CZ295225B6 - Amidiniový derivát a farmaceutický prostředek tento derivát obsahující - Google Patents
Amidiniový derivát a farmaceutický prostředek tento derivát obsahující Download PDFInfo
- Publication number
- CZ295225B6 CZ295225B6 CZ19982772A CZ277298A CZ295225B6 CZ 295225 B6 CZ295225 B6 CZ 295225B6 CZ 19982772 A CZ19982772 A CZ 19982772A CZ 277298 A CZ277298 A CZ 277298A CZ 295225 B6 CZ295225 B6 CZ 295225B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pharmaceutical composition
- amidinium
- derivative
- group
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 125000000909 amidinium group Chemical group 0.000 title claims abstract description 27
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 68
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol group Chemical group [C@@H]1(CC[C@H]2[C@@H]3CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)[C@H](C)CCCC(C)C HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 14
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims abstract description 7
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 51
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 39
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 39
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 39
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 32
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 25
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 claims description 22
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 20
- -1 amidinium compound Chemical class 0.000 claims description 18
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 16
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 claims description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 8
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 8
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 7
- JNUKAMAZVDNYCT-ZFYYWSQPSA-N (3S,8S,9S,10R,13S,14S,17S)-3-hydroxy-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-16-carboxamide Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC(C(N)=O)[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 JNUKAMAZVDNYCT-ZFYYWSQPSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 72
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 37
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 32
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 28
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 8
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- IVHKZGYFKJRXBD-UHFFFAOYSA-N amino carbamate Chemical compound NOC(N)=O IVHKZGYFKJRXBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 7
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical group NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N Spermidine Natural products NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 5
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 5
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- QNEPTKZEXBPDLF-JDTILAPWSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] carbonochloridate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(Cl)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 QNEPTKZEXBPDLF-JDTILAPWSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 4
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 4
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 3
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 2
- 125000005342 perphosphate group Chemical group 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 102000005162 pleiotrophin Human genes 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- MBYLVOKEDDQJDY-UHFFFAOYSA-N tris(2-aminoethyl)amine Chemical compound NCCN(CCN)CCN MBYLVOKEDDQJDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- WBNTUGPRADFXAL-UHFFFAOYSA-N 1H-pyrazole-5-carboximidamide Chemical compound NC(=N)C=1C=CNN=1 WBNTUGPRADFXAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- VDNMXEHWOCXKOZ-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(4-aminobutylamino)propyl]guanidine Chemical compound NCCCCNCCCN=C(N)N VDNMXEHWOCXKOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRYZPFWEZHSTHD-HEFFAWAOSA-O 2-[[(e,2s,3r)-2-formamido-3-hydroxyoctadec-4-enoxy]-hydroxyphosphoryl]oxyethyl-trimethylazanium Chemical class CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](NC=O)COP(O)(=O)OCC[N+](C)(C)C LRYZPFWEZHSTHD-HEFFAWAOSA-O 0.000 description 1
- ZXWQZGROTQMXME-WXUJBLQXSA-N 2-hydroxy-n-[(e,2s,3r)-3-hydroxy-1-[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoctadec-4-en-2-yl]tetracosanamide Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)N[C@H]([C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)CO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ZXWQZGROTQMXME-WXUJBLQXSA-N 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- OYXZMSRRJOYLLO-RVOWOUOISA-N 7alpha-hydroxycholesterol Chemical compound C([C@H]1O)=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 OYXZMSRRJOYLLO-RVOWOUOISA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102100040214 Apolipoprotein(a) Human genes 0.000 description 1
- 101710115418 Apolipoprotein(a) Proteins 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 125000006847 BOC protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010061846 Cholesterol Ester Transfer Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012336 Cholesterol Ester Transfer Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 102000012605 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Human genes 0.000 description 1
- 108010079245 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Proteins 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101900264058 Escherichia coli Beta-galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004038 Glia Maturation Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000011795 OF1 mouse Methods 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000001107 Phosphatidate Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010069394 Phosphatidate Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010011964 Phosphatidylcholine-sterol O-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100031538 Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 102000003867 Phospholipid Transfer Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000216 Phospholipid Transfer Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102100037814 Vigilin Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005275 alloying Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 229930183167 cerebroside Natural products 0.000 description 1
- 150000001784 cerebrosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 210000000188 diaphragm Anatomy 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- AQZNBAIWDZHJNK-UHFFFAOYSA-N ethanimidoyl cyanide Chemical compound CC(=N)C#N AQZNBAIWDZHJNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 108010092427 high density lipoprotein binding protein Proteins 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 108010053156 lipid transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
- C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
- C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
- A61K31/575—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of three or more carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, ergosterol, sitosterol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Je popsán amidiniový derivát obecného vzorce I, ve kterém R.sup.1.n. znamená cholesterylovou skupinu a R.sup.2.n. a R.sup.3.n. nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce II, přičemž alespoň jeden z R.sup.2.n. a R.sup.3.n. znamená skupinu obecného vzorce II a v obecném vzorci II R.sup.4.n. a R.sup.5.n. nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce III. Vynález se rovněž týká farmaceutického prostředku obsahujícího uvedený amidiniový derivát a použití uvedeného amidiniového derivátu pro přípravu farmaceutických prostředků určených pro transfekci buněk in vitro, ex vivo nebo/a in vivo.ŕ
Description
Oblast techniky
Vynález se týká amidiniového derivátu, farmaceutického prostředku, který tento derivát obsahuje a použití tohoto derivátu pro přípravu farmaceutických prostředků.
Dosavadní stav techniky
Hlavním předmětem genové léčby je korigovat genetická onemocnění spojená s nedostatečnou a/nebo abnormální expresí, což je nedostatečná nebo nadměrná exprese jedné nebo více nukleových kyselin. Je snahou korigovat tento typ genetické poruchy pomocí buněčné exprese klonovaných genů in vivo nebo in vitro.
Nyní je navrženo několik způsobů pro intracelulámí dodání tohoto typu genetické informace. Jeden ze způsobů, který se běžně používá, je založen na použití chemických nebo biochemických vektorů. Tyto syntetické vektory mají dvě hlavní funkce: spojení DNA, která má být transfekovaná, a podporu jejího buněčného připojení a její průchod přes plazmatickou membránu a, pokud je to vhodné, přes dvě buněčné membrány. Pro membránu a, pokud je to vhodné, přes dvě buněčné membrány. Pro tento účel byly určeny pozitivně nabité kationtové lipidy jako je N-[l(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylamoniumchlorid (DOTMA). S výhodou interagují ve formě liposomů nebo malých měchýřků spontánně s DNA, která je v této části záporně nabitá, za vzniku komplexů lipid-DNA, které jsou schopny spojení s buněčnou membránou a umožňují tedy intracelulámí dodání DNA. Ve specifickém případě DOTMA však dobrá schopnost transfekce bohužel zůstává spojená s poruchou v biologickém odbourání a toxickým charakterem vůči buňkám.
Po DOTMA byly vyvinuty jiné kationtové lipidy na stejném modelu struktury: lipofílní skupina kombinovaná s aminoskupinou pomocí takzvané „spojovací“ ruky. Mezi tyto sloučeniny zejména patří sloučeniny, které obsahují jako lipofílní skupinu dvě mastné kyseliny a derivát cholesterolu a dále, pokud je to vhodné, obsahují jako aminoskupinu kvartemí amoniovou skupinu. Jako reprezentativní sloučeniny této skupiny kationtových lipidů mohou být uvedeny DOTAP, DOBT nebo ChOTB.
V současné době je snaha získat nové chemické sloučeniny, které by na základě jejich chemické struktury a jejich biologické rozložitelnosti splňovaly požadavky potřebné pro transfekční vektory nukleových kyselin. Vynález poskytuje nové sloučeniny, které tyto požadavky dokonale splňují.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je amidiniový derivát obecného vzorce I
II
R1
R3 (I)
-1 CZ 295225 B6 ve kterém
R1 znamená cholesterylovou skupinu,
R2 a R3 nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce II (ID, přičemž alespoň jeden z R2 a R3 znamená skupinu vzorce II a v obecném vzorci Π m znamená celé číslo 0 až 4, n znamená celé číslo 0 až 4, přičemž v případě, že m je větší nebo rovno 2, potom n má stejné nebo rozdílné významy v jednotlivých jednotkách -[(CH2)n-N(R4)]- obecného vzorce II pro R2 a R3,
R4 a R5 nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce III — ( CHž )j>---(X)r -(CHz přičemž alespoň jeden z R4 a R5 znamená skupinu obecného vzorce III a v obecném vzorci III p znamená celé číslo 0 až 4, q znamená celé číslo 0 až 4 a r znamená 0 nebo 1, přičemž v případě, že r znamená 1, potom buď X znamená NH a x znamená 1, nebo X znamená N a x znamená 2, přičemž p, q a r mají stejné nebo rozdílné významy vjednotlivých skupinách obecného vzorce III pro obecné substituenty R4 a R5.
Výhodný je amidiniový derivát obecného vzorce I, ve kterém R2 a R3 nezávisle jeden na druhém znamenají skupinu obecného vzorce IV
NH2 (IV),
-2CZ 295225 B6 ve kterém n, m a p mají výše uvedené významy a R4 znamená atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce V
(V) ve kterém q a r mají významy uvedené v nároku 1, přičemž m, n, p, qar mají stejné nebo rozdílné významy v jednotlivých skupinách obecných vzorců IV a V pro obecné substituenty R2 a R3.
Obzvláště výhodný je amidiniový derivát, kterým je některá ze sloučenin následujících obecných vzorců:
(H2N)2 +C-NH-(CH2)2-NH-COO-R1(VI), [(H2N)2 +C-NH-(CH2)3][(H2N)2C+-NH-(CH2)4]-N-COO-R1 (VII), [(H2N)2 +C-NH-(CH2)2]2-N-(CH2-NH-COO-R1 (VIII), [(H2N)2 +C-(CH2)2]2-N-COO-R1(IX), [[(H^/C-ÍCH^j^N-ÍCH^j^-COO-R1(X), ve kterých R1 má výše uvedený význam.
