CN100335129C - 一种牛分枝杆菌三联核酸疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛分枝杆菌三联核酸疫苗。本发明所提供的牛分枝杆菌三联核酸疫苗，牛分枝杆菌三联核酸疫苗，是将Ag85B、MPT-83和MPT-64基因，分别单独克隆到真核表达载体中，将得到的三种表达载体进行联合形成的混合物。本发明所提供的牛分枝杆菌三联核酸疫苗可用于预防和/或治疗动物结核病特别是预防和/或治疗牛、人、羊结核病。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗，特别涉及一种牛分枝杆菌三联核酸疫苗。
背景技术
结核病是一种人、畜共患的慢性消耗性传染病。随着爱滋病患者人数的增加、抗药性菌株的产生等，结核病的发病率有逐年增加的趋势。国外有关资料报导，目前世界上约有10-20亿人口感染有结核杆菌，每年大约有3百万人死于结核病，同时又有1000万新病例出现。我国目前有上亿人感染有结核分枝杆菌，结核病患者约600万人，每年因治疗不及时造成死亡的人数约25.6万余人。如果不尽快改进结核病的控制措施，将有2亿多人发展成活动性肺结核。牛结核是家畜的一种慢性传染病且能传染给人。人、畜结核病的交叉传播是造成结核病广泛流行的重要原因，尤其是在畜牧业发达的地区，人、畜间结核病的交叉传播不仅对人类的身体健康造成威胁，而且也影响着畜牧业的快速发展。世界范围内有5千万牛感染有结核病，造成的经济损失达30亿美元。我国牛存栏数达到1亿3千万头，牛结核病阳性率按2％计算，每头按8000元计算，直接经济损失可达200亿元人民币以上。如果奶牛患有结核病，不但影响泌乳量和乳的营养成份，而且可通过各种途径传染给人。家畜中结核病的防治工作主要依靠PPD皮内变态反应检测，淘汰PPD阳性牛，没有疫苗。因此，搞好牛结核病的防治工作最重要的是要研制成功合理有效的结核杆菌疫苗。
自Calmette和Guerin研究出卡介苗(BCG)之后，人类已将致弱的卡介苗用于预防结核病的感染。但卡介苗在世界许多地方使用效果不佳，尤其对成人的保护力容易丧失。对不同人群的保护效率不一致，一般为0-85％。因此，研制更全面有效的新疫苗是控制结核病的重要途径。基因工程技术为重组亚单位疫苗以及DNA疫苗的发展提供了一条新途径，其中DNA疫苗兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全面免疫应答的高效力，已成为疫苗研究领域中的热点之一(Bonato V L D，LimaV M F，Tascon R E，et al.Identification and Characterization of ProtectiveT Cells in hsp64 DNA-Vaccinated and Mycobacterium tuberculosi-Infected Mice.Infect.Immun.1998，66：169-175)。
研究表明，结核分枝杆菌分泌蛋白能刺激机体产生保护性免疫反应，诱导抗体产生并诱导CD4+和CD8+T细胞介导的免疫应答。在结核病感染实验过程中，病人淋巴细胞早期识别的主要是一些分泌性蛋白，如Ag85复合体分布于大部分分枝杆菌中，其中Ag85B具有分枝酸转移酶的活性，与分枝杆菌细胞壁的合成有关，并与人纤维连接蛋白结合后参与致病过程，在分枝杆菌分泌蛋白中含量占居首位，在一系列纯化抗原试验中，该抗原的抗原性最强。MPT-83是一个附着在细胞表面促使抗原决定基暴露的脂化糖基化的蛋白(Wiker H G，uptyuioiloii S，Hewinson R G，RussellW P，and Harboe M.Heterogenous expression of the related MPB70 and MPB83proteins distinguish various substrains of Mycobacterium bovis BCG andMycobacterium tuberculosis H37Rv.Scand J.Immunol.1996，43：374-380)。该蛋白还是一个从感染了M.bovis的牛身上发现的sero-dominant抗原，并且只在感染的T淋巴细胞内可以检测到，而在BCG免疫过的动物细胞中检测不到(O’Loan CJ，Pollock J M，Hanna J，and Neill S D.Immunoblot analysis of humoral immuneresponses to Mycobacterium bovis in experimentally infected cattle：earlyrecognition of a 26-kilodalton antigen.Clin.Diagn.Lab.Immunol.1994，1：608-611；Vordermeier H M，Cockle P C，Whelan A，Rhodes S，Palmer N，BakkerD，and Hewinson R G.Development of diagnostic reagents to differentiatebetween Mycobacterium bovis BCG vaccination and M.bovis infection in cattle.Clin.Diagn.Lab.Immunol.1999，6：675-682)。MPT64也为结核分枝杆菌复合体的组成部分。它为23KD的蛋白，存在于人结核分枝杆菌、强毒牛结核分枝杆菌和一些BCG疫苗的株系中(Oettinge T，Andersen A B，Cloning and B-Cell-epitopemapping of MPT64 from Mycobacterium tuberculosis H37Rv.Infection andImmunity.1994，62：2058-2064)。纯化的天然MPT64能激发被结核分枝杆菌感染的老鼠和结核病人的T细胞应答反应。另外，天然的MPT64还能够在结核分枝杆菌激活的豚鼠内引发DTH反应(Oettinger T，Holm A，Mtoni I M，et al.Mapping ofthe delayed-type hypersensitivity-inducing epitope of secreted protein MPT64from Mycobacterium tuberculosis.Infection and Immunity.1995，63：4613-4618)。因此，编码这些蛋白的基因已成为核酸疫苗的首选对象。
国外有关结核分枝杆菌核酸疫苗的研究报道很多。1994年，Lowrie等人以麻风分枝杆菌65kDa热休克蛋白基因DNA疫苗免疫小鼠，结果表明：DNA疫苗与卡介苗有相似的保护作用(Lowrie D B，Tascon R E，Colston M J，et al.Towards a DNAvaccine against tuberculosis.Vaccine，1994，12：1537-1540)。
1996年，Huygen等人制备了Ag85 DNA疫苗，经Ag85 DNA疫苗免疫的鼠产生了体液和细胞应答并获得了明显的保护(Huygen K，Content J，Denis O，et al.Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine.Nat.基因启动子，是保证目的基因在肌肉细胞中高效转录的强启动子。该载体还带有组织血纤维蛋白溶酶原激活剂的胞外分泌信号序列，定向克隆在这一信号序列下游的外源基因产物能被成功地分泌到胞外，增加了抗原与巨噬细胞的接触机会，加速了依赖于蛋白酶体的内源性合成抗原的降解，导致体内诱导的细胞介导的应答增强。此外，pJW4303含有11个CpG序列，在DNA疫苗诱发机体产生免疫应答中起重要作用，可在无T细胞存在的情况下直接激活B细胞，刺激分泌免疫球蛋白及白细胞介素6，也可直接激活单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞，上调共刺激分子的表达，有利于产生多种Th1型细胞因子，提高保护性免疫力。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种具有较好免疫原性的牛分枝杆菌三联核酸疫苗。
本发明所提供的牛分枝杆菌三联核酸疫苗，是将Ag85B、MPT-83和MPT-64基因或所述Ag85B、MPT-83和MPT-64三种基因分别与其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突变后的且可编码与Ag85B、MPT-83和MPT-64具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分别克隆到真核表达载体中，将得到的表达载体进行联合形成的混合物。
上述疫苗中还含有佐剂DDA和/或MPL和/或Quil-A和/或RIBI佐剂和/或saline(生理盐水)或其它佐剂，如铝佐剂，福氏佐剂。该疫苗中牛分枝杆菌三联核酸疫苗与DDA的重量份数比可为1-3∶1，优选为3∶1。
其中，所述表达载体的启动子可为pJW4303带有的巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子或其它真核表达启动子，如老鼠看家基因的启动子。
上述牛分枝杆菌三联核酸疫苗优选为将MPT-64、MPT-83和Ag85B基因分别克隆到真核表达载体pJW4303联合而成的多价牛分枝杆菌核酸疫苗；其中，该牛分枝杆菌三联核酸疫苗优选为相同重量份数比的MPT-64、MPT-83和Ag85B表达载体联合而成的牛分枝杆菌三联核酸疫苗。
本发明的牛分枝杆菌三联核酸疫苗可用于预防和/或治疗动物结核病特别是预防和/或治疗人、牛、羊结核病。
三个基因的基因Bank收录号分别为：MPT-64：X75361；MPT-83：X94579；Ag85B：X62398。
本发明将编码结核分枝杆菌Ag85B、MPT-83和MPT-64分泌蛋白的结构基因或包括信号肽的全基因序列定向克隆到真核表达载体pJW4303中，转化到TOP10大肠杆菌，提取质粒DNA经限制性核酸内切酶鉴定及序列分析证实含有正确的上述三种分泌蛋白的结构基因(包括信号肽)全序列。三种重组表达质粒与DDA同时肌注免疫牛导致牛体内Ag85B、MPT-83和MPT-64的特异性IgG抗体反应水平显著提高，抗体Med.1996，2：893-897)。
1999年，Zhong M等人用编码ESAT-6，MPT-83，KatG或HBHA蛋白的DNA疫苗，实验证明它们均诱导特异性体液免疫，产生大量的r-干扰素并具有明显保护应答(Zhong M，Howard A，Kelley C，et al.Immunogenicity of DNA VaccinesExpressing Tuberculosis Proteins Fused to Tissue Plasminogen ActivatorSignal Sequences.Infect.Immun.1999，67：4780-4786)。
2000年，Morris对单价和多价结核杆菌DNA疫苗投放后的免疫应答进行了评价。单价DNA疫苗包括编码MPT-63和MPT-83的DNA疫苗，多价联合DNA疫苗包括ESAT-6，MPT-83，MPT-63，KatG，结果表明：多价联合DNA疫苗比活苗BCG诱导的保护更为强烈(Morris S，Kelley C，Howard A，et al.The immunogenicity of singleand combination DNA vaccines against tuberculosis.Vaccine.2000，18：2155-2163) 。
2000年，Vordermeier等用分枝杆菌抗原MPT70，MPT83，Ag85-A DNA疫苗对牛进行免疫，结果表明：MPT83 DNA免疫牛可诱导CD4+细胞应答和体液免疫应答(Vordermeier H M，Cockle P J，Whelan A O，et a1.Effective DNA vaccinationof cattle with the mycobacterial antigens MPB83 and MPB70 does not compromisethe specificity of the comparative intradermal tuberculin skintest.Vaccine，2000，19：1246-1255)。
虽然国内外对结核分枝杆菌核酸疫苗的开发做了大量的研究，但所获得的核酸疫苗保护力还不够高。2001年，范雄林等报道了结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白单基因疫苗特异性抗体滴度仅为1∶200(范雄林，徐志凯，李元，等结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白基因疫苗的构建和免疫原性的研究，中华结核和呼吸杂志，2001，24：548-550)。2001年，游力等报道的结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白单基因疫苗第三次免疫45天的特异性抗体滴度为1∶100 000(游力，赵跃然，高春义等，结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗的构建及其免疫作用的研究。中华结核和呼吸杂志，2001，24：736-739)。研制更全面有效的新核酸疫苗对有效控制结核病的传播和流行具有重要的意义。
牛分枝杆菌在生长特性、化学组成及毒力的潜在性上与结核杆菌有相似之处，牛分枝杆菌主要为牛的致病菌，引起牛的结核感染，人由于食入未经消毒的污染了此菌的牛乳而被感染。但如由呼吸道吸入，亦可发生与结核杆菌完全相同的感染，难以区别。
动物表达载体pJW4303，其物理图谱如图7所示，带有巨细胞病毒(CMV)早期水平在第三次免疫后2个月末达到高峰。PPD-B皮试试验表明，用本发明的牛分枝杆菌三联核酸疫苗进行免疫可以引发强的系统免疫应答，但不能引起牛结核菌素PPD皮试反应。用牛分枝杆菌三联核酸疫苗对牛进行气管攻毒前后γ-干扰素水平的比较结果显示，牛分枝杆菌三联核酸疫苗免疫过的牛能够产生对牛分枝杆菌有效的免疫性并激发显著的高水平T细胞应答反应，IFN-γ的含量在第三次免疫后的第二个月末达到最高。对牛外周血单核细胞的增殖应答检测(淋巴细胞增殖实验)表明，所有经牛分枝杆菌三联核酸疫苗免疫过的牛血液淋巴细胞都对Ag85B、MPT-64和MPT-83的刺激产生强烈的增殖应答。对免疫牛和对照牛气管攻毒后4个月肺组织病理组织变化进行了观察，结果表明：经空载体pJW4303 DNA免疫的对照牛肺部切片，肺实质的纤维化明显达50-70％且纤维母细胞和淋巴细胞增多，BCG免疫的牛肺部切片，肺实质的纤维化明显，纤维母细胞和淋巴细胞较多。经本发明的牛分枝杆菌三联核酸疫苗免疫的牛肺部切片，肺组织正常，肺泡清晰有少量的纤维母细胞和淋巴细胞。对免疫牛和对照牛气管攻毒后4个月的肺、肝、淋巴结组织进行了牛分枝杆菌培养，八周后活菌记数，免疫牛肺脏的细菌数同空载体对照组相比有明显的减少(p＜0.05)。其中经本发明的牛分枝杆菌三联核酸疫苗免疫的牛的肺内的细菌数量[(1.87±1.40)×101]比空载体对照组的数量减少了7,000倍以上，保护效率为80％，阳性对照BCG组的保护效率为60％，阴性对照组注射空载体的保护效率为16％，注射生理盐水的保护效率为0％。这些结果充分证明本发明的牛分枝杆菌三联核酸疫苗对牛具有很好的保护效率。本发明的牛分枝杆菌三联核酸疫苗不仅增强了免疫动物的肌体体液应答反应，同时增强了细胞介导的免疫反应，而后者是提高核酸疫苗效率的重要前提条件。另外，本发明中选用的佐剂DDA不仅提高了疫苗的免疫效率，而且可使免疫应答向Th1-反应进行。
与活的BCG疫苗和亚单位疫苗相比较，本发明的牛分枝杆菌三联核酸疫苗还具有其他潜在优点：容易生产，稳定性强，较安全，不引起结核菌素的敏感反应。此外，可免疫HIV免疫缺陷的病人，而BCG疫苗却不能用于这种病人。本发明所用的佐剂DDA大大提高了疫苗的保护效率。本发明的牛分枝杆菌三联核酸疫苗显著提高了对动物特别是大型动物(如牛、羊等)的保护效率，而且不会发生结核菌素的敏感反应，增强了疫苗的安全性。本发明对提高动物及人类对牛分枝杆菌的免疫力，更有效地控制结核病的传播和流行，繁荣畜牧业及增强人类体质具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明
图1为牛免疫后的PPD-B皮试试验柱状图
图2为牛在三联核酸疫苗免疫和牛分枝杆菌攻毒后体内IgG抗体应答的变化曲线
图3A为用三联核酸疫苗最后免疫4周后的牛全血培养物中IFN-γ的含量柱状图
图3B为用三联核酸疫苗最后免疫8周后的牛全血培养物中IFN-γ的含量柱状图
图3C为用三联核酸疫苗免疫的牛气管攻毒4周后的牛全血培养物中IFN-γ的含量柱状图
图4为用三联核酸疫苗免疫后牛全血培养物中IFN-γ的变化曲线
图5为牛经三联核酸疫苗免疫后的全血培养物的增值应答柱状图
图6A为pJW4303对照组的牛在牛分枝杆菌攻毒16周后肺脏组织切片的显微照片(×10)。
图6B为pJW4303对照组的牛在牛分枝杆菌攻毒16周后肺脏组织切片的显微照片(×40)
图6C为pJW4303对照组的牛在牛分枝杆菌攻毒16周后肺脏组织切片的显微照片(×100)
图6D为BCG免疫组的牛在牛分枝杆菌攻毒16周后肺脏组织切片的显微照片(×10)
图6E为BCG免疫组的牛在牛分枝杆菌攻毒16周后肺脏组织切片的显微照片(×40)
图6F为BCG免疫组的牛在牛分枝杆菌攻毒16周后肺脏组织切片的显微照片(×100)
图6G为三联核酸疫苗免疫组的牛在牛分枝杆菌攻毒16周后肺脏组织切片的显微照片(×10)
图6H为三联核酸疫苗免疫组的牛在牛分枝杆菌攻毒16周后肺脏组织切片的显微照片(×40)
图6I为核酸三联疫苗免疫组的牛在牛分枝杆菌攻毒16周后肺脏组织切片的显微照片(×100)
图7为动物表达载体pJW4303的物理图谱
具体实施方式
实施例1、真核表达载体的构建
用PCR方法扩增结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的Ag85B，MPT-83和MPT-64基因并克隆到真核表达载体pJW4303上用于在真核细胞内表达。
真核表达载体构建的基本步骤为：
(1)以常规方法提取的结核杆菌基因组DNA为模板，用PCR扩增Ag85B，MPT-83和MPT-64基因并定向克隆到pJW4303载体上的组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)信号序列下游，形成融合蛋白。扩增所用的引物序列如下：
Ag85B：5’-AAATGGGGCACAGCTAGCCATATGACAGACGTGAGCC-3’，和5’-ACTAGGATCCTAAGCAACCTTCGGTTGATCCCGTCAGC-3’；
MPT-83：5’-ATTGCTAGCATGATCAACGTTCAG-3’，和5’-TATGGATCCCGAACGTTACTGT-3’；
MPT-64：5’-TAGAGTACTGCTAGCGTGCGCATCAAGATCTTC-3’，和5’-TAGAGTACTGGATCCTAGGCCAGCATCGAGTCG-3’。5’端引物都含Nhe I位点，3’端引物都含有BamHI位点。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后按QIAquick Gel Extraction Kit说明书操作回收，得到目的基因。
(2)分别用Nhe I和BamH I双酶切经凝胶纯化的目的基因产物及pJW4303载体DNA，用T4 DNA连接酶处理16h(16℃)，取5μl连接产物(总体积20μl)转化感受态大肠杆菌DH5α菌株。挑取转化菌单菌落抽提质粒，Nhe I和BamH I双酶切鉴定后进行序列分析以证实插入片段序列的正确性。将含有正确读码框的重组载体转化到TOP10大肠杆菌中，在含Amp(100μg/ml)的琼脂中再次筛选重组菌株，用QIAGEN Plasmid Maxi Kit和Mega Kit大量制备质粒DNA，用DDA稀释成浓度为1-2μg/μl，紫外分光光度计定量，得到重组质粒pJW-Ag85B，pJW-MPT-83和pJW-MPT-64。
实施例2、用三联DNA疫苗免疫牛并检测该疫苗对牛的保护效率
1)三联DNA疫苗对牛的免疫
把16头牛随机分成四组：牛分枝杆菌三联核酸疫苗免疫组、卡介苗免疫组和pJW4303空载体对照组各五头，剩余的一头牛接种生理盐水作为非免疫对照。500μgDDA加热到80℃使胶束形成，冷却到室温后与1500μg分别编码Ag85B、MPT-64和MPT-83抗原的质粒DNA(每种质粒500μg)(即重组质粒pJW-Ag85B，pJW-MPT-83和pJW-MPT-64)混合，然后对核酸疫苗免疫组的牛进行颈部肌肉免疫接种，每次每头接种2000μg。以按照上述方法处理的1500μg pJW4303质粒DNA和500μg DDA的混合物对空载体对照组的牛进行颈部肌肉免疫接种，每次每头接种2000μg。在卡介苗免疫组的第一次和第三次注射时分别用1×106CFU BCG皮下接种，第二次注射时用1×106CFU BCG皮下接种。作为非免疫对照的那头牛每次接种2ml生理盐水。所有的接种都每隔一个月进行一次，共进行三次。在第三次免疫四周后，按常规方法分离抗血清。
2)酶联免疫试验(ELISA)检测核酸疫苗免疫后牛的抗原特异性免疫应答
分别用100μl(10μg/ml)溶于0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)的纯化抗原Ag85B，MPT-64，MPT-83涂于聚苯乙烯96孔微滴定板(Nunclon，Roskilde，Denmark)的孔中4℃包被过夜。用经脱脂牛奶饱和并含有0.05％Tween-20的PBS溶液在37℃洗板2小时，共洗涤5次。从1∶100开始用PBS-Tween缓冲液(含0.5M NaCl)两倍系列稀释血清样品，再按100μl/孔加入到两个重复的96孔板孔中。每个板在37℃温育2小时并持续摇动，然后根据上述方法洗板。洗板后，将辣根过氧化物酶标记的羊抗牛抗血清IgG，IgGl和IgG2(Serotec Ltd，Oxford，UK)按1∶50000稀释于PTN中分别加入到每个孔中，继续在37℃温育2小时。洗板后加入底物溶液3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine(Chemicon，Harrow，UK)，37℃温育10分钟。用2MH2SO4终止反应后，通过一个微板阅读仪(BIO-RAD，Model 550，Japan)读取的OD450值对颜色反应情况进行分析。结果用光密度(optical density)(OD)的比率来表示，即一个实验样品的OD450和0天样品OD450间的比率。OD≥2时显示为可靠的Ab应答。OD值在1.5-1.9之间的样品被记为弱Ab阳性。实验结果如表1所示，表明三联核酸疫苗免疫后的牛在第三次注射四周后产生显著的IgG应答；五头三联核酸疫苗免疫牛中的四头产生对MPT-64抗原的强烈反应，抗MPT-64的抗体可以在1∶100和1∶800稀释度之间检测到；五头三联核酸疫苗免疫牛中的三头产生对Ag85B抗原的阳性反应，抗体滴度范围为1∶100至1∶400；五头三联核酸疫苗免疫牛中的四头产生对MPT-83抗原的显著IgG应答，滴度范围为1∶100至1∶800。三种抗原在两个独立的实验中都诱导出相同的抗体滴度。同时，在三次免疫中经BCG免疫的牛没有产生特异的体液应答。另外，用空载体pJW4303质粒DNA免疫的五头牛也没有诱导出针对抗原的体液应答。
表1.用编码Ag85B，MPT-83，MPT-64的三联核酸疫苗和佐剂DDA免疫牛而诱导体液免疫应答产生的特异性抗体IgG的滴度
| 抗原 | 第三次免疫完四周后不同编号牛的总抗体IgG滴度 | ||||
| 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| Ag85BMPT-64MPT-83 | --- | 1∶4001∶8001∶200 | 1∶4001∶8001∶400 | -1∶1001∶800 | 1∶1001∶2001∶100 |
3)牛免疫后迟发性超敏反应的检测——PPD-B皮试试验
所有16头牛在最后免疫后的第四周都通过注射牛PPD(PPD-B)进行了皮内结核素试验。B-PPD诱发的反应大小在注射牛PPD后的第3-4天进行测定。用BCG免疫的牛作为正对照。结果用5头三联核酸疫苗免疫牛(或每组的5头BCG免疫牛)的平均反应大小来显示。结果如图1所示，表明经BCG免疫的5头牛对PPD的DTH反应为3.3-6mm，从这些牛得到的平均反应和标准差(4.56±2.27)高于三联DNA疫苗免疫组的相应数值(0.8±0.8)(P≤0.01)。三联DNA疫苗免疫组和空载体pJW4303DNA免疫对照组的牛都没有产生等于或超过0.82mm的DTH应答。所以，用三联核酸疫苗进行免疫可以引发强的系统免疫应答，但不能引起牛结核素PPD的变态反应。三联DNA疫苗免疫组与空载体pJW4303 DNA免疫组相比较，P≤0.05(Mann-Whitneytest)。
4)牛分枝杆菌攻毒实验
在首免后的第17周，用1×107CFU强毒牛分枝杆菌M.bovis(购自中国人民解放军第309医院结核病研究中心)对每个免疫组的牛和一头非免疫的牛都进行气管插管攻毒实验。即，一个长为80cm含很细套管的气管内管被深入到麻醉动物的气管中，把1.5ml含有1×107CFU强毒牛分枝杆菌M.bovis的菌液通过套管注入并用2ml的生理盐水冲入。
5)牛攻毒前后血清IgG抗体应答变化趋势分析
抗体滴度的测定方法同2)中所述。对所有免疫和攻毒的牛都进行了IgG抗体反应检测。结果用平均光密度来表示。结果如图2所示，表明在攻毒时，与非免疫对照组的牛比较，三联DNA疫苗免疫组的牛都显著具有更高的抗体水平，并在第三次免疫后的第八周达到最高。所有免疫牛的抗体滴度都在攻毒后的第八周显示一个轻微的下降，并在第16周显示进一步的降低。
6)牛攻毒前后γ-干扰素水平的测定和比较
全血培养在96孔板(0.2ml/孔)中进行。将1ml取自于颈静脉的肝素化血与等体积的抗原溶液(10μg/ml)混合培养。一部分血与没有抗原的溶液培养作为负对照。37℃下含5％CO2培养箱内培养24小时后收集上清，用BOVIGAMTM BovineγInterferon Test Kit(CSL，Victoria，Australia)测定γ-干扰素(IFN-γ)。结果如图3A、图3B、图3C和图4所示，表明在三免后第四周，与空载体及其它对照组比较，五头三联核酸疫苗免疫牛的T细胞对Ag85B特异抗原刺激产生显著的应答(P＜0.05)，但没有显示出对MPT-64和MPT-83特异抗原刺激产生的明显应答(图3A)；而在三免后8周后，三联核酸疫苗免疫组比空载体对照组显现出更高水平的T细胞应答反应，其中免疫组对Ag85B和MPT-64的平均应答显著高于对照组的平均应答(P＜0.01)，而对MPT-83的应答也显示出了差异(P＜0.05)(图3B，3C)。其中，结果用光密度指数ODI(含抗原OD450：不含抗原OD450)±S.D.表示；每组5头牛；用Mann-Whitney test进行统计分析，与pJW4303免疫组的反应相比P＜O.05。图4表明用三联核酸疫苗免疫引发牛体内产生很强的应答，IFN-γ的含量在三免后的第二个月末达到最高。
7)牛外周血单核细胞的增殖应答检测
在最后免疫注射的2个月后进行检测实验。具体过程为：肝素化的牛血液先按1∶4用培养基稀释，该培养基组成为：RPMI-1640并含有5％CPSR-1(Sigma，Poole，UK)，非必需氨基酸(Sigma)，5×10-5M巯基乙醇，100U/ml青霉素，100μg/ml硫酸链霉素；然后按每孔100μl分配到平底96孔板中，其中每个孔中含有溶于培养基中的抗原溶液(Ag85B溶液、MPT-64溶液和MPT-83溶液的浓度均为5或10μg/ml)(100μl/孔，重复三次)。每板培养6天，用没有任何处理和经Con A(10μg/ml)处理过的细胞作为对照。用3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)染色法测定增殖应答，即培育72小时后，在每个孔中加入20μl MTT继续培育4小时。最后每个孔中加入150μl DMSO。吸打混合深色沉淀后，读取650nm下的吸光度值。结果如图5所示，表明与空载体对照组相比，所有经三联核酸疫苗免疫过的牛血液都对Ag85B、MPT-64和MPT-83的刺激产生强烈的应答。相反，经BCG免疫过的牛血液在PPD刺激后都没有检测到和空载体对照组有显著差别的体外增值应答。对照组牛的增值应答没有显示出被抗原所激发。其中，结果用光密度指数ODI(含抗原培养物的OD450：不含抗原培养物的OD450)±S.D.表示0。5头牛/组。用Mann-Whitneytest进行统计分析，与pJW4303免疫组的反应相比P＜0.01。
8)牛攻毒后的病理学分析
在攻毒后第16周对所有的牛都进行广泛的病理检测。淋巴结被取出切成薄片后进行检查。对肺部先进行触诊以查看是否有节结，再切成约1cm厚的薄片观察损伤情况。发现的损伤部位用组织病理学检验来确定是否有结核病。做组织病理学检验时，收集全部牛的左右肩前淋巴结，左右股前淋巴结，肠系膜淋巴结和肺门淋巴结样品。另外的样品来自在其它淋巴结或器官发现的损伤部位。用于组织病理学分析的组织先在中性的10％的甲醛缓冲液中固定，再用石蜡包埋，用苏木精和曙红染色后制成6μm切片在显微镜下观察。结果如表2、图6A-6I所示，表2表明在所有的pJW4303对照组牛的脏器都发现了结核病损伤，而在三联核酸疫苗免疫组只发现1头牛有损伤。肺脏损伤情况在核酸疫苗免疫组和空载体对照组之间有显著的差异，且免疫组的分值(0.5±1.0)低于对照组的分值(2.6±1.7)。在BCG免疫组的5头牛中的3头中也发现了肺脏结核病损伤，平均肺脏损伤分值(1.8±1.8)也低于空载体对照组。牛分枝杆菌三联核酸疫苗免疫组、卡介苗免疫组、pJW4303空载体对照组和非免疫对照组的所有损伤都没有黄色的钙干酪化中心。非免疫对照组和免疫组的损伤在大小上没有显著差异。另外，五头pJW4303空载体对照组有显微镜可见结核病损伤的牛有培养阳性肺脏。BCG组的两头有培养阳性肺脏，其中一头BCG免疫的牛有脏器损伤但显示牛分枝杆菌培养阴性。图6A-6I表明所有的免疫过的牛的炎症程度都比对照组处理的牛的炎症降低了，从三联核酸疫苗和BCG疫苗免疫过的牛获得的结果与空载体对照组的结果有显著的不同。空载体pJW4303处理过的牛的肺泡组织显现不正常和趋向纤维化的肺器损伤，约70％肺实质参与但无肉芽肿或干酪样坏死出现(图6A)，并有大量的与上皮样巨噬细胞混合的淋巴细胞浸润(图6B&C)。相反，BCG免疫牛的肺纤维化只影响了一小部分肺实质(约15-20％)，且小而紧凑(图6D)，并有更多数量的淋巴细胞遍及损伤部位(图6E&F)。经三联核酸疫苗免疫过的牛的肺泡组织显得完整而清晰(图6G)，并有与上皮样巨噬细胞混合的淋巴细胞的少量浸润(图6H&I)。淋巴细胞的浸润程度在不同组之间有很大的差异，在每个部位所有免疫过的牛都有比对照组更小范围的淋巴细胞浸润，且在统计上是显著的。
表2.用牛分枝杆菌攻毒后的牛体内肉眼可见的肺脏损伤情况及分值
| 组别 | 有肺脏损伤的牛数/牛总数 | 肺脏损伤分值a |
| BCGAg85B，MPT-64，MPT-83pJW4303 | 3/51/5*5/5 | 1.8±1.80.5±1.0*2.6±1.7 |
a，免疫牛和对照牛的平均肺脏损伤分值±SE。损伤分值：4，≥100小损伤或一个直径＞60mm的损伤；3，25-99％的小损伤或一个直径20-60mm的损伤；2，10-24％的小损伤；1，1-9％的小损伤；0，没有损伤。
*，与空载体对照组有显著差异(P＜0.05)。
9)三联核酸疫苗对牛的遗传性免疫对攻毒实验的保护性分析
攻毒16周后宰杀所有的牛。摘取四个胸淋巴结(左右支气管的和前后纵隔的淋巴结)。组织样品用Tenbroeck研磨器(Wheaton，Millville，N.J.)匀浆，在0.75％cetylpyridium chloride中处理1小时，3,500×g离心20min，然后按文献(Buddle，B.M.，G.W.de Lisle，A.Pfeffer，and F.E.Aldwell.1995.Immunological responses and protection against Mycobacterium bovis in calvesvaccinated with a low dose of BCG.Vaccine 13：1123-1130)所述的方法分离牛分枝杆菌。10倍系列梯度稀释的肺组织匀浆涂布到Lowenstein-Jensen培养基上培养。8周后对牛分枝杆菌克隆进行计数。结果如表3所示，表明和pJW4303对照组的((1.38±1.31)×105)相比，BCG免疫过的牛的细菌数目降低了2,000倍((6.82±0.11)×101)。空载体DNA处理的牛都没有表现任何保护效果。经三联核酸疫苗免疫的牛肺内的细菌数量((1.87±1.40)×101)比空载体对照组的数量减少了7,000倍以上。
表3、不同疫苗及空载体DNA对气管攻毒实验后牛肺脏的保护效率分析
(以存活细菌数为指标)
| 疫苗 | 肺CFU±SD/器官* |
| BCGAg85B，MPT-64，MPT-83pJW4303 | (6.82±0.11)×101(1.87±1.40)×101(1.38±1.31)×105 |
*细菌数目的几何平均数(CFU/克组织)±SD。
序列表
<110>北京大学
<120>一种牛分枝杆菌三联核酸疫苗
<140>200410046101.9
<141>申请日2004-05-31
<160>2
<210>1
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
aaatggggca cagctagcca tatgacagac gtgagcc 37
<210>2
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
actaggatcc taagcaacct tcggttgatc ccgtcagc 38
Claims (8)
1、一种牛分枝杆菌三联核酸疫苗，是将Ag85B、MPT-83和MPT-64基因，分别单独克隆到真核表达载体中，将得到的三种表达载体进行联合形成的混合物。
2、根据权利要求1所述的牛分枝杆菌三联核酸疫苗，其特征在于：所述疫苗中还含有佐剂DDA和/或MPL和/或Quil-A和/或RIBI佐剂和/或生理盐水和/或铝佐剂和/或福氏佐剂。
3、根据权利要求2所述的牛分枝杆菌三联核酸疫苗，其特征在于：所述牛分枝杆菌三联核酸疫苗中核酸疫苗与DDA的重量份数比为1-3∶1。
4、根据权利要求3所述的牛分枝杆菌三联核酸疫苗，其特征在于：所述牛分枝杆菌三联核酸疫苗中核酸疫苗与DDA的重量份数比为3∶1。
5、根据权利要求1所述的牛分枝杆菌三联核酸疫苗，其特征在于：所述表达载体含有启动子。
6、根据权利要求5所述的牛分枝杆菌三联核酸疫苗，其特征在于：所述启动子为pJW4303带有的巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子或老鼠看家基因的启动子。
7、根据权利要求1至6中任意一项权利要求所述的牛分枝杆菌三联核酸疫苗，其特征在于：所述牛分枝杆菌三联核酸疫苗为将Ag85B、MPT-83和MPT-64基因分别克隆到真核表达载体pJW4303后并将表达产物联合而成的牛分枝杆菌三联核酸疫苗。
8、根据权利要求7所述的牛分枝杆菌三联核酸疫苗，其特征在于：所述牛分枝杆菌三联核酸疫苗为相同重量份数比的Ag85B、MPT-83和MPT-64的表达载体联合而成的牛分枝杆菌三联核酸疫苗。
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| 结核分枝杆菌DNA三价苗的细胞与体液应答研究 蔡宏 等，中国人兽共患病杂志，第2003年第5期 2003 * |
| 结核分枝杆菌组合DNA疫苗的免疫效果 潘怡 等，生物化学与生物物理学报，第35卷第1期 2003 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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