KR101526053B1

KR101526053B1 - 재조합 백신 개발을 위한 효모 야로위아 리폴리티카에서 코돈 최적화된 원형 및 n 단편-절단 형태의 노다 캡시드 단백질 생산 방법

Info

Publication number: KR101526053B1
Application number: KR1020130079709A
Authority: KR
Inventors: 강현아; 김홍진; 문혜연; 전선아
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2012-09-21
Filing date: 2013-07-08
Publication date: 2015-06-11
Also published as: KR20140039972A

Abstract

본 발명은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)에서 노다바이러스 캡시드 단백질을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 균주, 이 균주를 사용한 노다바이러스의 캡시드 단백질을 생산하는 방법, 및 상기 균체, 배양물 또는 이로부터 분리한 노다바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 안정성이 입증된 식품용 효모 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 발현시스템을 이용하여 노다바이러스 캡시드 단백질을 대량생산함으로써, 노다바이러스에 대한 안전한 백신을 경제적으로 제공할 수 있는 효과가 있다.

Description

재조합 백신 개발을 위한 효모 야로위아 리폴리티카에서 코돈 최적화된 원형 및 N 단편-절단 형태의 노다 캡시드 단백질 생산 방법{Method for production of codon-optimized intact and N-terminal truncated Noda Capsid Protein in the Yeast Yarrowia lipolytica for recombinant vaccine development}

본 발명은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)에서 노다바이러스 캡시드 단백질을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 균주, 이 균주를 사용한 노다바이러스의 캡시드 단백질을 생산하는 방법, 및 상기 균체, 배양물 또는 이로부터 분리한 노다바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

해산어 종묘 생산 과정에서 큰 피해를 입히고 있는 여러 질병 중 높은 폐사율을 보이는 노다바이러스(Nodavirus)는 단일가닥 RNA 바이러스로서 직경 25-30 nm의 크기의 정 20면체 모양을 지니고 있다(Ling et al., 2002). 노다바이러스는 신경 괴사 바이러스(Nervous Necrosis Virus)로서 어류의 신경세포에 감염되어 바이러스성 뇌수막염을 유발하여 대량 폐사를 초래한다. 노다바이러스는 특히 수온이 20℃ 이상일 때 폐사율이 높아서, 여름철 고수온기에 넙치, 능성어, 농어 등을 대량 폐사시키는 것으로 알려져 있다. 반면 15℃에서는 폐사가 발생되지 않아 온도에 민감한 병원성을 보이는 것으로 보고되어 있다(Roberts et al., 2001).

어류 노다 바이러스는 두 개의 단일쇄 mRNA를 가지고 있는데, 이중 3.1 kb 크기의 큰 RNA1은 RNA-의존적 RNA 중합체인 protein A와 아직 기능이 밝혀지지 않은 protein B 합성에 관여되어 있으며, 1.4 kb 크기의 작은 RNA2는 캡시드 단백질(coat protein, capsid protein) 합성에 관련된 유전자이다(Nishizawa et al., 1995). 어류 노다바이러스는 외막 단백질의 부분적인 뉴클레오타이드 서열 패턴에 따라 유전자형(genotype)을 구분하는 데, 특히, 캡시드 단백질은 중화 반응을 일으키는 면역유도 특성이 있음이 알려져 있다(Nagai et al., 1999). 노다 바이러스 캡시드 단백질은 극저온 전자현미경(cryo microscopy) 분석을 통해 구조가 밝혀졌다. 83-216 아미노산은 베타-샌드위치(beta-sandwich) 구조를 가지는데 이는 캡시드 안쪽을 구성하며, 217-308 아미노산은 삼량체의 표면 돌출부를 형성한다. 이는 tomato bushy stunt virus와 노로 바이러스와 유사한 구조로서 노다 바이러스의 진화적 이해에 도움을 제공할 수 있다(Ling et al., 2002). 이러한 구조에서 이황화 결합에 관여할 것이라 여겨지는 일부 시스테인(cystein)을 알라닌(alanine)으로 치환할 경우 바이러스 입자의 조립과 열 안전성에 영향을 미침이 알려져 있다(Wang et al., 2010). 또한 N-말단 23-31 RRRANNRRR 아미노산 서열은 핵으로의 이동에 중요한 기능을 담당하고 있음을 캡시드-GFP 융합 단백질을 SB 세포주(Asian sea bass), Cos-7 세포주(섬유아세포)에 발현시킨 실험을 통해 확인하였다(Guo et al., 2003).

재조합 백신 개발을 위한 캡시드 단백질의 발현은 여러 균주에서 시도되어 왔다. LMH(leghorn male hepatoma) 세포주에서 캡시드 단백질의 발현이 시도되었고(Huang et al., 2007), DGNNV(Dragon grouper, Epinephelus lanceolatus,necrvous virus) 캡시드 단백질을 대장균에서 N-말단 또는 C-말단이 절단된 형태로 발현하였을 때 N-말단이 25개 아미노산이 절단된 형태까지만 바이러스 유사입자를 형성하였으며, C-말단은 3개 아미노산이 절단된 형태까지만 바이러스 입자를 형성하였다(Lu et al., 2003). 최근 대장균에서 full-ORF 캡시드 단백질이 고발현시 봉입체(inclusion body)로 발현됨이 보고되었다(Goh et al., 2011).

