CN103517917B - 通过添加由nkt细胞识别的表位来调整抗原免疫原性 - Google Patents

通过添加由nkt细胞识别的表位来调整抗原免疫原性 Download PDF

Info

Publication number
CN103517917B
CN103517917B CN201180064048.3A CN201180064048A CN103517917B CN 103517917 B CN103517917 B CN 103517917B CN 201180064048 A CN201180064048 A CN 201180064048A CN 103517917 B CN103517917 B CN 103517917B
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
cell
polypeptide
cd1d
nkt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201180064048.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103517917A (zh
Inventor
圣雷米·吉恩玛丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ikovoli Co ltd
Original Assignee
Yi Munaite LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yi Munaite LLC filed Critical Yi Munaite LLC
Publication of CN103517917A publication Critical patent/CN103517917A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103517917B publication Critical patent/CN103517917B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43531—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from mites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明描述了用于预防和治疗具有细胞内有机体的感染、治疗肿瘤和通过接种预防传染性和变应性疾病的方法和化合物。

Description

通过添加由NKT细胞识别的表位来调整抗原免疫原性
技术领域
本发明涉及具有补充和激活NKT细胞的能力的肽或多肽以及其治疗具有细胞内有机体或肿瘤的感染和通过接种策略预防疾病的用途。
背景技术
由细胞内病原体所致的慢性传染病难以治疗，因为感染细胞降低通常允许免疫系统特异性识别所述感染细胞的许多分子的表面表达。实例是分枝杆菌感染，其中感染细胞抑制主要组织相容性(MHC)复合体的分子的表达，从而阻止通过CD8谱系的T淋巴细胞识别(经由MHCI类识别)和通过CD4谱系的淋巴细胞识别(经由II类MHC识别)。实际上，许多细菌和病毒具有逃避感染细胞识别的复杂方法。
在一定程度上，相同机理允许肿瘤逃避检测。此类肿瘤中的一些至少在炎性状况下表达MHCII类决定簇。最近的实验已经表明，即便当通过例如接种增加了呈现MHC I类的肿瘤衍生肽的CD8识别，对肿瘤生长的总效应仍有限。
在具有细胞内病原体的慢性感染中和在肿瘤中，急切需要制定新的方法，通过该方法，感染细胞或肿瘤细胞分别将被识别和消除。
用于传染病的接种是现行实践。然而，在大量的状况中，因特异性抗体对病原体的优先诱导和没有或极少诱出将识别感染细胞的免疫细胞，接种的功效很有限。因此，通过接种预防病毒和细菌疾病通常功效有限。在至少在某些世界区域内若干疫苗对病毒疾病、例如流感病毒、轮状病毒或甚至脊髓灰质炎病毒的功效中可找到实例。在一些情况下，考虑用于接种的抗原是弱免疫原，并且由于MHC决定簇的巨大差异，从一个受治疗者到另一个受治疗者观察到功效的显著变化。
用于变应性疾病的接种也受到限制，所述限制与变应原的弱免疫原性有关，或者与缺乏风险控制有关，所述风险与向受治疗者施用变应原很容易引起变应性症状有关。
在针对传染剂和针对变应原的接种中，都需要更有效和更安全的方法。
自然杀伤T(NKT)细胞构成识别由非经典MHC络合分子CD1d呈现的抗原的非常规T淋巴细胞的不同谱系。现在描述NKT细胞的两个亚型。1型NKT细胞，也称为不变NKT细胞(iNKT)，是最丰富的。它们的特征在于，存在由不变α链（小鼠中的Vα14和人中的Vα24）构成的α-β T细胞受体(TCR)。该α链与变量相关，但限制β链的数量。2型NKT细胞具有α-β TCR，但携带多态α链。然而，显而易见的是存在NKT细胞其它亚型，其表型仍未完全定义，但其特征为由在CD1d分子的背景下存在的糖脂激活。
NKT细胞一般表达自然杀伤(NK)细胞受体（包括NKG2D和NK1.1）的组合。NKT细胞是先天免疫系统的一部分，其可以区别于适应性免疫系统，实际上它们在得到完全效应子能力之前不需要扩张。NKT细胞的激活导致各种作用。这种细胞释放预形成介体，包括帮助B细胞产生抗体的一大列细胞因子(包括IL-4，IFN-γ，IL-21和IFN- α)，并且有人提出细胞因子的释放也可影响CD4+ T细胞(Burrows等人，Nature Immunology 2009，10:669-671)。在本发明中，提高B细胞激活和主要组织相容性(MHC) II类限制性CD4+ T细胞激活将是有益的。
用于NKT细胞的识别单元（CD1d分子）具有与MHC I类分子极其类似的结构，包括β-2微球蛋白的存在。其特征为毗连两个α链的很深裂隙并且含有接收脂质链的高度疏水的残基。该裂隙在两个末端开放，允许容纳较长链。用于CD1d的规范配位体是合成的α半乳糖酰基鞘氨醇(α GalCer)。然而，已经描述了许多自然替代性配位体，包括糖脂和磷脂，该自然脂质硫脂发现于髓鞘质、微生物磷酸肌醇甘露糖苷和α半乳糖醛酸神经酰胺中。目前的共识(参见综述，诸如Matsuda等人，Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368和Godfrey等人, Nature reviews Immunology 2010, 11:197-206)在于，CD1d仅结合含脂质链的配位体，或通常由被嵌入CD1d中的脂质尾部和从CD1d中伸出的糖类残基首基构成的常见结构。
不认为肽能够通过CD1d的呈现活化NKT细胞。然而，有人提出，含庞大氨基酸残基的长疏水肽可以结合至CD1d (Castano等人，Science 1995, 269:223-226)。使用表达具有未定义的生理相关性的随机序列肽的噬菌体呈现文库进行的观察，允许确立理论共有基序(Castano等人，Science 1995, 269: 223-226并且参见下文)。
实际上，Castano等人表明，活化的细胞是CD8+ T细胞，也就是MHC I类限制细胞，而不是NKT细胞。这些发现教导本领域技术人员不存在疏水肽由CD1d分子呈现的证据。因在常规免疫方案下不能诱出NKT细胞，Castano等人宣称的生理相关性被进一步怀疑(Matsuda等人，Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368 and BrutkiewiczJournal of Immunology 2006, 177: 769-775)。诸如用被转染以过表达CD1d并在体外加载卵清蛋白衍生肽的细胞进行免疫的人工系统能够诱出NKT细胞。同样地，用质粒DNA以及鼠CD1d和共刺激分子进行的真皮内免疫诱发溶细胞CD1d限制的T细胞 (Lee等人，Journalof Experimental Medicine 1998, 187: 433-438)。Castano等人宣称，含由P1位和P7位的芳族残基和P4位的脂族链构成的结构基序的疏水肽含有用于CD1d结合表位的核心基序。如上所述，Castano等人达成的该结论不受数据支持。
