CN101613401B - 一种猪链球菌2型核酸酶表面蛋白、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪链球菌2型核酸酶表面蛋白，还公开了该蛋白质的制备方法及用途。本发明的猪链球菌2型核酸酶表面蛋白在genebank中的编号为gi|146321396，其制备方法包括克隆该核酸酶表面蛋白基因；将基因与大肠杆菌表达质粒相连接，转化大肠杆菌；诱导表达；对表达产物进行分离纯化等步骤。本发明的核酸酶表面蛋白可用作诊断靶标，在猪链球菌感染的动物和人可检测到该蛋白特异的抗体，同时又是重要的保护性抗原，可用于制备疫苗。

Description

一种猪链球菌2型核酸酶表面蛋白、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种细菌表面蛋白，具体地说涉及一种猪链球菌2型的表面蛋白，还涉及该蛋白质的制备方法以及用途。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis)，属于兰氏分类法的R群，有35个血清型，以猪链球菌2型流行最广，致病性最强。自丹麦在1968年最早报道人感染猪链球菌病后，20世纪70年代以来，欧美部分国家和香港地区均报道过猪链球菌病例，主要以脑膜炎为主，中毒性休克综合征(TSS)少见，未见暴发流行。我国于1998年和2005年两次在江苏和四川暴发人感染猪链球菌2型疫情，不同于国外人感染病例以脑膜炎为主的特点，临床表现为休克型和脑膜炎型。多数病例死于中毒性休克综合征(TSS)，病理改变主要表现为全身多器官受损，败血症伴弥漫性血管内凝血(DIC)。人猪链球菌病已成为严重威胁我国人民健康的一种新的人畜共患病，如何有效地预防和控制猪链球菌感染已成为科学家们面临的重要研究难题。

由于对毒力因子和保护性抗原了解甚少，同一血清型的菌株在不同的地区毒力也不尽相同，高致病性猪链球菌感染缺乏有效的诊断靶标：对该类病原的分离鉴定主要依靠传统的分离培养和生化鉴定，然后用猪链球菌高免血清进行凝集试验分型。但家畜广泛携带链球菌，许多菌株毒力低，因此仅仅靠生化反应检测猪链球菌是远远不够的，必须建立针对特异毒力因子的检测手段，以区分弱毒株和强毒株。以上情况都阻碍了有效的猪链球菌病疫苗的研制及对感染的及时诊断与控制。

纵观国外猪链球菌病疫苗的研制情况，主要经历了全菌免疫和抗原蛋白免疫两个阶段。上世纪90年代，有研究者以福尔马林灭活的猪链球菌进行静脉注射能刺激被免疫猪产生调理化的抗体[Holt ME，Enright MR，AlexanderTJ.(1990)Immunisation of pigs with killed cultures of Streptococcus suis type 2.Res Vet Sci.48：23-7]。也有研究者通过筛选无毒力的猪链球菌突变体，如温度敏感性突变体、链霉素依赖性突变体等来获得具有保护性的全菌疫苗[KebedeM，Chengappa MM，Stuart JG.(1990)Isolation and characterization oftemperature-sensitive mutants of Streptococcus suis：efficacy trial of the mutantvaccine in mice.Vet Microbiol.22：249-57.Foster N，Staats JJ，Chengappa MM.(1994)Isolation，characterization and protection studies in mice of astreptomycin-dependent mutant of Streptococcus suis type 1/2.Vet Res Commun.18：155-63.]，但是灭活的全菌免疫常会引起免疫综合征等副作用。后续有研究者利用猪链球菌相关毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)结合油包水型乳剂(WO)和氢氧化铝佐剂(AH)作为疫苗，对其保护性和毒副作用作了评价，发现用MRP+EF/WO免疫的猪与用全菌/WO免疫的猪具有同等有效的抗-MRP和抗-EF滴度，而且在免疫后的存活猪中，没有观察到明显的临床表征[Wisselink HJ，Vecht U，Stockhofe-Zurwieden N，Smith HE.(2001)Protection of pigs against challenge with virulent Streptococcus suis serotype 2strains by a muramidase-released protein and extracellular factor vaccine.Vet Rec.148：473-7.]。也有人用纯化的溶血素(SLY)作为疫苗免疫小鼠，发现能对小鼠产生完全保护作用，免受毒力株的伤害[Jacobs AA，Loeffen PL，van den BergAJ，Storm PK.(1994)Identification，purification，and characterization of athiol-activated hemolysin(suilysin)of Streptococcus suis.Infect Immun.62：1742-8.]。但猪链球菌的毒力因子较常时间以来就呈现出时空上的相对多样性，虽然MRP、EF与毒力高度相关，但与欧洲致病株不同的是多数加拿大致病株不表达MRP和EF，且MRP和EF的2-型猪链球菌缺失突变体与野生型一样同样具备毒力[Gottshalk M，Lebrun A，Wisselink HJ，Dubreuil JD，SmithHE，Vecht U.(1998)Production of virulence-related proteins by Canadian strainsof Streptococcus suis capsular type 2.Can J Vet Res 62：75-79.]。我国流行株和非流行株都表达MRP，且动物实验显示流行株培养分泌的上清并不引起病变，单靠现了解的MRP、EF、SLY等毒力因子不足以解释我国2-型猪链球菌的致病机理，使用MRP作为人免疫疫苗产生抗体中和MRP可能难以达到理想的效果。而在国内，猪链球菌疫苗的研制还处于起步状态，即灭活的全菌疫苗[王卓，舒秀伟，王文成.猪链球菌病二价灭活疫苗候选株培养条件的优化及其安全性试验.(2004)中国药兽杂志.38：34-36.]。因此有必要根据我国实际情况，研制适合我国的2-型猪链球菌的新型疫苗，发掘新的具有免疫原性的毒力因子是寻找新型疫苗的重要途径。

