PL199189B1 - Szczepionka doustna i nowe zastosowanie drożdży zdolnych do ekspresji antygenu - Google Patents

Abstract

Ujawniono szczepionkę doustną oraz zastosowanie rekombinowanych komórek drożdży do wytwarzania szczepionek doustnych, w szczególności przeciwko wirusowemu zapaleniu typu B, klasycznemu pomorowi świń i motylicy wątrobowej.

Description

Przedmiotami wynalazku są szczepionka doustna oraz zastosowanie rekombinowanych komórek drożdży do wytwarzania szczepionek doustnych. Ogólnie wynalazek dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi immunologicznej, obejmującego podawanie szczepionki przez układ pokarmowy. Przedmioty wynalazku służą do otrzymywania szczepionek doustnych, w szczególności przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B (hepatitis B, HB), klasycznemu pomorowi świń i motylicy wątrobowej.

Drożdże Saccharomyces cerevisiae są jednokomórkowym organizmem eukariotycznym, stosunkowo szybko rosnącym, o niewielkich wymaganiach pokarmowych, zdolnym do pozyskiwania energii na drodze oddychania tlenowego i fermentacji. Jest on od dawna wykorzystywany w otrzymywaniu wielu produktów spożywczych. Drożdże (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii), uznawane za bezpieczne przy stosowaniu doustnym, są również używane jako probiotyki w leczeniu m.in. niektórych infekcyjnych chorób przewodu pokarmowego (Schellenberg D. i wsp., 1994, Lancet 343, 171-172; McFarland L.V., Bernasconi P., 1993, Microbiol. Ecol. Hlth. Dis. 6,157-171).

Organizm ten był przez wiele lat obiektem bardzo intensywnych badań, dzięki czemu jest bardzo dobrze scharakteryzowany biochemicznie i genetycznie. Opracowano wiele metod pracy z S. cerevisiae, które są stosunkowo proste, wydajne i dają powtarzalne wyniki. Cał y genom S. cerevisiae został zsekwencjonowany, co niesłychanie upraszcza i skraca analizę genetyczną szczepów.

Obce białka eukariotyczne syntetyzowane w rekombinowanych komórkach drożdży ulegają modyfikacjom kotranslacyjnym lub posttranslacyjnym, takim jak specyficzna proteoliza, glikozylacja, podobnym do tych, które zachodzą w komórkach naturalnego gospodarza. Także składanie (folding) białek eukariotycznych w komórkach drożdży odbywa się prawidłowo, tworzą się natywne formy interi intramolekularne (Venezuela P. i wsp., 1985, Bio/Technology, vol. 3, kwiecień , 323-326).

Wszystkie te cechy stanowią o szczególnej przydatności S. cerevisiae jako gospodarza dla produkcji heterologicznych białek o potencjalnych medycznych, weterynaryjnych i/lub innych komercyjnych zastosowaniach.

Motylica wątrobowa (Fasciola hepatica) to pasożyt przechodzący skomplikowany cykl życiowy, w którym ż ywicielem pośrednim jest ślimak błotniarka moczarowa, a żywicielami ostatecznymi są: zwierzęta hodowlane (bydło, owce, kozy, a nawet konie), zwierzęta dziko żyjące (żubry, sarny, jelenie, wiewiórki - Vaughan i wsp., 1997; Aust. Vet. J. 75 (11): 811-3), człowiek. Żywiciel ostateczny zaraża się motylicą zjadając metacerkarie (jedna z form rozwojowych motylicy wątrobowej) znajdujące się na roślinach lub w wodzie. W przewodzie pokarmowym zachodzi ekscystacja młodocianych przywr, które penetrują przez ścianę jelita, jamę otrzewnową i torebkę wątrobową do miąższu wątroby. Po kilku tygodniach docierają do przewodów żółciowych - jest to miejsce osiedlania się dorosłych przywr. Prócz inwazji przewodów żółciowych zdarzają się też inwazje innych narządów np. płuc. Choroba wywołana przez motylicę wątrobową określana jest jako fascjoloza. Zakażenia motylicą wątrobową są przyczyną zniszczenia wątroby, uszkodzenia ścianek przewodów żółciowych, wypływu żółci, krwotoków. Skutkami zakażenia motylicą są: anemia, marskość wątroby, a przez to, niska produktywność (duża utrata wagi, niska mleczność, obniżona produkcja mięsa). Cięższe przypadki zakażeń motylicą wątrobową mogą prowadzić do śmierci.

Leczenie farmakologiczne jest kosztowne i coraz mniej skuteczne ze względu na rozwijającą się lekooporność. W Australii szacuje się, że 40 mln owiec i 6 mln bydła pasie się na terenach endemicznego występowania motylicy wątrobowej. Hodowcy wydają rocznie blisko 10 mln dolarów na leczenie fascjolozy, a straty produkcji kosztują kolejne 50-80 mln dolarów (Boray J.C., 1999; NSW Agriculture Agfact (2nd ed.) A0.9.57).

Fasciola hepatica zaliczana jest do najistotniejszych problemów weterynaryjnych, ze względu na rozprzestrzenienie pasożyta na całym świecie i szerokie spektrum organizmów ulegających zakażeniu.

Uważa się, że najlepszą metodę walki z inwazją motylicy wątrobowej stanowiłyby szczepionki. Ich zaletą jest m.in. to, że chronią organizm żywiciela przed uszkodzeniami już w okresie prepatentnym, zapewniając jednocześnie odporność na wiele lat. Jednak mimo wielu prób konstrukcji szczepionki przeciwko motylicy wątrobowej, żadna z nich nie jest dostępna komercyjnie. Do tej pory, jako szczepionki, wykorzystywano już różne antygeny motylicy (Wędrychowicz i Klockiewicz, 1994, Acta Parasitologica, 39:173). Należą do nich m.in. proteazy cysteinowe (Piacenza L. i wsp., 1998, Parasitol. Int., 47S:266).

PL 199 189 B1

Cysteinowe proteazy to enzymy odgrywające bardzo ważną rolę w interakcjach pasożyt - gospodarz. Biorą udział w odżywianiu się pasożyta, jego migracji przez tkanki gospodarza, jak również ucieczce przed mechanizmami obronnymi układu immunologicznego gospodarza.

Kofta i wsp. użyli cDNA proteazy cysteinowej jako szczepionkę przeciwko infekcjom motylicą wątrobową (Kofta i wsp., 2000, Vaccine, 18: 2985). W przeprowadzonym doświadczeniu uzyskano bardzo dobre wyniki.

Klasyczny pomór świń jest wywoływany przez wirusa klasycznego pomoru świń (ang. Classical Swine Fever Virus - CSFV dawniej zwany również hog cholera virus). Klasyczny pomór świń jest jedną z chorób, powodowanych przez pestiwirusy, należące do rodziny Flaviviridae. Pestiwirusy atakują zwierzęta z rodziny Suidae (świnie) oraz niektóre gatunki przeżuwaczy (krowy, owce, kozy), a także wiele dzikich gatunków zwierząt. Po raz pierwszy klasyczny pomór świń został opisany w 1833 roku w Ohio. Od tego czasu drastycznie zwię kszył zasię g występowania na całym świecie, stając się jednym z najbardziej ograniczających czynników ekonomicznych w hodowli świń. W 1997 roku podczas epidemii pomoru świń w Hiszpanii wybito ponad milion zwierząt. Straty sięgnęły wówczas 140 mln dolarów. Do dnia dzisiejszego nie stwierdzono tej choroby tylko w 16 krajach na świecie. Światowa organizacja Office International des Epizooties wymienia tę chorobę na liście A - piętnastu najgroźniejszych chorób zwierząt. W zależności od stopnia wirulencji wirusa, choroba może mieć przebieg: ostry, umiarkowany lub łagodny. Podczas ostrego ataku choroby, u zwierząt obserwuje się: wysoką gorączkę, naprzemiennie zaparcia i biegunkę, leukopenię, (apoptozę leukocytów), wybroczyny skórne, silną immunosupresję. Skutkiem ostrego ataku pomoru świń jest w większości przypadków śmierć zwierzęcia. Łagodna postać może przebiegać bezobjawowo, co więcej choroba ma dość długi - od 2 do 14 dni - okres inkubacji, co dodatkowo utrudnia kontrolowanie epidemii. Najczę stszymi drogami przenoszenia wirusa jest kontakt zwierzęcia chorego ze zdrowym, możliwe jest również przenoszenie fizycznie przez ludzi, ptaki lub owady, przez narzędzia rolnicze, paszę, pojazdy, odzież, itp. Jak dotąd nie udało się opracować leku na tę chorobę. Po wykryciu obecności patogena, wszystkie stada w promieniu 25 km od ogniska epidemii muszą być zlikwidowane. O wysokiej odpornoś ci wirusa pomoru świń na warunki środowiska świadczy fakt, iż może on przetrwać poza organizmem żywiciela nawet przez miesiąc. Obecnie istnieją trzy rodzaje szczepionki - oparta na atenuowanym żywym szczepie C [Terpstra i wsp. Dtsch Tierarztl Wochenschr 1990; 97 (2): 77-9], na zmodyfikowanym infekcyjnym klonie cDNA [Meyers i wsp. J. Virol., 1996; 70 (3): 1588-95], oraz tzw. „szczepionki markerowe oparte głównie na glikoproteinie E2 [van Rijn i wsp., Vaccine 1999; 17 (5): 433-40].