我们出乎意料地发现，包括疏水氨基酸序列的肽实际上能够诱出NKT细胞的活化。
另外，由于由帮助诱出B细胞和II类限制性T细胞激活的NKT细胞分泌的大量细胞因子(Burrows等人，Immunology 2009, 10:669-671)并因此产生抗体，NKT细胞的激活提供提高针对传染病和针对变应原的疫苗的效率的一种方式。
如果来自蛋白的表位可以结合至CD1d，则向蛋白添加CD1d结合基序可能提高NKT细胞的激活，这可能导致对抗原呈现细胞杀伤的诱导，这将适合于治疗具有细胞内病原体的感染或治疗肿瘤，或提高抗原的免疫原性，这将适合于传染病或过敏症的接种策略。
具有细胞内病原体的感染的实例包括分枝杆菌感染、细胞内细菌感染、病毒疾病和寄生虫感染。肿瘤的实例是任何表达CD1d的肿瘤。用于接种的抗原的实例是用于流感接种、口服轮状病毒接种或口服脊髓灰质炎病毒接种和变应原接种的病毒蛋白。
更准确地说，当需要提高NKT细胞针对抗原呈现细胞的杀伤活性，或提高由NKT细胞制作的细胞因子的产生并因此提高免疫原性时，CD1d-结合基序的添加将是有用的。
本发明的基础为在肽或多肽的天然序列内产生新的CD1d结合基序、或向此类肽或多肽添加CD1d结合基序以补充和激活NKT细胞。
发明内容
本发明涉及肽或多肽用于在受治疗者中通过提高对携带细胞内病原体的细胞的消除治疗具有此类病原体的感染的用途。
本发明还涉及肽或多肽用于在受治疗者中通过提高肿瘤细胞的识别和杀伤来治疗肿瘤的用途。
本发明还涉及肽或多肽在具有来自传染剂或变应原的抗原的受治疗者中用于接种目的的用途。
我们意外地观察到肽可以通过CD1d分子呈现并且激活NKT细胞。此类细胞的激活导致针对呈现结合至CD1d的肽的细胞获得溶细胞性并释放细胞因子。
本发明在一个方面涉及来源于细胞内病原体的至少一种分离的免疫原性肽或多肽用作用于在受治疗者中治疗具有所述细胞内病原体的感染的药物的用途，所述至少一种分离的免疫原性肽或多肽通过在所述肽或多肽的天然序列中产生至少一个CD1d结合基序，或通过向所述肽或多肽添加至少一个CD1d结合基序而被修饰。
本发明还在一个方面涉及来源于肿瘤的至少一种分离的免疫原性肽或多肽用作用于在受治疗者中治疗所述肿瘤的药物的用途，所述至少一种分离的免疫原性肽或多肽通过在所述肽或多肽的天然序列中产生至少一个新的CD1d结合基序，或通过向所述肽或多肽添加至少一个CD1d结合基序而被修饰。
本发明还在一个方面涉及来源于细胞外传染剂的至少一种分离的免疫原性肽或多肽用作用于在受治疗者中预防所述感染的药物的用途，所述至少一种分离的免疫原性肽或多肽通过在所述肽或多肽的天然序列中产生至少一个新的CD1d结合基序，或通过向所述肽或多肽添加至少一个CD1d结合基序而被修饰。
本发明还在一个方面涉及来源于变应原的至少一种分离的免疫原性肽或多肽用作用于在受治疗者中预防变应性反应的药物的用途，所述至少一种分离的免疫原性肽或多肽通过在所述肽或多肽的天然序列中产生至少一个新的CD1d结合基序，或通过向所述肽或多肽添加至少一个CD1d结合基序而被修饰。
本领域技术人员应该明确的是，在上文所列指示的任一项中，当通过由抗原呈现细胞表达的CD1d分子呈现时，CD1d结合基序的产生暗示所述基序通过NKT细胞识别并激活所述NKT细胞。
在另一方面，本发明还涵盖来源于细胞内病原体、肿瘤、传染剂或变应原的至少一种分离的肽或多肽用作用于在受治疗者中激活溶细胞活性和在所述受治疗者中激活通过CD4+ NKT细胞进行细胞因子产生的药物的用途，所述至少一种分离的肽或多肽通过在所述肽或多肽的天然序列中产生至少一个新的CD1d结合基序、或通过向所述肽或多肽添加至少一个CD1d结合基序以补充并激活NKT细胞而被修饰。
在上述用途的任一项中，来源于细胞内病原体的所述肽或多肽可以是来源于具有细胞内生命周期的病毒、细菌、分枝杆菌或寄生虫的任何肽或多肽。病毒包括ssDNA、dsDNA和RNA病毒，例如疱疹病毒，黄病毒和小核糖核酸病毒，流感、麻疹和免疫缺陷病毒，细菌和分枝杆菌包括结核分枝杆菌，对人或动物致病的其它分枝杆菌，耶尔森菌(Yersiniosis)，布鲁氏菌(Brucella)，衣原体(Chlamydiae)，支原体(Mycoplasma)，立克次体(Rickettsiae)，沙门氏菌(Salmonellae)和志贺氏杆菌(Shigellae)。寄生虫包括原形体(Plasmodiums)、利什曼原虫(Leishmanias)、锥虫(Trypanosomas)、鼠弓形体(Toxoplasmagondii)、李斯特菌(Listeria)、组织浆菌(Histoplasma)。
在上述用途的任一项中，来源于肿瘤的所述肽或多肽可以是来源于以下的任何肽或多肽：(1) 致癌基因，例如在某些黑素瘤中鉴别的MAGE；(2) 原致癌基因，例如，在诸如肾脏或甲状旁腺的软组织癌上以及在多发性骨髓瘤中表达的细胞周期蛋白D1；(3) 病毒衍生蛋白，例如来自某些癌和某些霍奇金型淋巴瘤中的EB病毒的那些；(4) 存活因子，其是抗细胞凋亡因子，例如存活素(survivin)或bcl2；(5) 克隆型决定簇，例如来源于小囊淋巴瘤或多发性骨髓瘤中B细胞受体的个体基因型决定簇或T细胞恶性肿瘤中的T细胞受体决定簇。
在上述用途的任一项中，所述肽或多肽来源于传染剂，所述传染剂包括病毒、细菌和寄生虫。
在上述用途的任一项中，来源于变应原的所述肽或多肽可以是来源于以下的任何肽或多肽：
-食物变应原，其存在于花生，鱼如鳕鱼，卵白，甲壳纲如虾，乳如牛奶，小麦，谷物，蔷薇科的果实(苹果、李子、草莓)，百合科、十字花科、茄科和伞形科的植物，木本坚果，芝麻，花生，大豆和其它豆科变应原，香料甜瓜，鳄梨，芒果，无花果，香蕉等等。
-房尘螨变应原，得自尘螨(Dermatophagoides spp)或房尘螨(D.pteronyssinus)、粉尘螨(D. farinae)和微角尘螨(D. microceras)、宇尘螨(Euroglyphus maynei)或热带螨(Blomia sp.)，
-来自蟑螂或膜翅目中存在的昆虫的变应原，
-来自花粉的变应原，尤其是树、草和杂草的花粉，
-来自动物的变应原，特别是猫、狗、马和啮齿动物，
-来自真菌的变应原，尤其来自曲霉属、链格孢属或分子孢子菌属，和
-诸如胶乳或淀粉酶的产物中存在的职业性变应原。
本发明还涵盖分离的病毒载体，其特征为它们包含来源于细胞内病原体、肿瘤、传染剂或变应原的至少一种肽或多肽，其中在所述肽或多肽的天然序列内产生至少一个新CD1d结合基序，或其中添加至少一个CD1d结合基序。
定义
术语"肽"在本文中使用时是指包含由肽键连接的2至200个氨基酸的氨基酸序列，但其在具体实施方案中可以包含非氨基酸结构(如连接性有机化合物)。本发明的肽可以含有任何常规的20个氨基酸或它们的修饰物，或可以含有通过化学肽合成或化学或酶修饰掺入的非天然氨基酸。术语“多肽”当在本文中使用时是指通常较长的肽或蛋白质。
术语"表位"当在本文中使用时是指蛋白质的一个或若干个部分(其可以限定构象表位)，其由抗体或其一部分(Fab'、Fab2'等)或B或T细胞淋巴细胞的细胞表面上呈现的受体特异性识别和结合，并且其能够通过所述结合而诱发免疫应答。
