BR9707889B1

BR9707889B1 - composto e seus sais, composiÇço farmacÊutica, utilizaÇço do composto.

Info

Publication number: BR9707889B1
Application number: BRPI9707889-1A
Authority: BR
Inventors: Jean-Marie Lehn; Pierre Lehn; Jean-Pierre Vigneron
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-28
Publication date: 2010-03-23
Also published as: JP4271260B2; NO311806B1; GR3035205T3; EP0888379A1; IL125926A0; US6316422B1; SK118298A3; NO983691L; HUP9902465A1; KR100452062B1; DE69703878D1; HU228072B1; ES2154453T3; EP0888379B1; CZ277298A3; SK283575B6; NO983691D0; US6143729A; PT888379E; AU723998B2

Description

COMPOSTO E SEUS SAIS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA,UTILIZAÇÃO DO COMPOSTO.

A presente invenção refere-se a novos compostos aparentados com a famíliados amidínios, e destes em particular, aos guanidínios, a composições farmacêuticasque os contêm e a suas aplicações.

Mais especificamente, a presente invenção se refere a compostos de fórmulageral Iea seus sais

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na qual:

- Rl representa um derivado do colesterol.

- R2 e R3 representam, independentemente um do outro, um átomo dehidrogênio ou um grupamento de fórmula geral II, com ao menos um dentre elesdiferente de um átomo de hidrogênio,

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na qual:

-nem representam, independentemente um do outro e de maneira distintaentre os grupamentos R2 e R3, um inteiro compreendido entre O e 4,- R4 e R5 representam, independentemente um do outro, um átomo dehidrogênio ou um grupamento de fórmula III, sendo que pelo menos um deles, R4 ouR5, é diferente de hidrogênio:

<formula>formula see original document page 3</formula>

na qual

ρ e q representam, independentemente um do outro, um inteiro compreendidoentre 0 e 4, e r é igual a 0 ou a 1, com para r igual a 1,

X representando um grupamento NH e sendo χ então igual a 1, ouX representando um átomo de nitrogênio e sendo x, então, igual a 2, ecom p, q e r podendo variar, independentemente, entre os grupamentos R4 eR5.

A título de subfamília preferida, ciíar-se-ão mais particularmente, no quadroda presente invenção, os compostos de fórmula geral I, na qual R2 ou R3representam, independentemente um do outro, um átomo de hidrogênio ou umgrupamento de fórmula IV

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na qual

n, m e ρ são definidos como precedentemente, e R4 representa um átomo dehidrogênio ou um grupamento de fórmula V<formula>formula see original document page 4</formula>

com q e r definidos como precedentemente,

e com m, n, p, q e r podendo variar, de maneira independente, entre os diferentesgrupamentos R2 e R3.

Estes novos produtos de fórmula geral (I) podem apresentar-se na forma de sais nãotóxicos e farmaceuticamente aceitáveis. Estes sais não tóxicos compreendem os sais comos ácidos minerais (ácidos clorídrico, sulfúrico, bromídrico, fosfórico, nítrico), ou com osácidos orgânicos (ácidos acético, propiônico, succínico, maléico, hidroximaléico, benzóico,fumárico, metano-sulfônico ou oxálico), ou com as bases minerais (soda, potassa, litina,cal), ou orgânicos (aminas terciárias, como a trietilamina, a piperidina, a benzilamina).

A título representativo dos compostos segundo a invenção, pode-se maisparticularmente citar os compostos de subfórmulas gerais seguintes:

(H2N)/ C-NH-(CH2)2-NH-COO-RI VI

[(H2N)2" C-NH-(CH2)3] [(H2N)2" C -NH-(CH2)4-J-N-COO-Rl VII[(H2N)2+ C-NH-(CH2)2], - N-(CH2)2 - NH - COO - R1 VIII

[(H2N)2" C-(CH2)2], - N- COO - Rl IX

[[(H2N)2' C-(CH2)2], - N-(CH2)2], N- COO - Rl X

nas quais Rl possui a definição precedente.

A título representativo dos guanidínios e amidínios reivindicados, pode-se maisparticularmente citar os compostos das subfórmulas precedentes VII, VIII e IX, com Rlrepresentando, nelas, um grupamento colesterila. Os três compostos serão respectivamenteidentificados abaixo sob a designação BGSC (Bis Guanidino Espermidina Colesterol), eBGTC (Bis Guanidino Tren Colesterol), e BADC (bis cloridrato de Bis AmidínioDietilenotriamina Colesterol).

Os compostos reivindicados são, de modo todo particular, interessantes no planoterapêutico, devido a seus caracteres não tóxicos e a suas propriedades anfifilas. Levando-se em conta estas qualidades, eles podem notadamente ser utilizados para a complexaçãode ácidos nucléicos, na perspectiva de uma transfecção celular destes últimos. Estescompostos podem, portanto, ser empregados com vantagem em terapia gênica.

Os compostos VII (BGSC) e VIII (BGTC) são, de modo todo particular, vantajosospara a transferência de gene in vivo. Estes dois compostos se complexam com o DNA e oprotegem contra a degradação devida às variações de pH, quando do transporte para acélula a tratar.

A invenção concerne, pois, a uma composição farmacêutica que compreende aomenos um composto segundo a invenção. Num modo preferido de realização da invenção,o composto é o Bis Guanidino Espermidina Colesterol (BGSC) e, num outro modopreferido, o composto é o Bis Guanidino Tren Colesterol (BGTC).

A terapia gênica tem, como principal objetivo, a correção das doenças genéticasassociadas a um defeito de expressão e/ou a uma expressão anormal, isto é, deficiente ouexcessiva, de um ou de vários ácidos nucléicos. Tenta-se substituir este tipo de anomaliagenética pelo bias da expressão celular in vivo ou in vitro de genes clonados.

Hoje em dia, vários métodos são propostos para a entrega intracelular deste tipo deinformação genética. Uma das tecnologias atualmente empregadas repousa,especificamente, no emprego de vetores químicos ou bioquímicos. Estes vetores sintéticostêm duas funções principais, a de compactar o DNA a transfectar, e a de promover suafixação celular, assim como sua passagem através da membrana plásmica e, conforme ocaso, através das duas membranas nucleares. Lipídios catiônicos carregados positivamente,como o cloreto de N-[l-(2,3-dioleilóxi)propil]-N,N,N-trimetil-amônio (DOTMA), foramassim propostos. Eles interagem, vantajosamente, na forma de lipossomos ou de pequenasvesículas, espontaneamente com DNA, que, por sua vez, é carregado negativamente, paraformar complexos lipídios-DNA, capazes de fusionar com as membranas celulares, epermitem desse modo a entrega intracelular do DNA. Todavia, no caso particular doDOTMA, sua boa eficácia no nível da transfecção continua, infelizmente, associada a umdefeito de biodegradabilidade e a um caráter tóxico com relação às células.

A partir do DOTMA, outros lipídios catiônicos foram desenvolvidos sobre estemodelo de estrutura: grupo lipófilo associado a um grupamento amino via um braçochamado "spacer". Entre estes últimos, pode-se citar, de modo mais particular, os quecompreendem, a título de grupamento lipófilo, dois ácidos graxos ou um derivado docolesterol, e que comportam, ademais, conforme o caso, a título de grupamento amino, umgrupamento de amônio quaternário. Os DOTAP, DOBT, ou o ChOTB, podemnotadamente ser citados como representativos desta categoria de lipídios catiônicos.

Pondo-se de lado sua estrutura química e seu caráter biodegradável, os compostosreivindicados atendem especificamente às exigências requeridas para um vetor detransfecção de ácidos nucléicos.