Glikoproteina E2 wraz z glikoproteinami E0 i E1 buduje otoczkę wirusa pomoru świń. Infekcyjność patogena najskuteczniej neutralizują przeciwciała skierowane przeciwko epitopom białka E2 (Weiland i wsp. 1992, J. Virol. 66:3677). Białko E2 posiada na N-końcu charakterystyczne epitopy, rozpoznawane przez przeciwciała. Są nimi 4 domeny: A, B, C i D, eksponowane na zewnątrz błony, w której białko jest zakotwiczone C-końcem. (van Rijn i wsp., 1994, J. Virol. 68:3934).

Wirusowe zapalenie wątroby może być powodowane przez wirusy typu A, B, C, D i E. Wirus zapalenia wątroby typu B jest szczególnie groźny. Wywołuje niebezpieczną chorobę o przebiegu ostrym lub przewlekłym, która nie leczona prowadzi często do marskości wątroby lub rozwoju raka wątroby. Wirus HBV jest szeroko rozpowszechniony w populacji ludzkiej, w krajach o niskim poziomie sanitarnym 50% ludności jest seropozytywna w teście na HBV (Seeger Ch. i Mason W.S., Hepatitis B virus biology. Microbiology and Molecular Biology Reviews, Mar. 2000, 51-68). Profilaktycznie przeciw HB stosuje się szczepienia ochronne. Wykazano, że powierzchniowe białko S wirusa HBV (HBsAg) jest skuteczne jako antygen w szczepionkach przeciw HB (Malay Sh. i wsp., 2000, Childhood Immunizations, vol. 47 (2), 395-406).

Gen kodujący HBsAg, pochodzący z polskiego izolatu wirusa HBV (ayw4), został wyizolowany i scharakteryzowany przez prof. A. Pł ucienniczaka (Gen-Bank Acc. Nr Z35716).

Opis patentowy US4769238 (opublikowany 1989.05.03) opisuje syntezę HBsAg w drożdżach. Ujawniono wektory ekspresyjne zawierające promotor drożdżowy ADHI oraz region genomu HBV kodujący powierzchniowe białko S, pozwalające na produkcję tego antygenu wirusowego w komórkach drożdży. Ponadto, ujawniono i zastrzeżono szczepionkę (iniekcyjną) zawierającą syntetyzowany w ten sposób antygen.

Opis EP0339567 (opublikowany 1989.11.02) ujawnia sposób wydajnej ekspresji cząsteczek antygenowych białka preS2 w komórkach drożdży metylotroficznych, zwłaszcza gatunku Pichia pastoris. Ujawniono i zastrzeżono stosowany w sposobie wektor i komórki drożdży transformowane tym wektorem.

PL 199 189 B1

Ekspresja HBsAg w komórkach drożdżowych oraz służące do tego środki zostały opisane także w wielu kolejnych wynalazkach.

Przykładowo są one przedmiotami opisów: US4940661 (opublikowany 1990.07.10), EP0414374 (opublikowany 1991.02.27), EP0516286 (opublikowany 1992.12.02), US5310660 (opublikowany 1994.05.10), WO86/06077 (opublikowany 1986.10.23), US4757021 (opublikowany 1988.07.12), EP0340806 (opublikowany 1989.11.08), EP0409156 (opublikowany 1991.01.23), US5935789 (opublikowany 1999.08.10), EP0278940 (opublikowany 1988.08.17), US4977092 (opublikowany 1990.12.11), US5258302 (opublikowany 1993.11.02), EP0533492 (opublikowany 1993.03.24), EP0533263 (opublikowany 1993.03.24), US5614384 (opublikowany 1997.03.25), EP0533492 (opublikowany 1993.03.24), EP0106828 (opublikowany 1984.04.25) oraz WO00/37104 (opublikowany 2000.06.29).

Jednak dotychczasowe rozwiązania zakładały, że do przygotowywania szczepionki powinien być wykorzystywany oczyszczony antygen HBsAg, natomiast transformowane komórki drożdżowe stanowią jedynie dogodny układ przeznaczony do syntezy tego białka. Oczyszczony antygen HBsAg jest wykorzystywany tylko do otrzymywania szczepionek iniekcyjnych. Przykładem takiego preparatu jest Engerix - B oraz HB-Vax II.

Szczepionki doustne, w przeciwieństwie do parenteralnych, mogą zapewnić nie tylko odporność systemiczną ale również odporność błon śluzowych, co jest szczególnie ważne w profilaktyce chorób przenoszonych różnymi drogami, do których należy Hepatitis B. Rosnące zainteresowanie szczepionkami doustnymi wiąże się także z łatwością stosowania, przez co możliwe staje się ich użycie w szczepieniach na szeroką skalę (Richter L., Kipp B.B., 1999, Curr. Top.Microbiol. Immunol., 240, 159-176). Podjęto już pierwsze próby opracowania szczepionek doustnych. Opis WO00/37610 ujawnia wektory służące do otrzymywania polipeptydów immunogennych, takich jak HBsAg, w jadalnych tkankach roślinnych. Uzyskane w ten sposób rośliny transgeniczne wykorzystuje się do otrzymywania szczepionek doustnych.

Nie są one jednak pozbawione wad. Trudność stanowi zapewnienie odpowiednio wysokich i precyzyjnych dawek antygenu szczepionkowego. Poziom syntetyzowanego antygenu jest różny w róż nych tkankach i egzemplarzach otrzymywanych roślin transgenicznych.

Opisy US 5 770 214, US 5 811 105 i US 5 804 194 dotyczą stosowania szczepów atenuowanych Salmonella typhi jako szczepionki doustnej. Jednak obce białka syntetyzowane w komórkach bakteryjnych nie będą ulegały modyfikacjom posttranslacyjnym typowym dla systemów eukariotycznych, takim jak glikozylacja i mogą przyjmować konformację odbiegającą od natywnej, co w przypadku wielu antygenów wpływa na ich immunogenność.

Opis US6290962 opublikowany 2001.09.18 ujawnia sposób wywoływania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko Helicobacter polegający na podawaniu immunogennej ilości antygenu będącego ureazą z Helicobacter lub jej podjednostką.

Zgodnie z jedną z zastrzeganych realizacji wynalazku jako szczepionkę doustną podaje się m.in. żywe drożdże syntetyzujące wspomniany antygen. Zakres ujawnienia ogranicza się jednak jedynie do stosowania oczyszczonej ureazy.

Stosunkowo małe doświadczenie w immunizacji doustnej oraz nieprzewidywalne losy antygenu w przewodzie pokarmowym sprawiają , że warunki efektywnej immunizacji tą drogą nie są tak ściśle określone jak w przypadku immunizacji parenteralnej, a ponadto immunizacja doustna niesie za sobą ryzyko wyindukowania tolerancji pokarmowej (McGhee J. R. i wsp., 1999. w: Mucosal Immunology (Ogra P.L., Lamm M.E., Bienenstock J., Mestecky J., Strober W., McGhee J.R., red), str. 485-505, Academic Press). Ci sami autorzy wyrażają także poważne wątpliwości, czy żywe mikroorganizmy rekombinowane stanowiące potencjalne systemy dostarczające antygen, które mogłyby być wykorzystane w szczepionkach doustnych, znajdą w rzeczywistości zastosowanie w tej dziedzinie, zwłaszcza ze względu na trudności z ustaleniem stałej jakości i składu tego rodzaju produktów. Jako dużo bardziej atrakcyjną alternatywę dla szczepień doustnych wskazano cząsteczki czystych antygenów mikrootoczkowane chemicznie.