대장균 및 동물세포에 비해 효모는 저렴한 비용으로 손쉽게 원하는 재조합 단백질들을 생산할 수 있어서 경제성이 높으며, 거의 인류 문명이 발생한 시점에서부터 발효 과정에 많이 사용되어온 안전성이 입증된 미생물이다. 일반적으로 인체에 안정한 GRAS (Generally Recognized As Safe) 미생물로 알려진 효모 발현 시스템을 활용하여 의료용 또는 식품용 재조합 단백질을 대량 생산 시스템이 전통효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 대상으로 활발히 진행되어 왔다. 최근에는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) 보다 우수한 새로운 효모 균주를 대체 숙주로 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되어서 메타놀자화 효모인 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 분열형 효모인 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 알칸자화 효모인 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 유당 생산 효모인 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)와 식품 효모 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 등 여러 사카로마이세스 속이 아닌 효모(비전통 효모)를 이용한 발현 시스템이 주목을 받고 있다(Mattanovich et al., 2012). 동일한 재조합 단백질 생산 시 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)에서보다 이들 비전통 효모들에서 생산수율이 높게 나타나는 경우가 자주 있으며, 당단백질 발현시 사카로마이세스 세레비지애에 비해 과당화(hypermannosylation)가 훨씬 적게 일어나며 무엇보다 효모 특이적 면역반응을 유발하는 알파 1,3-만노즈기가 말단에 부착되지 않는다는 장점들로 인해 이들 비전통 효모들은 재조합 단백질 생산 숙주세포로서 유용한 발현시스템으로 각광 받고 있다(Kim et al., 2006, Song et al. 2007). 이들 비전통 효모들 중 야로위아 리포리티카 속 효모들은 소수성 기질을 잘 이용할 수 있는 특징이 있기 때문에 알칸과 같은 값싼 기질을 이용하여 자라는 장점이 있다. 또한 야로위아 리폴리티카 속에는 치즈, 소세지 같은 식품에 서식하거나 또는 해양에서 성장하는 효모 종들이 포함되어 있어 대체로 성장온도가 28℃로 낮은 편이어서 어류 감염 바이러스 단백질과 같이 저온에서 활성이 높은 단백질 발현에 아주 유용한 균주로 이용될 수 있다(Fickers et al., 2005; Madzak et al., 2004).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 발현 시스템을 사용하여 노다바이러스 백신용 항원 단백질을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 야로위아 리폴리티카 효모에서 노다바이러스 캡시드 단백질을 발현시킬 수 있는 재조합 벡터 및 발현 시스템을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)에서 노다바이러스 캡시드 단백질을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 균주를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)에서 노다바이러스의 캡시드 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 균체, 배양물 또는 이로부터 분리 정제된 노다바이러스 캡시드 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)에서 노다바이러스(nodavirus) 캡시드(capsid) 단백질을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터로서, (i) 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열; (ⅱ) 상기 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터로서, 야로위아 리폴리티카에서 전사(transcription) 개시를 할 수 있는 프로모터; (ⅲ) 선별 마커(selection marker)를 코딩하는 DNA 서열; 및 (iv) 야로위아 리폴리티카에서 벡터를 유지시킬 수 있는 복제원점(replication origin)을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “노다바이러스”는 노다바이러스과(nodaviridae family)에 속하는 바이러스로서 곤충을 숙주로 하는 알파노다바이러스(alphanodavirus)와 어류에 감염하는 베타노다바이러스(betanodavirus)를 모두 포함한다. 노다바이러스는 엔벨로프(envelope)를 갖지 않으며, 비리온의 크기는 29 - 35 nm이며, 캡시드(capsid)는 32개의 캡소머(capsomer)으로 구성된다. 노다바이러스의 지놈(genome)은 선형(linear)이며 포지티브 센스(positive sense)이고, RNA 1와 RNA 2의 2개의 부위로 구성된, 약 4500 뉴클레오타이드로 이루어진 단일쇄 RNA이다.

약 3.1 kb 크기의 RNA 1은 다중성 기능의 도메인을 갖는 단백질을 코딩하며, 상기 다중성 기능 도메인은 미토콘드리아 타겟팅 도메인, 막통과 도메인(transmembrane domain), RNA-의존성 RNA 중합효소(RdRp) 도메인, 자기-상호작용 도메인 및 RNA 캡핑 도메인이다. 또한, RNA 1은 RNA 침묵(RNA silencing) 억제자인 단백질 B2로 번역되는 서브 지놈 RNA3를 코딩한다.

약 1.4 kb 크기의 RNA 2는 바이러스 캡시드 단백질 전구체인 단백질 α를 코딩하며, 단백질 α는 바이러스 조립이 이루어지는 동안에 2개의 성숙 단백질인 38 kDa β 단백질과 5 kDa γ 단백질로 절단된다.

바람직하게는 본 발명의 “노다바이러스”는 어류에 감염하는 베타노다바이러스(betanodavirus)이며, 상기 베타노다바이러스는 SJNNV(striped jack nervous necrosis virus), BFNNV(barfin flounder nervous necrosis virus), TPNNV(tiger puffer nervous necrosis virus), RGNNV(red spotted grouper nervous necrosis virus), MGNNV(malabaricus grouper nervous necrosis virus), 및 DGNNV(dragon grouper nervous necrosis virus)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 “노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열”은 당업계에 공지된 적합한 방법을 통해 얻을 수 있다. 예컨대, 총 바이러스 RNA를 주형으로 하여 적합한 프라이머(primer)와 역전사 중합효소연쇄반응(reverse-transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)을 통해 cDNA로 증폭할 수 있다. 총 바이러스 RNA는 예컨대 노다바이러스에 감염된 어류의 뇌로부터 분리할 수 있다. 클로닝한 cDNA는 적합한 발현벡터안으로 삽입시키고, 캡시드 단백질의 발현을 위해 숙주세포에 형질전환시킨다.

본 발명에서 상기 “노다바이러스 캡시드 단백질”은 서열번호 3의 아미노산 서열, 이 서열과 적어도 70％ 동일성, 적어도 80％ 동일성, 적어도 90％ 동일성, 적어도 95％ 동일성, 또는 적어도 99％ 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 노다바이러스 캡시드 단백질로 이루어진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 서열번호 2에 개시된 DNA 서열이다. 서열번호 2의 DNA 서열은 서열번호 1에서 NLS (nucleus localization sequence)를 코딩하는 DNA 서열이 제거된 서열로서, 노다바이러스 캡시드 단백질에서 N-말단 NLS 서열이 제거된 형태의 캡시드 단백질을 코딩한다.

본 발명의 재조합 벡터는 상기 노다바이러스 캡시드 단백질을 발현시키기 위한, 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)에서 전사(transcription) 개시를 할 수 있는 프로모터가 포함된다.

본 명세서에서 용어 “작동 가능하게 연결된”은 DNA 서열의 발현조절 서열(예컨대 프로모터)과 기능적으로 결합되어 있다는 의미로서, 기능적 결합에 의해 DNA 서열의 발현이 발현조절 서열에 의해 조절된다.

본 명세서에서 용어 “프로모터”는 유전자 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다.

본 발명의 효모 야로위아 리폴리티가에서 사용될 수 있는 프로모터는 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트키나아제 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)], 당화 효소[(Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); 및 Holland et al., Biochem. 17:4900, (1978)], 예컨대, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-인산 디히드로지나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포플럭토키나아제, 글루코즈-6-인산 아이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나아제, 트리오세포스페이트 아이소머라제, 포스포글루코즈 아이소머라제, 및 글루코키나아제의 프로모터들이 포함되며, 가장 바람직하게는 TEF 프로모터를 포함한다.

본 발명의 재조합 벡터는 전사의 종료를 위해, 전사 종결자(transcription terminator)를 포함할 수 있으며, 예컨대, HSP150 종결자, TRP1 종결자, ADH1 종결자, GAP 종결자, MF1 종결자 또는 다른 기능적 종결자들이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 XPR 종결자이다.

본 발명의 재조합 벡터는 형질전환체의 선별을 용이하게 하기 위한 선별 마커(selection marker)를 포함한다. 상기 선별 마커는 예컨대 항생물질 내성 유전자, 대사 결핍특성을 갖는 효모 균주, 예컨대, 트립토판 또는 히스티딘 결핍성 돌연변이 균주를 보완할 수 있는 유전자이다. 바람직하게는 선별 마커에는 URA3, LEU2, HIS3, TRP1, HIS4, ARG4, 또는 항생물질 내성 유전자가 포함된다.

본 발명의 재조합 벡터는 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)에서 벡터를 유지시킬 수 있는 복제 원점(replication origin)을 포함한다. 예컨대, 적합한 복제 원점으로는 2μ, ARS1, 및 26 μM이 포함된다. 본 발명의 벡터는 벡터의 안정화를 위해 복제 원점에 CEN (yeast centromeric sequence)를 포함할 수 있다.

