CN115261391A - 一种毒害艾美耳球虫sag7抗原亚单位疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

一种毒害艾美耳球虫sag7抗原亚单位疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

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CN115261391A CN202210750516.2A CN202210750516A CN115261391A CN 115261391 A CN115261391 A CN 115261391A CN 202210750516 A CN202210750516 A CN 202210750516A CN 115261391 A CN115261391 A CN 115261391A
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刘园
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Abstract

本发明提供了一种毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗及其制备方法和应用。本发明还提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码毒害艾美耳球虫SAG7蛋白；所述核酸分子包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明以毒害艾美耳球虫SAG7作为抗原制备亚单位疫苗，所述SAG7蛋白具有良好的免疫原性，所述SAG7蛋白亚单位疫苗在抵抗毒害艾美耳球虫卵囊感染方面具有较强的活性。与强毒或减毒活疫苗相比，基因工程亚单位疫苗不仅可以诱导良好的抗体反应，保护禽类抵抗艾美耳球虫卵囊感染，而且安全性高、稳定性好，解决了活疫苗存在散毒风险的问题。

Description

一种毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单 位疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
鸡球虫病是由顶复门、孢子虫纲、球虫目、艾美耳亚目、艾美耳科、艾美 耳属的不同种艾美耳球虫同时或先后寄生于鸡肠道上皮细胞引起的一种寄生性 原虫病，导致肠上皮细胞大量崩解、坏死、脱落、肠黏膜出血。其中毒害艾美 耳球虫(E.necatrix)的致病性很强，引发的小肠球虫病为急性型，毒害艾美耳 球虫裂殖生殖阶段寄生在小肠中段，病灶处的小肠高度肿大，充血、出血和坏 死症状，内容物有大量血液和脱落的黏膜，浆膜面可见出血点和针尖状的白点， 感染鸡对营养物质的吸收困难并伴有或继发坏死性肠炎。E.necatrix常发生于 50～126日龄的鸡群，报道E.necatrix在自然感染和实验室感染的死亡率分别可 达25％以上和100％，因此给养鸡生产造成严重危害。
目前，球虫病的控制主要利用药物防治，但由于耐药虫株的不断出现，导 致很多抗球虫药物疗效不持久。同时，由于新药研制费用过高、成功率较低， 并且人们对禽产品的药物残留问题及环保意识的逐步增强，疫苗防治球虫病己 成为一种势在必行的医疗手段。
基因亚单位疫苗由于众多优势脱颖而出，其安全性高、纯度高、稳定性好， 表达系统种类众多，蛋白产量高。但亚单位相关研究中存在表达量不高、免疫 原性低及蛋白不稳定等问题。鉴于此，研发一款表达量高、免疫原性强的稳定 亚单位疫苗极具前景。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种毒害艾美耳球虫 SAG7抗原亚单位疫苗及其制备方法和应用。本发明选用了毒害艾美耳球虫 SAG7作为抗原制备亚单位疫苗，所述蛋白具有良好的免疫原性，SAG7蛋白亚 单位疫苗在抵抗E.necatrix卵囊感染方面具有较强的活性。与强毒或减毒活疫苗 相比，基因工程亚单位疫苗不仅可以诱导良好的抗体反应，保护禽类抵抗艾美 球虫卵囊感染，而且安全性高、稳定性好，解决了活疫苗存在散毒风险的问题。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码毒害艾美耳球虫 SAG7蛋白；所述核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
第二方面，本发明提供一种重组载体，所述重组载体包括至少一个拷贝的 第一方面所述的核酸分子。
优选地，所述重组载体的骨架包括pET-30a质粒。