A presente invenção visa pois igualmente qualquer aplicação destes novoscompostos na transfecção in vitro, ex vivo e/ou in vivo de células e, notadamente, para avetorização de ácidos nucléicos. Refere-se, em particular, a qualquer composiçãofarmacêutica que compreenda, além de ao menos um composto segundo a invenção, umácido nucléico.

Nas composições da presente invenção, o ácido nucléico associado a ao menos umcomposto reivindicado, pode ser tanto um ácido desoxirribonucléico, como um ácidoribonucléico. Pode tratar-se de seqüências oligonucleotídicas ou polinucleotídicas deorigem natural ou artificial, e notadamente de DNA genômico, de DNAc, de RNAt, deRNAr, de seqüências híbridas ou de seqüências sintéticas ou semi-sintéticas. Estes ácidosnucléicos podem ser de origem humana, animal, vegetal, bacteriana, viral, etc. Elescomportam, de preferência, um gene terapêutico.

Outro objeto da invenção se refere então a uma composição farmacêutica contendoademais um ácido nucléico. Preferencialmente, este ácido nucléico é, seja um ácidodesoxirribonucléico, seja um ácido ribonucléico. Num modo preferido de realização dainvenção, o ácido nucléico comporta um gene terapêutico.

No sentido da invenção, entende-se por gene terapêutico notadamente qualquergene que codifique para um produto protéico tendo efeito terapêutico. O produto protéicoassim codificado pode ser uma proteína, um peptídio, etc. Este produto protéico pode serhomólogo com relação à célula alvo (isto é, um produto que é normalmente expresso nacélula alvo, quando esta não apresenta nenhuma patologia). Neste caso, a expressão de umaproteína permite, por exemplo, paliar uma expressão insuficiente na célula, ou a expressãode uma proteína inativa ou fracamente ativa, em razão de uma modificação, ou ainda desuperexpressar a referida proteína. O gene terapêutico pode também codificar para ummutante de uma proteína celular tendo uma estabilidade aumentada, uma atividademodificada, etc. O produto protéico pode, igualmente, ser heterólogo com relação à célulaalvo. Neste caso, uma proteína expressa pode, por exemplo, completar ou conter umaatividade deficiente à célula, permitindo-lhe lutar contra uma patologia, ou estimular umaresposta imunitária.

Entre os produtos terapêuticos no sentido da presente invenção, pode-se citar maisparticularmente as enzimas, os derivados sangüíneos, os hormônios, as linfoquinas:interleucinas, interferons, TNF, etc. (FR 92 03120), os fatores de crescimento, osneurotransmissores ou seus precursores ou enzimas de síntese, os fatores tróficos: BDNF,CNTF, NGF5 IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofma, etc., a distrofina ouuma minidistrofina (FR 91 11947), a proteína CFTR associada com a mucoviscidose, osgenes supressores de tumores: p53, Rb, RapIA, DCC, k-rev, etc. (FR 93 04745), os genesque codificam para fatores implicados na coagulação: Fatores VII, VIII, IX, os genes queintervém na reparação do DNA, os genes suicidas (timidina quinase, citosina deaminase),os genes da hemoglobina ou outros transportadores protéicos, os genes que correspondemàs proteínas implicadas no metabolismo dos lipídios, de tipo apolipoproteína escolhidaentre as apolipoproteínas A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J e apo(a), as enzimas do metabolismo, como por exemplo a lipoproteína lipase, a lipase hepática, alecitina colesterol acil-transferase, a 7 alfa colesterol hidroxilase, a fosfatídico ácidofosfatase, ou ainda proteínas de transferência de lipídios, como a proteína de transferênciados ésteres de colesterol e a proteína de transferência dos fosfolipídios, uma proteína deligações dos HDL, ou ainda um receptor escolhido entre os receptores LDL, receptores dosquilomicrons-remnantes e os receptores scavenger, etc.

O ácido nucléico terapêutico pode igualmente ser um gene ou uma seqüência anti-sentido, cuja expressão na célula alvo permite controlar a expressão de genes ou atranscrição de RNAm celulares. Tais seqüências podem, por exemplo, ser transcritas nacélula alvo em RNA complementares de RNAm celulares, e bloquear assim sua traduçãoem proteína, segundo a técnica descrita na patente EP 140 308. Os genes terapêuticoscompreendem igualmente as seqüências que codificam para ribozimas, que são capazes dedestruir seletivamente RNA alvos (EP 321 201).

Como indicado mais acima, o ácido nucléico pode igualmente comportar um ouvários genes que codificam para um peptídio antigênico, capaz de gerar no homem ou noanimal uma resposta imunitária. Neste modo particular de emprego, a invenção permiteportanto a realização seja de vacinas, seja de tratamentos imunoterapêuticos aplicados nohomem ou no animal, notadamente contra microorganismos, vírus ou cânceres, etc. Podetratar-se notadamente de peptídios antigênicos específicos do vírus de Epstein Barr, dovírus HIV, do vírus da hepatite B (EP 185 573), do vírus da pseudo-raiva, do "syncitiaforming virus", de outros vírus, ou ainda específicos de tumores (EP 259 212).

Preferencialmente, o ácido nucléico compreende igualmente seqüências quepermitem a expressão do gene terapêutico e/ou do gene que codifica para o peptídioantigênico na célula ou no órgão desejado. Pode tratar-se de seqüências que sãonaturalmente responsáveis pela expressão do gene considerado, quando tais seqüências sãosuscetíveis de funcionar na célula infectada. Pode igualmente tratar-se de seqüências deorigem diferente (responsáveis pela expressão de outras proteínas, ou mesmo sintéticas).Notadamente, pode tratar-se de seqüências promotoras de genes eucarióticos ou virais. Porexemplo, pode tratar-se de seqüências promotoras provindas do genoma da célula que sedeseja infectar. Do mesmo modo, pode tratar-se de seqüências promotoras provindas dogenoma de um vírus. A respeito disso, pode-se citar por exemplo promotores dos genesElA, MLP, CMV, RSV, etc. Ademais, estas seqüências de expressão podem sermodificadas por adição de seqüências de ativação, de regulação, etc. Pode também tratar-sede promotor, induzível ou reprimível.

Por outro lado, o ácido nucléico pode igualmente comportar, em particular amontante do gene terapêutico, uma seqüência sinal que dirige o produto terapêuticosintetizado para as vias de secreção da célula alvo. Esta seqüência sinal pode ser aseqüência sinal natural do produto terapêutico, mas pode igualmente tratar-se de qualqueroutra seqüência sinal funcional, ou de uma seqüência sinal artificial. O ácido nucléico podeigualmente comportar uma seqüência sinal que dirija o produto terapêutico sintetizado paraum compartimento particular da célula.

Os lipídios catiônicos descritos na presente invenção, e, em particular, o BGTC e oBGSC, são capazes de se complexar com o DNA, e representam uma alternativa vantajosapara os vetores virais para a transferência de ácidos nucléicos de interesse terapêutico, invitro, ex vivo ou in vivo. Em razão das propriedades químicas dos grupos guanidínio, e emparticular do pKa elevado deles, estes lipídios catiônicos são capazes de proteger asmoléculas de DNA contra as degradações devidas às variações de pH. Os resultadosapresentados nos exemplos mostram que estes compostos permitem a transfecção denumerosos tipos celulares, com uma grande eficácia. A eficácia da transfecção depende,em particular, da relação lipidio catiônico / DNA nos complexos formados. Uma relaçãoentre os dois compostos, particularmente favorável para a transfecção, consiste em ter de 6a 8 grupos guanidínio para um grupo fosfato sobre o DNA.

