CN101613398B - 一种猪链球菌2型表面脂蛋白、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪链球菌2型表面蛋白，还公开了该蛋白质的制备方法及用途。本发明的猪链球菌2型表面蛋白在genebank中的编号为gi|146320941，其制备方法包括克隆该表面蛋白基因；将基因与大肠杆菌表达质粒相连接，转化大肠杆菌；诱导表达；对表达产物进行分离纯化等步骤。本发明的表面蛋白可用作诊断靶标，在猪链球菌感染的动物和人可检测到该蛋白特异的抗体，同时又是重要的保护性抗原，可用于制备疫苗。

Description

一种猪链球菌2型表面脂蛋白、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种细菌表面蛋白，具体地说涉及一种猪链球菌2型的表面蛋白，还涉及该蛋白质的制备方法以及用途。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis)，属于兰氏分类法的R群，有35个血清型，以猪链球菌2型流行最广，致病性最强。自丹麦在1968年最早报道人感染猪链球菌病后，20世纪70年代以来，欧美部分国家和香港地区均报道过猪链球菌病例，主要以脑膜炎为主，中毒性休克综合征(TSS)少见，未见暴发流行。我国于1998年和2005年两次在江苏和四川暴发人感染猪链球菌2型疫情，不同于国外人感染病例以脑膜炎为主的特点，临床表现为休克型和脑膜炎型。多数病例死于中毒性休克综合征(TSS)，病理改变主要表现为全身多器官受损，败血症伴弥漫性血管内凝血(DIC)。人猪链球菌病已成为严重威胁我国人民健康的一种新的人畜共患病，如何有效地预防和控制猪链球菌感染已成为科学家们面临的重要研究难题。

由于对毒力因子和保护性抗原了解甚少，同一血清型的菌株在不同的地区毒力也不尽相同，高致病性猪链球菌感染缺乏有效的诊断靶标：对该类病原的分离鉴定主要依靠传统的分离培养和生化鉴定，然后用猪链球菌高免血清进行凝集试验分型。但家畜广泛携带链球菌，许多菌株毒力低，因此仅仅靠生化反应检测猪链球菌是远远不够的，必须建立针对特异毒力因子的检测手段，以区分弱毒株和强毒株。以上情况都阻碍了有效的猪链球菌病疫苗的研制及对感染的及时诊断与控制。