Opis WO 98/32427 opublikowany 1998.07.30 proponuje jedno z takich rozwiązań ujawniając polimer służący do przygotowywania osłonkowanych szczepionek doustnych o spowolnionym tempie uwalniania substancji czynnej. Niezależnie od drogi podania, forma antygenu w znacznej mierze warunkuje stopień jego immunogenności. W przypadku szczepień przeciwko HBV, tworzenie cząstek przez HBsAg (Tiollais P. i wsp., 1981, Science 213, 406-411) ma decydujące znaczenie dla jego zastosowania jako szczepionki podjednostkowej. Stwierdzono, że HBsAg syntetyzowany w rekombinoPL 199 189 B1 wanych komórkach drożdży tworzy cząstki wirusopodobne (VLPs) (Biemans R. i wsp., 1992, DNA Cell Biol. 11, 621-6).

Nabycie odporności w wyniku szczepienia wymaga zastosowania właściwego reżimu immunizacji, który obejmuje m.in. odpowiednie określenie takich parametrów jak wielkość i ilość dawek antygenu oraz odstępy czasu między poszczególnymi szczepieniami. Kwaśne pH soku żołądkowego, enzymy proteolityczne oraz perystaltyka jelit powodują, że w przypadku szczepień doustnych efektywne dawki antygenu są o wiele wyższe niż w szczepieniach parenteralnych. Jednakże podanie zbyt wysokich dawek antygenu przez układ pokarmowy może powodować wspomnianą już tolerancję pokarmową. Nie oznacza to jednak, że użycie niskich dawek antygenu nie może wywołać tolerancji pokarmowej. Dotychczas nie poznano podstawowych mechanizmów rządzących tym zjawiskiem, i nie osiągnięto standardowego rozwiązania problemu indukowanej tolerancji. Przypuszcza się, że zjawisko tolerancji jest w pewnym stopniu zależne od wspomnianych wyżej czynników, tj. wielkości dawki, terminarza szczepień oraz rodzaju antygenu (Tacket C.O., Mason H.S., 1999, Microbes and Infection 1, 777-783). Perspektywa uzyskania uniwersalnych adiuwantów, optymalnych składów szczepionek, korzystnych dawek i terminarza szczepień dla szczepionek doustnych w świetle dotychczasowych badań wydaje się być jeszcze bardzo odległa. (Makela P.H., 2000, FEMS Microbiology Rewiews 24, 9-20).

Wydaje się, że warunkiem immunizacji przez błony śluzowe jest wielokrotne podawanie antygenu w wielokrotnie wyższych dawkach niż dawki skuteczne parenteralnie. Bardziej korzystne są antygeny tworzące formy multimeryczne. Nie ma również pewności co do zasadności stosowania adiuwantów. W przypadku roślinnych szczepionek jadalnych wydaje się być to niepożądane, jednak w przypadku pewnych antygenów może być ono konieczne (Richter L., Kipp B.B, 1999, Curr. Top Microbiol. Immunol. 240, 159-176).

Podsumowując, z istoty szczepień doustnych wynika, że opracowanie protokołu efektywnej immunizacji przez układ pokarmowy jest o wiele trudniejsze niż w przypadku szczepień metodami tradycyjnymi. W przypadku każdego preparatu jest to odrębne wyzwanie obarczone dużym ryzykiem niepowodzenia.

Wskaźnikami efektywności immunizacji przez błony śluzowe, w tym przez układ pokarmowy, są m.in.: poziom antygenowo-specyficznych sekrecyjnych przeciwciał klasy IgA (S-IgA) związanych z błonami ś luzowymi, miano przeciwciał klasy IgG i IgA w surowicy, profil przeciwciał klasy IgG oraz profil cytokin. W celu określenia odporności komórkowej stosowane są testy na cytotoksyczność limfocytów.

W świetle przedstawionego powyżej stanu techniki celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie skutecznych i łatwo dostępnych środków, które mogą być stosowane w szczepieniach doustnych. Szczególnym celem wynalazku jest zaproponowanie środków służących do doustnego szczepienia przeciw motylicy wątrobowej, wirusowi klasycznego pomoru świń albo HBV, pozwalających uzyskać odporność systemiczną, a także odporność błon śluzowych na zakażenie. Środki według wynalazku powinny być łatwe do stosowania i pozbawione innych znanych niedogodności związanych z przygotowywaniem i stosowaniem szczepionek, takich jak stosunkowo wysokie koszty przygotowania preparatu i niebezpieczeństwo przypadkowego zakażenia krwi w trakcie szczepienia. Szczepionki doustne według wynalazku powinny zapewniać skuteczną immunizację przez układ pokarmowy. Powinny być one także wolne od niepożądanych działań ubocznych, a korzystnie posiadać właściwości probiotyczne.

Nieoczekiwanie realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych ze stosowaniem znanych szczepionek tradycyjnych lub doustnych zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka doustna zawierająca antygen i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzująca się tym, że antygen syntetyzowany jest w komórce drożdżowej.

Obok korzystnych, znanych drożdży takich jak szczepy gatunków Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia membranaefaciens, Kluyveromyces lactis, Zygosaccharomyces, bailii, Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii, Candida catenulata, Candidia spharica, czy Candidia diffluens, w realizacjach wynalazku mogą być wykorzystane również inne gatunki drożdży, wybrane spośród: Saccharomyces sp., Hansenula sp., Pichia sp., Kluyveromyces sp., Zygosaccharomyces sp., Yarrowia sp., Debaryomyces sp., Candida sp., Hanseniaspora sp., Cryptococcus sp..

PL 199 189 B1

Korzystnie komórka drożdży zawiera funkcjonalną kasetę ekspresyjną niosącą sekwencję nukleotydową kodującą antygen, w szczególności antygen motylicy wątrobowej, antygen wirusa klasycznego pomoru świń, HBsAg.

W korzystnej realizacji antygen motylicy wątrobowej zawiera sekwencję aminokwasową proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej lub jej fragment, przy czym szczególnie korzystnie antygen motylicy wątrobowej jest kodowany przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 5 albo figurze 6.

W korzystnych realizacjach wynalazku wykorzystano sekwencję kodującą tylko część (tzw. katalityczną) jednej z proteaz cysteinowych motylicy wątrobowej. cDNA tej proteazy wyizolowano i scharakteryzowano w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków we współpracy z Katedrą Parazytologii SGGW. Poznano sekwencję genu tej proteazy, co stało się podstawą wydzielenia trzech części składowych, które kodują kolejno: peptyd sygnałowy (~15 aa), część liderową (~92 aa), część katalityczną (~220 aa). Posiadany klon cDNA jest najbardziej podobny do sekwencji opisanej przez Wijffels i wsp. (1994) (GenBank Accession No L33771), chociaż nie identyczny.

W korzystnej realizacji antygen wirusa klasycznego pomoru ś wiń zawiera sekwencję aminokwasową białka otoczki wirusa lub jej fragment, korzystnie sekwencję aminokwasową białka E2 lub jej fragment, przy czym szczególnie korzystnie antygen wirusa klasycznego pomoru świń jest kodowany przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 7 albo figurze 8.

W korzystnych realizacjach wynalazku wykorzystano sekwencję części antygenu E2 wirusa pomoru świń, szczepu Brescia. Sekwencja obejmuje tylko N-końcową część antygenu i nie zawiera części C-końcowej, mocującej białko E2 w błonie. Odpowiada ona sekwencji opisanej przez Moormann i wsp. (Virology 177 (1), 184-198 (1990)) (GenBank Accession No p21530).

W korzystnej realizacji antygen HBsAg zawiera sekwencję aminokwasową białka S pochodzą cego z HBV ayw4 zdeponowanego w Gen-Bank Acc.Nr Z35716 lub jej fragment, przy czym szczególnie korzystnie antygen HBsAg jest kodowany przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 2 albo figurze 3 albo figurze 4.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie drożdży zdolnych do ekspresji antygenu do produkcji szczepionki doustnej. Korzystnie stosowane drożdże zostały wybrane spośród szczepów wskazanych powyżej, a korzystne realizacje tego aspektu wynalazku obejmują wykorzystanie jednego z antygenów zdefiniowanych powyż ej.

Zaprezentowany wynalazek posiada liczne zalety wyróżniające go na tle znanych ze stanu techniki szczepionek doustnych. Ekspresja antygenu przebiega w komórkach drożdżowych, co pozwala na uzyskanie pożądanej, eukariotycznej struktury białka, a nie zawsze jest to możliwe w przypadku ekspresji przebiegającej w komórkach bakteryjnych. Stosunkowo prosta budowa wybranego gospodarza jednokomórkowego oraz możliwość kontroli procesu ekspresji antygenu szczepionkowego gwarantuje homogenność otrzymywanych preparatów a przez to precyzyjne dawkowanie, trudne do osiągnięcia w przypadku użycia roślin transgenicznych jako szczepionek doustnych. Rekombinowany antygen szczepionkowy jest uwalniany stopniowo z komórek drożdży w trakcie trawienia, dzięki czemu uzyskiwany jest efekt korzystny dla immunizacji, podobny do tego jaki daje otoczkowanie antygenu. W przypadku drożdży eliminowane są jednak ewentualne działania uboczne otoczki i dodatkowo mogą być wykorzystane probiotyczne właściwości mikroorganizmu.

Załączone figury pozwalają na lepsze wyjaśnienie istoty wynalazku.

Figura 1 przedstawia schemat wektora ekspresyjnego pIESHB1, przeznaczonego do wytwarzania antygenu powierzchniowego (HBsAg) wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) w drożdżach. Plazmidem wyjściowym jest wektor pYES2 produkowany przez firmę Invitrogen (sekwencja nukleotydowa i opis pYES2 dostępne na stronie http://www.invitrogen.com), do którego wstawiono pierwszy wariant sekwencji kodującej białko antygenu powierzchniowego HBV, oznaczony jako „Gen HBsAg. Pozostałe elementy wektora: PGAL1 i CYCTT elementy regulatorowe ekspresji genów, odpowiednio, promotor i terminator transkrypcji; pMB1 Ori - sekwencja nukleotydowa warunkująca replikację plazmidu w bakteriach Escherichia coli; 2μ Ori - sekwencja nukleotydowa zabezpieczająca replikację w droż d ż ach; f1 Ori - element umoż liwiają cy replikację fagemidu w bakteriach. Escherichia coli, pozwalający na otrzymywanie jednołańcuchowych, kołowych cząsteczek DNA; URA3 - drożdżowy gen selekcyjny.

Figura 2 przedstawia sekwencję nukleotydową pierwszego wariantu genu HBsAg. Kodony startu (ATG) i Stop (TAA) zaznaczono tłustym drukiem. Fragment DNA mający taką sekwencję nukleotydów umieszczono w wektorze pYES2 otrzymując plazmid pIESHB1.

PL 199 189 B1

Figura 3 przedstawia sekwencję nukleotydową drugiego wariantu genu HBsAg. Kodony startu (ATG) i Stop (TAA) zaznaczono tłustym drukiem. Fragment DNA mający taką sekwencję nukleotydów umieszczono w wektorze pYES2 otrzymując plazmid pIESHB2.

Figura 4 przedstawia sekwencję nukleotydów genu fuzyjnego ubikwityna/gen HBsAg. Kodon startu ubikwityny (ATG) zaznaczono tłustym drukiem. Sekwencję kodującą HBsAg podwójnie podkreślono. Sekwencje nukleotydowe rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne Hindlll i SalI podkreślono. Kodon stop (TAA) zaznaczono tłustym drukiem. Fragment DNA mający taką sekwencję nukleotydów umieszczono w wektorze pYES2 otrzymując plazmid pIESUHB.

Figura 5 przedstawia sekwencję kodującą fragment proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej (Fasciola hepatica). Fragment DNA włączono do wektora pYES2, który przed ligacją przecięto nukleazą restrykcyjną Xhol, powstałe lepkie końce wypełniono za pomocą fragmentu DNA polimerazy Klenowa, odbiałczono i trawiono nukleazą restrykcyjną BamHI.

Figura 6 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe ubikwityna::Fragment proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej (Fasciola hepatica). Fragment kodujący ubikwitynę podwójnie podkreślono.

Figura 7 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe ubikwityna::fragment antygenu E2 wirusa pomoru świń (CSFV). Fragment wirusowy koduje 220 aminokwasów antygenu E2.

Figura 8 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe ubikwityna::fragment antygenu E2 wirusa pomoru świń (CSFV). Fragment wirusowy koduje 341 aminokwasów antygenu E2.

Figura 9 przedstawia odpowiedź humoralną myszy po pierwszej (A) i drugiej (B) immunizacji drożdżami z ekspresją HBsAg (S. cerevisiae, szczep WHBS) przez układ pokarmowy.

Poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku.

P r z y k ł a d 1. Konstrukcja drożdżowego wektora ekspresyjnego zawierającego gen antygenu powierzchniowego (HBsAg) wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV)

Pierwszy wariant sekwencji kodującej HBsAg (fig. 2) otrzymano powielając DNA znajdujące się w plazmidzie zawierającym peł ny genom wirusa HBV typ ayw. Opis sekwencji tego genomu HBV znajduje się w banku genów GenBank pod numerem dostępu Z35716 (Płucienniczak A. [1994] Molecular cloning and sequencing of two complete genomes of polish isolates of human hepatitis B virus). Do selekcyjnego powielania wykorzystano technikę PCR stosując odpowiednio zaprojektowane primery HBSKURG i HBSKERD, zaprezentowane w tabeli 1.

T a b e l a 1. Sekwencje stosowanych primerów

nazwa primera	sekwencja
HBSKURG	5'-GGGGATCCATGGAGAACATCACATCAGG-3'
HBSKERD	5'-GAGAGTCGACGAGCTCTTAAATGTATACCCAAAGACA-3'
HBSGA	5'-GAAAAGCTTATAATGGAGAACATCACATCAGGA-3'

W primerze HBSKURG podkreślono sekwencję nukleotydów rozpoznawaną przez nukleazę restrykcyjną BamHI, w primerze HBSKERD sekwencję nukleotydów rozpoznawaną przez nukleazę SalI, w primerze HBSGA sekwencję nukleotydów rozpoznawan ą przez nukleazę Hindlll.

Dzięki wykorzystaniu primerów, które oprócz sekwencji nukleotydów specyficznych dla HBV zawierały dodatkowo sekwencje rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne BamHI i SalI, uzyskano zmodyfikowaną sekwencję kodującą HBsAg nadającą się do łatwego umieszczania w wektorze ekspresyjnym z użyciem standardowych procedur klonowania (Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Fragment powielono używając primerów HBSKURG i HBSKERD, trawiono nukleazami restrykcyjnymi BamHI i SalI i następnie połączono za pomocą enzymu DNA ligazy z faga T4 z plazmidem pBluesriptSK (+) firmy Stratagene, który był uprzednio trawiony tą samą parą enzymów. Mieszaniną ligacyjną transformowano bakterie Escherichia coli szczep NM522. Wśród transformantów znaleziono kolonie bakteryjne zawierające plazmidy z sekwencją kodującą HBsAg. Spośród nich wybrano jedną, z której potem pobrano bakterie w celu wyizolowania większej ilości plazmidu. Określono sekwencję nukleotydową wstawki tego plazmidu. Po stwierdzeniu, że jest ona zgodna z oczekiwaną, plazmid trawiono nukleazami BamHI i SalI, w celu oddzielenia wstawki od plazmidu. Wstawkę wyizolowano elektroforetycznie zgodnie z procedurą opisaną przez Dybczyńskiego i Płucienniczaka (Dybczyński I, Płucienniczak A [1988] A protocol for DNA fragment extraction from polyacrylamide geles. Biotechniques 6: 924-926).

PL 199 189 B1

Wyizolowany fragment DNA, zawierający sekwencję kodującą HBsAg połączono za pomocą ligazy DNA z bakteriofaga T4 z wektorem pYES2 firmy Invitrogen, który przed ligacją trawiono nukleazami restrykcyjnymi BamHI Xhol. Mieszaniną ligacyjną transformowano bakterie Escherichia coli NM522. Trasformanty analizowano ze względu na obecność plazmidów zawierających sekwencję kodującą HBsAg. Jeden z plazmidów pYES2 zawierających zmodyfikowany gen HBsAg nazwano pIESHB1. Plazmid ten został wyizolowany w większych ilościach i zastosowany do transformacji drożdży.

Drugi wariant genu HBsAg otrzymano stosując parę primerów: HBSGA i HBSKERD. W primerze HBSGA zmieniono otoczenie kodonu ATG (kodonu startu) genu HBsAg dostosowując otaczającą go sekwencję do sekwencji najczęściej występujących w otoczeniu tego kodonu w genomie drożdży, upodobniając tym samym gen HBsAg do genów drożdżowych. Otrzymano w ten sposób drugi wariant genu HBsAg, który, podobnie jak pierwszy, został przeniesiony do wektora pYES2, dając w rezultacie plazmid pIESHB2.

Trzeci wariant genu otrzymano tworząc gen hybrydowy składający się na końcu 5' z sekwencji kodującej ubikwitynę drożdżową i na końcu 3' z sekwencji kodującej HBsAg (sekwencję nukleotydową genu fuzyjnego przedstawiono na fig. 4). Gen fuzyjny, podobnie jak dwa poprzednie warianty genu HBsAg został umieszczony w wektorze pYES2. W rezultacie powstał plazmid pIESUHB.

W podobny sposób, bazując na sekwencjach przedstawionych na figurach 5-8 przygotowano plazmidy pochodzące od pYES2 pozwalające uzyskać w komórkach drożdżowych ekspresję antygenów z motylicy wątrobowej lub wirusa klasycznego pomoru świń.

P r z y k ł a d 2. Uzyskanie i analiza szczepu drożdży niosącego fragment kodujący HBsAg

Transformacji dokonywano standardową metodą z zastosowaniem PEG3350 i chlorku litu (Gietz R.D. i Woods R.A, Transformation of yeast by the lithium acetate/Single stranded Carrier DNA/PEG method. W: Yeast Gene Analysis, red. Brown A.J.P. i Tuite M.F., Academic Press: San Diego (1998), 53-66). Komórki drożdży hodowano na podłożu YPGA (1% ekstrakt drożdżowy, 1% bactopeptone, 2% glukoza, 2 mg/l adenina) w temperaturze 30°C z wytrząsaniem przez 48 godzin. 0,5 ml hodowli wirowano, zawieszano w mieszaninie zawierającej 40% PEG3350, 0,2 M octan litu, 0,1 M DTT. Dodawano plazmidowy DNA i 5 μΐ zdenaturowanego DNA ze spermy łososia (10 mg/ml). Intensywnie mieszano i inkubowano w 45°C przez 30 min. Dodawano 1 ml roztworu fizjologicznego. Wysiewano na podłoże W0 (0,67% yeast nitrigen base, 2% glukoza, 2% agar, z uzupełnieniami adenina 20 mg/l, histydyna 10 mg/l, tryptofan 20 mg/l, leucyna 60 mg/l). Hodowano w 30°C przez 3 do 5 dni. Użyto laboratoryjnego szczepu W303 (ade2-1, Ieu2-3, 112, trp1-1, his3-11, ura3 1, mit+, rho+) (Thomas.B.J. i Rothstein R. CelI, vol.56 (1989), 619-630). Eksperyment przeprowadzono trzykrotnie uzyskując wydajność 2-8 x 10³Ą.ig DNA. Uzyskane wyniki są w pełni zadowalające, jako że wszystkie planowane transformacje są wykonywane przy użyciu oczyszczonych preparatów plazmidowego DNA. W trakcie dalszych prac wykorzystywano szczep W303.

Analiza transformantów metodą PCR.

Komórki transformantów posiano na pożywkę YPGA, hodowano w temp. 30°C z wytrząsaniem przez 3 dni. Następnie izolowano totalny DNA według Hoffmana i Winstona, 1987 (Hoffman Ch.S. i Winston F., A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene, vol. 57 (1987), 267-272). W tym celu 5 ml 18 godzinnej hodowli drożdży w pożywce YPGA wirowano przez 30 sekund na mikrowirówce. Do osadu dodawano 0,2 ml buforu do lizy (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA), 0,2 ml mieszaniny fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego (25:24:1) oraz 3 g kulek szklanych. Mieszano intensywnie przez 3 min i wirowano przez 10 min na mikrowirówce. Do supernatantu dodawano 1 ml etanolu i wirowano 10 min, osad zawieszano w 0,4 ml TE. Dodawano 30 μg RNazy A, inkubowano 30 min w temperaturze 37°C. Strącano etanolem w obecności octanu amonu, następnie wirowano. Osad zawieszano w 50 μl buforu TE. Uzyskany materiał analizowano w żelu agarozowym. Wyizolowano znaczne ilości nie zdegradowanego DNA chromosomalnego, plazmidowy DNA występuje w komórkach drożdży w niewielkich ilościach i nie był widoczny na żelu. Całkowity DNA każdego ze szczepów użyto do reakcji PCR prowadzonej przy użyciu odpowiedniej dla danego plazmidu pary primerów i stosownej temperatury annilingu. Przykładowo dla plazmidu pIESHB1 użyto po 10 pmoli każdego z primerów HBSKURG i HBSKERD przy objętości próbki reakcyjnej 50 μ], a reakcję PCR prowadzono według następującego programu: wstępna denaturacja: 95°C, 3 min, denaturacja: 95°C, 0,5 min, renaturacja: 42°C, 0,5 min, elongacja: 72°C, 1 min, reakcję prowadzono w 25 cyklach. Produkty PCR analizowano w żelu agarozowym. Dla szczepu transformowanego plazmidem pIESHB1 (szczep oznaczono jako WHBS) oczekiwano prążka o wielkości około 694 par zasad. Obraz na żelu

PL 199 189 B1 agarozowym wskazuje na obecność takiego fragmentu. Brak prążka w przypadku szczepu transformowanego wektorem pYES2 potwierdza poprawność i pełną specyficzność uzyskanego wyniku.

Analiza komórek transformantów metodą „marker rescue

Całkowity DNA szczepu WHBS (w ilości 1/5 izolacji opisanej powyżej) został użyty do transformacji szczepu E. coli DH5a. Po transformacji komórki posiano na podłoże LB z ampicyliną i inkubowano przez 18 godzin w temp. 37°C. Uzyskano 9 kolonii transformantów. Jest to wynik zadowalający, gdyż plazmidy występują w komórkach drożdży w niewielkiej ilości kopii. Bakterie z uzyskanych kolonii hodowano w płynnym podłożu LB z ampicyliną, a następnie użyto do izolacji DNA metodą alkaliczną. DNA analizowano w żelu agarozowym. W komórkach transformantów stwierdzono obecność plazmidów o wielkości plazmidu pIESHB1, co oznacza stabilną obecność tego plazmidu w analizowanym szczepie drożdży WHBS.

P r z y k ł a d 3. Hodowle drożdżowe. Ustalanie wpływu warunków hodowli szczepu WHBS na ilość HBsAg w komórkach drożdży

Jako podstawowe podłoża drożdżowe stosowano:

Podłoże pełne YPA (1% yeast extract, 1% bactopeptone, 2 mg/ladenina) uzupełniano cukrem do stężenia 2%: glukozą lub galaktozą.

Podłoże minimalne (Brown A.J.P., Tuite M.F., Yeast Gene Analysis, 1998) SCI zawiera 0,67% yeast nitrigen base, z uzupełnieniami: adenina 2 mg/l, histydyna 10 mg/l, tryptofan 20 mg/l, leucyna 60 mg/l. Podłoże uzupełniano cukrem do stężenia 2%: glukozą lub galaktozą.

Uzyskiwanie inokulum. Materiałem z pojedynczej kolonii szczepiono porcję podłoża SCI z glukozą, hodowano 72 godziny w temperaturze 30°C na wytrząsarce (200 rpm). Uzyskiwano zwykle hodowlę o gęstości optycznej OD 600 od 1,0 do 0,3. Przygotowane w ten sposób inokulum służyło bezpośrednio do szczepienia hodowli lub było przechowywane przez 2-3 dni w lodówce. Zwykle dodawano 1 ml inokulum na 100 ml pożywki.

Odwirowywanie. Po zakończeniu hodowli, komórki drożdżowe odwirowywano. Przyjęto następujący standardowy sposób postępowania: wirowano hodowlę w wirówce Beckman (JA14) - 14 tys. rpm przez 10 min w temperaturze pokojowej, supernatant zlewano pozostawiając niewielką ilość, w której zawieszano komórki, przenoszono do wytarowanych probówek typu eppendorf, wirowano przez 10 min przy 12 tys. rpm, starannie usuwano supernatant.

Komórki były używane bezpośrednio do dalszych analiz lub przechowywane w temperaturze -20°C.

W prowadzonych testach porównawczych odwirowane komórki drożdży z hodowli szczepu dzikiego W303 i szczepu rekombinowanego WHBS rozbijano mechanicznie z kulkami szklanymi o średnicy 0,45 - 0,5 mm stosując wytrząsanie w urządzeniu vortex TK3S firmy TechnoKartell (3-5 cykli 3 x 30'').

W celu ustalania wpływu warunków hodowli szczepu WHBS na ilość antygenu HBsAg w komórkach drożdży wzięto pod uwagę następujące czynniki: rodzaj pożywki, sposób przygotowania inokulum oraz czas hodowli.

Drożdże hodowane były na podłożu minimalnym SCI oraz na pełnym podłożu YPA. W przypadku podłoża minimalnego możliwe jest stworzenie presji selekcyjnej poprzez pozbawienie szczepu uracylu w podłożu. Namnażają się tylko te komórki, które zachowały plazmid niosący zarówno gen kodujący HBsAg, jak i gen ura3 znoszący auksotrofię uracylową. Na tym ubogim podłożu komórki rosną jednak wolno, uzyskuje się niską biomasę komórek. W przypadku zastosowania bogatego podłoża uzyskuje się znaczną biomasę w krótkim czasie, ale istnieje zagrożenie utraty plazmidu przez komórki i spadku ilości białka HBsAg.

Promotor GALI, który kontroluje ekspresję białka sklonowanego w wektorze pYES2, jest promotorem podlegającym regulacji. W obecności glukozy dochodzi do jego represji, w obecności galaktozy jest indukowany. Cechy promotora rzutują na sposób przygotowania inokulum i hodowli. Przechowywanie szczepu na podłożu minimalnym z glukozą z jednej strony wymusza zachowanie plazmidu w komórkach (poprzez istnienie presji selekcyjnej), a z drugiej strony, poprzez represję promotora, chroni komórki przed negatywnymi skutkami obecności białka heterologicznego. Hodowlę przeznaczoną do przygotowania ekstraktu i testowanie w kierunku HBsAg prowadzono w obecności galaktozy jako źródła węgla. Szczepiono pożywkę małym inokulum i stosowano długi czas inkubacji lub w przypadku analizy czasu indukcji promotora przygotowywano inokulum z dużej ilości świeżych komórek i hodowano przez 2-10 godzin.

PL 199 189 B1

A. Hodowle z ograniczonym czasem indukcji.

Szczepiono drożdże na pożywkę SCI z glukozą. Hodowano przez 48 godzin, następnie wirowano i dodawano komórki do świeżego podłoża SCI z galaktozą. Ilość komórek wyliczano tak, by w nowej porcji poż ywki uzyskać wyjś ciową gę stość optyczną OD 600 ok. 0,4. Hodowlę prowadzono w porcjach pożywki po 100 ml, komórki z poszczególnych kolb wirowano po 2, 4, 6, 8 i 10 godzinach. Hodowlę prowadzono w sposób identyczny dla szczepu WHBS i W303 (pYES2). W tabeli 2 podano gęstość optyczną i biomasę uzyskane dla poszczególnych hodowli oraz ilości białka uzyskane po rozbiciu komórek. Rozbijanie prowadzono na vortexie (jak wyżej).

T a b e l a 2. Hodowla z ograniczonym czasem indukcji, właściwości uzyskanych z nich ekstraktów

Szczep WHBS
Czas (h)	OD (600 nm)	Biomasa ze 100 ml podłoża (g)	Ilość białka w ekstrakcie (mg/ml)	Ilość białka (mg) na 1 g biomasy
0	0,375	-	-	-
2	0,380	0,10	6,71	10,60
4	0,420	0,11	6,71	10,85
6	0,473	0,15	6,89	12,70
8	0,565	0,17	7,95	16,03
10	0,679	0,22	7,18	16,04

Szczep W303 (pYES2)
Czas (h)	OD (600 nm)	Biomasa ze 100 ml podłoża (g)	Ilość białka w ekstrakcie (mg/ml)	Ilość białka (mg) na 1 g biomasy
0	0,430	-	-	-
2	0,430	-	-	-
4	0,452	0,10	2,99	5,41
6	0,670	0,14	3,82	6,88
10	0,692	0,24	2,66	5,02

B. Hodowla na podłożu minimalnym w obecności induktora.

Zaszczepiono 100 ml podłoża SC1 z galaktozą używając 1 ml świeżego inokulum, uzyskanego na podłożu SC1 z glukozą. Hodowlę prowadzono w sposób standardowy, gęstość optyczną sprawdzono po 24 godzinach:

- szczep WHBS - OD 600 = 0,520 - szczep W303 (pYES2) - OD 600 = 0,547

Ponieważ gęstość optyczna była niska, hodowlę kontynuowano przez następne 24 godziny, po czym komórki poddano wirowaniu i rozbijaniu za pomocą vortexu (tabela 3).

T a b e l a 3. Hodowle na podłożu minimalnym z induktorem i uzyskane z nich ekstrakty

Szczep	OD 600 nm	Biomasa ze 100 ml podłoża (g)	Ilość białka w ekstrakcie (mg/ml)	Ilość białka (mg) na 1 g biomasy
WHBS	1,167	0,46	5,80	7,19
W303 (pYES2)	1,110	0,39	8,30	12,98

C. Hodowla na podłożu pełnym z induktorem.

Zaszczepiono 150 ml pożywki YPA z galaktozą używając 1,5 ml standardowego inokulum. Inkubowano 24 godziny, po czym wirowano i rozbijano używając homogenizatora firmy Braun postępując zgodnie z instrukcją producenta. Uzyskano większe ilości białka (tab. 4) niż przy ręcznym rozbijaniu na vortexie.

PL 199 189 B1

T a b e l a 4. Hodowle na podłożu pełnym z induktorem i uzyskane z nich ekstrakty białkowe

Szczep	OD 600 nm	Biomasa uzyskana z 75 ml hodowli (g)	Ilość białka w ekstrakcie (mg/ml)	Ilość białka (mg) na 1 g biomasy
WHBS	5,51	1,19	17,90	22,50
W303 (pYES2)	5,60	1,15	12,28	15,48

Procedury badania ekspresji HBsAg w transformowanych komórkach Saccharomyces cerevisiae

Materiałem wyjściowym w oznaczeniach rekombinowanego HBsAg były ekstrakty białkowe z droż dż y uzyskiwane przez mechaniczne rozbicie komórek w homogenizatorze firmy Braun. Procedury oparto o metodę ELISA i testowano z uwzględnieniem próby ślepej i kontroli negatywnej do oceny poziomu tła. Próbę ślepą (BLK) stanowił bufor do rozcieńczania prób. Ekstrakt z drożdży transformowanych wektorem pYES 2 (drożdże kontrolne) stanowił kontrolę negatywną. Poprawność wykonania oznaczenia oceniano przy użyciu kontroli pozytywnej - próby zawierającej firmowy antygen. W bezwzględnych oznaczeniach iloś ciowych rekombinowany HBsAg, podtyp ayw, firmy Biodesign, używano do sporządzenia roztworów standardowych.

W każdej z opracowywanych procedur pierwszy etap przygotowania prób do analizy polegał na wyrównaniu stężenia białek rozpuszczalnych w ekstraktach z drożdży badanych i kontrolnych przy użyciu buforu lizującego. Następnie do tak przygotowanych prób wprowadzano typowe dla ELISY składniki buforu do inkubacji, po czym przygotowywano serię 2-krotnych rozcieńczeń prób w buforze inkubacyjnym.

Właściwy wynik oznaczenia stanowił liniowy odcinek krzywej miareczkowania ekstraktów z droż dż y badanych skorygowany o wartości tła uzyskane przez miareczkowanie prób kontrolnych.

Półilościowe (względne) oznaczenie HBsAg

Oznaczenia przeprowadzono z użyciem zestawu: Hepanostika HBsAg Uni-Form II (Organon Teknika), który jest immunoenzymatycznym testem diagnostycznym na obecność HBsAg (podtyp ad i ay) w ludzkiej surowicy lub osoczu. Procedurę zalecaną przez producenta zmodyfikowano w zakresie umożliwiającym wykrywanie antygenu w ekstraktach białkowych z drożdży. Ze względu na to, że dołki płytki zestawu zawierają większość reagentów niezbędnych do związania i wykrycia antygenu (monoklonalne przeciwciała - Mab - przeciwko HBs opłaszczające dołek i liofilizowane owcze przeciwciała anty HBsAg znakowane peroksydazą chrzanową - HRP), oznaczenie z użyciem zestawu ograniczone było do: inkubacji z próbami, inkubacji z substratem HRP, dodania roztworu hamującego reakcję enzymatyczną i odczytu absorpcji prób.

Na płytkę nakładano (po 100 μΐ/dołek):

- ekstrakty z drożdży badanych i kontrolnych w 3 rozcieńczeniach, równoważnych stężeniom białka całkowitego zwykle niższym niż 0,1 mg/ml;

- kontrolę pozytywną zawierającą 3,0 ± 1,5 U/ml HBsAg, podtyp ad, produkowany przez ludzką linię komórkową (w zestawie);

- próbę ślepą (BLK).

Płytkę inkubowano przez 1 godzinę w temp. 37°C. Po 4-krotnym płukaniu, dodawano po 100 μΐ TMB/dołek. Reakcję hamowano po 30 min. przy użyciu 1 M H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy λ,=450 nm.

Opracowana procedura została wykorzystana w badaniach porównawczych ekspresji antygenu szczepionkowego w komórkach drożdży.

Ilościowe oznaczenie HBsAg

Ilościowe oznaczenie HBsAg przeprowadzono na zasadzie metody określanej jako sandwich ELISA, w której przeciwciała poliklonalne (Pab) przeciwko HBsAg (ad/ay) (Biodesign, Nr kat. B65811R) stosowano jako przeciwciało I a ich koniugat z biotyną jako przeciwciało II. Przeciwciała wyznakowano biotyną przy użyciu preparatu NHS-biotyną (Sigma, Nr kat. H-1759).

Płytkę (MaxiSorp, Nunc, Nr kat. 469914) opłaszczano Pab przeciw HBsAg (ay/aw) (Biodesign, Nr kat. B65811R) w buforze węglanowym w stężeniu 5 μg/ml. Po inkubacji w temp. +4°C w ciągu nocy, płukaniu i blokowaniu 2% BSA/PBS, na płytkę nakładano:

- roztwory standardowe antygenu (HBsAg, podtyp ayw, Biodesign, Nr. kat. R86870) w stężeniach 1 - 250 ng/ml;

- ekstrakty drożdży transformowanych genem dla HBsAg oraz drożdży kontrolnych rozcieńczone seryjnie w 2% BSA/PBS do stężeń w zakresie 0,700 - 0,005 mg białka całkowitego/ml;

- próby ślepe.

PL 199 189 B1

Wykrywanie związanego antygenu obejmowało: 1-godzinną inkubację w temp. 37°C z koniugatem anty-HBsAg Pab-biotyna (1:10 000), następnie 30-minutową inkubację w temp. 37°C z koniugatem streptawidyna-HRP (1:1 500) a na końcu z ABTS - substratem peroksydazy w temp. pokojowej. Po 30 minutach od dodania substratu, dodawano 2% SDS a następnie odczytywano absorpcję prób w czytniku do płytek ELISA przy λ,=410 nm.

HBsAg oznaczono zgodnie z opisanym protokołem w tych badaniach ekspresji antygenu, które miały na celu określenie poziomu ekspresji antygenu w stosunku do rozpuszczalnych białek drożdży lub w przeliczeniu na biomasę i ustalenie masy drożdży zawierającej pożądaną dawkę antygenu szczepionkowego. Hodowle opisane w punktach A, B i C poddano analizie przy użyciu zestawu Hepanostika HBsAg Uni-Form II (Organon Teknika). Wyniki przeliczone na stężenie białka 0,1 mg/ml w ekstrakcie po uwzględnieniu kontroli ujemnej (ekstrakt ze szczepu W303(pYES2)) przedstawiono w tabeli 5.

T a b e l a 5. Wartości absorpcji specyficznej dla HBsAg dla hodowli indukowanej w róż nych czasach lub prowadzonej na podłożu minimalnym (M) i pełnym (P).

Czas indukcji [h] albo warunki hodowli	Absorpcja 450 nm
2	0,105
4	0,209
6	0,358
8	0,544
10	0,476
M	1,514
P	0,788

Wyniki dowodzą obecności białka HBsAg w ekstraktach drożdżowych. Wyraźne jest narastanie ekspresji w czasie indukcji. Najwyższe wartości absorpcji uzyskano dla hodowli prowadzonej na podłożu minimalnym w obecności induktora. Dobry poziom ekspresji obserwowano na podłożu pełnym z induktorem. Jak podano w tabelach 2, 3 i 4, skuteczność rozbijania komórek była dla poszczególnych hodowli zróżnicowana. Szczególnie wyraźnie widać to w ilości miligramów białka uzyskiwanych z 1 g biomasy. Wartości dla szczepu WHBS wahają się od 7,19 do 16,04 w przypadku rozbijania komórek na vortexie i rosną do 22,5 mg białka na 1 g biomasy przy rozbijaniu na homogenizatorze firmy Braun. Nie jest to związane z rodzajem hodowli lub szczepem, lecz raczej rodzajem zastosowanej techniki rozbijania komórek. Podobny rozrzut wyników, jak ten przytoczony dla szczepu WHBS, obserwowano dla szczepu kontrolnego W303 (pYES2). Uwzględniono to w kolejnych testach.

D. Hodowle na podłożu pełnym z induktorem inkubowane przez różny czas

Inokulum przygotowywano w sposób standardowy i używano do szczepienia podłoża pełnego z galaktozą o objętości 100 lub 150 ml. Pożywki szczepiono w proporcji 1/100.

Po odwirowaniu rozbijano na homogenizatorze stosując 6 cykli rozbijania, a następnie analizowano za pomocą zestawu Hepanostika.

T a b e l a 6. Hodowla sporządzona na podłożu pełnym przy zróżnicowanym czasie inkubacji i uzyskane z nich ekstrakty bia ł kowe

Czas (h)	OD 600 nm	Ilość biomasy ze 100 ml hodowli (g)	Biomasa (g)	Ilość białka w ekstrakcie (mg/ml)	Ilość białka (mg) na 1 g biomasy
14	4,82	0,73	0,72	7,74	35,09
21	6,70	1,15	1,05	8,92	43,37
64	7,96	1,36	0,70	8,42	39,25

Uzyskano wysokie wartości absorpcji. Wyniki standardowo przeliczono dla stężenia białka 0,1 mg/ml, wynosiły one 1,972 dla 14 godzin hodowli, 3,348 dla 21 godzin hodowli i 1,432 dla 64 godzin hodowli. Należy odnotować duży wzrost ilości białka uzyskiwanego z 1 grama biomasy związany ze zwiększeniem cykli rozbijania. Podobne ilości białka uzyskano dla namnażanych w tych samych warunkach hodowli kontrolnego szczepu W303 (pYES2) (dane nie przedstawione).

PL 199 189 B1

Wartości absorpcji odpowiadające ilości HBsAg uzyskane dla poszczególnych hodowli są dość bliskie. Wskazuje to, że ekspresja HBsAg przebiega stabilnie w analizowanym szczepie. Najwyższe wartości absorpcji związanej z obecnością HBsAg uzyskano dla 21-godzinnej hodowli o OD = 6,7, dającej 1,15 g biomasy ze 100 ml hodowli. Wyniki te wskazują, że są to najlepsze parametry hodowli. Wysoka wartość absorpcji uzyskana dla 64-godzinnej hodowli oznacza, że białko ulega stabilnej ekspresji i utrzymuje się także w komórkach starych hodowli.

Ustalenie dokładnej ilości HBsAg wykonano dla hodowli 14-godzinnej ilościowym testem ELISA.

Wykazał on obecność 2,535 μg antygenu HBsAg w 1 g biomasy. Dla tej hodowli oznacza to, że ze 100 ml można uzyskać 1,86 μg antygenu. Dla hodowli 21-godzinnej wykonano ilościową analizą HBsAg. 1 g biomasy zawierał 5,06 μg antygenu, co oznacza, że ze 100 ml hodowli tej hodowli można uzyskać 5,8 μg HBsAg. Wartości te są wyższe niż publikowane dane na temat ekspresji HBsAg pod kontrolą promotora ADHI, gdzie uzyskiwano 2-5 μg HBsAg z 200 ml hodowli (Schneider J.C., Guarente L., Methods in Enzymology, 1991, 194, 373-388).

Podsumowanie. W wyniku opisanych testów wykazano metodami immunologicznymi obecność antygenu wirusowego HBsAg w komórkach drożdży szczepu WHBS. Stwierdzono, że ekspresja genu kodującego HBsAg podlega efektywnej indukcji galaktozą. Analizowano hodowle uzyskane na podłożu minimalnym i pełnym. Ilość HBsAg wyraźnie zależy od warunków hodowli, czasu hodowli, czasu indukcji. Ilość antygenu dla 21-godzinnej hodowli indukowanej oznaczona testem ilościowym wynosiła 5,06 μg na 1 g biomasy.

P r z y k ł a d 4. Hodowla drożdży przeznaczonych do immunizacji myszy

Hodowlę prowadzono na podłożu pełnym z galaktozą przez 24 h, w standardowy sposób, w porcjach pożywki po 150 ml. Przed żwirowaniem hodowle z poszczególnych kolb łączono i mieszano. Komórki odwirowane zgodnie z opisem podanym w przykładzie 3, przeznaczone do podania myszom przechowywano w razie potrzeby w temperaturze -20°C. Możliwe jest też poddawanie otrzymanych komórek liofilizacji i przygotowywanie szczepionek doustnych w oparciu o preparaty liofilizowane.

Poziom ekspresji HBsAg w drożdżach przeznaczonych do immunizacji myszy oznaczano zgodnie z procedurą, opisaną wyżej jako „Ilościowe oznaczanie HBsAg.

P r z y k ł a d 5. Immunizacja doustna szczepionką drożdżową

Myszy immunizowano przez podanie drożdży z ekspresją antygenu szczepionkowego drogą pokarmową. Efektywność szczepienia badano przez oznaczenie miana antygenowe-specyficznych przeciwciał klasy IgG.

Badania przeprowadzono na myszach, jednorocznych samicach linii wsobnych BALB/c pochodzących z Zakładu Genetyki i Hodowli Zwierząt Centrum Onkologii w Warszawie. Myszy (5 sztuk w grupie) immunizowano przez podanie 0,1 i 0,5 g drożdży z ekspresją HBsAg (~ 2 μg/g biomasy) w odstępie miesiąca, przy czym biomasę uzyskano w wyniku odwirowania hodowli z przykładu 4 zgodnie z opisem w przykładzie 3. Kontrolne myszy (5 sztuk w grupie) karmiono drożdżami zawierającymi wektor bez genu dla HBsAg, stosując taki sam reżim karmienia jak w przypadku myszy immunizowanych. Krew pobierano przyżyciowo myszom immunizowanym i kontrolnym 2 dni przed pierwszym karmieniem oraz 2 tygodnie po pierwszym i 2 tygodnie po drugim podaniu drożdży. Stosowano heparynę (Sigma, Nr kat. H-1027) jako antykoagulant. Osocza myszy z tej samej grupy łączono i zamrażano w porcjach, w temp. -20°C.

Oznaczenie poziomu przeciwciał przeciwko HBsAg w osoczu

Osocza myszy immunizowanych badano na obecność przeciwciał klasy IgG przeciwko HBsAg metodą ELISA. Płytkę PolySorp (Nunc, Nr kat. 475094) opłaszczono HBsAg (ayw) (Biodesign, Nr kat. C86313M) w buforze węglanowym, pH=9,6 (2 μg/ml), stosując całonocną inkubację w temp. +4°C. Po blokowaniu z użyciem 2% BSA/PBS, na płytkę nakładano osocza myszy immunizowanych i kontrolnych w rozcieńczeniach od 1:3 do 1:384. Przeciwciała monoklonalne przeciwko HBsAg (ayw) (Biodesign, Nr kat. C86313M) stosowano jako kontrolę pozytywną. Bufor do rozcieńczania prób (2% BSA/PBS) stanowił próbę ślepą (BLK). Płytkę inkubowano w ciągu nocy w temp. +4°C. Wywoływanie płytki obejmowało inkubację kolejno z: przeciwciałami przeciwko mysim IgG znakowanymi HRP (Sigma, Nr kat. A-4416) w rozcieńczeniu 1:1 000 (1 godzina, 370C) i TMB - substratem HRP (30 min, temp. pokojowa). Reakcję hamowano przez dodanie 0,5 M H2SO4. Absorpcję prób odczytywano przy λ=450 nm. Wyniki przedstawiono na figurze 9.

Test ELISA na obecność specyficznych wobec HBsAg przeciwciał klasy IgG wykazał zwiększoną reaktywność osocza myszy karmionych drożdżami z ekspresją HBsAg. Przy rozcieńczeniach

PL 199 189 B1 w zakresie 1:3 - 1:48, osocze myszy immunizowanych dawało absorpcję średnio ~1,3 razy wyższą niż myszy kontrolnych i ~1,8 razy wyższą niż próby pobrane przed immunizacją.

Po podaniu 1-szej dawki drożdży, osocze myszy immunizowanych HBsAg, rozcieńczone mniej niż 96 razy, dawało wyższy poziom absorpcji niż osocze myszy kontrolnych; różnice wartości absorpcji wynosiły od 0,10 przy rozcieńczeniu 1:48 do 0,35 przy rozcieńczeniu 1:3. Osocze myszy immunizowanych 2-krotnie dawało wyższy poziom absorpcji w porównaniu z osoczem myszy karmionych 2 razy drożdżami bez antygenu przy rozcieńczeniach mniejszych niż 1:48; różnice wartości absorpcji wynosiły od 0,07 przy rozcieńczeniu 1:24 do 0,48 przy rozcieńczeniu 1:3. U myszy karmionych drożdżami zawierającymi HBsAg obserwowano także łysienie, szczególnie wyraźne po zastosowaniu dwóch dawek antygenu, co także świadczy o wystąpieniu reakcji na podany antygen. Podobny efekt obserwowano uprzednio u ludzi szczepionych klasyczną szczepionką przeciw HBV. Z 60 odnotowanych przypadków łysienia u ludzi związanego z immunizacją, 46 przypadków dotyczyło osób, które szczepiono przeciwko HB (Wise R.P., Kiminyo K.P., Salive M.E. 1997. JAMA 278, 1176-1178).

Claims (14)

1. Szczepionka doustna zawierająca antygen i korzystnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że antygen syntetyzowany jest w komórce drożdżowej.

2. Szczepionka doustna według zastrz. 1, znamienna tym, że drożdże zostały wybrane spośród szczepów Saccharomyces sp., Hansenula sp., Pichia sp., Kluyveromyces sp., Zygosaccharomyces sp., Yarrowia sp., Debaryomyces sp., Candida sp., Hanseniaspora sp. i Cryptococcus sp., korzystnie spośród: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia membranaefaciens, Kluyveromyces lactis, Zygosaccharomyces bailii, Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii, Candida catenulata, Candidia spharica i Candidia diffluens.

3. Szczepionka doustna według zastrz. 1, znamienna tym, że komórka drożdży zawiera funkcjonalną kasetę ekspresyjną niosącą sekwencję nukleotydową kodującą antygen.

4. Szczepionka doustna według zastrz. 1, znamienna tym, że antygenem jest antygen motylicy wątrobowej, antygen wirusa klasycznego pomoru świń, HBsAg.

5. Szczepionka doustna według zastrz. 4, znamienna tym, że antygen motylicy wątrobowej zawiera sekwencję aminokwasową proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej lub jej fragment, przy czym korzystnie antygen motylicy wątrobowej jest kodowany przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 5 albo figurze 6.

6. Szczepionka doustna według zastrz. 4, znamienna tym, że antygen wirusa klasycznego pomoru świń zawiera sekwencję aminokwasową białka otoczki wirusa lub jej fragment, korzystnie sekwencję aminokwasową białka E2 lub jej fragment, przy czym korzystnie antygen wirusa klasycznego pomoru świń jest kodowany przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 7 albo figurze 8.

7. Szczepionka doustna według zastrz. 4, znamienna tym, że antygen HBsAg zawiera sekwencję aminokwasową białka S pochodzącego z HBV ayw4 określonego w Gen-Bank Acc.Nr Z35716 lub jej fragment.

8. Szczepionka doustna według zastrz. 7, znamienna tym, że antygen HBsAg jest kodowany przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 2 albo figurze 3 albo figurze 4.

9. Zastosowanie drożdży zdolnych do ekspresji antygenu do produkcji szczepionki doustnej, przy czym korzystnie drożdże zostały wybrane spośród szczepów Saccharomyces sp., Hansenula sp., Pichia sp., Kluyveromyces sp., Zygosaccharomyces sp., Yarrowia sp., Debaryomyces sp., Candida sp., Hanseniaspora sp. i Cryptococcus sp., korzystnie spośród: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia membranaefaciens, Kluyveromyces lactis, Zygosaccharomyces bailii, Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii, Candida catenulata, Candidia spharica i Candidia diffluens.

10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że antygenem jest antygen motylicy wątrobowej, antygen wirusa klasycznego pomoru świń, HBsAg.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że antygen motylicy wątrobowej zawiera sekwencję aminokwasową proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej lub jej fragment, przy czym korzystnie antygen motylicy wątrobowej jest kodowany przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 5 albo figurze 6.

PL 199 189 B1

12. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że antygen wirusa klasycznego pomoru świń zawiera sekwencję aminokwasową białka otoczki wirusa lub jej fragment, korzystnie sekwencję aminokwasową białka E2 lub jej fragment, przy czym korzystnie antygen wirusa klasycznego pomoru świń jest kodowany przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 7 albo figurze 8.

13. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że antygen zawiera sekwencję aminokwasową HBsAg lub jej fragment, przy czym korzystnie antygen HBsAg zawiera sekwencję aminokwasową białka S pochodzącego z HBV ayw4 określonego w Gen-Bank Acc.Nr Z35716 lub jej fragment.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że antygen HBsAg jest kodowany przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na figurze 2 albo figurze 3 albo figurze 4