CN104031125B

CN104031125B - 自然杀伤t细胞活化剂多肽及其应用

Info

Publication number: CN104031125B
Application number: CN201410295808.7A
Authority: CN
Inventors: 吴本春; 邵明亮; 沙洁; 杨培珂
Original assignee: 顾玉奎
Current assignee: Shenzhen Kuang Yi Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2014-06-27
Filing date: 2014-06-27
Publication date: 2016-10-05
Anticipated expiration: 2034-06-27
Also published as: CN104031125A

Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及具有活化自然杀伤T细胞，抑制基质金属蛋白酶‑2、具有减轻急性炎症反应对机体破坏的多肽。其序列为RQQQEATRPRTAAANGLMQT是全新的序列，可以在体外抑制基质金属蛋白酶‑2的活力，并在体内试验中增加内毒素休克小鼠的生存率，具有潜在的新药开发价值。

Description

自然杀伤T细胞活化剂多肽及其应用

技术领域

本发明涉及自然杀伤T细胞活化剂及其应用，具体涉及具有活化自然杀伤T细胞，治疗急性淋巴细胞性白血病的多肽。

背景技术

急性淋巴细胞性白血病（ALL）是一种进行性恶性疾病，其特征为大量的类似于淋巴母细胞的未成熟白细胞。这些细胞可在血液、骨髓、淋巴结、脾脏和其它器官中发现。急性淋巴细胞性白血病占儿童急性白血病的80%，发病率高峰在3岁至7岁之间。ALL也可发生于成年人，占所有成年人白血病的20%。近年来随着医学研究的深入，对急性淋巴细胞性白血病的认识和治疗取得了很大进展。生物靶向治疗肿瘤是非常有前景的，靶向治疗是阻断肿瘤发生的某个过程，达到治疗肿瘤的目的。

自然杀伤T（natural killer T cells, NKT）细胞是一种具有特定标志的T细胞亚群，既表达T 细胞表面标志，如CD3、TCRaß（人类表达Va24 Vß11，小鼠表达Va14 Ja18），又表达NK 细胞的表面标志。NKT 细胞只能识别由CD1d 分子递呈的特异性糖脂类分子，而不是由主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）递呈的多肽。NKT 细胞活化后可迅速分泌一系列的细胞坏死相关因子，如穿孔素和TNF-α，增强其杀伤肿瘤细胞的作用；还可通过激活其他具有杀伤活性的效应细胞，如NK 细胞和CD8＋细胞，发挥抗肿瘤作用。

因此，活化自然杀伤T细胞，抑制急性淋巴细胞性白血病发展，是治疗急性淋巴细胞性白血病的新靶点。但是，尚未有开发成熟的自然杀伤T细胞活化剂多肽的治疗急性淋巴细胞性白血病的药物。

本专利中的自然杀伤T细胞活化剂多肽已证明在急性淋巴细胞性白血病中有效，具有在其他肿瘤模型中开发的前景。

发明内容

发明目的

本发明提供全新的序列，该序列自然杀伤T细胞活化剂，对急性淋巴细胞白血病具有很好的疗效。

技术方案

自然杀伤T细胞活化剂，其特征在于其序列为RQQQEATRPRTAAANGLMQT。

自然杀伤T细胞活化剂在制备治疗急性淋巴细胞白血病药物中的应用。

有益效果

利用固相合成法化学合成自然杀伤T细胞活化剂，该多肽具有全新的序列，该多肽可体外活化自然杀伤T细胞，治疗急性淋巴细胞白血病。可以在体外抑制基质金属蛋白酶-2的活力，并在体内试验中增加内毒素休克小鼠的生存率，具有潜在的新药开发价值。同时也对乳腺癌有效。

具体实施方式

本发明涉及多肽有吉尔生化（上海）合成。

实施例1

多肽的化学合成方法

多肽用Fmoc化学方法合成。合成反应从C端向N端进行，Rink介质（可在AdvancedChemTech公司购得）上有自由氨基，顺序连接氨基酸。每一步连接过程中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU，HOBt，DIEA和Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑（4:1:0.5）的混合物来封闭未连接的自由氨基，封闭反应10 min。每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基酸连接之前，都要把介质上的Fmoc-基团去掉，去Fmoc-基团使用含20%哌啶的二甲基甲酰胺，需15分钟。最后，当所有氨基酸残基顺序连接之后，多肽用98%三氟乙酸从介质上切割下来，切割在室温下进行2小时。

应用上述化学条件可合成并获得多肽，序列为RQQQEATRPRTAAANGLMQT，该序列为全新序列。

实施例2

自然杀伤T细胞活化剂体外基质金属蛋白酶-2的IC50值。

基质金属蛋白酶-2的活力是通过切割荧光产生底物Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys(Dnp)-NH₂来检测 (激发波长=320 nm, 发射波长=405 nm)。反应在37°C下100 µl反应体系中进行。反应开始时向反应体系中加4 µl自然杀伤T细胞活化剂2存储液 (1 ng/µl)底物的终浓度为10 µM。计算IC50值为2.05 µM。

实施例3

用内毒素休克模型检测自然杀伤T细胞活化剂的体内活力

在建立内毒素休克模型之前，我们首先测定了LPS（E. coli 0111：B4，sigma公司购买）小白鼠的LD50为50 µg每只小鼠，在实验中我们采用了100 µg每只小鼠，这样，对照组的小鼠可全部死亡。在我们前面的科研工作中，发现Regasepin2（另外一条多肽抑制剂，已公开）可提高C57BL/6小鼠在内毒素休克过程中的生存率。为了在我们的小白鼠上建立内毒素休克模型，我们用Regasepin2做了一个阳性对照实验。对照组小鼠注射100 µg LPS，而Regasepin2实验组的小鼠在注射LPS 5分钟之后，每只小鼠再注射0.7 mg的多肽。通过制作Kaplan-Meier生存曲线发现Regasepin2可有效的保护注射了100 µg的小鼠，提高了生存率。成功地在小白鼠上建立内毒素休克模型之后，用该模型检测自然杀伤T细胞活化剂2的体内活力。对照组小鼠（12只）注射100 µg LPS，而自然杀伤T细胞活化剂2组小鼠（12只）在注射LPS 5 min后，每只小鼠注射0.7 mg自然杀伤T细胞活化剂2。用Kaplan-Meier生存曲线分析，自然杀伤T细胞活化剂2可有效地保护小白鼠，提高内毒素休克小鼠的生存率。

实施例4

自然杀伤T细胞活化剂多肽对人宫颈癌HeLa裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验

取对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞株，在无菌条件下制备成5×10⁷/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm³后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试多肽的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；多肽高中低组分别以20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。

表1.多肽对人宫颈癌HeLa裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

多肽对人宫颈癌HeLa裸鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，多肽20mg/kg组对人宫颈癌HeLa移植瘤的生长有极显著性的抑制作用，多肽10mg/kg组对人宫颈癌HeLa移植瘤的生长有显著性的抑制作用。与阳性对照组紫杉醇相比，多肽对实验动物的体重没有明显影响，未见明显的毒副反应。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州普罗达生物科技有限公司

<120> 自然杀伤T细胞活化剂多肽及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Arg Gln Gln Gln Glu Ala Thr Arg Pro Arg Thr Ala Ala Ala Asn Gly

1 5 10 15

Leu Met Gln Thr

20

Claims

1.一种多肽，其特征在于其序列为RQQQEATRPRTAAANGLMQT。

2.一种药物组合物，其特征在于其包含如权利要求1所述多肽与一种以上药学上可接受的填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、或稳定剂。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物为注射剂。

4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于有效剂量为10mg/kg。

5.如权利要求1所述的一种多肽在制备治疗急性淋巴细胞性白血病药物中的应用。