CN103386124B - 一种鸡球虫多价重组蛋白亚单位疫苗及其应用 - Google Patents
一种鸡球虫多价重组蛋白亚单位疫苗及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103386124B CN103386124B CN201310273603.4A CN201310273603A CN103386124B CN 103386124 B CN103386124 B CN 103386124B CN 201310273603 A CN201310273603 A CN 201310273603A CN 103386124 B CN103386124 B CN 103386124B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chicken
- recombinant protein
- vaccine
- coccidia
- eimeria
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 title claims abstract description 70
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 48
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 22
- 208000003495 Coccidiosis Diseases 0.000 title claims abstract description 17
- 206010023076 Isosporiasis Diseases 0.000 title claims abstract description 17
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 241000224483 Coccidia Species 0.000 abstract description 26
- 241000223934 Eimeria maxima Species 0.000 abstract description 16
- 241000223931 Eimeria acervulina Species 0.000 abstract description 15
- 241000499563 Eimeria necatrix Species 0.000 abstract description 15
- 241000223932 Eimeria tenella Species 0.000 abstract description 15
- 230000004224 protection Effects 0.000 abstract description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 4
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 abstract description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 62
- 210000003250 oocyst Anatomy 0.000 description 25
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 23
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 15
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 13
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 13
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 13
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 11
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 230000003903 intestinal lesions Effects 0.000 description 8
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 7
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 235000021053 average weight gain Nutrition 0.000 description 6
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 241000519995 Stachys sylvatica Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 4
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 230000001165 anti-coccidial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001502050 Acis Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 1
- 241000223203 Coccidioides Species 0.000 description 1
- 206010013554 Diverticulum Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 244000203593 Piper nigrum Species 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 208000027954 Poultry disease Diseases 0.000 description 1
