoetylačních. .'reakcí postupem,, který je popsán v následujícím textu pro syntézu Rep, když y je větší než' 1. . . ' .2) Syntéza stavebního bloku Rep ' ' . .

Skupina Rep se získá kyanoetylací nebo dikyanoetylací (v závislosti na tom, zda se má získat Rep s lineární nebo rozvětvenou strukturou) aminokyseliny se, vzorcem

HOOC-(CH₂) _r-NH₂ ' a následující redukcí, nitrilových funkčních skupin na aminové skupiny.

• · · · · · • · · · · • · β « « ····.♦ · · · • · · · · ·· ·· ··

a) Mono- nebo dikyanoetylace:

CN

HOOC-(CH,)r—Νΐς ⁺ ~ Γ~~

R'

Z

R‘—N H

Γ-1

CN

R' r-l

CN

Výhodně se reakce provádí v bazickém vodném prostředí. Např. ,se. reakce provádí v rozpouštědle jako je voda, alkoholy (etanol, metanol apod.)·, v přítomnosti báze jako je hydroxid sodný, hydroxid draselný,· trietylamin .apod. V případě monokyanoětylace se provád-i celý proces.· výhodně při. nízké teplotě [J. Am. Chem. Soc., 1950, pp. . 2599-2603] . V případě dikyanoetylace· se provádí celý proces výhodně při zvýšené /teplotě a. s nadbytkem acetonitrilu . [J. Am. Chem. Soc.., 1951, pp. 1641-1644'] . . ' '

b) Redukce niťrilových funkčních skupin na aminové skupiny se provádí katalytickou· hydrogenací v bazickém, prostředí nebo jakoukoliv jinou. metodou odborníkovi známou. Ták např. je možné užiti oxid platiny nebo ·. Raneyho nikl ¹ jako . . katalyzátory [J. Org'. Chem., 1988, pp. 3108-3111 ].. Výhodně je vybrané rozpouštědlo alkohol '(.etanol, metanol apod.) v přítomnosti báze jako .je hydroxid sodný, hydroxid draselný, trietylamin apo'd.

·· ·· ··- ·· ·· ·· '·-·'·· · » · · · « · · • · · · · 4 4 · 4 4 4 • ··· · · · ··· * · · e · • · · · 4 ···· ···· ·· ·· 44 ·· ··

- 15 3) Syntéza stavebního bloku Rep-R:

Stavební blok Rep-R se získá peptidovou kondenzací mezi kyselinou Rep a aminem R, které byly získán v předchozích krocích. Peptidová kondenzace se provádí obvyklou metodou odborníkovi známou (viz Bodans.ki M., Principles and Practices , of peptide Synthesis, Ed. Springe-Veríag) nebo jakoukoliv, jinou podobnou metodou, která- je známa. Zejména lze reakci provést v přítomnost nenukleofilní báze ve vhodném aprotickém rozpouštědle . (jako· je např.. chloroform,. dimetylfórmamid,

T , . metylpyrrolidion, acetonitril, dichlorometan apod.) při

-teplotě 0 až 100 °C a pH nastaveném na 9 až 11. _t

4) Syntéza sloučenin CA-Rep-R podle vynálezu:

Sloučeniny -podle vynálezu se .získávaj í jednou- z několika následujících metod: .. .

. a) kondenzací v bazickém prostředí, mezi koncovou . aminoskupinou. na Rep-R získaném v předchozím kroku a CA-S- CH₃, a sice obvyklým způsobem odborníkovi známým. Reakce 'se výhodně provádí v chlorovaném rozpouštědle (např. dichlorometan,- chloroform apod.) nebo v jiném organickém rozpouštědle kompatibilním' s reakcí, jako je voda, alkohol·, dimetylfórmamid apod., . a. v přítomnosti báze (jako je '· trietylamin, . hydroxid- sodný, - hydroxid draselný nebo « - N-etyldiisopropylamin apod.) při teplotě místnosti (přibližně

0 °C) . ·.,

..Stavební blok CA-S-CH₃ je buďto komerčně dostupný (to je například 2-metyÍthio-2-imidazolinhydrojodid) nebo ho lze připravit působením sulfidu uhličitého na vhodnou diaminovou skupinu (vybranou podle^: toho, kde se má získat cykloamidinová funkční skupina) a pak metylací. Tak např. reakční schéma může být znázorněno následujícím způsobem:

‘•Ť*—' • · · · · · ·· · · · · • · · · · · · · · · ·· · • · · · · · · ····

:<r

Výhodně se reakce provádí .v alkoholu (např. etanolu). Metylační krok se provádí působením halogenmetylové skupiny, přičemž halogenem je např. jód [J.. Am. Cem. Soc., 1956, pp. 1618-1620 and Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, pp. 351-35'4].·

b) . ' Vnitřní cyklizací .cykloamidinové skupiny z aminoskupin přítomných v Rep-R působením hydrogénsulfátu O-metylisomočovihy nebo hemisulfátu S-metylisomočoviny.' Výhodně se reakce provádí ve vodném prostředí v .přítomnosti báze za zvýšené teploty (J. Med.· Chem., 1985, pp. 694-698. and J. Med.. Chem., 1996, pp. 6.69-672] .

Jako výhodné rozpouštědla lze uvést.směsi voda/alkohol nebo dimetyl formamid.- , Jako ' vhodné báze lze užít, např. tríetylamin,- N-etyldiisopropylamin, hydroxid draselný apod. Výhodná teplota je 40 až 6.0 °C, výhodněji sé. reakce provádí’ při 50' °C.

- c) Peptidovou kondenzací mezi CA-COOH á Rep-R obvyklým způsobem, který je- odborníkovi znám a byl již popsán výše. Stavební blok CA-COOH lze získat různými způsoby:

• působení stavebního bloku CA-S-CH₃ na aminokyselinu nebo polyaminokyselinu' způsobem odborníkovi známým nebo. jakoukoliv jinou obdobnou metodou. [J. Am. Chem.

• . / . · ' .

Soc., 1956, pp. 1618-1620]. Stavební.blok CA-S-CH₃ je získán • t 99

stejným způsobem jako výše, a . aminokyselina nebó polyaminokyselina je vybrána v závislosti na požadované 'sloučenině, podle předkládaného vynálezu, nebo • působením S,S-dimetyltosyliminothiokarbonimidátu nebo jeho derivátu na polyaminokyselinu /způsobem odborníkovi známým nebo jakoukoliv podobnou metodou [J. Org. Chem., 1971, pp. 46-48]. Výhodně se reakce provádí v etanolovém prostředí p' . za přítomnosti báze⁷ (např. hydroxid -so.ďný) a/ při . teplotě

- refluxu směsi. , . Jako příklad stavebních bloků CA-COOH, které lze získat, je možné - uvést·následující stavební.bloky:

%í‘

NH

a

Ve všech reakcích popisovaných v předkládané přihlášce, když, aminové substituenty přítomné v různých skupinách mohou narušovat prováděné reakce, je výhodné, chránit je předem kompatibilními - skupinami, které mohou být vneseny a zase odstraněny, aniž by došlo k ovlivnění zbytku, molekuly.

·· 9· ·· ·· ·· ·· '· « · · · ·· · · «·/· ·· · · · · » * ·· · • ··· · · · ··· · · 9,4 · e · ·· · · · » · ···· ·· ·· ·> ·· ··

1«

Tak např. uvedených v Svnthesis, J ochranné skupiny se mohou vybrat ze skupin T.W. GREENE, Protective Groups. in Organic

Wiley-Inte-rscience Publication (1991) , nebo

MčOmie> Protective Groups in Organic Chemistry, Plenům Press (1973).. ··. '·'

Další předmět předkládaného vynálezu se týká přípravků, které obsahují alespoň 'jednu sloučeninu podlé .vzorce (I) Uvedenou výše.· Zejména jde o přípravky, které obs.ahují alespoň jednu sloučeninu' podle vzorce (I) uvedenou výše a nukleovou kyselinu. Když se sloučenina podle vynálezu á nukleová kyselina uvedou do kontaktu, vytvářejí komplexy v důsledku interakce mezi kladnými náboji přítomnými při fyziologickém pH na sloučenině podle vynálezů a negativními náboji nukleové- kyseliny. Tyto komplexy se v textu předkládané· přihlášky nazývají .nukleolipidové komplexy'.

Výhodně jsou sloučeniny podle vynálezu a nukleové kyseliny přítomny· v takovém množství, že poměr kladných nábojůsloučeniny a' záporných nábojů nukleové kyseliny je 0,1 až 50, výhodně 0,1'až 20. Tento' poměr. se dá. snadno nastavit .odborníkem v závislosti na použité sloučenině, nukleové kyselině a požadované aplikaci, (zejména typu buněk, které· mají být transfekovány).

.i

Termín „nukleová kyselina v popisu předkládaného vynálezu znamená jak deoxyribonukleovou tak i ribonukleovou kyselinu. Mohou to být^přirozené nebo umělé sekvence, zejména genomová DNA (gDNA)', komplementární DNA (cDNA), mediátorová. RNA (mRNA), transferová RNA (tRNA), ribosomální RNA (rRNA), hybridní sekvence nebo syntetické či.semisýntetické sekvence, oligonukleotidy, modifikované, i nemodifikované, atd. Tyto nukleové kyseliny mohou., být· lidského, živočišného, ·· ·· ·· ·· ·· ·· > » * · * ·· · · a · • · a a a a a a a * a a aa a a a a a a a a aa >· ·· • a aa

j.y nukleové kyseliny . ve expresních kazet -apod.

rostlinného, bakteriálního nebo virového původu. Lze je připravit- jakýmikoliv metodami známými v oboru, zejména screeningem¹ knihoven, . chemickou syntézou .nebo smíšenými metodami, včetně .chemických nebo enzymatických modifikací sekvencí získaných primárně screeningem knihoven. Mohou být chemicky modifikovány.

Pokud se týká konkrétně deoxyribonukleových kyselin, mohou to být jednořetěžcové nebo dvouřetězcové molekuly, jak dlouhé molekuly tak i krátké oligonukleotidy. Výhodně jsou formě plazmidů, vektorů, episomů, Deoxyri.bonukleové kyseliny nesou geny s terapeutickým využitím, sekvence pro· regulaci transkripce nebo replikace, . anti-sense sekvence, které jsou· modifikované a jiné,, úseky pro vazbu k jiným buněčným složkám a pod. ·. ·

Výhodně obsahuje- nukleová kyselina expresní' .kazetu obsahující jeden nebo několik genů's terapeutickým využitím, které jsou řízeny, jedním, nebo několika promotory a terminátory transkripce, které jsou aktivní v cílových buňkách. * · ·

Termín expresní kazeta požadovaného genu znamená v popisu'předkládaného vynálezu fragment DNA, který může být vložen do vektoru ve. specifických rěstrikčních místech. Tento fragment DNA /obsahuje, sekvenci nukleové kyseliny kódující požadovanou RNA nebo polypeptid a navíc obsahuje sekvence nezbytné pro expresi (jedna nebo několik . zesilovacích sekvencí, tzv. enhacery, jeden nebo několik promotorů,, .pólyadenylační sekvence apod.). Kazeta a restrikční místa jsou navrženy tak, aby zajistila vložení expre-sní kazety do vektoru ve shodě se čtecím rámcem pro. transkripci a translaci. ' .

·· ··

Β · * · » · · ·

Β · ···

Β Φ β ' φφ . «· • ·· • · · • · φ • Φ ,

Β

Β · φ Β

Β Φ Φ « • Φ ΦΦ

Obecně se jedná ο plazmid nebo episom nesoucí jeden nebo. .několik požadovaných' terapeutických genů.; Jako příklad lze uvést plazmidy popsané, v-patentové přihlášce WO .96/26270 'a WO 97/103.43., které jsou zahrnuty formou, odkazu,.

„Geny s terapeutickým využitím nebo terapeutické geny • v popisu předkládaného vynálezu . j sou konkrétně .j akékoliv geny kódující proteinový produkt mající terapeutický účinek. Proteinový produkt 'je protein, peptid a pod. Proteinový i - , ' .produkt je homologní ve' vztahu k cílové buňce, čili produkt, _si . který, je normálně exprimován v cílové buňce, pokud buňka není.

v patologickém stavu.. V takovém případě exprese proteinu umožňuje např. zmírnit . nedostatečnou expresi v buňce nebo expresi proteinu, . . který je nedostatečně. aktivní kvůli modifikaci nebo· nadměrně exprimovat požadovaný . protein ’ („ovérexprese) Terapeutický, gen může také kódovat- mutantu • . buněčného proteinu, , která má zvýšenou - stabilitu, modifikovanou aktivitu apod. Proteinový produkt může být také heterologní ve vztahu „k cílové buňce.. V takovém případě exprimovaný protein např. poskytuje nebo doplňuje aktivitu,' která v buňce chybí, ..což dovoluje bojovat s patologickým stavem nebo např. stimulovat imunitní reakci. .

. K produktům s terapeutickým využitím vhodným k využití. podle -předkládaného vynálezu . patří např. enzymy, krevní deriváty, hormony,, lymfokiny: interleukiny, interferony, TNF , a pod, (viz' patent FR 9 203 120), růstové faktory', neurotransmitery nebo jej ich'· prekurzory -nebo enzymy jejich *' syntézy, trofické faktory (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, .aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotropin a pod.),.. apolipoproteiny . (apo AI, apoA-IV, apoE apod.), dystrofin. nebo minidistrof in '(viz přihláška FR 91/11947), CTFR protein asociovaný s · cystickou fibrózou, nádorový supresorový gen (např. P53, Rb,

-raplA, DCC, k-rev a pod., viz přihláška. FR 93/04745), geny ··· e

·· ··· e

*.· ···· kódujíc faktory podílející se na krevní koagulaci (faktory VII, VIII, IX),· geny účastnící se reparace DNA, tzv. sebevražedné geny (thymidinkináza, cytosindeamináz.a), geny pro hemoglobin nebo jiný transportní protein, geny metabolíckých enzymů, katabolických enzymů apod.