벡터의 조작은 박테리아 균주 내에서 더 효율적일 수 있으므로, 본 발명의 재조합 벡터는 박테리아 세포 내에서 복제 가능한 복제 원점을 포함할 수 있으며, 예컨대, ColE1, Ori, 또는 oriT가 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 도 3b 또는 도 3c에 도시된 벡터의 구성을 갖는다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술된 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 노다바이러스(nodavirus) 캡시드 단백질을 발현하는 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 균주를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 균주는 본 명세서 도 3b에 도시된 재조합 발현벡터 pYlTEF-LEU-YlNNV I 및 도 3c에 도시된 재조합 발현벡터 pYlTEF-URA-YlNNV I 로 각각 또는 동시에 형질전환된 야로위아 리폴리티카 균주이며, 보다 바람직하게는 재조합 발현벡터 pYlTEF-LEU-YlNNV I 및 재조합 발현벡터 pYlTEF-URA-YlNNV I 으로 동시에 형질전환된 야로위아 리폴리티카 균주(Yarrowia lipolytica)(KCTC 12272BP)이다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 의하면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)에서 노다바이러스(nodavirus)의 캡시드 단백질을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 상기 노다바이러스 캡시드 단백질을 발현하는 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 세포로부터 노다바이러스 캡시드 단백질을 분리 및 정제하는 단계.

본 발명의 방법에서 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터 및 이 발현벡터로 형질전환되어 상기 노다바이러스 캡시드 단백질을 발현하는 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 세포에 관한 내용은 상기 본 발명의 재조합 벡터에서 설명된 내용과 동일하므로 중복하여 기재하지 않는다.

본 발명의 방법에서 형질전환된 효모 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)의 배양은 효모 균주가 배양될 수 있는 당업자에게 공지된 배지를 사용하여 행한다. 효과적인 배지는 일반적으로 동화 가능한 탄수화물, 질소 및 포스페이트(phosphate) 원 뿐만 아니라, 적합한 염, 미네랄, 금속 및 비타민과 생장 인자와 같은 기타 영양분을 포함하는 수용성의 배지이다. 배지는 복합 영양분을 포함하거나 제한된 최소 배지일 수도 있다. 본 발명의 형질전환 효모는 생물 반응기, 플라스크, 시험관, 마이크로타이터 디쉬 및 페트리 플레이트를 포함한 다양한 용기에서 배양될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 효모의 배양은 효모 세포에 적합한 온도, pH 및 산소 농도에서 수행한다. 효모 세포의 배양 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 예컨대 Guthrie et al. (eds.), 1991, Methods in Enzymolgy, vol.194, Academic Press, San Diego를 참조할 수 있다.

형질전환 야로위아 리폴리티카의 세포 배양물로부터 발현된 노다바이러스 캡시드의 분리 및 정제는 당업계에 공지된 다양한 단백질 분리 및 정제 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 상기 노다바이러스 캡시드 단백질을 발현하는 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 균체, 배양물 또는 이로부터 분리 정제된 노다바이러스 캡시드 단백질의 면역학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 백신 조성물의 형질전환 세포에서 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터는 상기 설명된 본 발명의 재조합 발현 벡터이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 상기 백신 조성물은 어류에서의 노다바이러스 감염증을 예방 또는 치료하기 위한 용도이다.

상기 노다바이러스는 알파노다바이러스 및 베타노다바이러스를 포함하며, 보다 바람직하게는 베타노다바이러스이다. 상기 베타노다바이러스는 예를 들어 SJNNV(striped jack nervous necrosis virus), BFNNV(barfin flounder nervous necrosis virus), TPNNV(tiger puffer nervous necrosis virus), RGNNV(red spotted grouper nervous necrosis virus), MGNNV(malabaricus grouper nervous necrosis virus), 및 DGNNV(dragon grouper nervous necrosis virus)를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 백신 조성물은 어류에 대한 백신 조성물이며, 상기 어류는 능성어류, 넙치, 농어, 또는 볼락류이나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 백신 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 항원 물질을 생체내 부위에 전달하는데 적합한 임의의 성분을 의미하며, 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 혈청 함유 용액, 한스 용액, 기타 수용성의 생리학적 평형 용액, 오일, 에스테르 및 글리콜 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 담체는 화학적 안정성 및 등장성을 증진시키기 위해 적합한 보조 성분과 보존제를 포함할 수 있으며, 트레할로스, 글라이신, 솔비톨, 락토오스 또는 모노소듐 글루타메이트(MSG)와 같은 안정화제를 포함시켜 온도 변화 또는 동결건조에 대해 백신 조성물을 보호할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 멸균수 또는 식염수(바람직하게는 완충된 식염수)와 같은 현탁 액체를 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 면역원에 대한 면역반응을 향상시키기에 충분한 양의 임의의 애쥬번트(adjuvant)를 함유할 수 있다. 적합한 애쥬번트는 문헌 Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875에 기술되어 있으며, 예컨대, 알루미늄염(알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 히드록시드), 스쿠알렌 혼합물(SAF-1), 무라밀 펩티드, 사포닌유도체, 마이코 박테리아 세포벽 제조물, 모노포스포릴 지질 A, 미콜산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B 서브유닛, 폴리포스파젠 및 유도체, 및 면역자극 복합체 (ISCOMs)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

다른 모든 백신 조성물과 마찬가지로, 면역원의 면역학적 유효량은 경험적으로 결정되어야 하며, 이 경우 고려될 수 있는 인자는 면역원성, 투여 경로 및 투여되는 면역 투여 회수를 들 수 있다.

본 발명 백신 조성물 중의 항원물질인 세포의 배양물 또는 노다바이러스 캡시드 단백질은 본 발명의 조성물내에서 다양한 농도로 존재할 수 있으나, 통상적으로, 상기 항원물질이 생체 내에서 적절한 수준의 항체 형성을 유도하기에 필요한 농도로 포함한다.

