CN1279979C - 一种结核杆菌核酸疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结核杆菌核酸疫苗，该疫苗具有较好的免疫原性。本发明所提供的结核杆菌核酸疫苗，是将Ag85B、MPT-83和ESAT-6基因分别克隆到真核表达载体pJW4303中，将得到的三种表达载体进行联合形成的混合物。本发明所提供的结核杆菌核酸疫苗可用于预防和/或治疗动物结核病特别是预防和/或治疗人、牛、羊结核病。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗，特别涉及一种结核杆菌核酸疫苗。
背景技术
结核病是一种人、畜共患的慢性消耗性传染病。随着爱滋病患者人数的增加、抗药性菌株的产生等，结核病的发病率有逐年增加的趋势。国外有关资料报导，目前世界上约有10-20亿人口感染有结核杆菌，每年大约有3百万人死于结核病，同时又有1000万新病例出现。我国目前有上亿人感染有结核分枝杆菌，结核病患者约600万人，每年因治疗不及时造成死亡的人数约25.6万余人。如果不尽快改进结核病的控制措施，将有2亿多人发展成活动性肺结核。牛结核是家畜的一种慢性传染病且能传染给人。人、畜结核病的交叉传播是造成结核病广泛流行的重要原因。如果奶牛患有结核病，不但影响泌乳量和乳的营养成份，而且可通过各种途径传染给人。
自Calmette和Guerin研究出卡介苗(BCG)之后，人类已将致弱的卡介苗用于预防结核病的感染。但卡介苗在世界许多地方使用效果不佳，尤其对成人的保护力容易丧失。对不同人群的保护效率不一致，一般为0-85％。因此，研制更全面有效的新疫苗是控制结核病的重要途径。基因工程技术为重组亚单位疫苗以及DNA疫苗的发展提供了一条新途径，其中DNA疫苗兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全面免疫应答的高效力，已成为疫苗研究领域中的热点之一(Bonato V L D，Lima V M F，Tascon R E，et al. Identification and Characterization of Protective T Cellsin hsp64 DNA-Vaccinated and Mycobacterium tuberculosi-Infected Mice.Infect.Immun.1998，66：169-175)。
研究表明，结核分枝杆菌分泌蛋白能刺激机体产生保护性免疫反应，诱导抗体产生并诱导CD4+和CD8+T细胞介导的免疫应答。在结核病感染实验过程中，病人淋巴细胞早期识别的主要是一些分泌性蛋白，如Ag85复合体分布于大部分分枝杆菌中，其中Ag85B具有分枝酸转移酶的活性，与分枝杆菌细胞壁的合成有关，并与人纤维连接蛋白结合后参与致病过程，在分枝杆菌分泌蛋白中含量占居首位，在一系列纯化抗原试验中，该抗原的抗原性最强。MPT-83是一个附着在细胞表面促使抗原决定基暴露的脂化糖基化的蛋白(Wiker H G，uptyuioiloii S，Hewinson R G，Russell W P，andHarboe M.Heterogenous expression of the related MPB70 and MPB83 proteinsdistinguish various substrains of Mycobacterium bovis BCG and Mycobacteriumtuberculosis H37Rv.Scand J.Immunol.1996，43：374-380)。该蛋白还是一个从感染了M.bovis的牛身上发现的sero-dominant抗原，并且只在感染的T淋巴细胞内可以检测到，而在BCG免疫过的动物细胞中检测不到(O’Loan C J，Pollock J M，Hanna J，and Neill S D.Immunoblot analysis of humoral immune responses toMycobacterium bovis in experimentally infected cattle：early recognition ofa 26-kilodalton antigen.Clin.Diagn.Lab.Immunol.1994，1：608-611；Vordermeier H M，Cockle P C，Whelan A，Rhodes S，Palmer N，Bakker D，and HewinsonR G.Development of diagnostic reagents to differentiate between Mycobacteriumbovis BCG vaccination and M.bovis infection in cattle.Clin.Diagn.Lab.Immunol.1999，6：675-682)。