Terapeutické nukleové kyseliny mohou být také geny nebo anti-sense sekvence, jejichž exprese v'cílové buňce umožní kontrolovat expresi genů nebo transkripci buněčných mRNA. Takové sekvence mohou např. Být transkribovány v cílové, buňce, do RNA, která je komplementární k buněčné .mRNA a tudíž blokuje translaci do proteinu, což bylo popsáno v 'evropském patentu EP 140 308. K terapeutickým genům patří také sekvence kódující ribozymy, které, jsou schopné, selektivní destrukce cílové RNA (viz EP 321201). . ¹

Jak bylo již zmíněno výše.,, nukleové kyseliny mohou .obsahovat jeden nebo několik genů /kódujících antígenní peptidy, které jsou schopné indukovat, imunitní reakci u člověka nebo zvířete. V takovém specifickém, provedení předkládaný vynález umožňuje produkci vakcin nebo provádění imunoterapie . u' člověka ' nebo zvířete, . zejména proti mikroorganismům, virům nebo rakovině. Mohou to být konkrétně antígenní peptidy specifické pro virus Epstein-Barrové, HIV, virus hepatitidy B (viz EP 185 573), virus pseudorabies virus tvořící syncitia SFV.' a další viry nebo specifické pro nádory (viz EP 259 212) .

Výhodně nukleové .kyseliny také obsahují sekvence umožňující expresi terapeutických genů a/nebo genů kódujících antígenní'peptidy v požadovaných-buňkách nébo orgánu. Jsou to sekvence, . které jsou přirozeně zodpovědné za expresi požadovaného genu, pokud jsou tyto sekvence funkční v infikované buňce.. Také to mohou být sekvence odlišného původu (zodpovědné za expresi jiných proteinů nebo dokonce syntetické sekvence). Zejména to jsou promotorové sekvence eukarýotických nebo virových genů. Např. jsou to promotorové sekvence pocházející z genomu buněk, které . 'mají být infikovány. .Podobně, to mohou být promotorové sekvence pocházející z virového genomu. V této. souvislosti lze -jako příklad zmínit· promotory genů E1A, MLP, CMV a RSV. Kromě toho, tyto expresní sekvence mohou být modifikovány přidáním aktivačních nebo regulačních sekvencí a. pod. Promotor může být indukovatelný nebo reprimovatelný.

Navíc nukleová kyselina může. obsahovat/ zejména v poloze „upstream (proti směru transkripce) od terapeutického genu, signální ' sekvenci, . směruj.ící syntetizovaný . terapeutický produkt do sekretorické dráhy cílové buňky. Signální, sekvence je buďto přirozená signální- sekvence terapeutického produktu nebo.' to může být jakákoliv jiná funkční . signální sekvence nebo¹ i. umělá .signální sekvence. Nukleová kyselina může' také obsahovat signální sekvenci směřující .syntetizovaný terapeutický produkt do určitého kompartméntu v.buňce.

< 'Přípravek podle předkládaného 'vynálezu navíc může obsahovat adjuvans · schopné. kombinace s· ’ ' komplexem

I · transfekčního činidla a nukieové kyseliny, které zlepšuje transfekční účinnost. '

Jedno provedení, předkládaného vynálezu se proto týká přípravku, který obsahuje nukleovou kyselinu, sloučeninu podle vzorce : (I) definovanou výše a jedno, nebo několik adjuvans schopných kombinace s nukleolipidovým komplexem sloučenina (I) /nukleová kyselina a. zlepšujících transfekční účinnost. Přítomnost takové druhu adjuvans (jako jsou např. lipidy,' peptidy nebo. proteiny) ' umožňuje výhodně zvýšit transfekční-účinnost sloučeniny podle vynálezu.

V tomto smyslu .přípravky podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat jako -adjuvans jeden nebo několik neutrálních neutrálních nukleolipidových částic i v lipidů. Takové přípravky jsou zvláště výhodné, zejména pokud je poměr nábojů R nízký. .Původce skutečně ukázal, že, přidání lipidů umožňuje . zlepšit vytváření a překvapivě podporuje pronikání částic do buňky tím, že destabilizuje membránu.

Výhodněji jsou neutrální .lipidy pojužité v přípravku, podle předkládaného vynálezu lipidy obsahující dva mastné řetězce. Zvláště výhodné je použití přírodních nebo' syntetických lipidů, které jsou ,za fyziologických podmínek ve formě zwitteriontu· nebo postrádají iontový náboj. Takové lipidy . jsou, vybrány ze skupiny., obsahující. dioleo.ylfosfatidyletanolamin (DOPE) , o.leoylpalmitoylfosfatidyletanolamin (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl,.· -cholesteryl, -myristoýlfosfatidyletanolaminy včetně jejich derivátů, které jsou jednou až třikrát N-metylované,·. -fosfatidylglyceroiy, glykosyldiacylglyceroly, cerebro.sidy. (zejména např. galaktocerebrosidy), sfingolipidy (zejména např. sfingomyeliny), nebo asialogangliosidy ,(zvláště např. asialoGMl a GM2) .

Tyto různé lipidy lze získat buďto syntézou nebo extrakcí . z orgánů . (např. z mozku) nebo. z vajíček, . a sice konvenčními způsoby odborníkům známými.. . Konkrétně . např. extrakcí neutrálních lipidů, lze ,,provést pomocí·, organických rozpouštědel (viz také Lehninger, Biochemistry).

Původce také nedávno ukázal, že bylo zvláště výhodné použití jakožto adjuvans sloučenin přímo se podílejících na. kondenzaci 'nukleových kyselin (WO 96/25508). Přítomnost takových sloučenin v přípravcích pro třansfekci založených na lipopolyaminech dovoluje výrazně snížit množství sloučeniny podle vzorce (I), což má příznivé .důsledky z toxikoldgického hlediska, aniž by se však projevilo jakékoliv zhoršení transfekční účinnosti. Termín sloučenina podílející se na kondenzaci nukleových kyselin . definuje v popisu ··· · · z 4 .

předkládaného vynálezu- sloučeninu,/, která. vede ke kondenzaci nukleové kyseliny, ať přímo nebo nepřímo. Přesněji řečeno, tato sloučenina působí buďto přímo na úrovni nukleové kyseliny, která je transfekována, nebo se účastní kondenzace na úrovni dalších látek, které jsou přímo v kondenzaci nukleové kyseliny. Výhodně působí zúčastněny přímo na úrovni nukle.ové kyseliny/ Předkondenzačním činidlem je polylysin. Ve výhodném činidlo -účastnící se odvozeno, zcela' nebo kondenzace částečně, zvláště jakýkoliv polykation, např provedení předkláda.ného vynálezu nukleové kyseliny je z protaminu, histonu, nukleolinu a/nebo jejich derivátů. Toto činidlo j.e také tvořeno, zcela, nebo/částečně, peptidovými jednotkami (ΚΤΡΚΚΑΚΚΡ) a/nebo (ΆΤΡΑΚΚΆΑ), přičemž počet těchto jednotek může být 2 až Ϊ0. Vě.struktuře sloučeniny podle předkládaného, vynálezu, se mohou tyto. jednotky opakovat souvisle bez -přerušení za sebou· nebo jinak. Mohou být odděleny spojovacími můstky biochemické povahy, tj: např. jednou nebo několika aminokyselinami, nebo spojovacími můstky chemické povahy.·

Výhodně přípravek podle předkládaného, vynálezu obsahuje 0, 01 až 20 ekvivalentů jednoho nebo více adjuvans · na jeden ekvivalent,nukleové kyseliny (mol/mol) a ještě výhodněji 0,5 až 5.

Ve zvláště výhodném' provedení přípravek’ podle vynálezu obsahuje navíc zaměřovači prvek, který umožní nasměrovat přenos nukleové kyseliny. Tento zaměřovači prvek může být extracelulární zaměřovači prvek umožňující orientovat přenos DNA' do určitých buněčných typů nebo určitých požadovaných tkání (nádorové buňky, jaterní buňky, hematopoetické buňky apod.). Může to být také intracelulární zaměřovači prvek umožňující orientovat přenos nukleové kyseliny do výhodného kompartmentů (mitochondrie, jádro apod.). Zaměřovači prvek '· · ·« • ··« ► < I · · · · • ··· · « · · • · · · · » 4· ·· ·« je spojen se. sloučeninou podle vynálezu nebo také s, nukleovou kyselinou, jak bylo popsáno výše.

K zaměřovacím ..prvkům podle vynálezu patří cukry, peptidy,· proteiny, oligonukleotidy, ' lipidy, nervové přenašeče, ' hormony, vitamíny nebo jejich 'deriváty. Výhodně, jsou to cukry, peptidy nebo proteiny jako např. .protilátky nebo jejich fragmenty, ligandy buněčných receptorů apod. Konkrétně to mohou být ligandy 'receptorů růstového faktoru, cytokinových receptorů, receptorů typu buněčných lekt.inů, nebo RGD-sekvence obsahující ligandy s'afinitou k receptorům pro, proteiny buněčné adheze jako např. integriny. ' Lze. dále uvést receptory pro. transferiny, HDLa LDL 'nebo přenašeč řolátu. zaměřovači prvky mohou být také cukry, které umožňují zaměřit lektiny jako jsou receptory pro asialoglykoproteiny. nebo síalidy.jako je. např. sialid Lewis X, nebo alternativně fragment Fab protilátek nebo .· j ednořeťězcová protilátka. (ScFv) . i. ' - , ' ‘ .'

Kombinace zaměřovacího prvku,s nukleolipidovým komplexem podle vynálezu' lze dosáhnout způsobem' odborníkovi ' známým, např. ;navázáním k .'hydrofobní části nebo- k části ' sloučeniny' podle .vzorce (I),' která vstupuje do interakce' s nukleovou kyselinou, nebo alternativně - keskupině, která interaguje se sloučeninou podle vzorce (I) podle, vynálezu nebo -s nukleovou kyselinou. Interakcí- je myšlena,, vy výhodném provedení vynálezu, interakce· iontové nebo kovalentní. povahy.

V jiné variantě předkládaného.- vynálezu, 'přípravek obsahuje také alespoň jeden neiono.tvý surfak.tant (povrchově aktivní činidlo) . v^;dostatečném množství k tomu, abv stabilizoval velikost částic nukleolipidového komplexu sloučenina podle vzorce (I)/nukleová kyselina. Vnesení neiontového surfaktantů zabraňuje vytváření agregátů, což činí přípravek zejména vhodný pro podávání in vivo. Přípravky

Z ϋ ' podle vynálezu obsahující takové neiontové surfaktanty mají také výhodu z- hlediska bezpečnosti. Další jejich výhodou je 'to, ' že snižuji ..riziko interference s' jinými, proteiny., vzhledem k redukci celkového náboje nukleolipidového komplexu.

Surfaktant je výhodně tvořen alespoň jedním hydrofobním Segmentem a alespoň jedním hydrofilním. segmentem. Výhodně je hydrofobní segment vybrán ze, skupiny, obsahující alifatické řetězce, polyoxyalkyleny, aikylidinpolyestery, polyetylen. glyko.ly ' s· benzylpolyétěrovou hlavou a cholesterolem, a hydrofilní segment . je vybrán ze.' skupiny obsahující polyoxyalkyleny, polyvinylakoholy, polyvinylpyrrolidony nebo sacharidy, takové neiontové surfaktanty byly popsány v patentové přihlášce WO 98/34648. · .

Předmětem předkládaného.. vynálezu je také. použití sloučenin podle obecného vzorce (I) pro výrobu léků k léčení nemocí přenosem, nukleových kyselin (obecně pblyaniontůj /ďo· primárních buněk nebo stálých buněčných linií. Tyto buňky 'jsou fibroblasty, svalové buňky,' nervové buňky (neurony,. astrocyty, glíové buňky), jaterní buňky, buňky hematopoetické řady (lymfocyty,. CD34, dendritické buňky apod.) , epi.telové buňky apod. ,· .'a sice v diferencované nebo pluripotentní formě, (prekurzory) . .·

Takové použití je zvláště, výhodné, protože' sloučeniny, podle obecného vzorce (I). podle vynálezu mají sníženou cytotoxicitu ve srovnání . s dosud užívanými , kationtovými lipidy podle stavu techniky. Původce vynálezu zejména ukázal, že při velmi vysokém' poměru nábojů, který obvykle vede. k usmrcení zvířat po transfekci, nebyla, detekována žádná •zjevná cytotoxicita. . ,

Sloučeniny podle' předkládaného vynálezu se mohou užít zejména pro in vitro, ex vivo nebo in vivo transfekci DNA

Β •J

kódující proteiny nebo polypeptidy, což je zde uvedeno formou ilustrace..

Pro použití in vitro,. . ať již pro. terapii nebo pro studium' regulace genů nebo vytváření zvířecích modelů nemocí, přípravky podle předkládaného vynálezu jsou formulovány pro topické, kutánní, perorální, rektální, , vaginální, parenterální, intranasální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní/ intraokulární, . transdermální, intratracheální nebo intraperitóneální .podávání·. Výhodně přípravek podle předkládaného .vynálezu obsahuje vehikulum, . které ' je farmaceuticky přijatelné pro injikovateihé přípravky, zejména pro přímou, injekcí do požadovaného orgánu, nebo pro topické podávání (na kůži a/nebo na sliznici). Takovým vehikulem jsou zejména, i.sotonické sterilní roztoky. Nebo se jedná o suché, zejména lyofilizované přípravky, které v závislosti na případu buďto vody nebo roztoku, umožní rekonstituovat injikovateIný roztok. Dávky nukleové kyseliny použité pro injekce stejně jako jejich počet. se upraví v závislosti na různých parametrech, ..zejména podle způsobu ' podávání, relevantní nemoci., genu, který se má expřimovať, 'nebo . požadované doby léčení. Pokud' se' týká způsobu podávání, jedná se. buďto o přímé injekce do tkání, např. přímo do nádorů,, nebo do krevního oběhu, a nebo se ošetří buňky v buněčné kultuře a pak se reimplantují in vivo. injekcí nebo transplantací..

Relevantní tkáně jsou např. svaly, kůže, mozek, plíce, játra slezina, kostní dřeň, brzlík, srdce, lymfatícká tekutina,· krev, chrupavka, pankreas, ledviny, močový měchýř/ žaludek, střeva, varlata, vaječníky, .konečník, nervový systém, oči, žlázy, pojivová tkáň apod. Výhodně je transfekovanou tkání sval a plicní tkáň.

po . přidání, fyziologického

Předkládaný vynález nukleových kyselin do následující kroky:.