A eficácia de transfecção dos complexos lipidio catiônico/DNA pode ademais sermelhorada, por adição de lipidio neutro, e formação de lipossomos catiônicos. Esteslipossomos são formados por um complexo entre o lipidio catiônico e o lipidio neutro. Esteúltimo pode ser escolhido entre:

- a dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE),

- a oleoil-palmitoilfosfatidiletanolamina (POPE),

- a di-estearoil, -palmitoil, -miristoil fosfatidiletanolamina,

- seus derivados N-metilados de 1 a 3 vezes;

- os fosfatidilgliceróis,

- os diacilgliceróis,

- os glicosildiacilgliceróis,

- os cerebrosídios (tais como notadamente os galactocerebrosídios),

- os esfingolipídios (tais como notadamente as esfingomielinas).

- e os asialogangliosídios (tais como notadamente os asialoGMl e GM2).

Utiliza-se, preferencialmente, a DOPE.De preferência, o composto da invenção e o lipídio neutro estão presentes numarelação compreendida entre 1 e 5, e com maior preferência, entre 2 e 4. Ademais, a relaçãolipídio total (composto da invenção mais lipídio neutro) sobre DNA é, vantajosamente,escolhida de maneira que a relação líquida de cargas positivas esteja compreendida entre 2e 5. De modo particularmente vantajoso, a relação é de aproximadamente 3.

Portanto, a invenção concerne igualmente a qualquer composição farmacêutica quecompreenda um composto segundo a invenção, um lipídio neutro e um ácido nucléico. Depreferência, o composto segundo a invenção é escolhido entre o BGTC e o BGSC. Demodo também todo preferencial, o lipídio neutro é a DOPE. O ácido nucléico é seja umácido desoxirribonucléico, seja um ácido ribonucléico. De preferência, o ácido nucléicocomporta um gene terapêutico.

Além desta aplicação dos derivados de amidínio reivindicados, é igualmentepossível considerar sua valorização nas aplicações seguintes: interferência no nível deinterações entre ácidos nucléicos e proteínas resultantes numa inibição ou estimulação decertos processos, por exemplo, de regulação de expressão genética ou de atividadeenzimática (polimerase, transcriptase, etc.), complexação seletiva de espécies aniônicas,para sua extração, sua eliminação ou sua detecção, com o auxílio de sondas/eletrodos demembrana por exemplo, utilização como reagente de laboratório, para efetuar operações detransfecção in vitro, etc.

Em conseqüência, a presente invenção tem igualmente por objeto qualqueraplicação terapêutica dos derivados de amidínio, tais como descritos precedentemente, sejadiretamente, seja no seio de composições farmacêuticas.

De preferência, as composições farmacêuticas da invenção contêm igualmente umveículo farmaceuticamente aceitável para uma formulação injetável, notadamente para umainjeção direta no nível do órgão desejado, ou para uma administração por via tópica (sobrepele e/ou mucosa). Pode tratar-se em particular de soluções estéreis, isotônicas, ou decomposições secas, notadamente liofilizadas, que, por adição, segundo o caso, de águaesterilizada ou de soro fisiológico, permitem a constituição de solutos injetáveis.

A presente invenção será descrita de modo mais completo, com a ajuda dosexemplos e figuras que seguem, que devem ser considerados como ilustrativos e nãolimitativos.

FIGURAS

Figura 1 : Representação esquemática dos protocolos operatórios de preparação doBGSC e BGTC.

Figura 2 : Representação esquemática dos protocolos operatórios de preparação doBADC.

Figura 3 : Medição da eficácia de transfecção em função da relação compostolipídico/DNA.

Figura 4 : Medição da eficácia de transfecção em função da relação lipídiostotais/DNA.

Figura 5 : Medição do efeito soro sobre a eficácia de transfecção de células HepG2(5A), HeLa (5B), NIH 3T3 (5C) e 293 (5D). Barras cinzas: Presença de soro; Barrasvazias: trasnfecções em ausência de soro durante 2h.

Figura 6 : Fotografias de crio-seções de traquéias murinas mostrando a expressão degene repórter no epitélio do aparelho respiratório, após transfecção in vivo com lipossomosBGTC/DOPE. (6A) e (6B): Detecção da expressão da beta-galactosidase em célulastransfectadas, localizadas na superfície do epitélio (6A) e nas glândulas submucosais (6B);(6C) : Detecção das células que expressam a beta-galactosidase nas glândulas submucosais,por marcação com a imunoperoxidase, utilizando um anticorpo monoclonal anti-beta-galactosidase; (6D) : detecção das células que expressam a luciferase nasglândulas submucosais, por marcação com a imunoperoxidase, utilizando um anticorpopoliclonal antiluciferase; (6E) : coloração com a imunoperoxidase: controle negativoefetuado em ausência de anticorpos.

Figura 7 : Medição da eficácia de transferência de genes in vivo, por injeçãointravenosa de um complexo DNA/BGTC-lipossomo.

Figura 8 : Medição da eficácia de transferência de genes in vivo, por injeçãointraperitoneal de um complexo DNA/BGTC-lipossomo.

A - PREPARAÇÃO DE DERIVADOS SEGUNDO A INVENÇÃOMATERIAL E MÉTODOS

1. Medidas físicas

Os espectros de ressonância magnética nuclear do próton (RMN 1H) foramregistrados num espectrômetro Bruker AC200. Os deslocamentos químicos são expressosem ppm com relação ao TMS.

2. Cromatografias sobre sílica

. As cromatografias sobre camada fina (CCN) foram efetuadas sobre placas de gelde sílica Merck de 0,2mm de espessura.

. As cromatografias sobre coluna foram efetuadas sobre gel de sílica 60 Merck degranulometria 0,040-0,063mm.

EXEMPLO 1:

PREPARAÇÃO DO GUANIDINO ESPERMIDINA COLESTEROL BGSC

- 1 : Preparação do Di-Boc carbamato (1)

Adiciona-se uma solução de cloroformato de colesterila (0,9g, 2mmol) e de Et3N(0,214g, 2mmol) em CH2Cl2 (40ml), a uma solução de 'N,8N-Boc2-espermidina (0,690g,2mmol) em CH2Cl2 (20ml). Após refluxo durante 5 horas, a mistura é lavada com água (2 χ50ml), secada sobre Na2SO4 e o solvente é evaporado. O produto bruto é purificado porcromatografia sobre um gel de sílica, utilizando-se CH2Cl2/MeOH 95/5 como eluente, paradar çarbamato puro (l,3g, 86%).

1H NMR, 5fCDCl1. 200 Mhz); 0,5-2,5(m, estrutura de colesteril, Boc sinal e gruposcentrais CH2 depois da espermidina), 3,l-3,3(m, 8H, N-CH2), 4,50 (m,lH,H3a),5,37(d,lH,H6).

- 2. Preparação do aminocarbamato (2)

Dissolve-se o composto (1) (l,3g) em 20ml de CH2Cl2 e adicionam-se, a estasolução resfriada (leito de gelo), 2ml de CF3CO2H destilado há pouco, para libertar osgrupos protetores BOC. Após agitação à temperatura ambiente durante 3 horas, adicionam-se 50ml de 1N NaOH e a mistura é extraída com CH2Cl2. As camadas orgânicas são lavadascom água, secadas sobre Na2SO4 e evaporadas, para se obter o aminocarbamato (2) bruto(0,945g, 98%).

1H NMR. ôíCDCh. 200 MhzV 0,5-2,5(m, estrutura de colesteril e grupos centraisdepois da espermidina), 2,7(m, 4H, CH2-N-CO-), 3,25 (largo m, 4H, N-CH2),4,49(m,lH,H3a), 5,35(d,lH,H6).

3. - Síntese do BGSC.