术语"抗原"当在本文中使用时是指包含一个或多个半抗原和/或包含一个或多个T细胞表位的大分子的结构。一般而言，所述大分子是蛋白质或肽(具有或没有多糖)或由蛋白成分构成并且包含一个或多个表位；所述大分子在本文可替换地称为"抗原性蛋白质"或“抗原性肽”。
术语”变应原”是指抗原的特定亚型，特征为其在易感染个体中诱出IgE同种型的抗体的能力。
在本发明的背景下术语"T细胞表位"或"T-细胞表位"是指优势、次优势或次要T细胞表位，即，被T淋巴细胞的细胞表面上的受体特异性识别并且结合的抗原性蛋白质的一部分。表位是否为优势、亚优势或次要，取决于针对表位诱出的免疫反应。优势取决于蛋白质的所有可能T细胞表位中，这种表位被T细胞识别并且能够激活所述T细胞的频率。特别地，T细胞表位是由MHC I类或MHC II类分子结合的表位。
术语“NKT细胞表位”是指被T淋巴细胞的细胞表面上的受体特异性识别并且结合的抗原性蛋白质的一部分。特别地，NKT细胞表位是由CD1d分子结合的表位。
术语“CD4+效应子细胞”是指属于T-细胞的CD4-阳性亚型的细胞，其功能为向其它细胞例如B-细胞提供协助。这些效应子细胞通常作为Th细胞(T协助细胞)报告，具有不同的亚型，例如Th0、Th1、Th2和Th17细胞。
术语“NKT细胞”是指先天性免疫系统的细胞，其特征为实际上它们携带诸如NK1.1和NKG2D的受体，并且识别由CD1d分子呈现的表位。在本发明的背景下，NKT细胞可以属于1型(不变)或2型亚型。
“CD1d分子”是指由3 α链和β链的一个逆平行组构成的非MHC衍生分子，所述β链被布置到在两侧开放的深疏水凹槽中，所述非MHC衍生分子能够向NKT细胞呈现脂质、糖脂或疏水肽。
术语“CD1d结合基序”是指对应于一般氨基酸基序[FW]-XX-[ILMV]-XX-[FW]的氨基酸序列，其中F代表苯丙氨酸，W代表色氨酸，I代表异亮氨酸，L代表亮氨酸，M代表蛋氨酸和V代表缬氨酸。X代表任何氨基酸。在一些情况下，位置7中的[FW]被T (苏氨酸)或H (组胺酸)替换。
术语“假定CD1d结合基序”当在本文中使用时是指对应于一般氨基酸基序[FWHY]-X2X3-[ILMV]或[ILMV]-X2X3-[FWHY]的氨基酸序列，其中Y代表酪氨酸。在一些情况下，假定基序可以是 [FWHY]-X2-[ILMV]或[ILMV]-X2-[FWHY]或[FWHY]-X2X3X4-[ILMV]或[ILMV]-X2X3X4-[FWHY]。
术语"免疫紊乱"或"免疫疾病"是指这样的疾病，其中免疫系统的反应对有机体中功能失常或非生理性情况负责或者维持所述功能失常或非生理性情况。在本发明的背景下，免疫紊乱是指由传染剂和肿瘤监视诱发的病理学。
术语“受治疗者”是指哺乳动物，包括灵长类和非灵长类。
本发明详述
本发明提供这样的方法，其用于在受治疗者中抑制或消除具有细胞内病原体的感染或肿瘤，或提高抗原如用于接种策略的某些传染剂和变应原的免疫原性。
特别地，本发明提供提高CD4+ NKT细胞的扩张和官能性活动的方法。这种细胞通常分类为两种不同的亚型，也就是针对携带不变TCR α链(小鼠中Vα14，人中Vα24)的1型，或用不同的α链谱呈现的2型NKT细胞。然而，近来有证据提出不适合1型或2型种类的NKT细胞的替代性亚型。本发明的目的为包括这些非常规NKT细胞，前提是它们携带CD4共同受体。在结合于CD1d的抗原呈现之后，NKT细胞被迅速激活，获得溶细胞性，并且分泌被认为是影响来自先天性和适应性免疫系统的其它细胞的决定簇的许多细胞因子。
在本发明的背景下，我们意外地观察到，肽可能由CD1d分子呈现，并且可以激活识别CD1d与肽之间制得的复合体的NKT细胞。CD1d分子的特征在于，其由形成裂缝的两个逆平行α链构成，所述α链位于由两个逆平行β链构成的平台的顶上。该裂隙狭窄且很深，并且仅接受疏水的残基，经典地认为仅接受脂质。
该裂隙可以容纳7个氨基酸的序列，所述序列的特征为在(P)1和7位置中的疏水残基，和在P4中的脂族残基。P1是专性疏水残基，诸如F、W、H或Y。然而，P7是允许的，并且可以含有替代性残基，前提是它们是非极性的。P4中残基优选脂族，但这是任选的。CD1d结合基序的一般序列因此是 [FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]。然而，本领域技术人员应该清楚的是，该基序是对称的，并且P7可以被看作P1，而P1可以被看作P7。此处作为一般指示提供CD1d结合基序的一般序列，而无任何限制意图。本发明的肽和多肽是根据其通过呈现到CD1d分子中而激活NKT细胞的能力来定义。
许多肽或多肽未天然地携带CD1d结合基序。然而，本发明还涵盖已在其天然序列中携带至少一个CD1d基序的肽或多肽，因为发现增加所述基序的数量以提高对具有细胞内病原体的感染或肿瘤细胞的抑制，或提高来自传染剂或来自变应原的抗原的免疫原性可能是有利的。
本发明涉及肽或多肽的产生，所述肽或多肽通过在所述肽或多肽的天然序列内产生至少一个新的CD1d结合基序，或通过向所述肽或多肽添加至少一个CD1d结合基序而被修饰，无论它们实际上已携带此类基序。
在另一方面，本发明还涵盖至少一种分离的疏水肽或多肽用于在受治疗者中提高对感染细胞内病原体的细胞或肿瘤细胞的消除，或用于在所述受治疗者中提高接种用传染性抗原或变应原的免疫原性的用途，所述至少一种分离的疏水肽或多肽包含由一般[FW]-X2X3-[ILMV]- X5X6-[FWTHY]序列基序代表的至少一个CD1d结合基序。
在另一方面，本发明还涵盖至少一种分离的肽或多肽用于在受治疗者中激活NKT细胞的用途，其中由[FW]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]序列代表的至少一个CD1d结合基序已经在所述肽或多肽的天然序列内产生，或者已经被加入所述天然序列中。
在另一方面，本发明还涵盖至少一种分离的疏水肽或多肽用作用于在受治疗者中抑制具有细胞内病原体的感染或者肿瘤细胞，或提高来自传染剂或来自接种用的变应原的抗原的功效的药物的用途，所述至少一种分离的疏水肽或多肽包含由[FW]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]序列代表的至少一个新的CD1d结合基序。
本发明的另一优点在于在肽或多肽中添加芳族氨基酸残基的产生CD1d结合基序，这在所述基序可以结合至所有或绝大多数受治疗者的CD1d分子的意义上是杂乱的。这是由于实际上CD1d分子本身存在十分有限程度的多态性。另外，NKT细胞抗原性受体的多态性非常受限，对于本领域技术人员应该显而易见的是，相同芳族氨基酸添加适用于考虑用于本发明应用的所有受治疗者。
这与结合至主要组织相容性II类分子的肽或多肽基序呈鲜明对比，其中可以描绘含有合适序列的大量的肽。这是由于施加于MHCII类结合肽和II类分子大多态性的极小约束。
作为本发明的目的的肽和多肽如下获得：
(1) 任选地，评价肽或多肽激活NKT细胞的能力。这是通过用表达CD1d分子的细胞系培育所述肽或多肽来进行。这种细胞系的实例是本领域已知的(例如JAWS2细胞)。在优选实施方案中，该细胞系不呈现MHC II类分子，并且用含有CD1d的DNA序列的病毒载体或本领域已知的在细胞中引入基因的任何其它方法将其转导用于CD1d的超表达。用于细胞转导的方法是本领域已知的。将该细胞系加载于具有肽或多肽的培养物中。随后，通过测量NKT细胞的激活，评价CD1d分子对肽或多肽的有效呈现。可以从周围血液中（通过例如磁力分选）获得这种细胞并且在细胞因子例如IL-2和IL-15或IL-7存在下维持于具有刺激剂如α-gal-神经酰胺的培养物中。这些方法本领域中有描述 (参见例如 Brutkiewicz Journal ofImmunology 2006, 177: 769-775)。使用诸如细胞因子产生的评价之类方法，评估NKT细胞的激活。选择不显示或仅显示有限NKT细胞激活的肽或多肽。
(2) 随后，针对对应于[FWHY]- X2X3-[ILMV]或ILMV]-X2X3-[FWHY]序列(假定CD1d结合基序)的存在，使用本领域熟知的算法如http://expasy.org/tools/scanprosite/，评价肽或多肽氨基酸序列。
更具体来说，所述算法允许在对应于[FWHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6 -[FWHY]序列的一种或多种7氨基酸长序列的肽或多肽内预测，并因此具有嵌入CD1d分子的裂隙的可能性。更具体来说，所述算法允许对应于[FW]- X2X3-[ILMV]或[ILMV]- X2X3-[FW]的氨基酸序列的预测。
(3) 通过所述算法鉴别的氨基酸的序列被检验，并通过氨基酸取代修饰以增加结合至CD1d的可能性。这主要地包括：当所需时，由疏水的残基诸如F、W、H或Y取代P1位中的氨基酸和/或由F、W、T、H或Y取代P7位中的氨基酸。
(4) 任选地，鉴别假定CD1d结合基序，其对应于[FWHY]-X2-[ILMV]或[ILMV]-X2-[FWHY]、或[FWHY]-X2X3X4-[ILMV]或[ILMV]-X2X3X4-[FWHY]。在此类情况下，X3的添加或X4的删除分别被发现有利于重构CD1d结合基序，所述CD1d结合基序包含P4位中的脂族氨基酸残基。更一般地，假定CD1d结合基序可能对应于通式[FWHY]-R-[ILMV]或[ILMV]-R-[FWHY]，其中R代表氨基酸或氨基酸序列。
(5) 任选地，在序列的羧基端或氨基端中，或在肽或多肽天然序列内任何位置，可将CD1d基序加入肽或多肽的氨基酸序列中。
(6) 任选地，本发明的肽或多肽可以通过产生至少一个CD1d基序和通过添加至少一个CD1d结合基序来修饰。
(7) 任选地，使用如(1)中所述的表达CD1d分子的细胞系，体外测试包括含有CD1d结合基序的序列的合成肽。
(8) 任选地，使用CD1d分子的四聚物检测对这种肽具有特异性的NKT细胞，体外测试通过如上所述取代、添加或删除氨基酸而修饰的肽或多肽结合至CD1d的能力。一种可能性是使用荧光标记的四聚物并且用荧光激活的细胞分选系统(facs)检测。
本领域技术人员应该清楚的是，氨基酸残基的取代或添加、或CD1d结合基序的添加可以使用非生理性氨基酸残基诸如D-氨基酸或有机化合物来进行。
随后，用本领域已知用于产生重组蛋白质的方法，使用表达系统如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞来产生含有氨基酸取代、添加或删除的肽或多肽。
根据本发明，设想出用于治疗由细胞内病原体所致疾病的药物。所述细胞内病原体的实例包括ssDNA、dsDNA和RNA病毒、细菌和分枝杆菌和寄生虫。
还设想出用于治疗肿瘤的药物。
此外，还设想出用于针对具有主要细胞外生命周期的传染剂和针对变应原的接种策略的药物。
应当理解的是，在本发明的背景下设想的任何肽或多肽可以用于转基因的基因形式施用，所述施用通过使用本领域技术人员已知的病毒载体或其它方法进行。在这种情况下，可能发现有利的是通过添加CD1d结合基序来改变病毒载体本身的氨基酸序列，从而增加转基因的表达。
在优选实施方案中，肽可以由包含[FW]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]序列的CD1d结合基序构成。在更优选实施方案中，所述肽还在氨基端或羧基端、或所述肽的两端含有氨基酸侧翼残基。在优选实施方案中，所述肽在侧翼残基中含有庞大氨基酸残基。在又一个实施方案中，所述肽携带至少一个II类限制性T细胞表位。在又一个实施方案中，所述肽含有氨基酸侧翼残基，所述氨基酸侧翼残基是衍生出所述肽的天然序列的一部分。
尽管不是必需，本发明的药物通常是(药物)制剂，其包含作为活性成分的至少一种本发明的肽或多肽或能够表达所述肽或多肽的基因治疗性载体。除所述活性成分以外，这种制剂将包含至少一种(药学上可接受的)稀释剂。
一般说来，本发明的肽或多肽的施用提高先天性免疫系统的激活，更特别是提高NKT细胞的激活，更特别是提高与NKT细胞激活相关的细胞因子的产生，更特别是提高NKT细胞的溶细胞性。
本发明的肽或多肽的施用途径可以根据指示和/或肽或多肽的性质变化。实例是用于传染病和用于变应原或用于肿瘤的疫苗的皮下或肌肉内注射，或者用于具有细胞内病原体的感染的口服、鼻内或气管内施用。本发明旨在涵盖所有其它可能的施用途径，例如鼻内、舌下、经皮、肌肉内、直肠内或阴道内。
如进一步详细解释的，本发明的肽或多肽可以通过化学合成制备，所述制备允许非天然氨基酸的掺入。
本发明的另一方面涉及获得包含能够激活NKT细胞的人工序列的肽或多肽的方法，所述方法包含以下步骤：
(a) 鉴别不扩增、激活或者仅有限扩增、激活NKT细胞的肽或多肽；
(b) 通过氨基酸添加、取代和/或删除来引入至少一个CD1d结合基序。
这种方法包括鉴别可以通过氨基酸取代、添加或删除被修饰以携带CD1d结合基序的表位。用于假定NKT细胞表位的计算机模拟的鉴别的方法是本领域熟知的，并且某些方面在后文详细说明。
举例而言，当鉴别到所述假定NKT细胞表位时，产生包含所述序列的合成肽。还合成替代性肽，其包括判断为适合提高氨基酸序列结合至CD1d的能力的氨基酸取代、添加或删除。针对结合CD1d四聚物的能力和/或通过加载表达CD1d的抗原呈现细胞而激活NKT细胞的能力，测试包含天然序列的肽和具有氨基酸取代、添加、删除或这些的组合的肽。
举例而言，获得可溶CD1d分子，并且通过合成和/或化学偶合制备四聚体。通过亲合色谱法纯化该CD1d分子。用根据对所述CD1d分子的强烈结合亲和力产生的生物素标记的参考肽，培育可溶CD1d分子。随后在不同浓度下培育待评估肽以用于CD1d结合，并且通过添加亲和素来计算其替代其CD1d结合位点的参考肽的能力。在例如Texier等人(2000) J.Immunology 164, 3177-3184中可见用于通过主要组织相容性II类分子呈现肽的方法，但该方法可以容易地应用于CD1d限制性T细胞表位。
任选地，可以通过用NKT细胞培育和荧光激活的细胞分选(facs)分析，评价本发明的肽对CD1d四聚物的结合。这些方法在本领域中有充分描述
或者，用本发明的肽或多肽来加载表达CD1d但不表达主要组织相容性II类复合体的诸如JAWS2细胞的抗原呈现细胞，并且通过由掺入氚化胸苷来评估的NKT细胞的增殖来评价所述抗原呈现细胞激活NKT细胞的能力。这些方法是本领域技术人员熟知的。本发明的肽或多肽具有大于或等于2的平均NKT细胞刺激指数。NKT细胞刺激指数大于或等于2的肽被认为可用作进行本发明的候选者。
经鉴别适于本发明的氨基酸取代、所述氨基酸的添加或删除随后被引入用于实践本发明的全长肽或多肽中。
可以通过在例如细菌细胞(例如大肠杆菌(Escherichia coli))，酵母细胞(例如毕赤酵母(Pichia)物种，汉逊酵母(Hansenula)物种，酿酒酵母(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种)，昆虫细胞(例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda )或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))，植物细胞或哺乳动物细胞(例如，CHO、COS细胞)中重组表达产生本发明的肽或多肽。同时，因此所需的合适表达载体的结构(包括进一步信息，例如启动子和终止序列)涉及标准重组DNA技术。例如，经由接近肽或多肽的N-和/或C-末端插入的酶切位点的酶切，随后适当纯化，本发明的重组产生的肽或多肽可以来源于较大前体蛋白。
考虑到本发明某些肽或多肽的有限长度，它们可以通过化学肽合成法制备，其中肽是通过不同氨基酸彼此偶合来制备。化学合成特别适于对例如D-氨基酸、具有非天然侧链的氨基酸或具有修饰侧链的天然氨基酸例如甲基化半胱氨酸的夹杂。化学肽合成法已被充分描述，并且肽可以订购自诸如Applied Biosystems公司和其它公司。可以按固相肽合成法(SPPS)或者与液相肽合成法相反，进行肽合成。最熟知的SPPS方法是技术人员熟知的t-Boc和Fmoc固相化学法。另外，按Kent最初描述(Schnolzer & Kent (1992) Int. J.Pept. Protein Res. 40, 180-193)和例如在Tam等人(2001) Biopolymers60, 194-205中总结，可以使用连接策略(两个未保护肽片段的化学选择偶合)将肽彼此连接以形成较长肽。这提供实现超过SPPS范围的蛋白合成的可能性。尺寸为100至300个残基的许多蛋白已经成功通过该方法合成。
测验所关注的肽或多肽的物理和化学性质(例如可溶性、稳定性)以确定该肽是否适用于/是否将适用于治疗性组合物。一般地，所述性质通过调整肽的序列来优化。任选地，该肽可以在合成之后使用本领域已知技术修饰(化学修饰，例如添加/删除官能团)。
基因修饰的肽或多肽的产生依赖于本领域技术人员众所周知的方法，包括克隆、定点诱变和生长。
本发明还涉及编码本发明的肽或多肽的核苷酸序列，和它们例如用于重组表达或基因疗法的方法。特别地，所述核苷酸序列能够表达本发明的肽。
在基因疗法中，编码本发明的肽或多肽的重组核苷酸分子可以用作裸露DNA，或用于递送至靶标细胞的脂质体或其它脂质系统中。用于将质粒DNA直接转移到细胞中的其它方法是本领域技术人员熟知用于人基因疗法中的，并且涉及通过将该质粒DNA复合至蛋白而使DNA靶向细胞上的受体。在其最简单的形式中，可以通过显微注射的方法，简单地将微量DNA注射到细胞的核中，进行基因转移。一旦重组基因被引入细胞中，则可以通过转录和翻译的细胞正常机制将其识别，并且基因产物将被表达。也已经尝试了将DNA引入大量细胞中的其它方法。这些方法包括：转染，其中由磷酸钙沉淀DNA并且通过胞饮作用进入细胞；电穿孔，其中细胞暴露于大电压脉冲以在膜中开孔；脂质体转染/脂质体融合，其中DNA被包装到与靶标细胞融合的亲脂性囊泡中；和粒子轰击，其使用结合至小轰击粒子的DNA。将DNA引入细胞中的另一方法是将DNA偶合至化学修饰的蛋白。腺病毒蛋白能够使核内体不稳定并且增强细胞中DNA的摄取。将腺病毒混合至含有DNA复合物的溶液，或使用蛋白交联剂将DNA结合至与腺病毒共价连接的聚赖氨酸，显著提高重组基因的摄取和表达。腺相关病毒载体也可用于对血管细胞的基因传递。如本文中所用，"基因转移"意思是将外来核苷酸分子引入细胞中的方法，通常进行该方法以允许由该基因编码的特定产物表达。所述产物可以包括蛋白、多肽、反义DNA或RNA、或酶活性的RNA。可以在培养细胞中或由直接施用到哺乳动物中，进行基因转移。在另一实施方案中，提供包含编码本发明的肽的核苷酸分子序列的载体。在具体实施方案中，产生该载体以使得核苷酸分子序列仅在特定组织中表达。实现组织特异性基因表达的方法是本领域熟知的，例如，将编码本发明的免疫原性肽的序列置于启动子的控制下，所述启动子指导肽在一个或多个组织或器官中的特异性表达。来源于病毒诸如逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、RNA病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可以用于将编码本发明的肽、其同系物或衍生物的核苷酸序列(例如cDNA)递送到靶向组织或细胞群中。本领域技术人员熟知的方法可用于构造含有这种编码序列的重组病毒载体。或者，含有本发明的肽或多肽的核苷酸分子代码的工程细胞可以用于基因疗法中。
虽然不是必需，本发明的药物通常是(药物)制剂，其包含作为活性成分的至少一种本发明的肽，多肽，能够表达所述肽或多肽的基因治疗性载体。除所述活性成分以外，这种制剂将包含至少一种(药学上可接受的)稀释剂。一般地，药用可接受的化合物可以见于例如药典手册(例如美国、欧洲或国际药典)。本发明的药物或药物组合物通常包含(预防或治疗)有效量的活性成分，其中有效是相对于待预防或治疗的病况或病症。
作为包含多次施用所述药物或组合物的预防性或治疗性方案的一部分，本发明的药物或药物组合物可能需要施用至有需要的受治疗者。所述多次施用通常顺序地发生，并且两次施用之间的时间间隔可以变化并将针对活性成分的性质和待预防或治疗的病况的性质进行调整。给予需要单独施用的受治疗者的活性成分的量也可变化，并且将取决于诸如受治疗者的物理状态(例如重量和年龄)，待预防或治疗的病况的状态，和主治医生、医师或护士的经验之类因素。
术语“稀释剂”是指例如生理盐水溶液。术语"药学上可接受的载体"意思是用于配制活性成分以便例如通过溶解、分散或扩散所述组合物来促进其对待治疗部位的应用或传播，和/或促进其存贮、运输或处理而不削弱其有效性的任何材料或物质。它们包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂(例如苯酚、山梨酸、氯丁醇)、等渗剂(例如糖类或氯化钠)等等。可以包括其它成分，以便控制组合物中活性成分的作用持续时间。药学上可接受的载体可以是固体或液体或经压缩形成液体的气体，即，本发明的组合物可以适当地用作浓缩物，乳液，溶液，颗粒，粉剂，喷雾剂，气溶胶，悬浮体，软膏，霜剂，片剂，小球或粉末。供所述药物组合物和其制剂使用的合适药用载剂是本领域技术人员熟知的，并且在本发明内对其选择不存在特别限制。它们也可包括添加剂，例如润湿剂、分散剂、粘着剂、粘合剂、乳化剂、溶剂、涂层、抗细菌和抗真菌剂(例如苯酚、山梨酸、氯丁醇)、等渗剂(例如糖类或氯化钠)等等，前提是它们符合药用实践，即，不对哺乳动物产生永久伤害的载体和添加剂。本发明药物组合物可以任何已知方式制备，例如将所述活性成分与所选载体材料和在适当情况下的其它添加剂如表面活性剂一起单步或多步地均匀混合、涂布和/或研磨。它们也可微分化制备，例如以便获得通常直径为约1至10µm的微球体形式，即制造用于受控或持续释放所述活性成分的微胶囊。
本发明的肽或多肽、其同系物或衍生物(和其生理上可接受的盐或药物组合物，均包括在术语"活性成分"中)可以通过适合待预防或治疗的病况并适合所述化合物（此处待施用的肽或多肽）的任何路径来施用。可能的路径包括区域，全身，口服(固态或吸入)，直肠，鼻内，局部(包括眼，颊和舌下)，阴道和肠道外(包括皮下，肌肉内，静脉内的，真皮内，动脉内，鞘内和硬膜外)。优选的施用途径可以随例如接受者的状况或待预防或治疗的病况而变化。
该制剂可以方便地以单位剂型中呈现，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。适于口服施用的本发明制剂可以作为离散单元呈现，例如均含有预定量的活性成分的胶囊、扁胶囊或片剂；作为粉末或颗粒呈现；作为水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮体呈现；或作为水包油液体乳液或油包水液体乳液呈现。活性成分也可作为大丸剂、药糖剂或糊剂呈现。片剂可以通过压缩或模制来制备，并且任选地具有一个或多个辅助成分。通过在合适机器中将活性成分压缩成自由流动形式如粉末或颗粒，并任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性或或分散剂混合，可以制备压缩片剂。通过在合适机器中，模塑由惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物，可以制作模制片剂。片剂可以任选地被涂布或刻痕，并且可以经配制而提供其中活性成分的缓释或受控释放。