ř' se dále týká způsobu přenosu buněk, který způsob obsahuje

Ί) nukletívá kyselina' se uvede do ..kontaktu se sloučeninou podle vzorce (I) podle vynálezu, aby se vytvořil nukleolipidový komplex,

2) buňky se přivedou do kontaktu, s nukleolipidovým komplexem vytvořeným podle bodu 1).

Buňky se přivedou do kontaktu s komplexy tím, že se buňky s komplexy inkubuj 1 (při použití. in 'vitro .nebo ex vivo) nebo se komplexy injikují do organismu (při použití in vivo). Inkubace se výhodně provádí v přítomnosti např. 0,01 až 1000 pg nukleové ..kyseliny na 10⁶ buněk. Pro podávání in vivo se užívají např. dávky nukleové kyseliny v rozmezí 0,01 až mg.

. Pokud přípravek, podle vynálezu obsahuje .navíc jedno nebo několik adjuvans, jak byla- definována výše, adjuvans se předem smíchá se sloučeninou podle vzorce.(I) podle vynálezu a nebo s r.ukleovou kyselinou. . .

Předkládaný vynález poskytuje zvláště výhodný způsob léčení nemocí,. který obsahuje in vivo, ex vivo' nebo in vitro podávání nukleových kyselin kódujících protein nebo transkript. nukleové kyseliny, které jsou schopné upravit •léčenou nemoc, v kombinaci se sloučeninou podle vzorce (I) předkládaného vynálezu, za podmínek popsaných .výše. Tento způsob je/zvláště využitelný v. případě ^!nemocí,· které jsou důsledkem nepřítomnosti nebo nedostatku proteinu nebo produktu.nukleové kyseliny. Podávaná nukleová kyselina kóduje -požadovaný proteinový produkt nebo obsahuje požadovanou nukleovou kyselinu. ' .

• · ' • · · ·

Předkládaný vynález se dále týká jakéhokoliv' použití sloučenin podle vzorce (I) podle vynálezu k transfekci buněk in vivo, ex vivo nebo in vitro.

Kromě výše uvedeného předkládaný, vynález má další • * vlastnosti a výhody, 'které.vyplynou z dále uvedených výkresů a příkladů. Jak' výkresy tak i příklady jsou uvedeny jako ilustrace pro lepší 'vysvětlení vynálezu a předmět vynálezu nijak neomezují'. Původce uvádí' různé protokoly postupů a reakční meziprodukty pro přípravu sloučeniny «podle vzorce (I).. Samozřejmě odborník na základě inspirace poskytnuté popsanými postupy nebo meziprodukty je schopen odvodit analogické metody vedoucí -ke sloučeninám obecného 'vzorce ‘(I) podle vynálezu. ·

Popis obrázků

Obr. 1: Struktura syntetických v předkládané.přihlášce lipid A, lipid. B, které byly popsány v patentové přihlášce je zahrnuta formou odkazu.

vektorů nazvaných lipid C a lipid D, WO 97/18185,. která

Obr. 2: Schematické znázornění, plazmidu pXL2,774.

Obr. 3: Fázový diagram pro nukleolipidoyé komplexy sloučenina. (1)/DNA. vazba sloučeniny (1) na- DNA byla určována měřením poklesu fluorescence (v %, .100% je fluorescencenahé. DNA) etidiumbromidu (EtBr)- (symbol ·, celá čára), jak je popsáno na ose y vpravo. Velikost částic (v nm) komplexů je uvedena na ose y vlevo. 'Osa x představuje poměr nábojů činidlo/DNA. Velikost nukleolipidových komplexů bez kplipidu je znázorněna symboly . a plnou čar-ou. ' Velikost nukleolipidových komplexů obsahujících 25% cholesterol je

znázorněna symboly O. a přerušovanou čarou. Velikost nukleolipidových komplexů obsahujících 40% DOPE je znázorněna symboly ♦ a přerušovanou čarou. - Použitá metoda neumožnila určit velikost částic nad 3 μπι. _ .

Obr., 4: Aktivita přenosu genu in vitro do 'HeLa buněk užitím nukleolipidových komplexů ·obsahující sloučeninu (1) .podle vynálezu .bez kolipídu (tmavě stínovaný střední sloupec.) , s - 25% cholesterolem. (středně stínovaný levý sloupec), a, se 40 % (mol,) DOPE' (světlý sloupec vpravo),' ve srovnání s nahou DNA., Byly užity pouze nukleolipidové komplexy, kde DNA. byla plně nasycena sloučeninou podle vynálezu a jejichž velikost byla 100 až 300 nm.

' Obr. 5: Aktivita přenosu - genu in vitro do .HeLa. buněk užitím· · nukleolipidových komplexů vytvořených .užitím sloučeniny (3) .. . Exprese luciferázy, . vyjádřená v- pg na . transfekovanou jamku, je znázorněna na ose y. Poměr nábojů sloučeniny (3) a DNA. v. nmol/^g je ^znázorněn osou x. Exprese byla měřena vždy pro. přípravek bez kolipidu. (micely),- s.DOPE.

a s, cholesterolem.

Obr. 6: Aktivita přenosu- genu in vitro do HeLa buněk užitím nukleolipidových · \. komplexů. . ’ vytvořených užitím sloučeniny (5). Exprese luciferázy, vyjádřená v pg na transf ekovanou jamku, je znázorněna na·, ose y.· Poměr nábojů sloučeniny (5) a DNA v nmol^g. je znázorněn, osou x. Exprese byla měřena vždy pro přípravek bez kolipidu (micely) , s DOPE a s cholesterolem.

Obr. 7: .Aktivita přenosu genu in vitro do HeLa buněk užitím nukleolipidových . komplexů vytvořených užitím sloučeniny (6). Exprese luciferázy, vyjádřená v pg. na transfekovanou jamku, je znázorněna na ose y. Poměr nábojů ·· ·· ·· • · · · · • · .· · · ··· · · · ··· sloučeniny (6) a DNA v nmol/pg je znázorněn osou^x. Exprese·, byla měřena vždy pro přípravek bez kolipidu (micely) , s DOPE a s cholesterolem. ·

Obr. 8: Aktivita přenosu genu in vivo po přímé injekci komplexů obsahujících sloučeninu. (1) .podle vynálezu nebo sloučeninu podle vzorce:

H₂N(CH₂) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH2).-3NHCH₂eOArgN[ (CH_Z) 17CH3] ₂ ' (nazvanou lipid A v celém následujícím textuj bez kolipidu (tmavý sloupec) s 25% cholesterolem (středně stínovaný sloupec), a. se 40 % (mol.) DOPE (světlý sloupec), ve srovnání S nahou DNA. Byly užity pouze -nukleolipidové komplexy, .kde DNA byla plně nasycena ..sloučeninou podle vynálezu a. jejichž velikost byla 100 až 300 nm. ·

J '

Obr. 9: Význam vynálezu je ilustrován tak, že je provedeno srovnání aktivity přenosu genu užitím dvou . lipidů·, a·,sice sloučeniny (1) podle předkládaného vynálezu, lipidu A a nahé DNÁ' dvěma způsoby podávání: intravehózním · (iv) a i.ntramuskulárním, (im). Byly užity pouze . nukleolipidové komplexy, kde 'DNA byla plně nasycena, sloučeninou· podle vynálezu a jejichž velikost byla 100 až 300 nm.'

Obr. 10: Aktivita, přenosu-· genu in vivo 48/hodin po i.m.injekci·nukleolipidových komplexů obsahujících sloučeninu (5) nebo (6) podle předkládaného vynálezu bez kolipidů s poměrem nábojů 0,25/1, ve srovnání s .nahou . DNA. Exprese je .vyjádřena v pg luciferázy na ml. Směrem zleva·, jednotlivé sloupce znamenají: (a) negativní kontrola, (b) nahá DNA, (c) sloučenina (5) a (d). sloučenina (6)’.

Materiály a metody

A) Materiály , \ · . ' výchozí aminokyseliny nebo , po.lyaminokyseliny (nebo jejich deriváty), byly komerčně dostupně. To je případ . N-(3aminopropyl)glycinu,. . N-(2-kyanoetyl)glyčinu nebo 2,4diaminomáselné kyseliny,, nebo byly syntetizovány obvyklými metodami, které jsou odborníkům známy.

cyklické isothiomočoviny .jsou také komerčně .dostupné produkty,· jako např.. 2-metylthio-2-imidazolinhydro j o.did, nebo byly syntetizovány obvyklými metodami, které jsou odborníkům známy.

aminy-· substituované, ./jedním. -'nebo .několika 'lipidy, -jsou komerčně dostupné nebo byly -připraveny z odpovídajících.

..aminů a aldehydů alkylační redukcí, ¹. '

- produkty jako ‘trietylamin, trifluoroctová kyselina, benzottiazol-l-yloxytr.is (dimetylamino)-fosfoniumhexafluorqfosfát (BOP), dimetylaminopyridin (DMAP), benzylchloro.formiát, di-terc-butylbikarbonát j sou ' komerčně dostupné produkty. Použité. roztoky chloridu , sodného a uhličitanu sodného byly nasycené. . Roztok síranu draselného ¹ měl koncentraci 0,5M.

B) Metody , . ' ·

1) Fyzikální měření ;

Spektra protonové NMR (nukleární magnetická rezonance) byla získána pomocí spektrometrů Brucker 400 a 600 Mhz.

f *'. ······'········· • ·-·'-· ♦···· ···· ·· ·· ·· ·· ·· > i • 1 ' ' ' ' - - -

Hmotová spektra byla získána užitím API-MS/III.

' 2) Analytické a purifikační metody a) . Chromatografie' s přímou fází ' i

- Chromatografie ne tenké vrstvě (TLC) byla provedena, na ' hliníkových deskách, pokrytých silikagelem velikosti.· 20 x 20 cm (Merck). Desky byly vyvíjeny pod UV.zářením (254 nm) . s ninhydrinem, postřikem etanolovýiir roztokem ninhydrinu (40 mg/100 cm³ ' etánolu) aby.' se objevily aminy nebo .amidy zahřátím na 150' °C, s fluorescaminem, postřikem roztokem (40 mg/100 cm³ acetonu) k objevení primárních aminů.,' s bromokresolovou zelení,., 'postřikem roztokem . (0,1% ve 2 · ypropanolu) k objevení kyselin, 's vanilinem .('lehký postřik) . _k postři-kem etanolového roztoku (3%) s 3% kyselinou sírovou .a zahřátím na· 120 °C, nebo s jódem pokrytím desky jódovým práškem ' - Sloupcová chromatografie, prováděná.na silikagelu' Merck 60 s velikostí částice 0,063-0,200'mm.

b) Purifikce užitím . preparativní . HPLC -(vysokoúčinná , kapalinová chromatografie) . . ' <? - Použité zařízení je souprava- pro gradientovou kapalinovou . , chřomátografii s UV detekcí. Preparativní systém byl

I ·' složen .z následujících komponent:

Pumpa A: GILSON model 305, vybavená hlavou 50 SC.

Pumpa B: GILSON model. 303, vybavená hlavou 50 SC.

·· ··.

• · · φ • · • ··· · • · ···· ·* ♦ · ·· • » · · • · · · • · ··· • · · .·· ·· ·· ·· • · · · • · · ♦ • · · · * • · · · ·· ··

Vstřikovací pumpa: GILSON model 303, vybavená hlavou 2 5 SC.

Tlakový modul: .GILSON model '806.

Mixer: GILSON model 811 C vybavený hlavou 23 ml.

UV detektor: GILSON model 119, .vybavený preparativní komorou,a. nastaven na 220 nm.

Sběrač frakcí: GILSON model 202, vybavený stojanem č. 21 a skleněnými IQml zkumavkami

Integrátor: SHIMADZU model C-R6A. , ·

Kolona: Kolona C4 (10 mm) z nerezové oceli, dlouhá 25 cm s’ průměrem 2,2 cm, komerčně dostupná jako model 214 TP 1022 firmy'VYDAC. '

Roztok produktu, který měl být purifikován, se nanesl na kolonu vstřikovací smyčkou, eluent byl získán ve .frakcích z¹jedné zkumavky ve 30 vteřinách.

Mobilríí fáze byla definována následujícím .způsobem:

Rozpouštědlo A Rozpouštědlo B .

Demineralizovaná Acetonitril pro HPLC 2500 cm³ voda .2500 cm³ Trifluoroctové

Trifluoroctové kyselina 2,5 cm³ .

kyselina 2 cm³ ' . ' · .

Gradient:

čas v ' .	% rozpouštědla	% rozpouštědla	průtok
minutách	A	B	cm3/min
0	90	10	.18
10	90	10	18
110	/ . 0:	100 .	18.
.120	0	100	18 .

• A Aa

A A A ·

- 3S • AAA A · ···· ··

A.· ·* ·· *·

-A · · * · A A

A AAA AAAA · • A AAA·

AA ·· ·· ··

c) Analytická.chromatografická technika

-HPLC analýza byla prováděna na zařízení Merck-Hitachi vybaveném HITACHI D .2500 integrátorem-kalkulátorem, autosběračem -AS-2000A, inteligentní pumpou L-6200A, a detektorem VIS-UV L-4000 S nastavitelnou vlnovou délkou nastavenou na 220 nm. Pro analytickou separaci byly užity kolony Browlee z nerezavějící oceli 3 cm dlouhé. a . 0,46 cm v průměru, dostupné od firmy APPLIED BIOSYSTEM.

Stacionární fáze byla' tvořena Aqúapore. Butyl 7 micron.

Mobilní fáze byla voda (s .. trif luoroctovou kyselinou) ,a. acetonitril (s trifluoroctovou kyselinou). Injikováno bylo 20 μί roztoku koncentrace 1 mg/cm³ do 0,1 cm³ smyčkového ventilu, rychlost průtoku při analýze býla nastavena ná 1 cm³/min až 4 cm³/min. Tlak byl přibližně 18 MPa· (180 bar). Podmínky separace js.ou shrnuty v následujících tabulkách:

Rozpouštědlo A ' Rozpouštědlo B

Demineřalizovaná · Acetonitril pro HPLC 2500 cm³ voda . 2500 cm³ Trifluoroctové

Trifluoroctové · kyselina 2,5 cm'³ kyselina 2 cm'

Gradient:

čas v minutách	% rozpouštědla A	%' rozpouštědla Β i	průtok cm3/.min
o	60	40 '	1 .
3	60	40	1
. 20	0	100 -	1
35	0	100	1
35,-1	60	40	4
36,1	60	4 0 -	4
36,2	60	40 ,	2
44	60	40	2

• · · · · ·

- 36 Příklady provádění vynálezu

A) Syntézy sloučenin podle vynálezu .