ESAT-6是结核分枝杆菌早期分泌的一种小分子量蛋白，只存在于人型结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，BCG中缺少该抗原的编码基因。最新的研究证明，ESAT-6不仅是抗结核分枝杆菌细胞免疫应答的主要配体，还是效应性T细胞的主要靶抗原之一，可刺激感染结核病的小鼠释放γ-干扰素。因此，编码这些蛋白的基因已成为核酸疫苗的首选对象。
国外有关结核分枝杆菌核酸疫苗的研究报道很多。1994年，Lowrie等人以麻风分枝杆菌65kDa热休克蛋白基因DNA疫苗免疫小鼠，结果表明：DNA疫苗与卡介苗有相似的保护作用(Lowrie D B，Tascon R E， Colston M J，et al.Towards a DNAvaccine against tuberculosis.Vaccine，1994，12：1537-1540)。
1996年，Huygen等人制备了Ag85 DNA疫苗，经Ag85 DNA疫苗免疫的鼠产生了体液和细胞应答并获得了明显的保护(Huygen K，Content J，Denis O，et al.Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosi s DNA vaccine.Nat.Med.1996，2：893-897)。
1999年，Kamath等人将含结核分枝杆菌MPT64，Ag85B和ESAT-6基因克隆到载体pJW4303中，制备成DNA疫苗免疫鼠，结果表明：Ag85B免疫效果最佳，其次为ESAT-6，MPT64为未知。3种DNA疫苗联合免疫效果更强(Kamath A T，Feng C G，Macdonald M，et al.Differential Protective effi cacy of DNA Vaccines Expressing SecretedProteins of Mycobacterium tuberculosis.Infect.Immun.1999，67：1702-1707)。
1999年，Zhong M等人用编码ESAT-6，MPT-83，KatG或HBHA蛋白的DNA疫苗，实验证明它们均诱导特异性体液免疫，产生大量的r-干扰素并具有明显保护应答(ZhongM，Howard A，Kelley C，et al.Immunogenicity of DNA Vaccines ExpressingTuberculosis Proteins Fused to Tissue Plasminogen Activator Signal Sequences.Infect.Immun.1999，67：4780-4786)。
2000年，Morris对单价和多价结核杆菌DNA疫苗投放后的免疫应答进行了评价。单价DNA疫苗包括编码MPT-63和MPT-83的DNA疫苗，多价联合DNA疫苗包括ESAT-6，MPT-83，MPT-63，KatG，结果表明：多价联合DNA疫苗比活苗BCG诱导的保护更为强烈(Morris S，Kelley C，Howard A，et al.The immunogenicity of singleand combination DNA vaccines against tuberculosis. Vaccine.2000.18：2155-2163)。
2000年，Vordermeier等用分枝杆菌抗原MPT70，MPT83，Ag85-A DNA疫苗对牛进行免疫，结果表明：MPT83 DNA免疫牛可诱导CD4+细胞应答和体液免疫应答(Vordermeier H M，Cockle P J，Whelan A O，et al.Effective DNA vaccinationof cattle with the mycobacterial antigens MPB83 and MPB70 does not compromisethe specificity of the comparative intradermal tuberculin skintest.Vaccine，2000，19：1246-1255)。