现在将通过以下实施例说明本发明，无任何限制意图地提供所述实施例。此外，本文所述的所有参考资料明确地以引用方式包括在本文中。
实施例
实施例1. 分枝杆菌
结核分枝杆菌导致每年数以千计的死亡。唯一可用的接种（Calmette-Guérin分枝杆菌牛基疫苗(BCG)）无效。用于改善接种的一个候选者是结核分枝杆菌产生的6 kDa早期分泌抗原靶标(ESA-6)，其为人和动物如小鼠都识别的一种主要抗原。
使用电脑算法分析ESA-6的序列(SEQ ID1)以鉴别对应于[FW]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]序列的CD1d结合基序。未发现这种基序。通过标准诱变法分别在14位和20位中引入A至F和G至F的突变，这产生对激活NKT细胞敏感的CD1d结合基序(突变ESA-6; SEQ ID2)。
用ESA-6 (SEQ ID1)或SEQ ID NO:2的突变ESA-6以及辅剂如明矾，使C57Bl/6小鼠免疫。以十四天间隔，进行50µg所述肽的四次注射。在最后免疫两周之后，处死小鼠，并且从脾脏通过密度梯度离心和抗体涂层磁珠上选择的组合，制备CD4+ T淋巴细胞。
随后，使用JAWS2细胞，如加载有SEQ ID2的突变ESA-6的抗原呈现细胞，体外激活和扩增CD4+ T细胞。JAWS2细胞不表达主要组织相容性II类决定簇，从而阻止II类限制性CD4+ T细胞的激活，但JAWS2细胞表达CD1d并且因此可以用于鉴定肽激活NKT细胞的能力。经观察，仅得自用突变ESA-6 (SEQ ID2)免疫的小鼠的NKT细胞被加载的JAWS2细胞激活，而来自用ESA-6 (SEQ ID1)免疫的小鼠的NKT细胞未被激活。
为评价被SEQ ID2的突变ESA-6激活的CD4+ NKT细胞的溶细胞性，在用NKT细胞培育18小时之后，针对细胞凋亡的诱导，分析JAWS2细胞。这样，通过添加荧光标记的膜联蛋白V，检测结合至凋亡细胞的表面的膜联蛋白V。结果表明，用得自用突变ESA-6 (SEQ ID2)免疫的小鼠的NKT细胞培育的JAWS2细胞被诱发出细胞凋亡。
这些结果因此表明，产生CD1d结合基序的单一氨基酸取代足以诱出NKT细胞的激活和抗原呈现细胞的细胞凋亡。
实施例2. EG7肿瘤
EG7肿瘤细胞(H-2b)来源于用含卵清蛋白(ova)的构造转导的胸腺瘤。CD1d限制性ova表位是由这种细胞呈现，但这已知不足以触发NKT激活和肿瘤细胞杀伤(Castano等人，Science 1995, 269: 223-226)。
使用电脑算法进行搜索，以鉴别可能通过氨基酸取代改变而产生新CD1d结合基序的替代性表位。在16位至22位(FKELKVH)和181位至187位(FKGLWEK)，鉴别出两个序列。在ova序列中，H22和K187被突变为F，从而产生SEQ ID4的蛋白。
间隔10天，4次单独地皮下施用明矾中的50µg ova，用SEQ ID4的ova使小鼠免疫。用天然序列(SEQ ID3)的ova使对照组免疫。所有小鼠随后被注射在侧面中的106个EG7肿瘤细胞移植，并且肿瘤接着随时间生长。用SEQ ID4的ova预免疫的小鼠排斥该肿瘤，而用天然SEQ ID3的ova预免疫的对照小鼠则不排斥。
使用从脾脏利用磁珠分选制备的NKT细胞，评价EG7细胞的体外杀伤。首先，用加载有SEQ ID4的ova的抗原呈现细胞在体外刺激NKT细胞4小时。用1µM DiOC18的膜水平(来自Invitrogen的3,3’-二(十八烷基)氧代羰花青高氯酸盐)标记EG7细胞。随后，利用1/1到1/5的比率(EG7细胞比NKT细胞)，在得自2个小鼠组的每个组的NKT细胞存在下，在37℃下培养EG7细胞(每孔1x105) 18小时。18小时之后，收获细胞，并且遵循制造商说明书(ApoptosisDetection kit; BD Biosciences)针对膜联蛋白V和7-AAD着色并且在FACSCantoII流式细胞仪(BD Biosciences)上分析。结果表明，用得自用SEQ ID4的ova免疫的小鼠的NKT细胞培育的EG7细胞被诱发出细胞凋亡，而得自用SEQ ID3的ova免疫的对照小鼠的NKT细胞未诱发出显著程度的肿瘤细胞凋亡。
实施例3. 流感
流感病毒血凝素是用于接种目的的主要抗原。然而，接种的功效受到血凝素的相对弱的免疫原性的限制。
血凝素的序列(SEQ ID5)含有3个序列，所述3个序列适于突变以获得编码[FW]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]格式的CD1d结合基序的氨基酸序列。获得血凝素的cDNA，并且通过标准诱变法将3个突变引入以将CD1d结合基序的7位中的氨基酸替换为F (苯丙氨酸)。这些突变对应于V314F、A348F和K459F，其中将314位、348位和459位的缬氨酸、丙氨酸和赖氨酸分别突变为苯丙氨酸。通过重组技术产生SEQ ID6的突变血凝素。
通过皮下路径，以1周的间隔，用SEQ ID5或SEQ ID6的血凝素，使小鼠4次免疫。在最后免疫七天之后，处死小鼠，并且从脾脏利用磁珠分选制备CD4+ T细胞。通过在室温下培育18小时，使JAWS2细胞加载有SEQ ID6的突变血凝素。随后洗涤所述细胞，并且在得自用SEQ ID5的血凝素或SEQ ID6的血凝素免疫的小鼠的CD4+ T细胞存在下，培育所述JAWS2细胞。经观察，当得自用SEQ ID6的血凝素免疫的小鼠时，显著比例的NKT细胞被激活，而当得自用SEQ ID5的血凝素免疫的小鼠时则不是如此，这证明用SEQ ID6的血凝素免疫已经在体内诱发NKT细胞的扩增。
此外，将SEQ ID6的突变血凝素用于接种。经观察，用SEQ ID6的血凝素免疫的小鼠产生更高浓度的血凝素特异性抗体。
实施例4. 变应原
用于变应性疾病的接种目前受到变应原的相对弱的免疫原性的限制。可能获得变应原-特异性IgG抗体的增加的产生的方法是非常需要的。
Der p 2是来自房尘螨（D. pteronyssinus）的主要变应原，其与全世界的变应性鼻炎和哮喘相关。利用电脑算法在Der p 2的序列内进行搜索未鉴别出携带CD1d结合基序的序列。在Der p 2的序列的羧基端添加由7个氨基酸(FAALAAF)构成的基序。这种序列编码对应于序列[FW]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]的CD1d结合基序。应注意，由主要组织相容性II类复合体呈现的主要T细胞表位已知位于成熟Der p 2分子的24位至35位。
使用明矾中的50µg蛋白，以10天的间隔，皮下注射4次，用天然Der p 2 (SEQ ID7)或其中已经添加CD1d结合基序的天然Der p 2 (SEQ ID8)，使C57Bl/6小鼠(H-2b)的两个组免疫。小鼠随后放血，并且通过直接结合ELISA，测试特异性抗Der p 2抗体的浓度。经观察，在用SEQ ID8的Der p 2免疫的小鼠组中的抗体浓度高10倍。
此外，利用磁珠分选，从来自2个组的每个小鼠的脾脏，制备CD4+ T细胞。用从同系CD1d KO小鼠制备的树状细胞培养这种细胞(106细胞/孔)。这种细胞仅可激活II类限制性CD4+ T细胞。经观察，得自用SEQ ID8的Der p 2免疫的小鼠的细胞以比得自用天然Der p 2(SEQ ID7)免疫的小鼠的细胞高4倍的刺激指数增殖。
因此推断出，CD1d结合基序的存在增加特异性抗体的产生和II类限制性CD4+ T细胞的增殖。
应当理解的是，本文提供的实施例并非详尽无遗，并且在本发明范围之内想象出含有各种数量的氨基酸取代或删除以产生新CD1d结合基序或含有各种数量的添加CD1d结合基序的蛋白或肽的组合。