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 208000037063 Thinness Diseases 0.000 description 1
- 241000212749 Zesius chrysomallus Species 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 235000013614 black pepper Nutrition 0.000 description 1
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003224 coccidiostatic agent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003640 drug residue Substances 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000003821 menstrual periods Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 206010034754 petechiae Diseases 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 229940126583 recombinant protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013077 scoring method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 206010048828 underweight Diseases 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及生物兽药技术领域，涉及一种鸡球虫多价重组蛋白亚单位疫苗。该疫苗包含4种鸡球虫的重组蛋白成分：TA4（E.tenella）、NA4（E.necatrix）、LDH（E.acervulina）和Em8（E.maxima），经动物免疫保护性实验证实，该疫苗能够有效抵抗4种鸡球虫感染，可在制备预防鸡球虫病的药物制剂中应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物兽药技术领域，涉及一种鸡球虫多价重组蛋白亚单位疫苗。
背景技术
鸡球虫病是一种严重危害养鸡业生产发展的寄生原虫病，每年因此而导致的经济损失高达20亿英镑以上。随着鸡球虫抗药性和药物残留问题的日趋严重，人们期待用更理想的方法代替抗球虫药的使用。然而球虫活疫苗的成功研制和应用提供了一种可代替药物控制鸡球虫病的技术手段，但却存在成本高、难保存、易散毒及具致病威胁等缺点，其中最大的缺点是易散毒，对鸡群具有致病性，严重限制了鸡球虫活疫苗的应用。因此随着分子生物学和现代生物技术的发展，重组亚单位疫苗以其独特的优势显示出在未来畜禽疫病控制中的诱人前景，该疫苗只含有病原体的一种或几种产生保护性免疫应答所必需的免疫原蛋白成分，在鸡体内不能在体内复制，不会散毒，对鸡没有致病性，用这些疫苗接种动物，都可使之在获得抗性同时而免受球虫感染，克服了传统活疫苗易散毒、具有致病性等缺点。
国内外一些学者已经构建了一些鸡球虫重组亚单位疫苗，如但大多只具有单一的抗原成分，关于鸡球虫多价重组蛋白亚单位疫苗的研究未见报道。能够感染鸡的球虫公认的有7种，危害较大的有4种，分别是柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、巨型艾美耳球虫（E.maxima）和堆型艾美耳球虫（E.acervulina），在临床上，这4种球虫多为混合感染，给养鸡业带来了巨大的危害。因此，研制能够同时抵抗4种球虫混合感染的多价重组蛋白亚单位疫苗显得尤为重要。
本实验室分别用E.tenella抗原基因TA4、E.necatrix抗原基因NA4、E.maxima抗原基因Em8和E.acervulina抗原基因LDH构建了4种球虫的单价DNA疫苗，动物免疫保护试验结果发现用所述抗原基因构建的重组表达质粒能够为鸡提供针对上述4种鸡球虫的有效免疫保护。但是相应的原核表达的重组蛋白是否也能提供有效的免疫保护却是未知的，需要用大量的实验来摸索验证的。因为DNA疫苗免疫不同于原核表达重组蛋白免疫，DNA疫苗免疫是抗原基因在机体进行真核表达，表达的蛋白更有可能形成正确的结构，具备糖基化、乙酰化等修饰，更可能具有天然功能，其在体内诱导免疫反应的过程，接近于自然感染的过程，既能够诱导体液免疫反应，又能够诱导细胞免疫反应。原核表达重组蛋白免疫是用体外原核表达的的重组蛋白进行免疫，重组蛋白缺乏糖基化、乙酰化等修饰，能否能提供有效的免疫保护需要大量的实验来验证。重组蛋白疫苗不能在体内复制，对宿主没有致病风险，而且易于在体外大量表达，具有很好的运用前景。本发明将E.tenella的重组蛋白pET28b(+)-TA4，E.necatrix的重组蛋白pET28a(+)-NA4，E.acervulina的重组蛋白pET28a(+)-LDH和E.maxima的重组蛋白pET32a(+)-Em8等质量混合进行动物保护试验，检测其对临床上危害最为严重的4种球虫的抵抗力，以期为该疫苗在临床上的应用提供参考。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够预防多种鸡球虫混合感染的多价重组蛋白亚单位疫苗。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种鸡艾美耳球虫多价重组蛋白亚单位疫苗，该疫苗包含4种鸡球虫重组蛋白：TA4（E.tenella），NA4（E.necatrix），LDH（E.acervulina）和Em8（E.maxima），所述的4种重组蛋白TA4、NA4、LDH和Em8依次具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4所示的氨基酸序列。