纵观国外猪链球菌病疫苗的研制情况，主要经历了全菌免疫和抗原蛋白免疫两个阶段。上世纪90年代，有研究者以福尔马林灭活的猪链球菌进行静脉注射能刺激被免疫猪产生调理化的抗体[Holt ME，Enright MR，AlexanderTJ.(1990)Immunisation of pigs with killed cultures of Streptococcus suis type 2.Res Vet Sci.48：23-7]。也有研究者通过筛选无毒力的猪链球菌突变体，如温度敏感性突变体、链霉素依赖性突变体等来获得具有保护性的全菌疫苗[KebedeM，Chengappa MM，Stuart JG.(1990)Isolation and characterization oftemperature-sensitive mutants of Streptococcus suis：efficacy trial of the mutantvaccine in mice.Vet Microbiol.22：249-57.Foster N，Staats JJ，Chengappa MM.(1994)Isolation，characterization and protection studies in mice of astreptomycin-dependent mutant of Streptococcus suis type 1/2.Vet Res Commun.18：155-63.]，但是灭活的全菌免疫常会引起免疫综合征等副作用。后续有研究者利用猪链球菌相关毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)结合油包水型乳剂(WO)和氢氧化铝佐剂(AH)作为疫苗，对其保护性和毒副作用作了评价，发现用MRP+EF/WO免疫的猪与用全菌/WO免疫的猪具有同等有效的抗-MRP和抗-EF滴度，而且在免疫后的存活猪中，没有观察到明显的临床表征[Wisselink HJ，Vecht U，Stockhofe-Zurwieden N，Smith HE.(2001)Protection of pigs against challenge with virulent Streptococcus suis serotype 2strains by a muramidase-released protein and extracellular factor vaccine.Vet Rec.148：473-7.]。也有人用纯化的溶血素(SLY)作为疫苗免疫小鼠，发现能对小鼠产生完全保护作用，免受毒力株的伤害[Jacobs AA，Loeffen PL，van den BergAJ，Storm PK.(1994)Identification，purification，and characterization of athiol-activated hemolysin(suilysin)of Streptococcus suis.Infect Immun.62：1742-8.]。但猪链球菌的毒力因子较常时间以来就呈现出时空上的相对多样性，虽然MRP、EF与毒力高度相关，但与欧洲致病株不同的是多数加拿大致病株不表达MRP和EF，且MRP和EF的2-型猪链球菌缺失突变体与野生型一样同样具备毒力[Gottshalk M，Lebrun A，Wisselink HJ，Dubreuil JD，SmithHE，Vecht U.(1998)Production of virulence-related proteins by Canadian strainsofStreptococcus suis capsular type 2.Can J Vet Res 62：75-79.]。我国流行株和非流行株都表达MRP，且动物实验显示流行株培养分泌的上清并不引起病变，单靠现了解的MRP、EF、SLY等毒力因子不足以解释我国2-型猪链球菌的致病机理，使用MRP作为人免疫疫苗产生抗体中和MRP可能难以达到理想的效果。而在国内，猪链球菌疫苗的研制还处于起步状态，即灭活的全菌疫苗[王卓，舒秀伟，王文成.猪链球菌病二价灭活疫苗候选株培养条件的优化及其安全性试验.(2004)中国药兽杂志.38：34-36.]。因此有必要根据我国实际情况，研制适合我国的2-型猪链球菌的新型疫苗，发掘新的具有免疫原性的毒力因子是寻找新型疫苗的重要途径。一般来说，表面暴露蛋白和细胞壁附着蛋白常被作为疫苗的候选靶标和血清学诊断试剂。近10年来，也有研究者试图寻找有免疫原性的猪链球菌表面细胞壁蛋白作为疫苗的候选分子，1996年Haataja S等分离并鉴定出一种半乳糖抑制型黏附素，在23种血清型的猪链球菌中，用免疫印迹的方法均能检测到这种黏附素的存在，发现具有很强的免疫原性和调理功能，适合作为疫苗候选分子[Haataja S，Tikkanen K，HytonenJ，Finne J.(1996)The Gal alpha 1-4 Gal-binding adhesin of Streptococcus suis，a gram-positive meningitis-associated bacterium.Adv Exp Med Biol.408：25-34.]。2005年Okwumabua O等人通过对2-型猪链球菌的全基因组进行筛选，发现一种分子量为38kDa蛋白，具有很好的免疫原性和保护性，认为这种蛋白是较好的疫苗候选分子并且适合用作诊断试剂的开发，这种蛋白的生物学功能以及与致病机理的关系正在进一步研究中[Okwumabua O，Chinnapapakkagari S.(2005)Identification of the gene encoding a 38-kilodalton immunogenic andprotective antigen of Streptococcus suis.Clin Diagn Lab Immunol.12：484-90]。

目前在获得具有免疫原性的蛋白方面，还缺乏有力的手段，传统生物学方法鉴定免疫原性蛋白是困难的，需要构建基因文库，然后用相应血清筛选，该方法耗时较长，不能实现高通量筛选，并可能存在假阳性反应。免疫蛋白质组是一种快速、高效筛选候选诊断靶标的方法，通过将2D电泳分辨率高和质谱直接鉴定蛋白质的优势结合，直接选取2D电泳胶上有免疫反应的蛋白点，以质谱方法进行鉴定，因此，借助免疫蛋白质组学手段则完全可能在较短时间内快速高效的筛选并鉴定免疫原性蛋白，尤其对猪链球菌研究相对较少的病原微生物来说，更有可能短时间内鉴定多个全新的免疫原性蛋白。

发明内容

为了寻找具有免疫原性的毒力因子，研发猪链球菌新型疫苗，本发明提供了一种猪链球菌2型新型表面蛋白，还公开了该表面蛋白的制备方法及其用途。本发明所公开的猪链球菌2型表面蛋白具有序列表中序列1所示的氨基酸序列，编码该表面蛋白的基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列，编码该蛋白的基因在猪链球菌2型菌株中广泛存在。该蛋白命名为SSU98_1094，genebank编号为gi|146320941。

本发明还公开了上述表面蛋白的制备方法，该方法包括如下步骤：

首先克隆该表面蛋白基因：可通过PCR方法进行，首先设计合成引物，在引物两端可添加酶切位点和保护性碱基，然后按照PCR方法，用猪链球菌制备的模板，在一定条件下进行扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收产物并进行酶切，确定表面蛋白基因。然后是表达该表面蛋白基因的重组质粒制备：将制备的表面蛋白基因与大肠杆菌表达载体相连接，表达载体可以为原核表达载体，可采用商业的原核表达载体，如大肠杆菌表达载体pET32a，制备表达载体，并转化大肠杆菌，制备重组菌，利用菌落PCR和限制性内切酶进行重组菌的筛选和鉴定；对重组菌进行IPTG诱导表达；超声波破碎重组菌，收集上清，以GE镍亲和层析柱进行纯化。