一般来说，表面暴露蛋白和细胞壁附着蛋白常被作为疫苗的候选靶标和血清学诊断试剂。近10年来，也有研究者试图寻找有免疫原性的猪链球菌表面细胞壁蛋白作为疫苗的候选分子，1996年Haataja S等分离并鉴定出一种半乳糖抑制型黏附素，在23种血清型的猪链球菌中，用免疫印迹的方法均能检测到这种黏附素的存在，发现具有很强的免疫原性和调理功能，适合作为疫苗候选分子[Haataja S，Tikkanen K，Hytonen J，Finne J.(1996)The Gal alpha1-4 Gal-binding adhesin of Streptococcus suis，a gram-positivemeningitis-associated bacterium.Adv Exp Med Biol.408：25-34.]。2005年Okwumabua O等人通过对2-型猪链球菌的全基因组进行筛选，发现一种分子量为38kDa蛋白，具有很好的免疫原性和保护性，认为这种蛋白是较好的疫苗候选分子并且适合用作诊断试剂的开发，这种蛋白的生物学功能以及与致病机理的关系正在进一步研究中[Okwumabua O，Chinnapapakkagari S.(2005)Identification of the gene encoding a 38-kilodalton immunogenic and protectiveantigen of Streptococcus suis.Clin Diagn Lab Immunol.12：484-90]。

发明内容

为了寻找具有免疫原性的毒力因子，研发猪链球菌新型疫苗，本发明提供了一种猪链球菌2型新型核酸酶表面蛋白，还公开了该核酸酶表面蛋白的制备方法及其用途。本发明所公开的猪链球菌2型核酸酶表面蛋白具有序列表中序列1所示的氨基酸序列，编码该核酸酶表面蛋白的基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列，编码该蛋白的基因在猪链球菌2型菌株中广泛存在。该蛋白命名为SSU98_1549，genebank编号为gi|146321396。

本发明还公开了表达上述猪链球菌2型核酸酶表面蛋白的重组表达质粒，其含有序列表中序列2的核苷酸序列。上述表达质粒可以为大肠杆菌表达质粒，具体质粒可以是pET32a等。

本发明还公开了含有上述表达猪链球菌2型核酸酶表面蛋白的重组表达质粒的菌株，该菌株为大肠杆菌，可以为BL21菌株。

本发明还公开了上述核酸酶表面蛋白的制备方法，该方法包括如下步骤：

首先克隆该核酸酶表面蛋白基因：可通过PCR方法进行，首先设计合成引物，在引物两端可添加酶切位点和保护性碱基，然后按照PCR方法，用猪链球菌制备的模板，在一定条件下进行扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收产物并进行酶切，确定核酸酶表面蛋白基因。然后是表达该核酸酶表面蛋白基因的重组质粒制备：将制备的核酸酶表面蛋白基因与大肠杆菌表达载体相连接，表达载体可以为原核表达载体，可采用商业的原核表达载体，如大肠杆菌表达载体pET32a，制备表达载体，并转化大肠杆菌，制备重组菌，利用菌落PCR和限制性内切酶进行重组菌的筛选和鉴定；对重组菌进行IPTG诱导表达；超声波破碎重组菌，收集上清，以GE镍亲和层析柱进行纯化。

