CN107658086A - 一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法，属于生物医学工程领域。该制备方法首先采用溶剂热法制备磁性Fe3O4纳米粒子，利用正硅酸四乙酯和羧基改性的硅烷偶联剂对磁性Fe3O4纳米粒子进行表面改性，并用牛血清白蛋白（BSA）使其表面巯基化，然后加入由柠檬酸三钠还原法制备的金纳米粒子，通过二硫键的形成组装得到Fe3O4@Au核壳复合纳米粒子，最后采用3‑巯基丙酸（MPA）使其表面羧基化，制备得到表面羧基化的金磁核壳复合纳米粒子。该纳米粒子分散性好，稳定性高，磁性能强，平均水合粒径为860.2nm，分布系数PDI为0.103，平均Zeta电位为‑30.1mv，同时红外谱图结果表明该纳米粒子表面含有可进一步发生功能化的羧基基团，拓展了其在靶向药物控释、热疗、细胞与蛋白质分离等生物医学领域的应用潜力。

Description

一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法。
背景技术
磁性纳米粒子，如Fe3O4磁性纳米粒子具有独特的磁学性能和较好的生物相容性，在细胞和生物分子分离、磁共振成像、靶向给药、热疗和干细胞标记等生物医学领域表现出潜在的应用前景。金纳米粒子具有优良的电学、光学性质和良好的生物相容性，易与生物大分子（如蛋白质、核酸、肽）稳定结合，在分子识别和生物标记方面有广泛应用。另外，金纳米粒子具有高光热转化效率，经过静脉注射后，能够富集在肿瘤部位，经近红外光照射后，通过吸收近红外激光能量，能迅速升温“热死”肿瘤细胞。将磁性纳米粒子与金纳米粒子结合形成金磁复合纳米粒子，由于兼具了纳米氧化铁和纳米金的优点而在化学和生物学领域具有更为广阔的应用前景，成为目前研究的热点。然而，作为理想材料的核壳型磁性复合纳米粒子必须具有生物相容性、多重响应性、智能化等优势。
专利CN101145425公开了一种在Fe3O4粒子表面用盐酸羟铵还原金的方法；专利CN200810029399.0和CN 104043438 A公开了一种在超声作用下合成Fe3O4@Au核壳纳米粒子。但这些方法制备的Fe3O4@Au复合纳米粒子，表面没有可反应的功能性基团，如果要进一步与其他材料复合，必须要对其表面进一步修饰。
CN101954085A公开了一种磁靶向热化疗金壳纳米载药系统的制备方法，该专利首先采用化学共沉淀法制备出Fe3O4磁性纳米内核，然后采用自组装—化学镀法在磁性纳米粒的表面镀上一层金壳，再在超声条件下，在金壳的表面形成一层温敏可控的高分子聚合层PNIPAM。本专利拟采用3-巯基丙酸（MPA）对Fe3O4@Au磁性核壳复合纳米粒子进行表面羧基化，改善金磁核壳复合纳米粒子的分散稳定性并促进生物功能化，进而拓展其在生物医学领域的应用潜力。
发明内容
为了促进金磁核壳复合纳米粒子的生物功能化，本发明的目的在于提供一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法，该纳米粒子不仅具有分散稳定性好、磁化性能高，其表面还可以进一步包覆高分子层，为进一步制备多功能化磁性纳米粒子提供反应平台，从而拓展了磁性复合纳米粒子的应用。
本发明首先采用柠檬酸三钠还原法制备Au纳米粒子，采用溶剂热法制备磁性Fe3O4纳米粒子，并用正硅酸四乙酯（TEOS）和羧基改性的氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）改性，然后通过牛血清白蛋白（BSA）修饰组装制备金磁核壳复合纳米粒子，最后通过3-巯基丙酸（MPA）进行表面羧基化。
本发明的目的通过下述方案实现：一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法，包括下述步骤：
（1）Fe3O4纳米粒子的制备：将六水合氯化铁、醋酸铵、柠檬酸三钠溶于乙二醇中，加热至170℃时保持1小时；冷却至室温后，将溶液转移到反应釜中，在200℃反应8～16小时；反应结束后进行磁分离，用无水乙醇和水交替洗涤3～4次，最后分散在无水乙醇中；