本发明所述的鸡艾美耳球虫多价重组蛋白亚单位疫苗，优选由上述4种鸡球虫重组蛋白成分按照1:1:1:1的质量比例混合而成。
本发明所述的鸡艾美耳球虫多价重组蛋白亚单位疫苗在制备预防鸡球虫病的药物制剂中的应用。
生产本发明鸡球虫多价重组蛋白亚单位疫苗的方法，简而言之，其技术路线如下：
1.4种鸡球虫重组亚单位疫苗的重组蛋白的表达及纯化：将E.tenella重组质粒pET-TA4（李祥瑞.用于预防鸡球虫病的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号：ZL200510124048.4），E.necatrix重组质粒pET28a-NA4（李祥瑞等.预防鸡毒害艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号：ZL200810155080.2），E.acervulina重组质粒pET28a-LDH（李祥瑞等.预防鸡堆型艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号：ZL200810155079.X）和E.maxima重组质粒pET32a(+)-Em8（雷晨昱.鸡巨型艾美耳球虫抗原EmTFP250的免疫原性研究.南京农业大学硕士学位论文，2008）分别进行表达，将表达出来的重组蛋白TA4、NA4、LDH和Em8分别经His蛋白纯化柱纯化后，将这4种重组蛋白等质量比混合，配制成为鸡球虫多价重组蛋白亚单位疫苗。
2.重组亚单位疫苗的免疫保护性检测。
本发明具有以下优点和效果：
1.该疫苗是重组蛋白亚单位疫苗，只含有鸡球虫产生保护性免疫应答所必需的免疫原性蛋白，在鸡体内不能在体内复制，不会散毒，对鸡没有致病性，用这些疫苗接种动物，都可使之在获得抗性同时而免受球虫感染，克服了传统活疫苗易散毒、具有致病性等缺点。
2.本发明为多价疫苗，包含临床上常见的、危害最为严重的4种球虫的抗原蛋白，能够抵抗多种球虫的混合感染。
附图说明
图1该疫苗所含4种重组蛋白纯化后SDS-PAGE分析结果。
M：蛋白质分子量标准；1：TA4纯化重组蛋白；2：NA4纯化重组蛋白；3：LDH纯化重组蛋白；4：Em8纯化重组蛋白
具体实施方式
基础材料：
1．孢子化卵囊：江苏株柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，每3个月经鸡体复壮并孢子化，孢子化率在80％以上（索勋,李国清.鸡球虫病学[M].北京:中国农业大学出版社,1998.）。
2．实验动物：0龄的小公雏，购自南京汤泉鸡场，自出壳至实验结束时饲养在严格消毒，无球虫的环境中，自由采食和饮水。
3.菌种：
转化了重组质粒E.tenella pET28b(+)-TA4（李祥瑞.用于预防鸡球虫病的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号：ZL200510124048.4），E.necatrix pET28a(+)-NA4（李祥瑞等.预防鸡毒害艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号：ZL200810155080.2），E.acervulina pET28a(+)-LDH（李祥瑞等.预防鸡堆型艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号：ZL200810155079.X）和E.maximapET32a(+)-Em8（雷晨昱.鸡巨型艾美耳球虫抗原EmTFP250的免疫原性研究.南京农业大学硕士学位论文，2008）的E.coli BL21菌株。
4.工具酶与试剂：蛋白分子量Marker购自Fermentas公司；HIS融合蛋白纯化试剂盒（美国GE公司）、聚丙烯酰胺、N,N′-亚甲双丙烯酰、考马斯亮蓝购自上海化学试剂分装厂；其余试剂为国产分析纯。
5.主要仪器设备：冷冻台式离心机（Eppendorf centrifuge5417R）；紫外可见分光光度计（Bio-Rad）；空气浴摇床（THZ，江苏太仓市实验设备厂）；紫外分析仪（WD-9304C型，北京市六一仪器厂）；电泳仪（DYY-11B，北京市六一仪器厂）。
实施例1.鸡球虫TA4、NA4、LDH和Em8重组蛋白的表达纯化
1.E.maximaEm8基因原核表达质粒的构建
分别用BamH I、Not I双酶切pMD18-T-Em8（雷晨昱.鸡巨型艾美耳球虫抗原EmTFP250的免疫原性研究.南京农业大学硕士学位论文，2008）和pET32a(+)质粒，胶回收试剂盒回收目的基因和pET32a(+)大片段，连接构建pET32a(+)-Em8重组质粒。
2.基因工程菌制备
分别将E.tenella重组质粒pET28-TA4（李祥瑞.用于预防鸡球虫病的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号：ZL200510124048.4），E.necatrix重组质粒pET28a-NA4（李祥瑞等.预防鸡毒害艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号：ZL200810155080.2），E.acervulina重组质粒pET28a-LDH（李祥瑞等.预防鸡堆型艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号：ZL200810155079.X）和E.maxima重组质粒pMD18-T-Em8（李祥瑞等.预防鸡巨型艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号：ZL200810234982.5）转化E.coliBL21感受态细胞，得到分别含有pET28-TA4、pET28a-NA4、pET28a-LDH、pET32a(+)-Em8重组质粒的细菌。
3.鸡球虫TA4、NA4、LDH和Em8重组蛋白的表达纯化
