CN115007118A - 蛋白质分离纯化用磁珠和其交联壳聚糖及其制备使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白质分离纯化用磁珠和其交联壳聚糖及其制备使用方法，所述蛋白质分离纯化用磁珠是外壳为交联壳聚糖，内核为磁粒子的交联壳聚糖包膜结构，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法利用表面羧基对含氨基壳聚糖的吸附作用，自组装后用环氧氯丙烷再交联，以于所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖引入烷基链而保障所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖分子内的氢键的稳定性，对应保障所述蛋白质分离纯化用磁珠中的磁粒子对相应蛋白质的吸附效果和与所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖的结合的稳定性，以获得具优良分散特性和宽pH稳定性的所述蛋白质分离纯化用磁珠，能够同时用于蛋白质的纯化和固定化，具有广泛的应用范围。

Description

蛋白质分离纯化用磁珠和其交联壳聚糖及其制备使用方法

技术领域

本发明涉及蛋白质的分离纯化领域，尤其涉及蛋白质分离纯化用磁珠和其交联壳聚糖及其制备使用方法。

背景技术

蛋白质的分离纯化主要有盐析、离心、凝胶电泳和亲和层析等方法。其中，盐析、离心和凝胶电泳受限于成本高和效率低的因素，不适用于工业化的蛋白质分离纯化，应用比较局限。亲和层析是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当混合有要被分离的目标蛋白质的混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中，以在后继能够经洗脱而实现对相应蛋白质的分离纯化。目前，对于重组蛋白的分离纯化，金属螯合亲和层析是最常应用的技术手段。金属螯合亲和层析是利用蛋白质表面的一些氨基酸如组氨酸、色氨酸和半胱氨酸等能与金属离子发生特异性吸附，从而对蛋白质进行分离的技术。其中的His-tag（聚组氨酸标签）技术，就是以4-10个组氨酸标记要分离的目标蛋白质，组氨酸残基带有1个咪唑基团，能够与Ni2+、Co2+、Cu2+金属离子螯合从而特异吸附到介质上实现分离。常规的金属螯合亲和层析介质大多是葡聚糖和琼脂糖，但这两种层析介质制备复杂，价格昂贵，且不耐压，一般仅适合实验室使用。

作为葡聚糖和琼脂糖基质的替代者，壳聚糖有很多优势，如资源丰富价格低，生物相容性好，配基偶联方法简单，非特异性吸附弱等。壳聚糖是一种天然的碱性多糖，C2位带有氨基，C3和C6位带有羟基，可与各种含有醛基的交联剂反应，因此易于衍生化。目前，对于壳聚糖应用的开发主要集中于废水处理领域 。CN201010610928.3于2011年7月27日公开了一种磁性壳聚糖微球的制备方法，将壳聚糖，含Fe³⁺，Fe²⁺的溶液在酸性条件下混合，然后将该混合液滴加到碱性溶液中进行沉淀反应，所得沉淀物即为磁性壳聚糖微球。该发明制得的磁性壳聚糖微球，分布在表层，且对壳聚糖并未采用交联剂增强机械强度，承压力较差，不适用于蛋白质的分离纯化，仅适合于污水处理或者用于作为药物载体。CN201510622284.2于2015年12月23日公开了一种糠醛改性交联壳聚糖螯合树脂磁性颗粒的制备方法，其步骤为:1、以糠醛为原料，壳聚糖为基质，制备糠醛改性壳聚糖；2、使用戊二醛为交联剂，将糠醛改性壳聚糖进行交联，并将其包覆在颗粒表面，得到糠醛改性交联壳聚糖螯合树脂磁性颗粒。该发明采用糠醛对壳聚糖进行改性，是为了引入更多的N原子和O原子，增加树脂中可以与金属离子配对的原子数量。这种处理办法对于处理工业废水污染中重金属离子的回收吸附比较有效，但在金属螯合亲和层析中金属离子过多反而导致蛋白质变性，因此不适用 。CN201310257075 .3于2013年10月9日公开了一种咪唑和壳聚糖功能化磁性粒子及其制备方法，由磁粉、油酸、壳聚糖和咪唑等反应制得，用于去除工业废水中磺酸染料。 CN201610674866.X康盈红莓（中山）生物有限公司于2017年1月4日公布了用于一种蛋白纯化用磁珠的制备方法，以壳聚糖和磁粉为原料，在交联剂作用下形成交联壳聚糖包覆磁粉的核壳结构颗粒，经还原和羧甲基化作用形成蛋白纯化用磁珠。将该蛋白纯化用磁珠用于带有His‐tag的蛋白质的分离纯化，避免了洗脱时可能出现的蛋白质变性的问题，且能提高蛋白质的分析效率，但磁珠受pH、螯合离子浓度等的影响，吸附his-tag蛋白不稳定，使用过程易脱落，且循环使用效果欠佳。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种蛋白质分离纯化用磁珠和其交联壳聚糖及其制备使用方法，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠能够作为吸附剂以亲和层析的方法用于蛋白质的纯化和固定化，因而具有低成本和高效率的优势而适用于工业化应用的蛋白质大规模分离纯化。

本发明的另一个目的在于提供一种蛋白质分离纯化用磁珠和其交联壳聚糖及其制备使用方法，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠在酸性和碱性环境中的分散性良好，在各种pH=1～14范围内的水溶液中不溶解，有较好的抗酸碱侵蚀特性，因而具有更为广泛的应用范围。

本发明的另一个目的在于提供一种蛋白质分离纯化用磁珠和其交联壳聚糖及其制备使用方法，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖中同时引入有亚胺二乙酸基团和环氧基团两个功能基团，以基于所述亚胺二乙酸基团螯合的二价离子（锌、镍、钴、铜等）与具有聚组氨酸标签的重组蛋白的特异性结合实现对该重组蛋白的分离纯化，和基于被吸附于所述蛋白质分离纯化用磁珠而被分离纯化的该重组蛋白的氨基与所述环氧基团的共价结合实现对该该重组蛋白的固定化，如此以在功能上使得所述蛋白质分离纯化用磁珠能够在用于蛋白质的纯化的同时用于蛋白质的固定化。

本发明的另一个目的在于提供一种蛋白质分离纯化用磁珠和其交联壳聚糖及其制备使用方法，其中由于所述亚胺二乙酸基团螯合的二价离子与具有聚组氨酸标签的重组蛋白的特异性结合的反应速度快于该重组蛋白的氨基与所述环氧基团的共价结合速度，所述蛋白质分离纯化用磁珠能够在细胞破碎液中特异性吸附具有聚组氨酸标签的重组蛋白而分离纯化该重组蛋白后再固定化该重组蛋白，以基于反应时间的控制使得所述蛋白质分离纯化用磁珠能够在功能上独立用于蛋白质的纯化或同时用于蛋白质的纯化和固定化，因而具有更为广泛的应用范围。

本发明的另一个目的在于提供一种蛋白质分离纯化用磁珠和其交联壳聚糖及其制备使用方法，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖中引入有烷基链而有利于保障所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖分子内的氢键的稳定性，对应有利于保障所述蛋白质分离纯化用磁珠中的磁粒子对相应蛋白质的吸附效果和与所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖的结合的稳定性，从而保障所述蛋白质分离纯化用磁珠的抗酸碱侵蚀特性和被循环使用的稳定性。

本发明的另一个目的在于提供一种蛋白质分离纯化用磁珠和其交联壳聚糖及其制备使用方法，其中相较于现有的以羧甲基化交联壳聚糖制得的磁珠结构受到体系pH、螯合离子浓度的影响，对相应蛋白质的吸附效果并不稳定而仅能用于蛋白质的纯化，所述蛋白质分离纯化用磁珠中的磁粒子对相应蛋白质的吸附效果和与所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖的结合的稳定性基于所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖中烷基链的引入能够被保障，如此以基于对所述蛋白质分离纯化用磁珠在使用过程中的稳定性的保障，在稳定性上使得所述蛋白质分离纯化用磁珠能够在用于蛋白质的纯化的同时用于蛋白质的固定化，因而具有更为广泛的应用范围。

本发明的另一个目的在于提供一种蛋白质分离纯化用磁珠和其交联壳聚糖及其制备使用方法，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠在循环使用中的稳定性能够被保障而具有更高的经济效益和环保价值，因而具有重要的商业价值和战略意义。

本发明的另一个目的在于提供一种蛋白质分离纯化用磁珠和其交联壳聚糖及其制备使用方法，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法利用表面羧基对含氨基壳聚糖的吸附作用，自组装后用环氧氯丙烷再交联，获得了具优良分散特性和宽pH稳定性的所述蛋白质分离纯化用磁珠，工艺简单且经济环保，适于推广使用。

为实现以上至少一目的，根据本发明的一个方面，本发明提供一蛋白质分离纯化用磁珠，所述蛋白质分离纯化用磁珠是外壳为交联壳聚糖，内核为磁粒子的交联壳聚糖包膜结构，其中所述交联壳聚糖具有亚胺二乙酸基团和环氧基团两个功能基团，以使得所述蛋白质分离纯化用磁珠能够基于所述亚胺二乙酸基团与相应二价离子的螯合特异性结合具有聚组氨酸标签的蛋白质而实现对该蛋白质的分离纯化，和基于所述环氧基团与该蛋白质的氨基的共价结合实现对该蛋白质的固定化，如此以在功能上使得所述蛋白质分离纯化用磁珠能够在用于蛋白质的纯化的同时用于蛋白质的固定化。

在一实施例中，其中所述交联壳聚糖的结构为：

。

在一实施例中，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠为在反应体系中加入有磁粉的状态，依以下反应式形成的交联壳聚糖包膜结构：

。

在一实施例中，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠为依以下步骤形成的交联壳聚糖包膜结构：

（S1）取壳聚糖、纯水以及冰醋酸充分溶解获得壳聚糖溶液；

（S2）取所述壳聚糖溶液加入磁粉和加入碱性溶液以调节体系的PH至碱性；

（S3）在搅拌条件下于所述步骤（S2）的体系中加入环氧氯丙烷溶液并升温至60℃以上，在催化量十六烷基三甲基溴化铵存在条件下搅拌反应；

（S4）于所述步骤（S3）的体系中加入亚胺二乙酸搅拌反应；以及

（S5）于所述步骤（S4）的体系中加入酸性溶液以调节体系的PH至中性，以在后继基于对沉淀物的洗涤和干燥获得所述蛋白质分离纯化用磁珠。

在一实施例中，其中在所述步骤（S2）中，所述磁粉的规格为300-1000目。

在一实施例中，其中在所述步骤（S5）中，可选地在调节体系的PH至中性后，对沉淀物的洗涤和干燥包括步骤：

（S51）加入2倍体积丙酮沉淀，过滤，加甲醇-水充分洗涤，再用丙酮、乙醇充分洗涤后，真空干燥以获得所述蛋白质分离纯化用磁珠。

在一实施例中，其中在所述步骤（S3）中，在搅拌条件下于所述步骤（S2）的体系中加入环氧氯丙烷溶液并升温至80℃，在催化量十六烷基三甲基溴化铵存在条件下搅拌反应。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供一蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖，所述交联壳聚糖的结构为：

。

在一实施例中，其中所述交联壳聚糖依以下反应式形成：

。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供一蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法，所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法包括以下步骤：

（S1）取壳聚糖、纯水以及冰醋酸充分溶解获得壳聚糖溶液；

（S2）取所述壳聚糖溶液加入磁粉和加入碱性溶液以调节体系的PH至碱性；

（S3）在搅拌条件下于所述步骤（S2）的体系中加入环氧氯丙烷溶液并升温至60℃以上，在催化量十六烷基三甲基溴化铵存在条件下搅拌反应；

（S4）于所述步骤（S3）的体系中加入亚胺二乙酸搅拌反应；以及

（S5）于所述步骤（S4）的体系中加入酸性溶液以调节体系的PH至中性，以在后继基于对沉淀物的洗涤和干燥获得所述蛋白质分离纯化用磁珠。

在一实施例中，其中在所述步骤（S2）中，所述磁粉的规格为300-1000目。

在一实施例中，其中在所述步骤（S5）中，可选地在调节体系的PH至中性后，对沉淀物的洗涤和干燥包括步骤：

（S51）加入2倍体积丙酮沉淀，过滤，加甲醇-水充分洗涤，再用丙酮、乙醇充分洗涤后，真空干燥以获得所述蛋白质分离纯化用磁珠。

在一实施例中，其中在所述步骤（S3）中，在搅拌条件下于所述步骤（S2）的体系中加入环氧氯丙烷溶液并升温至80℃，在催化量十六烷基三甲基溴化铵存在条件下搅拌反应。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供一蛋白质分离纯化用磁珠的使用方法，所述蛋白质分离纯化用磁珠的使用方法包括以下步骤：

A、将所述蛋白质分离纯化用磁珠加入螯合金属离子溶液中搅拌均匀，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠是外壳为交联壳聚糖，内核为磁粒子的交联壳聚糖包膜结构，其中所述交联壳聚糖具有亚胺二乙酸基团和环氧基团两个功能基团，以使得所述蛋白质分离纯化用磁珠能够基于所述亚胺二乙酸基团与金属离子的螯合特异性结合具有聚组氨酸标签的蛋白质而实现对该蛋白质的分离纯化，和基于所述环氧基团与该蛋白质的氨基的共价结合实现对该蛋白质的固定化，如此以在功能上使得所述蛋白质分离纯化用磁珠能够在用于蛋白质的纯化的同时用于蛋白质的固定化：

B、在所述步骤A的体系中加入带有多聚组氨酸标签的目标蛋白混合液，以使得目标蛋白特异性结合在所述蛋白质分离纯化用磁珠上；以及

C、采用磁性吸附的方式将所述蛋白质分离纯化用磁珠自目标蛋白混合液分离，以在后继通过洗杂的方式获得纯化后的目标蛋白。

在一实施例中，其中在所述步骤A中，所述交联壳聚糖的结构为：

。

在一实施例中，其中在所述步骤C中，基于反应时间的控制进一步通过洗脱的方式获得分离纯化后的目标蛋白。

在一实施例中，其中在所述步骤C中，基于反应时间的控制获得纯化和固定化的目标蛋白。

通过对随后的描述和附图的理解，本发明进一步的目的和优势将得以充分体现。

附图说明

图1为本发明的蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖的结构图。

图2为依本发明的一实施例的所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖的实现过程的反应式。

具体实施方式

以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、形变方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。

本发明提供一种蛋白质分离纯化用磁珠和其交联壳聚糖及其制备使用方法，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠能够作为吸附剂以亲和层析的方法用于蛋白质的纯化和固定化，因而具有低成本和高效率的优势而适用于工业化应用的蛋白质大规模分离纯化。

具体地，所述蛋白质分离纯化用磁珠是外壳为交联壳聚糖，内核为磁粒子的交联壳聚糖包膜结构，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖中同时引入有亚胺二乙酸基团和环氧基团两个功能基团，以基于所述亚胺二乙酸基团螯合的二价离子（锌、镍、钴、铜等）与具有聚组氨酸标签的重组蛋白的特异性结合实现对该重组蛋白的分离纯化，和基于被吸附于所述蛋白质分离纯化用磁珠而被分离纯化的该重组蛋白的氨基与所述环氧基团的共价结合实现对该该重组蛋白的固定化，如此以在功能上使得所述蛋白质分离纯化用磁珠能够在用于蛋白质的纯化的同时用于蛋白质的固定化。

特别地，由于所述亚胺二乙酸基团螯合的二价离子与具有聚组氨酸标签的重组蛋白的特异性结合的反应速度快于该重组蛋白的氨基与所述环氧基团的共价结合速度，所述蛋白质分离纯化用磁珠能够在细胞破碎液中特异性吸附具有聚组氨酸标签的重组蛋白而分离纯化该重组蛋白后再固定化该重组蛋白，以基于反应时间的控制使得所述蛋白质分离纯化用磁珠能够在功能上独立用于蛋白质的纯化或同时用于蛋白质的纯化和固定化，因而具有更为广泛的应用范围。

进一步地，其中区别于现有的以羧甲基化交联壳聚糖制得的交联壳聚糖包膜结构，本发明的所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖种引入有烷基链而有利于保障所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖分子内的氢键的稳定性，对应有利于保障所述蛋白质分离纯化用磁珠中的磁粒子对相应蛋白质的吸附效果和与所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖的结合的稳定性，从而保障所述蛋白质分离纯化用磁珠的抗酸碱侵蚀特性和被循环使用的稳定性。

因此，相较于现有的以羧甲基化交联壳聚糖制得的磁珠结构受到体系pH、螯合离子浓度的影响，对相应蛋白质的吸附效果并不稳定而仅能用于蛋白质的纯化，本发明的所述蛋白质分离纯化用磁珠中的磁粒子对相应蛋白质的吸附效果和与所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖的结合的稳定性基于所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖中烷基链的引入能够被保障，如此以基于对所述蛋白质分离纯化用磁珠在使用过程中的稳定性的保障，在稳定性上使得所述蛋白质分离纯化用磁珠能够在用于蛋白质的纯化的同时用于蛋白质的固定化，因而具有更为广泛的应用范围。

也就是说，所述蛋白质分离纯化用磁珠中的磁粒子对相应蛋白质的吸附效果和与所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖的结合的稳定性基于所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖中烷基链的引入能够被保障，从而保障所述蛋白质分离纯化用磁珠的抗酸碱侵蚀特性和被循环使用的稳定性，并具体表现为所述蛋白质分离纯化用磁珠在酸性和碱性环境中的分散性良好，在各种pH=1～14范围内的水溶液中不溶解，以及在被循环使用时所述蛋白质分离纯化用磁珠中的磁粒子不易脱落。

具体地，所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖的结构对应于本发明的说明书附图之图1被示意，也就是说，所述蛋白质分离纯化用磁珠是外壳为交联壳聚糖，内核为磁粒子的交联壳聚糖包膜结构，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖对应于本发明的说明书附图之图1被具体示意。

进一步地，对应于本发明的说明书附图之图2所示，依本发明的一实施例的所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖的实现过程的反应式被示意，其中对应于该反应式，所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法利用表面羧基对含氨基壳聚糖的吸附作用，自组装后用环氧氯丙烷再交联，获得了具优良分散特性和宽pH稳定性的所述蛋白质分离纯化用磁珠，工艺简单且经济环保，适于推广使用。

具体地，对应于该反应式，依本发明的一实施例的所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法被示例，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法包括以下步骤：

S1、取壳聚糖、纯水以及冰醋酸充分溶解获得壳聚糖溶液；

S2、取所述壳聚糖溶液加入磁粉和加入碱性溶液以调节体系的PH至碱性；

S3、在搅拌条件下于所述步骤（S2）的体系中加入环氧氯丙烷溶液并升温至60℃以上，在催化量十六烷基三甲基溴化铵存在条件下搅拌反应；

S4、于所述步骤（S3）的体系中加入亚胺二乙酸搅拌反应；以及

S5、于所述步骤（S4）的体系中加入酸性溶液以调节体系的PH至中性，以在后继基于对沉淀物的洗涤和干燥获得所述蛋白质分离纯化用磁珠。

优选地，其中在所述步骤（S2）中，所述磁粉的规格为300-1000目。

进一步地，其中在所述步骤（S3）中，优选地在搅拌条件下于所述步骤（S2）的体系中加入环氧氯丙烷溶液并升温至80℃，在催化量十六烷基三甲基溴化铵存在条件下搅拌反应。

特别地，在本发明的这个实施例中，其中在所述步骤（S5）中，可选地在调节体系的PH至中性后，对沉淀物的洗涤和干燥包括步骤：

S51、加入2倍体积丙酮沉淀，过滤，加甲醇-水充分洗涤，再用丙酮、乙醇充分洗涤后，真空干燥以获得所述蛋白质分离纯化用磁珠。

可以理解的是，基于部分反应物和中间产物能够依所述步骤（S5）被洗涤分离或依其他方式被分离，在本发明的这个实施例中，作为反应物的所述壳聚糖、所述环氧氯丙烷溶液以及所述亚胺二乙酸之间的摩尔比例并不受本发明的说明书附图之图2所示意的反应式对所述壳聚糖、所述环氧氯丙烷溶液以及所述亚胺二乙酸的比例限制。也就是说，在本发明的这个实施例中，作为反应物的所述壳聚糖、所述环氧氯丙烷溶液以及所述亚胺二乙酸之间的比例多样，在本发明的说明书附图之图2所示意的所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖的实现过程的反应式基础上，本领域技术人员能够依该反应式推导多种不同于上述所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法的所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法，或依该反应式和上述所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法轻易调整上述所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法中反应物的比例。因此，在本发明的这个实施例中，作为反应物的所述壳聚糖、所述环氧氯丙烷溶液以及所述亚胺二乙酸之间的摩尔比例并不构成对本发明的限制。

换而言之，上述所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法仅作为示例而不构成对本发明的所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法的限制，本发明的所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法为在反应体系中加入有磁粉的状态，依本发明的说明书附图之图2所示意的所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖的实现过程的反应式，生成对应于本发明的说明书附图之图1所示意的所述交联壳聚糖的反应步骤。

为进一步理解本发明，依本发明的一实施例的所述蛋白质分离纯化用磁珠的使用方法被示例，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠的使用方法包括以下步骤：

A、将所述蛋白质分离纯化用磁珠加入螯合金属离子溶液中搅拌均匀，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠是外壳为交联壳聚糖，内核为磁粒子的交联壳聚糖包膜结构，其中所述交联壳聚糖的结构对应于本发明的说明书附图之图1；

B、在所述步骤（A）的体系中加入带有His-tag 的目标蛋白混合液，以使得目标蛋白特异性结合在所述蛋白质分离纯化用磁珠上；以及

C、采用磁性吸附的方式将所述蛋白质分离纯化用磁珠自目标蛋白混合液分离，以在后继通过洗杂的方式获得纯化后的目标蛋白。

可选地，在本发明的一些实施例中，其中在所述步骤（C）中，基于反应时间的控制进一步通过洗脱的方式获得分离纯化后的目标蛋白。

在本发明的另一些实施例中，其中在所述步骤（C）中，基于反应时间的控制，获得纯化和固定化的目标蛋白。

特别地，为充分展示本发明的所述蛋白质分离纯化用磁珠相对于现有的以羧甲基化交联壳聚糖制得的磁珠结构的优势，具体展示本发明的所述蛋白质分离纯化用磁珠用于蛋白质的固定化时的稳定性，本发明的上述实施例的所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法和依该实施例的所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法制备的所述蛋白质分离纯化用磁珠的使用方法被具体示例，以作为对照实施例展示本发明的所述蛋白质分离纯化用磁珠相对于现有的以羧甲基化交联壳聚糖制得的磁珠结构的优势。

具体示例的所述蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法：

（1）取壳聚糖9g，加纯水900ml，充分搅拌溶解，冷却至4°C制得壳聚糖溶液；

（2）在10L的反应体系中，加入磁粉750g、蒸馏水1875ml，加入步骤(1)中所制的壳聚糖溶液，在40°C搅拌条件下加入氢氧化钠固体9g，反应1h；

（3）加入环氧氯丙烷溶液15ml，0.6g CTAB，并升温至80°C，高速搅拌反应8h；

（4）加入亚胺二乙酸10.6g，匀速搅拌反应24h；以及

（5）经以上步骤得到的混合溶液，用盐酸中和溶液pH至7，加入2倍体积丙酮沉淀，过滤得沉淀，用甲醇-水（85:15）充分洗涤沉淀，再用丙酮、乙醇充分洗涤后，在40°C真空干燥24h；即得到所述蛋白质分离纯化用磁珠。

具体示例的所述蛋白质分离纯化用磁珠的使用方法：

（6）取上述所述蛋白质分离纯化用磁珠0.3g(湿)，加入0.1mol/l的NiSO₄ 1ml，混匀10min，磁吸去上清，用缓冲液(含0.5mol/L NaCl，20mmol/L 磷酸盐，pH 7.4)洗涤3次(1ml*3)；

（7）加入含有 6His标记的青霉素酰化酶的大肠杆菌细胞破碎液，在4°C恒温混合10min；以及

（8）磁吸去上清，以 1ml 0.5mol/L NaCl溶液(含20mmol/L磷酸盐，pH 7.4)洗涤3次去除杂质，最后加洗脱液(含 0.5mol/L Na Cl和0.5mol/L咪唑，pH 7.4)洗脱三次(0.5ml*3)，合并洗脱液，将洗脱液进行SDS-PAGE电泳，目标蛋白洗脱不掉。

使用现有方法制备的磁珠（CN201610674866.X）做对照试验：

在所述步骤（6）中以现有磁珠替代本发明的所述蛋白质分离纯化用磁珠，对应在所述步骤（8）中，加洗脱液(含 0.5mol/L Na Cl和0.5mol/L咪唑，pH 7.4)洗脱三次(0.5ml*3)，合并洗脱液，得到纯化青霉素酰化酶。将洗脱液进行SDS-PAGE电泳，得到目标蛋白的纯度为95%。

经过对照试验可知，本发明的所述蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖的吸附能力更强，所述蛋白质分离纯化用磁珠能够在用于蛋白质的纯化的同时用于蛋白质的固定化，因而具有更为广泛的应用范围。

本领域的技艺人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。

Claims (17)

1.蛋白质分离纯化用磁珠，其特征在于，所述蛋白质分离纯化用磁珠是外壳为交联壳聚糖，内核为磁粒子的交联壳聚糖包膜结构，其中所述交联壳聚糖具有亚胺二乙酸基团和环氧基团两个功能基团，以使得所述蛋白质分离纯化用磁珠能够基于所述亚胺二乙酸基团与相应二价离子的螯合特异性结合具有聚组氨酸标签的蛋白质而实现对该蛋白质的分离纯化，和基于所述环氧基团与该蛋白质的氨基的共价结合实现对该蛋白质的固定化，如此以在功能上使得所述蛋白质分离纯化用磁珠能够在用于蛋白质的纯化的同时用于蛋白质的固定化。

2.根据权利要求1所述的蛋白质分离纯化用磁珠，其中所述交联壳聚糖的结构为：

。

3.根据权利要求2所述的蛋白质分离纯化用磁珠，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠为在反应体系中加入有磁粉的状态，依以下反应式形成的交联壳聚糖包膜结构：

。

4.根据权利要求1至3中任一所述的蛋白质分离纯化用磁珠，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠为依以下步骤形成的交联壳聚糖包膜结构：

（S1）取壳聚糖、纯水以及冰醋酸充分溶解获得壳聚糖溶液；

（S2）取所述壳聚糖溶液加入磁粉和加入碱性溶液以调节体系的PH至碱性；

（S3）在搅拌条件下于所述步骤（S2）的体系中加入环氧氯丙烷溶液并升温至60℃以上，在催化量十六烷基三甲基溴化铵存在条件下搅拌反应；

（S4）于所述步骤（S3）的体系中加入亚胺二乙酸搅拌反应；以及

（S5）于所述步骤（S4）的体系中加入酸性溶液以调节体系的PH至中性，以在后继基于对沉淀物的洗涤和干燥获得所述蛋白质分离纯化用磁珠。

5.根据权利要求4所述的蛋白质分离纯化用磁珠，其中在所述步骤（S2）中，所述磁粉的规格为300-1000目。

6.根据权利要求5所述的蛋白质分离纯化用磁珠，其中在所述步骤（S5）中，可选地在调节体系的PH至中性后，对沉淀物的洗涤和干燥包括步骤：

（S51）加入2倍体积丙酮沉淀，过滤，加甲醇-水充分洗涤，再用丙酮、乙醇充分洗涤后，真空干燥以获得所述蛋白质分离纯化用磁珠。

7.根据权利要求5所述的蛋白质分离纯化用磁珠，其中在所述步骤（S3）中，在搅拌条件下于所述步骤（S2）的体系中加入环氧氯丙烷溶液并升温至80℃，在催化量十六烷基三甲基溴化铵存在条件下搅拌反应。

8.蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖，其中所述交联壳聚糖的结构为：

。

9.根据权利要求8所述的蛋白质分离纯化用磁珠的交联壳聚糖，其中所述交联壳聚糖依以下反应式形成：

。

10.蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（S1）取壳聚糖、纯水以及冰醋酸充分溶解获得壳聚糖溶液；

（S2）取所述壳聚糖溶液加入磁粉和加入碱性溶液以调节体系的PH至碱性；

（S3）在搅拌条件下于所述步骤（S2）的体系中加入环氧氯丙烷溶液并升温至60℃以上，在催化量十六烷基三甲基溴化铵存在条件下搅拌反应；

（S4）于所述步骤（S3）的体系中加入亚胺二乙酸搅拌反应；以及

（S5）于所述步骤（S4）的体系中加入酸性溶液以调节体系的PH至中性，以在后继基于对沉淀物的洗涤和干燥获得所述蛋白质分离纯化用磁珠。

11.根据权利要求10所述的蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法，其中在所述步骤（S2）中，所述磁粉的规格为300-1000目。

12.根据权利要求11所述的蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法，其中在所述步骤（S5）中，可选地在调节体系的PH至中性后，对沉淀物的洗涤和干燥包括步骤：

（S51）加入2倍体积丙酮沉淀，过滤，加甲醇-水充分洗涤，再用丙酮、乙醇充分洗涤后，真空干燥以获得所述蛋白质分离纯化用磁珠。

13.根据权利要求10至12中任一所述的蛋白质分离纯化用磁珠的制备方法，其中在所述步骤（S3）中，在搅拌条件下于所述步骤（S2）的体系中加入环氧氯丙烷溶液并升温至80℃，在催化量十六烷基三甲基溴化铵存在条件下搅拌反应。

14.蛋白质分离纯化用磁珠的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将所述蛋白质分离纯化用磁珠加入螯合金属离子溶液中搅拌均匀，其中所述蛋白质分离纯化用磁珠是外壳为交联壳聚糖，内核为磁粒子的交联壳聚糖包膜结构，其中所述交联壳聚糖具有亚胺二乙酸基团和环氧基团两个功能基团，以使得所述蛋白质分离纯化用磁珠能够基于所述亚胺二乙酸基团与金属离子的螯合特异性结合具有聚组氨酸标签的蛋白质而实现对该蛋白质的分离纯化，和基于所述环氧基团与该蛋白质的氨基的共价结合实现对该蛋白质的固定化，如此以在功能上使得所述蛋白质分离纯化用磁珠能够在用于蛋白质的纯化的同时用于蛋白质的固定化：

B、在所述步骤A的体系中加入带有聚组氨酸标签的目标蛋白混合液，以使得目标蛋白特异性结合在所述蛋白质分离纯化用磁珠上；以及

C、采用磁性吸附的方式将所述蛋白质分离纯化用磁珠自目标蛋白混合液分离，以在后继通过洗杂的方式获得纯化后的目标蛋白。

15.根据权利要求14所述的蛋白质分离纯化用磁珠的使用方法，其中在所述步骤A中，所述交联壳聚糖的结构为：

。

16.根据权利要求15所述的蛋白质分离纯化用磁珠的使用方法，其中在所述步骤C中，基于反应时间的控制进一步通过洗脱的方式获得分离纯化后的目标蛋白。

17.根据权利要求15所述的蛋白质分离纯化用磁珠的使用方法，其中在所述步骤C中，基于反应时间的控制获得纯化和固定化的目标蛋白。

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