（2）Fe3O4纳米粒子的表面改性：① 取马来酸酐置于圆底烧瓶中，冰水浴的条件下逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），放入转子搅拌，待反应物变成白色固体APTES-COOH即停止反应；② 取步骤（1）含 Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和氨水加入到无水乙醇中，分散均匀后置于40℃的水浴锅反应；加入正硅酸四乙酯，反应2h，所述 Fe3O4纳米粒子、氨水、正硅酸四乙酯用量比为1：0.03～1:0.2～10；加入步骤① 的APTES-COOH，再反应7h后结束反应，磁分离或离心分离，用去离子水洗涤3～5次，最后分散在超纯水中，所述的APTES-COOH与Fe3O4纳米粒子的质量比为1～5:1；
（3）Au纳米粒子的制备：将洗净的三口烧瓶用王水浸泡过夜，再用超纯水清洗；将氯金酸溶液置于三口烧瓶中，在冷凝回流下将溶液加热至沸腾；快速加入柠檬酸三钠溶液，反应10min去除热源继续搅拌15min，得到酒红色的溶液即为胶体金溶液，4℃保存待用；
（4）Fe3O4@Au纳米粒子的制备：取步骤（2）含羧基功能化的Fe3O4@SiO2-COOH纳米粒子的水溶液，用PBS缓冲溶液磁分离清洗3～5次，最后分散在PBS缓冲溶液中；加入1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）搅拌30min，再加入N-羟基丁二酰亚胺（NHS）和BSA，反应过夜，用PBS缓冲溶液洗涤3～5次并分散在PBS缓冲溶液中；加入过量的步骤（3）的胶体金溶液，室温搅拌过夜，磁分离或离心分离，用PBS洗涤数次，最后分散在适量PBS中；
所述的1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、BSA与Fe3O4@SiO2-COOH纳米粒子的质量比为2～10:2～10:2～10:1；
（5）Fe3O4@Au表面羧基化：将步骤（4）的Fe3O4@Au纳米粒子磁分离，并用超纯水洗涤3次，最后分散在超纯水中；加入3-巯基丙酸（MPA），用碱溶液调节pH至9～11，室温下搅拌过夜，磁分离或离心分离，用PBS洗涤3～5次，最后分散在PBS中，所述3-巯基丙酸与Fe3O4@Au纳米粒子的质量比为3～20:1。
如上所述的一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法，步骤（5）中的溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液中的一种，碱液浓度为0.1mol/L。
与现有技术相比，本发明的优点为：表面羧基化的核壳型磁性Fe3O4@Au复合纳米粒子具有良好的生物相容性和分散稳定性，且表面富含功能性基团（羧基），可与其他材料进一步复合，具有良好的生物功能性和多重响应性。
附图说明
图1是本发明所制得的Fe3O4@Au/MPA磁性核壳复合纳米粒子的粒径及Zeta电位分布图，左图为Fe3O4@Au/MPA磁性核壳复合纳米粒子的水合粒径分布图，右图为Fe3O4@Au/MPA磁性核壳复合纳米粒子的Zeta电位分布图。
图2是本发明所制得的Au纳米粒子溶液及其紫外-可见吸收光谱图，左图为所制备的金纳米粒子溶液，右图为金纳米粒子的紫外-可见吸收光谱图。
图3是本发明所制得的Fe3O4@Au复合纳米粒子的紫外-可见吸收光谱图。
图4是本发明所制得的Fe3O4@Au纳米粒子的透射电镜图。
图5是本发明所制得的Fe3O4@Au/MPA磁性复合纳米粒子在外磁场作用下的分离图，左图为所制备的Fe3O4@Au/MPA磁性复合纳米粒子溶液，右图为外加磁场后的Fe3O4@Au/MPA磁性复合纳米粒子溶液。