Příklad 1 '

Syntéza sloučeniny (1) : > (N-dioktadecylkarbamoylmetyl-2-{3-[4(2-iminotetrahydropyrimidin-l-yl) butylamino]propylamino}. acetamid) z kationtového lipidu podle kondenzovaného vzorce NH₂ (CH₂) ₃NH (CH₂).₄NH (CH₂) ₃NHCH₂COGlyN[ (CH₂) 17CH3] ₂ ' (je označován v dalším textu lipid B, jeho příprava bylá popsána v mezinárodní patentové přihlášce·WO 98/18185 a Struktura je uvedena na. obr. lj .

0,7 84 mmol lipidu B ' bylo rozpuštěno v· 25 cm³ metanolu v baňce s' kulatým dnem s magnetickým míchadlem a bylo přidáno 10,21 mmol trietylaminu. Ke směsi byl pomalu (5 minůt) •přiléván roztok 1,173 mmol metylisomočoviny a kyseliny sírové v 9 cm³ vody. Směs byla udržována v olejové lázni na 5.0 °C po dobu 20 hodin. - Pak byla směs vysušena do. sucha · pomocí rotačního evaporátoru. .Suchý extrakt, byl solubilizován směsí 4 cm³ vody a 1 cm³ trifluoroctové kyseliny,·Tento roztok byl injikován ve. dvou ' částech do preparativní. HPLC, Požadované frakce’ (určené analytickou HPLC) byly, sloučeny, zmraženy a lyofilizovány. Bylo . tak získáno 194 mg (0,163 mmol) produktu ve formě soli.

” Výtěžnost: 20,8% . HPLCanalytická·: Rt = 15,99 minut.

³H NMR spektrum (400 MHz, (CD₃)₂SO d6, δ v ppm): 0,88 (t,· J =

6,5 Hz, 6H: CH₃ mastných řetězců); 1,24 (m, 60H: centrální CH₂ mastných řetězců); od 1,35 do 1,70 (m, 4H: 1 ' CH₂ každého •ί ~ ' • fefe·· « • · 4 • fe · ·♦ _: mastného řetězce); 1,57 (m, 4H: centrální (CH₂)₂ butylové skupiny)1,88 a 1,96 (2 m, 2H každý: centrální CH₂ propylové skupiny a centrální CH₂ kruhu);, od 2,85. do 3,35 . (2 m, 16H celkem/ 8. NCH₂) ; 3, 81 (široký s, 2H: NCH₂CON) ; 4,03 (d, J = 5

Hz, 2H: CONCH₂CON glycylové skupiny); 7,25 a-7,84 (s a široký s, IH každý: 2 -NH kruhu); 8,61 (t, J = 5,5 Hz, IH: NHCO);

8,7Ό a 9,02 (2 nerozlišené komponenty, IH každý:.2 NH) .

MH~ = 84 6

Příklad 2

..Syntéza sloučeniny (2) :· (N-ditetradecylkarbamoylmetyl’2-{3[4-(2-iminotetrahydropyrimidin-l-yl)butylamino]propylamino} acetamid)’. ze, sloučeniny s.kondenzovaným vzorcem NH₂ (CH₂) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) ₃NHCH₂COGlyN[ (CH₂) 73] 2. (je· Označována v dalším textu lipid C, příprava byla popsána v mezinárodní patentové přihlášce WO .98/18185 a struktura je uvedena naobr. 1).

1,036 mmol lipidu C bylo rozpuštěno ve 30 cm³ metanolu v baňce s kulatým dnem s magnetickým, míchadlem abylo přidáno· 13,13 mmol trietylaminu. ' Ke /směsi byl . pomalu .(5 /minut) přiléván roztok 1,554' mmol . O-metylisomočoviny a kyseliny sírové v 9 cm³ vody. Směs byla udržována v olejové lázni na 50 °C po dobu 20 hodin. Pak byla směs vysušena do .’ sucha pomocí rotačního evaporátoru. Suchý extrakt byl solubilizován směsí 3 cm³ vody, 2 cm³ etanolu a 0,5 cm³ trifluoroctové· kyseliny. Tento roztok byl injikován do preparativní HPLC. Požadované frakce (určené analytickou HPLC) byly sloučeny, zmraženy a lyofilizóvány. Bylo tak získáno 218 mg (0,2,022 mmol) produktu ve formě soli'. . · ·

Výtěžnost: 19,5% ·

• ·

- 38 .- .

HPLC_anai_yt_icki: . Rt '= 10,76 minut. í' .

^XH NMR spektrum (400 MHz, (CD₃) ₂SO d6, .5. v ppm): 0, 88 (t, J = 7 Hz, 6H: CH₃ mastných řetězců); od 1,15 do 1,40. (m, 44H: centrální (CH₂) π mastných řetězců); 1,45 a od 1,-50 do 1,65 (2 m, 2H každý: 1 CH₂ každého mastného řetězce); 1,59. (m, 4H: 2 centrální CH₂ butylové skupiny); 1,91 á 1,97 (2 m, 2H každý: centrální CH₂ propylových skupin) ; od 2,85 ’ do 3,10 (m,. 10H: 2 NCH? butylové skupiny - 2 NCH₂ jedné ze 2 propylových skupin - a- 1 ze 2, NHC₂ další propylové skupiny); 3,23 a od .3,30 do 3,50 .(2 m, 5H a 1H, v příslušném pořadí: další. NCH₂ další propylové skupiny a NCH₂ mastných řetězců); 3,79 (nerozlišené komponenty, 2H: NCH₂CON) ; 4,03 (d, J = 5 Hz, 2H:

.CONCH₂CON glycylové skupiny); .7,27 a od 8,40 do 9,30 (široký s. a nerozlišené komponenty, .v příslušném pořadí, 2H a 4H: NH₂ ⁺ .CF3COO; NH⁺ '.CF.3COO' a =NH ) ; 7,88. a 8,61 . (s a· široký' sy v příslušném pořadí, ÍH. každý: NHC=N .a GONH, v příslušném pořadí ) .

MH~ = 734 ..

.Příklad 3 j

Syntéza· sloučeniny (3), (2-(3-(4-[3-(4,5-dihydro-lH-imidazol2-ylamino) propylamino} -N-d.itetradecylkarbamoylmetylacetamid) z lipidu C (viz příklad 2, struktura je ha obr. 1).

., . .. 0, 36 mmol 2-metylmerkaptg-2-imidazoliniumjodidu bylo rozpuštěno ,v 0,36. cm³ 1' N hydroxidu sodného. ..v baňce s kulatým dnem s probublávánim a s magnetickým míchadlem. Do tohoto roztoku bylo přidáno .0,36 mmol lipidu C, předem' rozpuštěného v 1,44 cm³ 1 N hydroxidu sodného, 5 cm³ vody a 4 cm³ etanolu.

Směs byla udržována za míchání, dokud se nezastavilo

- 39. uvolňování metylmerkáptanu (24 hodin).. Směs pak byla vysušena do sucha pomocí rotačního evapórátoru. Suchý extrakt byl solubilizován směsí 4 cm³ vody, 4 cm³ etanolu' a 0,5 cm³ trifluoroctové kyseliny.. Tento roztok byl injikován ve dvou částech do preparativní HPLC. Požadované frakce (určené analytickou HPLC) byly sloučeny, zmraženy a lyofilizovány. Bylo tak získáno 213 mg (0,1727 mmol) produktu ve formě soli. Výtěžnost: Y = 48% '

HPLCanalytická: Rt = 8,90 minut. \ . , ³H ' NMR spektrum ,.(400 MHz, (CD₃) ₂SO d6 s přidáním' několika kapek CD₃COOD d4, δ v ppm);: 0,87 (t, J. = 7 Hz, 6H: CH₃ mastných řetězců); od 1,15 do 1,40 (m, 44H: centrální [CH₂)n mastných ..řetězců) ; 1,45 a 1,55 (2 m, 2H každý: i CH₂ každého mastného řetězce); 1,65 (m, 4H:

skupiny) ; od 1,80 do '1,95 (m, 4H skupin); od 2,80 do 3,05 (m, 10H: 2 NCH₂ butylové skupiny - 2 NCH₂ jedné ze 2 propylových skupin - a 1 ze 2 HCH₂ další -propylové skupiny) ; 3,24 (m, 6H: další NCH₂ další propylóvé skupiny a NCH₂ mastných řetězců); 3,56 (s, 2H u NCH₂CON) ; 3,62 (S, 4H: NCH₂CH₂CH₂N) ; 4,02 (d, J = 5 Hz, 2H: CONCH₂CON glycylové skupiny). MH' =-.777 ' '''',·

2' centrální GH₂ . -butylové centrální 'CH₂ ‘ propylových

Příklad 4 ' ' ’

Syntéza sloučeniny (4) (2-(3-{bis [3-(4, 5-dihydro-lH-im.idázol·. 2-ylamino) propyl] amino Jpropylamino) -N-ditetradecylkarbamoylmetylacetamid) pomocí metody syntézy stavebních bloků.

• · · · ·. · · ' ' ' . — 40 —

I) Syntéza boc-gly-ditetradecýlaminu (a) mmol skupiny Gly, jejíž aminy jsou chráněny skupinami Boc, a 10 “mmol .ditetrádecylaminu bylo vloženo do baňky s kulatým dnem o objemů 250 ml, a bylo přidáno 100 cm³ dichlormetanu. Směs byla míchána tak dlouho,, dokud nebylo dosaženo kompletního rozpuštění. Pak bylo,přidáno 30. mmol Netyldiisopropylaminu (DIEA) a 11 mmol benzotriazol-1yloxytrisdimetylaminfosfonia (BOP).. pří bylo udržováno na 10 pomocí DIEA a· směs byla· míchána 2 hodiny. Když byla reakce e' . kompletní, (monitorovaná pomocí CLC a/nebo , HPLC), •dichlormetan byl odpařen a získaná.pevná. látka byla odebrána· do 300 cm³ etylacetátu. Organická fáze byla promyta čtyřikrát . 100 cm³ roztoku síranu ' draselného, čtyřikrát, 100 cm³, uhličitanu sodného a čtyřikrát 100. cm³ chl.oridu sodného. .Organická fáze pak byla vysušena přes síran hořečnatý, filtrována a odpařena ve vakuu. Produkt (a), byl získán . ' s výtěžkem 93%. . ¹ .

TLC: 'R_f = 0,9 (CHCl₃/MeOH, 9:1)

MH⁺ = 567 '

II) Syntéza [Z-NH (CH₂) ₃] ₂-N- (CH₂) ₃.-NH-Boc-CH₂-COOH · (b) _:1) Syntéza.' NC-(CH₂) ₂-NH-3cc-CH,-CCGH ' (c) .

Amin N-(cyanoetyl)glycinu (0,1 mol/amin, komerčně dostupný) byl .solubilizován v IN. hydroxidu sodném (200 cm³/amin) a 200 cm³..· dioxanu. Roztok byl míchán na ledové $ lázni, a pak .· byl po kapkách přidáván roztok . O-(tbutoxykarbonylu)₂ nebo p-chlorobenzyloxykarbohylu CC1Z, 0,14 mol/amin) ve 200 cm³ dioxanu. pH bylo udržováno na hodnotě v.yšší, než 9. Pak byla směs míchána v přibližně 20°C přes noc. Dioxan byl odpařen ve vakuu, a pak byla směs acidifikována na pH 3 pomocí roztoku síranu draselného,. Nerozpustná látka pak byla extrahována 3 krát' 100 cm³ etylacetátu, a pak promyta

I · · « · · · e e c β © » '*· ·* ' . - . 41 2 krát 100 cm³ roztoku chloridu sodného. Organická fáze byla vysušena přes síran hořečnatý, filtrována a odpařena ve vakuu. Produkt (c) o vzorci NC-(CH₂) ₂-NH-Boc-CH₂COOH byl získán s výtěžkem 98%.'

TLC: R_f = 0,66 (CHCl₃/MeOH·, -8:2)

ΜΗ’ = 22 9 .... .· „i 2 i Syntéza . NH₂- (CH;) ₃-NH-Boc-CH₂-COOH ' (d) , mmol produktu (c) o vzorci . NC- (CH₂) ₂-NH-Boc-CH₂-COOH bylo vloženo¹ do nerezového autoklávu o objemu 1 litr. V kádince byl současně připraven roztok 10 cm³. 95%etanolu a 3,3 g (8.0 mol) hydroxidu sodného. Když byl hydroxid sodný rozpuštěn, byly vloženy. 2 . cm³ Raneyova niklu na uhlíku. Autokláv byl uzavřen. Počáteční hydrogenační tlak · byl přibližně 5200 kPa (52 bar) a'přes noc.při teplotě místnosti (20°C) se snížil -na přibližně 4850 kPa (48,5 bar) .' Suspense byla filtrována přes^ papír, filtr byl promyt 4 krát' 25 cm³ etanolu 'a filtráty byly koncentrovány do sucha pod, vakuem. Byl získán produkt (d) , který byl v dalším stadiu použit bez ’ další purifikace.

TLC: R_f = 0,12, (CHCl₃/MeOH,- 6:4)

MK’ = 233 ' '

3) Syntéza - [NC (CH₂) ₂] ₂-N-(CH₂) ₃-NH-3oc-CH₂-COCH (e)

0, 05 mol produktu (d) o vzorci NH₂- (CH₂) ₃-NH-Boc-CH₂-COOH a 0,1 mol. hydroxidu sodného bylo solubilizováno ve 150 cm³ i»5 vody, v baňce s kulatým dnem. Roztok byl chlazen v ledové lázni. Zatímco'· teplota hmoty byla udržována pod 20°C, bylo pomalu přiléváno -0,12 mol akrylnitrilu za důkladného míchání.