本发明还公开了上述核酸酶表面蛋白的用途。本发明的核酸酶表面蛋白是通过免疫蛋白质组鉴定的2型猪链球菌新的免疫原性抗原分子，目前根据猪链球菌基因组注释的结果，仅有该基因开放阅读框架的预测，尚未有该蛋白在猪链球菌中表达的报道，也未有该基因功能的线索。

本发明通过实验证明，该蛋白可用作诊断靶标，在猪链球菌感染的动物和人血清中针对该蛋白的抗体明显上升，因而可用于开发猪链球菌感染的诊断试剂。本发明还公开了核酸酶表面蛋白在制备猪链球菌2型疫苗中的应用。通过该蛋白制备的免疫血清调理的全血杀伤实验发现该蛋白具有一定的保护性，是新的高效保护性抗原，可用于制备疫苗，作为重点疫苗候选和诊断分子。

本发明首次将该核酸酶表面蛋白鉴定为猪链球菌2型新的免疫原性抗原分子，并通过基因工程方法制备了该核酸酶表面蛋白并制备了相应抗体。并公开了该核酸酶表面蛋白可以用于制备猪链球菌的诊断试剂和疫苗，在有效预防和控制猪链球菌感染方面具有良好的应用价值和广阔的市场前景。

附图说明

图1为猪链球菌2型核酸酶表面蛋白SSU98_1549的纯化蛋白电泳图，其中3为低分子量蛋白标准，从上至下依次为97.4kDa，66.2kDa，43.0kDa，31.0kDa，20.0kDa；1为上样前蛋白诱导物原液，2为上样后蛋白诱导物穿透液，4-5为50mMol/L浓度咪唑的洗脱液(不含目的蛋白)，6-8为150mmol/L浓度咪唑的洗脱液(含目的蛋白)。

图2针对SSU98_1549特异抗体的比较。病人和健康人的抗体水平比较(A)，猪感染前后的抗体水平比较(B)。ELISA实验用于评价针对SSU98_1549特异的抗体反应，硫氧还蛋白(Trx)用作阴性对照。

具体实施方式

实施例一猪链球菌2型核酸酶表面蛋白SSU98_1549的表达纯化及抗体制备

1.材料和方法

1.1菌株和质粒

猪链球菌2型98HAH12株[Chen C，Tang J，Dong W，Wang C，Feng Y，et al(2007)A Glimpse of Streptococcal Toxic Shock Syndrome from ComparativeGenomics of S.suis 2Chinese Isolates.PLoS ONE 2(3)：e315]；大肠杆菌DH5a，BL21，均为国际标准株；表达载体pET32a(+)为Novagen公司产品。

1.2酶和试剂

EcoRI和XhoI等限制性内切酶以及Taq酶、dNTPs、DL15000分子量标准等PCR所用试剂均为宝生物工程(大连)有限公司产品；DNA回收试剂盒为天为公司产品；镍亲和层析柱为GE公司产品；质粒提取盒为V-gene公司产品；弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂为Sigma公司产品；Amp为中诺药业产品。

1.3PCR引物设计及SSU98_1549核酸序列，蛋白序列

根据所要扩增的片段，设计一对引物，引物两端分别添加EcoRI和XhoI酶切位点和保护性碱基，引物P1和P2可扩增猪链球菌2型SSU98_1549基因开放阅读框(ORF)全长片断。引物序列分别为：

上游引物P1：5‘-gcggatccaaaaagaatattcggttg-3’见序列表中序列3；

下游引物P2：5‘-atctcgagctccccttccttacgtctca-3’见序列表中序列4。

核酸序列＞SSU98_1549见序列表中序列2，氨基酸序列＞SSU98_1549见序列表中序列1。

1.4PCR扩增

按下列顺序和条件依次加入各反应物并进行PCR扩增。猪链球菌2型模板DNA 2μL，10×buffer 5μL，2.5mmol/L dNTPs 3μL，引物P1和P2(5μmol/L)各1μL，ddH₂O 37μL，LA-Taq酶(5U/μL)1μL。扩增的条件为；94℃7min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，30个循环；72℃7min。