Dissolve-se o çarbamato (2) bruto (0,94g) em 30ml de THF/MeOH 85/15. Depoisadiciona-se IH-pirazolocarboxamidina (0,495g, 3,4mmol) e diisopropil-etilamina (0,436,3,4mmol) em 30ml de THF/MeOH 85/15. Após agitação à temperatura ambiente, durante18 horas, juntam-se lentamente 250ml de dietiléter e separa-se o precipitado obtido pordecantação. O composto bruto é posto em suspensão três vezes em dietiléter e separado pordecantação, para dar GSC puro (0,570g, 47%).

1H NMR, ÔÍDMSO d6). 200 Mhz: 0,5-2,5(m, estrutura do colesteril e CH2 central),3,l(m, 8H, N-CH2), 4,3(m,lH,H3a), 5,3(d,lH,H6); 7,2 (largo s, 8H, NH2+), 7,8(s,2H,NH),Anal. Cale. para C37H67N7O2, 2HC1,C,62,15 ; H,9,67; N.13,71.

Resultado de análise elementar: C,62,28 : H,9,81 ; N,13,15.

EXEMPLO 2:

PREPARAÇÃO DO GUANIDINO TREN COLESTEROL. BGTC

1. preparação do Aminocarbamato (5)

Adiciona-se lentamente uma solução de cloro formato de colesterila (l,8g, 4mmol)em IOml de CH2Cl2 a uma saturação de tris(2-aminoetil)amina (TREN) (ll,68g, 80mmol)em 400ml de CH2Cl2. Após agitação à temperatura ambiente durante duas horas, liberta-sea amina inerte por lavagem com água (3xl00ml) e, após secagem sobre Na2SO4, evapora-seo solvente. Isola-se (5) na forma de triidrocloreto, da maneira seguinte: dissolve-se oproduto bruto em IOml de MeOH e adiciona-se, gota a gota, uma solução saturada de HClmetanólico (5ml); o precipitado obtido é separado por decantação e, para se obter umcomposto puro, é posto em suspensão três vezes em MeOH e separado por decantação.

Após secagem sob vácuo, é obtido o triidrocloreto (6) puro (l,71g, 64%).

1H NMR- ÔÍCDCL + SCD1OD. 200 Mhz): 0,5-2,4(m, estrutura de colesteril),2,5(m,2H,CH2NHCO); 2,8 (largo s, 4H, + HN-CH2), 3,06 (largo s,4H,CH2NH3+),3,20(m,2H,+HN-CH2), 4,4(m,lH,H3a), 5,3(d,lH,H6), Anal. Cale. para C34H62N4O2,3HC1;C,61,10; H,9,80 : N,8,38. Resultado: C,61,25 ; H,9,96 ; N,8,22.

2 - Preparação do B.GTC

Adiciona-se lentamente uma solução de cloroformato de colesterila (2,24g, 5mmol)em IOOml de CH2Cl2, numa larga saturação de tris(2-aminoetil)amina(TREN)(29,2g,200mmol) em 250ml de CH2Cl2. Após agitação à temperatura ambiente, durante 2 horas,liberta-se a amina inerte por lavagem com água (3xl00ml) e, após secagem sobre Na2SO4,o solvente é evaporado. 0 produto bruto (3,2g) é dissolvido em THF/MeOH 50/50 (20ml);depois, adiciona-se à mistura da lH-pirozolo-l-carboximidina (l,465g, lOmmol) ediisopropilamina (l,3g, IOmmol). Após agitação à temperatura ambiente durante 18 horas,adiciona-se dietiléter e o precipitado obtido é separado por decantação. A fim de se obteruma amostra pura, o composto bruto é posto em suspensão três vezes em dietiléter eseparado por decantação (2,15g), 60% após secagem sob vácuo.

1H NMR. ÍDMSOdó. 200 MhzV 0,5-2(m, estrutura do colesteril), 2,2(m,2H,N-CH2); 2,6 (largo s, 4H, + HN-CH2), 3,0 (d,2H,N-CH2), 3,2 (largo s,4H), 4,3(m, 1Η,Η3α),5,3(d,lH,H6), 7,3 (largo s,8H,NH2+), (7,8(largo s,2H,NH). Anal. Cale. paraC36H66N8O2,2HC1; C,60,39; H,9,57 ; N,15,65. Resultado: C,60,38 ; H,9,67 ; N,15,56.

EXEMPLO 3:

PREPARAÇÃO DO BIS-CLORIDRATO DE BIS AMIDÍNIO BACD

1. Preparação da dinitrila

Adiciona-se uma solução de cloroformato de colesterila (8,97g; 20mmol.) emCH2Cl2 (IOOml), gota a gota, a uma solução de iminopropionitrila (2,46g, 20mmol.) e Et3N(2,02g, 20mmol em CH2Cl2 (lOOml). Após agitação à temperatura ambiente, durante 6horas, lava-se com água (2 χ lOOml) e seca-se sobre Na2SO4. O solvente é evaporado e oproduto bruto (10,5g) é recristalizado no metanol (8,59g; 80%).

1H NMR. arCDCU, 200 MHz): 0,5-2,5(m, estrutura de colesteril), 2,7(m,4H;-CH2CN); 3,62(m, 4H, CH2-N-), 4,50(m,IH5H3J, 5,39(d,lH,H6).

2. Preparação da ditioamida

Numa solução da dinitrila, preparada como descrito precedentemente, (0,324g,6mmol.) e de dietilamina (0,884g; 12mmol) em DMF (30ml), mantida a 50°C, faz-seborbulhar durante 2 horas uma leve corrente de H2S. Derrama-se a solução azul sobre geloe separa-se o precipitado assim obtido por filtração. Dissolve-se este produto bruto emCH2Cl2 e lava-se com água (2 χ 50ml). Após secagem sobre Na2SO4, o solvente éevaporado e o produto obtido é recristalizado duas vezes em metanol (l,86g; 51,5%).

1H NMR ÍDMSOdó. 200 MHz): 0,5-2,5(m, estrutura de colesteril), 2,67(t,4H-N-CH2); 3,50(t, 4H, S=C-CH2), 4,3(m,1Η,Η3α), 5,33(d,lH,H6).

3. Preparação do bis-iodeto de ditioamidato)

A uma solução de ditioamida (0,603g; lmmol) em acetona (20ml), adiciona-seiodeto de metila (2ml) e deixa-se repousar, à temperatura ambiente, durante 48 horas.Filtra-se o precipitado obtido (0,741g; 83,5%). Este produto é utilizado diretamente, sempurificação anexa.

4. Preparação do bis cloridrato de bis amidínio BADC.

Numa suspensão sob refluxo do bis-iodeto (0,741g; 0,83mmol.). tal como obtidoprecedentemente, em isopropanol (IOml), faz-se borbulhar uma corrente de NH3, durante 2horas, depois continua-se a aquecer sob refluxo 4 horas suplementares. Evapora-se oisopropanol e o resíduo é retomado em metanol (lOml). Após passagem desta soluçãosobre uma resina permutadora de ions básica, faz-se passar uma corrente de ácidoclorídrico no eluente e evapora-se a seco. O bis cloridrato assim obtido é dissolvido nomínimo de etanol (cerca de 5ml). Filtra-se um ligeiro insolúvel e adiciona-se de novo aofiltrado um largo excesso de éter dietílico. Obtém-se um pó que se filtra e que se seca(320mg; 60%). Uma recristalização no isopropanol permite isolar o produto esperado,numa forma analiticamente pura.

1H NMR ÍDMSOd6. 200 MHz): 0,5-2,6(m, estrutura do colesteril e -CH2-amidínio), 3,57(s, largo 4H-N-CHr); 4,3(m,lH,H3J, 5,3(d,lH,H6), 8,64 (s, largo; 2H;NH2),9,07 (s; largo; 1H; NH), 9,18 (s; largo; 2H).

Anal. Cal. Para C34H56N4O2, 2HC1 : C, 65,25. H, 9,32; N, 8,94. Resultado C, 65,40.H, 9,87; N, 9,55.Β: UTILIZAÇÃO DE DERIVADOS SEGUNDO A INVENÇÃO PARA ATRANSFERÊNCIA DE GENES IN VITRO E IN VIVOMATERIAIS E MÉTODOS

1. Os ensaios de transfecção que seguem são efetuados com BGSC e BGTC,preparados segundo os protocolos descritos nos exemplos 1 e 2.

2. Preparação dos lipossomos

Uma mistura de lipídio catiônico e de DOPE (numa relação molar de 3/2) emclorofórmio (CHCl3) é evaporada sob vácuo e posta em suspensão numa solução de tampãoHEPES 20mM a Ph 7,4, numa atmosfera N2.

A concentração final de lipídio é de l,2mg/ml.

A mistura é submetida a vórtice durante 5min, depois de submetida a som durante5min, com um sonificador (Branson Ultrasonic 2210), e finalmente armazenada a +4°C,durante 24h, para hidratação.

A dispersão resultante é submetida a som novamente (Sonifier Branson 450),durante 5 a 10 min, para formar lipossomos.

Após centrifugação, a solução é filtrada num filtro com diâmetro de poro 0,22μ(Millex GS, Millepore) e armazenada a +4°C.

0 tamanho dos lipossomos que contêm BGSC e BGTC foi estudado com a ajuda deum aparelho de difração laser (Autosizer 4700, Malvern Instruments). Este estudo mostraum pico único, correspondente a um diâmetro médio de 50nm em análise multimodal pornúmeros.

3 - Culturas celulares

A origem (espécie e tecidos) da maioria das linhagens celulares utilizadas para asexperiências de transfecção é dada no quadro I.As células da linhagem celular HeLa (P Briand, ICGM Paris) são derivadas de umcarcinoma humano de origem epitelial cervical.

As células NIH 3T3 (C Lagrou, Instituí Pasteurj Lille) são fibroblastos decamundongo.

A linhagem celular NB2A (C. Gouget, Paris) é derivada de um neuroblastoma decamundongo.

Todas as células, com exceção das células AtT-20 e PC12, foram cultivadas emmeio Dulbecco modificado (DMEM, GIBCO), complementado com 10% de soro de vitelofetal (FCS; GIBCO), de penicilina com 100 unidades/ml (GIBCO) e de estreptomicina(GIBCO) com 1 0(^g/ml.

As células AtT-20 foram cultivadas em DMEM/F12 (GIBCO), complementadocom 10% de soro de vitelo fetal.

As células PC12 foram cultivadas em DMEM complementado com 10% FCS e 5%de soro de cavalo.

Todas as células foram mantidas em cultura em caixas plásticas (Falcon), sobatmosfera úmida a 5% de C02.

4 - Plasmidios

Os plasmídios pRSV-Luc (O. BENSAUDE, ENS, Paris) e pRSV-nlsLacZ foramamplificadas em E. coli e preparados por purificação sobre gradiente CsCl por técnicaspadrão. No plasmídio pRSV-nlsLacZ, e o plasmídio pRSV-Luc, o gene LacZ de E. coli esua seqüência sinal de localização nuclear e o gene luciferase estão, respectivamente, sob ocontrole transcricional do LTR/RSV (Rous Sarcoma Viras). O plasmídio pXL2774comporta o gene que codifica para a luciferase, sob controle do promotor docitomegalovírus (CMV).

5 - Protocolo de transfecção in vitroNo dia anterior, a transfecção 2 X IO5 células são depositadas por cavidades (placascom 6 cavidades Falcon).

Cada cavidade contém uma linhagem celular diferente.

Assim, no dia da transfecção, as células estão confluentes pela metade.

O DNA plasmídico (5μ§) e a quantidade desejada de lipídio bis-guanidínio foram,cada um, diluído em 250μ1 de DMEM sem FCS e submetido ao vórtice. Após cerca de5min, as duas soluções foram deixadas a incubar, à temperatura ambiente durante 15min. Amistura de transfecção é então adicionada às células (0,5ml por cavidade), que foramlavadas com um meio sem soro. Após 4 a 6 horas de incubação a 37°C, Iml de meio comsoro é adicionado em cada cavidade, sem se retirar a mistura de transfecção. 24 horas apósa transfecção, o meio é substituído por Iml de meio de cultura fresco. As células sãorecolhidas 2 dias após a transfecção, para medir a expressão da luciferase.

Transfecções testemunhos foram feitas, utilizando-se agentes de transfecçõescomercializados:

- a lipopoliamina Transfectam® (JP Behr, Estrasburgo, França) foi utilizada emsolução alcoólica, numa relação ótima de cargas iônicas Transfectam®/DNA 6-8.

- a Lipofectin® (Life Technologies Inc., Cergy Pontoise, France), que é umaformulação de lipossomos tendo por lipídio neutro a DOPE e por lipídio catiônico oDOTMA. (N[l(2,3-dioleilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio cloreto).

Os complexos DNA/Lipossomos foram obtidos nas condições padrãorecomendadas pelo fabricante.

- células foram transfectadas por precipitação com fosfato de cálcio. (Keown, W.A.,Campbell, C.R.; Kucherlapati, R.S. (1990) Methods in Enzymology;

Academic Press : New York, 185, 527-537).6 - Medição da luciferase para as transfecções realizadas in vitro

A atividade luciferase é medida 48 horas após a transfecção, utilizando-se umavariante o procedimento de Wet et al. (De Wet, J.R., Wood, K.V., DeLuca, M., Helinski,D.R. & Subramani, S. (1987) Mol Cell Biol. 7, 725-737).

- retira-se o meio de cultura

- as células são lavadas com uma solução salina de tampão fosfato frio,

- depois elas são lisadas por incubação em 250μ1 de tampão de Iise (25mMtrifosfato pH 7; 8, 8 mM MgCl2, ImM ditiotreitol, 15% de glicerol e 1% de triton X-100).

- obtém-se um lisado claro, após eliminação dos materiais insolúveis porcentrifugação (15mm a + 4°C) numa microcentrifiigadora.

- um Aliquot (20μ1) de extrato celular é diluído em ΙΟΟμΙ de tampão de lise, ao qualse adicionam 9μ1 de ATP 25 mM (sigma) e 20μ1 de luciferina 25mM (sigma).

- as amostras são colocadas num luminômetro (Lurmet LB9501 Berthold, Nashua,NH) e mede-se a emissão luminosa durante 10 segundos.

O aferimento da curva RLU/Luciferase foi feito, utilizando-se diferentes diluiçõesde luciferase de vagalume purificada (sigma) e mostra que a parte linear da curva vai de IO4a IO7 RLU (relative light units).

A concentração de proteína foi medida pelo teste BCA (ácido bicinconínico),utilizando-se a soroalbumina bovina como testemunho.

Os dados para a atividade luciferase são expressos em RLU/mg de proteína.

7 - Protocolo de injeção in vivo no nível das vias respiratórias de camundongos

Os camundongos são camundongos machos OFl (peso 30g), provenientes de Iffa-Credo (Lyon, França). Lipossomos catiônicos BGTC/DOPE (relação mo lar 3:2) sãoutilizados. A mistura de transfecção é obtida a partir de 10μg de DNA plasmídico (em ΙΟμΙde água), 20μ1 de lipossomos catiônicos, num meio Hepes 20mM (pH 7,4), a umaconcentração lipídica total de 5mg/ml. Os agregados DNA/lipídios assim formadospossuem uma relação carga da ordem de 6.

Após anestesia dos camundongos com pentobarbital, a mistura de transfecção(30μ1) é injetada nas vias respiratórias, por instilação intratraqueal, através de uma cânulainserida na luz traqueal. 48h após a instilação, os animais são sacrificados por overdose depentobarbital e os pulmões e traquéias retiradas para análise.

8 - Coloração com o X-gal

Para dosar a expressão da beta-galactosidase de E. coli nas culturas primárias,impregnam-se as células durante 15 minutos a 4°C com uma solução de paraformaldeído a4% e, em seguida, incubam-se as mesmas com o X-gal de substrato beta-galactosidasecromogênica (Sigma). A coloração azul dos núcleos das células transfectadas é dosada pormicroscopia por luminiscência.

9 - Dosagem das células X-gal no nível das vias respiratórias transfectadas in vivo

Para a detecção das células X-gal, no nível das vias respiratórias, os pulmões etraquéias são tratados Ih em paraformaldeído a 4%, mergulhados em seguida por umanoite inteira em PBS contendo 30% de sucrose, depois incorporados num meio decongelação e congelados com nitrogênio líquido. Seções de criostatos de 5μ são emseguida coloridas para a atividade de β-galactosidase, por incubação durante uma noiteinteira com reagente X-gal (Sigma).

10 - Dosagem da luciferase no nível das vias respiratórias transfectadas in vivo

Para dosar a atividade luciferase à saída das transfecções in vivo, fragmentos detecidos são colocados em presença de 30μ1 de tampão de Iise (25mM Tris-fosfato pH 7,8,ImM ditiotreitol (DTT), 15% glicerol e 1% Triton X-100), Usados em cerca de lmin, comum homogeneizador (Polylabo, Estrasburgo, França) e conservados no gelo. Apóscentrifiigação, 20μ1 de lisado são utilizados para a dosagem. A atividade luciferase éexpressa em RLU por mg de proteína.

11 - Protocolo de imuno-histoquímica

Crio-seções de amostras de pulmões e traquéias são incubadas Ih seja comanticorpos murinos monoclonais anti-P-galactosidase de E. coli a 5μg/ml (Genzyme,Cambridge, MA), ou anticorpos de coelho policlonais 1:400 diluição (Promega).

A proteína β-galactosidase de Escherichia coli é dosada por coloração com aimunoperoxidase, utilizando-se um anticorpo secundário anti Ig de camundongo marcadocom a biotina (Boehringer) e um conjugado estrepta-vidin-POD (Boehringer). A proteínaluciferase é dosada por coloração com a imunoperoxidase, utilizando-se um anticorpo decabra anti-coelho (ICN Biomedicals, Inc.), e o sistema peroxidase-antiperoxidase de coelho(PAP) (Dako Glostrup, Denmark). As seções são examinadas por microscopialuminiscente. Controles negativos são efetuados sem anticorpos.

EXEMPLO 4:

TRANSFECCÕES IN VITRO COM RELAÇÕES AGENTE DETRANSFECCÃO/ DNA DIFERENTES

A fim de otimizar a eficácia de transfecção obtida com agregados BGTC/DNA, arequerente estudou a influência da relação BGTC/DNA sobre a taxa de transfecção, em 3tipos diferentes de células de mamíferos, conhecidos por sua relativa sensibilidade aosmétodos de transfecção clássica. Os resultados são apresentados na figura 3.

Experiências de transfecção foram então realizadas com fibroblastos murinos 3T3das células epiteliais humanas HeLa e com neuroblastomas de camundongos NB2A. Nocurso destas experiências, uma certa quantidade fixa de plasmídio pRSV-Luc foi posta emcontato com quantidades variáveis de BGTC em solução. Para determinar a diferença derelação a estudar, a requerente partiu do princípio que um μg de DNA eqüivale a 3nm defosfato carregado negativamente, e que somentè dois grupos guanidínio são carregadospositivamente com pH neutro de formação dos agregados e de transfecção. Mede-se aatividade luciferase 48h após a transfecção. A expressão da luciferase é máxima paraagregados contendo de 6 (células HeLa) a 8 (células 3T3, NB2A) grupos guanidínio, paraum grupo fosfato do DNA, isto é, agregados tendo uma carga positiva importante.

EXEMPLO 5

TRANSFECCÕES IN VITRO COM DIFERENTES TIPOS CELULARES

A transferência de genes por intermédio de lipídios catiônicos é uma técnica detransfecção atraente, não somente pelo fato de não necessitar de intermediários, mastambém por permitir transfectar uma muito grande variedade de células provenientes detecidos e de organismos diferentes. Para estudar a extensão da eficácia do BGTC comoagente de transfecção, foram testadas várias linhagens celulares de origens diversas. Osresultados estão expostos no quadro 1 abaixo. A relação de cargas foi escolhida entre 6 e 8,para uma eficácia máxima. A fim de estabelecer uma comparação, células das mesmaslinhagens foram igualmente transfectadas, utilizando-se uma lipopoliamina, de um lado eoutro do fosfato de cálcio. Os resultados mostram que o BGTC é normalmente tão eficazquanto o Transfectam, e duas vezes mais eficaz que o fosfato de cálcio.

Quadro 1 : Expressão da luciferase em diferentes linhagens celulares de mamíferostransfectados, seja por BGTC, por fosfato de cálcio ou por Transfectam®.<table>table see original document page 25</column></row><table>

Todas as transfecções foram feitas ao menos duas vezes (n> 2).

EXEMPLO 6

TRANSFECÇÕES IN VITRO EM PRESENÇA DE UM LIPÍDIO NEUTRO

Sendo o composto BGSC menos solúvel em meio aquoso que o BGTC, arequerente utilizou o primeiro, na forma de lipossomos em presença de um lipídio neutro, aDOPE (dioleoilfosfatdietanolamina). As formulações são preparadas numa relação molar3/2. Uma segunda preparação contendo, desta vez, BGTC, foi igualmente preparada com aDOPE nas mesmas composições.

6.1 - Determinação da relação lipídio total / DNA

A requerente determinou, logo de início, a relação lipídio/DNA, no curso de umaexperiência de transfecção sobre células HeLa. A curva obtida é representada na figura 4.Os índices ótimos de transfecção são obtidos para relações lipossomos BGSC/DNAcompreendidos entre 1,5 e 5, com centro em 2,5-3. Sendo os grupos guanidínio protonadoscom pH neutro, os melhores agregados BGSC-DOPE/DNA têm uma carga positiva demais ou menos 3 (figura 4).

As melhores relações BGSC-DOPE/DNA são, portanto, inferiores às obtidas comagregados de tipo BGTC/DNA (entre 6 e 8). A transfecção em presença de lipossomoscatiônicos é facilitada pela presença de DOPE e das propriedades fusogênicas desta última.

6.2 - Transfecção de diferentes linhagens celulares por lipossomos catiônicos.

A requerente procedeu a experiências de transfecção em diferentes linhagenscelulares, utilizando formulações de lipossomos catiônicos BGSC-DOPE e BGTC-DOPE,em relações molares 3/2. A relação de cargas guanidínio dos lipídios/fosfatos do DNA é deaproximadamente de 2,5 (~3) para estes dois sistemas de transferência de genes. Umatransfecção com a Lipofectin® serve de testemunho. Os resultados estão expostos no quadro2 abaixo.

Estes resultados mostram que os derivados do colesterol que portam gruposguanidínios na forma de lipossomos catiônicos são ao menos tão eficazes para atransfecção quanto a Lipofectin. Estes resultados podem, bem entendido, ser otimizadospara cada linhagem celular.

Quadro 2: Expressão da luciferase em diferentes linhagens celulares eucarióticastransfectadas.por meio de lipossomos BGSC/DOPE, de lipossomos BGTC/ DOPE e deLipofectin®.<table>table see original document page 27</column></row><table>

Todas as transfecções foram feitas ao menos três vezes (n> 3).

a: medida média em RLU da atividade luciferase para IOC^g de lisado total (n> 4).

EXEMPLO 7

ESTUDO DO EFEITO DA PRESENÇA DE PROTEÍNAS SÉRICAS SOBREA EFICIÊNCIA DA TRANSFERÊNCIA DE GENES IN VITRO

A maioria das composições de transfecção à base de lipídios catiônicos apresentamuma eficácia diminuída em presença de soro. Este exemplo tem por objeto testar asensibilidade dos compostos da invenção com efeito soro.

7.1 - Formulações dos lipídios catiônicos

Os lipídios descritos na invenção são solubilizados em etanol.

i) soluções de "lipossomos" são obtidas em presença de DOPE, como segue: aDOPE (AVΑΝΤΙ), em solução no clorofórmio, é adicionada às soluções de lipídio noetanol, numa relação molar lipídio catiônico/DOPE de 3/2. Após evaporação a seco, asmisturas são retomadas com água e aquecidas a 50°C durante 30 minutos;

ii) soluções de "micelas" são obtidas segundo o protocolo descrito para a obtençãode "lipossomos", mas a solução de DOPE é substituída por clorofórmio.

As soluções são todas ajustadas a 10 mM de lipídio catiônico.

7.2 - Ácido Nucléico

O ácido nucléico utilizado é o plasmídio pXL2774.

7.3 - Misturas citofectantes (preparação extemporânea)

O DNA é diluído a 2(^g/ml em NaCl 150 mM e as diferentes formulações delipídio catiônico são diluídas em água a 40, 80, 120 e 160μΜ. As soluções de DNA e delipídio são misturadas volume a volume, o que dá razões em nmoles/Vg DNArespectivamente de 2, 4, 6 e 8; a concentração salina é de 75 mM.

7.4 - Transfecções

As células são cultivadas nas condições apropriadas em microplacas de 24cavidades (2cm2/cavidade) e são transfectadas enquanto estão em fase exponencial decrescimento e a 50-70% da confluência. As células são lavadas com 2 vezes 500μ1 de meiodesprovido de proteínas séricas e postas em crescimento seja em meio sem soro[transfecção em ausência de soro], seja em meio completo [transfecção em presença désoro] e 50μ1 de mistura citofectante [0^g de DNA/cavidade] são adicionados às células[3 cavidades/condição lipídio-DNA],

Quando as células são transfectadas em "ausência de soro", o meio de crescimentoé suplementado pela quantidade apropriada de soro, 2 horas após a transfecção.

A eficácia de transfecção é avaliada por uma medição da expressão da luciferase,segundo as recomendações dadas para a utilização do kit Promega. [Luciferase AssaySystem]. A toxicidade das misturas citofectantes é estimada por uma medição dasconcentrações protéicas nos lisados celulares.

7.5 - Resultados (Figura 5)Os resultados obtidos com quatro tipos celulares [NIH3T3 - 293 - HepG2 - HeLa]mostram que, nas condições testadas, as formulações em forma de "lipossomos" são maiseficazes do que as com forma de "micelas". Por outro lado, contrariamente ao que seobserva com a maioria das preparações citofectantes que contêm lipídios catiônicos,nenhum efeito inibidor significativo ligado à presença de soro para o BGTC, na forma de"lipossomos"ou de "micelas", pôde ser evidenciado em nossas condições de transfecção.

EXEMPLO 8

EXPRESSÃO IN VIVO DE TRANSGENE NAS VIASRESPIRATÓRIAS DE CAMUNDONGOS COM LIPOSSOMOS BGTC/DOPE

Para isto, utilizamos os lipossomos catiônicos BGTC/DOPE. A obtenção dosagregados DNA/lipossomos e o protocolo de administração são efetuados como descritosem material e método.

As células X-gal são detectadas no epitélio das vias respiratórias dos camundongostratados, 48h após transfecção no nível das células do plasmídio LacZ, com a ajuda doslipossomos BGTC/DOPE. Os resultados são apresentados na figura 6.

A maioria das células transfectadas estão localizadas na traquéia e só algumascélulas X-gal são observadas nas vias respiratórias secundárias. Este tipo de distribuição jáfoi reportado em outras transfecções celulares.

Efetuamos, outrossim, uma imuno-histoquímica para identificar o produto do generepórter. Majoritariamente, são as células maduras que são transfectadas no nível dasuperfície do epitélio (figura 6A). Estes dados mostram que os lipossomos catiônicos sãocapazes de induzir a transfecção de genes em células não proliferativas e totalmentediferenciadas do epitélio das vias respiratórias. A expressão do transgene é igualmentedetectada nas glândulas submucosais (figura 6B). A detecção por marcação imunológicadas células transfectadas, com a utilização de um anticorpo monoclonal dirigido contra a β-galactosidase de Ε. coli, confirma esta expressão nas glândulas submucosais e no epitéliode superfície (figura 6C). A expressão transgênica é igualmente evidenciada nas glândulassubmucosais, por coloração pela imunoperoxidase, com um anticorpo dirigido contra aproteína luciferase, após transfecção de ρ RSV-Luc com BTGC/DOP (figura 6D).

Controles negativos são efetuados sem anticorpos (figura 6E).Estes resultados são de interesse todo particular para a terapia gênica dirigida contraa muscovidose. Com efeito, para tratar esta patologia, é necessário alvejar as glândulassubmucosais, que são o sítio principal da expressão da CFTR nos brônquios humanos.

EXEMPLO 9

DOSAGEM QUANTITATIVA DA EFICÁCIA DE TRANSFECCÃO DEBGTC/POPE INVIVO

Para isto, os pulmões e a traquéia de camundongo, tratadas com lipossomoBGTC/DOPE e plasmídio pRSV-Luc, nas condições descritas no exemplo 8, são retiradas48h após a transfecção, e a atividade luciferase dosada segundo o protocolo descrito emmaterial e método.

Os resultados são apresentados no quadro 3 abaixo.

Quadro 3

<table>table see original document page 30</column></row><table>A atividade luciferase é detectada de maneira sistemática nos homogenados detraquéia, mas não nos dos pulmões. Esta observação está de acordo com os resultadosprecedentes, obtidos quando do exame da distribuição das células positivas ao Xgal. Nota-se que a expressão luciferase está diretamente ligada ao plasmídio de expressão, uma vezque nenhuma atividade pôde ser detectada no testemunho contendo um plasmídio LacZ. Atítulo de testemunho, foi igualmente realizada uma transfecção do plasmídio sem vetor.Não se obseva neste ensaio testemunho nenhuma expressão de luciferase.

Estes dados demonstram a eficácia dos lipossomos BGTC/DOPE para a transfecçãogênica in vivo das vias respiratórias.

EXEMPLO 10

TRANSFERÊNCIA DE GENE IN VIVO POR INJEÇÃO INTRAVENOSAOU INTRAPERITONEAL

As formulações dos lipídios catiônicos e o DNA são descritos no exemplo 7.

10.1 - Efeito Dose dos lipídios catiônicos (figuras 7-8)

Os camundongos BalbC, com idade de 5 semanas, são injetados por via intravenosa(veia da cauda) ou intraperitoneal, com 200μ1 de mistura transfectante em solução em NaCl37,5 mM, glicose 5%, e a expressão da luciferase é pesquisada 24 horas após a transfecçãono pulmão, após injeção intravenosa, e no fígado e no baço, após injeção intraperitoneal.

Os órgãos são retirados a frio em tampão de Iise [Promega El53A], adicionado deinibidores de protease [Boehringer 1697498] e homogeneizados com um moinho HeidolphDIAX600. A atividade luciferase é pesquisada na nata 14000g dos extratos tissulares.

Injeção intravenosa

Cada camundongo recebe 5C^g de DNA, complexado por diferentes concentraçõesde BGTC, na forma de "lipossomos". A relação ótima em nanomoles lipídio catiônico/Vgde DNA observada é de 9 (figura 7); nenhuma toxicidade pôde ser evidenciada paradoses indo até a 900 nanomoles de BGTC injetadas.

Injeção intraperitoneal:

O BGTC, na forma de "lipossomos", foi injetado com 100 de DNA porcamundongo. Tanto no fígado (figura 8B), como no baço (figura 8A), o máximo deexpressão é obtido para 1,5 nanomoles BGTG^ig de DNA.

10.2 - Cinética de expressão após injeção intravenosa

Pesquisamos a biodistribuição da expressão da luciferase em 7 órgãos, emfunção do tempo subseqüente à injeção de 200μ1 de mistura "lipossomos"BGTC/DNA, em NaCl 37,5 mM, glicose 5% [50μg de DNA e 9 nanomoles deBGTCg de DNA], na veia da cauda de camundongos BalbC com idade de 5semanas. Os resultados são expressos em picograma de luciferase extraída por órgão,segundo uma curva de calibração com luciferase comercializada na formacristalizada. O limite de detecção situa-se entre 0,5 e 1 picograma de luciferase.

Colocamos em evidência que, nas condições testadas, o máximo de expressãoé obtido 23 horas após a transfecção, para 6 dos 7 órgãos estudados, a saber odiafragma, o gastrocnemiano, o pulmão, o rim e o baço. A expressão no nível dofígado parece mais precoce. O máximo de expressão é obtido no nível pulmonar,com um teor de 0,5 nanograma, 23 horas após a transfecção.

Claims

1. Composto caracterizado pelo fato de compreender a fórmula geral I e seussais: <formula>formula see original document page 33</formula> na qual:-Rl representa um derivado do colesterol;- R2 e R3 representam, independentemente um do outro, um átomo dehidrogênio ou um grupamento de fórmula geral II, com ao menos um dentre elesdiferente de um átomo de hidrogênio, <formula>formula see original document page 33</formula> na qual:-nem representam, independentemente um do outro e de maneira distinta,entre os grupamentos R2 e R3, um inteiro compreendido entre 0 e 4,- R4 e R5 representam, independentemente um do outro, um átomo dehidrogênio ou um grupamento de fórmula III, sendo que pelo menos um deles, R4 ouR5, é diferente de hidrogênio:<formula>formula see original document page 34</formula>na qualρ e q representam, independentemente um do outro, um inteiro compreendidoentre 0 e 4, e r é igual a 0 ou a 1, com para r igual a 1,X representando um grupamento NH e sendo χ então igual a 1, ouX representando um átomo de nitrogênio e sendo x, então, igual a 2com p, q e r podendo variar, independentemente, entre os grupamentos R4 e

2. Composto segundo a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de R2 ou R3ali representarem, independentemente um do outro, um átomo de hidrogênio ou umgrupamento de fórmula IV<formula>formula see original document page 34</formula>na qualn, m e p são definidos como precedentemente, e R4 representa um átomo dehidrogênio ou um grupamento de fórmula V<formula>formula see original document page 35</formula>com q e r definidos como precedentemente,e com m, n, p, q e r podendo variar, de maneira independente, entre osdiferentes grupamentos R2 e R3.

3. Composto segundo a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de setratar preferencialmente de um composto representado por uma das sub-fórmulasgerais seguintes:(H2N)2+ C-NH-(CH2)2-NH-COO-RI VI[(H2N)2+ C-NH-(CH2)3] [(H2N)2+ c -NH-(CH2)4-I-N-COO-Rl VII[(H2N)2+ C-NH-(CH2)2J2 - N-(CH2)2 - NH - COO - Rl VIII[(H2N)2+ C-(CH2)2J2 - N- COO - Rl IX[[(H2N)2+ C-(CH2)2J2 - N-(CH2)2J2 N- COO - Rl Xnas quais Rl é definido segundo a reivindicação 1.

4. Composto segundo uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fatode ser escolhido entre[[(H2N)2* C-(CH2)2J2 - N-(CH2)2J2 N- COO - Rl[(H2N)2+ C-NH-(CH2)3J [(H2N)2+ C-NH-(CH2)4-J-N-COO-Rl[(H2N)2+ C-(CH2)2J2 - N- COO - Rlnas quais Rl representa um grupamento colesterila.

5. Composto segundo uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fatode se tratar do 3 (3-0- [N-(3-guanidinopropil),N-(4-guanidinobutil)]carbamoilcolesterol (BGSC).

6. Composto segundo uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fatode se tratar do 3P-0-[N-(N',N'-bis-(2-guanidinoetil)-2-aminoetil)]carbamoilcolesterol (BGTC).

7. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender aomenos um composto segundo reivindicações de 1 a 6.

8. Composição farmacêutica segundo a reivindicação 7, caracterizada pelofato de o composto ser o 3P-0-[N-(3-guanidinopropil),N-(4-guanidinobutil)]carbamoilcolesterol (BGSC).

9. Composição farmacêutica segundo a reivindicação 7, caracterizada pelofato de o composto ser o 3(3-0-[N-(N',N'-bis-(2-guanidinoetil)-2-aminoetil)]carbamoilcolesterol (BGTC).

10. Composição farmacêutica segundo uma das reivindicações 7 a 9,caracterizada pelo fato de conter ainda um ácido nucléico.

11. Composição farmacêutica segundo a reivindicação 10, caracterizada pelofato de o ácido nucléico ser um ácido desoxirribonucléico.

12. Composição farmacêutica segundo a reivindicação 10, caracterizada pelofato de o ácido nucléico ser um ácido ribonucléico.

13. Composição farmacêutica segundo uma das reivindicações 10 a 12,caracterizada pelo fato de o ácido nucléico comportar um gene terapêutico.

14. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender umcomposto segundo a reivindicação 1, um lipídio neutro e um ácido nucíéico.

15. Composição farmacêutica segundo a reivindicação 14, caracterizada pelofato de o composto ser escolhido entre o 3P-0-[N-(N',N'-bis-(2-guanidinoetil)-2-aminoetil)] carbamoilcolesterol (BGTC) e o 3 p-O- [N-(3-guanidinopropil),N-(4-guanidinobutil)]carbamoilcolesterol (BGSC).

16. Composição farmacêutica segundo a reivindicação 14, caracterizada pelofato de o lipídio neutro ser a DOPE.

17. Composição farmacêutica segundo a reivindicação 14, caracterizada pelofato de o ácido nucléico ser um ácido desoxirribonucléico.

18. Composição farmacêutica segundo a reivindicação 14, caracterizada pelofato de o ácido nucléico ser um ácido ribonucléico.

19. Composição farmacêutica segundo uma das reivindicações 17 ou 18,caracterizada pelo fato de o ácido nucléico comportar um gene terapêutico.

20. Composição farmacêutica segundo uma qualquer das reivindicações 7 a 19, caracterizada pelo fato de compreender um veículo farmaceuticamente aceitávelpara uma formulação injetável.

21. Composição farmacêutica segundo uma qualquer das reivindicações 7 a 19, caracterizada pelo fato de compreender um veículo farmaceuticamente aceitávelpara uma aplicação sobre a pele e/ou sobre as mucosas.

22. Utilização de um composto segundo uma das reivindicações de 1 a 6,caracterizado pelo fato de ser empregado para a transfecção de células in vitro.