Reakční směs byla udržována přes noc při teplotě místnosti (20°C) .· Pak byla směs ponechána v 50°C 2 hodiny. Rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu a směs pak byla acidifikována na pH 3 roztokem síranu draselného. Nerozpustná látka . byla

• ·· · · • . · • »

- qz - / extrahována 3 krát '200 rm³ etylacetátu, a pak promyta 2.krát 100 cm³ roztoku chloridu sodného. Organická fáze byla vysušena přes síran hořečnatý, filtrována a odpařena ve vakuu. Surová, látka byla volitelně purifikována na křemičitanové koloně. Produkt ,(e) byl získán s výtěžkem 50%'. ' ’

TLC: R_f = 0,75 (C.HCl₃/MeOH, 6:4).

MH~ = 339

4) Syntéza [Z-NH (CH₂) ₃] 2N- (CH₂) ₃-NH-Boc-CH₂-COOH ' (b) ' · ' f ; . .

mmol produktu (e) o vzorci [NC (CH₂) ₂] ₂-N- (CH₂).₃=NH-BocCH₂-COOH bylo vloženo do'. nerezového ..autoklávu o objemu 1 litr. V kádince byl současně připraven roztok; 10' cm³ 95%etanolu a 3,3 g (80 mol) .hydroxidu sodného. Když byl hydroxid sodný rozpuštěn, . byl tento, roztok vložen do autoklávu. Autoklávem byl prohnánproud dusíku a byly vloženy 2 cm³ Raneyova niklu na uhlíku. Autokláv byl' uzavřen. Počáteční hydrogenační tlak byl přibližně 5200 kPa (52 bar) a přes noc při teplotě místnosti (20°C) se snížil na přibližně •4850 kPa (48,5 bar). Suspense byla filtrována přes papír, filtr byl promyt 4 krát 25 cm³ etanolu a filtráty byly.' koncentrovány do sucha pod vakuem. Byla získána' bílá pevná, látka,, která bylá bez další purifikace použita po analýze TLC.

TLC: R_f = 0,14 (CHCl₃/MeOH, 6:4)

Pevná látka', získaná výše byla solubilizována v IN hydroxidu sodném (200 cm³/amin) a 200 cm³ dioxanu. Roztok byl míchán na ledové lázni, a pak byl po kapkách přidáván roztok (t-butoxykarbonylo) ₂O nebo p-chlorobenzyloxykarbonylu (0,14 mol/amin) · ve .200 cm³ dioxanu.. pH bylo udržováno na hodnotě vyšší než 9. Pak byla směs míchána při teplotě místnosti (20°C) přes noc. Dioxan byl odpařen ve vakuu, a pak byla směs acidifikována na pH 3· pomocí roztoku síranu draselného. Nerozpustná látka- pak byla extrahována 3 krát 100 .cm³ ·* · ětylacetátu, a· pak: promyta 2 krát 100 cm³ roztoku chloridu sodného.. Organická fáze byla vysušena přes síran hořečnatý, filtrována a^? odpařena ve' vakuu. Produkty byly; analyzovány prostřednictvím TLC a/nebo HPLC. ;

., Surový produkt byl purifikován. na křemičité koloně (dichlormetan/metanol, 8:2).

Produkt (b) byl . získán s výtěžkem 66% relativně i» k produktu (d) ,

TLC: R_t- - 0,42. (CHCl₃/MeOH, 6:4)

MH⁺ = 615

Β ·

Β · ··· • ·· ·

III) Syntéza [Z-NH (CH₂) ₃] ₂~N-(CH₂) ₃-NH-Boc-CH₂-COGlyN[ (CH₂) ₁₃CH₃]₂ . (f) · mmol produktu (a), jehož aminy-jsou chráněny skupinami > . . Boc, byl vložen do baňky s kulatým dnem s ..magnetickým míchadlem. Bylo přidáno 30 cm³ kyseliny trifluoroctové ve 4°C,. a. pak byl roztok míchán jednu hodinu. Když byla reakce kompletní .(monitorovaná pomocí TLC a/nebo( HPLC), byla kyselina trifluoroctová odpařena ve vakuu, a pak byl'produkt usušen společným odpařením s 3 krát 30 cm³ etyléteru.

HPLC: R_t ·= 12,86 min, - (H₂O/MeCN: 3 min ‘ [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] .

Získaný produkt (Gly-ditetradecylamin, 10 mmol) a produkt, (b) (10 mmol), bylo vloženo do baňky s kulatým dnem o _Λ ·- objemu 250 ml, bylo. přidáno 100 .cm³ dichlormetanu a směs byla míchána, tak dlouho, dokud nebylo dosaženo kompletního £ rozpuštění. Pak bylo přidáno 30 mmol N-etyldiisopropylaminu (DIEA) a 11 mmoT ' BOP hexa.f luorofosf átu. pH bylo udržováno na ¹ 10 pomocí DIEA a -směs . byla míchána dvě hodiny. Když byla reakce · kompletní, .(monitorovaná pomocí TLC a/nebo HPLC), dichlormetan byl odpařen a získaná pevná látka byla odebrána do 300 cm³ etylacetátu. Organická fáze byla promyta čtyřikrát

100 cm³ roztoku síranu draselného, čtyřikrát 100 cm³ • · » · i · • · · · • . - 4,4 uhličitanu sodného a čtyřikrát 100 cm³ chloridu sodného. Organická fáze byla ' vysušena, přes síran hořečnatý, filtrována, a odpařena ve vakuu. 'Produkty byly použity bez další purifikace. Produkt (f) , byl . získán s výtěžkem . 75% po purifikaci na křemičité koloně (dichlormetan/metanol, 8:2). TLC: R_f = 0,36 (CHCla/MeOH, 8:2)

HPLC: R_t = 17,44 min, (H₂O/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]) .

IV) Syntéza [NH₂ (CH₂) ₃] ₂-N- (CH₂) ₃-NH-Boc-CH₂-COGlyN [ (CH₂) i₃CH₃]₂- . (g) ,

Produkt (f) , jehož aminy jsou chráněny, byl. vložen do baňky s. kulatým dnem s magnetickým míchadlem a- rozpuštěn v 10 cm³ metanolu na gram produktu. 10% palladium na uhlíku (1 g/g produktu) a fqrmiát ammonný' (1 g/g produktu) byly přidány ' při teplotě místnosti.

Hydrogenolýza monitorována pomocí HPLC. . Po dvou hodinách byla byla reakce kompletní·, směs byla 'filtrována a filtr byl třikrát promyt 10 cm³ metanolu na gram produktu. Byla přidána dvakrát! destilovaná, voda a 'roztok byl zmražen a 1-yofilizpván, nebo byl filtrát vysušen do suchaa pevná látka byla odebrána do 300 cm³ etylacetátu. Organická fáze byla promyta dvakrát 100 cm³ roztoku uhličitanu sodného a dvakrát 100 cm³ chloridu sodného, a pak byla vysušena přes síran, hořečnatý, filtrována

·. a odpařena ve vakuu. Produkty byly analyzovány pomocí HPLC a ' byly použity bez další purifikace. Produkt (g) byl získán s výtěžkem 40% relativně k produktu (f).

HPLC: R_c =' 9,62 min, (H₂O/MeCN:· 3 .min [40/60], '3-20 min [0/100], 35 min [0/100]). ' ,·

MH⁺: 795 _/ ' φφ φφ ·· ·* ·* • * · · ·. * · · * * . 'φ*~···'φ'φ'φ····φ··· ' ♦ ' φ φ · · φφφφ φφφφ φ φ φφφφ φφφφ • k ' - 45 V) Syntéza sloučeniny .(4)

Produkt (g), obsahující primární amin, který má být modifikován (1 mmol/amin), byl solubilizován v 10 cm³ dichlormetanu, a pak byly, přidány 1,2 mmol/amin.2-metylthioimidazolinhydrojodidu· a 3 mmol/amin trietylaminu.· Směs byla míchána při teplotě místnosti (20°C), dokud se nezastavilo . uvolňování metylsulfidu. Na ' konci. . reakce (monitorované '

•.^ prostřednictvím HPLC), dichlormetan byl odpařen ve vakuu.

mmol získaného produktu, jehož aminy jsou chráněny <* ' skupinami Boc, byl vložen do baňky s kulatým dnem s magnetickým míchadlem. Bylo přidáno 30 . cm³ kyseliny trifluoroctové ve 4°C, a pak byl roztok míchán jednu hodinu.

’ Když byla reakce kompletní (monitorovaná pomocí TLC. a/nebo' HPLC), byla kyselina trifluoroctová odpařena ve vakuu, a pak . byl ¹ produkt usušen' společným odpařením s 3. krát 30 cm³ , 'étyiéteru.

Získaný produkt byl purifikován prostřednictvím preparativní HPLC a frakce analyzovány HPLC. Sloučenina (4) podle předkládaného vynálezu. byla tedy získána s výtěžkem 34%. ·'

HPLC: R- = 10,07 min, (H₂O/MeCN: 3 min [40/60],' 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]). '' ' »

³H NMR spektrum (400 MHz, (CD₃)₂SO d_e při teplotě 383 K, d v . ppm): 0,92 (t, J = 7 Hz, 6H: ,CH₃· mastných řetězců,).; od 1,25 do 1,45 (m, 44H: (centrální (CH₂)ii .mastných řetězců); 1,57 £ (m, 4H: 1 CH₂ každého’ mastného řetězce) ; od 1,70 do 1,90 (m,

6H: centrální’ CH₂propylovýčh 'skupin); od 2,50 do 3·,40 (m,

16H: 2 NHC₂ propylovýčh skupin a NCH₂ mastných řetězců); 3,68 (s, 8H :' 2 NCH₂CH₂N) ; 3,72 (široký s, 2H: NCH₂CON) ; 4,06 (s, .

2H: CONCH₂CON glycylové skupiny).

MH⁺: 831

Příklad. 5 ...

, , / ·

Syntéza sloučeniny (5): (N-ditetradecylkarbamoylmetýl-2-(3[3-(1,4,5, 6-tetrahydropyrimidin-2-ylamino) propylamino]propylamino}acetamid) pomocí metody /syntézy, stavebních bloků.

I) Syntéza boc-gly-ditetradécylaminu ' . . - , (a)

Postup byl prováděn stejným způsobem jako v předchozím příkladu.' Produkt (a) byl získán s výtěžkem.93%.

TLC: R_ť = 0,9 '(CHČls/MeOH, 9:1)

MH+: 567 - II) 'Syntéza Z-NH(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-CQOH , (b) '

1) Syntéza NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH. (c)

Postup byl prováděn- stejným . způsobem jako výše v příkladu 4. Produkt . (c) byl získán s výtěžkem 98%.

TLC: Rf = 0,66 (CHC13/MeOH,. 8:2)

MH+: -22.9. ' '

2) Syntéza NH2- (CH2) 3-NH-3oc-CH2-COOH .. (d)

Produkt (ď) byl získán stejným .způsobem jako výše v příkladu 4.

TLC: R_ť 0,12 (CHCi₃/MeOH, 6:4)

MHj_ 233 ' Ir

3) Syntéza NC (CH₂)'₂-N-Boc-(CH₂) 3-NH-Boc-CH₂-COOH ' . (e)

0,05 mol produktu (d) a 0,1 mol hydroxidu sodného bylo solubilizováno ve 150 cm³, vody, v baňce s kulatým dnem.

Roztok byl chlazen v. ledové lázni.. Zatímco teplota hmoty byla udržována pod 20°C, bylo pomalu přiléháno 0,05 mol φφ

- 217 i I akrylnitrilu za důkladného míchání. Reakční směs bylaudržována přes noc při teplotě místnosti (20°C). Rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu a směs pak byla acidifikována na pH 3 roztokem síranu draselného. Nerozpustná ,1-átka byla extrahována 3 krát 200 cm³ etylacetátu, a pak promyta 2 krát 100 cm³ roztoku chloridu sodného. Organická fáze byla vysušena přes síran hořečnatý, fi.ltrována a odpařena ve vakuu. Získaný produkt byl volitelně purifikován na křemičitanové koloně.

Získaný produkt (0,1 mol/amin) byl solubilizován 'v IN hydroxidu sodném (200 cm³/amin) a 200 cm³ dioxanu. Roztok byl míchán na ledové lázni, a pak byl po kapkách přidáván roztok • / (Boc)'₂0 nebo p-chTorobenzyloxyk-arbonylu (0,14.. mol/amin). ve

200 cm³ dioxanu. pH bylo udržováno na hodnotě vyšší než 9.

Pak byla směs míchána při teplotě místnosti· (20°C) přes noc.

Dioxan byl odpařen ve vakuu, a pak byla směs acidifikovária na pH 3 pomocíroztoku;síranu draselného. Nerozpustná látka pak byla extrahována 3 krát 100 cm³ etylacetátu, a pak promyta krát 100 cm³ roztoku chloridu sodného. Organická fáze byla vysušena přes síran hořečnatý, filtrována a odpařena ve vakuu. Produkty byly analyzovány prostřednictvím TLC a/nebo , - ‘ \

HPLC. Produkt (e) byl tedy. získán s výtěžkem' 93%.

TLC: R_ť = 3,75 (CHCI,/MeOH, 8:2),

MH~: 38 6 · '

4) Syntéza Z-NH- (CH₂) ₃-N-Boc- (CH₂) ₃rN-Boc-CH₂-COOH (b) mmol . produktů (e) bylo vloženo do nerezového autoklávu- ó objemu. .1 ..litr . V kádince byl současně připraven roztok 10 cm³ -95%etanolu a 3,3 g (80 mol) hydroxidu sodného. Když byl hydroxid sodný .rozpuštěn, byl tento-roztok vložen do autoklávu. Autoklávem býl prohnán proud dusíku a byly vloženy 2 cm³ Řaneyova niklu na uhlíku. Aůtokláv byl uzavřen. Počáteční hydrog.enační tlak byl přibližně 5200 kPa (52 bar) !