第三方面，本发明提供一种毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗，所述 毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗包括毒害艾美耳球虫SAG7蛋白和佐剂， 所述毒害艾美耳球虫SAG7蛋白为由第二方面所述的重组载体诱导表达得到的 重组蛋白，所述毒害艾美耳球虫SAG7蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
SEQ ID NO:2：
MLKITQAGQQTPKYAATLGKSVKCLSELNSAREAAGLPNFTEATEDKKL TDPKEDLDQDTEWKKVCTHLIPTEQTDPVAAASAANPFQDGTYAFKSLTAAE PNCKETVDHWKAAFKNFTGLPPSKTQGADLYKNQDNVSFVALYNPSSDATA DCQVVTCTKTTTEGTVLQNDSEQSPEYGYALICKTMPSAFKDDNAVPFTQDQWDKIASSHHHHHH。
本发明中，SAG7蛋白是E.necatrix第二代裂殖子表面抗原，以SAG7蛋白 作为亚单位疫苗候选蛋白，经分析去除信号肽和跨膜结构域得到的蛋白能够有 效激发鸡抵抗毒害艾美耳球虫感染的免疫保护力，可作为高效亚单位疫苗，经 过简化后的序列更利于制备和纯化，具有重要的应用价值。
优选地，所述佐剂包括完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。
优选地，所述佐剂与所述重组蛋白的体积比为1:(0.5～2)，例如可以是1:0.5、 1:0.6、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8或1:2等。
优选地，所述重组蛋白的浓度为0.5～2mg/mL，例如可以是0.5mg/mL、0.6 mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL 或2mg/mL等。
第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第三方面所 述的毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
第五方面，本发明提供一种第三方面所述的毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚 单位疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)构建含有编码毒害艾美耳球虫SAG7蛋白的核酸分子的重组载体；
(2)将步骤(1)所述的重组载体转入感受态细胞中，筛选阳性克隆后进 行培养，诱导表达，裂解细胞，得到裂解液；
(3)从步骤(2)所述的裂解液中提取和纯化蛋白质，得到重组蛋白；
(4)将步骤(3)所述的重组蛋白与佐剂混合，得到所述毒害艾美耳球虫 SAG7抗原亚单位疫苗。
优选地，步骤(1)中，所述重组载体的构建方法包括如下步骤：
将编码毒害艾美耳球虫SAG7蛋白的核酸分子插入pET-30a质粒的NdeⅠ和HindⅢ酶切位点之间，构建重组质粒pET-30a-SAG7。
优选地，步骤(2)中，所述感受态细胞包括BL21感受态细胞。
优选地，步骤(2)中，所述诱导表达的方式包括利用IPTG作为表达目的 蛋白的诱导剂。
优选地，步骤(2)中，所述裂解细胞的方法包括超声破碎。
优选地，步骤(3)中，所述提取和纯化采用如下步骤进行：
将所述裂解液离心收集上清液，并对所述上清液进行过滤，将过滤后的上 清液加入活化后的固定层析柱中，加入洗脱液，收集目标蛋白。
第六方面，本发明提供第一方面所述的核酸分子、第二方面所述的重组载 体、第三方面所述的毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗、第四方面所述的 药物组合物或第五方面所述的毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗的制备方 法中任意一种或至少两种的组合在制备球虫病治疗药物和/或疫苗中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上 述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽 列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明选用了毒害艾美耳球虫SAG7作为抗原制备亚单位疫苗，所述蛋白 具有良好的免疫原性，SAG7蛋白亚单位疫苗在抵抗E.necatrix卵囊感染方面具 有较强的活性。与强毒或减毒活疫苗相比，基因工程亚单位疫苗不仅可以诱导 良好的抗体反应，保护禽类抵抗艾美球虫卵囊感染，而且安全性高、稳定性好， 解决了活疫苗存在散毒风险的问题。