虽然国内外对结核分枝杆菌核酸疫苗的开发做了大量的研究，但所获得的核酸疫苗保护力还不够高。2001年，范雄林等报道了结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白单基因疫苗特异性抗体滴度仅为1∶200(范雄林，徐志凯，李元，等结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白基因疫苗的构建和免疫原性的研究，中华结核和呼吸杂志，2001，24：548-550)。2001年，游力等报道的结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白单基因疫苗第三次免疫45天的特异性抗体滴度为1∶100 000(游力，赵跃然，高春义等，结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗的构建及其免疫作用的研究。中华结核和呼吸杂志，2001，24：736-739)。研制更全面有效的新核酸疫苗对有效控制结核病的传播和流行具有重要的意义。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种具有较好免疫原性的结核杆菌核酸疫苗。
本发明所提供的结核杆菌核酸疫苗，是将Ag85B、MPT-83和ESAT-6基因分别克隆到真核表达载体中，将得到的三种表达载体进行联合形成的混合物。
上述疫苗中还含有佐剂DDA，MPL，Quil-A，RIBI adjuvant和/或saline或其它佐剂，如铝佐剂，福氏佐剂。该疫苗中联合多价结核杆菌核酸疫苗与DDA的重量份数比可为5∶6，联合多价结核杆菌核酸疫苗在saline中的浓度可为1mg/ml。
其中，所述表达载体含有启动子，该启动子可为pJW4303带有的巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子或其它真核表达启动子，如老鼠看家基因的启动子。
上述结核杆菌核酸疫苗可为将Ag85B、MPT-83和ESAT-6基因分别克隆到真核表达载体pJW4303后并将表达产物联合而成的多价结核杆菌核酸疫苗；其中，该结核杆菌核酸疫苗为相同重量份数比的Ag85B、MPT-83和ESAT-6表达载体联合而成的多价结核杆菌核酸疫苗。
本发明的结核杆菌核酸疫苗可用于预防和/或治疗动物结核病特别是预防和/或治疗人、牛、羊结核病。
三个基因的基因Bank收录号分别为：Ag85B：X62398；MPT-83：X94579；ESAT-6：X79562。
动物表达载体pJW4303，其物理图谱如图6所示，带有巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子，是保证目的基因在肌肉细胞中高效转录的强启动子。该载体还带有组织血纤维蛋白溶酶原激活剂的胞外分泌信号序列，定向克隆在这一信号序列下游的外源基因产物能被成功地分泌到胞外，增加了抗原与巨噬细胞的接触机会，加速了依赖于蛋白酶体的内源性合成抗原的降解，导致体内诱导的细胞介导的应答增强。此外，pJW4303含有11个CpG序列，在DNA疫苗诱发机体产生免疫应答中起重要作用，可在无T细胞存在的情况下直接激活B细胞，刺激分泌免疫球蛋白及白细胞介素6，也可直接激活单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞，上调共刺激分子的表达，有利于产生多种Th1型细胞因子，提高了保护性免疫力。
本发明将编码结核分枝杆菌Ag85B、MPT-83和ESAT-6分泌蛋白的结构基因或包括信号肽的全基因序列定向克隆到真核表达载体pJW4303中，转化到TOP10大肠杆菌，提取质粒DNA经限制性核酸内切酶鉴定及序列分析证实含有正确的上述三种分泌蛋白的结构基因(包括信号肽)全序列。用脂质体介导法将重组表达质粒导入COS7细胞内并进行瞬时表达，收集表达细胞或浓缩上清液，12％或15％的SDS-PAGE电泳分离，用结核杆菌特异性抗体进行免疫印迹杂交，证明上述三种重组质粒能在哺乳动物细胞中表达出特异蛋白。三种重组表达质粒与saline或(dimethyldioctyldecyl ammoniumbromide)DDA同时肌注免疫小鼠导致Ag85B、MPT-83和ESAT-6的特异性IgG抗体反应水平显著提高。用DNA疫苗免疫过的小鼠能够产生对结合杆菌有效而长期的免疫性并激发显著的Th1 cytokine反应。免疫小鼠与三个纯化抗原相应答的脾脏T细胞来源的Th1型γ-干扰素(IFN-γ)水平与对照组相比有了显著提高。通过测定在肺脏相对CFU数量发现，在saline或DDA中形成的核酸疫苗提高了小鼠抗结核杆菌H37Rv的保护效率。经联合DNA疫苗免疫过的小鼠对肺脏和脾脏内结核菌的生长有抑制。组织病理学分析显示免疫小鼠大大提高了感染后肺部病理状况。攻毒56天后计算出的DNA疫苗组存活率为100％，而对照组为0％。本发明不仅增强了免疫动物的肌体体液应答反应，同时增强了细胞介导的免疫反应，而后者是提高DNA疫苗效率的重要前提条件。