9'

4

4 ·· ·· “48-;

a přes noc při teplotě místnosti (20°C) se snížil na přibližně 4850 kPa (48,5' bar). Suspense byla filtrována přes papír, filtr byl promyt 4 krát 25 cm³ etanolu a filtráty byly . koncentrovány do sucha pod vakuem..Byla získána bílá pevná , látka, která byla bez další purifikace použita po analýze

TLC. ) ' ’ 2 'TLC: R_t- = 0,14 (CHCl₃/MeOH, 6:4) \ Získaný produkt (0,1 mol/amin) byl solubilizován ·ν IN . hydroxidu sodném (200 cm³/amin) a 200. cm³ dioxanu. Roztok byl cv ' míchán na ledové · lázni, a pak byl po kapkách, přidáván roztok p-chlorobenzyloxykarbonylu (0,14 mol/amin). ve, 200. cm³ dioxahu. pH bylo udržováno na hodnotě vyšší než 9. Pak byla směs. míchána při teplotě místnosti (20°C) přes noc. Dioxan byl odpařen ve vakuu, a pak byla směs acidifikována na pH 3 pomocí roztoku síranu draselného. Nerozpustná látka pak byla extrahována 3 .krát 100 cm³ etylacetátu, a pak promyta.2 krát '100 cm³ roztoku chloridu sodného. Organická fáze byla vysušena přes síran hořečnatý, filtrována a odpařena ve vakuu. Získaný produkt byl purifikován na křemičitanové koloně i !

(dichlormetan/metanol, 9:1). Produkty byly analyzovány prostřednictvím TLC a/nebo HPLC. Produkt (b) byl .získán s výtěžkem 32% relativně k produktu (d) . . . ·

TLC: R_f =0,63 (CHCl₃/MěOH, 9:1) .

MrC: 523

III) Syntéza 2-mety.lsulf anyl-1,4,.5, 6-tetráhydropyrimidinu (f) $ . 0,0103 mol 3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidinethiolu bylo vloženo do baňky s kulatým dnem, za míchání a v toku dusíku, a bylo přidáno 5 cm³ metanolu a 0,65 cm³ (0,0105 mol) metyljodidu. Směs byla zahřívána s refluxem 1 hodinu a pak . · byla ponechána vychladnout na teplotu . místnosti (20°C) .

Produkt byl precipitován přidáním 5 cm³ etyléteru. Precipitát

- 49 byl filtrován, a pak promyt etyléterem.. Produkt byl pak sušen přes noc při,tlaku 3,4 kPa (34 mbar).

Bylo získáno 1/5 g (0, 0041 mol) produktu (VI), což byl výtěžek 40%. . '

TLC: R_f = 0,25 (CHCl₃/MeOH, 9:1)

MH⁺: 131 > ( . . · · .

d) , Syntéza Z-NH (CH₂) ₃-N-Boc (CH₂j ₃-N-Boc-CH₂-COGlyN[CH₂) ₁₃ch₃]₂ (g) mmol produktu (a),.jehož aminy jsou chráněny skupinami Boc, byl vložen do baňky ' s kulatým .dnem s magnetickým míchadlem. Bylo přidáno 30 cm³ kyseliny trifluoroctové ve 4°C, a pak byl roztok míchán, jednu hodinu. . Když byla reakce kompletní (monitorovaná pomocí ' TLC a/nebo HPLC), . byla kyselina trifluoroctové odpařena ve vakuu, a pak byl získaný produkt usušen společným odpařením s 3 krát 30 cm³ etyléteru. HPLC: R_t 12,86 min/ (H₂O/MeCN: 3 ’ min [40/60], 3-20.min [0/100], 35 min [0/100]) . .

.10‘mmol získaného produktu a 10 mmol produktu (b) bylo vloženo . do baňky s kulatým dnem o objemu 250 cm³. Bylo přidáno 100 cm³ dichlormetanu a směs byla míchána tak dlouho, dokud nebylo dosaženo kompletního rozpuštění. Pak bylo přidáno 3.0 mmol DIEA a. 11 mmol BOP. pH bylo udržováno na, 10 pomocí DIEA a směs byla míchána 2 hodiny. Když byla reakce, kompletní, (monitorovaná pomocí TLC a/neb.o HPLC) , dichlormetan byl odpařen a- získaná pevná látka byla' odebrána do 300 cm³ etylacetátu. Organická fáze byla promyta čtyřikrát 100 cm³ roztoku síranu draselného, . čtyřikrát 100 cm³ uhličitanu sodného a čtyřikrát 100 cm³ chloridu sodného. Organická fáze pak byla vysušena ' přes síran· horečnatý, filtrována a odpařena . ve vakuu., Produkty byly použity bez další purifikace. .Po purifikací na křemičité koloně

-· 50 (dichlormetan/metanol, 8:.2), ' byl získán produkt (g) s výtěžkem 85%. ' TLC: R_f = 0,9 (CHCl₃/MeOH, 9:1) ·

HPLC: R_t = 19,79 v, (H₂0/MeCN: 3 min .[.40/60], '3-20 , min [0/100], 35 min [0/100]). '

V) Syntéza. NH₂ (CH₂) ₃] ₂-N-3oc-(CH₂) ₃-NH-Boc-CH₂-COGlyN [ (CH₂)₁₃CH₃]₂ (h)· ' v · .

Produkt (g) byl' vložen do baňky s kulatým dnem s magnetickým míchadlem a rozpuštěn v io _cm ³ metanolu/g produktu. 10%· palladium na uhlíku (1. g/g produktu) a formiát ammonný (1 g/g produktu) byly přidány při teplotě místnosti (20^QC). Hydrogenolýza byla monitorována pomocí. HPLC. Po dvou hodinách byla reakce kompletní, směs byla filtrována a filtr byl třikrát promyt 10 cm³ metanolu/g produktu. Byla přidána dvakrát.destilovaná, voda a roztok byl zmražen a lyofilizován, nebo byl filtrát vysušen do sucha a pevná látka byla odebrána do 300. cm³ etylacetátu. Organická fáze byla promyta dvakrát .100 cm³ roztoku uhličitanu sodného a dvakrát 100 cm³ chloridu sodného, a pak byla vysušena přes síran hořečnatý, filtrována a, odpařena ve vakuu.. Produkty byly analyzovány pomocí HPLC a byly použity bez další purifikace. Produkt (h) 'byl získán s výtěžkem. 93% relativně k produktu Cg). ' ,

TLC: 'Rf = 0, 42 . (CHCl₃/MeOH, 6:4) .

HPLC: R_t = 14,66 min, , (H₂O/MeCN: 3 min [40/60],, 3-20 min[0/100], 35 min [0/100]). ‘ ·

MHj_ 838 ·

I

VI) Syntéza sloučeniny (5)

Produkt (h) obsahující primární amin, který má být

I · modifikován ' (1 mmol/amine) ; byl solubilizován v 10 cm³ dichlormetanu, a pak byly přidány 1,2 mmol/amin produktu (f) a 1,3 mmol/amin trietylaminu. Směs byla míchána při teplotě • é ·* » · · <

I · · 1 místnosti' (20°C),. dokud se. nezastavilo uvolňování .metylsulfidu. Na konci reakce (monitorované prostřednictvím HPLC), dichlormetan byl odpařen've vakuu. .

..Získaný’ produkt byl' purifikován prostřednictvím

preparativní HPLC a .frakce analyzovány HPLC, ,'Sloučenina	(5)
byla tedy získána s výtěžkem 38%..
HPLC: ,Rt = 8,42 . min, · (H2O/MeCN: 3 min [40/60),.3-20	mih
[0/100], 35 min [0/100]).
1H NMR spektrum (400 MHz, (CD3)2SO ds δ v ppm) : 0,86 (t,	J =
7 Hz,· -6H: CH3 mastných řetězců) ; od' 1,10 do .1,35 -(m,	44H:
centrální (CH2jji mastných řetězců); 1,44 a 1,;53 (2-m,	, 2H

každý: 1. CH₂ každého mastného řetězce.) ; od 1,80 do .2,00 (m,

6H:· centrální . CH₂ propylových skupin , a CH₂ . 1,4,5,6tetrahydropyrimidinu) ;' od 2,80 do 3,10 · (m, , . 10H: ,NCH₂ propylových skupin a NCH₂ 1,4,5,6-tetrahydropyrimidinu); ’ od. 3,14 do 3,45 (m: 6H' odpovídající =NCH₂. 1,4,5; 6-tetrahydropyrimidinu a. =NCH₂ mastných řetězců); 3,81 (nerozlišeně komponenty,. 2H: NCH₂CON) ; 4,04 (d, J = 5 Hz, 2H: CONCH₂CON glycylové skupiny); 7,89 = 8,62- 8,75 a 9,01 (4 nerozlišeně komponenty, 8H vcelku: směnitelné a OH CF₃COOH).

MH': 72 0 · .

Příklad 6 ,

Syntéza sloučeniny (6) : N-dioktadecylkarbamoylmetyl-2-{3-[3-(1,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-ylamino)propylamino]propylamino } acetamid) pomocí metody· syntézy'stavebních bloků

I) Syntéza bóc-gly-ditetradec.ylaminú (a)

Postup byl prováděn stejným způsobem jako v předchozím příkladu. Produkt, (a) byl získán s výtěžkem 93%.

·* ·· ·· ··. ··-··.

• »· · · ·· · · ·· · .- 52 - ...

TLC: R_f = 0,9 (CHCl₃/MeOH, 9:1)

MHU 567 '

TI) SYNTÉZA Z-NH (CH₂) 3-N-Boc-(CH₂) 3-N-Boc-CH₂-COOH (b)' .1). Syntéza NC-(CH₂) ₂-NH-Boc-CH₂-COOH '· ' (c)

Postup byl prováděn stejným způsobem jako výše v příkladů 5. Produkt (c). byl získán s výtěžkem 98%.

TLC: Rf. = 0,66 (CHCl₃/MeOH, 8:2) '

MHU 229 /' i'

2) Syntéza NH₂-(CH₂) 3-NH-Boc-CH₂-COOH /' ’ (d)

- 'Produkt (d) byl. získán stejným způsobem jako výše v příkladu 5.

TLC: ,R_ť = 0,12 (CHCl₃/MeOH, 6:4)

MH⁺: .233 .

3) Syntéza NC (CH₂) ₂-N-Boc~ (CH₂) ₃-NH-Boc-CH₂-COOH (e)

Postup byl prováděn stejným' způsobem jako výše v příkladu 5. Produkt (e) byl tedy získán s výtěžkem 93%.

TLC: Rf = 0,75 (CHCl₃/MeOH, 8:2) .

MHU 38 6

4) Syntéza Z-NH-(CH₂) 3-N-Boc-(CH₂) ₃-N-Boc-CH₂-ČOOH. (b) - Postup byl- prováděn . stejným způsobem jako . výše v příkladu 5. Byla získána bílá pevná látka, která byla. bez další purifikace použita po analýze TLC.

TLC: Rf = 0,14, (CHCl₃/MeÓH, 6:4) '

Získaný.produkt byl použit stejným způsobem, jak'uvedeno výše, tak, aby chránil koncový amin benzyloxykarbonylovou skupinou. Produkt (b) byl tedy získán s výtěžkem 32% relativně k produktu (d).

TLC: Rf = 0,63 (CHCÍ₃/MeOH, .9:1) ·» ·· » · · « ·· ·· ·· ·* » · · · · · · · • · · · · · · • ··· · · · ··· ·

5'

- OJ III) Syntéza 2-metylsulfanyl-l, 4, 5, 6-tetrahydropyrimidinu (f )

Postup. byl prováděn stejným způsobem jako výše v příkladu 5.’ Bylo tak .získáno- 1,5 g (0, 0041 mol) produktu (f), což je výtěžek 40%.

.TLC:'R_f = 0,25 (CHCl₃/MeOH, 9:1) ·

MH⁺: 131. - - ΜΗ*:- 523

4* <ř'l

IV) Syntéza ch₃.]2. (g) .

Postup v příkladu 5 byly štěpeny

Z-NH (CH₂) 3-N-Boc (CH₂)-3-N-Boc-.CH₂-COGlyN[ (CH?) ι·₇ ' - . ' . ... .

byl prováděn stejným, způsobem, jako -výše Byl tak.-získán produkt (a), jehož Boc skupiny

HPLC: R_t

19,44 min, (H₂O/MeCN: 3 min [40/60]-, 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]) .

Získaný produkt byl použit stejným způsobem s produktem (b) jak je uvedeno výše v příkladu 5. 'Po purif ikaci na křemičité koloně (dichlormetan/metanol, 8:2), byl produkt (g) získán s výtěžkem' 84%. ·- '

TLC: R_f. = .0,9- (CHCl₃/MeOH, 9:1)

HPLC: R_t = 23,.95 min, ,(H₂0/MeCN: 3,. min [40/60], 3-20 min [0/100] , '35 min [0/10.0]). -.

V) Syntéza NH₂ (CH₂) ₃] ₂-N-Boc-(CH₂) ₃-NH-Boc-CH₂-COGlyN [ (CH₂)₁₇.CH₃],₂ (h) . ’ '

Postup byl prováděn stejným- způsobem jako výše v příkladu 5. Produkt (h) byl získán s výtěžkem 73% relativně

I k produktu (g).

TLC: Rf = 0,28 (CHCl₃/MeOH, 6:4) '

HPLC: R_t =' 20, 59 min, (H₂O/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/10.0] ) . MHj_ 838 ' ·· » · > · ···

- 54 VI) Syntéza.sloučeniny (6)

Postup byl prováděn stejným . způsobem .jako výše v příkladu 5 ..· Sloučenina (6) tak byla získána s výtěžkem 68%.

HPLC:, R_t = 15,83 min, (H₂O/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100]., 35 min • ··

[0/100]j .. ! .
(500 MHZ. (CDU -‘-'O d- nr.ml ·	0,88 (t,.	J =

7 Hz, 6H': CH3 mastných řetězců) ; . od	1,15	do	1,35	(m,	60H:.
centrální (CH2)í5 mastných řetězců);	.1,4 6	a	1, 54	(2 m,	2H
každý:' 1 CH2 každého mastného řetězce	) ; od	1,	80 do	. 2 ,<00	(m,.
6H: centrální . CH2 propylových ski	npin	a	CH2 '	1,4,	5, 6-
tetrahydropyrímidinu);. od 2,85 do	3,05		(m, . 1	OH:	NCH2

propylových - skupin a NCH₂ 1,4,5, 6-tetrahydropyrímidinu); od 3,15 do 3, 45 (m: 6H odpovídající. =NC.H₂ ^- 1,4,5,6-tetrahydropyrimidinu a- NCH₂ mastných řetězců)'; ·' 3/81 · (nerozlišené komponenty, 2H: NCH₂.CON) ; 4, 04 (d, J. = 5 Hz., 2H = CONCH₂CON, glycylové skupiny); 7,88 = 8,61 - 8, 74, a 8,99 (4 nerozlišené komponenty, 8H vcelku': směnitelné a OH CF₃C00H) .