本发明还公开了上述表面蛋白的用途。本发明的表面蛋白是通过免疫蛋白质组鉴定的2型猪链球菌新的免疫原性抗原分子，目前根据猪链球菌基因组注释的结果，仅有该基因开放阅读框架的预测，尚未有该蛋白在猪链球菌中表达的报道，也未有该基因功能的线索。

本发明通过实验证明，该蛋白可用作诊断靶标，在猪链球菌感染的动物和人血清中针对该蛋白的抗体明显上升，因而可用于开发猪链球菌感染的诊断试剂。本发明还公开了表面蛋白在制备猪链球菌2型疫苗中的应用。动物实验显示，该蛋白对猪链球菌致死具有很好的保护作用。通过该蛋白制备的免疫血清调理的全血杀伤实验发现该蛋白具有与全菌免疫相当的保护性，是新的高效保护性抗原，可用于制备疫苗，作为重点疫苗候选和诊断分子。

本发明首次将该表面蛋白鉴定为猪链球菌2型新的免疫原性抗原分子，并通过基因工程方法制备了该表面蛋白并制备了相应抗体。公开了该表面蛋白可以用于制备猪链球菌的诊断试剂和疫苗，在有效预防和控制猪链球菌感染方面具有良好的应用价值和广阔的市场前景。

附图说明

图1为重组质粒酶切图谱。其中1为DNA分子量标准DL15000，2为重组质粒经EcoRI和XhoI酶双酶切。

图2为重组质粒表达图谱，其中1-5为诱导后，6为诱导前，7为低分子量蛋白标准，从上至下依次为97.4kDa，66.2kDa，43.0kDa，31.0kDa，20.0kDa。

图3为猪链球菌2型表面蛋白SSU98_1094的纯化蛋白电泳图，其中1为低分子量蛋白标准，从上至下依次为97.4kDa，66.2kDa，43.0kDa，31.0kDa，20.0kDa。2为上样前蛋白诱导物原液，3为上样后蛋白诱导物穿透液，4-5为125mmol/L浓度咪唑的洗脱液(不含目的蛋白)，6-8为250mmol/L浓度咪唑的洗脱液(含目的蛋白)。

图4针对SSU98 1094特异抗体的比较。病人和健康人的抗体水平比较(A)，猪感染前后的抗体水平比较(B)。ELISA实验用于评价针对SSU98_1094特异的抗体反应，硫氧还蛋白(Trx)用作阴性对照。

具体实施方式

实施例一猪链球菌2型表面蛋白SSU98_1094的表达纯化及抗体制备

1.材料和方法

1.1菌株和质粒

猪链球菌2型98HAH12株[Chen C，Tang J，Dong W，Wang C，Feng Y，et al(2007)A Glimpse of Streptococcal Toxic Shock Syndrome from ComparativeGenomics of S.suis 2Chinese Isolates.PLoS ONE 2(3)：e315]；大肠杆菌DH5a，BL21，均为国际标准株；表达载体pET32a(+)为Novagen公司产品。

1.2酶和试剂

EcoRI和XhoI等限制性内切酶以及Taq酶、dNTPs、DL15000分子量标准等PCR所用试剂均为宝生物工程(大连)有限公司产品；DNA回收试剂盒为天为公司产品；镍亲和层析柱为GE公司产品；质粒提取盒为V-gene公司产品；弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂为Sigma公司产品；Amp为中诺药业产品。

1.3PCR引物设计及SSU981094核酸序列，蛋白序列

根据所要扩增的片段，设计一对引物，引物两端分别添加EcoRI和XhoI酶切位点和保护性碱基，引物P1和P2可扩增猪链球菌2型SSU981094基因开放阅读框(ORF)全长片断。引物序列分别为：

上游引物P1：5‘-gcgaattcaacaagaaacttgttggactg-3’见序列表中序列3；

下游引物P2：5‘-atctcgagaggtttttcaggaacttctac-3’见序列表中序列4。

核酸序列＞SSU98_1094见序列表中序列2，氨基酸序列＞SSU98_1094见序列表中序列1。

1.4PCR扩增

按下列顺序和条件依次加入各反应物并进行PCR扩增。猪链球菌2型模板DNA 2μL，10×buffer 5μL，2.5mmol/L dNTPs 3μL，引物P1和P2(5μmol/L)各1μL，ddH₂O 37μL，LA-Taq酶(5U/μL)1μL。扩增的条件为：94℃7min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，30个循环；72℃7min。