본 발명의 백신 조성물은 전신 또는 점막 경로를 통해 투여함으로써, 노다바이러스 감염에 민감한 동물을 보호하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 백신 조성물의 투여는 근내, 복막내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사, 경구/식사, 호흡기, 비뇨생식관으로의 점막 투여를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

백신 자체 또는 백신 조성물의 제조는 일반적으로 문헌 [Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York)]에 기술되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

도 1a 내지 도 1d는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)의 면역 유발성 측정 결과에 관한 것이다.
도 2a 및 도 2b는 야로위아 리폴리티카에서 발현을 위한 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 코돈 최적화 합성 cDNA(YlNNV)와 바이러스 유래 cDNA의 염기서열 및 아미노산 서열을 비교한 결과이다.
도 2c는 노다바이러스 캡시드 단백질에 대한 코돈 최적화된 합성 cDNA (YlNNV)를 갖는 박테리아 증폭용 벡터의 모식도이다.
도 3a는 야로위아 리폴리티카에서 발현시키기 위한 노다 바이러스 캡시드 단백질의 원형(structure 1) 및 N-말단 절단된 형태(structure 2와 structure 3)를 코딩하는 코돈 최적화 합성 cDNA의 염기서열 부위를 나타낸 것이다.
도 3b는 노다 바이러스 캡시드 단백질의 원형 및 N-말단 절단된 형태를 발현시키기 위한 LEU2 마커를 지닌 야로위아 리폴리티카용 발현 벡터 pYlTEF-LEU-YlNNV 벡터의 구조를 보여준다. 도 3b에서 pYlTEF-LEU-YlNNV(I)은 노다 바이러스 캡시드 단백질의 원형 단백질(structure 1)을 발현하기 위한 벡터이며, pYlTEF-LEU-YlNNV(II) 및 pYlTEF-LEU-YlNNV(III)는 바이러스 캡시드 단백질의 N-말단 절단된 형태(structure 2와 structure 3)를 발현하기 위한 벡터이다.
도 3c는 노다 바이러스 캡시드 단백질의 원형 형태를 발현시키기 위한 URA3마커를 지닌 야로위아 리폴리티카용 발현 벡터 pYlTEF-URA-YlNNV(I) 벡터의 구조를 보여준다.
도 4a는 pYlTEF-LEU 벡터를 사용하여, 야로위아 리폴리티카 코돈 최적화된 노다바이러스 캡시드 단백질 원형(structure 1) 및 N-단편 절단된 변이체 단백질들(structure 2 및 structure 3)의 발현을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다. Structure 1 및 Structure 2 형태의 노다바이러스 캡시드 단백질은 발현이 확인된 반면, Structure 3 형태의 노다바이러스 캡시드 단백질은 발현을 확인되지 않았다.
도 4b는 야로위아 리폴리티카 숙주에서 노다바이러스 캡시드 단백질 발현용 벡터의 카피 수(copy number) 증가에 의한 캡시드 단백질의 발현량 증가를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다. 도 4b에서 NNV는 pYlTEF-LEU-YlNNV(I) 벡터만을 포함하는 형질전환 야로위아 리폴리티카로부터 얻은 세포 파쇄액이며, 2*NNV는 두 개의 발현 벡터 pYlTEF-URA-YlNNV(I)와 pYlTEF-LEU-YlNNV(I)를 동시에 포함하는 형질전환 야로위아 리폴리티카로부터 얻은 세포 파쇄액이다.
도 5은 노다바이러스 캡시드 발현 야로위아 리폴리티카를 마우스에 경구로 3회 (왼쪽 패널), 4회 (오른쪽 패널) 면역시킨 후 혈중 노다바이러스 캡시드 단백질에 대한 IgG 역가를 ELISA 분석을 통해 측정 결과에 대한 도식도이다. 야생형 야로위아 리폴리티카 균체를 대조구로 투입하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 야로위아 리폴리티카 점막 면역 유발성 분석

야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 점막 면역 증강 유도능을 조사하기 위하여 모델 항원(model antigen)인 인플루엔자 A/PR/8/34 H1N1(이하, ‘인플루엔자’로 기재함) 약독화 백신과 함께 동물실험에 사용하였다. 실험 그룹은 ‘대조군(Control)’, 인플루엔자 백신만 투여한 ‘Vaccine only’ 그리고 인플루엔자와 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)를 함께 투여한 ‘Vaccine + Y. lipolytica’그룹으로 나누었다. 먼저, 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) (SMS397A-IL3)를 정지기(stationary phase)까지 배양 후 동결 건조하였다. 완전히 건조된 효모를 약독화 인플루엔자 백신과 함께 삼주 간격으로 2회 비강면역 하였다. 두 번째 면역 10일 후, 마우스 혈청 내 항-인플루엔자 A/PR/8/34 H1N1 IgG 역가(titer)를 간접 ELISA 기법으로 측정하였다(도 1a). 'Vaccine + Y. lipolytica' 그룹의 IgG 역가 중앙값(titer median)은 450으로, 'Vaccine only' 그룹의 150에 비하여 그 값이 3배 높았고, IQR 수치 또한 월등히 높은 모습을 보여, 점막을 통한 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)의 투여가 인플루엔자 백신에 대한 체액성 면역 반응을 올려준다는 사실을 도출할 수 있었다(도 1b). 이후 100 LD₅₀의 인플루엔자를 공격실험에 사용하였고, 2 주간 몸무게 변화와 사망률을 기록하였다. 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)가 함께 투여된 그룹은 'Vaccine only' 그룹에 비해 몸무게의 감소폭이 현저히 적었으며, 회복 또한 빨랐다(도 1c). 뿐만 아니라, 'Vaccine only' 그룹의 생존율이 40％인 것에 비교해, ‘Vaccine + Y.lipolytica’ 그룹은 75％로 월등히 높은 생존율이 관찰되어, 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)의 점막을 통한 투여가 면역 증강 유도능이 있다는 사실을 재확인하였다(도 1d).

실시예 2 : 야로위아 리폴리티카 코돈 최적화 노다 바이러스 캡시드 단백질( YlNNV ) cDNA 합성

한국형 노다바이러스 유전자 서열(Gomez et al., 2008)을 참조하여 야로위아 리폴리티카 코돈 정보를 토대로 코돈 최적화된 노다바이러스 캡시드(YlNNV) cDNA(서열번호 1)을 합성하였다. 코돈 최적화된 YlNNV는 원래의 바이러스 염기서열과 78％ 동일성을 유지하고 있고(도 2a), Expasy(http://www.expasy.org)의 번역툴(translation tool)로 아미노산 서열로 변형 후, NCBI의 BlastP로 비교한 결과 아미노산 서열은 동일하게 유지되고 있음을 확인하였다(도 2b). 확보된 YlNNV cDNA는 캐리어 벡터(carrier vector)인 pUC에 서브클로닝하여, pUCminus-YlNNV를 제작하였다(도 2c).

실시예 3 : 야로위아 리폴리티카 균주에서 코돈 최적화된 노다바이러스 캡시드( YlNNV)의 단백질의 발현

야로위아 리폴리티카를 숙주로 사용하여 야생형 형태의 노다바이러스 캡시드 단백질을 발현하기 위한 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 실시예 2에서 제작된 벡터 pUCminus-YlNNV을 주형으로 하고, 하기 표 1에 기재된 염기서열을 갖는 프라이머 YlNNV I-for 및 YlNNV I-rev 또는 YlNNV I-F-rev(epitope FLAG)을 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 행하여, 노다바이러스 캡시드 단백질에 대한 코돈 최적화된 전장 cDNA인 YlNNV(I)를 증폭하였다.

본 발명자들이 제작한 벡터로서 야로위아 리폴리티카 TEF 프로모터, LEU2 선별 마커(selection marker), 센트로미어(CEN)가 포함된 자가 복제서열 ARS68를 포함하는 pYlTEF-LEU 벡터와, 상기 제작한 cDNA YlNNV (I)를 각각 BamH I 및 Not I 제한효소를 처리하고, 이들을 접합(ligation)시켰다. 접합물을 대장균에 형질전환(transfection) 도입하여 pYlTEF-LEU-YlNNV(I)를 최종 제작하였다(도 3b). 제한효소 절단 패턴 및 염기 서열 분석으로 벡터 제작이 정확하게 이루어졌는지 확인하였다.