MH': 832.

B) Použití transfekčních činidel podle předkládaného vynálezu

Příklad 7 . - ....

Příprava nukleolipidových komplexů

Tento příklad ilustruje přípravu. nukleolipidových komplexů podle vynálezu.

V-tomto příkladu byl užit chloroformový ' roztok sloučeniny (1). bylo užito 10 nmol -sloučeniny (1) · (tj. 11,8 pg) na. 1 pg DNA. V některých případech byly předem se

4

4 9 • · · • ·

···· 44

99

4 9 4 • · · * • 4 4 ·

4 9 ·

9 49 sloučeninou podle vynálezu smíchány neutrální kolipidy, cholesterol nebo DOPE. Když se.. chlorofprm za pomoci slabého proudu argonu odpařil., vytvořil se tenký lipidový film a byl pak rehydratován ve směsi 5% dextrózy. a 10 mM chloridu sodného přes noc. ve 4°C. Vzorky pak byly 5 minut ošetřeny ultrazvukem,, zahřátý na 30 minut na· 65 °C a nakonec opět 5 minut ošetřeny . ultrazvukem. takto připravená . lipidová suspenze byla uložena ve 4 °c až do použití.

Použitá DNA. byl plazmid pXL2774 (obr. 2) v roztoku ve směsi 5% dextrózy a ^;20mM chloridu' sodného v koncentracích 0,5 mg/ml nebo 1,0 mg/ml. Plazmid pXL2774 měl. následující vlastnosti:

hladina endotóxinů nižší , než 50 EU/mg,

- podíl DNA ve formě nadšroubovice vyšší než.60 %, obsah. RNA, , t j . mRNA, . tRNA a ribozomální RNA ^: (stanovený ' ' ^e.tí;

pomocí HPLC) byl nižší než 5 %, . hladina chromozomální DNA menší než T. %,

- obs.ah proteinů nižší než ·! %, · · ., ·

- osmólarita nižší než 15 mosmol/kg.· < , . .

Nukleolipidové · komplexy podle 'předkládaného vynálezu byly připraveny rychlým, smícháním stejných dílů roztoku DNA a.lipidové suspenze 'popsané v předchozích. příkladech.' •Množství sloučeniny podle vynálezu, vytvářející komplexy s DNA bylo od 0,5 nmcl/ug DNA do 12 nmol/pg. DNA.

Příklad 8

Chování komplexů s různým poměrem nábojů .

Tento příklad ilustruje . chování nukleolipidových komplexů , podle předkládaného vynálezu připravených s . různým'

99 .44 44 *· ·*

P · · · · · * · 4 4·· ··· 4 4 4 4 4 4 4 « • ··· 4 4 4 444 4 4 4 4 ·

4

4· »•44 44 obsahujícím 5% dextrózu zabránilo násobné difúzi.

poměrem nábojů. .Je také ilustrován vliv' přidání dalšího neutrálního lipidu, (tzv. kolipidu).

Nejdříve byla' analyzována velikost komplexů měřením jejich hydrodynamického průměru měřením dynamického rozptylu světla (Dynamic Laser Light Scattering) pomocí zařízení Coulter N4plus.. Vzorky byly naředěny .20 x roztokem a 2 0mM chlorid sodný,- aby se Tímto způsobem byl .studován vliv cykloamidinové. skupiny, lipidové sloučeniny a poměru, nábojů na. velikost nukleolipidových komplexů podle předkládaného vynálezu.

Když se zvyšuje poměr nábojů mezi sloučeninou . (1) podle .vynálezu a DNA,... je možné rozlišit tři. možné fáze. tyto tři fáze rozhodují o terapeutickém potenciálu sloučeniny (1). Obr. 3 ilustruje tyto tři fáze pro sloučeninu (I.)-. ..Shodné chování· bylo pozorováno i pro další, sloučeniny podle vynálezu, · ' ·Při nízkém poměru nábojů není DNA saturována sloučeninou (1), Část DNA zůstává jako nahá DNA. a komplexy jsou celkově 'negativně' nabity. Částice mají malou; velikost ..(10Ό až

300 nm). Tato fáze se nazývá fáze A.

Skutečnost, že DNA není zcela saturována sloučeninou (1) znamená, _zže DNA není touto, sloučeninou plně chráněna. DNA je proto vystavena působení degradujících enzymů, tj· DNáz. Navíc jelikož komplexy mají celkový negativní, náboj, tyto komplexy obtížně pronikají membránami. Z těchto důvodů jsou nukleolipidové komplexy ve fázi A mnohem méně. účinné při. transfekci.

Při středním poměru nábojů je DNA plně saturována sloučeninou (1) a komplexy.jsou celkově neutrální nebo mírně pozitivně nabity. Tato fáze je nestabilní, protože odpuzování iontů, je minimální a může dojít k jevu· zesítění. Velikost částic je značně nad limitem detekce pomocí dynamického rozptylu světla (větší než 3 pm). Tato nestabilní

9 ·Ι

- 57 • · · ·

I · · ·

I « · . * » · · · pozitivní aniontové. povahy.

fáze se nazývá fáze B. Tato velikost částic není vhodná pro injekční aplikaci, neznamená to nutně, že komplexy ve fázi B jsou neaktivní, jen jsou formulovány tak, že nejsou vhodné pro farmaceutické použití injekční formou.

Při relativně vysokém poměru ' nábojů je DNA nadměrně saturována sloučeninou· (.1.) a celkově mají komplexy pozitivní náboj. Vzhledem k silnému odpuzování mezi kladnými náboji .je tato fáze stabilní. Je označena 'fáze O. Na rozdíl od fáze A jsou ve fázi Cnukleolipidové komplexy v takové formě, že DNA je dobře' chráněna proti enzymatické degradaci a celkový náboj usnadňuje průchod , buněčnou ; ./membránou Komplexy ve fázi C jsou proto, zvláště vhodné pro přenos^- nukleových kyselin do buněk.

Kromě cýklóamidinové skupiny sloučeniny podle vynálezu také použití dalších neutrálních /lipidů (kolipidů) má velký vliv na stabilitu komplexů, jak je ilustrováno na obr,. 3. Přidané kolipidy byly buďto DOPE (kationtový lipid/DOPE = 3/2) nebo cholesterol (kationtový, lipid/cholesterol· '= 3/1). Obecně přidání neutrálního'lipidu vedlo ke .zvýšení stability komplexů, což zvyšuje množství sloučeniny nutné k dosažení fáze C. To velmi zřetelně ilustruje obr. 3, kde se porovnává poměr nábojů při kterém je· dosaženo fáze C v přítomnosti či nepřítomnosti kolipidů. . ·

Je třeba uvést, že. hodnoty poměru nábojů, . které, představují hranice mezi fázemi A, Ba C závis! na použité' sloučenině. Tudíž tyto hodnoty jsou velmi rozdílné pro jednotlivé sloučeniny.. . . '

Nakonec byla studována afinita sloučenin podle vynálezu k DNA jako funkce poměru nábojů. Pro tento účel bylo ., měřeno snížení fluorescence po přidání 3 pg etidiumbromidu (EtBr).. Skutečně nahrazení etidiumbromidu ria DNA sloučeninou podle vynálezu je indikátorem vazby k DNA.

Použitá formulace byla naředěna 20 x na výslednou koncentraci 25 pg DNA/ml. Relativní f lu.orescenci měřené -pro

Γ ··

-58-.

nahou DNA bylo. definicí přiřazeno 100 %. Míra vazby se sloučeninou - (1) podle vynálezu byla vyjádřena snížením relativní-. . fluorescence vzorku. Obr.. 3. ukazuje, . .že fluorescence' se snižuje, když se poměr nábojů zvyšuje, což znamená, že větší množství sloučeniny (1) - je dostupné pro vazbu s DNA (čím větší je pokles fluorescence, tím více sloučeniny se vážek DNA, dokud nedojde .k saturaci) .

Tímto způsobem bylo ukázáno, že afinita.'sloučeniny (1) podle vynálezu k DNA je určována, cykloamidinovou skupinou á nikoliv přítomností kolipidu.

Příklad 9 _; ' ·.

Transfekce in vitro užitím- sloučeniny (1) podle vynálezu

Tento příklad ilustruje schopnost sloučeniny (1) podle .vynálezu -transfekovat . DNA do buněk in vitro. a . srovnání' s naformulovanou DNA.

24jamkové mikrodestičky byly osazeny 60 000 HeLa buněk (ATCC) na- jamku a o 24 hodin později transfekoýány. Komplexy obsahující 1 ^g-DNA byly naředěny v 0,5 ml kultivačního média DMEM (Gibco/BRL) '.bez séra a pak přidány, do jamek ,.k buňkám. Buňky pak byly inkubovány 4 hodiny .ve 37. °C.· 'Médium obsahující komplexy·, pak bylo odstraněno a nahrazeno směsí DMEM s 10 %. fetálním telecím sérem. Buňky pak -byly .opět inkubovány 24 hodin. Nakonec byly buňky lyžovány a testovány pomocí luciferázové testovací soupravy(Promega) a, luminometru Dynex MLX...

Výsledky ukázané na obr. 4 podtrhují rozdíl mezi účinkem nahé DNA a komplexů, sloučenina (1)/DNA, které byly plně saturovány: žádná luciferázová aktivita nebyla detekována (citlivost zařízení menší než 1 -pg na jamku) po transfekci • · in vitro nahé DNA, zatímco transfekce komplexů podle vynálezu byla 200 pg/jamka až;8000 pg/jamka..

Tento příklad jasně, ukázal výhody sloučeniny (1) podlé vynálezu pro transfekci buněk in vitro.

» .

Příklad 10 '

Transfekce in vitro- užitím sloučenin (3), (5) a (6) podle vynálezu ' , ....

Tento příklad ilustruje schopnost sloučenin (3), (5) a (6) podle, vynálezu transfekovat DNA. do buněk in viťro .a.srovnání s neformulovanou DNA. . .

Transfekce HeLa buněk se prováděla stejným postupem jako v příkladu 9. Výsledky . jsou ukázány, na obr. 5, 6 a 7. Bylo ukázáno, že sloučenina (3) má ' irí vitro velmi dobrou transfekční účinnost. - . '

Přiklad 11 . · · '

Transfekce in vivo užitím sloučeniny (1) podle vynálezu ; . '

Tento příklad ilustruje schopnost sloučeniny (1) podle vynálezu transfekovat DNA do buněk in vivo a srovnání s neformulovanou DNA a s lipidem A, který má kondenzovaný vzorec N.H₂ (CH₂).₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) ₃NHCH₂COAřgN [,CH₂) ₁₇CH₃] ₂> byl popsán, v patentové přihlášce WO 97/18185 a jeho struktura je uvedena na obr. 1.

Přenos genu · in vivo . se prováděl na myších Balb/C intramuskulárním a intravenózním podáváním.’' Přípravky, které se porovnávaly, byly nahá DNA, formulace obsahující lipid A a formulace obsahující sloučeninu (1) podle vynálezu.

• *eee· ··· »··· ·· ·· ·· ·· ··

- 60 V případě intramuskulárních injekcí každá' myš dostala injekci 30 μΐ . přípravku obsahující 15 μg DNA do horního lýtkového svalu. Tkáně byly .odebrány 7 dnů , po injekci, zmrazený a uchovány v —80 °C až do provedení luciférázového testu. Měření luciferázové aktivity se provádělo ^stejně jak je popsáno, v příkladu 8. - ·

V případě. intravenóžních ’ injekcí každá myš dostala 200 μΐ přípravku obsahuj ící 50 μg DNA. V tomto případě byla. tkán odebrána 24 hodin po injekci, -zmrazená a uchována stejně jako v předchozím příkladu.

. Výsledky přenosu DNA. in vivo jsou uvedený na obr. 8 a 9'. Poměr mezi . sloučeninou (1) ' podle vynálezu a DNA byl 10 nmol/pg DNA.. Poměr lipidu A k DNA byl 4. nmol/pg DNA.

Obr. 8 ilustruje aktivitu ve svalu po transfekci in vivo sloučeninou (1) podle vynálezu ve 'srovnání s nahou DNA- a lipidem A. Bylo pozorováno, že ·. hladiny luciferázové aktivity byly shodné - pro -· nahou. ‘DNA -a sloučeninu (1/, -'přičemž . sloučenina (1) měla výrazně vyšší, aktivitu' ve . srovnání s lipidem A. Mechanismus přenosu se zdá být odlišný při použití nahé DNA nebo sloučeniny (1) podle vynálezu. Skutečně použité komplexy podle vynálezu neobsahují volnou DNA .(fáze

C) a navíc· výsledky jimi dosažené lepší než s nahou DNA.	• in	vitro byly opakovaně.
Obr. '9 porovnává	aktivitu	po	intravenózním	nebo
intramuskulárním podání	sloučeniny	(1) '	podle , vynálezu,	.nahé

DNA.a lipidu A.

' Bylo' pozorováno,’ že při intravenó.zním podání transfekční účinnost byla zhruba stejná pro lipid A a sloučeninu .(1) * ’ podle vynálezu. Na druhé straně, při intramuskulárním podání byla transfekční účinnost sloučeniny (1) podle vynálezu podstatně vyšší než u lipidu A.

Ve srovnání s nahou DNA vykazuje sloučenina (1) podle vynálezu' i při intravenózním podání, navíc k podání intramuskulárnímu,. přinejmenším stejnou transfekční účinnost.

• ···«· ······ . · · ·

Vyplývá z. toho, že účinnost přenosu, nukleových kyselin in vivo užitím sloučeniny (1) podle vynálezu je.celkově lepší než s pomocí .lipidu A, což je -známý kationtový lipid, nebo užitím-.neformulované DNA. .

Nakonec se ukazuje, že komplexy, podle vynálezu mají výhodu, že proti transfekci nahé DNA,. DNa j e lépe chráněna před degradací nukleázami., což přispívá k výraznému' zlepšení stability přípravku. Sloučeniny podle vynálezu se -také mohou užít - k ochraně DNA. při lyofilizací, a tudíž opě.t ke zlepšení : stability takových přípravků,- .