附图说明
图1为重组质粒pET-30a-SAG7的酶切鉴定结果图。
图2A为重组蛋白SAG7的SDS-PAGE电泳结果。
图2B为重组蛋白SAG7的Western blot分析结果。
图3为纯化后的重组蛋白SAG7的SDS-PAGE电泳结果。
图4为免疫原性检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员 应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或 条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可 通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种核酸分子，所述核酸分子编码毒害艾美耳球虫SAG7蛋 白。所述核酸分子为根据大肠杆菌的密码子偏好优化之后的编码毒害艾美耳球 虫SAG7蛋白的基因。
(1)SAG抗原基因序列寻找及分析
选择SAG作为疫苗候选基因：从ToxoDB获得ENH-00018890蛋白序列， 经序列比对显示：ENH-00018890基因与Eimeria tenella SAG7同源性高(85.6％)， 故命名为EN-SAG7。
(2)E.Necatrix SAG7基因优化
从ToxoDB原虫数据库中获得SAG7基因的mRNA序列和预测的蛋白序列。 利用Uniprot蛋白数据库分析信号肽和跨膜结构域，去除信号肽和跨膜结构域的 多肽序列。在GenSmartTM Codon Optimization系统中，根据大肠杆菌的密码子 偏好优化SAG7(长度：663bp，GC％：53)编码基因，由GenScript公司合成。 密码子优化后的基因序列如SEQ IDNO:1所示。
SEQ ID NO:1：
atgctaaaaataacacaggctggacaacaaaccccgaagtatgccgctaccctgggtaaaagcgtaaaatgcctg agcgaactgaatagcgcgcgtgaagctgcgggtctgccgaactttactgaggcaaccgaggacaagaagctgaccgat ccgaaagaggaccttgatcaagacaccgagtggaaaaaagtttgcacccatctgatcccgaccgagcagaccgaccca gtggccgcggcgtctgcggccaatccgtttcaggacggcacgtacgccttcaagtccctgaccgcggctgaaccgaatt gtaaagagacagtggatcattggaaggcggcgttcaagaacttcactggtttaccgccttcgaaaacccaaggtgcagatt tgtacaaaaaccaggacaacgtcagctttgttgcgttgtacaacccgtcgagcgatgcaaccgcagactgtcaggttgttac gtgcaccaagacgaccaccgaaggcaccgtgctgcaaaacgattccgaacaaagcccggaatatggctatgcgttgatc tgcaagacgatgccgtctgcgtttaaggacgataatgctgtgccgttcactcaggaccagtgggataaaattgcgtccagc catcaccaccaccaccactaa。
实施例2
本实施例提供一种重组载体，所述重组载体中含有实施例1中所述的核酸 分子，所述重组载体的制备方法包括如下步骤：
(1)重组表达载体pET-30a-SAG7的构建和鉴定
合成实施例1中所述核酸分子(由GenScript公司合成)，然后将核酸分子 插入pET-30a载体的5’-NdeⅠ和3’-HindⅢ酶切位点之间，构建重组质粒 pET-30a-SAG7。
从超低温冰箱中取出BL21(DE3)感受态细胞，置于冰上融化，加入质粒 pET-30a-SAG7(100ng)，充分混匀，冰浴30min，42℃反应90s，冰浴5min， 加入100μL LB培养基，37℃、200rpm摇床培养60min，均匀涂布在Kana+LB 琼脂板上，37℃倒置培养过夜。
而后进行菌落PCR鉴定：在培养板上挑取单菌落，接种于新的kana+LB琼 脂板上，然后配制PCR反应体系，所述PCR反应体系如下所示：
Figure BDA0003718106010000061
Figure BDA0003718106010000071
PCR扩增的条件如下所示：94℃预变性2min；94℃热变性30s，50℃退火 30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min。
PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳，120V电泳30min，于凝胶成像仪上进行 分析。
用内切酶NdeⅠ、HindⅢ对重组质粒pET-30a-SAG7进行双酶切鉴定，双酶 切反应体系如下所示：
Figure BDA0003718106010000072
双酶切反应的条件：37℃孵育4h。
酶切后取酶切产物5μL与1μL Loading Buffer混合后，用1％琼脂糖凝胶电 泳检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，泳道1：pET-30a-SAG7质粒；泳道 2：pET-30a-SAG7质粒双酶切产物；泳道M：KB Ladder Marker，酶切后条带大 小正确。
取酶切阳性质粒15-20μL送华大基因公司进行测序，测序结果与SAG7进 行比对，结果正确，最终成功构建表达载体pET-30a-SAG7。
实施例3
本实施例提供一种由实施例2所述的重组载体诱导表达得到的重组蛋白， 并对所述重组蛋白进行检测，所述重组蛋白为毒害艾美耳球虫SAG7蛋白(后 称重组蛋白SAG7)，所述重组蛋白SAG7由实施例2中构建的表达载体 pET-30a-SAG7诱导表达得到。所述重组蛋白SAG7的制备方法包括如下步骤：
(1)重组蛋白的诱导表达
挑取阳性克隆接种到4mL含有50μg/mL Knan+的LB培养基中，37℃、200 rpm震荡培养，当OD600nm处于0.6-0.8之间，向2个试管中分别加入0.5mM IPTG， 一个15℃培养16h，一个37℃培养4h，另取一支试管为阴性参照，培养后采 用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白质的表达和溶解度。
(2)重组蛋白SAG7样品的制备：
取450μL培养基离心后的沉淀，重悬于300μL裂解缓冲液，超声裂解1min。
全菌样品：取100μL裂解液，与50μL loading buffer(5×)混合均匀，100℃ 加热10min，12000rpm离心5min。
上清和包涵体样品：取剩余裂解液200μL，12000rpm离心10min，分别获 取上清和沉淀样品。混合90μL 5×loading buffer到180μL上清，作为上清样品。 用150μL 5×loading buffer重悬沉淀，作为包涵体样品。100℃加热10min后， 12000rpm离心5min，待上样。
(3)重组蛋白SDS-PAGE检测：
按照碧云天公司的BeyoGelTMSDS-PAGE预制胶(Tris-Gly，4-20％，12孔) 的操作说明进行实验，包括预制胶的处理，样品孔的清洗和上样等，而后进行 80V 30min、120V60min的电泳，撬开胶板，切割目的胶体，备用。按照碧云 天公司的考马斯亮蓝染色试剂盒(P0017A)的操作说明进行凝胶染色试验，包 括凝胶染色、室温孵育1h、脱色过夜与凝胶成像等。利用化学发光成像系统的 SDS灰度值分析重组蛋白的可溶性比例，以及利用BCA蛋白浓度检测试剂盒检 测破碎后样品的总蛋白浓度，通过可溶性比例预测目的蛋白的浓度。
(4)重组蛋白Western-blotting分析：
(a)电泳：将表达的目的蛋白作为样品进行SDS-PAGE电泳试验，电泳结 束前预先剪取大小合适的PVDF膜1张和同该膜一样大的滤纸6张。PVDF膜先 于甲醇中浸泡10min激活，后于电转缓冲液泡10min；滤纸和海绵在电转缓冲 液中稍作浸泡。
(b)转膜：待电泳结束，切取所需凝胶部分于电转缓冲液泡10min，按照 负极板、海绵、3层滤纸、膜、分离胶、3层滤纸、海绵、正极板的顺序放妥， 在放置期间应该使用玻棒赶尽滤纸、胶和膜之间可能存在的气泡，否则，在显 色时可见膜上有气泡印迹。将上述的转膜板放入电转糟，加入电转缓冲液至膜 上沿所在的位置，恒流200mA，电转60min。
(c)洗膜：将转膜结束后的PVDF膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次5min。
(d)封闭：把洗毕的膜浸泡在5％脱脂奶粉封闭液，室温摇床80rpm振摇 2h或在4℃过夜；洗膜：用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5min。
(e)一抗温育：将HIS单抗用TBST作1:10000比例稀释(按照Thermo FisherScientific说明书)，与PVDF膜在室温作用1h或4℃过夜。
(f)洗膜：用TBST洗涤PVDF膜4次，每次5min。
(g)二抗温育：用TBST对兔抗鼠IgG多抗作1：40000稀释(按照Thermo FisherScientific说明书)，将PVDF浸泡于其中，室温作用0.5-1h。
(h)洗膜：用TBST洗涤PVDF膜5次，每次5min。
(i)显色：使用ECL显色液进行显色1min，后用TBST终止反应，利用 化学发光成像系统观察特异性条带。
重组蛋白SAG7表达产物经过SDS-PAGE和Western-blotting鉴定，结果如 图2A和图2B所示，图2A为重组蛋白SAG7的SDS-PAGE电泳结果，其中箭 头指向的条带为重组蛋白SAG7对应的条带，图2A中，泳道M1：Protein marker (蛋白分子量标准)；泳道PC1：BSA(1μg)；泳道PC2：BSA(2μg)；泳道 NC：未诱导的全细胞；泳道1：15℃诱导16h的全细胞；泳道2：37℃诱导4h 的全细胞；泳道NC1：未诱导的细胞裂解上清；泳道3：15℃诱导16h的细胞 裂解上清；泳道4：37℃诱导4h的细胞裂解上清；泳道NC2：未诱导的细胞裂 解沉淀；泳道5：15℃诱导16h的细胞裂解沉淀；泳道6：37℃诱导4h的细胞 裂解沉淀。图2B为重组蛋白SAG7的Western blot分析结果，其中箭头指向的 条带为重组蛋白SAG7对应的条带，图2B中，泳道3：15℃诱导16h的细胞裂 解上清；泳道4：37℃诱导4h的细胞裂解上清；泳道M2：Westernblot Protein marker(WB分子量标准)。
诱导表达后的重组蛋白SAG7分子量约为23kDa，而未诱导的在相应位置 无明显条带。可溶性分析表明，在15℃诱导16h的情况下，上清和沉淀中均有 目的蛋白存在，但沉淀中目的蛋白更多。最佳诱导结果为：15℃诱导16h，表 达水平为30mg/L，可溶性比例为5％。
实施例4
本实施例对实施例3中所述重组蛋白SAG7进行大量表达和纯化。
(1)重组蛋白大量诱导表达
前期先进行1L菌液的IPTG诱导。取菌液，4℃、4000rpm离心10min后， 弃上清，收集菌体沉淀。随后进入细菌裂解过程，也可以在-20℃冻存备用。
(2)重组蛋白的纯化
将步骤(1)收集的菌体沉淀按照每克细菌沉淀湿重加入4mL裂解缓冲液 的比例，重悬菌体。于重悬菌体中加入溶菌酶，使其终浓度为1mg/mL，然后 冰浴30min。冰上超声破碎细菌，使裂解液变得澄清。超声波功率为300W， 每次超声处理持续4s，每次间隔持续6s，共超声处理时长30min。4℃、10000 g离心10min，收集裂解液上清并置于冰上。
根据PurKineTM组氨酸标签蛋白纯化试剂盒操作步骤，样品在应用于纯化装 置前应先经过离心，后用0.22μm或0.45μm过滤器过滤，以防止堵塞色谱柱。
固定层析柱，摘取顶部和底部塞子，让储存的缓冲液排出。在柱上加入2 个树脂体积裂解缓冲液。平衡层析柱，排出裂解缓冲液，重复此步骤三次。
将准备好的样品(蛋白提取液混合等体积裂解缓冲液制备样品)加入层析 柱，收集滤过液，可进行SDS-PAGE分析。注意：为了目的蛋白的最佳结合。 样品可在室温或4℃下孵育30min。注意不要超过树脂的结合能力。
加入2个树脂体积洗涤缓冲液，以去除非特异性吸附蛋白。收集的洗涤液 可用于SDS-PAGE分析，重复此步骤6次。
在色谱柱中加入5-10个树脂体积洗脱缓冲液，以洗脱目标蛋白，或直到流 出液在280nm的吸光度稳定。收集的洗脱液即为目的蛋白，可进行SDS-PAGE 或Western-blotting检测。
测试例1
本测试例对实施例4中纯化后的重组蛋白SAG7进行SDS-PAGE检测和蛋 白浓度测量。
(1)对纯化后的重组蛋白SAG7进行SDS-PAGE检测
分别将上步纯化后重组蛋白样品取20μL加入6×SDS-PAGE上样缓冲液4 μL，在沸水中煮5-10min，处理样品进行SDS-PAGE，观察电泳结果进行分析。
纯化后的重组蛋白SAG7的SDS-PAGE电泳结果如图3所示，其中箭头指 向的条带为重组蛋白SAG7对应的条带，其中，泳道M1：蛋白分子量标准；泳 道BSA：牛血清白蛋白；泳道R：重组蛋白SAG7。结果表明重组蛋白SAG7 纯化成功，蛋白大小分别为23kDa。
(2)对纯化后的纯化重组蛋白SAG7进行浓度测定
根据BCA蛋白浓度测定试剂盒的操作程序，按样品数量制备BCA工作液， 充分混匀。
将标准品按0μL、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL和20μL加到 96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL，相当于标准品浓度分别为 0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4 mg/mL和0.5mg/mL。
加20μL体积样品到96孔板的样品孔中，各孔加入200μL BCA工作液， 37℃孵育30min。用酶标仪测定A562波长的吸光度，按照绘制的标准曲线和使 用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
根据蛋白标准曲线：y＝0.0009x+0.0998，对重组蛋白SAG7样品进行OD562 测定，代入公式中y值，得到重组蛋白SAG7的浓度为0.63mg/mL。
实施例5
本实施例提供一种毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗，所述毒害艾美 耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗含有实施4中所述的重组蛋白SAG7。
将重组蛋白SAG7等体积混合完全弗氏佐剂，按50μg/羽分别免疫1周龄黄 鸡，14日龄时将重组蛋白等体积混合不完全弗氏佐剂(50μg/羽)，进行等量二 次免疫，21日龄时从翅下静脉采集血清作为一抗，羊抗鸡HRP标记抗体作为二 抗，进行Western blot分析，验证纯化重组蛋白的免疫原性。免疫原性检测结果 如图4所示，其中箭头指向的是重组蛋白SAG7对应的条带，泳道3、4：重组 蛋白SAG7；泳道M2：蛋白分子量标准，结果表明重组蛋白SAG7具有良好的 免疫原性。
测试例2
本测试例对所得重组蛋白SAG7进行动物免疫试验。
1、动物免疫试验的步骤如下所示：
(1)阴性对照组：不感染不进行免疫，用100μL PBS进行同步接种7、14、 21日龄健康鸡；
(2)阳性对照组：7、14日龄健康鸡进行100μL PBS同步注射，21日龄 攻毒30000个/羽强毒株卵囊；
(3)SAG7免疫组：7日龄健康鸡进行首次免疫，14日龄进行二次免疫， 21日龄攻毒30000个/羽强毒株卵囊。
具体如表1所示。
表1
Figure BDA0003718106010000131
2、免疫保护效果的评估
(1)卵囊产量：记录实验与对照组6-8d p.i.(感染后天数)的OPG和粪重， 统计卵囊产量(实验与对照组共4个，每组3个重复实验，每笼5只鸡，共60 只)；
(2)卵囊减少率(％)：记录实验与对照组6-8d p.i.的OPG和粪重，统计 卵囊产量，卵囊减少率(％)＝(阳性对照组卵囊产量-免疫组卵囊产量)×100/ 阳性对照组卵囊产量；
(3)增重：记录感染当天至感染后第10天的增重(感染后第10天体重- 感染第1天体重)；
(4)料肉比：记录黄鸡感染球虫后10天的料肉比情况，料肉比＝消耗饲料 总量(kg)/增重总量(kg)；
(5)平均病变记分：6d p.i.剖检黄鸡进行病变记分，根据Johnson病变记 分准则(Johnson J,Reid W M.Anticoccidial drugs:Lesion scoring techniques in batteryand floor-pen experiments with chickens[J].Experimental Parasitology,1970, 28(1):30-36.)评价鸡小肠中段的病变程度；
(6)抗球虫指数(Anticoccidial index，ACI)：ACI是包括存活率、平均 增重、病变记分、卵囊产量等因素，综合评估后作为判定球虫药物效力的指标， 在此作为候选基因工程疫苗效力的评价方法，采用以下ACI计算公式：
ACI＝(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)；
存活率＝(试验结束时存活鸡只数/试验组鸡只数)×100％；
相对增重率＝(试验组增重率/不感染不用药对照组增重率)×100％；
病变值(0～40)＝各试验组的平均病变记分(0～4)×10。
卵囊值(0～40)按以下方法(表2)计算，此后，用以下标准评价每种蛋白 质的免疫保护作用：ACI>180表示优良活性，160-179中度活性，120-159有限 的活性，<120无免疫保护力。
表2
粪便匀浆中卵囊百万数/只 卵囊数
小于0.1 0
0.1～1.0 1
2.0～5.0 10
6.0～10.0 20
大于11.0 40
3、免疫保护效果分析
(1)本测试例的结果的数据采用GraphPad Prism 6软件进行处理，均以平 均±标准差表示，并使用IBM SPSS Statistics 22.0统计软件进行差异显著性分析 (SpssSoftware,Inc.,New York,USA)。数据用方差分析比较不同组间的差异。 P值<0.05表示有统计学意义；
(2)在平均增重、相对增重率、料肉比、卵囊值、平均病变评分和ACI 结果如表3，疫苗接种组优于阳性对照组(用PBS免疫和E.necatrix感染)，在 卵囊产量和小肠病变评分方面均差异显著(P<0.05)，SAG7蛋白的ACI分别高 达162.07，两者均优于阳性对照组的ACI，这些结果表明，SAG7蛋白亚单位疫 苗在抵抗3万个E.necatrix卵囊感染方面具有中等活性。
表3
Figure BDA0003718106010000151
Figure BDA0003718106010000161
注：阴性组用PBS免疫但不感染E.necatrix卵囊；阳性组用PBS免疫并感 染E.necatrix卵囊。优异的活性：ACI>180；中等活性：179>ACI>160；有限的 活性：159>ACI>120；无免疫保护力：ACI<120。
综上，本发明提供的毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗具有良好的免 疫原性，SAG7蛋白亚单位疫苗在抵抗E.necatrix卵囊感染方面具有较强的活性。 与强毒或减毒活疫苗相比，基因工程亚单位疫苗不仅可以诱导良好的抗体反应， 保护禽类抵抗艾美球虫卵囊感染，而且安全性高、稳定性好，解决了活疫苗存 在散毒风险的问题，具有广阔的应用前景。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围 并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技 术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明 的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 佛山市正典生物技术有限公司
<120> 一种毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗及其制备方法和应用
<130> 2022
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgctaaaaa taacacaggc tggacaacaa accccgaagt atgccgctac cctgggtaaa 60
agcgtaaaat gcctgagcga actgaatagc gcgcgtgaag ctgcgggtct gccgaacttt 120
actgaggcaa ccgaggacaa gaagctgacc gatccgaaag aggaccttga tcaagacacc 180
gagtggaaaa aagtttgcac ccatctgatc ccgaccgagc agaccgaccc agtggccgcg 240
gcgtctgcgg ccaatccgtt tcaggacggc acgtacgcct tcaagtccct gaccgcggct 300
gaaccgaatt gtaaagagac agtggatcat tggaaggcgg cgttcaagaa cttcactggt 360
ttaccgcctt cgaaaaccca aggtgcagat ttgtacaaaa accaggacaa cgtcagcttt 420
gttgcgttgt acaacccgtc gagcgatgca accgcagact gtcaggttgt tacgtgcacc 480
aagacgacca ccgaaggcac cgtgctgcaa aacgattccg aacaaagccc ggaatatggc 540
tatgcgttga tctgcaagac gatgccgtct gcgtttaagg acgataatgc tgtgccgttc 600
actcaggacc agtgggataa aattgcgtcc agccatcacc accaccacca ctaa 654
<210> 2
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Leu Lys Ile Thr Gln Ala Gly Gln Gln Thr Pro Lys Tyr Ala Ala
1 5 10 15
Thr Leu Gly Lys Ser Val Lys Cys Leu Ser Glu Leu Asn Ser Ala Arg
20 25 30
Glu Ala Ala Gly Leu Pro Asn Phe Thr Glu Ala Thr Glu Asp Lys Lys
35 40 45
Leu Thr Asp Pro Lys Glu Asp Leu Asp Gln Asp Thr Glu Trp Lys Lys
50 55 60
Val Cys Thr His Leu Ile Pro Thr Glu Gln Thr Asp Pro Val Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ser Ala Ala Asn Pro Phe Gln Asp Gly Thr Tyr Ala Phe Lys Ser
85 90 95
Leu Thr Ala Ala Glu Pro Asn Cys Lys Glu Thr Val Asp His Trp Lys
100 105 110
Ala Ala Phe Lys Asn Phe Thr Gly Leu Pro Pro Ser Lys Thr Gln Gly
115 120 125
Ala Asp Leu Tyr Lys Asn Gln Asp Asn Val Ser Phe Val Ala Leu Tyr
130 135 140
Asn Pro Ser Ser Asp Ala Thr Ala Asp Cys Gln Val Val Thr Cys Thr
145 150 155 160
Lys Thr Thr Thr Glu Gly Thr Val Leu Gln Asn Asp Ser Glu Gln Ser
165 170 175
Pro Glu Tyr Gly Tyr Ala Leu Ile Cys Lys Thr Met Pro Ser Ala Phe
180 185 190
Lys Asp Asp Asn Ala Val Pro Phe Thr Gln Asp Gln Trp Asp Lys Ile
195 200 205
Ala Ser Ser His His His His His His
210 215

Claims (10)

1.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码毒害艾美耳球虫SAG7蛋白；所述核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括至少一个拷贝的权利要求1所述的核酸分子；
优选地，所述重组载体的骨架包括pET-30a质粒。
3.一种毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗，其特征在于，所述毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗包括毒害艾美耳球虫SAG7蛋白和佐剂，所述毒害艾美耳球虫SAG7蛋白为由权利要求2所述的重组载体诱导表达得到的重组蛋白；所述毒害艾美耳球虫SAG7蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
4.根据权利要求3所述的毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂包括完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。
5.根据权利要求3或4所述的毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂与所述重组蛋白的体积比为1:(0.5～2)；
优选地，所述重组蛋白的浓度为0.5-2mg/mL。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求3～5中任一项所述的毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
7.一种权利要求3～5中任一项所述的毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)构建含有编码毒害艾美耳球虫SAG7蛋白的核酸分子的重组载体；
(2)将步骤(1)所述的重组载体转入感受态细胞中，筛选阳性克隆后进行培养，诱导表达，裂解细胞，得到裂解液；
(3)从步骤(2)所述的裂解液中提取和纯化蛋白质，得到重组蛋白；
(4)将步骤(3)所述的重组蛋白与佐剂混合，得到所述毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗。
8.根据权利要求7所述的毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述重组载体的构建方法包括如下步骤：
将编码毒害艾美耳球虫SAG7蛋白的核酸分子插入pET-30a质粒的NdeⅠ和HindⅢ酶切位点之间，构建重组质粒pET-30a-SAG7。
9.根据权利要求7或8所述的毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述感受态细胞包括BL21感受态细胞；
优选地，步骤(2)中，所述诱导表达的方式包括利用IPTG作为表达目的蛋白的诱导剂；
优选地，步骤(2)中，所述裂解细胞的方法包括超声破碎；
优选地，步骤(3)中，所述提取和纯化采用如下步骤进行：
将所述裂解液离心收集上清液，并对所述上清液进行过滤，将过滤后的上清液加入活化后的固定层析柱中，加入洗脱液，收集目标蛋白。
10.权利要求1所述的核酸分子、权利要求2所述的重组载体、权利要求3～5中任一项所述的毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗、权利要求6所述的药物组合物或权利要求7～9中任一项所述的毒害艾美耳球虫SAG7抗原亚单位疫苗的制备方法中任意一种或至少两种的组合在制备球虫病治疗药物和/或疫苗中的应用。
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