分别将含有pET28-TA4、pET28a-NA4、pET28a-LDH、pET32a(+)-Em8重组质粒的细菌按1:10体积比例接种于LB液体培养基，37℃,200r/min培养至OD600值0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达。按照GE公司蛋白纯化试剂盒说明书对TA4、NA4、LDH和Em8重组蛋白纯化，将收集的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析纯化情况，结果表明，这4种重组蛋白效果良好（图1）。然后将这4种重组蛋白等质量比混合，配制成为鸡球虫多价重组蛋白亚单位疫苗。
实施例2.鸡球虫多价重组蛋白亚单位疫苗的免疫保护性检测
1.实验设计
0日龄雏鸡饲养在严格消毒，无球虫的环境中，自由饮水采食。14日龄实验鸡逐只称重，淘汰体重过重和过轻的个体，随机分组并调整各实验组间的平均体重，使它们接近一致，每组30只。TA4、NA4、LDH和Em84种重组蛋白等比例混合，用该重组蛋白免疫鸡后分别感染E.tenella、E.necatrix、E.acervulina、E.maxima。并设4种球虫的感染非免疫组（红对照组）和共用的非感染非免疫组（白对照组），共9组。
各实验组14日龄腿部肌肉注射混合重组蛋白200μg，21日龄加强免疫，对照组注射PBS0.5mL。28日龄，除白对照组外，其余各组分别经口感染新鲜的E.tenella、E.necatrix、E.acervulina、E.maxima孢子化卵囊5×104个/羽、5×104个/羽、10×104个/羽和10×104个/羽。各组于首免，攻虫和剖杀时逐只称重。攻虫后7天（35日龄）剖杀并逐只进行肠道病变记分和卵囊计数，分组情况见表1。
2．免疫保护效果的观察
2.1增重效果
注射重组蛋白时逐只称重，然后分别在攻虫时和宰杀时逐只称重，观察免疫后至攻虫前、以及攻虫后到宰杀时鸡体重变化情况，然后计算平均增重和相对增重率。
平均增重1=攻虫时重一首免时重
平均增重2=宰杀时重一攻虫时重
增重率（%）=（宰杀时重一攻虫时重）/攻虫时重×100
相对增重率（%）=实验组增重率/非免疫非攻虫组增重率×100
表1多价重组蛋白亚单位疫苗免疫程序
2.2肠道病变记分
攻虫后7天宰杀全部鸡，逐羽观察肠道病变，并按Johnson病变记分方法（索勋，李国清.鸡球虫病学[M].北京：中国农业大学出版社，1998，373-377）进行肠道病变记分。具体记分方法如下：
感染E.tenella后的盲肠病变记分：
0分，无肉眼病变。
＋1分，盲肠壁有少量散在瘀点，肠壁不增厚，内容物正常。
＋2分，病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚，内容物正常。
＋3分，盲肠内有多量血液或有盲肠芯（血凝块或灰白色干酪样的香蕉型块状物），盲肠壁肥厚明显，盲肠中粪便含量少。
＋4分，因充满大量血液或肠芯而盲肠肿大，肠芯中含有粪渣或不含，死亡鸡只也记＋4分。两侧盲肠病变不一致时，以严重的一侧为准。
感染E.necatrix后小肠病变记分：
0分，无肉眼病变。
＋1分，从小肠中部浆膜面看有散在的针尖大小出血点或白色斑点，粘膜损伤不明显。
＋2分，从小肠中部浆膜面看有多量的出血点，也可见到中部肠管稍充气。
＋3分，小肠腔大量出血，浆膜面可见有红色或白色斑点；粘膜面粗糙，增厚，有多量针尖状出血点。肠内容物含量少；充气达小肠下半段，小肠明显变粗但长度明显缩短。
＋4分，小肠因严重出血而呈暗红色、褐色，大部分肠管气胀明显；粘膜增厚加剧，肠腔内充满血液和粘膜组织碎片，从浆膜面看，在感染部位组织见到白色或红色病状，在死亡鸡只病灶为白色和黑色，呈“白盐与黑胡椒”样外观，有些情况，可见到寄生性肉芽肿；肠管增粗一倍，长度缩短一倍。死亡鸡只也记＋4分。
感染E.acervulina后小肠病变记分：
0分，无肉眼可见病变。
＋1分，十二指肠浆膜面有散在白色斑，每平方厘米不超过5处。
＋2分，白色斑增多但不融合，形成白色梯形条纹状外观，3周龄以上的鸡，病变可扩展到十二指肠下20cm，肠壁不增厚，内容物正常。
＋3分，白色病灶增多且融合成片，小肠壁增厚；内容物呈水样，病变蔓延到卵黄囊憩室之后。
＋4分，被感染的肠绒毛缩短融合，十二指肠和小肠粘膜呈灰白色，肠壁高度肥厚，肠内容物呈奶油状。死亡鸡只也计为＋4分。
感染E.maxima后小肠病变记分：
0分，无肉眼可见病变。
＋1分，小肠中段浆膜面隐约可见出血点，肠腔内含有少量桔黄色粘液，肠管形状未见异常。
＋2分，小肠中段浆膜面有多量出血点，肠腔中见有多量桔黄色粘液，肠壁增厚。
＋3分，小肠充气，壁增厚，粘膜面粗糙，小肠内容物含有小血凝块和粘液。
＋4分，小肠充气明显，肠壁高度增厚，肠内容物含有大量血凝块和红褐色血液。死亡鸡只也计＋4分。
病变记分减少率(%)=(感染非免疫组病变记分一实验组病变记分)/感染非免疫组病变记分×100
2.3卵囊计数
按麦克马斯特法计算卵囊，具体为：攻虫后第7天，宰杀全部鸡，逐羽取其肠道，将肠管纵向剖开，用载玻片刮取肠道内容物，混合均匀后称取2g，先加10mL饱和食盐水，搅拌均匀后再加50mL饱和食盐水，混匀后立即取粪液充满两个计数室，静止1-2分钟后，镜检计数两个计数室的卵囊数。计数室容积为1×1×0.15=0.15mL，0.15mL内含肠道内容物2×0.15/(10+50)=0.005g，两个计数室则为0.01g，所得卵囊数乘100即为每克肠道内容物卵囊数(OPG)。
卵囊减少率(%)=(感染非免疫组克卵囊数一实验组克卵囊数)/感染非免疫组克卵囊数×100
2.4抗球虫指数（Anticoccidial Index，ACI）
ACI包括存活率、增重、肠道病变以及卵囊产量等多项指标，综合评定抗球虫药物的效力或疫苗免疫的效果。本研究采用如下ACI计算公式：
ACI=（存活率+相对增重率）一（病变值+卵囊值）
存活率=（实验结束时存活鸡只数/实验组鸡只数）×100%
相对增重率=（实验组增重率/非感染非免疫组增重率）×100%
病变值（0-40）=各实验组的平均病变记分（0-4）×10