与活的BCG疫苗和亚单位疫苗相比较，本发明的结核杆菌核酸疫苗还具有其他潜在优点：容易生产，稳定性强，较安全，不引起结核菌素的敏感反应。此外，核酸疫苗可免疫HIV免疫缺陷的病人，而BCG疫苗却不能用于这种病人。从免疫小鼠的肺部载菌量来看，本发明的结核杆菌核酸疫苗的保护效率要高于卡介苗，表明本发明的疫苗可以取代传统的卡介苗用于结核病的预防。本发明的结核杆菌核酸疫苗与现有的结核杆菌核酸疫苗的不同之处在于本发明的结核杆菌核酸疫苗免疫小鼠后，由于使用了含信号肽的高效表达载体，确保了抗原高效持续表达并分泌到胞外。本发明所用的佐剂DDA大大提高了疫苗的保护效率。由本发明对小鼠的免疫效果可推断，本发明的结核杆菌核酸疫苗显著提高了对动物的保护效率，对大型动物(如牛、羊等)的保护效率也必定高于以前报导的核酸疫苗保护效率。如果用该核酸疫苗免疫牛，必将大大减少牛患结核的机率，保证牛肉及牛奶的产量和质量。如果用该核酸疫苗免疫人，不但能让人体产生对结核杆菌的免疫力，而且不会发生结核菌素的敏感反应，增强了疫苗的安全性。总之，本发明对提高动物及人类对结核杆菌的免疫力，更有效地控制结核病的传播和流行，繁荣畜牧业及增强人类体质具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明
图1为重组质粒pJW4303-Ag85B，pJW4303-MPT-83和pJW4303-ESAT-6的酶切分析电泳图
图2A为含pJW4303空载体和含pJW4303-Ag85B表达载体的COS7细胞表达蛋白的Western blotting分析结果
图2B为含pJW4303空载体和pJW4303-MPT-83表达载体的COS7细胞表达蛋白的Western blotting分析结果
图2C为含pJW4303空载体和pJW4303-ESAT-6表达载体的COS7细胞表达蛋白的Western blotting分析结果
图3A为用空载体DNA免疫小鼠感染结核杆菌后肺脏组织的酸法快速细菌染色结果
图3B为BCG免疫小鼠感染结核杆菌后肺脏组织的酸法快速细菌染色结果
图3C为用saline作为佐剂的多价DNA疫苗免疫小鼠感染结核杆菌后肺脏组织的酸法快速细菌染色结果
图3D为用DDA作为佐剂的多价DNA疫苗免疫小鼠感染结核杆菌后肺脏组织的酸法快速细菌染色结果
图4A为用结核杆菌H37Rv静脉攻毒8周后的pJW4303对照免疫小鼠肺脏组织的显微照片(×10)
图4B为用结核杆菌H37Rv静脉攻毒8周后的pJW4303对照免疫小鼠肺脏组织的显微照片(×40)
图4C为用结核杆菌H37Rv静脉攻毒8周后的在saline中的多价DNA疫苗免疫小鼠肺脏组织的显微照片(×10)
图4D为用结核杆菌H37Rv静脉攻毒8周后的在saline中的多价DNA疫苗免疫小鼠肺脏组织的显微照片(×40)
图4E为用结核杆菌H37Rv静脉攻毒8周后的在DDA中的多价DNA疫苗免疫小鼠肺脏组织的显微照片(×10)
图4F为用结核杆菌H37Rv静脉攻毒8周后的在DDA中的多价DNA疫苗免疫小鼠肺脏组织的显微照片(×40)
图4G为用结核杆菌H37Rv静脉攻毒8周后的BCG组免疫小鼠肺脏组织的显微照片(×10)
图4H为用结核杆菌H37Rv静脉攻毒8周后的BCG组免疫小鼠肺脏组织的显微照片(×40)
图5A为结核杆菌H37Rv静脉攻毒8周后对在saline中的多价DNA疫苗免疫小鼠肺脏目的基因表达的检测
图5B为结核杆菌H37Rv静脉攻毒8周后对在DDA中的多价DNA疫苗免疫小鼠肺脏目的基因表达的检测
图5C为结核杆菌H37Rv静脉攻毒8周后对空载体DNA对照免疫小鼠肺脏目的基因表达的检测
图6动物表达载体pJW4303的物理图谱
具体实施方式
实施例1、真核表达载体的构建
用PCR方法扩增结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的Ag85B，MPT-83和ESAT-6基因并克隆到真核表达载体pJW4303上用于在真核细胞内表达。
真核表达载体构建的基本步骤为：
(1)以常规方法提取的结核杆菌基因组DNA为模板，用PCR扩增Ag85B，MPT-83和ESAT-6基因并定向克隆到pJW4303载体上的组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)信号序列下游，形成融合蛋白。扩增所用的引物序列如下：
Ag85B：5’-AAATGGGGCACAGCTAGCCATATGACAGACGTGAGCC-3’，和5’-ACTAGGATCCTAAGCAACCTTCGGTTGATCCCGTCAGC-3’；
MPT-83：5’-ATTGCTAGCATGATCAACGTTCAG-3’，和5’-TATGGATCCCGA ACGTTACTGT-3’；
ESAT-6：5’-CTATGCTAGCATGACAGAGCAGCAGTG-3’，和5’-ATATGGATCCGCCCTATGCGAACATCCC-3’。5’端引物都含Nhe I位点，3’端引物都含有BamH I位点。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后按QIAquick Gel Extraction Kit说明书操作回收，得到目的基因。
(2)分别用Nhe I和BamH I双酶切经凝胶纯化的目的基因产物及pJW4303载体DNA，用T4DNA连接酶处理16h(16℃)，取5μl连接产物(总体积20μl)转化感受态大肠杆菌DH5α菌株。挑取转化菌单菌落抽提质粒，Nhe I和BamH I双酶切鉴定后进行序列分析以证实插入片段序列是否正确。如图1所示，电泳结果表明插入片段大小和酶切图谱正确；图1中，1为lambda DNA/Hind III+EcoR I双酶切；2为pJW4303-ESAT-6经Pst I单酶切；3为pJW4303-MPT-83经Pst I单酶切；4为pJW4303-Ag85B经Pst I酶切；5为pJW4303空载体经Pst I单酶切；6为pJW4303-ESAT-6经BamH I和Nhe I双酶切；7为pJW4303-MPT-83经BamH I和Nhe I双酶切；8为pJW4303-Ag85B经BamH I和Nhe I双酶切；9为pJW4303空载体经BamH I和Nhe I双酶切。
分别选取3个含有不同目的基因表达载体的菌株进行DNA序列分析，以获取带有正确读码框的表达载体。将含有正确读码框的重组载体转化到TOP10大肠杆菌中，在含Amp(100μg/ml)的琼脂中再次筛选重组菌株，用QIAGEN Plasmid Maxi Kit和MegaKit大量制备质粒DNA，用灭菌生理盐水稀释成浓度为1-2μg/μl，紫外分光光度计定量。
实施例2、重组蛋白在原核与真核细胞中的表达
(1)三种结核杆菌重组蛋白的制备与纯化
把得到的Ag85B，MPT-83和ESAT-6基因分别克隆到原核表达载体pET-22质粒中在大肠杆菌中表达，在变性条件下用Ni亲和法纯化三种带有多聚组氨酸标签的重组蛋白。
(2)将COS7细胞生长在25cm2含高浓度葡萄糖的Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)瓶中，加入10％热灭活胎牛血清(FCS)，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，置37℃ 5％CO2孵育箱中，待细胞培养瓶中细胞长至80-100％汇合，吸出培养液，用1×PBS洗涤，加0.25％的胰酶0.25ml，置37℃2-3min后，倾去消化液，加入含10％的FCS的培养基10ml充分吹打，使细胞充分分散和悬浮，每瓶细胞分至5个35mm的培养皿中，培养12-24h后，观察细胞长至50-60％汇合，用DMEM将质粒稀释至适当浓度，将稀释的DNA和稀释的LipoFectin混合，混合液同细胞感染5h，将含LipoFectin培养基弃掉，加2ml完全培养基，细胞再温育24-48h，PBS洗涤两次，收集细胞，上清用10％三氯乙酸沉淀，用9倍量的丙酮洗涤，细胞和沉淀物悬浮在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳载样缓冲液中。
(3)重组蛋白表达的免疫印迹(Western blotting)分析。将凝胶上的蛋白通过电转移装置转移到硝酸纤维素(NC)膜上。电转移结束后，将NC膜放入封闭液中室温下封闭2h，用1×PBS漂洗3次，每次10min；再将NC膜放入杂交袋内，加入1∶25或1∶50稀释的结核杆菌单抗血清或羊抗H37Rv菌株的菌体免疫羊的阳性血清5ml，封口后室温下缓慢振荡过夜，同前洗膜3次，加入1∶2000稀释的HPR-标记二抗，37℃温育1h；同前洗膜3次，加入预先混合底物液，室温显色至适当将NC膜转移至蒸馏水中终止反应。结果如图2A-C所示，表明真核细胞COS7中能表达上述三种基因编码的蛋白质，SDS凝胶中出现了能与结核杆菌特异性抗体发生免疫反应，相对分子质量分别为30，26和6kDa的蛋白质，有空表达载体的菌株中没有检测到相应的条带。进一步的分析表明，重组质粒不仅成功地在COS7中得到表达，带有信号肽序列的结核分枝杆菌结构基因还能被顺利地分泌到胞外培养液中。
实施例3、用多价DNA疫苗免疫模型动物以检测DNA疫苗的保护效率。
(1)多价DNA疫苗对模型动物的免疫。对C57BL/6鼠进行免疫，疫苗组合为Ag85B、MPT-83和ESAT-6三联苗。250μg DDA(ICN Biomedicals，Aurora，美国)加热到80℃使胶束形成，冷却到室温后与300μg编码三种抗原的质粒DNA(每种质粒100μg)混合。300μg编码三种抗原的质粒DNA(每种质粒100μg)在saline中的浓度为1mg/ml。全部疫苗被分成4个相等的部分，注射入每条后腿的tibialisanterior肌肉内。对照小鼠用空载体pJW4303进行免疫。小鼠连续免疫三次，每次间隔3周。
(2)酶联免疫试验(ELISA)检测免疫小鼠的特异性抗体。小鼠首免后21天，二免后21天和三免后21天眼球分别采血，分离血清。3只免疫小鼠的血清等量混合后，从1∶25开始2倍系列稀释后用于检测，ESAT-6、MPT-83和Ag85B重组抗原用包被液(0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液)稀释至10μg/ml，分别加入96孔酶标板(NUNC)，100μl/每孔，4℃过夜，用洗涤液(PBS/Tween0.05％)洗涤3次。每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶粉PBS-Tween 0.05％)，置37℃恒温箱封闭60min，按上法洗涤3次。加待测血清，阴性血清(正常小鼠)及稀释液，取不同稀释度的待测血清，阴性血清及稀释液(PBS/Tween)各100μl加入孔中，置37℃恒温箱2h，反复洗涤3次。加酶标抗体HRP-抗体(1∶2000稀释抗抗体)，每孔加100μl，置37℃温育2h，洗涤3次，用TMB(四甲基联苯胺二盐酸)显色后，测波长450nm吸光度(A)。以正常鼠血清相对应稀释度作为阴性对照，吸光度值0.05以上、A实验组/A对照组或阴性组≥2.1为阳性。
实验结果如表1所示。三价结核杆菌核酸疫苗第一次免疫后21天，对小鼠血清中三种结核杆菌抗原蛋白的抗体滴度进行分析。用多价核酸疫苗免疫过的小鼠产生了强烈的抗体应答。用DDA处理的DNA疫苗免疫小鼠，特异性IgG抗体滴度在第一、第二和第三次注射后分别上升到3200、51200和204800。而用溶于saline中的相同DNA疫苗免疫小鼠产生的特异性抗体应答显著降低，分别为400、12800和25600。而作为负对照的空载体DNA免疫组在整个实验过程中未检测到特异性抗体的产生。因为相对的IgG1和IgG2a抗体水平是总T细胞表型的标志，所以同时检测了免疫小鼠血清样品中二者的水平。与saline和与DDA组合的DNA疫苗造成了大致相同的免疫后IgG1和IgG2a滴度，提示重组DNA疫苗诱导了一个混合的T细胞表型。
表1.使用saline和佐剂DDA辅助的多价DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠后诱导体
液免疫应答而产生的特异性抗体
| 疫苗+方式 | 总抗体IgG | IgG13rd | IgG2a3rd | ||
| 1st | 2nd | 3rd | |||
| DNA-saline | 400 | 12800 | 25600 | 12800 | 6400 |
| DNA-DDA | 3200 | 51200 | 204800 | 12800 | 6400 |
a.将三种小鼠经一免，二免和三免三周后的血清进行抗原特意性抗体产量分析。只有第三次免疫三周后的样品被用于IgG1和IgG2a分析。三个抗原在两个独立的实验中诱导了相同的抗体滴度。用空载体DNA免疫的小鼠没有产生特异性抗体。
(3)采用双抗体夹心酶联免疫试验(ELISA)检测免疫小鼠的细胞因子γ-干扰素水平。具体操作步骤如下：
1)细胞因子γ-干扰素的诱导。第三次接种DNA疫苗后的3周，宰杀免疫小鼠，无菌分离脾脏，用3只混合鼠的脾脏进行分析。脾细胞的浓度调整在4×106/ml，细胞培养在圆底培养板中(NUNC)，培养液含L-谷氨酰胺，10％热灭活胎牛血清，50μM/ml 2-巯基乙醇和100u/ml青链霉素制备而成的完全培养基RPM1-1640。在180μl的细胞悬液中加入20μl的重组纯化蛋白，终浓度为5μg/ml，在5％CO2培养箱中37℃温育72h，收集3个孔/每种的上清混合液于-20℃保存。
2)γ-干扰素的测定。抗γ-干扰素鼠抗体(clone R4-6A2)用包被液(0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液)稀释至10μg/ml，分别加入96孔酶标板(NUNC)，每孔加100μl，加盖置4℃过夜，用洗涤液(PBS/Tween 0.05％)洗涤3次。封闭液封闭60min，加待测的经抗原刺激的免疫鼠的脾细胞培养上清液(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等)，各100μl/每孔，置37℃恒温箱1-2h，洗涤3次。加入生物素化的抗γ-干扰素的鼠抗体(XMG1-2)1μg/ml每孔加100μl 37℃温育1-2h，洗涤3次。加入HRP-亲合素结合体(1∶1000稀释抗抗体)100μl/每孔，置37℃温育1h，洗涤3次。每孔加入TMB应用液100μl显色、测波长450nm吸光度(A)。以正常鼠血清相对应稀释度作为阴性对照，吸光度值0.05以上、A实验组/A对照组或阴性组≥2.1为阳性。然后取Log2为底的对数按公式(Log2＝1相当于110pg/ml)换算成浓度。
结果如表2所示，表明用DDA溶解的DNA疫苗免疫小鼠后的脾脏细胞被诱导的γ-干扰素水平从18410到20610pg/ml，比空载体对照组的水平高出100倍还多。而用saline溶解的DNA疫苗免疫的小鼠γ-干扰素水平是从2570到9970pg/ml，用BCG免疫的小鼠γ-干扰素水平是2350pg/ml。
表2.不同DNA疫苗、BCG及空载体DNA处理后C57BL/6小鼠中IFN-γ干扰素水平分析
| 疫苗+方式 | IFN-γ干扰素水平(pg/ml)a | ||
| Agg5B | ESAT-6 | MPT-83 | |
| 多价DNA疫苗-saline | 9970±330 | 2570±10 | 6280±150 |
| 多价DNA疫苗-DDA | 18410±200 | 20220±520 | 20610±370 |
| BCG | 2350±370(PPDb) | ||
| 空载体对照-saline | ≤125 | ≤125 | ≤125 |
a.用不同的DNA疫苗、BCG或空载体DNA三免后第21天，三只小鼠的脾脏混合并用ELISA方法测定细胞中的抗原特异性IFN-γ。
b.来源于BCG免疫小鼠脾脏的培养物经PPD-B刺激后进行IFN-γ测定。
(4)结核杆菌攻毒实验检测DNA疫苗对小鼠的保护效率。
1)结核杆菌攻毒实验。在最后一次注射DNA疫苗的8周后，用106CFU的结核杆菌H37Rv从侧尾静脉对小鼠进行攻毒。在8周后杀死小鼠，匀浆后的肺脏组织经过10倍系列梯度稀释后涂板到Lowenstein-Jensen培养基上培养。4周后对克隆进行计数。用1×107CFU的BCG免疫过的小鼠同样接受攻毒用于比较。
结果如表3所示，表明与空载体对照组相比较，三个免疫组在肺脏中的细菌克隆数减少了1-2个数量级。表中数据清楚地表明用DDA溶解的联合DNA疫苗具有比其它疫苗更好的保护效果。
表3.不同疫苗及空载体DNA对静脉攻毒后实验小鼠肺脏的保护效率分析
(以存活细菌数为指标)
| 疫苗 | CFU±SD/organa |
| 对照DNAM.bovis BCG多价DNA疫苗-saline多价DNA疫苗-DDA | (3.39±1.84)×108(5.89±2.00)×107(2.63±0.72)×107*b(1.26±1.05)×106** |
a.用106CFU的结核杆菌H37Rv经尾部侧静脉攻毒后8周的小鼠肺脏和脾脏内结核菌数量。小鼠(n＝5-7)是在DNA疫苗三免8周后进行攻毒。
b.统计显著性：*P＜0.05；**，P＜0.01.
2)组织病理学分析。肺脏组织灌注并用10％的多聚甲醛(PBS配制)固定后包埋在石蜡中切片。组织切片用苏木精和曙红试剂染色，或用Ziehl-Neelsen acid-fast染色(甲醇固定，热carbol-fuchsin处理10分钟，3％HCl在95％中处理30s，再于1％的亚甲基蓝中30s)，光学显微镜下观测分析。每组取5只小鼠分析。
结果如图3A-C(×100)所示，表明被免疫了空载体DNA的小鼠肺部分布有许多的acid-fast细菌颗粒，而受到疫苗免疫的动物肺部acid-fast染色颗粒大大减少。同时发现，肺部病理学程度与呈现在组织中的细菌数量有很好的相关性。与BCG免疫组相比，与DDA组合或与saline组合的核酸疫苗所免疫的动物肺部切片都显示出更少的acid-fast染色颗粒。
为了研究免疫小鼠和对照小鼠在攻毒后肺部病理学的情况，把用于检测CFU细菌的组织切片经过处理进行H&E染色。结果如图4A-H所示。图4A和B表明，作为对照的空载体DNA组中，50％以上的肺部软组织都受到损害，并且肉芽瘤产生中心干酪样病变及分散的淋巴细胞渗透与上皮样巨噬细胞混合(epithelioid macrophages)，从而表明肺的功能已经被大大削弱。图4C和D表明，接种了溶于saline的联合核酸疫苗的免疫动物，齿槽组织(alveolar tissue)看上去是完整的，并可见轻微的齿槽炎。广泛的淋巴细胞渗透现象在高倍镜下可以见到。图4E和F表明，当实验动物被接种上DDA辅佐的联合核酸疫苗，可以观察到最少量的固化组织和大量的淋巴细胞。图4G表明，在BCG免疫组，没有观察到干酪样病变，齿槽组织正常，只有一小部分的肺部软组织固化。图4H表明，在高倍镜下观察到一个多核巨细胞。因此，数据显示，与接种空载体的对照相比，接种溶于DDA的联合核酸疫苗的小鼠能更有效地在感染部位补充淋巴细胞。
3)免疫组化染色。将组织切片在3％内源过氧化物酶阻断剂中处理10分钟。PBS润洗后，在含有1.5％正常封闭血清并用PBS按1∶10稀释过的抗结核杆菌H37Rv的羊多克隆抗体溶液中4℃温育2h。用PBS洗涤5min，重复3次。然后将切片在生物素化的(biotinylated)兔抗羊IgG(DakoCytomation，Glostrup，Denmark)中30min。用PBS洗涤5min，重复3次，加入底物DAB(3，3’-Diaminobenzidine，Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)直到显现满意的染色效果(30秒到几分钟)。
结果如图5A-C(目镜放大倍率都为×100)所示。图5A-B表明，肺部巨噬细胞的胞质中有明显的蓝色信号。这些结果显示重组DNA至少在最后一次免疫后的16周内已经表达。图5C表明免疫了pJW4303 DNA的对照小鼠没有观察到颜色反应，这与在这些小鼠中没有免疫反应的结果相一致。
4)统计分析。用Graph Pad InStat程序对结核杆菌数量、cytokinedeterminations和所有生存数据进行统计分析和评价。
如表4所示，在56天的观察过程中，无论组合了DDA还是saline的联合核酸疫苗，都有效地控制了感染，使得小鼠存活率达到100％。相反，免疫了空载体的对照小鼠56天后的存活率仅为14.3％(1/7)(平均23天后死亡)。BCG疫苗所免疫的小鼠56天后成活率为80％。
表4.免疫小鼠经结核杆菌攻毒后的存活率。
| 免疫方法 | 小鼠存活/死亡比 | 保护率(％) | MTDa |
| 多价DNA疫苗-saline多价DNA疫苗-DDAM.bovis BCG空载体DNA | 7/07/04/11/6 | 1001008014.3 | 56565623 |
a.半致死时间。
Claims (6)
1、一种结核杆菌核酸疫苗，是将Ag85B、MPT-83和ESAT-6基因分别克隆到真核表达载体pJW4303中，将得到的三种表达载体进行联合形成的混合物。
2、根据权利要求1所述的结核杆菌核酸疫苗，其特征在于：所述疫苗中还含有佐剂DDA和/或生理盐水。
3、根据权利要求2所述的结核杆菌核酸疫苗，其特征在于：所述结核杆菌核酸疫苗中联合多价结核杆菌核酸疫苗与DDA的重量份数比为5∶6。
4、根据权利要求2所述的结核杆菌核酸疫苗，所述结核杆菌核酸疫苗中联合多价结核杆菌核酸疫苗在生理盐水中的浓度为1mg/ml。
5、根据权利要求1所述的结核杆菌核酸疫苗，其特征在于：所述表达载体含有pJW4303带有的巨细胞病毒早期基因启动子。
6、根据权利要求1-5中任意一项所述的结核杆菌核酸疫苗，其特征在于：所述结核杆菌核酸疫苗为相同重量份数比的Ag85B、MPT-83和ESAT-6的表达载体联合而成的三价结核杆菌核酸疫苗。
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