1.5PCR产物的回收和酶切

PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳，后以DNA回收试剂盒回收目的片段，并以EcoRI和XhoI 37℃酶切3h。

1.6重组质粒的构建和鉴定

在含有100μg/mL Amp的LB肉汤中接种携带pET32a空质粒的DH5α大肠杆菌单菌落，37℃摇振培养12～16h后，1％转接入100μg/mL Amp的新鲜LB肉汤37℃摇振培养6h，以质粒抽提试剂盒抽提质粒。EcoR I和Xho I双酶切后，以DNA回收试剂盒回收酶切产物。将PCR双酶切回收产物与空质粒双酶切回收产物进行连接，并转化感受态的DH5α宿主菌。感受态细菌的制备、转化均按常规方法进行，利用菌落PCR和限制性内切酶酶切进行重组菌的筛选和鉴定。

1.7重组质粒的测序和序列分析

重组质粒的序列测定采用Sanger双脱氧末端终止法，由北京三博远志生物技术有限公司完成，以验证其阅读框架，并以BLAST软件进行同源性分析。

1.8重组质粒在大肠杆菌中的表达和纯化

将重组质粒按常规方法转化感受态的大肠杆菌BL21，利用Amp抗性筛选重组菌，挑单菌落接种LB肉汤中(含100μg/mL Amp)，30℃剧烈摇振培养2～4h，当菌液浓度OD₆₀₀达0.5～0.6时，加IPTG至终浓度1mmol/L，30℃继续剧烈摇振培养2～4h。6000r/min离心10min，沉淀以蒸馏水重悬，加等体积的2×电泳上样缓冲液煮沸10min，SDS-PAGE检测。含空pET32a(+)的大肠杆菌BL21亦同样经IPTG诱导处理后，SDS-PAGE检测表达情况。以超声波破碎诱导的重组菌，收集上清，以GE镍亲和层析柱进行亲和层析，具体步骤按使用说明书进行。

1.9重组蛋白动物免疫试验

将收集的蛋白以pH7.210mmol/L的PBS稀释至0.1mg/ml，加入等量的弗氏完全佐剂，皮下免疫Wistar大鼠(购自军事医学科学院试验动物中心)，0.5ml/只；以后3-5周，分别以0.2，0.4，0.8，1.6mg/ml加弗氏不完全佐剂加强免疫，第7周断尾取血ELISA法测抗体效价。同时设立全菌免疫对照组和空白对照组(pET32a空质粒转化BL21，诱导表达Trx蛋白，以此蛋白免疫大鼠为空白对照)。以硫酸铵沉淀法制备抗血清。

2.结果

2.1PCR结果

PCR产物经电泳后，出现一条1068bp的条带，大小与预期一致。

2.2重组质粒的鉴定

SSU981094基因片段经回收，以EcoR I和Xho I酶切位点定向克隆至pET-32a中，获得重组质粒，命名为SSU98_1094-pET-32a。重组质粒转化感受态的DH5α宿主菌，经Amp抗性筛选得到重组菌。提取重组质粒，经EcoR I和Xho I双酶切，可切出约1000bp左右的片断，说明SSU98_1094片段已成功克隆，见图1。

2.3重组质粒的表达

重组BL21转化菌经IPTG诱导后，菌体SDS-PAGE显示有一条52kD的蛋白带，而含诱导前的菌在该处无特异条带。见图2。经镍柱纯化获得纯化的SSU98_1094蛋白。见图3。

2.4测序结果和序列分析

克隆的序列长度经测序为1068bp，如序列表中序列2所示，翻译后为355个氨基酸残基，见序列表中序列1。

实施例二猪链球菌2型表面蛋白SSU98_1094的免疫原性

及抗体介导的调理吞噬试验

1.材料方法：材料同实施例一。

1.1重组猪链球菌2型表面蛋白SSU98_1094和多抗的制备：见实施例一。

1.2SSU98_1094抗体介导的调理吞噬

血平板刮取猪链球菌2型单菌落，接入THB培养基，37℃，CO₂孵箱培养8h后转接新鲜THB培养基培养8h至对数生长期。取1ml菌液(约1×10⁸CFU/ml)13,000rpm，1.0min集菌，PBS洗菌并重悬，调整至10⁶CFU/ml，涂血平板，记为初始菌量。取50μl(≈10⁶CFU/ml)菌液加入100μl抗体，37℃15min后冰上15min；加入350μl健康人全血37℃，3h；加入55μl 1％saponin，冰上20min；反复吹打后稀释涂血平板，16h后血平板记数单克隆。

2.3小鼠的免疫和攻毒

6周雌性Balb/C小鼠每次用20μg与弗氏佐剂混合的SSU98_1094纯化蛋白皮下免疫，共免疫2次，间隔2周，第1次免疫采用弗氏完全佐剂，第2次采用弗氏不完全佐剂，以同等条件下免疫的硫氧还蛋白(Trx)为对照。第二次免疫一周后攻毒，每只小鼠腹腔接种悬浮于1ml THB培养基(Todd-Hewitt broth)猪链球菌5x10⁸CFU，攻毒后观察7天记录发病率和死亡率。

2.4感染猪与人中SSU98_1094蛋白特异抗体测定

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定病人和感染动物中针对该蛋白的特异抗体，采用健康人的血清和感染前的动物血清作为对照。采用5μg/ml的重组蛋白包被酶联板包被缓冲液为0.05M NaHCO₃(pH9.6)，4℃包被过夜，然后采用3％BSA 37℃封闭3h。病人和健康人血清样品1∶500稀释，感染前后猪血清均1∶200稀释，反应信号通过辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗进行检测。

2.结果

2.1重组蛋白抗体介导的调理吞噬作用

经GE镍亲和层析柱层析获得纯化的重组蛋白SSU98_1094，分别加弗氏完全和不完全佐剂免疫后，制备抗血清，进行间接杀菌试验。杀菌率计算：(CFUrTrx-CFUr98_1094)/CFUrTrx。Trx为从含pET32a(+)空载体的大肠杆菌BL21镍柱纯化的硫氧还蛋白。

抗体介导的调理吞噬试验：分别用SSU98_1094重组蛋白；MRP重组蛋白免疫大鼠后的大鼠血清调理健康人血，进行人全血对猪链球菌2型活菌的杀伤试验。SSU98_1094重组蛋白的抗血清调理人全血对猪链球菌2型的杀伤率为60％左右，但略低于MRP蛋白的抗血清。

2.2重组蛋白对小鼠攻毒的保护作用

接种细菌10个小时后，对照组表现出临床症状，如发烧和对刺激反应缓慢，48小时内对照组死亡率为100％(10/10)，而SSU98_1094重组蛋白免疫组的动物临床症状轻微，持续时间短，死亡率仅为20％(2/10)。48小时后各组小鼠不再死亡。

2.3感染的人和猪血清中SSU98_1094特异抗体检测

本发明检测了6个猪链球菌2型感染的病人和5个健康人血清中SSU98_1094特异抗体的存在状况，结果发现与健康人相比，病人SSU98_1094特异抗体水平明显升高，见图4。我们检测了猪链球菌2型感染猪前后血清中SSU98_1094特异抗体的存在状况，结果发现与感染前相比，感染后血清中SSU98_1094特异抗体水平显著升高，见图4。上述实验结果表明SSU98_1094可作为诊断靶标用于猪链球菌2型感染的血清学诊断。

猪链表面蛋白.SEQ

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所

<120>一种猪链球菌2型表面脂蛋白、其制备方法及用途

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>355

<212>PRT

<213>

<400>1

Met Asn Lys Lys Leu Val Gly Leu Gly Leu Ala Ala Ala Ala Ala Val

1               5                   10                  15

Ser Leu Ala Ala Cys Gly Asn Arg Ala Ser Lys Ser Ser Ser Ser Glu

            20                  25                  30

Ala Ser Ser Ser Ala Asp Thr Ser Val Lys Ala Ala Ile Val Thr Asp

        35                  40                  45

Ile Gly Gly Val Asp Asp Arg Ser Phe Asn Gln Ser Ala Trp Glu Gly

    50                  55                  60

Leu Gln Glu Trp Gly Lys Ala Ala Ser Leu Ser Lys Gly Asn Gly Tyr

65                  70                  75                  80

Asp Tyr Phe Gln Ser Ala Ser Glu Ser Asp Tyr Ile Thr Asn Leu Asp

                85                  90                  95

Ser Ala Val Ala Gly Gly Tyr Asn Leu Val Phe Gly Ile Gly Phe Ala

            100                 105                 110

Leu Glu Ser Ala Ile Ala Glu Val Ala Pro Asn Asn Pro Asn Thr His

        115                 120                 125

Tyr Val Ile Val Asp Ser Val Val Pro Asp Gln Asp Asn Val Val Ser

    130                 135                 140

Val Gly Phe Ala Asp His Glu Ala Ser Tyr Leu Ala Gly Val Ala Ala

145                 150                 155                 160

Ala Lys Ser Thr Lys Thr Asn His Val Gly Phe Ile Gly Gly Met Glu

                165                 170                 175

Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu Ala Gly Phe Val Ala Gly Ala Lys

            180                 185                 190

Ser Val Asn Lys Asp Ile Lys Ile Thr Val Asp Tyr Ala Gly Ser Phe

        195                 200                 205

Gly Asp Ala Ala Lys Gly Gln Thr Leu Ala Ala Ala Gln Tyr Ala Ala

    210                 215                 220

Gly Ala Asp Val Ile Phe His Ala Ser Gly Gly Thr Gly Asn Gly Val

225                 230                 235                 240

Phe Ala Ala Ala Lys Ala Glu Asn Glu Thr Arg Ash Glu Ala Asp Lys

                245                 250                 255

Val Trp Val Ile Gly Val Asp Arg Asp Gln Ser Ala Glu Gly Thr Tyr

            260                 265                 270

Thr Ser Lys Asp Gly Lys Ser Ser Asn Phe Val Leu Ala Ser Thr Leu

        275                 280                 285

Lys Gln Val Gly Thr Ser Val Lys Asp Ile Ala Thr Lys Ala Ala Ala

    290                 295                 300

Gly Asp Phe Pro Gly Gly Gln Val Leu Gln Phe Ser Leu Lys Asp Lys

305                 310                 315                 320

Gly Val Glu Leu Ala Glu Thr Asn Leu Ser Glu Asp Ala Ser Lys Ala

                325                 330                 335

Val Ala Asp Ala Lys Gln Ala Ile Leu Asp Gly Lys Val Glu Val Pro

            340                 345                 350

Glu Lys Pro

        355

<210>2

<211>1068

<212>DNA

<213>

<400>2

atgaacaaga aacttgttgg actgggtcta gcagctgctg cggctgtatc tttggctgca     60

tgtggtaacc gtgcttcaaa aagcagtagc tcagaagcat cttcatcagc ggacacatct    120

gtgaaagctg ctatcgttac tgacattggt ggtgttgatg accgttcatt taaccaatct    180

gcttgggaag gtcttcaaga gtggggtaaa gcagctagtc tttccaaagg taatggctac    240

gattacttcc aatcagctag tgaatcagat tatatcacaa accttgattc agctgttgct    300

ggtggttaca atcttgtgtt cggtattggt tttgccttgg agagtgcgat tgctgaggtt    360

gcaccaaata atcctaatac acactatgta atcgtggata gtgttgttcc agatcaagac    420

aatgtagtta gcgtaggttt cgcagaccat gaagcatcat atcttgctgg tgttgctgca    480

gctaaatcaa ctaaaacaaa tcacgtaggt ttcattggtg gtatggaagg tgttatcatc    540

gatcgctttg aagctggttt cgttgctggt gctaagtctg taaacaaaga catcaagatt    600

acagttgact atgcgggttc atttggtgat gctgctaaag gtcaaactct tgcagctgct     660

caatatgctg caggtgcaga tgttattttc cacgcttctg gtggtactgg taacggtgta     720

tttgcagctg ctaaagcaga aaacgaaact cgtaatgaag cagataaagt ttgggtaatc     780

ggtgttgacc gtgaccaatc agcagaaggt acatacactt ctaaagatgg taaatcttct     840

aactttgtat tggcttcaac attgaaacaa gttggtactt cggttaaaga tattgcaact     900

aaggcagctg caggtgattt ccctggcggt caagtacttc aattctcatt gaaagataaa     960

ggtgttgaat tggcagaaac taatctttca gaagatgctt ctaaagcagt tgcagatgct    1020

aaacaagcaa ttttggatgg caaagtagaa gttcctgaaa aaccttaa                 1068

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>

<400>3

gcgaattcaa caagaaactt gttggactg                                        29

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>

<400>4

atctcgagag gtttttcagg aacttctac                                        29

Claims (2)

1.一种猪链球菌2型表面蛋白在制备猪链球菌2型感染诊断试剂中的应用，其中所述表面蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

2.一种猪链球菌2型表面蛋白在制备猪链球菌2型疫苗中的应用，其中所述表面蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

Images