卵囊值（0～40）的转化标准如下：E.tenella盲肠内容物卵囊百万数（×106）若小于0.1，卵囊值则计为0，若为0.1～1.0，则计为1，若为1.0～2.0，则计为5，若为2.0～5.0，则计为10，若为5.0～6.0，则计为15，若为6.0～10.0，则计为20，若为10.0～11.0，则计为30，若大于11.0，则计为40；E.necatrix盲肠内容物卵囊十万数（×105）若小于0.1，卵囊值则计为0，若为0.1～1.0，则计为1，若为1.0～2.0，则计为5，若为2.0～5.0，则计为10，若为5.0～6.0，则计为15，若为6.0～10.0，则计为20，若为10.0～11.0，则计为30，若大于11.0，则计为40；E.maxima和E.acervulina肠内容物卵囊值取决于试验组卵囊数占非免疫攻虫组的比例(%)，若此比例(%)为0～1.0，卵囊值则计为0，若为1～25，则计为1，若为1～25，则计为1，若为26～50，则计为10，若为51～75，则计为20，若为76～100，则计为40。
3免疫保护效果分析
根据SPSS软件统计分析结果显示（表2）：首免时各组间体重差异不显著（P>0.05），表明实验分组平均、合理；平均增重1代表疫苗对鸡增重的影响，各实验组鸡体重与对照组间差异不显著（P>0.05），表明该疫苗对增重无负面影响；平均增重2则代表疫苗免疫对鸡的保护作用；该疫苗免疫对鸡感染E.tenella、E.necatrix、E.acervulina和E.maxima的平均增重2均显著高于各自的感染非免疫组的平均增重2（P<0.05），且各实验组之间差异不显著（P>0.05）。说明该疫苗能够缓解鸡在感染4种艾美耳球虫时对体重的负面影响，且保护效果较为平均。疫苗免疫组鸡的OPG和肠道病变记分均明显高于各虫种感染非免疫组，差异显著（P<0.05）；各实验组的卵囊减少率和肠道病变记分减少率也较为平均。说明该疫苗能够不同程度的减少E.tenella、E.necatrix、E.acervulina和E.maxima感染后的卵囊排出量和减轻肠道的病变，对4种鸡球虫均具有不同程度的免疫保护力。该多价重组蛋白亚单位疫苗对E.tenella、E.necatrix、E.acervulina和E.maxima均具有免疫保护作用，其ACI均大于160，分别为174.69、173.10、171.10和177.90。
表2混合蛋白免疫鸡攻4种球虫后的抗球虫指数分析
Claims (2)
1.一种鸡艾美耳球虫多价重组蛋白亚单位疫苗，该疫苗由4种鸡球虫重组蛋白成分组成： 源于E. tenella 的TA4、源于E. necatrix的NA4、源于E. acervulina的LDH和源于E. maxima的Em8；该4种重组蛋白TA4、NA4、LDH和Em8依次为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，所述的4种鸡球虫重组蛋白成分均为原核表达，按照1:1:1:1的质量比例混合。
2.权利要求1所述的鸡艾美耳球虫多价重组蛋白亚单位疫苗在制备预防鸡球虫病的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310273603.4A CN103386124B (zh) | 2013-07-01 | 2013-07-01 | 一种鸡球虫多价重组蛋白亚单位疫苗及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310273603.4A CN103386124B (zh) | 2013-07-01 | 2013-07-01 | 一种鸡球虫多价重组蛋白亚单位疫苗及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103386124A CN103386124A (zh) | 2013-11-13 |
| CN103386124B true CN103386124B (zh) | 2015-02-18 |
Family
ID=49530657
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310273603.4A Active CN103386124B (zh) | 2013-07-01 | 2013-07-01 | 一种鸡球虫多价重组蛋白亚单位疫苗及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103386124B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107019799A (zh) * | 2016-01-30 | 2017-08-08 | 天津赫莱恩特生物科技有限公司 | 一种鸡球虫病四价弱毒活疫苗组合物在生产中的应用 |
| CN106421767B (zh) * | 2016-09-19 | 2019-07-26 | 中国农业大学 | 具备交叉免疫保护力的球虫病疫苗组分及疫苗 |
| CN110559431B (zh) * | 2019-10-11 | 2023-02-28 | 南京农业大学 | 一种巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用 |
| CN113061593B (zh) * | 2021-04-02 | 2023-11-10 | 洛阳华荣生物技术有限公司 | 一种l-苹果酸脱氢酶突变体及其应用 |
| CN113289010A (zh) * | 2021-05-30 | 2021-08-24 | 吉林大学 | 一种鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗及制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101422604A (zh) * | 2008-11-03 | 2009-05-06 | 南京农业大学 | 预防鸡堆型艾美耳球虫的免疫调节型dna疫苗 |
-
2013
- 2013-07-01 CN CN201310273603.4A patent/CN103386124B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101422604A (zh) * | 2008-11-03 | 2009-05-06 | 南京农业大学 | 预防鸡堆型艾美耳球虫的免疫调节型dna疫苗 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 高云路.鸡四种艾美球虫重组蛋白免疫保护性研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》.2014,(第04期),D050-289. * |