상기 제작한 pYlTEF-LEU-YlNNV(I) 벡터를 야로위아 리폴리티카 균주 IL3 (MatA, ade1, ura3, xpr2 leu2) 내로 형질전환시켰고, LEU2 선별마커를 이용하여 류신(leucin) 결핍 최소배지에서 성장하는 형질전환체들을 선별하였다. 확보된 형질전환체 Yl/pYlTEF-LEU-YlNNV(I) 균주를 전-배양한 후 본 배양은 OD = 0.5가 될 때까지 24시간 동안 배양후 원심분리를 통하여 효모 세포를 회수하였다. 회수한 효모 세포에 TNE (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) 완충용액를 첨가하여 세포를 파쇄하여 세포 용해물(lysate)을 제조하였다. 세포용해물을 SDS 샘플 로딩 버퍼(62.5 mM Tris-HCl pH=6.8, 0.1％ BPB, 10％ glycerol, 10％ SDS, 1％ beta-mercaptoethanol)와 혼합한 후, 끊는 물에 10분간 열처리하여 웨스턴 블롯(western blot) 분석을 수행하였다. 1차 항체는 노다바이러스 캡시드 항체와 FLAG 항체를 이용하였고, 2차 항체는 토끼(rabbit)-AP(alkaline phosphatase) 혹은 생쥐(mouse)-AP를 사용하였다. 분석 결과, 노다바이러스 캡시드 단백질의 발현을 노다 캡시드 항체와 FLAG 항체를 이용하여 확인할 수 있었다(도 4a).

실시예 4 : 야로위아 리폴리티카에서 N-단편 절단 노다 캡시드 단백질 발현

야로위아 리폴리티카에서 N-단편 절단 노다바이러스 캡시드 단백질을 발현하기 위해 상기 pUCminus-YlNNV 벡터를 주형으로 하고, 하기 표 1에 기재된 프라이머 YlNNV II-for 및 YlNNV I-rev 또는 YlNNV I-F-rev을 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 행하여, N-단편 절단된 형태의 노다 캡시드 단백질 cDNA인 YlNNV(II)와 YlNNV(III)를 증폭하였다. 상기 제작한 cDNA YlNNV(II) 또는 YlNNV(III)와 상기 pTEF-LEU 벡터를 각각 BamH I과 Not I 제한효소로 처리한 후, 이들을 접합(ligation)시켰다. 접합물을 대장균에 형질전환시켜 각각 pYlTEF-LEU-YlNNV(II)와 pYlTEF-LEU-YlNNV(III)를 제작하였다(도 3b). 제한효소 절단 패턴 및 염기 서열 분석으로 정확한 벡터 제작을 확인한 후 상기 벡터들을 야로위아 리폴리티카 세포내로 도입하였고, LEU2 선별 마커 유전자를 이용해서 류신(leucin)이 결핍된 최소배지에서 성장하는 형질전환체들을 선별하였다.

N-단편 절단된 형태의 YlNNV 발현 벡터를 지닌 형질전환체 Yl/pYlTEF-LEU-YLNNV(II) 및 Yl/pYlTEF-LEU-YLNNV(III)들을 전배양한 후 OD = 0.5가 될때까지 본 배양을 24 시간 동안 수행한 후, 실시예 4에 기술한 바와 같이 세포 파쇄액을 제조하여 웨스턴 블랏(western blot) 분석을 수행하였다.

1차 항체는 노다바이러스 캡시드 항체와 FLAG 항체를 이용하였고, 2차 항체는 토끼-AP(alkaline phosphatase) 혹은 생쥐-AP를 사용하였다. 그 결과 Yl/pTEF-LEU-YlNNV(II) 형질전환체의 경우, NLS(Necleus localization sequence)가 절단된 형태의 노다 캡시드 단백질(structure 2)은 노다 캡시드 항체와 FLAG 항체를 이용한 두 가지 모두 경우에 발현을 확인할 수 있었다. 이는 NLS 도메인이 없어도 캡시드 단백질 발현 및 항원성에 별다른 문제가 없음을 시사한다. 이에 반해, Yl/pYlTEF-LEU-YLNNV(III) 형질전환체의 경우, N 말단이 Structure 2에 비해 더욱 절단된 형태의 노다 캡시드 단백질(structure 3)은 구조적 불안정성에 의한 단백질 분해로 인해 노다 캡시드 항체 뿐만 아니라 FLAG 항체를 사용한 웨스턴 블랏 분석에서도 측정되지 않았다(도 4a).

유전자	프라이머	염기서열
YlNNV I	YlNNV I-for	5'-gaggatccatggtccgaaaaggtgaaaaa-3' (서열번호 4)
	YlNNV I-rev	5'-ttagtcgacttctagaccgttttcggaatcgact-3' (서열번호 5)
	YlNNV I-F-rev	5'-ttagtcgaccttatcgtcgtcatccttgtaatcttctagaccgttttcggaat cgact-3' (서열번호 6)
YlNNV II	YlNNV II-for	5'-gaggatccatgggtacaaacgacgtgcat-3' (서열번호 7)
YlNNV III	YlNNV III-for	5'-cgggatccatgactatagttcccgac-3' (서열번호 8)

실시예 5 : 벡터 카피 수 증가에 의한 야로위아 리폴리티카에서 재조합 노다 캡시드 단백질 발현 증폭

야로위아 리폴리티카를 숙주로 재조합 노다 캡시드 단백질의 발현양을 증대시키기 위해, 기존 형질전환 균주 Yl/pYlTEF-LEU-YlNNV(I)에 노다 바이러스 캡시드 단백질 발현 벡터를 추가 도입하였다. 먼저, URA3 선별 표지를 가진 발현 벡터 pYlTEF-URA-YlNNV(I)를 제작하였다. 이 벡터는 상기 설명된 pYlTEF-LEU-YlNNV(I) 벡터와 벡터 골격이 동일하지만 LEU2 대신 URA3 선별 표지를 가지고 있으며, ARS68 대신 ARS18을 갖고 있다(도 3c). ARS18는 자가 복제(autonomous replication) 기능 외에도 센트로미어 기능을 갖고 있어서, pYlTEF-URA-YlNNV(I)와 pYlTEF-LEU-YlNNV(I)는 동일한 숙주내에서 서로 안정되게 유지될 수 있다. 발현 벡터 pYlTEF-URA-YlNNV(I)은 실시예 4에서 설명된 바와 유사하게 pYlTEF-LEU-YLNNV(I) 벡터의 제조와 동일한 방식으로 행하여 제작하였다. 상기 제작한 pYlTEF-URA-YlNNV(I) 벡터를 Yl/pYlTEF-LEU-YLNNV(I) 균주내로 형질전환시켜 도입한 후 URA3 선별 표지 유전자를 이용해서 류신(leucin) 및 우라실(uracil)이 모두 결핍된 최소배지에서 성장하는 형질전환체들을 선별하였다. 확보된 형질전환체인 Yl/pYlTEF-LEU-YlNNV(I)/pYlTEF-URA-YlNNV(I) 균주를 전-배양한 후 OD = 0.5가 되도록 24시간 동안 본 배양을 수행하고, 원심분리하여 효모 세포를 회수하였다. 회수한 효모세포를 TNE 완충용액를 첨가하여 파쇄하여 세포용해물을 준비하였다. 준비된 세포용해물을 SDS 샘플 로딩 버퍼와 혼합한 후 끊는 물에 10분간 열처리하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 1차 항체는 노다 캡시드 항체를 이용하였고 2차 항체는 토끼-AP를 사용하였다. 그 결과 1-2개의 pYlTEF-LEU-YlNNV(I) 벡터를 가진 야로위아 리폴리티카 균주 "Yl/pYlTEF-LEU-YlNNV(I)"와 비교하여, 총 2-4개의 pYlTEF-LEU-YlNNV(I)/pYlTEF-URA-YlNNV(I) 벡터를 가진 균주"Yl/pYlTEF-LEU-YlNNV(I)/pYlTEF-URA-YlNNV(I)"에서 더욱 많은 양의 노다바이러스 캡시드 단백질이 발현되고 있음을 확인할 수 있었다(도 4b).

상기 본 발명에서 제작한 재조합 야로위아 리폴리티카 균주 “Yl/pYlTEF-LEU-YlNNV(I)/pYlTEF-URA-YlNNV(I)”는 2012년 9월 3일자로 한국생명공학연구원내 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁번호 KCTC 12272BP로 기탁하였다.

실시예 6 : 경구 투여된 노다바이러스 캡시드 단백질 발현 재조합 야로위아 리폴리티카의 면역 유발성 분석

상기 제작된 노다바이러스 캡시드 단백질 발현 재조합 야로위아 리폴리티카 자체를 경구용 백신으로 활용할 수 있는 가능성을 조사해 보기 위해 경구 투여할 효모 균주들을 24시간 YPD 배지에서 24시간 배양 후 동결건조하였다. 동결 건조된 야생형 야로위아 리폴리티카 균주와 재조합 야로위아 리폴리티카 Yl/pYlTEF-LEU-YlNNV(I)/pYlTEF-URA-YlNNV(I) 균주를 각각 마우스에 dose당 150 mg(dry weight)씩 2주 간격 4회 경구로 투여하였다. 1회 면역을 위해 3-day regimen(3일 처방)이 적용하여, 마우스는 1회 면역 시 3일간 매번 50 mg 효모 균체를 2.5 mg의 sapnin(saponin from Quillaja Bark, Sigma, USA)과 함께 동시에 경구로 투여하였다.

마우스 혈청 내 항-노다바이러스 캡시드 단백질 IgG 역가 측정은 본 발명팀에서 공지한 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 방법을 활용하여 진행되었다[Choi et al., Protein Expr Purif. 89:162 (2013)]. 96-well plate는 정제된 노다바이러스 캡시드(100 ng per well)으로 코팅되었고 5% skim milk가 포함된 PBST로 블로킹하였고, 각 마우스의 혈청은 순차 희석된 후 준비된 plate에서 반응을 시켰다. 코팅된 RGNNV capsid protein과 반응한 혈청 내 IgG는 HRP가 부착된 anti-mouse IgG (Bethyl, USA)로 검출되었으며, o-phenylenediamine dihydrochloride (Sigma, USA)를 기질로 하여 발색하였다. 마우스 혈청 내 항-노다바이러스 캡시드 IgG 역가는 대조구 수치의 1.5배 이상의 optical density를 나타내는 혈청의 희석비율로 결정하였다.

대조구로 사용한 야생형 야로위아 리폴리티카 균체를 마우스에 경구 투입한 경우와는 달리 노다바이러스 캡시드 발현 야로위아 리폴리티를 3차 4차 경구 면역시킨 결과 각각 1,300과 4,000 수준의 항체 역가를 나타내었다(도 5). 이는 노다바이러스 캡시드 단백질을 발현하는 재조합 야로위아 리폴리티카를 경구로 투여시 노다바이러스 캡시드 단백질 특이적인 항체를 효과적으로 유도할 수 있음을 보여준다. 즉, 재조합 캡시드 단백질 분리 정제 과정없이 노다바이러스 캡시드 단백질 발현 재조합 야로위아 리폴리티카 균체 자체를 경구용 백신으로 활용할 수 있는 가능성이 매우 높음을 입증한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

1. Ardiani A, Higgins JP, Hodge JW. (2010) Vaccines based on whole recombinant Saccharomyces cerevisiae cells. FEMS Yeast Res. 10(8):1060-9.

2. Bian G, Cheng Y, Wang Z, Hu Y, Zhang X, Wu M, Chen Z, Shi B, Sun S, Shen Y, Chen EJ, Yao X, Wen Y, Yuan Z. (2009) Whole recombinant Hansenula polymorpha expressing hepatitis B virus surface antigen (yeast-HBsAg) induces potent HBsAg-specific Th1 and Th2 immune responses. Vaccine. 28(1):187-94.

3. Chen F, Chen XM, Chen Z, Jiang HL, Pan XP, Hu ZR, Liu RH, Chen XM. (2005) Construction and application of a yeast expression system for thymosin alpha1. Biocell. 29(3):253-9.

4. Fickers P, Benetti PH, WachY, Marty A, Mauersberger S, Smit MS, Nicaud JM. (2005)Hydrophobic substrate utilisation by the yeast Yarrowia lipolytica, and its potential applications. FEMS Yeast Res. 5(6-7):527-43.

5. Fournier P, Abbas A, Chasles M, Kudla B, Ogrydziak DM, Yaver D, Xuan JW, Peito A, Ribet AM, Feynerol C, et al. (1993) Colocalization of centromeric and replicative functions on autonomously replicating sequences isolated from the yeast Yarrowia lipolytica. Proc Natl Acad Sci U S A. 90(11):4912-6.

6. Goh ZH, Tan SG, Bhassu S, Tan WS.(2011) Virus-like particles of Macrobrachium rosenbergii nodavirus produced in bacteria. J Virol Methods. Jul;175(1):74-9.

7. Gomez DK, Baeck GW, Kim JH, Choresca CH Jr, Park SC. (2008) Molecular detection of betanodavirus in wild marine fish populations in Korea. J Vet Diagn Invest. 20(1):38-44.

8. Guo YX, Dallmann K, Kwang J.(2003)Identification of nucleolus localization signal of betanodavirus GGNNV protein alpha. Virology. 306(2):225-35.

9. Huang JN, Lin L, Weng SP, He JG.(2007) High expression of capsid protein of red-spotted grouper nervous necrosis virus in an avian cell line requires viral RNA2 non-coding regions. J Fish Dis.30(7):439-44.

10. Kim MW, Kim EJ, Kim JY, Park JS, Oh DB, Shimma Y, Chiba Y, Jigami Y, Rhee SK, Kang HA. (2006) Functional characterization of the Hansenula polymorpha HOC1, OCH1, and OCR1 genes as members of the yeast OCH1 mannosyltransferase family involved in protein glycosylation. J Biol Chem. 281(10):6261-72. Epub 2006 Jan 10.

11. Lu MW, Lin CS. (2003) Involvement of the terminus of grouper betanodavirus capsid protein in virus-like particle assembly. Arch Virol. 148(2):345-55.

12. Lu MW, Liu W, Lin CS. (2003) Infection competition against grouper nervous necrosis virus by virus-like particles produced in Escherichia coli. J Gen Virol. 84(Pt 6):1577-82.

13. Mattanovich D, Branduardi P, Dato L, Gasser B, Sauer M, Porro D. (2012) Recombinant protein production in yeasts. Methods Mol Biol. 824:329-58.

14. Madzak C, Gaillardin C, Beckerich JM. (2004) Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica: a review. J Biotechnol. 109(1-2):63-81.

15. Nishizawa T, Mori K, Furuhashi M, Nakai T, Furusawa I, Muroga K.(1995) Comparison of the coat protein genes of five fish nodaviruses, the causative agents of viral nervous necrosis in marine fish. J Gen Virol. 76 (Pt 7):1563-9.

16. Nagai T, Nishizawa T.(1999)Sequence of the non-structural protein gene encoded by RNA1 of striped jack nervous necrosis virus. J Gen Virol. 80 (Pt 11):3019-22.

17. Ogra PL, Faden H, Welliver RC. (2001) Vaccination strategies for mucosal immune responses. Clin Microbiol Rev. 14(2):430-45.

18. Roberts RJ, W.B. Saunders. 2001, Fish Pathology.W.B. Saunders; 472.

19. Song Y, Choi MH, Park JN, Kim MW, Kim EJ, Kang HA, Kim JY (2007) Engineering of the yeast Yarrowia lipolytica for the production of glycoproteins lacking the outer-chain mannose residues of N-glycans. Appl Environ Microbiol 73:4446-4454.

20. Tamaru Y, Ohtsuka M, Kato K, Manabe S, Kuroda K, Sanada M, Ueda M. (2006) Application of the arming system for the expression of the 380R antigen from red sea bream iridovirus (RSIV) on the surface of yeast cells: a first step for the development of an oral vaccine. Biotechnol Prog. 22(4):949-53.

21. Tang L, Lin CS, Krishna NK, Yeager M, Schneemann A, Johnson JE. (2002) Virus-like particles of a fish nodavirus display a capsid subunit domain organization different from that of insect nodaviruses. J Virol. 76(12):6370-5.

22. Wang CH, Hsu CH, Wu YM, Luo YC, Tu MH, Chang WH, Cheng RH, Lin CS. (2010)

23. Roles of cysteines Cys115 and Cys201 in the assembly and thermostability of grouper betanodavirus particles. Virus Genes. 41(1):73-80.

24. Wangman P, Senapin S, Chaivisuthangkura P, Longyant S, Rukpratanporn S, Sithigorngul P.(2012) Production of monoclonal antibodies specific to Macrobrachium rosenbergii nodavirus using recombinant capsid protein. Dis Aquat Organ. 98(2):121-31.

25. Choi YR, Kim HJ, Lee JY, Kang HA, Kim HJ (2013). Chromatographically-purified capsid proteins of red-spotted grouper nervous necrosis virus expressed in Saccharomyces cerevisiae form virus-like particles Protein Expr Purif. 89(2):162-168

한국생명공학연구원

KCTC12272BP

20120903

<110> Chung-Ang University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Method for production of codon-optimized intact and N-terminal truncated Noda Capsid Protein in the Yeast Yarrowia lipolytica for recombinant vaccine development <130> ADP-2013-0261 <150> KR 10-2012-0105323 <151> 2012-09-21 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon Optimized cDNA of Nodavirus for Expression in Yarrowia lipolytica <400> 1 atggtccgaa aaggtgaaaa aaagctcgct aaacccgcca ccacaaaagc tgccaatcca 60 caaccccgaa gacgagccaa taacagacga cgatccaaca gaactgacgc ccctgtctct 120 aaagcttcta cagttacagg cttcggtcgt ggtacaaacg acgtgcatct ctccggaatg 180 tctcgaatct ctcaagctgt ccttcctgca ggcactggaa ccgacggata tgtcgttgtc 240 gacgccacta tagttcccga ccttctcccc cgacttggac acgccgctag aatttttcaa 300 cgttacgctg tcgaaacctt agagtttgaa atccaaccca tgtgccctgc taatacaggt 360 ggtggttacg ttgccggatt cctccccgac cctactgata atgaccatac attcgatgct 420 ctccaagcca cccgaggagc cgttgttgct aaatggtggg aatcacgaac agttagacct 480 caatacaccc gaactctttt atggacctcc tctggaaaag aacaacgact tacatcccct 540 ggccgactta ttttactgtg tgtgggaaat aataccgacg ttgttaacgt ttctgtgctc 600 tgccgttggt ccgtccgatt atctgtcccc tcccttgaaa cccccgaaga aacaactgcc 660 cctattatga cacaaggatc actttacaac gactctcttt ccacaaacga cttcaaatct 720 attcttctcg gatctacccc tctcgacatt gctcccgatg gcgccgtctt tcagcttgac 780 cgtccccttt caatcgatta ctcactcggt actggagatg ttgaccgagc agtttactgg 840 cacctcaaaa aattcgctgg aaatgcaggt acccccgctg gttggttccg atggggaatt 900 tgggacaact ttaacaaaac cttcgccgat ggtgtcgcct attactcaga cgaacaaccc 960 cgacaaattc tccttcctgt gggaaccgtg tgcacccgag tcgattccga aaacggtcta 1020 gaagattaca aggatgacga cgataaggtc gac 1053 <210> 2 <211> 903 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon Optimized cDNA of Nodavirus capsid protein <400> 2 ggtacaaacg acgtgcatct ctccggaatg tctcgaatct ctcaagctgt ccttcctgca 60 ggcactggaa ccgacggata tgtcgttgtc gacgccacta tagttcccga ccttctcccc 120 cgacttggac acgccgctag aatttttcaa cgttacgctg tcgaaacctt agagtttgaa 180 atccaaccca tgtgccctgc taatacaggt ggtggttacg ttgccggatt cctccccgac 240 cctactgata atgaccatac attcgatgct ctccaagcca cccgaggagc cgttgttgct 300 aaatggtggg aatcacgaac agttagacct caatacaccc gaactctttt atggacctcc 360 tctggaaaag aacaacgact tacatcccct ggccgactta ttttactgtg tgtgggaaat 420 aataccgacg ttgttaacgt ttctgtgctc tgccgttggt ccgtccgatt atctgtcccc 480 tcccttgaaa cccccgaaga aacaactgcc cctattatga cacaaggatc actttacaac 540 gactctcttt ccacaaacga cttcaaatct attcttctcg gatctacccc tctcgacatt 600 gctcccgatg gcgccgtctt tcagcttgac cgtccccttt caatcgatta ctcactcggt 660 actggagatg ttgaccgagc agtttactgg cacctcaaaa aattcgctgg aaatgcaggt 720 acccccgctg gttggttccg atggggaatt tgggacaact ttaacaaaac cttcgccgat 780 ggtgtcgcct attactcaga cgaacaaccc cgacaaattc tccttcctgt gggaaccgtg 840 tgcacccgag tcgattccga aaacggtcta gaagattaca aggatgacga cgataaggtc 900 gac 903 <210> 3 <211> 453 <212> PRT <213> Noda virus <400> 3 Met Ser Ala Ile Ser Gly Ala Asn Val Thr Ser Gly Phe Ile Asp Ile 1 5 10 15 Ser Ala Phe Asp Ala Met Glu Thr His Leu Tyr Gly Gly Asp Asn Ala 20 25 30 Val Thr Tyr Phe Ala Arg Glu Thr Val Arg Ser Ser Trp Tyr Ser Lys 35 40 45 Leu Pro Val Thr Leu Ser Lys Gln Thr Gly His Ala Asn Phe Gly Gln 50 55 60 Glu Phe Ser Val Thr Val Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Leu Ile Asn Val 65 70 75 80 Trp Leu Arg Val Lys Ile Pro Ser Thr Thr Ser Ser Lys Glu Asn Ser 85 90 95 Tyr Ile Arg Trp Cys Asp Asn Leu Met His Asn Leu Val Glu Glu Val 100 105 110 Ser Val Ser Phe Asn Asp Leu Val Ala Gln Thr Leu Thr Ser Glu Phe 115 120 125 Leu Asp Phe Trp Asn Ala Cys Met Met Pro Gly Ser Lys Gln Ser Gly 130 135 140 Tyr Asn Lys Met Ile Gly Met Arg Ser Asp Leu Val Gly Gly Ile Thr 145 150 155 160 Asn Gly Gln Thr Met Pro Ala Ala Tyr Leu Asn Leu Pro Ile Pro Leu 165 170 175 Phe Phe Thr Arg Asp Thr Gly Leu Ala Leu Pro Thr Val Ser Leu Pro 180 185 190 Tyr Asn Glu Val Arg Ile His Phe Lys Leu Arg Arg Trp Glu Asp Leu 195 200 205 Leu Ile Ser Gln Ser Thr Gln Ala Asp Met Ala Ile Ser Thr Val Thr 210 215 220 Leu Ala Asn Ile Gly Asn Val Ala Pro Ala Leu Thr Asn Val Ser Val 225 230 235 240 Met Gly Thr Tyr Ala Val Leu Thr Ser Glu Glu Arg Glu Val Val Ala 245 250 255 Gln Ser Ser Arg Ser Met Leu Val Glu Gln Cys Gln Val Ala Pro Arg 260 265 270 Val Pro Val Thr Pro Val Asp Asn Ser Leu Val His Leu Asp Leu Arg 275 280 285 Phe Ser His Pro Val Lys Ala Leu Phe Phe Ala Val Lys Asn Val Thr 290 295 300 His Arg Asn Val Gln Ser Asn Tyr Thr Ala Ala Ser Pro Val Tyr Val 305 310 315 320 Asn Asn Lys Val Asn Leu Pro Leu Leu Ala Thr Asn Pro Leu Ser Glu 325 330 335 Val Ser Leu Ile Tyr Glu Asn Thr Pro Arg Leu His Gln Met Gly Val 340 345 350 Asp Tyr Phe Thr Ser Val Asp Pro Tyr Tyr Phe Ala Pro Ser Met Pro 355 360 365 Glu Met Asp Gly Val Met Thr Tyr Cys Tyr Thr Leu Asp Met Gly Asn 370 375 380 Ile Asn Pro Met Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Arg Leu Ser Asn Val Thr 385 390 395 400 Leu Ser Cys Lys Val Ser Asp Asn Ala Glu Thr Thr Ala Ala Gly Gly 405 410 415 Gly Gly Asn Gly Thr Gly Tyr Thr Val Ala Gln Lys Phe Glu Leu Val 420 425 430 Val Ile Ala Val Asn His Asn Ile Met Lys Ile Ala Asp Gly Ala Ala 435 440 445 Gly Phe Pro Ile Leu 450 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 gaggatccat ggtccgaaaa ggtgaaaaa 29 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 ttagtcgact tctagaccgt tttcggaatc gact 34 <210> 6 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 ttagtcgacc ttatcgtcgt catccttgta atcttctaga ccgttttcgg aatcgact 58 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 gaggatccat gggtacaaac gacgtgcat 29 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 cgggatccat gactatagtt cccgac 26

Claims

야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)에서 노다바이러스(nodavirus) 캡시드(capsid) 단백질을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터로서,
(i) 서열번호 1 또는 서열번호 2에 개시된 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열;
(ⅱ) 상기 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터로서, 야로위아 리폴리티카에서 전사(transcription) 개시를 할 수 있는 프로모터;
(ⅲ) 선별 마커(selection marker)를 코딩하는 DNA 서열; 및
(iv) 야로위아 리폴리티카에서 벡터를 유지시킬 수 있는 복제원점(replication origin)을 포함하는 재조합 발현 벡터.
제 1 항에 있어서, 상기 선별마커는 URA3, LEU2, TRP1, HIS3, HIS4, ARG4, 및 항생제 내성 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
제 1 항에 있어서, 박테리아 세포에서 벡터를 복제시킬 수 있는 복제 원점을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 도 3b에 도시된 pYlTEF-LEU-YlNNV I 또는 pYlTEF-LEU-YlNNV II 또는 도 3c에 도시된 벡터 구성을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 노다바이러스(nodavirus) 캡시드 단백질을 발현하는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 균주.
제 6 항에 있어서, 상기 균주는 도 3b에 도시된 재조합 발현벡터 pYlTEF-LEU-YlNNV I 및 도 3c에 도시된 재조합 발현벡터 pYlTEF-URA-YlNNV으로 동시에 형질전환된 것을 특징으로 하는 야로위아 리폴리티카 균주(Yarrowia lipolytica)(KCTC 12272BP).
다음의 단계를 포함하는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)에서 노다바이러스(nodavirus)의 캡시드 단백질을 생산하는 방법:
(a) 서열번호 1 또는 서열번호 2에 개시된 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 상기 노다바이러스 캡시드 단백질을 발현하는 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 세포로부터 노다바이러스 캡시드 단백질을 분리 및 정제하는 단계.
제 8 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터는 청구항 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 발현벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 서열번호 1 또는 서열번호 2에 개시된 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 상기 노다바이러스 캡시드 단백질을 발현하는 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 균체, 배양물 또는 이로부터 분리 정제된 노다바이러스 캡시드 단백질의 면역학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 노다바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터는 청구항 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 발현벡터인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.