Claims (10)

1.一种获得包含能够激活NKT细胞的人工序列的肽或者多肽的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)鉴别不激活NKT细胞的肽或者多肽；
(b)在所述肽和多肽的自然序列内通过氨基酸添加、取代和/或删除来引入至少一个的CD1d-限制性NKT细胞抗原，所述CD1d-限制性NKT细胞抗原是[FWHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWHY]，其中X2,X3,X5,X6代表了任意一种氨基酸；
(c)测试从步骤(b)获得的肽或者多肽的对NKT细胞的刺激活动的能力，并与具有自然序列的NKT细胞刺激活动的肽或者多肽进行比较。
2.根据权利要求1所述的方法，其中不激活NKT细胞的所述肽或者多肽包含选自[FWHY]-R-[ILMV]和/或[ILMV]-R-[FWHY]的至少一个假定的CD1d-限制性NKT细胞抗原，其中R代表氨基酸或者氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一个假定的CD1d-限制性NKT细胞抗原选自[FWHY]-X2X3-[ILMV],[ILMV]-X2X3-[FWHY],[FWHY]-X2X3X4-[ILMV],[ILMV]-X2X3X4-[FWHY],[FWHY]-X2-[ILMV],[ILMV]-X2-[FWHY]氨基酸序列或者它们的任何组合，其中X2,X3,X4代表任何一种氨基酸。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述假定CD1d-限制性NKT细胞抗原来自细胞内病原体、肿瘤相关抗原、来自传染剂或者变应原的抗原，其中所述的细胞内病原体是具有细胞内生命周期的病毒、细菌、分枝杆菌或寄生虫。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的细胞内病原体是：ssDNA病毒、dsDNA病毒、RNA病毒、结核分枝杆菌、耶尔森菌、布鲁氏菌、衣原体、支原体、立克次体、沙门氏菌和致贺氏杆菌、原形体、利什曼原虫、锥虫、鼠弓形体、李斯特菌、组织浆菌。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原是致癌基因、原致癌基因、病毒衍生蛋白、存活因子或克隆型决定簇。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述变应原是空气传播的变应原、接触性变应原、全身性变应原或食物变应原。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽或多肽进一步包含至少一个II类 限制性T细胞表位。
9.据权利要求1所述的方法，所述肽或多肽进一步包含在CD1d-限制性NKT细胞抗原的侧翼序列内的至少一个II类限制性T细胞表位。
10.根据权利要求1到7任一项所得到的肽或者多肽用于制造治疗药物的方法，所述治疗药物用于哺乳动物中激活NKT细胞。
CN201180064048.3A 2010-11-25 2011-11-24 通过添加由nkt细胞识别的表位来调整抗原免疫原性 Active CN103517917B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10192564 2010-11-25
BE10192564.2 2010-11-25
PCT/EP2011/070907 WO2012069572A1 (en) 2010-11-25 2011-11-24 Modulation of antigen immunogenicity by addition of epitopes recognized by nkt cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103517917A CN103517917A (zh) 2014-01-15
CN103517917B true CN103517917B (zh) 2016-10-12