| 鸡4种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗交叉免疫保护性研究;徐立新;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20111215(第S1期);摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103386124A (zh) | 2013-11-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103386124B (zh) | 一种鸡球虫多价重组蛋白亚单位疫苗及其应用 | |
| CN104784686B (zh) | Tgev、pedv二联活疫苗及其制备方法 | |
| Zhang et al. | Single-walled carbon nanotubes as delivery vehicles enhance the immunoprotective effect of a DNA vaccine against spring viremia of carp virus in common carp | |
| EP3098301B1 (en) | Swine mycoplasmal pneumonia attenuated live vaccine and use thereof | |
| EP4410843A1 (en) | Recombinant fusion protein derived from hr region of s2 protein of sars-cov-2 and application of recombinant fusion protein | |
| CN104884084A (zh) | 鱼用亚单位浸泡疫苗 | |
| CN101514334A (zh) | 鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株及其应用 | |
| CN113454102A (zh) | 非洲猪瘟疫苗 | |
| LiHua et al. | Evaluation of an outer membrane protein as a vaccine against Edwardsiella anguillarum in Japanese eels (Anguilla japonica) | |
| Gao et al. | Plasmid pcDNA3. 1-s11 constructed based on the S11 segment of grass carp reovirus as DNA vaccine provides immune protection | |
| CN103849632B (zh) | 鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因及其弱毒株和应用 | |
| Chen et al. | Oral immunization with recombinant Lactobacillus casei displayed AHA1-CK6 and VP2 induces protection against infectious pancreatic necrosis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) | |
| CN110559432B (zh) | 一种堆型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
| Cao et al. | An oral double-targeted DNA vaccine induces systemic and intestinal mucosal immune responses and confers high protection against Vibrio mimicus in grass carps | |
| CN111514284A (zh) | 鸡球虫多价重组蛋白疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN110559431B (zh) | 一种巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
| KR101846478B1 (ko) | 재조합 단백질을 포함하는 돼지 마이코플라즈마 감염 예방용 백신 조성물 | |
| Ma et al. | Screening the potential part of the G protein antigen is an achievable strategy to improve the immune effect of DNA vaccine against MSRV infection | |
| CN103352047B (zh) | 旋毛虫肌幼虫es抗原基因疫苗及其制备方法 | |
| CN106834168B (zh) | 一种猪链球菌2型弱毒株及其应用 | |
| CN103028111B (zh) | 一种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位dna疫苗 | |
| CN110891597B (zh) | 防治家禽滑膜霉浆菌感染的组合物 | |
| CN111471107B (zh) | 抗鸡球虫多价重组蛋白卵黄抗体及其制备方法和应用 | |
| CN105497885B (zh) | 一种亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN110846285A (zh) | 伪狂犬病毒基因缺失株、猪伪狂犬病灭活疫苗及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |