PT888379E

PT888379E - Compostos analogos a familia dos amidinios composicoes farmaceuticas que os contem e suas aplicacoes

Info

Publication number: PT888379E
Application number: PT97907154T
Authority: PT
Inventors: Jean-Marie Lehn; Pierre Lehn; Jean-Piere Vigneron
Original assignee: Centre Nat Rech Scient
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-28
Publication date: 2001-05-31
Also published as: JP4271260B2; NO311806B1; EP0888379B1; HU228072B1; DE69703878T2; AU723998B2; EP0888379A1; KR19990087372A; HUP9902465A1; NO983691L; ATE198599T1; WO1997031935A1; JP2000506136A; HUP9902465A3; DK0888379T3; SK283575B6; IL125926A0; US6143729A; KR100452062B1; NO983691D0

Description

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ΕΡ Ο 888 379/PT

DESCRICÃO “Compostos análogos à família dos amidínios, composições farmacêuticas que os contêm e suas aplicações” O presente invento refere-se a novos compostos análogos à família dos amidínios, e em particular aos guanidínios, às composições farmacêuticas que os contêm e às suas aplicações.

Mais precisamente, o presente invento refere-se a compostos de fórmula geral I e seus sais. R2 \ / R3

O —

RI

I na qual: - RI representa um derivado de colesterol; - R2 e R3 representam, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo de fórmula geral II, sendo pelo menos um de entre eles diferente de um átomo de hidrogénio, R5 Π. na qual: -nem representam, independentemente um do outro e de modo distinto, entre os grupos R2 e R3, um inteiro compreendido entre 0 e 4, 2 85 632 ΕΡ Ο 888 379/ΡΤ - R4 e R5 representam, independentemente um do outro um átomo de hidrogénio ou um grupo de fórmula EH, sendo pelo menos um de entre eles diferente de um átomo de hidrogénio, — ( CH2)p-(X)r NH2 NH2

X m na qual p e q representam, independentemente um do outro, um inteiro compreendido entre 0 e 4 e r é igual a 0 ou 1, sendo que para r igual a 1. X representa um grupo NH sendo então x igual a 1 ou X representa um átomo de azoto sendo então x igual a 2 e com p, q e r podendo variar independentemente entre os grupos R4 e R5.

Como sub-família preferida referiremos, mais particularmente, no quadro do presente invento, os compostos de fórmula geral I na qual R2 ou R3 representam, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo de fórmula IV NH2 // -[«S2)n^T-mt CH,^ na qual

n, m e p são definidos como anteriormente e R4 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo de fórmula V

V 3 85 632 ΕΡ Ο 888 379 / ΡΤ

(CH2) (ΝΗ)— CL 1 r χ ΝΗ2 com q e r definidos como anteriormente, e com m, n, p, q e r podendo variar de modo independente entre os diferentes grupos R2 e R3.

Estes novos produtos de fórmula geral (I) podem estar na forma de sais não tóxicos e farmaceuticamente aceitáveis. Estes sais não tóxicos compreendem os sais com ácidos os inorgânicos (ácidos clorídrico, sulfurico, bromídrico, fosfórico, nítrico) ou com os ácidos orgânicos (ácidos acético, propiónico, succínico, maleico, hidroximaleico, benzóico, fumárico, metanossulfónico ou oxálico) ou com as bases inorgânicas (soda, potassa, litina, cal) ou orgânicas (aminas terciárias como a trietilamina, a piperidina, a benzilamina).

Como compostos representativos de acordo com o invento podemos referir mais particularmente, os compostos com as sub-fórmulas gerais seguintes:

VI (H2N)2+C-NH -(CH2)2-NH-COO-Rl

[(H2N)2+C-NH-(CH,)3][(H2N)2C+-NH-(CH2)4]-N-COO-Rl vn [(H2N)2+C-NH-(CH2)2]2-N-(CH2)2-NH-COO-Rl vm [(H2N)2+C-(CH2)2]2N-COO-Rl

IX

[[(H2N)2+C-(CH2)2]2N-(CH2)2]2N-COO-Rl

X nas quais RI tem a definição anterior.

Como representantes dos guanidínios e amidínios reivindicadas, podemos referir mais particularmente os compostos com as sub-fórmulas VII, VIU e IX anteriores com RI representando um grupo colesterilo. Os três compostos serão identificados no que se segue, 4 85 632 ΕΡ Ο 888 379 / ΡΤ respectivamente, com a designação BGSC (BisGuanidinoEspermidinoColesterol) e BGTC (BisGuanidinoTrenColesterol) e BADC (biscloridrato de BisAmidínioDietilenotriamino-(Jolesterol).

Os compostos reivindicados são mais particularmente interessantes no plano terapêutico pelo seu carácter não tóxico e pelas suas propriedades anfifílicas. Tendo em conta estas qualidades, eles podem ser utilizados particularmente, para a complexação de ácidos nucleicos na perspectiva de uma sua transfecção celular. Estes compostos podem, assim, ser utilizados vantajosamente em terapia genética. O J. Biol. Chem. Vol. 270 (52) p. 31391-6 (1995) descreve agentes de transfecção do tipo poliaminacolesterol e seus grupos amidínio.

Os compostos VII (BGSC) e VIII (BGTC) são mais particularmente vantajosos para a transferência de genes in vivo. Estes dois compostos complexam-se com o ADN e protegem-no contra a degradação devida às variações de pH aquando do transporte para a célula a tratar. O invento refere-se, consequentemente, a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um composto de acordo com o invento. Numa concretização preferida do invento, o composto é o BisGuanidinoEspermidinoColesterol (BGSC) e noutra concretização o composto é o BisGuanidinoTrenColesterol (BGTC). A terapia genética tem por objectivo principal a correcção das doenças genéticas associadas a um defeito de expressão e/ou a uma expressão anormal, ou seja deficiente ou excessiva, de um ou vários ácidos nucleicos. Tenta-se suprir este tipo de anomalias genéticas através da alteração da expressão celular in vivo ou in vitro, de genes clonados.

Hoje em dia, são propostos vários métodos para a distribuição intracelular deste tipo de informação genética. Uma das tecnologias actualmente utilizada apoia-se precisamente no uso de vectores químicos ou bioquímicos. Estes vectores sintéticos têm duas funções principais, compactar o ADN a transfectar e promover a sua fixação celular bem como a sua passagem através da membrana plasmática e, sendo esse o caso, através das duas membranas nucleares. Lípidos catiónicos carregados positivamente, como o cloreto de N-[l-(2,3-dioleiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamónio (DOTMA) foram deste modo propostos. Vantajosamente, eles interactuam espontaneamente, na forma de lipossomas ou de pequenas vesículas, com o ADN que está carregado negativamente para a formação de complexos 5 85 632

ΕΡ Ο 888 379/PT lípidos-ADN capazes de se fundirem com as membranas celulares, permitindo deste modo a distribuição intracelular do ADN. No entanto, no caso particular do DOTMA, a sua boa eficiência ao nível da transfecção permanece, lamentavelmente, associada a um defeito na biodegrabilidade e a um carácter tóxico relativamente às células.

Depois do DOTMA, foram desenvolvidos outros lípidos catiónicos com base nesse modelo de estrutura: grupn lipófilo associado a um grupo amino através de um braço referido como “spacer”. De entre estes podemos mais particularmente referir aqueles que compreendem, como grupo lipófilo, dois ácidos gordos ou um derivado do colesterol, e compreendendo, para além disso, sendo esse o caso, como grupo amino, um grupo amónio quaternário. Os DOTAP, DOBT, ou o ChOTB podem ser, nomeadamente, referidos como representativos desta categoria de lípidos catiónicos.

Para além da sua estrutura química e do seu carácter biodegradável, os compostos reivindicados respondem precisamente às exigências necessárias para um vector de transfecção de ácidos nucleicos. O presente invento visa portanto, igualmente, qualquer aplicação destes novos compostos na transfecção in vitro, ex vivo e/ou in vivo de células e, particularmente, para a vectorização de ácidos nucleicos. Ele refere-se em particular a qualquer composição farmacêutica compreendendo um ácido nucleico para além de pelo menos um composto de acordo com o invento.

Nas composições do presente invento, o ácido nucleico associado ao pelo menos um composto reivindicado, pode também ser um ácido desoxirribonucleico ou um ácido ribonucleico. Podem tratar-se de sequências oligonucleotídicas ou polinucleotídicas de origem natural ou artificial e, particularmente, de ADN genómico, ADNc, ARNm, ARNt, ARNr, sequências híbridas ou sequências sintéticas ou semi-sintéticas. Estes ácidos nucleicos podem ser de origem humana, animal, vegetal, bacteriana, virai, etc. Eles compreendem, de preferência, um gene terapêutico.

Um outro objecto do invento consiste, portanto, numa composição farmacêutica compreendendo também, um ácido nucleico. Preferencialmente esse ácido nucleico é um ácido desoxirribonucleico ou um ácido ribonucleico. Numa concretização preferida do invento, o ácido nucleico compreende um gene terapêutico

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No âmbito do invento, entende-se por gene terapêutico, nomeadamente qualquer gene que codifica um produto proteico com um efeito terapêutico. O produto proteico assim codificado pode ser uma proteína, um péptido, etc. Este produto proteico pode ser homólogo relativamente à célula alvo (ou seja um produto que é expresso normalmente na célula alvo quando esta não apresenta qualquer patologia). Neste caso, a expressão de uma proteína permite, por exemplo, atenuar uma expressão insuficiente na célula ou a expressão de uma proteína inactiva ou pouco activa devido a uma modificação ou, então, sobre-expressar a referida proteína. O gene terapêutico pode, também, codificar um mutante de uma proteína celular, com uma estabilidade melhorada, uma actividade modificada, etc. O produto proteico pode, igualmente, ser heterólogo relativamente à célula alvo. Neste caso, uma proteína expressa pode, por exemplo, completar ou trazer uma actividade deficiente à célula, permitindo-lhe lutar contra uma patologia, ou estimular uma resposta imunitária.

De entre os produtos terapêuticos no sentido do presente invento, podemos referir mais particularmente os enzimas, os derivados sanguíneos, as hormonas, as linfoquinas: interleucinas, interferões, TNF, etc (FR 9203120), os factores de crescimento, os neurotransmissores ou os seus percursores ou enzimas de síntese, os factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofina, etc, a distrofina ou uma minidistrofína (FR 9111947), a proteína CFTR associada à mucoviscidose, os genes supressores de tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), os genes que codificam para factores implicados na coagulação: Factores VII, VDI, IX, os genes que intervêm na reparação do ADN, os genes suicidas (timidina-quinase, citosina-desaminase), os genes da hemoglobina ou de outros transportadores proteicos, os genes correspondentes às proteínas implicadas no metabolismo dos lípidos, de tipo apolipoproteína escolhidos de entre as apolipoproteínas A-I, A-Π, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J e apo(a), os enzimas do metabolismo como, por exemplo, a lipoproteína lipase, a lipase hepática, a lecitina-colesterol-aciltransferase, a 7-alfa-colesterol-hidroxilase, a ácido fosfatídico-fosfatase, ou ainda proteínas de transferência de lípidos como a proteína de transferência dos ésteres de colesterol e a proteína de transferência dos fosfolípidos, uma proteína de ligação dos HDL ou ainda um receptor escolhido, por exemplo, de entre os receptores LDL, receptores de resíduos de quilomicra e os receptores “scavenger”, etc. O ácido nucleico terapêutico pode igualmente ser um gene ou uma sequência anti-sentido, cuja expressão na célula alvo permite controlar a expressão de genes ou a transcrição de ARNm celulares. Estas sequências podem, por exemplo, ser transcritas na célula alvo em ARN complementares de ARNm celulares e bloquear, deste modo, a sua tradução em proteína, de acordo com a técnica descrita na patente EP 140308. Os genes 7 85 632 ΕΡ Ο 888 379/ΡΤ terapêuticos compreendem, igualmente, as sequências que codificam ribozimas, que são capazes de destruir selectivamente os ARN alvo (EP 321201).

Tal como indicado anteriormente, o ácido nucleico pode igualmente compreender um ou vários genes que codificam um péptido antigénico, capaz de gerar, no homem ou no animal, uma resposta imunitária. Nesta concretização particular, o invento permite, consequentemente, a realização quer de vacinas quer de tratamentos imunoterapêuticos aplicados ao homem ou ao animal, particularmente contra microorganismos, vírus ou cancros. Podem ser particularmente péptidos antigénicos específicos do vírus de Epstein Barr, vírus HW, vírus da hepatite B (EP 185573), vírus da pseudo-raiva, vírus formadores de sincícios, outros vírus ou ainda específicos para tumores (EP 259212).

Preferencialmente, o ácido nucleico compreende igualmente sequências que permitem a expressão do gene terapêutico e/ou do gene que codifica o péptido antigénico na célula ou no órgão desejado. Pode tratar-se de sequências que são naturalmente responsáveis pela expressão do gene considerado, quando estas sequências são susceptíveis de actuar na célula infectada. Pode, igualmente, tratar-se de sequências de origem diferente (responsáveis pela expressão de outras proteínas ou mesmo sintéticas). Particularmente, pode tratar-se de sequências promotoras de genes eucariotas ou virais. Por exemplo, pode tratar-se de sequências promotoras provenientes do genoma da célula que se deseja infectar. Igualmente, podem ser sequências promotoras do genoma de um vírus. A este respeito podemos referir, por exemplo, os promotores dos genes EIA, MLP, CMV, RSV, etc. Adicionalmente, estas sequências de expressão podem ser modificadas por adição de sequências de activação, de regulação, etc. Podem ser o promotor indutor ou repressor.

Por outro lado, o ácido nucleico pode igualmente compreender, em particular, a montante do gene terapêutico, uma sequência de sinal dirigindo o produto terapêutico sintetizado nas vias de secreção da célula alvo. Esta sequência de sinal pode ser a sequência de sinal natural do produto terapêutico, mas pode igualmente ser qualquer outra sequência de sinal funcional, ou uma sequência de sinal artificial. O ácido nucleico pode igualmente compreender uma sequência de sinal que dirige o produto terapêutico sintetizado para um compartimento particular da cclula.

Os lípidos catiónicos descritos no presente invento e, em particular, o BGTC e o BGSC, têm capacidade de se complexar com o ADN e representam uma alternativa vantajosa aos vectores virais para a transferência in vitro, ex vivo ou in vivo de ácidos nucleicos de interesse terapêutico. Devido às propriedades químicas dos grupos guanidínio e 8 85 632 ΕΡ Ο 888 379 / ΡΤ em particular ao seu elevado pKa, estes lípidos catiónicos são capazes de proteger as moléculas do ADN contra as degradações devidas às variações de pH. Os resultados apresentados nos exemplos mostram que estes compostos permitem a transfecção de numerosos tipos celulares com uma grande eficiência. A eficiência da transfecção depende, em particular, da razão lípido catiónico/ADN nos complexos formados. Uma razão entre os dois compostos particularmente favorável para a transfecção consiste em ter 6 a 8 grupos guanidínio para um grupo fosfato do ADN. A eficiência da transfecção dos complexos lípido catiónico/ADN pode adicionalmente ser melhorada por adição de lípido neutro e formação de lipossomas catiónicos. Estes lipossomas são formados por um complexo entre o lípido catiónico e o lípido neutro. Este pode ser escolhido de entre: - a dioleoílfosfatidiletanolamina (DOPE), - a oleoílpalmitoílfosfatidiletanolamina (POPE) - o diestearoíl, -palmitoíl, -miristoílfosfatidiletanolamina - seus derivados N-metilados 1 a 3 vezes; - os fosfatidilgliceróis, - os diacilgliceróis, - os glicosildiacilgliceróis, - os cerebrosidos (tais como, particularmente, os galactocerebrosidos), - os esfingolípidos (tais como, particularmente, as esfmgomielinas) - e os asialogangliosidos (tais, como particularmente, os asialoGMl e GM2).

Utilizamos, preferencialmente, a DOPE.

Preferencialmente, o composto do invento e o lípido neutro estão presentes numa razão compreendida entre 1 e 5, mais preferencialmente 2 e 4. Para além disso a razão lípido total (composto do invento mais lípido neutro) para ADN é vantajosamente escolhida de modo a que a razão líquida entre cargas positivas esteja compreendida entre 2 e 5. Particularmente e vantajosamente, a razão é de cerca de 3. O invento refere-se então, igualmente, a qualquer composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com o invento, um lípido neutro e um ácido nucleico. Preferivelmente, o composto de acordo com o invento é escolhido de entre o BGTC e o BGSC. Igualmente e preferencialmente o lípido neutro é a DOPE. O ácido

85 632 ΕΡ Ο 888 379 / ΡΤ 9 nucleico é um ácido desoxirribonucleico ou um ácido ribonucleico. Preferencialmente, o ácido nucleico compreende um gene terapêutico.

Para além desta aplicação dos derivados de amidínio reivindicados, é igualmente possível considerar a sua valorização nas aplicações seguintes: interferência ao nível de interacções entre ácidos nucleicos e proteínas, resultando numa inibição ou estimulação de certos processos, por exemplo, de regulação da expressão genética ou da actividade enzimática (polimerase, transcriptase, etc.), complexação selectiva de espécies aniónicas para a sua extracção, sua eliminação ou sua detecção com o auxílio de sondas/eléctrodos de membrana, por exemplo, utilização como reagente de laboratório para a realização de operações de transfecção in vitro, etc.

Consequentemente, o presente invento tem igualmente por objecto qualquer aplicação terapêutica dos derivados de amidínio, tal como descritos anteriormente, seja directamente, seja no seio de composições farmacêuticas.

De preferência, as composições farmacêuticas do invento contêm igualmente um veículo farmaceuticamente aceitável para uma formulação injectável, particularmente, para uma injecção directa ao nível do órgão desejado, ou por uma administração por via tópica (sobre a pele e/ou mucosa). Podem ser, em particular, soluções estéreis, isotónicas, ou composições secas, particularmente, liofilizadas, que por adição, de acordo com o caso, de água esterilizada ou soro fisiológico, permitindo a constituição de solutos injectáveis. O presente invento será descrito mais completamente com o auxílio dos exemplos e figuras seguintes, que devem ser considerados como ilustrativos e não limitantes.

Figuras

Figura 1: Representação esquemática dos protocolos operatórios de preparação do BGSC e BGTC.

Figura 2: Representação esquemática dos protocolos operatórios de preparação do BADC.

Figura 3: Medição da eficiência de transfecção em função da razão composto lipídico/ADN. 10 85 632 ΕΡ Ο 888 379/ΡΤ

Figura 4: Medição da eficiência de transfecção em função da razão lípidos totais/ ADN.

Figura 5 : Medição do efeito do soro na eficiência de transfecção de células HepG2 (5A), HeLa (5B), NIH 3T3 (5C) e 293 (5D). Barras a cinzento: Presença de soro; Barras a branco: transfecções na ausência de soro, durante 2 h.

Figura 6: Fotografias de crio-secções de traqueias murinas que mostram a expressão do gene repórter no epitélio do aparelho respiratório após transfecção in vivo com lipossomas BGTC/DOPE. (6A) e (6B): Detecção da expressão da beta-galactosidase em células transfectadas, localizadas na superfície do epitélio (6A) e nas glândulas sub-mucosas (6B); (6C): Detecção de células que exprimem a beta-galactosidase nas glândulas sub-mucosas por marcação com imunoperoxidase utilizando um anticorpo monoclonal anti-beta-galactosidase; (6D): detecção de células que exprimem a luciferase nas glândulas sub-mucosas para marcação com imunoperoxidase utilizando um anticorpo policlonal anti-luciferase; (6E): coloração com imunoperoxidase: controlo negativo efectuado na ausência de anticorpos.

Figura 7: Medição da eficiência de transferência de genes in vivo por injecção intravenosa de um complexo ADN/BGTC-lipossoma.

Figura 8 : Medição da eficiência de transferência de genes in vivo por injecção intraperitoneal de um complexo ADN/BGTC-lipossoma. A: Preparação de derivados de acordo com o invento

Material e métodos 1. Medições físicas

Os espectros de ressonância magnética nuclear do protão (RMN 1H) foram registados num cspcctrómetro Brulcer AC200. Os desvios químicos são expressos em ppm relativamente ao TMS. 11 85 632 ΕΡ Ο 888 379/ΡΤ 2. Cromatografías em sílica

As cromatograiias em camada fina (CCF) foram efectuadas sobre placas de sílica-gel Merck com 0,2 mm de espessura.

As cromatoerafias em coluna foram efectuadas em sílica-gel 60 Merck com granulometria 0,040-0,063 mm.

Exemplo 1

Preparação do guanidinoespermidinocolesterol BGSC 1. Preparação do Di-Boc carbamato (1) A uma solução de 1 N,8N-Boc2-espermidina (0,690 g, 2 mmol) em CH2C12 (20 ml) é adicionada uma solução de cloroformato de colesterilo (0,9 g, 2 mmol) e Et3N (0,214 g, 2 mmol) em CH2C12 (40 ml)). Após refluxo durante 5 horas, a mistura é lavada com água (2x250 ml), seca sobre NajS04 e o solvente é evaporado. O produto em bruto é purificado por cromatografia em sílica-gel utilizando CH2Cl2/MeOH 95/5 como eluente para originar carbamato puro (1,3 g, 86%). 'H RMN, 6(CDC1,. 200MHzt: 0,5-2,5 (m, estrutura do colesterilo, sinal Boc e grupos centrais CH2 após a espermidina), 3,1-3,3 (m, 8H, N-CH2), 4,50 (m, 1H, H3a), 5,37 (d, 1H, H6). 2. Preparação do aminocarbamato (2) O composto (1) (1,3 g) é dissolvido em 20 ml de CH2C12 e a esta solução arrefecida (banho de gelo) são adicionados 2 ml de CF3C02H recém-destilado para a libertação dos grupos protectores BOC. Após agitação à temperatura ambiente durante 3 horas, são adicionados 50 ml de 'N NaOH e a mistura é extractada com CH2C12. As camadas orgânicas são lavadas com água, secas sobre NajSO,, e evaporadas para a obtenção do aminocarbamato (2) em bruto (0,945 g, 98%). Ή RMN. δ/CDCl··. 200 MHz): 0,5-2,5 (m, estrutura do colesterilo e grupos centrais após a espermidina), 2,7 (m, 4H, CH2-N-CO-), 3,25 (largo m, 4H, N-CH2) 4,49 (m, 1H, H3a), 5,35 (d, 1H, H6). 12 ΕΡ Ο 888 379/ΡΤ

3. Síntese do BGSC Ο carbamato (2) em bruto (0,y4 g) é dissolvido em 30 ml de THF/MeOH 85/15. Seguidamente são adicionados lH-pirazolocarboxamidina (0,495 g, 3,4 mmol) e di-isopropiletilamina (0,436, 3,4 mmol) em 30 ml de THF/MeOH 85/15. Após agitação à temperatura ambiente durante 18 horas são adicionados, lentamente, 250 ml de éter dietílico e o precipitado obtido é separado por decantação. O composto em bruto é suspenso três vezes em éter dietílico e separado por decantação para originar GSC puro (0,570 g, 47%). 1H RMN. ÓÍDMSO d61 200 MHzl 0,5-2,5 (m, estrutura do colesterilo e CH2 central), 3,1 (m, 8H, N-CHj), 4,3 (m, 1H, H3a), 5,3 (d, 1H, H6); 7,2 (largo s, 8H, NH2+), 7,8 (s, 2H, NH), Anal. Cale. para C37H67N702.2HC1, C, 62,15; H,9,67; N,13,71.

Resultado da análise elementar: C, 62,28; H, 9,81; N, 13,15.

Exemplo 2:

Preparação do guanidinotrencolesterol. BGTC 1. Preparação do Aminocarbamato (5)

Uma solução de cloroformato de colesterilo (1,8 g, 4 mmol) em 100 ml de CH2C12 é adicionada lentamente a uma solução saturada de tris(2-aminoetil)amina (TREN) (11,68 g, 80 mmol) em 400 ml de CH2C12. Após agitação à temperatura ambiente durante duas horas, a amina inerte é libertada por lavagem com água (3x100 ml) e após secagem sobre NajSO,,, o solvente é evaporado. Isola-se (5) na forma de tri-cloridrato do modo seguinte: o produto em bruto é dissolvido em 10 ml de MeOH e é adicionada, gota a gota, uma solução saturada de HC1 metanólico (5 ml); o precipitado obtido é separado por decantação e, para a obtenção de um composto puro, é suspenso três vezes em MeOH e separado por decantação. Após secagem em vácuo, é obtido o tri-cloridrato (6) puro (1,71 g, 64%). 1H RMN ófCDCl, + sCD,OD. 200MHzl. 0,5-2,4 (m, estrutura do colesterilo), 2,5 (m, 2H, CH2NHCO), 2,8 (largo s, 4H, +HN-CH2), 3,06 (largo s, 4H, CH2NH3+), 3,20 (m, 2H, +HN-CH2), 4,4 (m, 1H, H3o), 5,3 (d, 1H, H6), Anal. Cale. para C34H62N402.3HC1; C, 61,10; H, 9,80; N, 8,38. Resultado: C, 61,25; 11,9,96; N, 8,22.

2- Preparação do BGTC

Uma solução de cloroformato de colesterilo (2,24 g, 5 mmol) em 100 ml de CH2C12 é adicionada lentamente a uma solução muito saturada de tris(2-amino-etil)amma (TREN)

85 632 ΕΡ Ο 888 379/ΡΤ (29,2 g, 200 mmol) em 250 ml de CH2C12. Após agitação à temperatura ambiente durante 2 horas, a amina inerte é libertada por lavagem com água (3x100 ml) e após secagem sobre Na2S04, o solvente é evaporado. O produto em bruto (3,2 g) é dissolvido em THF/MeOH 50/50 (20 ml); seguidamente são adicionados à mistura lH-pirazolo-l-carboximidina (1,465 g, 10 mmol) e di-isopropilamina (1,3 g, 10 mmol). Após agitação à temperatura ambiente durante 18 horas, é adicionado éter dietílico e o precipitado obtido é separado por decantação. De modo a ser obtida uma amostra pura, o composto em bruto é suspenso três vezes em éter dietílico e é separado por decantação (2,15 g), 60% após secagem em vácuo. 1H RMNfDMSOdó. 200 MHzl: 0,5-2,0 (m, estrutura do colesterilo), 2,2 (m, 2H, N-CH2), 2,6 (largo s, 4H, N-CH2), 3,0 (d, 2H, N-CH2), 3,2 (largo s, 4H), 4,3 (m, 1H, H3a), 5,3 (d, 1H, H6), 7,3 (largo s, 8H, NH2+), 7,8 (largo s, 2H, NH). Anal. Cale. para C36H66N802,2HC1; C, 60,39; H, 9,57; N, 15,65. Resultado: C, 60,38; H, 9,67; N, 15,56.

Exemplo 3

Preparação do bis-cloridrato de bis amidínio BACD 1. Preparação do dinitrilo

Uma solução de cloroformato de colesterilo (8,97 g; 20 mmol) em CH2C12 (100 ml) é adicionada, gota a gota, a uma solução de iminopropionitrilo (2,46 g, 20 mmol) e Et3N (2,02 g, 20 mmol) em CH2C12 (100 ml). Após agitação à temperatura ambiente, durante 6 horas, é lavada com água (2x100 ml) e seca sobre NajSCX, O solvente é evaporado e o produto em bruto (10,5 g) é recristalizado em metanol. (8,59 g; 80%). 1H RMN ôfCDCli. 200 MHz). 0,5-2,5 (m, estrutura do colesterilo), 2,7 (m, 4H; -CH2CN), 3,62 (m, 4H, -CH2-N-), 4,50 (m, 1H, H3a), 5,39 (d, 1H, H6). 2. Preparação da ditioamida

Numa solução do dinitrilo, preparada como descrito anteriormente, (0,324 g, 6 mmol) e de dietilamina (0,884 g; 12 mmol) em DMF (30 ml), mantida a 50°C, é feita borbulhar durante 2 horas uma ligeira corrente de H2N. A solução azul é vertida em gelo e o precipitado assim obtido é separado por filtração. Este produto em bruto é dissolvido em CH2C12 e é lavado com água (2x50 ml). Após secagem sobre Na^O,,, o solvente é evaporado e o produto obtido é recristalizado duas vezes em metanol (1,86 g; 51,5%). 1H RMN 5fDMSOd6. 200 MHzl: 0,5-2,5 (m, estrutura do colesterilo), 2,67 (t, 4H, N-CH2), 3,50 (t, 4H, S=C-CH2), 4,3 (m, 1H, H3J, 5,33 (d, 1H, H6).

85 632 ΕΡ Ο 888 379 / ΡΤ 14 3. Preparação do bis-iodeto de ditioamidato A uma solução de ditioamida (0,603 g; 1 mmol) em acetona (20 ml) é adicionado iodeto de metilo (2 ml) e deixa-se repousar à temperatura ambiente durante 48 horas. O precipitado obtido é filtrado (0,741 g; 83,5%). Este produto é utilizado directamente sem purificação adicional. 4. Preparação do bis cloridrato de bis amidínio BADC.

Numa suspensão em refluxo do bis-iodeto (0,741 g; 0,83 mmol), obtida tal como anteriormente, em isopropanol (10 ml) faz-se borbulhar uma corrente de NH3 durante 2 horas, seguidamente o aquecimento ao refluxo é prosseguido durante 4 horas suplementares. O isopropanol é evaporado e o resíduo é retomado em metanol (10 ml). Após passagem desta solução sobre uma resina de permuta iónica básica, é feita passar uma corrente de ácido clorídrico no eluente e faz-se a evaporação até à secura. O bis cloridrato obtido deste modo é dissolvido num mínimo de etanol (cerca de 5 ml). É filtrado uma pequena quantidade de insolúvel e ao filtrado é adicionado um grande excesso de éter dietílico. É obtido um pó que é filtrado e seco (320 mg; 60%). Uma recristalização em isopropanol permite isolar o produto esperado, sob uma forma analiticamente pura. 1H RMN (DMSOdó. 200 MHzl: 0,5-2,6 (m, estrutura do colesterilo e -CH2-amidínio), 3,57 (s, largo 4H, N-CH2), 4,3 (m, 1H, H3a), 5,3 (d, 1H, H6), 8,64 (s, largo; 2H; NHj), 9,07 (s; largo; 1H; NH), 9,18 (s; largo; 2H).

Anal. Cale? para C34H56N402.2HC1: C, 65,25; H, 9,32; N, 8,94. Resultado C, 65,40; H, 9,87; N, 9,55. B: Utilização de derivados de acordo com o invento para a transferência de genes in vitro e in vivo

Materiais e métodos 1 - Os ensaios de transfecção que se seguem são efectuados com BGSC e BGTC preparados de acordo com os protocolos descritos nos Exemplos 1 e 2. 2 - Preparação de lipossomas 15 ΕΡ Ο 888 379/ΡΤ

Uma mistura de lípido catiónico e DOPE (numa razão molar de 3/2) em clorofórmio (CHC13) é evaporada sob vácuo e recolocada em suspensão numa solução de tampão HEPES 20 mM a PH 7,4 sob uma atmosfera de N2. A concentração final em lípido é de 1,2 mg/ml. A mistura é misturada em vórtice durante 5 min., depois sujeita a ultra-sons durante 5 min. com um aparelho Branson Ultrasonic 2210 e finalmente armazenada a +4°C durante 24 h para hidratação. A dispersão resultante é tratada de novo (Sonifier Branson 450) durante 5 a 10 min para a formação dos lipossomas.

Após centrifugação, a solução é filtrada num filtro com diâmetro de poro de 0,22μ (Millex GS, Millepore) e armazenada a +4°C. O tamanho dos lipossomas que contêm BGSC ou BGTC e foi estudado com o auxílio de um aparelho de difracção laser (Autosizer 4700, Malvem Instruments). Este estudo mostra um pico único correspondente a um diâmetro médio de 50 nm em análise multimodal por números. 3 - Culturas celulares A origem (espécie e tecidos) da maior parte das- linhas celulares utilizadas nas experiências de transfecção é apresentada na Tabela I.

As células da linha celular HeLa (P Briand, ICGM Paris) são derivadas de um carcinoma humano de origem epitelial cervical.

As células NIH 3T3 (C Lagrou, Instituí Pasteur, Lille) são fibroblastos de ratinho. A linlia celular NB2A (C. Gougct, Paris) c derivada de um neuroblastoma de ratinho.

Todas as células com a excepção das células AtT-20 e PC12, foram cultivadas em meio Dulbecco modificado (DMEM, GIBCO) complementado com 10% de soro de bovino fetal (FCS; GIBCO), penicilina a 100 unidades/ml (GIBCO) e estreptomicina (GIBCO) a 100 pg/ml. 16 85 632 ΕΡ Ο 888 379/ΡΤ

As células AtT-20 foram cultivadas em DMEM/F12 (GEBCO) complementado com 10% de soro de bovino fetal.

As células PC 12 foram cultivadas em DMEM complementado com 10% de FCS e 5% de soro de cavalo.

Todas as células foram mantidas em cultura em caixas plásticas (Falcon) sob atmosfera húmida a 5% de C02. 4 - Plasmídeos

Os plasmídeos pRSV-Luc (O. BENSAUDE, ENS, Paris) e pRSV-nlsLacZ foram amplificados em E. Coli e preparados por purificação em gradiente de CsCl por técnicas padrão. No plasmídeo pRSV-nlsLacZ e no plasmídeo pRSV-Luc, o gene LacZ de E. Coli e a sua sequência de sinal de localização nuclear e o gene da luciferase estão, respectivamente, sob o controlo transcripcional de LTR/RSV (Rous Sarcoma Viras). O plasmídeo pXL2774 compreende o gene que codifica a luciferase sob o controlo do promotor do citomegaloviras (CMV). 5 - Protocolo de transfeccão in vitro

No dia anterior à transfecção são colocadas 2x105 células por alvéolo (placas de 6 alvéolos Falcon).

Cada alvéolo contém uma linha celular diferente.

Deste modo, no dia da transfecção as células estão semi-confluentes. O ADN plasmídico (5 pg) e a quantidade desejada de lípido bis-guanidínio foram, cada um, diluídos em 250 μΐ de DNEM sem FCS e misturados em vórtice. Após cerca de 5 min. os duos soluções foram deixadas a incubar à temperatura ambiente durante 15 min. A mistura de transfecção é, então, adicionada às células (0,5 ml por alvéolo) que foram lavadas com um meio sem soro. Após 4 a 6 horas de incubação a 37°C, é adicionado 1 ml de meio com soro a cada alvéolo sem que se tenha removido a mistura de transfecção. 24 horas após a transfecção, o meio é substituído por 1 ml de meio de cultura fresco. As células são recolhidas 2 dias após a transfecção para a medição da expressão da luciferase. 17 85 632 ΕΡ Ο 888 379 / ΡΤ

Foram feitas transfecções testemunha utilizando agentes de transfecção comercializados: - a lipopoliamina Transfectam® (JP Behr, Estrasburgo, França) foi utilizada em solução alcoólica numa razão óptima de cargas iónicas Transfectam®/ADN 6-8. - a Lipofectin® (Life Techonologies Inc., Cergy Pontoise, França) que é uma formulação de lipossomas tendo como lípido neutro a DOPE e como lípido catiónico o DOTMA. (cloreto de N[l(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamónio).

Os complexos ADN/Lipossomas foram obtidos nas condições padrão recomendadas pelo fabricante. - foram transfectadas células por precipitação com fosfato de cálcio (Keown, W.A., Campbell, C.R.; Kucherlapati, R.S. (1990) Methods in Enzymology·. Academic Press: New York, 185, 527-537). 6 - Medição da luciferase nara as transfecções realizadas in vitro A actividade de luciferase foi medida 48 após transfecção utilizando uma variante do procedimento de De Wet et al. (De Wet, J.R., Wood, K.V., DeLuca, M., Helinski, D.R. & Subramani, S. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 725-737). - o meio de cultura é removido. - as células são lavadas com uma solução salina de tampão fosfato fria. - seguidamente são lisadas por incubação em 250 μΐ de tampão de lise (trifosfato 25mM, pH 7,8, MgCl2 8 mM, ditiotreitol 1 mM, 15% de glicerol e 1% de triton X-100). - c obtido um lisado claro após eliminação dos materiais insolúveis por centrifugação (15 mm a +4°C) num microcentrifugador. - uma aliquota (20 μΐ) de extracto celular é diluída em 100 μΐ de tampão de lise ao qual são adicionados 9 μΐ de ATP 25mM (sigma) e 20 μΐ de luciferina 25mM (sigma).

85 632 ΕΡ Ο 888 379/ΡΤ - as amostras são colocadas num luminómetro (Lurmet LB9501 Berthold, Nashua, NH) e é medida a emissão luminosa durante 10 segundos. O estabelecimento da curva RLU/Luciferase foi feito utilizando diferentes diluições de luciferase de pirilampo purificada (sigma) e mostra que a parte linear da curva vai de 104 a 107 RLU (unidades relativas de luz). A concentração de proteína foi medida pelo teste BCA (ácido bicinconínico) utilizando albumina de soro bovino como testemunha.

Os dados para a actividade de luciferase são expressos em RLU/mg de proteína. 7 - Protocolo de inieccão in vivo ao nível das vias respiratórias do ratinho

Os ratinhos utilizados são ratinhos macho OF1 (peso 30 g) provenientes de Iffa-Credo (Lyon, França). Foram utilizados lipossomas catiónicos BGTC/DOPE (razão molar 3:2). A mistura de transfecção é obtida a partir de 10 pg de ADN plasmídico (em 10 μΐ de água), 20 μΐ de lipossomas catiónicos num meio Hepes 20mM (pH 7,4), a uma concentração lipídica total de 5 mg/ml. Os agregados ADN/lípidos formados deste modo possuem uma razão de carga da ordem de 6.

Após anestesia dos ratinhos com pentobarbital, a mistura de transfecção (30 μΐ) é injectada nas vias respiratórias por instilação intratraqueal através de uma cânula inserida no lúmen traqueal. 48 horas após a instilação, os animais são sacrificados por uma “overdose” de pentobarbital e os pulmões e as traqueias são colhidos para análise. 8 - Coloração com X-gal

Para dosear a expressão da beta-galactosidase de E. Coli nas culturas primárias, as células são impregnadas durante 15 minutos a 4°C com uma solução de paraformaldeído a 4% e são incubadas, seguidamente, com a X-gal de substrato beta-galactosidase cromogénica (Sigma). A coloração azul dos núcleos das células transfectadas é doseada por microscopia por luminescência. 19 85 632 ΕΡ Ο 888 379 / ΡΤ 9 - Dosagem de células X-gal ao nível das vias respiratórias transfectadas in vivo

Para a detecção de células X-gal ao nível das vias respiratórias, os pulmões e traqueias são tratados durante 1 h com paraformaldeído a 4%, imersos seguidamente durante uma noite em PBS contendo 30% de sacarose, depois incorporados num meio de congelação e são congelados com azoto líquido. Secções de criostatos com 5 μ são, seguidamente, coloradas quanto à actividade de β-galactosidase por incubação durante uma noite com o reagente X-gal (Sigma). 10 - Dosagem da luciferase ao nível das vias respiratórias transfectadas in vivo

Para dosear a actividade de luciferase proveniente de transfecções in vivo, são colocados fragmentos de tecidos em presença de 30 μΐ de tampão de lise (Tris-fosfato 25mM pH 7,8, ditiotreitol 1 mM (DTT), 15% de glicerol e 1% de Triton X-100) Usados em cerca de 1 min. com um homogeneizador (Polylabo, Estrasburgo, França) e conservados em gelo. Após centrifugação, são utilizados 20 μΐ do lisado para a dosagem. A actividade de luciferase é expressa em RLU por mg de proteína. 11 - Protocolo de imuno-histoQuímica

Criosecções de amostras de pulmões e traqueias são incubados durante 1 h com anticorpos monoclonais murinos, anti-P-galactosidase de E. Coli a 5 pg/ml (Genzyme, Cambridge, MA) ou com anticorpos policlonais de coelho, diluição 1:400 (Promega). A proteína β-galactosidase de Escherichia coli é doseada por coloração com imunoperoxidase utilizando um anticorpo secundário anti Ig de ratinho marcado com biocina (Boeringer) e com um conjugado estreptavidina-POD (Boehringer). A proteína luciferase é doseada por coloração com imunoperoxidase utilizando um anticorpo de cabra anti-coelho (ICN Biomedicals, Inc.) e o sistema peroxidase-antiperoxidase de coelho (PAP) (Dako Glostrup, Dinamarca). As secções foram examinadas por microscopia de luminescência. São efectuados controlos negativos sem anticorpos.

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Exemplo 4

Transfeccões in vitro a razões diferentes de agente de transfeccão/AND

Com o fim de optimizar a eficiência de transfecção obtida com os agregados BGTC/ADN, o requerente estudou a influência da razão BGTC/ADN sobre a taxa de transfecção em 3 tipos diferentes de células de mamíferos conhecidos pela sua relativa sensibilidade aos métodos de transfecção clássica. Os resultados apresentam-se na Figura 3.

Foram, então, realizadas experiências de transfecção com fibroblastos murinos 3T3, células epiteliais humanas HeLa e neuroblastomas de ratinho NB2A. No decurso destas experiências uma certa quantidade fixa de plasmídeo pRSV-Luc é feita contactar com quantidades varáveis de BGTC em solução. Para determinar o intervalo da razão a estudar, a requerente partiu do principio que um pg de ADN equivale a 3 nm de fosfato carregado negativamente, e que apenas dois grupos guanidínio estavam carregados positivamente ao pH neutro de formação dos agregados e de transfecção. E medida a actividade de luciferase 48 h após a transfecção. A expressão da luciferase é máxima para os agregados que contêm de 6 (células HeLa) a 8 (células 3T3, NB2A) grupos guanidínio para um grupo fosfato do ADN, ou seja agregados com uma carga positiva importante.

Exemplo 5

Transfeccões in vitro com diferentes tipos celulares A transferência de genes por intermédio de lípidos catiónicos é uma técnica de transfecção atractiva não apenas pelo facto de ela não necessitar de intermediários, mas também porque ela permite transfectar uma grande variedade de células de tecidos e organismos diferentes. Para estudar a amplitude da eficiência do BGTC como agente de transfecção, foram testadas várias linhas celulares de diversas origens. Os resultados estão expostos na Tabela 1 seguinte. A razão de cargas foi escolhida entre 6 a 8 para uma eficiência máxima. De modo a estabelecer uma comparação, células das mesmas linhas foram igualmente transfectadas utilizando por um lado uma lipopoliamina e por outro fosfato de cálcio. Os resultados mostram que o BGTC é normalmente tão eficaz quanto o Transfectam e duas vezes mais eficaz do que o fosfato de cálcio. 21 85 632 ΕΡ Ο 888 379 / ΡΤ

Tabela 1: Expressão da luciferase em diferentes linhas celulares de mamíferos transfectados por BGTC, fosfato de cálcio ou Transfectam® RLU/mg de proteínas celulares Espécies Linhas celulares Tecidos BGTC Fosfato de cálcio Transfectam® Humana A549 Carcinoma do pulmão 4 x 105 7 x 103 3,1 x 10s Macaco COS-7 Rim transformada por SV40 2,1 x 107 3,7 x 105 8,4x106 Cão MDCK-1 Rim 3x 106 4,5 x 10s 2,2 x 106 Ratazana RIN-m5F Célula tumoral de ilha pancreática 2x 107 2x 105 3,3 x 105 ROS Osteossarcoma 4,0 x 106 4,5 x 105 2,3 x 106 PC12 Feocromocitoma 3x 107 1,7 x 105 6x 106 Ratinho AtT-20 Tumor pituitário 2x 107 8x 105 3 x 107

Todas as transfecções foram efectuadas pelo menos duas vezes (n>2).

Exemplo 6

Transfecções in vitro na presença de um lípido neutro

Sendo o composto BGSC é menos solúvel em meio aquoso que o BGTC, a requerente utilizou o primeiro na forma de lipossomas na presença de um lípido neutro a DOPE (dioleoílfosfatidiletanolamina). As formulações são preparadas numa razão molar de 3/2. Uma segunda preparação contendo desta vez BGTC foi igualmente preparada com a DOPE nas mesmas condições.

6.1 - Determinação da razão lípido total/ADN O requerente, em primeiro lugar, determinou a razão lípido/ADN no decurso de uma experiência de transfecção em células HeLa. A curva obtida está representada na Figura 4. Os óptimos de transfecção são obtidos para razões de lipossomas BGSC/ADN compreendidas entre 1,5 e 5, com um centro em 2,5-3. Os grupos guanidínio estavam protonados a pH neutro, os melhores agregados BGSC-DOPE/ADN têm uma carga positiva de cerca de 3 (Figura 4).

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As melhores razões BGSC-DOPE/ADN são assim inferiores às obtidas com agregados do tipo BGTC/ADN (entre 6 e 8). A transfecção na presença de lipossomas catiónicos é facilitada pela presença do DOPE e pelas suas propriedades fusogenéticas. 6.2 - Transfecção de diferentes linhas celulares para lipossomas catiónicos O requerente procedeu a experiências de transfecção em diferentes linhas celulares utilizando formulações de lipossomas catiónicos BGSC-DOPE e BGTC-DOPE em razões molares de 3/2. A razão de cargas guanidínio dos lípidos/fosfatos do ADN é de cerca de 2,5 (~3) para estes dois sistemas de transferência de genes. Uma transfecção com a Lipofectin® serve de testemunha. Os resultados estão expostos na Tabela 2 seguinte.

Estes resultados mostram que os derivados do colesterol, compreendendo de grupos guanidínio na forma de lipossomas catiónicos são pelo menos tão eficazes para a transfecção quanto a Lipofectin. Estes resultados podem, bem entendido, ser optimizados para cada linha celular.

Tabela 2: Expressão da luciferase em diferentes linhas celulares eucariotas transfectadas por meio de lipossomas BGSC/DOPE, lipossomas BGTC/DOPE e de Lipofectin®

RLU/mg de proteínas celulares Linhas celulares lipossomas BGSC lipossomas BGTC Lipofectin® HeLa 4,6 x 106 7,7 x 106 3,3 x 106 A 549 6x 105 2x 105 4 x 106 COS-7 ND 1,4 x 107 9,5 x 10" MDCK-1 1 x 106 7 x 106 1,9 x 10' ROS ND 9x 106 6x 106 NB2 Aa 1,5 x 107 1,4 x 107 ND NIH 3T3a 7x 106 1,5 x 106 ND

Todas as transfecções foram feitas pelo menos três vezes (n>3). a: medida média em RLU da actividade de luciferase para 100 pg/500 pg de lisado total (n>4).

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Exemplo 7

Estudo do efeito da presença de proteínas séricas na eficiência da transferência de genes in vitro A maior parte das composições de transfecção à base de lípidos catiónicos apresenta uma eficiência diminuída na presença de soro. Este exemplo tem por objecto testar a sensibilidade dos compostos do invento ao efeito do soro. 7.1 - Formulações de lípidos catiónicos

Os lípidos descritos no invento são solubilizados em etanol. i) são obtidas soluções de «lipossomas» na presença de DOPE como se segue: a DOPE (AVANTI) em solução em clorofórmio é adicionada às soluções de lípido em etanol, numa razão molar lípido catiónico/DOPE de 3/2. Após evaporação até à secura as misturas são retomadas em água e aquecidas a 50°C durante 30 minutos; ii) são obtidas soluções de «micelas» de acordo com o protocolo descrito para a obtenção de «lipossomas» mas a solução DOPE foi substituída por clorofórmio.

As soluções foram todas ajustadas a lOmM em lípido catiónico. 7.2 - Ácido nucleico O ácido nucleico utilizado é o plasmídeo pXL2774. 7.3 - Misturas citofectantes (preparação extemporânea) O ADN foi diluído a 20 pg/ml em NaCl 150 mM e as diferentes formulações de lípido catiónico são diluídas em água a 40, 80, 120 e 160 μΜ. As soluções de ADN e de lípido são misturadas volume a volume que origina razões em nmoles/pg de ADN respectivamente de 2, 4, 6 e 8; a concentração salina é de 75 mM. 7.4 - Transfeccões 24 85 632 ΕΡ Ο 888 379 / ΡΤ

As células são cultivadas em condições adequadas em microplacas de 24 poços (2 cmVpoço) e são transfectadas quando estão em fase exponencial de crescimento e a 50-70% da confluência. As células são lavadas por 2 vezes com 500 μΐ de meio desprovido de proteínas séricas e repostas em crescimento em meio sem soro [transfecção na ausência de soro] ou em meio completo [transfecção na presença de soro], e são adicionadas às células 50 μΐ de mistura citofectante [0,5 pg ADN/alvéolo] [3 poços/condição lípido-ADN],

Quando as células são transfectadas na «ausência de soro» o meio de crescimento è suplementado com a quantidade adequada de soro, 2 horas após a transfecção. A eficiência da transfecção é avaliada por uma medida da expressão da luciferase de acordo com as recomendações dadas para a utilização do conjunto Promega [sistema de ensaio de Luciferase]. A toxicidade das misturas citofectantes é estimada por uma medida de concentrações proteicas nos lisados celulares. 7.5 - Resultados (Figura 5)

Os resultados obtidos com quatro tipos celulares [NIH3T3 - 293 - HepG2 - HeLa] mostram que, nas condições testadas, as formulações em forma de «lipossomas» são mais eficazes do que aquelas em forma de «micelas». Por outro lado, contrariamente ao que é observado com a maior parte das preparações citofectantes contendo lípidos catiónicos, não foi possível pôr em evidência, nas condições de transfecção, qualquer efeito inibidor significativo ligado à presença do soro pelo BGTC sob a forma de «lipossomas» ou de «micelas».

Exemolo 8

Expressão in vivo de transeene nas vias respiratórias de ratinhos com lipossomas BGTC/DOPE

Para realizar o referido em epígrafe, utilizámos lipossomas catiónicos BGTC/DOPE. A obtenção dos agregados ADN/lipossomas e o protocolo de administração são efectuados de acordo com o descrito em material e método.

As células X-gal são detectadas no epitélio das vias respiratórias dos ratinhos tratados 48 horas após transfecção ao nível das células do plasmídeo LacZ, com o auxílio de lipossomas BGTC/DOPE. Os resultados são apresentados na Figura 6.

85 (532 ΕΡ Ο 888 379/ΡΤ 25 A maior parte das células transfectadas estão localizadas na traqueia e apenas algumas células X-gal são observadas nas vias respiratórias secundárias Este tipo de distribuição foi já referido noutras transfecções celulares.

Efectuámos adicionalmente uma imuno-histoquímica para identificar o produto do gene repórter. Maioritariamente são as células maduras que são transfectadas ao nível da superfície do epitélio (Figura 6A). Estes dados mostram que os lipossomas catiónicos têm capacidade de induzir a transfecção de genes em células não proliferativas e totalmente diferenciadas do epitélio das vias respiratórias. A expressão do transgene é igualmente detectada nas glândulas sub-mucosas (Figura 6B). A detecção por marcação imunológica das células transfectadas, utilizando um anticorpo monoclonal dirigido contra a β-galactosidase de E. coli, confirma esta expressão nas glândulas sub-mucosas e no epitélio de superfície (Figura 6C). A expressão transgénica é igualmente posta em evidência nas glândulas sub-mucosas por coloração de imunoperoxidase com um anticorpo dirigido contra a proteína luciferase após transfecção de p RSV-Luc com BGTC/DOP (Figura 6D). São efectuados controlos negativos sem anticorpos (Figura 6E).

Estes resultados têm um interesse muito particular para a terapia genética dirigida contra a muscovidose. Com efeito, para tratar esta patologia, é necessário alvejar as glândulas sub-mucosas que são o local principal da expressão de CFTR nos brônquios humanos.

Exemplo 9

Dosagem quantitativa da eficiência de transfectacão de BGTC/DOPE in vivo

Para realizar o referido em epígrafe, os pulmões e a traqueia de ratinhos, tratados com lipossoma BGTC/DOPE e com plasmídeo pRSV-Luc nas condições descritas no Exemplo 8, são colhidas 48 horas após a transfecção e a actividade de luciferase é doseada de acordo com o prolocolo descrito cm material c método.

Os resultados são apresentados na Tabela 3 seguinte.

85 632 ΕΡ Ο 888379/ΡΤ VECTORES ACTIVIDADE DE LUCIFERASE (RLU/mg proteína) BGTC/DOPE lipossomas: pRSV-Luc 2,8 x 105 (média: 3 x 104 - 8 x 105) pRSV-Lac Z 0 ADN nu pRSV-Luc 0 A actividade de luciferase é detectada de maneira sistemática nos homogeneizados de traqueia mas não nos dos pulmões. Essa observação está de acordo com os resultados anteriores obtidos aquando do exame da distribuição de células positivas a Xgal. Fazemos notar que a expressão de luciferase está directamente ligada ao plasmídeo de expressão, tuna vez que não foi possível detectar qualquer actividade na testemunha contendo o plasmídeo LacZ. Como testemunha foi igualmente realizada uma transfecção do plasmídeo sem vector. Não é observado neste ensaio testemunha qualquer prova de expressão de luciferase.

Estes dados evidenciam a eficiência dos lipossomas BGTC/DOPE para a transfecção genética in vivo das vias respiratórias.

Exemnlo 10

Transferência de gene in vivo por inieccão intravenosa ou intraperitoneal As formulações dos lípidos catiónicos e de ADN são descritas no Exemplo 7. 10.1 - Efeito da dose dos lípidos catiónicos (Figuras 7-8)

Os ratinhos BalbC, com 5 semanas de idade, são injectados por via intravenosa (veia da cauda) ou intraperitoneal com 200 μΐ de mistura transfectante em solução em NaCl 37,5 mM, glucose a 5% e a expressão da luciferase foi pesquisada às 24 horas pós-transfecção no pulmão após injecção intravenosa e no fígado e no baço após injecção intraperitoneal. Os órgãos foram colhidos a frio com um tampão de lise [Promega EI 53A], com a adição de inibidores de protease [Boehringer 1697498] e foram homogeneizados com um triturador 27 27

Lisboa,

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Heidolph DIAX600. A actividade de luciferase foi pesquisada no sobrenadante de 14.000 g de extractos tissulares.

Inieccão intravenosa

Cada ratinho recebe 50 pg de ADN complexado para diferentes concentrações de BGTC sob a forma de «lipossomas». A razão óptima em nanomoles de lípido catiónico/pg ADN observada é 9 (Figura 7); não foi possível pôr em evidência qualquer toxicidade para doses que iam até a 900 nanomoles de BGTC injectado.

Inieccão intraperitoneal O BGTC em forma de «lipossomas» foi injectado com 100 pg de ADN por ratinho. Tanto no fígado (figura 8B) como no baço (figura 8A), o máximo de expressão é obtido para 1.5 nanomoles BGTC/pg de ADN. 10.2 - Cinética de expressão após injecção intravenosa

Pesquisámos a biodistribuição da expressão da luciferase em 7 órgãos em função do tempo que se segue à injecção de 200 pl de misturas «lipossomas» BGTC/ADN em NaCl 37.5 mM, glucose a 5% [50 pg ADN e 9 nanomoles BGTC/pg ADN] na veia da cauda de ratinhos BalbC com 5 semanas de idade. Os resultados são expressos em picograma de luciferase extraída por órgão, seguindo uma curva de calibração com luciferase comercializada sob a forma cristalizada. O limite de detecção situa-se entre 0,5 e 1 picograma de luciferase. É evidenciado que, nas condições testadas, o máximo de expressão é obtido a 23 horas pós-transfecção para 6 dos 7 órgãos estudados, a saber o diafragma, gastrocnémio, coração, pulmão, rim e baço. A expressão ao nível do fígado parece mais precoce. O máximo de expressão foi obtido ao nível pulmonar com uma taxa de 0,5 nanogramas a 23 horas pós-transfecção. -5. K& 2001

Por CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) - O AGENTE OFICIAL - )W? EN6.* ANTÓNIO J0Â0 DA CUNHA FERREIRA A$. 0|. Pr. Ind.

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1SSO LISBOA

Claims

85 632 ΕΡ Ο 888 379 / ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1 - Composto de fórmula I e seus sais O II

RI R3 I na qual: RI representa um derivado de colesterol; R2 e R3 representam, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo de fórmula geral Π, sendo pelo menos um de entre eles diferente de um átomo de hidrogénio,

na qual: nem representam, independentemente um do outro e de modo distinto, entre os grupos R2 e R3, um inteiro compreendido entre 0 e 4, R4 e R5 representam, independentementé um do outro um átomo de hidrogénio ou um grupo de fórmula III, sendo pelo menos um de entre eles diferente de um átomo de hidrogénio, // (CH2)p-(X)r -(CHaV— NH2 NH2

na qual -> x

85 632 ΕΡ Ο 888 379/ΡΤ 2/5 ρ e q representam, independentemente um do outro, um inteiro compreendido entre 0 e 4 e r é igual a 0 ou l, sendo que para r igual a 1. X representa um grupo NH sendo então x igual a 1 ou X representa um átomo de azoto sendo então x igual a 2 e com p, q e r podendo variar independentemente entre os grupos R4 e R5. caracterizado por R2 e R3 de hidrogénio ou um grupo de
2 - Composto de acordo com a reivindicação 1 representarem, independentemente um do outro, um átomo fórmula geral IV NH2 //-[(a^)n_NÍ^i(CH2)p“Css nh2 IV na qual n, m e p são definidos como anteriormente e R4 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo de fórmula V NH2 NH2 // — (CH2)—(NH)-CL 4 r V com q e r definidos como anteriormente, e com m, n, p, q, e r podendo variar de modo independente entre os diferentes grupos R2 e R3.
3 - Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por se tratar de um composto representado por uma das sub-fórmulas gerais seguintes: VI (H2N)2+C-NH-(CH2)2-NH-COO-Rl

\ 85 632 ΕΡ Ο 888 379 / ΡΤ 3/5 [(H2N)2+C-NH-(CH2)3][(H2N)2C+-NH-(CH2)4]-N-COO- R1 νπ [(H2N)2+C-NH-(CH2)2]2-N-(CH2)2-NH-COO-Rl [(H2N)2+C-(CH2)2]2N-COO-Rl [[(H2N)2+C-(CH2)2]2N-(CH2)2]2N-COO-Rl νιπ IX X nas quais RI é definido de acordo com a reivindicação 1.
4 - Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações caracterizado por ser escolhido de entre [[(H2N)2+C-(CH2)2]2N-(CH2)2]2N-COO-Rl [(H2N)2+C-NH-(CH2)3][(H2N)2C+-NH-(CH2)4]-N-COO-Rl e [(H2N)2+C-(CH2)2]2N-COO-Rl nos quais RI representa um grupo colesterilo
5 - Composto de acordo com uma das reivindicações anteriores caracterizí 3P-0[N-(3-guanidinopropil)-N-(4-guanidinobutil)]carbamoílcolesterol (“BGSC”).
6 - Composto de acordo com uma das reivindicações anteriores caracterizí 3P-0-[N-(N’,N’-bis-(2-guadininoetil)-2-aminoetil)carbamoílcolesterol] (“BGTC”)
7 - Composição farmacêutica caracterizada por compreender pelo r composto de acordo com uma das reivindicações anteriores. anteriores
8 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o composto ser 3 P-0-[N-3-guanidinopropil)-N-(4-guanidinobutil)carbamoílcolesterol (“BGSC”).

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9 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o composto ser 3 β-0-[Ν-(ΝΓ’,Ν’-0ί8-(2-§^^ϊηίηο6ύ1)-2-3ηιίηοεΙϊ1)ο3Γ03Πΐοί1ο-οοΐ68ί6Γθ1] (“BGTC”).
10 - Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada por conter adicionalmente um ácido nucleico.
11 - Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o ácido nucleico ser um ácido desoxirribonucleico.
12 - Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o ácido nucleico ser um ácido ribonucleico.
13 - Composição de acordo com uma das reivindicações 10 a 12, caracterizada por o ácido nucleico compreender um gene terapêutico.
14 - Composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com a reivindicação 1, um lípido neutro e um ácido nucleico.
15 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o composto ser escolhido entre o BGTC e o BGSC.
16 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o lípido neutro ser l,2-dioleoíl-sn-glicero-3-fosfo-etanolamina (“DOPE”).
17 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o ácido nucleico ser um ácido desoxirribonucleico
18 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o ácido nucleico ser um ácido ribonucleico
19 - Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindicações 17 ou 18, caracterizada por o ácido nucleico compreender um gene terapêutico.
20 - Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 19, caracterizada por compreender um veículo farmaceuticamente aceitável para uma formulação injectável. 85 632 ΕΡ Ο 888 379 / ΡΤ 5/5
21 - Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 19, caracterizada por compreender um veículo farmaceuticamente aceitável para uma aplicação sobre a pele e/ou mucosas.
22 - Utilização de um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 6 para a preparação de composições farmacêuticas destinadas à transfecção in vitro, ex vivo e/ou in vivo de células. Lisboa, -5. «Â!L 2001

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