Family

ID=43827717

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180064048.3A Active CN103517917B (zh) 2010-11-25 2011-11-24 通过添加由nkt细胞识别的表位来调整抗原免疫原性

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11236127B2 (zh)
EP (1) EP2643346B1 (zh)
JP (1) JP2014501726A (zh)
CN (1) CN103517917B (zh)
AU (1) AU2011333753B2 (zh)
BR (1) BR112013013044A2 (zh)
CA (1) CA2818536C (zh)
DK (1) DK2643346T3 (zh)
ES (1) ES2689141T3 (zh)
RU (1) RU2603075C2 (zh)
WO (1) WO2012069572A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201319160D0 (en) * 2013-10-30 2013-12-11 Imcyse Sa Methods for induction of antigen-specific regulatory t cells
CN104031126B (zh) * 2014-06-27 2016-10-12 顾玉奎 一种自然杀伤t细胞活化剂多肽及其应用
CN104031125B (zh) * 2014-06-27 2016-10-05 顾玉奎 自然杀伤t细胞活化剂多肽及其应用
KR20240015731A (ko) * 2016-04-19 2024-02-05 임시스 에스에이 신규 면역원성 CD1d 결합 펩티드
EP3388447A1 (en) * 2017-04-14 2018-10-17 Imnate Sarl Methods to produce peptides, polypeptides or cells for modulating immunity
EP3936867A1 (en) 2020-07-06 2022-01-12 Imnate Sarl Cd1 peptide-epitope for use in the treatment of a disease caused by an intracellular pathogen

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101031307A (zh) * 2004-11-02 2007-09-05 小利兰斯坦福大学托管委员会 抑制nkt细胞的方法
WO2010037402A1 (en) * 2008-10-02 2010-04-08 Dako Denmark A/S Molecular vaccines for infectious disease
WO2010037395A2 (en) * 2008-10-01 2010-04-08 Dako Denmark A/S Mhc multimers in cancer vaccines and immune monitoring

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020193330A1 (en) * 2000-09-08 2002-12-19 David Hone Genetically engineered co-expression DNA vaccines, construction methods and uses thereof
GB0605247D0 (en) * 2006-03-15 2006-04-26 Chiron Srl Compositions and methods for immunisation
WO2010065544A2 (en) 2008-12-01 2010-06-10 The Johns Hopkins University Diagnostic and treatment methods for cancer based on immune inhibitors

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101031307A (zh) * 2004-11-02 2007-09-05 小利兰斯坦福大学托管委员会 抑制nkt细胞的方法
WO2010037395A2 (en) * 2008-10-01 2010-04-08 Dako Denmark A/S Mhc multimers in cancer vaccines and immune monitoring
WO2010037402A1 (en) * 2008-10-02 2010-04-08 Dako Denmark A/S Molecular vaccines for infectious disease

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Peptide Binding and Presentation by Mouse CD1;Castano A.R.等;《Science》;19990714;第269卷(第5221期);第223-226页 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2011333753A1 (en) 2013-06-13
AU2011333753B2 (en) 2016-06-30
WO2012069572A1 (en) 2012-05-31
JP2014501726A (ja) 2014-01-23
CA2818536A1 (en) 2012-05-31
RU2013128744A (ru) 2014-12-27
US20220259262A1 (en) 2022-08-18
EP2643346B1 (en) 2018-08-29
DK2643346T3 (en) 2018-10-29
RU2603075C2 (ru) 2016-11-20
CN103517917A (zh) 2014-01-15
CA2818536C (en) 2020-04-28
ES2689141T3 (es) 2018-11-08
US20130302375A1 (en) 2013-11-14
BR112013013044A2 (pt) 2016-09-13
US11236127B2 (en) 2022-02-01
EP2643346A1 (en) 2013-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103517917B (zh) 通过添加由nkt细胞识别的表位来调整抗原免疫原性
Almazán et al. Control of tick infestations in cattle vaccinated with bacterial membranes containing surface-exposed tick protective antigens
CN109069605B (zh) 新免疫原性CD1d结合肽
CN104220080B (zh) 用于加强cd4+t细胞应答的经修饰表位
US20210355162A1 (en) Modulation of antigen immunogenicity by deleting epitopes recognized by nkt cells
Min et al. Enhancement of protective immune responses induced by Toxoplasma gondii dense granule antigen 7 (GRA7) against toxoplasmosis in mice using a prime-boost vaccination strategy
CN105142653B (zh) 增强对肠病原体免疫应答的组合物和方法
Gu et al. A multiple antigen peptide vaccine containing CD4+ T cell epitopes enhances humoral immunity against Trichinella spiralis infection in mice
JPH04500066A (ja) ポリペプチドの百日咳トキシンのワクチン
Smith et al. Group B meningococcal outer membrane protein vaccine promote potent anti-viral effect
Piraine et al. Journal of Vaccines & Vaccination
Carroll Babesia microti Recombinant DNA Vaccine as a Model for Babesia bovis Prevention

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240131

Address after: 6 Ch a teau S e claitlon Street, Novo Leuven, Belgium

Patentee after: Ikovoli Co.,Ltd.

Country or region after: Belgium

Address before: L-8041 Rome Street Strassen, Belgium

Patentee before: IMNATE S.A.R.L.

Country or region before: Belgium