1.5PCR产物的回收和酶切

PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳，后以DNA回收试剂盒回收目的片段，并以BamHI和XhoI 37℃酶切3h。

在含有100μg/mL Amp的LB肉汤中接种携带pET32a空质粒的DH5α大肠杆菌单菌落，37℃摇振培养12～16h后，1％转接入100μg/mL Amp的新鲜LB肉汤37℃摇振培养6h，以质粒抽提试剂盒抽提质粒。BamH I和Xho I双酶切后，以DNA回收试剂盒回收酶切产物。将PCR双酶切回收产物与空质粒双酶切回收产物进行连接，并转化感受态的DH5α宿主菌。感受态细菌的制备、转化均按常规方法进行，利用菌落PCR和限制性内切酶酶切进行重组菌的筛选和鉴定。

1.7重组质粒的测序和序列分析

重组质粒的序列测定采用Sanger双脱氧末端终止法，由北京三博远志生物技术有限公司完成，以验证其阅读框架，并以BLAST软件进行同源性分析。

1.8重组质粒在大肠杆菌中的表达和纯化

将重组质粒按常规方法转化感受态的大肠杆菌BL21，利用Amp抗性筛选重组菌，挑单菌落接种LB肉汤中(含100μg/mL Amp)，30℃剧烈摇振培养2～4h，当菌液浓度OD₆₀₀达0.5～0.6时，加IPTG至终浓度1mmol/L，30℃继续剧烈摇振培养2～4h。6000r/min离心10min，沉淀以蒸馏水重悬，加等体积的2×电泳上样缓冲液煮沸10min，SDS-PAGE检测。含空pET32a(+)的大肠杆菌BL21亦同样经IPTG诱导处理后，SDS-PAGE检测表达情况。以超声波破碎诱导的重组菌，收集上清，以GE镍亲和层析柱进行亲和层析，具体步骤按使用说明书进行。

1.9重组蛋白动物免疫试验

将收集的蛋白以PH7.2 10mmol/L的PBS稀释至0.1mg/ml，加入等量的弗氏完全佐剂，皮下免疫Wistar大鼠(购自军事医学科学院试验动物中心)，0.5ml/只；以后3-5周，分别以0.2，0.4，0.8，1.6mg/ml加弗氏不完全佐剂加强免疫，第7周断尾取血ELISA法测抗体效价。同时设立全菌免疫对照组和空白对照组(pET32a空质粒转化BL21，诱导表达TRX蛋白，以此蛋白免疫大鼠为空白对照)。以硫酸铵沉淀法制备抗血清。

2.结果

2.1PCR结果

PCR产物经电泳后，出现一条约2025bp的条带，大小与预期一致。

2.2重组质粒的鉴定

SSU98_1549基因片段经回收，以BamHI和Xho I酶切位点定向克隆至pET-32a中，获得重组质粒，命名为SSU98_1549-pET-32a。重组质粒转化感受态的DH5α宿主菌，经Amp抗性筛选得到重组菌。提取重组质粒，经EcoRI和Xho I双酶切，可切出约2025bp左右的片断，说明SSU98_1549片段已成功克隆。

2.3重组质粒的表达

重组BL21转化菌经IPTG诱导后，菌体SDS-PAGE显示有一条90kD的蛋白带。经镍柱纯化获得纯化的SSU98_1549蛋白。见图1。

2.4测序结果和序列分析

克隆的序列长度经测序为2025bp，如序列表中序列2所示，翻译后为674个氨基酸残基，见序列表中序列1。

实施例二猪链球菌2型核酸酶表面蛋白SSU98_1549的免疫原性及抗体介导的调理吞噬试验

1.材料方法：材料同实施例一。

1.1重组猪链球菌2型核酸酶表面蛋白SSU98_1549和多抗的制备：见实施例一。

1.2SSU98_0267抗体介导的调理吞噬

血平板刮取猪链球菌2型单菌落，接入THB培养基，37℃，CO₂孵箱培养8h后转接新鲜THB培养基培养8h至对数生长期。取1ml菌液(约1×10⁸CFU/ml)13,000rpm，1min集菌，PBS洗菌并重悬，调整至10⁶CFU/ml，涂血平板，记为初始菌量。取50μl(≈10⁶CFU/ml)菌液加入100μl抗体，37℃15min后冰上15min；加入350μl健康人全血37℃，3h；加入55μl 1％saponin，冰上20min；反复吹打后稀释涂血平板，16h后血平板记数单克隆。

1.3感染猪与人中SSU98_0267蛋白特异抗体测定

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定病人和感染动物中针对该蛋白的特异抗体，采用健康人的血清和感染前的动物血清作为对照。采用5μg/ml的重组蛋白包被酶联板，包被缓冲液为0.05M NaHCO₃(PH 9.6)，4℃包被过夜，然后采用3％BSA 37℃封闭3h。病人和健康人血清样品1∶500稀释，感染前后猪血清均1∶200稀释，反应信号通过辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗进行检测。

2.结果

2.1重组蛋白抗体介导的调理吞噬作用

经GE镍亲和层析柱层析获得纯化的重组蛋白SSU98_1549，分别加弗氏完全和不完全佐剂免疫后，制备抗血清，进行间接杀菌试验。杀菌率计算：(CFUrTrx-CFUr98_1549)/CFUrTrx。Trx为从含pET32a(+)空载体的大肠杆菌BL21镍柱纯化的硫氧还蛋白。

抗体介导的调理吞噬试验：分别用SSU98_1549重组蛋白；MRP重组蛋白免疫大鼠后的大鼠血清调理健康人血，进行人全血对猪链球菌2型活菌的杀伤试验。SSU98_1549重组蛋白的抗血清调理人全血对猪链球菌2型的杀伤率为40％左右，但低于MRP蛋白的抗血清，MRP蛋白的抗血清调理人全血对猪链球菌2型的杀伤率为90％。

2.2感染的人和猪血清中SSU98_1549特异抗体检测

我们检测了6名猪链球菌2型感染的病人和5名健康人血清中SSU98_0267特异抗体的存在状况，结果发现与健康人相比，病人SSU98_0267特异抗体水平明显升高，见图2A。我们检测了猪链球菌2型感染猪前后血清中SSU98_0267特异抗体的存在状况，结果发现与感染前相比，感染后血清中SSU98_0267特异抗体水平显著升高，见图2B。上述实验结果表明SSU98_0267可作为诊断靶标用于猪链球菌2型感染的血清学诊断。

猪链2型核酸酶表面蛋白.SEQ

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所

<120>一种猪链球菌2型核酸酶表面蛋白、其制备方法及用途

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>674

<212>PRT

<213>

<400>1

Met Lys Lys Asn Ile Arg Leu Lys Ser Ser Ile Leu Ala Leu Val Ala

1               5                   10                  15

Gly Phe Ser Val Ile Ala Thr Gln Ala Val Leu Ala Asp Glu Leu Ala

            20                  25                  30

Val Gln Ile Met Gly Val Asn Asp Phe His Gly Ala Leu Asp Met Thr

        35                  40                  45

Gly Thr Ala Arg Leu Glu Gly Glu Thr Val Arg Asn Ala Gly Thr Ala

    50                  55                  60

Ala Leu Leu Asp Ala Tyr Met Asp Asp Ser Gln Ala Glu Phe Glu Glu

65                  70                  75                  80

Thr Ala Ala Glu Thr Glu Thr Pro Ala Glu Ser Ile Arg Val Gln Ala

                85                  90                  95

Gly Asp Met Val Gly Ala Ser Pro Ser Asn Ser Gly Leu Leu Gln Asp

            100                  105                  110

Glu Pro Thr Val Lys Val Phe Asn Lys Met Asp Val Glu Tyr Gly Thr

        115                 120                 125

Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Glu Gly Leu Asp Glu Tyr Asn Arg Ile

    130                 135                 140

Met Thr Gly Glu Ala Pro Lys Lys Gly Gln Phe Asn Glu Ile Val Asp

145                 150                 155                 160

Asn Tyr Thr Arg Glu Ala Ala Lys Gln Glu Ile Val Ile Ala Asn Val

                165                 170                 175

Ile Asp Lys Glu Thr Gly Glu Ile Pro Tyr Gly Trp Lys Pro Tyr Ala

            180                 185                 190

Ile Lys Thr Ile Pro Val Asn Asp Lys Glu Ala Lys Ile Gly Phe Ile

        195                 200                 205

Gly Val Val Thr Thr Glu Ile Pro Asn Leu Val Leu Lys Lys Asn Tyr

    210                 215                 220

Glu Gln Tyr Thr Phe Leu Asn Glu Ala Glu Thr Ile Ala Lys Tyr Ala

225                 230                 235                 240

Arg Glu Leu Ala Glu Lys Gly Val Asn Ala Ile Val Val Leu Ala His

                245                 250                 255

Val Pro Ala Thr Ser Lys Asp Gly Val Ala Ala Gly Glu Ala Ala Asp

            260                 265                 270

Met Ile Ala Lys Leu Asn Glu Ile Tyr Pro Glu His Ser Val Asp Leu

        275                 280                 285

Val Phe Ala Gly His Asn His Val Tyr Thr Asn Gly Thr Thr Gly Lys

    290                 295                 300

Thr Leu Ile Val Gln Ala Thr Ser Gln Gly Lys Ala Tyr Ala Asp Val

305                 310                 315                 320

Arg Ala Val Tyr Asp Thr Asp Ile Ala Asp Phe Lys Ala Val Pro Thr

                325                 330                 335

Ala Lys Ile Ile Ala Val Ala Pro Gly Gln Lys Thr Pro Ser Pro Glu

            340                 345                 350

Ile Gln Ala Ile Val Asp Glu Ala Asn Thr Ile Val Lys Lys Val Thr

        355                 360                 365

Glu Gln Lys Ile Ala Thr Ala Ser Gln Ala Thr Asp Ile Ser Arg Glu

    370                 375                 380

Val Asn Glu Phe Lys Glu Ser Ala Val Gly Asn Leu Val Thr Ser Ala

385                 390                 395                 400

Gln Leu Ala Ile Ala Lys Lys Ser Gly Tyr Asp Val Asp Phe Ala Met

                405                 410                 415

Thr Asn Asp Gly Gly Ile Arg Ala Asp Leu Lys Val Gln Glu Asp Gly

            420                 425                 430

Thr Val Thr Trp Gly Ala Ala Gln Ala Val Gln Pro Phe Gly Asn Ile

        435                 440                 445

Leu Gln Val Val Gln Met Thr Gly Glu Gln Ile Tyr Thr Ala Leu Asn

    450                 455                 460

Gln Gln Tyr Asp Glu Gly Glu Lys Tyr Phe Leu Gln Met Ser Gly Ile

465                 470                 475                 480

Lys Tyr Ile Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Pro Thr Glu Glu Asn Pro Tyr

            485                 490                 495

Lys Val Val Lys Ala Phe Lys Glu Asp Gly Thr Glu Ile Val Pro Thr

            500                 505                 510

Glu Thr Tyr Thr Leu Val Ile Asn Asp Phe Leu Phe Gly Gly Gly Asp

        515                 520                 525

Gly Phe Ser Ile Phe Lys Glu Ala Lys Leu Ile Gly Ala Ile Asn Pro

    530                 535                 540

Asp Thr Glu Val Phe Val Glu Tyr Leu Thr Asp Leu Glu Lys Ala Gly

545                 550                 555                 560

Gln Thr Ile Ser Ala Thr Ile Pro Gly Arg Lys Ala Phe Val Glu Lys

                565                 570                 575

Tyr Val Glu Glu Pro Lys Ala Glu Glu Lys Glu Asp Asn Ala Gly Thr

            580                 585                 590

Thr Thr Asp Val Lys Thr Pro Glu Lys Ala Asn Asp Gly Gly Asp Ser

        595                 600                 605

Val Thr Asn Gln Lys Ala Thr Glu Gln Pro Ala Pro Ser Gly Ser Met

    610                 615                 620

Ala Pro Ile Ser Asn Lys Lys Thr Glu Lys Ala Ser Gly Asn Gln Thr

625                 630                 635                 640

Leu Pro Asn Thr Gly Gln Glu Ala Leu Gly Ser Leu Leu Ile Ser Leu

                645                 650                 655

Gly Gly Leu Val Ser Leu Gly Met Ala Val Ser Val Arg Arg Lys Glu

            660                 665                 670

Gly Glu

<210>2

<211>2025

<212>DNA

<213>

<400>2

atgaaaaaga atattcggtt gaaaagcagt atactagctc ttgtagctgg ttttagcgtt     60

attgcaacac aagctgtttt agcagatgaa ttagctgtcc aaattatggg agttaatgat    120

ttccatggtg cgcttgatat gacggggaca gcgcgattgg aaggggaaac agttcgtaat    180

gcaggaactg ccgctttact tgatgcttac atggatgatt cacaagcaga atttgaagaa    240

acagcagcag aaacagagac acctgcagag tctatccgtg ttcaagctgg ggatatggtt     300

ggtgcaagtc catcgaattc tggacttttg caagatgaac caactgtaaa agtctttaat     360

aaaatggatg ttgaatacgg aactttgggg aaccatgagt ttgatgaggg acttgatgag     420

tataaccgta tcatgactgg tgaagctcca aaaaaaggtc agtttaatga gattgtagat     480

aattatactc gtgaagctgc taaacaggag attgttattg ctaacgttat tgacaaagaa     540

acaggtgaaa ttccgtatgg ttggaagccc tacgctatta agactattcc cgtgaatgat     600

aaagaagcta agattggctt tattggtgta gttacgacag aaattcctaa tcttgttttg     660

aagaaaaact atgagcagta cacttttttg aatgaggcag agacgattgc taaatatgcg     720

cgtgaattag ctgaaaaagg tgtaaatgcg atagttgtac tggctcacgt tccggctaca     780

agcaaggatg gtgtggctgc tggtgaagct gcagatatga ttgctaagct aaatgaaatc     840

tatcctgaac actcagttga ccttgtattt gctggccata accatgtcta tacaaacggt     900

acaacgggca aaaccttgat tgttcaagct acctcacaag gtaaggctta cgcagatgtt     960

agggctgttt atgatacaga tattgccgac tttaaagctg ttccgactgc gaaaattatt    1020

gcagtagcac cagggcagaa aacaccaagt ccggaaattc aggcaattgt agatgaggca    1080

aataccattg ttaaaaaagt aactgagcaa aaaattgcta cagctagtca agcgacagat    1140

atttcacgcg aagtgaatga atttaaagaa agtgctgtag gtaatctagt aacatcggct    1200

caattagcta tcgctaagaa atcgggttat gatgttgact ttgcaatgac aaacgatggc    1260

gggattcggg cagatttgaa ggtccaagaa gatggaacag ttacttgggg agcagcacaa    1320

gctgttcaac catttgggaa tatcctacaa gtcgttcaaa tgacaggtga gcagatttat    1380

acagccttaa atcaacaata tgatgaaggt gaaaaatatt tccttcaaat gtctggaatt    1440

aaatatatct acacgaaggc tgacaatcca acggaagaaa atccttataa ggttgttaaa    1500

gccttcaaag aagatgggac ggagattgtt ccgacagaaa cctatacact tgtcatcaac    1560

gacttcttat ttggtggtgg ggatggcttc tcgattttca aagaagctaa actgattggt    1620

gctatcaatc cagatacaga agtatttgtg gagtacttga ctgatttaga aaaagcaggt    1680

caaaccatta gtgcaacaat tccaggtaga aaagcatttg tagagaagta cgtagaagaa    1740

ccaaaagcag aagaaaaaga agataatgct gggacaacta ctgatgtgaa aacacctgag    1800

aaagcaaatg acggtggcga tagtgtaaca aatcagaaag caaccgagca accggcacca    1860

tctggaagta tggctcctat ttcaaataag aaaactgaaa aagcatcagg aaatcaaaca    1920

cttccaaata ccggtcaaga agccctaggc tcacttctta ttagcttggg tggcttagtt    1980

tcactcggaa tggctgtctc agtgagacgt aaggaagggg agtag                    2025

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>

<400>3

gcggatccaa aaagaatatt cggttg      26

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>

<400>4

atctcgagct ccccttcctt acgtctca    28

Claims (2)

1.一种猪链球菌2型核酸酶表面蛋白在制备猪链球菌2型感染诊断试剂中的应用，其中所述核酸酶表面蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

2.一种猪链球菌2型核酸酶表面蛋白在制备猪链球菌2型疫苗中的应用，其中所述核酸酶表面蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

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