Příklad 12' ' - /

Transfekce ih vivo- užitím' sloučenin (5). a .(6) podle vynálezu

Tento příklad ilustruje schopnost sloučenin (5) a (6) podle vynálezu účinně-přenášet nukleové kyseliny in vivo.

Byl. použit .stejný postup, jako v předchozí ch příkladech. Obr. 10 ukazuje,, že. sloučenina (5) a ('6) formulované s DNA ,tak,’, že poměr nábojů byl 0,25:1 bez kolipidu,- mají transfekční účinnost in vivo vyšší nebo stejnou jako-nah-á DNA 48 hodin po Íntramuskulární, injekci, Následující tabulka uvádí získané výsledky ' pro sloučeniny (5) a.(6) v různých formulacích. ‘ • · · ·

I · · « ··

Sloučenina.	Poměr nábojů	Kolipiď	RLU/ jamka	pg/ jamka	Způsob podáni
Sloučenina (5)	6/.1 .	DOPE (1:1)	25 4/9	1611,3	i. v.
Sloučenina (5),	8/1	DOPE (1:1)	535,2	3558.,.1	i. v.
Sloučenina (5)	0,5/1 .	Chol. (3:1)	209, 6	1-330,,5	i.m.
Sloučenina (5)	0,5/1	DOPE (1:1)	155,8.·	97 4,6.	i.m.
Sloučenina (6)	6/1		175,1	1098,7	i .v.
Sloučenina (6)	5/1 ·	DOPE (1:1)	407,7.	2700,8	i . v.
Sloučenina (6)	0,5/1	DOPE (l.:l)	1768,7	13005,4	i.m.

Claims (2)

1. PATENTOVÉ

   ΖΟΟΟ Ν AR Ο Κ Υ

   I. Sloučenina, v D,L nebo DL formě a .její soli, kterážto sloučenina má obecný vzorec (I) : .

   CA—Rep·-R (I) kde φ CA představuje čykloamidinovou skupinu,, a její .mezomerní formy obecného vzorce (II) : . , ’ kde' •man jsou celá čísla, navzájem nezávislá,. 0 až 3 včetně, přičemž m+n je rovno nebo větší 1,• Ri je skupina obecného vzorce (III).: _K .

   ‘(CH,)—Y(*) (HT) kde p a q jsou celá čísla, navzájem nezávislá, 0 až .10 včetně, Y je karbonylová skupina, aminoskupina, metylaminoskupina nebo metylenová skupina, přičemž Y může mít různé významy v. různých skupinách [(CH₂)_p-YJ., a (*) je buďto .atom vodíku’nebo je to místo pro navázání skupiny Rep, přičemž Ri se může vázat ke kterémukoliv atomu¹ ve vzorci (II) včetně Z a že ve vzorci' (II) j.e jediná skupina R_lz..

   • X je skupina NR₂ nebo CHR_2/ přičemž R₂ buďto atom vodíku

   - 64 nebo. je to místo pro navázání skupiny Ř_lz ’ . Z

   Skupina; y 'W

   4 4 *1. případ: skupipu podle obecného vzorce (IV):

   NH

   II

   R^N-^-W i i (IV) kde W/ představuje CHR nébo NR, a R a R jsou, navzájem nezávisle, atom vodíku, metylová skupina nebo. místo vazby skupiny Ri, nebo *2. případ: skupina podle obecného, vzorce (V)':

   NHR’ (V) kde WC představuje CHR nebo ŇR,. a R' a R jsou, navzájem nezávisle, atom vodíku, metylová skupina nebo místo vazby skupiny R;, '' © Rep buďto, chybí nebo je to můstek obecného vzorce (VI):. ' /

   -|-N—<CH)r

   Jt (VI)

   R<

   R, jehož atom dusíku .je navázán na atomy X, · V, W nebo Z nebo na substituent Y skupiny Ri v závislosti na případu, a přitom • t je celé číslo 0 až 8 včetně, • r je celé číslo 0 až 10 včetně, přičemž r může mít různý ♦ · ' β ··· ·' · · ··· · · · · « ······· ······ · · · · · · ·'

   - 65 význam v různých ..skupinách -NR,₄- (CH) _t-, • R₃,· která může mít různý ..význam v různých skupinách NR₄-(CH) _rR₃> jě atom vodíku, metylová skupina nebo skupina podle obecného vzorce (VII): .

   P.

   kde. U je celé. číslo 1 až 10 včetně, s je celé číslo 2 až 8 včetně, přičemž může mít různý význam v různých -skupinách -(CHzh-NRs, a R₅ je atom vodíku, skupina CA, přičemž skupiny CA jsou navzájem nezávislé a mohou být různé, nebo skupina obecného' vzorce (Vil)., přičemž skupiny podle vzorce (VII) jsou navzájem nezávislé a mohou být různé, * R₄ je definována stejně jako R₃ nebo je to skupina CA, a © R je navázána na . karbonylovou funkční skupinu skupiny Rep obecného vzorce (VT), nebo jestliže Rep chybí, R je navázána přímo na skupinu CA a představuje: ' .

   * buďto, skupinu vzorce NRsR?/.· kde R₆ a R7 představují, navzájem nezávisle/ atom vodíku, nebo alifatickou skupinu .obsahující 1 až 22 atomů uhlíku, která je lineární -nebo rozvětvená, nasycená . nebo nenasycená, případně fluorovaná, přičemž alespoň jedna ,ze skupin R₆ nebo R7 není vodík a .druhá obsahuje 10 až 22 atomů uhlíku,. ' * nebo steroidní derivát, nebo skupina obecného vzorce (VIII) :

   —(Vili) kde x je . celé číslo 1 až .8 včetně, y je celé číslo 1 až 10 včetně, a Q buďto .představuje skupinu C(O)NR₆R7, kde R₆ a R7 jsou jak byly definovány výše, nebo Q představuje skupinu C(O)R₈ kde R₈ je skupina podle vzorce (IX):

   ·· ·· ♦ · · · ·· ·· ·· ·· • · · · · < Φ · • · • · · · · · • · · ···· • · · · ·· ·· - 66 - R-r „ 1 V⁶ 0 (ix) kde z je ce.lé čislo. 2 až -8 včetně, a Rg je nasycená nebo nenasycená alifatická . skupina obsahující 8 až 22 atomů uhlíku, případně fluorovaná, nebo steroidní derivát,' a dva

   substituenty R₆ jsou, navzájem nezávisle, jak byly definovány ). výše, '^λ' nebo' Rg představuje skupinu -O-Rg kde R₉ je, jak byla definována výše.

   , . 2. Sloučeniny podle nároku 1, kde skupina Ri je navázána na jedné straně buďto' na Z nebo. V a na .druhé straně na skupinu Rep,. prostřednictvím Y,. . j

   3. Sloučeniny podle nároku 1, kde cykloamidinová skupina CA podle obecného vzorce (II) obsahuje 5; 6,'7 nebo 8.členů.

   4. . Sloučeniny, podle nároku .1, kde R₃ je atom vodíku nebo metylová skupina a R₄ je jak byla definována v nároku 1, nebo R₃ a. R₄- ve vzorci (VI) přestavují atomy vodíku, nebo R₄ je, atom vodíku a R₃ je skupina podle vzorce (VII), kde R₅ je skupina CA. ' ' ^Λ 5. ..Sloučeniny podle nároku 1, kde' ve vzorci (V) p a q jsou vybrány, navzájem nezávisle, z 2, 3 a 4.

   6. Sloučeniny podle nároku 1, kde skupiny R₆ a R₇ jsou shodné nebo různé, a každá z nich představuje nasycený nebo · nena'sycený, lineární nebo rozvětvený alifatický řetězec,

   volitelně fluorovaný, obsahující 10 až 22 atomů uhlíku.

   7·. Sloučeniny podle . nároku 1,. kde skupiny ,R₆ a R₇ jsou shodné nebo různé, a každá z.nich představuje nasycený nebo nenasycený·, ..lineární nebo rozvětvený alifatický řetězec, volitelně fluorovaný, obsahující 12, 14, 16, 17, 18 nebo

   19 atomů uhlíku. ' ·8. Sloučeniny podle nároku 1, kde.R je steroidní derivát, vybraný ze skupiny obsahující' cholesterol, cholestanol, 3-a-5-cyklo-5-cc-choles.tah-6-|3-ól, kyselinu cholcvou, cholesterylformiát, cholestanýíformiát,. 3a,.5-cyclo-5a-cholestan63~ylformiát, cho.lesterylamin,· 6- (1,5-dimetylhexýl) 3a, 5a-dimetylhexadekahydroCyklopenta [a] cyklo.propa [2,3] cyklopenta[1,2-f]naftalen-lCHylamin nebo cholestanylamin.

   9. Sloučeniny podle nároku 1,'které mají vzorce:

   Sloučenina (1) <f·· ·· 49 99 94

   4 4 4 · · · · • .· · ' · · · • ······ ··

   Sloučenina (3)

   Sloučenina (4)

   Sloučenina (5)

   Sloučenina (6)

   10'.· Způsob přípravy sloučenin podle nároků 1 až 9' v y z' n a č u j i c 1 s e ' t 1 m, že. se provede syntéza, stavebních bloků nesoucích cykloamidinovou funkční skupinu a tyto stavební bloky se naroubují na lipidy opatřené můstky.

   11. Způsob přípravy sloučenin podle '.nároků 1 až 8 vyznačující se ti m, že se provede syntéza analogických lipopolyaminů a pak cyklizace ¹ - do φ φ φ ·

   69 cykloamidinových skupin.

   12'. Přípravek vyznačující; se tím, že obsahuje alespoň jednu sloučeninu podle obecného vzorce 1 (I) .

   13.. Přípravek podle nároku 12 v y z n a č u j í c í s e tím, že obsahuje alespoň jednu · .sloučeninu .podle , obecného vzorce (I) a nukleovou kyselinu. . '

   14. -Přípravek. podle nároku 12 nebo.. . .13' vyznačující se tím, . že ' obsahuje, navíc' jedno nebo více adjuvans .

   15., Přípravek podle nároku 14 v y z n .a č u j í c í s e tím,, že' adjuvans je jeden . nebo, více neutrálních' .lipidů obsahujících dva mastné řetězce. _;

   16. „Přípravek podle nároku' 15 vyznačuj í c 'i se tím, že neutrální lipidy jsou přírodní nebo syntetické lipidy, které mají povahu zwitteriontu. nebo za fyziologických podmínek postrádají iontový náboj, vybrané ze skupiny... obsahující . např. dioleoylfosfatidyleťanolamin, (DOPE), oleoylfo.sfatidyletanolamin (POPE) , di-stearóyl, -paímitoyl, mirýstoylfosfatidylatánol-aminy a jejich deriváty 1 až 3.x metylované, . fosfatidylglycerbly, ¹ * ďiacylglyceroly, glykosyldiacylglycero.ly, . cerebrosi.dy ' jako . Jsou zejména galaktocerebrosidy, sfingolipidy, jako jsou zejména sfingbmyeliny, a asialogahglíosidy, jako jsou zejména asialoGMl a GM2.

   - 70 • · • · • · • ·

   17. Přípravek podle nároku 14 vyznačuj ící se tím, že .adjuvans je sloučenina' přímo nebo nepřímo se, podílející·na kondenzaci nukleové kyseliny.

   18. Přípravek podle nároku 17 v y z n a č. .u. j 1 c 1 s e tím, že adjuvans je odvozeno zcela nebo .zčásti z protaminu, histónu nebo., nukleolinu a/nebo jednoho z jejich derivátů, nebo je tvořeno, zcela nebo částečně, peptidovými jednotkami (KTPKKAKKP) a/nebo (ATPAKKAA) , jejichž počet, je 2 až 10, a opakují se za sebou souvisle nebo nesouvisle. , ' 19. Přípravek podle- > nároku 12 až .18 v y z n a č.ú j í c 1 . s ^pe tím, že. obsahuje navíc jeden nebo· více aniontových surfaktantů v dostatečném množství na to, aby stabilizovaly velikost· částice nukleolipidových komplexů.

   20. Přípravek podle, nároku 12. až .19 v y z n a , .č u j ící s e tím, že obsahuje vehikulum, které.

   • je farmaceuticky přijatelné pro formulaci do injikovatelného přípravku.

   -21. Přípravek podle nároku 12 až 19 v y z-n a č u j 1 c 1 s e tím, že obsahuje vehikulum, které je ..farmaceuticky .přijatelné pro formulaci , do přípravku, pro aplikaci na kůži a/nebo sliznici.

   *22., Přípravek· podle nároku 13 v y z n a č u j 1 c 1 se tím, ,že nukleová kyselina je deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina. . . ^; '

   23. Přípravek podle nároku 22 vyznačuj 1 c 1 se tím, že nukleová kyselina obsahuje expresní' kazetu složenou • fefefe ·

   - 71 ifefe fe · · · · e '9 ·· «fe • ··· • fe · fe ·· ·· z jednoho nebo více terapeutických genů řízených jedním nebo více promotory a terminátorem transkripce, které jsou aktivní v cílových buňkách., 24. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků . 1 až 9 pro výrobu léku k léčení nemocí. . \

   25. Použití sloučeniny.podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 pro . výrobuléku k léčení nemocí tím, že se vnesou nukleové kyseliny do buněk intramuskulárním podáním.

   nukleových . kyselin do buněk tím, že . obsahuje následující' se přivede do -kontaktu. ,se vzorce (I), aby vytvořila

   - 26. Způsob přenosu vyznačující se kroky: .

   1) nukleová kyselina sloučeninou podle obecného nukleolipidový komplex, a ’
2. 2) buňky se přivedou do ' kontaktu, s komplexem připraveným podle kroku 1.

   nukleolipidovým

   I •v

   27. Způsob přenosu nukleových kyselin do buněk podle nároku 26 vyznačuj ící s e. tím, že nukleová kyselina a/nebo sloučenina obecného vzorce (I) jsou předem smíchány s jedním nebo více adjuvans.

   .28. Způsob léčení nemocí vyznačující. se tím, že se podává nukleová kyselina, která kóduje protein nebo která může být přepsána do. nukleové kyseliny schopné vyléčit nemoc, přičemž nukleová. kyselina.' se kombinuje se sloučeninou obecného vzorce (I) .