Výhodný je rovněž amidiniový derivát, kterým je některá ze sloučenin následujících obecných vzorců:
[(H2N)2 +C-NH-(CH2)3] [(H2N)2C+-NH-(CH2)4]-N-COO-R‘ (VII), [(H2N)2 +C-(CH2)2]2-N-COO-R* (IX), [[(H2N)2 +C-(CH2)2]2-N-(CH2)2]2N-COO-R’ (X), ve kterých R1 má výše uvedený význam.
Mimořádně výhodným amidiniovým derivátem podle vynálezu je 3fl-[N-guanidinopropyl-Nguanidinobutyljkarbamoylcholesterol.
Výhodným amidiniovým derivátem podle vynálezu je rovněž 3p-[N-[N',N'-guanidinoethylaminoethyl)karbamoyl] cholesterol.
Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje alespoň jeden amidiniový derivát obecného vzorce I a nukleovou kyselinu.
Farmaceutický prostředek podle vynálezu výhodně jako amidiniový derivát obsahuje 3β-[Νguanidinopropyl-N-guanidinobutyl]karbamoylcholesterol.
Farmaceutický prostředek podle vynálezu výhodně jako amidiniový derivát obsahuje 3β-[Ν[N' ,N'-guanidinoethylaminoethyl)karbamoyl] cholesterol.
Farmaceutický prostředek podle vynálezu výhodně jako nukleovou kyselinu obsahuje kyselinu deoxyribonukleovou.
Farmaceutický prostředek podle vynálezu výhodně jako nukleovou kyselinu obsahuje kyselinu ribonukleovou.
Výhodně ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu nukleová kyselina obsahuje terapeutický gen.
Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje amidiniový derivát obecného vzorce I, neutrální lipid a nukleovou kyselinu.
Výhodně tento farmaceutický prostředek podle vynálezu jako amidiniový derivát obsahuje amidiniový derivát zvolený z množiny zahrnující
P~[N-guamdinopropyl-N-guanidinobutyl]karbamoylcholesterol a
3p-[N-[N',N'-guanidinoethylaminoethyl)karbamoyl]cholesterol.
Výhodně tento farmaceutický prostředek podle vynálezu jako neutrální lipid obsahuje dioleoylfosfatidylethanolamin.
Výhodně tento farmaceutický prostředek podle vynálezu jako nukleovou kyselinu obsahuje kyselinu deoxyribonukleovou.
Výhodně tento farmaceutický prostředek podle vynálezu jako nukleovou kyselinu obsahuje kyselinu ribonukleovou.
Výhodně v tomto farmaceutickém prostředku podle vynálezu nukleová kyselina obsahuje terapeutický gen.
Výhodně farmaceutický prostředek podle vynálezu obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič vhodný pro injekční podání.
Výhodně farmaceutický prostředek podle vynálezu obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič vhodný pro aplikaci na pokožku nebo na sliznici.
Předmětem vynálezu je rovněž použití amidiniového derivátu podle obecného vzorce I pro přípravu farmaceutických prostředků určených pro transfekci buněk in vitro, ex vivo nebo/a invivo.
Nárokované sloučeniny jsou zejména velmi výhodné z léčeného hlediska pro svou nejedovatou povahu a amfífílní vlastnosti. Kvůli těmto vlastnostem mohou být zejména použity pro komplexaci nukleových kyselin s perspektivou jejich buněčné transfekce. Tyto sloučeniny mohou být proto výhodně použity v genové léčbě.
Sloučeniny VII (BGSC) a VIII (BGTC) jsou nejvýhodnější pro in vivo genový přenos. Tyto dvě sloučeniny tvoří komplex s DNA a chrání proti degradaci způsobené změnami pH v průběhu přenosu na buňky, které mají být léčeny.
Vynález se proto týká farmaceutických prostředků, které obsahují nejméně jednu sloučeninu podle předkládaného vynálezu. Ve výhodném provedení podle předkládaného vynálezu je sloučeninou bisguanidinospermidincholesterol (BGSC) a v jiném výhodném provedení podle předkládaného vynálezu je sloučeninou bisguanidinotrencholesterol (BGTC).
Na základě chemické struktury a jejich biologické rozložitelnosti spojují nárokované sloučeniny podle předkládaného vynálezu dobře požadavky potřebné pro transfekční vektor nukleových kyselin.
-4CZ 295225 B6
Předkládaný vynález se proto také týká jakéhokoli použití těchto nových sloučenin při in vitro, ex vivo a/nebo in vivo transfekci buněk a zejména při vektorizaci nukleových kyselin. Předkládaný vynález se týká zejména jakýchkoli farmaceutických prostředků obsahujících nukleové kyseliny společně s nejméně jednou sloučeninou podle předkládaného vynálezu.
V prostředcích podle předkládaného vynálezu může být nukleová kyselina kombinovaná s nejméně jednou nárokovanou sloučeninou buď deoxyribonukleová kyselina, nebo ribonukleová kyselina. Mohou to být oligonukleotidové nebo polynukleotidové sekvence přírodního nebo umělého původu a zejména genomické DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, hybridní sekvence nebo syntetické nebo polosyntetické sekvence. Tyto nukleové kyseliny mohou být lidského, zvířecího, rostlinného, bakteriálního nebo virového původu a podobně. S výhodou obsahují terapeutické geny.
Jiný předmět podle předkládaného vynálezu se tedy týká farmaceutických prostředků obsahujících dále nukleovou kyselinu. S výhodou je tato nukleová kyselina deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina. Ve výhodném provedení podle předkládaného vynálezu obsahuje nukleová kyselina terapeutický gen.
Pro účely podle předkládaného vynálezu se terapeutickým genem rozumí zvláště jakýkoli gen kódující proteinový produkt, který má terapeutický účinek. Takto kódovaným proteinovým produktem může být protein, peptid a podobně. Tento proteinový produkt může být homologický vzhledem k cílové buňce (to znamená produkt, který se normálně vylučuje v cílové buňce, pokud buňka nevykazuje žádnou chorobnou změnu). V tomto případě umožňuje exprese proteinu například kompenzaci nedostatečné exprese v buňkách nebo expresi proteinu, který je neaktivní nebo slabě aktivní z důvodu modifikace nebo alternativně nadměrnou exprimaci jmenovaného proteinu. Terapeutické geny mohou také kódovat mutant buněčného proteinu, který má zvýšenou stabilitu, modifikovanou aktivitu a podobně. Proteinový produkt může také být heterologní vzhledem k cílové buňce. V tomto případě může například doplňovat nebo poskytovat činnost, která je v buňce nedostatečná, což umožňuje potírání chorobných změn nebo stimulaci imunitní odpovědi.
Mezi terapeutickými produkty pro účely podle předkládaného vynálezu mohou být uvedeny zejména enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny: interleukiny, interferony, TNF a podobně (FR 92/03120), růstové faktory, neuropřenašeče nebo jejich prekurzory nebo syntetické enzymy, trofícké faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofín a podobně, dystrofín nebo minidistrofín (FR 91/11947), protein CFTR spojený s cystickou fibrózou, geny potlačující nádory, p53, Rb, RaplA, DCC, krev a podobně (FR 93/04745), geny kódující faktory obsažené ve sraženinách: faktor VII, VIII a IX, geny obsažené v opravě DNA, sebevražedné geny (thymidinkináza, cytosin deamináza), geny pro hemoglobin nebo jiné nosičové proteiny, geny odpovídající proteinům obsaženým v metabolizmu tuků, alipoproteinový typ vybraný ze sady, která obsahuje apolipoproteiny A-I, A-II, A-IV, B, -C-I, C-Π, C-III, D, E, F, G, H, J a apo(a), metabolické enzymy jako je například lipoproteinlipáza, jatemí lipáza, lecitincholesterolacyltransferáza, 7-alfacholesterolhydroxylázy, fosfatáza fosfatidové kyseliny, nebo alternativně proteiny pro přenos lipidů jako je protein pro přenos esterů cholesterolu a protein pro přenos fosfolipidů, protein pro vazbu HDL nebo alternativně receptory vybrané například z LDL receptorů, receptorů pro zbytky chylomikronů a lapače receptorů a podobně.
Terapeutická nukleová kyselina může být také gen nebo protismyslná sekvence, která expresí v cílové molekule umožňují kontrolu genů nebo transkripce buněčné mRNA. Tyto sekvence mohou být například přepsány v cílové buňce na RNA komplementární k buněčné mRNA, a tak blokovat jejich translaci na protein podle postupu popsaného v patentu EP 140 308. Terapeutické geny mohou také obsahovat sekvenci kódující ribozomy, které jsou schopny selektivně ničit cílovou RNA (EP 321 201).
-5 CZ 295225 B6
Jak je uvedeno výše, nukleová kyselina může také obsahovat jeden nebo více genů kódujících antigenní peptid schopný vyvolání imunitní odpovědi u člověka nebo zvířat. V tomto specifickém provedení předkládaný vynález poskytuje přípravu buď vakcíny, nebo imunoterapeutické léčby aplikované na člověka nebo zvířata, zejména proti mikroorganizmům, virům nebo rakovině. Toto provedení mohou reprezentovat zejména antigenní peptidy specifické pro Epstein-Barrův virus, virus HIV, virus hepatitidy B (EP 185 573), pseudovzteklinový virus, virus tvořící syncitium (soubuní) nebo jiné viry nebo alternativně antigenní peptidy specifické pro nádory.
S výhodou obsahuje nukleová kyselina také sekvenci umožňující expresi terapeutického genu a/nebo genu kódujícího antigenní peptid v buňce nebo požadovaném orgánu. Mohou to být sekvence, které jsou přírodně odpovědné za expresi uvažovaného genu, kdy tyto sekvence jsou schopny působit v nakažených buňkách. Mohou to být také sekvence jiného původu (odpovědné za expresi jiných proteinů) nebo dokonce syntetické. Zejména to mohou být sekvence podporující eukaryotické nebo virové geny. Například to mohou být podpůrné sekvence odvozené od genomu buňky, kterou je žádoucí nakazit. Podobně mohou být podporující sekvence odvozeny od genomu viru. V tomto ohledu mohou být například uvedeny promotory E1A, MLP, CMV a RSV genů a podobně. Dále mohou být tyto expresní sekvence modifikovány přidáním aktivační nebo regulační sekvence a podobně. Promotor může být stimulující nebo potlačující.
Dále mohou nukleové kyseliny obsahovat, zejména proti proudu terapeutického genu, signální sekvenci terapeutického produktu syntetizovaného sekreční cestou cílové buňky. Tato signální sekvence může být přírodní signální sekvence terapeutického produktu, ale může to také být jiná funkční signální sekvence nebo umělá signální sekvence. Nukleová kyselina může také obsahovat signální sekvenci řídící terapeutický produkt syntetizovaný pro určitou část buňky.
Kationtové lipidy popsaného podle předkládaného vynálezu, a zejména BGTC a BGSC, jsou schopny tvořit komplex s DNA a představují výhodnou alternativu virových vektorů pro přenos nukleových kyselin, které jsou terapeuticky zajímavé, in vitro, ex vivo nebo in vivo. Kvůli chemickým vlastnostem guanidiniových skupin, zejména jejich vysokému pKa, jsou tyto kationtové lipidy schopny chránit molekulu DNA proti degradaci způsobené změnami pH. Výsledky uvedené v příkladech ukazují, že tyto sloučeniny umožňují transfekci mnoha buněčných typů s velkou účinností. Účinnost transfekce závisí zejména na poměru kationtový lipid/DNA ve vytvořeném komplexu. Poměr mezi dvěma sloučeninami, který zvláště vhodný pro transfekci tvoří 6 až 8 guanidiniových skupin na jednu fosfátovou skupinu DNA.
Účinnost transfekce komplexů kationtový lipid/DNA může být dále zlepšena pomocí přidání neutrálního lipidu a tvorbou kationtových liposomů. Tyto lipidy se připraví pomocí komplexace mezi kationtovým lipidem a neutrálním lipidem. Neutrální lipidy jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří:
- dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE),
- oleoylpalmitoylfosfatidylethanolamin (POPE),
- distearoyl, dipalmitoyl, dimirystoyl fosfatidylethanolamin,
- jejich deriváty, které jsou 1 až 3krát N-methylované, fosfatidylglyceroly,
- diacylglyceroly,
- glykosyldiacylglyceroly, cerebrosidy (j ako j sou zejména galaktocerebrosidy),
-6CZ 295225 B6
- sfíngolipidy (jako jsou zejména sfíngomyeliny) a asialogangliosidy (jako jsou zejména asialoGMl a GM2).
S výhodou se používá DOPE.
S výhodou je sloučenina podle předkládaného vynálezu a neutrální lipid přítomen v poměru 1 až 5, výhodně 2 až 4. Dále poměr úplný lipid (sloučenina podle předkládaného vynálezu plus neutrální lipid) ku DNA je s výhodou vybrán tak, že čistý poměr kladných nábojů je mezi 2 až 5. Zvláště výhodný je poměr 3.
Předkládaný vynález se také týká jakýchkoli farmaceutických prostředků obsahujících sloučeninu podle předkládaného vynálezu, neutrální lipid a nukleovou kyselinu. S výhodou je sloučenina podle předkládaného vynálezu vybrána z BGTC a BGSC. Stejně výhodně je neutrálním lipidem DOPE. Nukleová kyselina je buď deoxyribonukleová kyselina, nebo ribonukleová kyselina. S výhodou nukleová kyselina obsahuje terapeutický gen.
Dále k použití nárokovaných amidiniových derivátů, je také možné je použít v následujících aplikacích: interference při interakci mezi nukleovou kyselinou a proteinem za dosažení inhibice nebo stimulace určitého procesu, například regulace genetické exprese nebo enzymatické aktivity (polymerázy, transkriptázy a podobně), selektivní komplexace aniontových druhů při jejich extrakci, jejich odstranění nebo jejich detekci například za pomoci membrány elektroda/sonda, použití jako laboratorního činidla pro provádění in vitro transfekčních operací a podobně.
Předmětem podle předkládaného vynálezu je tedy také terapeutická aplikace amidiniových derivátů, jak je popsáno výše, buď přímo, nebo ve farmaceutických prostředcích.
S výhodou farmaceutické prostředky obsahují farmaceuticky přijatelná vehikula pro injekční podávání prostředků, zejména pro přímé injekční podávání v množství vhodném pro orgán, nebo pro podávání místním způsobem (na pokožku a/nebo sliznici). Prostředky mohou být ve formě zejména isotonických, sterilních roztoků nebo v suché formě, s výhodou sušené za mrazu, která se při podávání v závislosti na druhu rozpustí ve sterilní vodě nebo ve fyziologické solance za získání roztoku pro injekční podávání.
Přehled obrázků na výkresech
Předkládaný vynález bude dále podrobněji popsán pomocí následujících příkladů a obrázků, které jsou pouze ilustrativní a předkládaný vynález neomezují.
Obrázek 1: Schématicky zobrazuje postup pro přípravu BGSC a BGTC.
Obrázek 2: Schématicky zobrazuje postup pro přípravu BADC.
Obrázek 3: Měření účinnosti transfekce jako funkce poměru lipidní sloučenina/DNA.
Obrázek 4: Měření účinnosti transfekce jako funkce poměru úplné lipidy/DNA.
Obrázek 5: Měření vlivu séra na účinnost transfekce HepG2 (5A), HeLa (5B), NIH 3T3 (5C) a 293 (5D). Srafované sloupce: přítomnost séra; prázdné sloupce: transfekce za nepřítomnosti séra 2 hodiny.
Obrázek 6: Fotografie kryosekcí průdušnice myši ukazující expresi genu v epitelu dýchacích cest po in vivo transfekci liposomy BGTC/DOPE. (6A) a (6B): detekce exprese beta-galaktosidázy
-7CZ 295225 B6 v transfekovaných buňkách umístěných na povrchu epitelu (6A) a ve žláze pod sliznicí (6B); (6C): detekce buňky vylučující beta-galaktosidázu ve žláze pod sliznicí pomocí imunoperoxidázového značení za použití antibetagalaktosidázové monoklonální protilátky; (6D): detekce buňky vylučující luciferázu ve žláze pod sliznicí pomocí imunoperoxidázového značení za použití antiluciferázové polyklonální protilátky; (6E): zbarvení imunoperoxidázy: negativní kontrola prováděná za nepřítomnosti protilátek.
Obrázek 7: Měření účinnosti přenosu genů in vivo pomocí nitrožilní injekce komplexu DNA/BGTC-liposom.
Obrázek 8: Měření účinnosti přenosu genů in vivo pomocí intraperitoneální injekce komplexu DNA/BGTC-liposom.
Příklady provedení vynálezu
A. Příprava derivátů podle předkládaného vynálezu
Látky a způsoby
1. Fyzikální měření
Protonová spektra nukleární magnetické rezonance ('H NMR) byla zaznamenána na spektrometru Bruker AC200. Chemické posuny jsou vyjádřeny v ppm vzhledem k TMS.
2. Chromatografie na silikagelu
Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) se prováděla na silikagelových deskách Měrek 0,2 mm silných.
Kolonová chromatografie se prováděla na silikagelu Měrek 60 o velikosti částic 0,040 až 0,063 mm.
Příklad 1
Příprava guanidinospermidincholesterolu BGSC
1. Příprava di-Bockarbamátu (1)
Roztok cholesterylchloroformiátu (0,9 g, 2 mmol) a triethylaminu (0,214 g, 2 mmol) v dichlormethanu (40 ml) se přidá k roztoku 1N,8N-Boc2-spermidinu (0,690 g, 2 mmol) v dichlormethanu (20 ml). Po 5 hodinách zahřívání k varu se směs promyje vodou (2 x 50 ml), suší se nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Surový produkt se čistí pomocí chromatografie na silikagelu za eluce směsí dichlormethan/methanol 95/5 za získání surového karbamátu (1,3 g, 86 %).
*H NMR δ (deuterochloroform, 200 MHz): 0,5-2,5 (m, struktura cholesterylu, Boc signál a centrální CH2 skupiny ze spermidinu), 3,1-3,3 (m, 8H, N-CH2), 4,50 (m, 1H), 5,37 (d, 1H, H6).
2. Příprava aminokarbamátu (2)
Sloučenina (1) (1,3 g) se rozpustí v 20 ml dichlormethanu a k tomuto chlazenému roztoku (ledová lázeň) se přidají 2 ml čerstvě destilované kyseliny trifluoroctové a odstraní se tak chránící skupiny BOC. Po 3 hodinách míchání při teplotě místnosti se přidá 50 ml IN hydroxidu sodného
-8CZ 295225 B6 a směs se extrahuje dichlormethanem. Organické vrstvy se promyjí vodou, suší se nad síranem sodným a odpaří za získání surového aminokarbamátu (2) (0,945 g, 98 %).
'H NMR δ (deuterochloroform, 200 MHz); 0,5-2,5 (m, struktura cholesterylu a centrálních skupin ze spermidinu), 2,7 (m, 4H, CH2-N-CO-), 3,25 (široký m, 4H, N-CH2), 4,49 (m, 1H, H3a), 5,35 (d, 1H,H6)
3. Příprava BGSC
Surový karbamát (2) (0,94 g) se rozpustí v 30 ml směsi tetrahydrofuran: methanol 85/15. Potom se přidá lH-pyrazolkarboxamidin (0,495 g, 3,4 mmol) a diizopropylethylamin (0,436, 3,4 mmol) v 30 ml směsi tetrahydrofuran: methanol 85/15. Po 18 hodinách míchání při teplotě místnosti se pomalu přidá 250 ml diethyletheru a získaná sraženina se oddělí slitím. Surová sloučenina se třikrát suspenduje v diethyletheru a oddělí se slitím za získání surového GSC (0,570 g, 47 %).
'H NMR δ (perdeuterodimethylsulfoxid, 200 MHz); 0,5-2,5 (m, struktura cholesterylu a centrální skupiny CH2), 3,1 (m, 8H, N-CH2), 4,3 (m, 1H, H3a), 5,3 (d, H, H6); 7,2 (široký s, 8H, NH2+), 7,8 (s, 2H, NH).
Elementární analýza pro C37H67N7O2.2HC1 vypočteno: C, 62,15; H, 9,67; N, 13,71 nalezeno: C, 62,28; H, 9,81; N, 13,15.
Příklad 2
Příprava guanidinotrencholesterolu (5)
1. Příprava aminokarbamátu
Roztok cholesterylchloroformiátu (1,8 g, 4 mmol) v 100 ml dichlormethanu se pomalu přidá k roztoku tris(2-aminoethyl)aminu (TŘEN) (11,68 g, 80 mmol) v 400 ml dichlormethanu. Po dvou hodinách míchání při teplotě místnosti se inertní amin odstraní promytím vodou (3 x 100 ml) a po sušení nad síranem sodným se rozpouštědlo odpaří. Sloučenina (5) se izoluje ve formě trihydrochloridu následujícím způsobem: surový produkt se rozpustí v 10 ml methanolu a přikape se nasycený methanolický roztok (5 ml) kyseliny chlorovodíkové; získaná sraženina se oddělí slitím a získaná čistá sloučenina se třikrát suspenduje v methanolu a oddělí slitím. Po sušení za vakua se získá čistý trihydrochlorid (6) (1,71 g, 64 %).
’H NMR δ (deuterochloroform + ε perdeuteromethanol, 200 MHz); 0,5-2,4 (m, struktura cholesterylu), 2,5 (m, 2H, CH2NHCO), 2,8 (široký s, 4H, +HN-CH2), 3,06 (široký s, 4H, CH2NH3+), 3,20 (m, 2H, eHN-CH2), 4,4 (m, 1H, H3a), 5,3 (d, 1H, H6).
Elementární analýza pro C34H62N4O2-3HC1;
vypočteno: C, 61,10; H, 9,80; N, 8,38;
nalezeno: C, 61,25; H, 9,96; N, 8,22.
2. Příprava BGTC
Roztok cholesterylchloroformiátu (2,24 g, 5 mmol) v 100 ml dichlormethanu se pomalu přidá k roztoku tris(2-aminoethyl)aminu (TŘEN) (29,2 g, 200 mmol) v 250 ml dichlormethanu. Po 2 hodinách míchání při teplotě místnosti se inertní amin odstraní promytím vodou (3 x
-9CZ 295225 B6
100 ml) a potom se organický roztok suší nad síranem hořečnatým, rozpouštědlo se odpaří. Surový produkt (3,2 g) se rozpustí ve směsi tetrahydrofuran: methanol 50/50 (20 ml); potom se ke směsi přidá lH-pyrazol-l-karboximidin (1,465 g, lOmmol) a diizopropylamin (1,3 g, 10 mmol). Po 18 hodinách míchání při teplotě místnosti se přidá diethylether a získaná sraženina se oddělí slitím. Pro získání čistého vzorku se surová sloučenina suspenduje třikrát v diethyletheru a oddělí se slitím (2,15 g), 60 % po sušení ve vakuu.
’H NMR δ (perdeuterodimethylsulfoxid, 200 MHz); 0,5-2 (m, struktura cholesterylu), 2,2 (m, 2H, N-CH2), 2,6 (široký s, 4H, N-CH2), 3,0 (d, 2H, N-CH2), 3,2 (široký s, 4H), 4,3 (m, 1H, H3a), 5,3 (d, 1H, H6), 7,3 (široký s, 8H, NH2+), 7,8 (široký s, 2H, NH).
Elementární analýza pro C36H66NgO2.2HCl;
vypočteno: C, 60,39; H, 9,57; N, 16,65, nalezeno: C, 60,38; H, 9,67; N, 15,56.
Příklad 3
Příprava bisamidiniumbishydrochloridu BACD
1. Příprava dinitrilu
Roztok cholesterylchloroformiátu (8,97 g; 20 mmol) v dichlormethanu (100 ml) se přikape k roztoku iminopropionitrilu (2,46 g, 20 mmol) a triethylaminu (2,02 g, 20 mmol) v dichlormethanu (100 ml). Po 6 hodinách míchání při teplotě místnosti se reakční směs promyje vodou (2x 100 ml) a suší nad síranem sodným. Rozpouštědlo se odpaří a surový produkt (10,5 g) se rekrystalizuje z methanolu (8,59 g; 80 %).
'H NMR δ (deuterochloroform, 200 MHz); 0,5-2,5 (m, struktura cholesterylu), 2,7 (m, 4H; -CH2CN), 3,62 (m, 4H, -CH2-N-), 4,50 (m, 1H, H3a), 5,39 (d, 1H, H6).
2. Příprava dithioamidu
Slabý proud sirovodíku se nechá 2 hodiny probublávat roztokem dinitrilu připraveného tak, jak je popsáno výše (0,324 g, 6 mmol) a diethylaminu (0,884 g; 12 mmol) v dimethylformamidu (30 ml), teplota se udržuje na 50 °C. Modrý roztok se nalije na led a získaná sraženina se oddělí filtrací. Surový produkt se rozpustí v dichlormethanu a promyje vodou (2 x 50 ml). Po sušení nad síranem sodným se rozpouštědlo odpaří a získaný produkt se rekrystalizuie dvakrát z methanolu (1,86 g; 51,5%).
*H NMR δ (perdeuterodimethylsulfoxid, 200 MHz); 0,5-2,5 (m, struktura cholesterylu), 2,67 (t, 4H, N-CH2), 3,50 (t, 4H, S=C-CH2), 4,3 (m, 1H, H3a), 5,33 (d, 1H, H6).
3. Příprava dithioamidátu bisjodidu
Methyljodid (2 ml) se přidá k roztoku dithioamidu (0,603 g; 1 mmol) v acetonu (20 ml) a směs se nechá stát při teplotě místnosti 48 hodin. Získaná sraženina se odfiltruje (0,741 g; 83,5 %). Tento produkt se použije přímo bez dalšího čištění.
4. Příprava bisamidiniumbishydrochloridu BADC
Proud amoniaku se nechá při teplotě varu probublávat 2 hodiny přes suspenzi bisjodidu (0,741 g; 0,83 mmol), který se získá tak, jak je uvedeno výše, v izopropanolu (10 ml), a potom pokračuje
- 10CZ 295225 B6 zahřívání k varu další 4 hodiny. Izopropanol se odpaří a zbytek se převede do methanolu (10 ml). Roztok se přefiltruje přes bazickou jontoměničovou pryskyřici, potom se rozpouštědlem nechá procházet proud kyseliny chlorovodíkové a roztok se odpaří do sucha. Takto získaný bishydrochlorid se rozpustí v minimálním objemu ethanolu (asi 5 ml). Světlá nerozpustná látka se odfiltruje a k filtrátu se přidá velký přebytek diethyletheru. Získá se prášek, která se odfiltruje a suší (320 mg; 60 %). Rekrystalizace z izopropanolu umožní izolovat očekávaný produkt v analyticky čisté formě.
’H NMR δ (perdeuterodimethylsulfoxid, 200 MHz); 0,5-2,6 (m, struktura cholesterylu a -CH2amidinia), 3,57 (s, široký 4H, N-CH2), 4,3 (m, 1H, H3a), 5,3 (d, 1H, H6), 8,64 (s, široký; 2H; NH2), 9,07 (s; široký; 1H; NH), 9,18 (s; široký; 2H).
Analýza pro C34H56N4O2.2HC1:
vypočteno: C, 65,25; H, 9,32; N, 8,94;
nalezeno: C, 65,40; H, 9,87; N, 9,55.
B. Použití derivátů podle předkládaného vynálezu pro in vitro a in vivo přenos genů
Látky a způsoby
- Transfekční testy uvedené níže se provádějí s BGSC a BGTC, které se připraví podle postupu popsaného v příkladech 1 a 2.
- Příprava liposomů
Směs kationtového lipidu a DOPE (v molárním poměru 3/2) v chloroformu (CHC13) se odpaří za vakua a v dusíkové atmosféře se suspenduje v 20 mM HEPES pufrovacím roztoku při pH 7,4.
Koncentrace úplného lipidu je 1,2 mg/ml.
Směs se 5 minut míchá a potom se na ní působí ultrazvukem (sonikuje) 5 minut pomocí ultrazvukového přístroje (sonikátor) (Branson Ultrasonic 2210), nakonec se skladuje při +4 °C 24 hodin za hydratace.
Vzniklá disperze se znovu sonikuje (Sonikátor Branson 450) 5 až 10 min za vzniku liposomů.
Po odstředění se roztok filtruje na filtru s velikostí pórů 0,22 pm (Millex GS, Millepore) a skladuje při +4 °C.
Velikost liposomů obsahujících BGSC nebo BGTC se zkoumá pomocí laserového difrakčního přístroje (Autosizer 4700, Malvem Instruments). Tento test vykáže jeden pík odpovídající střednímu průměru 50 nm při mnoha multimodálních analýzách.
- Buněčné kultury
Zdroje (druhy a tkáně) většiny buněčných kmenů použitých pro transfekční pokusy jsou uvedeny v tabulce I.
Buňky buněčného kmene HeLa (P. Briand, ICGM Paříž) jsou odvozeny od lidské rakoviny pocházející z krčního epitelu. Buňky NIH 3T3 (C. Lagrou, Pasteurův institut, Lilie) jsou fibroblasty myší.
Buněčný kmen NB2A (C. Gouget, Paříž) je odvozen od neuroblastomu myší.
-11 CZ 295225 B6
Všechny buňky kromě buněk AtT-20 a PC 12 se kultivují v modifikovaném médiu Dulbecco (DMEM, GIBCE) doplněném 10% fetálním telecím sérem (FCS, GIBCO), penicilinem o 100 jednotkách/ml (GIBCO) a streptomycinem (GIBCO) při 100pg/ml.
Buňky AtT-20 se kultivují v DMEM/F12 (GIBCO) doplněném o 10% fetální sérum telat.
Buňky PC 12 se kultivují v DMEM doplněném 10% FCS a 5% sérem koní.
Všechny buňky se udržují v kultuře v plastových miskách (Falcon) ve vlhké atmosféře s 5 % oxidu uhličitého.
4- Plazmidy
Plazmidy pRSV-Luc (O. BENSAUDE, ENS, Paříž) a pRSV-nlsLacZ se namnoží v E. Coli a připraví se čištěním na CsCl gradientu pomocí standardní techniky. V plazmidu pRSV-nlsLacZ a plazmidu pRSV-Luc je gen E. coli LacZ a jeho sekvence jaderného lokalizačního signálu a gen luciferázy v tomto pořadí pod transkripční kontrolu LTR/RSV („Rous sarcoma virus“). Plazmid pXL2774 obsahuje gen kódující luciferázu pod kontrolou promotoru cytomegaloviru (CMV).
- Postup pro in vitro transfekci
Jeden den před transfekci se 2 x 105 buněk uloží do každé jamky (šestijamkové desky Falcon).
Každá jamka obsahuje jiný buněčný kmen.
V den transfekce jsou tedy buňky semikonfluentní.
Plazmid DNA (5 pg) a požadované množství bis-guanidiniumlipidu se vždy zředí 250 μΐ FCS bez DMEM a promíchá. Asi po 5 minutách se dva roztoky nechají inkubovat 15 minut při teplotě místnosti. Transfekční směs se potom přidá k buňkám (0,5 ml na jamku), které byly promyty médiem bez séra. Po 4 až 6 hodinách inkubace při 37 °C se bez odstranění transfekční směsi do každé jamky přidá 1 ml média se sérem. Po 24 hodinách po transfekci se médium nahradí 1 ml čerstvého kultivačního média. Buňky se izolují 2 dny po transfekci a změří se exprese luciferázy.
Kontrolní transfekce se prováděla za použití komerčně dostupných transfekčních činidel:
lipopolyamin Transfectam® (JP Behr, Strasbourg, Francie) se použil v alkoholickém roztoku v optimálním poměru Trasnfectam®/DNA jontový měnič 6-8.
- Lipofectin® (Life Technologies lne., Cergy Pontoise, Francie), který je liposomovým prostředkem obsahujícím jako neutrální lipid DOPE a jako kationtový lipid DOTMA. (N-[l-(2,3dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylamoniumchlorid).
- Komplex DNA/liposom se získá za standardních podmínek doporučených výrobcem.
- Buňky se transfekují pomocí precipitace fosforečnanem vápenatým. (Keown, W. A., Campbell, C. R., Kucherlapati, R. S., (1990) Methods in Enzymology; Academie Press: NewYork, 185,527-537).
- Měření luciferázy pro transfekci prováděnou in vitro
Aktivita luciferázy se měřila 48 hodin po transfekci za použití varianty postupu popsaného v De Wet a kol. (De Wet J. R., Wood K. V., DeLuca M., Helinski D. R., a Subramani S. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 725-737).
-12CZ 295225 B6
- odstraní se kultivační médium
- buňky se promyjí solným roztokem studeného fosfátového pufru
- potom se lyžují inkubací v 250 μΐ lyzovacího pufru (25mM trifosfát pH 7; 8,8 mM chlorid hořečnatý, 1 mM dithiotreitol, 15% glycerol a 1% triton X-100).
Po odstranění nerozpustných látek pomocí odstředění (15 mm, 4 °C) v mikroodstředivce se získá čirý lyzát,
- alikvotní díl (20 pl) buněčného extraktu se zředí v 100 μΐ lyzovacího pufru, ke kterému se přidá 9 μΐ 25mM ATP (Sigma) a 20 μΐ 25 mM luciferinu (Sigma).
- vzorky se umístí do luminometru (Lurmet LB9501 Berthold, Nashua, NH) a 10 sekund se měří emise světla.
Kalibrace křivky RLU/luciferáza se provádí za použití různých zředění čisté luciferázy ze světlušek (Sigma) a zjistí se, že lineární část křivky se pohybuje od 104 až 107 RLU (relativní světelná jednotka).
Koncentrace proteinu se měří pomocí BCA (bicinchoninová kyselina) testu za použití hovězího sérového albuminu jako kontroly.
Údaje pro aktivitu luciferázy jsou vyjádřeny v RLU/mg proteinu.
- Postup pro in vivo injektáž na úrovni dýchacích cest myší
Použitými myšmi jsou samice OF1 myší (hmotnost 30 g) získané od Iffa-Credo (Lyon, Francie). Použijí se kationtové liposomy BGTC/DOPE (molámí poměr 3:2). Transfekční směs se získá z 10 pg plazmidu DNA (v 10 pl vody), 20 pl kationtového liposomu v 20 mM média Hepes (pH 7,4), při koncentraci úplného lipidu 5 mg/ml. Agregáty DNA/lipid takto připravené mají poměr náboje řádu 6.
Po anestézii myši pomocí pentobarbitalu se transfekční směs (30 pl) injektuje do dýchacích cest pomocí intratracheálního nakapání pomocí kanyly vložené do dýchací dutiny. 48 hodin po nakapání se zvíře usmrtí pomocí předávkování pentobarbitalem a plíce a průdušnice se vyjmou pro analýzu.
- barvení pomocí X-gal
Pro měření exprese E. coli betagalaktosidázy v primární kultuře se buňky napouštěly 15 minut při 4 °C 4% roztokem paraformaldehydu a potom se inkubovaly s chromogenním betagalaktosidázovým X-gal substrátem (Sigma). Modrá barva jader transfekovaných buněk se měřila pomocí luminiscenční mikroskopie.
- Měření X-gal buněk na úrovni dýchacích cest transfekovaných in vivo
Pro detekci X-gal buněk na úrovni dýchacích cest se plíce a průdušnice podrobily 1 hodinu působení 4% paraformaldehydu, potom se ponořily na noc do PBS obsahujícího 30 % sacharózy, potom se uložily do mrazicího média a zmrazily kapalným dusíkem. Zmrzlé části 5 μ se potom barvily na aktivitu β-galaktosidázy pomocí inkubace s činidlem X-gal (Sigma) přes noc.
-13 CZ 295225 B6
- Měření luciferázy na úrovni dýchacích cest transfekovaných in vivo
Pro měření aktivity luciferázy na konci in vivo transfekce se části tkáně vystavily 30 μΐ lyzovacího pufru (25 mM trisfosfát pH 7,8, 1 mM dithiotreitol (DTT), 15 % glycerol a 1 % triton (X100), lyžovaly se asi 1 minutu v homogenizéru (Polylabo, Strasbourg, Francie) a skladovaly se v ledu. Po odstředění se 20 μΐ lyzátu použilo pro měření. Aktivita luciferázy je vyjádřena v RLU na mg proteinu.
- Imunohistochemický postup
Zmrazené části vzorků plic a průdušnice se 1 hodinu inkubovaly bud’ s myší monoklonální protilátkou anti-E. coli β-galaktosidázou při 5 pg/ml (Genzyme, Cambridge, MA), nebo s králičí polyklonální protilátkou při zředění 1:400 (Progema).
Escherichia coli β-galaktosidázový protein se měřil pomocí barvení imunoperoxidázou za použití biotinem značené sekundární protilátky anti-myší Ig (Boehringer) a konjugátu streptavidin-POD (Boehringer). Luciferázový protein se měřil pomocí barvení imunoperoxidázou za použití protilátky kozího séra proti králičímu séru (ICN Biomedicals, lne) a králičího systému peroxidáza-antiperoxidáza (PAP) (Dako Glostrup, Dánsko). Sekce se testovaly pomocí luminiscenční mikroskopie. Negativní kontrola se prováděla bez protilátky.
Příklad 4
Transfekce in vitro při různém poměru transfekčního činidla/DNA
Aby se optimalizovala účinnost transfekce dosažená s agregáty BGTC/DNA, studoval se vliv poměru BGTC/DNA na lychlost transfekce u 3 různých typů buněk savců, které jsou známy pro svou citlivost na běžné postupy transfekce. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 3.
Transfekční pokusy se tedy prováděly s myšími fíbroblasty 3T3, lidskými buňkami epitelu HeLa a myšími neuroblastomy NB2A. V průběhu těchto testů se určité pevné množství plazmidu pRSV-Luc uvedlo do kontaktu s různými množstvími BGTC v roztoku. Aby se určil rozsah poměru, který má být studován, vyšlo se z principu, že jeden pg DNA je ekvivalentní 3nm negativně nabitého fosfátu a že pouze dvě guanidiniové skupiny jsou pozitivně nabité při neutrálním pH pro vznik agregátu a pro transfekci. Aktivita luciferázy se měřila 48 hodin po transfekci. Exprese luciferázy je maximální pro agregáty obsahující 6 (buňky HeLa) až 8 (3T3 aNB2A buňky) guanidiniových skupin na jednu fosfátovou skupinu DNA, tedy agregáty mající velký kladný náboj.
Příklad 5
Transfekce in vitro s různými typy buněk
Přenos genů pomocí intermediace kationtových lipidů je zajímavou transfekční technikou nejen proto, že nevyžaduje meziprodukty, ale také proto, že umožňuje transfekovat velmi širokou škálu buněk různých tkání a organizmů. Pro studium míry účinnosti BGTC jako transfekčního činidla se testovalo několik buněčných kmenů různého původu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1 níže. Poměr náboje pro maximální účinnost byl určen mezi 6 až 8. Pro porovnání se buňky stejných kmenů transfekovaly za použití lipopolyaminu na jedné straně a fosforečnanu vápenatého na druhé straně. Výsledky ukazují, že BGTC je běžně účinný jako Transfectam a dvakrát účinnější než fosforečnan vápenatý.
-14CZ 295225 B6
Tabulka 1: Exprese luciferázy na různých kmenech buněk savců pomocí BGTC, fosforečnanu vápenatého a Transfectamu®.
| RLU/mg buněčných proteinů | |||||
| Druhy | Buněčné kmeny | Tkáně | BGTC | Fosforečnan vápenatý | Transfectam® |
| Člověk | A549 | Rakovina plic | 4xl05 | 7xl03 | 3,lxl05 |
| Opice | COS-7 | Ledviny transformované SV40 | 2,lxl07 | 3,7xl05 | 8,4xl06 |
| Pes | MDCK-1 | Ledviny | 3xl06 | 4,5xl05 | 2,2x105 |
| Krysa | RIN-m5F | Nádorové buňky rakoviny ostrůvku slinivky břišní | 2x107 | 2x105 | 3,3xl05 |
| ROS | Osteosarkom | 4,0x106 | 4,5xl05 | 2,3xl06 | |
| PC12 | Fenochromocytom | 3xl07 | l,7xl05 | 6x106 | |
| Myš | AtT-20 | Nádor podvěsku mozkového | 2x107 | 8xl05 | 3x107 |
Všechny transfekce se prováděly nejméně dvakrát (n>2).
Příklad 6
Transfekce in vitro za přítomnosti neutrálního lipidu
Sloučenina BGSC je méně rozpustná ve vodném médiu než sloučenina BGTC, použili jsme BGSC ve formě liposomů v přítomnosti neutrálního lipidu DOPE (dioleylfosfatidylethanolamin). 15 Prostředky se připraví v molámím poměru 3/2. Druhý prostředek obsahující BGTC se připraví s DOPE za stejných podmínek.
6.1 Určení poměru úplný lipid/DNA
Nejprve jsme určili poměr lipid/DNA během transfekčního experimentu na buňkách HeLa. Získaná křivka je uvedena na obrázku 4. Optimální transfekce se získá pro poměry BGSC liposomy/DNA mezi 1,5 až 5 s centrem na 2,5 až 3. Guanidiniová skupina se protonuje při neutrálním pEl, nejlepší agregáty BGSC-DOPE/DNA mají kladný náboj okolo 3 (obrázek 4).
Nejlepší poměry BGSC-DOPE/DNA jsou proto nižší než poměry získané s agregáty typu BGTC/DNA (mezi 6 a 8). Transfekce za přítomnosti kationtových liposomů se usnadňuje za přítomnosti DOPE a pomocí jeho fusogenních vlastností.
6.2 Transfekce různých buněčných kmenů pomocí kationtových liposomů
Transfekční pokusy se prováděly na různých buněčných kmenech za použití prostředků kationtových liposomů BGSC-DOPE a BGTC-DOPE v molámím poměru 3/2. Poměr náboje guanidinium lipid/fosfát DNA je asi 2,5 (~ 3) pro tyto dvougenové přenosové systémy. Transfekce Lipofectinem® slouží jako kontrola. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 níže.
Tyto výsledky ukazují, že deriváty cholesterolu opatřené guanidiniovými skupinami ve formě kationtových liposomů jsou minimálně stejně účinné pro transfekci jako Lipofectin. Tyto výsledky mohou být samozřejmě pro každý buněčný kmen optimalizovány.
- 15CZ 295225 B6
Tabulka 2: Exprese luciferázy v různých eukaryotických buněčných kmenech transfekovaných pomocí BGSC/DOPE liposomů, BGTC/DOPE liposomů a Lipofectinu®
| RLU/mg celulámích proteinů | |||
| Buněčné kmeny | BGSC liposomy | BGTC liposomy | Lipofectin® |
| HeLa | 4,6xl06 | 7,7xl06 | 3,3xl06 |
| A 549 | 6xl05 | 2xl05 | 4xl06 |
| COS-7 | ND | l,4xl07 | 9,5xl06 |
| MDCK-1 | lxlO6 | 7xl06 | l,9xl06 |
| ROS | ND | 9x106 | 6xl06 |
| NB2 Aa | l,5xl07 | l,4xl07 | ND |
| NIH 3T3a | 7xl06 | l,5xl06 | ND |
Všechny transfekce se prováděly nejméně třikrát (n>3).
a: znamená měření při RLU aktivity luciferázy pro 100 pg/500 pg úplného lyzátu (n>4).
Příklad 7
Testování účinku přítomnosti sérových proteinů na účinnost přenosu genu in vitro
Většina transfekčních prostředků založených na kationtových lipidech má sníženou účinnost v přítomnosti séra. Cílem tohoto příkladu je testovat citlivost sloučenin podle předkládaného vynálezu na působení séra.
7.1 Prostředky kationtových lipidů
Lipidy popsané v předkládaném vynálezu se rozpouští v ethanolu.
i) Roztoky „liposomů“ se získají za přítomnosti DOPE následujícím způsobem: DOPE (AVANTI) v roztoku v chloroformu se přidá k roztoku lipidu v ethanolu vmolámím poměru kationtový lipid/DOPE 3/2. Po odpaření do sucha se směs převede do vody a zahřívá se 30 minut na 50 °C;
ii) roztoky „micel“ se získají podle postupu popsaného pro přípravu „liposomů“, ale roztok DOPE se nahradí chloroformem.
Roztoky se všechny upraví na lOmM kationtového lipidu.
7.2 Nukleová kyselina
Použitou nukleovou kyselinou je plazmid pXL2774.
7.3 Směsi cytofektantů (příprava těsně před použitím)
DNA se zředí na 20 pg/ml v 150 mM chloridu sodném a různé prostředky kationtového lipidu se zředí ve vodě na 40, 80, 120 a 160 μΜ. Stejné objemy roztoků DNA a lipidu se smísí za získání poměrů v nmol/pg DNA 2, 4, 6 a 8 v tomto pořadí, koncentrace solanky je 75 mM.
-16CZ 295225 B6
7.4 Transfekce
Buňky se kultivují za vhodných podmínek v 24 jamkové mikrotitrační desce (2 cm2/jamka) a při exponenciálním růstu se transfekují a z 50 až 70 % se slijí. Buňky se dvakrát promyjí 500 μΐ média bez sérových proteinů a kultivují se znovu buď v médiu bez séra (transfekce za nepřítomnosti séra), nebo v úplném médiu (transfekce za přítomnosti séra) a k buňkám (3 jamky/stav lipid-DNA) se přidá směs cytofektantu (0,5 pg DNA/jamka).
Když se buňky transfekují „v nepřítomnosti séra“, kultivační médium se doplní vhodným množstvím séra 2 hodiny po transfekci.
Účinnost transfekce se hodnotí pomocí měření exprese luciferázy podle doporučení uvedeného pro použití sady Progema (luciferázový testovací systém). Toxicita směsi cytofektantu se určí měřením koncentrací proteinu v buněčném lyzátu.
7.5 Výsledky (obrázek 5)
Výsledky získané se čtyřmi buněčnými typy (NIH3T3 - 293 - HepG2 - HeLa) ukazují, že za testovaných podmínek jsou prostředky ve formě „liposomů“ účinnější než prostředky ve formě „micel“. Dále naproti tomu, co bylo pozorováno u většiny cytofektantových prostředků obsahujících kationtové lipidy nemůže být za podmínek naší transfekce demonstrován žádný výrazný inhibiční účinek na BGTC ve formě „liposomů“ nebo „micel“ spojený s přítomností séra.
Příklad 8
In vivo exprese transgenu v dýchacích cestách myši s BGTC/DOPE liposomy
Pro tento účel jsme využily kationtových liposomů BGTC/DOPE. Příprava agregátů DNA/liposomy a podávání se provádělo tak, jak je popsáno v látkách a způsobech.
X-gal buňky se v epitelu dýchacích cest u léčených myší detekovaly 48 hodin po transfekci LacZ plazmidu do buněk pomocí BGTC/DOPE liposomů. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 6.
Většina transfekovaných buněk se nacházela v průdušnici a pouze malé množství X-gal buněk bylo nalezeno v sekundárních dýchacích cestách. Tento typ rozdělení byl již zmiňován u jiných buněčných transfekci.
Imunohistochemie byla dále prováděna za účelem identifikace produktu uvedeného genu. Na úrovni povrchu epitelu (obrázek 6A) byly převážně transfekované maturované buňky. Tyto údaje ukazují, že kationtové liposomy jsou schopny indukovat transfekci genů u neproliferačních a úplně diferencovaných buněk epitelu dýchacích cest. Exprese transgenu se také zjišťovala ve žláze pod sliznicí (obrázek 6B). Detekce pomocí imunologického značení transfekovaných buněk za použití monoklonální protilátky namířené proti E. coli β-galaktosidáze potvrzuje tuto expresi ve žláze pod sliznicí a na povrchu epitelu (obrázek 6D). Transgenní exprese se také demonstruje ve žláze pod sliznicí pomocí imunoperoxidázového značení protilátkou řízenou proti luciferázovému proteinu po transfekci pRSV-Luc pomocí BGTC/DOP (obrázek 6D).
Negativní kontrola se prováděla bez protilátky (obrázek 6E).
Tyto výsledky jsou velmi zajímavé pro genovou léčbu namířenou proti cystické fíbróze. Samozřejmě je pro léčbu tohoto onemocnění nutné zasáhnout žlázu pod sliznicí, která je hlavním místem exprese CTFR v lidských průduškách.
-17CZ 295225 B6
Příklad 9
Kvantitativní měření účinnosti transfekce BGTC/Dope in vivo
Pro tento účel se plíce a průdušnice myši léčené BGTC/DOPE liposomem a plazmidem pRSVLuc za podmínek popsaných v příkladu 8 vyjmou 48 hodin po transfekci a aktivita luciferázy se měří pomocí postupu popsaného v látkách a způsobech.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3 níže.
Tabulka 3
| Vektory | Aktivita luciferázy (RLU/mg proteinu) |
| BGTC/DOPE liposomy: | 2,8xl05 |
| pRSV-Luc | (průměr: 3xl04 - 8xl05 |
| pRSV-Lac Z | 0 |
| Prostá DNA pRSV-Luc | 0 |
Aktivita luciferázy se detekuje soustavně v homogenátech průdušnic, ale ne v homogenátech plic. Toto pozorování je v souladu s předchozími výsledky získanými v průběhu testování rozdělení buněk pozitivních na X-gal. Je třeba poznamenat, že exprese luciferázy je přímo spojená s expresí plazmidů, protože se v kontrolním vzorku obsahujícím LacZ plazmid nedetekuje žádná aktivita. Kontrolou byla také transfekce plazmidů prováděná bez vektoru. Při tomto kontrolním testu nebyla pozorována žádná exprese luciferázy.
Tyto údaje demonstrují účinnost BGTC/DOPE liposomů pro in vivo genovou transfekci v dýchacích cestách.
Příklad 10
Genový přenos in vivo pomocí nitrožilní nebo intraperitoneální injekce
Prostředky kationtových lipidů a DNA jsou popsány v příkladu 7.
10.1 Vliv dávky kationtových lipidů (obrázky 7 až 8)
Pět týdnů staré myši BalbC se injektují pomocí nitrožilní (ocasní žíla) nebo intraperitoneální injekce 200 μΐ transfekční směsi v roztoku 37,5 mM chloridu sodného, 5% glukózy a exprese luciferázy se určí 24 hodin po transfekci v plicích po nitrožilní injekci a v játrech a ve slezině po intraperitoneální injekci. Orgány se vyjmou a umístí do studeného lyzovacího pufru (Promega El53A) doplněného inhibitory proteázy (Boehringer 1697498) a homogenizují se vhomogenizéru Heidolph DIAX600. Aktivita luciferázy se určí v 14 000 g supematantu extraktu tkáně.
Nitrožilní injekce
Každá myš dostala 50 pg DNA komplexované s různými koncentracemi BGTC ve formě „liposomů“. Pozorovaný optimální poměr vnanomolech kationtového lipidu/pg DNA je 9 (obrázek 7); pro dávky 900 nanomolů injektovaného BGTC nebyla pozorována žádná toxicita.
- 18CZ 295225 B6
Intraperitoneální injekce
BGTC ve formě „liposomů“ se injektoval se 100 pg DNA na myš. Maximální exprese jak pro játra (obrázek 8B), tak pro slezinu (obrázek 8A) byla získána pro 1,5 nanomolu BGTC/pg DNA.
10.2 Kinetika exprese po nitrožilní injekci
Určili jsme biologické rozložení exprese luciferázy v 7 orgánech jako funkci času po injekci 200 μΐ směsi BGTC „liposomů‘7DNA v 37,5 mM chloridu sodného, 5 % glukózy (50 pg DNA a 9 nanomolů BGTC/pg DNA) do ocasní žíly 5 týdnů starých BalbC myší. Výsledky jsou vyjádřeny v pikogramech luciferázy extrahované na orgán vzhledem ke kalibrační křivce s luciferázou značenou v krystalizované formě. Mezi detekce se pohybuje mezi 0,5 až 1 pikogramem luciferázy.
Ukázali jsme, že za testovaných podmínek se maximální exprese dosáhne 23 hodin po transfekci pro 6 ze 7 testovaných orgánů, kterými jsou bránice, žaludek, srdce, plíce, játra a slezina. Exprese na úrovni jater byla více prematurovaná. Maximální exprese se získá na úrovni plic v hladině 0,5 nanogramu 23 hodin po transfekci.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (21)
1. Amidiniový derivát obecného vzorce I
O
II
R2 Q (I), Xo--R1
R3 ve kterém
R1 znamená cholesterylovou skupinu,
R2 a R3 nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce II í () n —N~ř R5 2 (II>, přičemž alespoň jeden z R2 a R3 znamená skupinu vzorce II a v obecném vzorci Π m znamená celé číslo 0 až 4, n znamená celé číslo 0 až 4, přičemž v případě, že m je větší nebo rovno 2, potom n má stejné nebo rozdílné významy v jednotlivých jednotkách -[(CH2)n-N(R4)]- obecného vzorce II pro R2 a R3,
-19CZ 295225 B6
R4 a R5 nezávisle jeden na druhém znamenají atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce III přičemž alespoň jeden z R4 a R5 znamená skupinu obecného vzorce III a v obecném vzorci III p znamená celé číslo 0 až 4, q znamená celé číslo 0 až 4 a r znamená 0 nebo 1, přičemž v případě, že r znamená 1, potom buď X znamená NH a x znamená 1, nebo X znamená N a x znamená 2, přičemž p, q a r mají stejné nebo rozdílné významy v jednotlivých skupinách obecného vzorce III pro obecné substituenty R4 a R5.
2. Amidiniový derivát podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém R2 a R3 nezávisle jeden na druhém znamenají skupinu obecného vzorce IV
- [<OT2 )n < ch2>p-A, (i V), ve kterém n, m a p mají významy uvedené v nároku 1 a R4 znamená atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce V (V), ve kterém q a r mají významy uvedené v nároku 1, přičemž m, n, p, q a r mají stejné nebo rozdílné významy vjednotlivých skupinách obecných vzorců IV a V pro obecné substituenty R2 a R3.
3. Amidiniový derivát podle nároku 1 nebo 2, kterým je některá ze sloučenin následujících obecných vzorců:
(H2N)2 +C-NH-(CH2)2-NH-COO-R1(VI), [(H2N)2 +C-NH-(CH2)3] [(H2N)2C+-NH-(CH2)4]-N-COO-R' (VII), [(H2N)2 +C-NH-(CH2)2]2-N-(CH2-NH-COO-R1 (VIII), [(H,N),+C-(CH,),1,^-000^1(IX), [[(H2N)2 +C-(CH2)2]2-N-(CH2)2]2N-COO-R1(X), ve kterých R1 má význam uvedený v nároku 1.
-20CZ 295225 B6
4. Amidiniový derivát podle nároku 3, kterým je některá ze sloučenin následujících obecných vzorců:
[(H2N)2 +C-NH-(CH2)3][(H2N)2C+-NH-(CH2)4]-N-COO-R' [(H2N)2 +C-(CH2)2]2-N-COO-R1 [[(H2N)2 +C-(CH2)2]2-N-(CH2)2]2N-COO-R1 (VII), (IX), (X), ve kterých R1 má význam uvedený v nároku 1.
5. Amidiniový derivát podle některého z nároků 1 až 4, kterým je 33-[N-guanidinopropyl-Nguanidinobutyljkarbamoylcholesterol.
6. Amidiniový derivát podle některého z nároků 1 až 5, kterým je 33-[N-[N',N'-guanidinoethylaminoethyl)karbamoyl]cholesterol.
7. Farmaceutický prostředek, vyznačený tím, že obsahuje alespoň jeden amidiniový derivát podle některého z nároků 1 až 6 a nukleovou kyselinu.
8. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, vyznačený tím, že jako amidiniový derivát obsahuje 3 3-[N-guanidinopropyl-N-guanidinobutyl]karbamoylcholesterol.
9. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, vyznačený tím, že jako amidiniový derivát obsahuje 3p-[N-[N',N'-guanidinoethylaminoethyl)karbamoyl]cholesterol.
10. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, vyznačený tím, že jako nukleovou kyselinu obsahuje kyselinu deoxyribonukleovou.
11. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, vyznačený tím, že jako nukleovou kyselinu obsahuje kyselinu ribonukleovou.
12. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 7 až 11, vyznačený tím, že nukleová kyselina obsahuje terapeutický gen.
13. Farmaceutický prostředek, vyznačený tím, že obsahuje amidiniový derivát podle nároku 1, neutrální lipid a nukleovou kyselinu.
14. Farmaceutický prostředek podle nároku 13, vyznačený tím, že jako amidiniový derivát obsahuje amidiniový derivát zvolený z množiny zahrnující
3 β-fN-guanidinopropyl-N-guanidinobutylJkarbamoylcholesterol a
33-[N-[N',N'-guanidinoethylaminoethyl)karbamoyl]cholesterol.
15. Farmaceutický prostředek podle nároku 13, vyznačený tím, že jako neutrální lipid obsahuje dioleoylfosfatidylethanolamin.
16. Farmaceutický prostředek podle nároku 13, vyznačený tím, že jako nukleovou kyselinu obsahuje kyselinu deoxyribonukleovou.
17. Farmaceutický prostředek podle nároku 13, vyznačený tím, že jako nukleovou kyselinu obsahuje kyselinu ribonukleovou.
-21 CZ 295225 B6
18. Farmaceutický prostředek podle nároku 16 nebo 17, vyznačený tím, že nukleová kyselina obsahuje terapeutický gen.
5
19. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 7 až 18, vyznačený tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič vhodný pro injekční podání.
20. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 7 až 18, vyznačený tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič vhodný pro aplikaci na pokožku nebo na sliznici.
o
21. Použití amidiniového derivátu podle některého z nároků 1 až 6 pro přípravu farmaceutických prostředků určených pro transfekci buněk in vitro, ex vivo nebo/a in vivo.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9602604A FR2745569B1 (fr) | 1996-03-01 | 1996-03-01 | Composes apparentes a la famille des amidiniums, compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications |
| FR9609557A FR2751972B1 (fr) | 1996-07-30 | 1996-07-30 | Composes apparentes a la famille des amidiniums, compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ277298A3 CZ277298A3 (cs) | 1998-12-16 |
| CZ295225B6 true CZ295225B6 (cs) | 2005-06-15 |
Family
ID=26232562
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19982772A CZ295225B6 (cs) | 1996-03-01 | 1997-02-28 | Amidiniový derivát a farmaceutický prostředek tento derivát obsahující |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6143729A (cs) |
| EP (1) | EP0888379B1 (cs) |
| JP (1) | JP4271260B2 (cs) |
| KR (1) | KR19990087372A (cs) |
| AT (1) | ATE198599T1 (cs) |
| AU (1) | AU723998B2 (cs) |
| BR (1) | BRPI9707889B8 (cs) |
| CZ (1) | CZ295225B6 (cs) |
| DE (1) | DE69703878T2 (cs) |
| DK (1) | DK0888379T3 (cs) |
| ES (1) | ES2154453T3 (cs) |
| GR (1) | GR3035205T3 (cs) |
| HU (1) | HU228072B1 (cs) |
| IL (1) | IL125926A (cs) |
| NO (1) | NO311806B1 (cs) |
| PT (1) | PT888379E (cs) |
| SK (1) | SK283575B6 (cs) |
| WO (1) | WO1997031935A1 (cs) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6884430B1 (en) * | 1997-02-10 | 2005-04-26 | Aventis Pharma S.A. | Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles |
| FR2763943B1 (fr) * | 1997-05-28 | 1999-07-09 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composes, leur preparation et leur utilisation pour le transfert d'acides nucleiques dans les cellules |
| FR2777017B1 (fr) * | 1998-04-02 | 2002-08-23 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications |
| EP1068188A1 (fr) * | 1998-04-02 | 2001-01-17 | Aventis Pharma S.A. | Nouveaux agents de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant et leurs applications |
| DE10109898A1 (de) | 2001-02-21 | 2002-09-05 | Novosom Gmbh | Lipide mit veränderlicher Ladung |
| FR2824557B1 (fr) * | 2001-05-14 | 2003-08-29 | Aventis Pharma Sa | Derives lipidiques de polythiouree |
| CA2446951C (fr) * | 2001-05-14 | 2012-07-10 | Gencell S.A. | Derives lipidiques de polythiouree |
| FR2829136B1 (fr) * | 2001-08-29 | 2006-11-17 | Aventis Pharma Sa | Derives lipidiques d'aminoglycosides |
| WO2003060411A1 (en) | 2002-01-17 | 2003-07-24 | York Refrigeration Aps | Submerged evaporator with integrated heat exchanger |
| JP4980893B2 (ja) * | 2005-04-28 | 2012-07-18 | 日本曹達株式会社 | 新規なグアニジン化合物、製造方法及びそれらを含有する殺菌性組成物 |
| CA2665403C (en) * | 2006-10-04 | 2015-06-23 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Compositions comprising a sirna and lipidic 4,5-disubstituted 2-deoxystreptamine ring aminoglycoside derivatives and uses thereof |
| TW201019969A (en) * | 2008-11-17 | 2010-06-01 | Enzon Pharmaceuticals Inc | Branched cationic lipids for nucleic acids delivery system |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5283185A (en) * | 1991-08-28 | 1994-02-01 | University Of Tennessee Research Corporation | Method for delivering nucleic acids into cells |
| NZ276975A (en) * | 1993-11-24 | 1998-04-27 | Megabios Corp | Guanidine based amphiphiles and their use in liposomes for delivering genetic material intracellularly |
| US5777153A (en) * | 1994-07-08 | 1998-07-07 | Gilead Sciences, Inc. | Cationic lipids |
| US6071890A (en) * | 1994-12-09 | 2000-06-06 | Genzyme Corporation | Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy |
| US5811406A (en) * | 1995-06-07 | 1998-09-22 | Regents Of The University Of California | Dry powder formulations of polynucleotide complexes |
-
1997
- 1997-02-28 AT AT97907154T patent/ATE198599T1/de active
- 1997-02-28 KR KR1019980706784A patent/KR19990087372A/ko active Granted
- 1997-02-28 JP JP53067797A patent/JP4271260B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 WO PCT/FR1997/000364 patent/WO1997031935A1/fr not_active Ceased
- 1997-02-28 CZ CZ19982772A patent/CZ295225B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 AU AU19304/97A patent/AU723998B2/en not_active Expired
- 1997-02-28 SK SK1182-98A patent/SK283575B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 US US09/125,825 patent/US6143729A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 DK DK97907154T patent/DK0888379T3/da active
- 1997-02-28 HU HU9902465A patent/HU228072B1/hu unknown
- 1997-02-28 PT PT97907154T patent/PT888379E/pt unknown
- 1997-02-28 EP EP97907154A patent/EP0888379B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 BR BRPI9707889A patent/BRPI9707889B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 DE DE69703878T patent/DE69703878T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 ES ES97907154T patent/ES2154453T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 IL IL12592697A patent/IL125926A/en not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-08-12 NO NO19983691A patent/NO311806B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-11-06 US US09/706,619 patent/US6316422B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-01-11 GR GR20000402653T patent/GR3035205T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0888379B1 (fr) | 2001-01-10 |
| HUP9902465A3 (en) | 2009-10-28 |
| ES2154453T3 (es) | 2001-04-01 |
| DK0888379T3 (da) | 2001-01-29 |
| US6143729A (en) | 2000-11-07 |
| EP0888379A1 (fr) | 1999-01-07 |
| WO1997031935A1 (fr) | 1997-09-04 |
| HU228072B1 (en) | 2012-09-28 |
| IL125926A0 (en) | 1999-04-11 |
| AU723998B2 (en) | 2000-09-07 |
| JP4271260B2 (ja) | 2009-06-03 |
| AU1930497A (en) | 1997-09-16 |
| KR100452062B1 (cs) | 2005-04-08 |
| NO983691D0 (no) | 1998-08-12 |
| NO983691L (no) | 1998-08-12 |
| DE69703878D1 (de) | 2001-02-15 |
| SK283575B6 (sk) | 2003-09-11 |
| ATE198599T1 (de) | 2001-01-15 |
| PT888379E (pt) | 2001-05-31 |
| IL125926A (en) | 2004-09-27 |
| KR19990087372A (ko) | 1999-12-27 |
| BR9707889A (pt) | 2000-01-04 |
| JP2000506136A (ja) | 2000-05-23 |
| GR3035205T3 (en) | 2001-04-30 |
| DE69703878T2 (de) | 2001-04-26 |
| NO311806B1 (no) | 2002-01-28 |
| HUP9902465A1 (hu) | 1999-12-28 |
| SK118298A3 (en) | 1999-02-11 |
| US6316422B1 (en) | 2001-11-13 |
| BRPI9707889B8 (pt) | 2016-11-08 |
| BR9707889B1 (pt) | 2010-03-23 |
| CZ277298A3 (cs) | 1998-12-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0845981B1 (en) | Compositions comprising cationic amphiphiles and co-lipids for intracellular delivery of therapeutic molecules | |
| US5948767A (en) | Cationic amphiphile/DNA complexes | |
| US5650096A (en) | Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules | |
| US5840710A (en) | Cationic amphiphiles containing ester or ether-linked lipophilic groups for intracellular delivery of therapeutic molecules | |
| US8193246B2 (en) | Lipids and lipid assemblies comprising transfection enhancer elements | |
| JP4467084B2 (ja) | 核酸を細胞に導入するための化合物、その製法及びその使用 | |
| JPH10509958A (ja) | トランスフェクション剤としてのリポポリアミン及びその医薬への使用 | |
| US5939401A (en) | Cationic amphiphile compositions for intracellular delivery of therapeutic molecules | |
| WO1998043994A1 (en) | Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules | |
| CZ295225B6 (cs) | Amidiniový derivát a farmaceutický prostředek tento derivát obsahující | |
| US5942634A (en) | Cationic amphiphiles for cell transfections | |
| US5912239A (en) | Imidazole-containing cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules | |
| US6331524B1 (en) | Organ-specific targeting of cationic amphiphile / DNA complexes for gene therapy | |
| CA2268945A1 (en) | Cationic amphiphile compositions for intracellular delivery of therapeutic molecules | |
| JP4629333B2 (ja) | アミノグリコシドの脂質誘導体 | |
| US20030109699A1 (en) | Amphiphilic quinolylpolyamines as transfer agents for biologically active macromolecules | |
| CA2248186C (fr) | Composes apparentes a la famille des amidiniums, compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications | |
| MXPA98006892A (en) | Compounds related to the amidinium family, pharmaceutical compositions containing them and their applications | |
| US20020013282A1 (en) | Cationic amphipile compositions for interacelluar delivery of therapeutic molecules |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20170228 |