图6是本发明所制得的Fe3O4@Au/MPA磁性核壳复合纳米粒子的红外谱图。
图7是本发明所制得的Fe3O4磁性纳米粒子的透射电镜图。
具体实施方式
为能清楚说明本发明方案的技术特点，下面结合具体实施例，对本发明进行阐述。但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
（1）Fe3O4纳米粒子的制备：1.156gFeCl3·6H2O、3.3012g醋酸铵、0.3424g柠檬酸三钠溶于60mL乙二醇，加热至170℃时保持1小时；冷却至室温后，将溶液转移到反应釜中，在200℃反应8小时；反应结束后进行磁分离，用无水乙醇和水交替洗涤3次，最后分散在无水乙醇中。
（2）Fe3O4纳米粒子的表面改性：① 取1.96g马来酸酐（顺丁烯二酸酐）置于10mL圆底烧瓶中，冰水浴的条件下逐滴加入3.4mL APTES，放入转子搅拌，待反应物变成白色固体（APTES-COOH）即停止反应；② 取含30mg Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和2mL氨水加入到100mL无水乙醇中，分散均匀后置于40℃的水浴锅反应；加入30μL TEOS，反应2h；加入30mgAPTES-COOH，再反应7h后结束反应，磁分离或离心分离，用去离子水洗涤4次，最后分散在超纯水中。
（3）Au纳米粒子的制备：将洗净的三口烧瓶用王水浸泡过夜，再用超纯水清洗；将配置浓度为0.01%（w/v）HAuCl4溶液置于200mL的三口烧瓶中，在冷凝回流下将溶液加热至沸腾；快速加入2mL新配置的1%（w/v）柠檬酸三钠溶液，反应10min去除热源继续搅拌15min，得到酒红色的溶液即为胶体金溶液，4℃保存待用。
（4）Fe3O4@Au纳米粒子的制备：取含10mg羧基功能化的Fe3O4@SiO2-COOH纳米粒子的水溶液，用10mL pH7.4的PBS缓冲溶液磁分离清洗3次，最后分散在10mL PBS缓冲溶液中；加入50mg EDC搅拌30min，再加入50mg NHS和50mg BSA，反应过夜，用PBS缓冲溶液洗涤3次并分散在PBS缓冲溶液中；加入过量的胶体金溶液，室温搅拌过夜，磁分离或离心分离，用0.01M PBS(pH7.4)洗涤数次，最后分散在适量0.01M PBS(pH7.4)中。
（5）Fe3O4@Au表面羧基化：将 Fe3O4@Au纳米粒子磁分离，并用超纯水洗涤3次，最后分散在10mL超纯水中；加入Fe3O4@Au纳米粒子18倍质量的MPA，用0.1mol/L NaOH调节溶液pH至9，室温下搅拌过夜，磁分离或离心分离，用0.01M PBS(pH7.4)洗涤5次，最后分散在0.01MPBS(pH7.4)中。
图1为本实施例所制得Fe3O4@Au/MPA金磁核壳复合纳米粒子的水合粒径分布图，可看出其平均水合粒径为860.2nm，分布系数PDI为0.103，平均Zeta电位为-30.1mv。图2为本实施例所制得Au纳米粒子的紫外-可见吸收光谱图，在520nm处出现强的特征吸收峰。图3为本实施例所制得Fe3O4@Au复合纳米粒子的紫外-可见吸收光谱图，在526nm处出现金的特征吸收峰，可看出金纳米粒子成功包覆在Fe3O4纳米粒子表面。图4为本实施例所制得Fe3O4@Au核壳磁性复合纳米粒子的透射电镜图，可看出内核Fe3O4纳米粒子的平均直径约为170nm，壳层Au纳米粒子的平均直径约为12nm，且该核壳磁性复合纳米粒子分散性好，无团聚。图5为本实施例所制得金磁核壳复合纳米粒子Fe3O4@Au/MPA在外磁场作用下的磁分离图，结果表明该纳米粒子在外磁场作用下能实现快速（5分钟内）分离，这说明其具有较强的磁性，能达到磁性分离的目的。图6为本实施例所制得的表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子Fe3O4@Au/MPA的红外谱图，图中出现较明显的羧基吸收峰（1627cm-1、1400cm-1、963cm-1），说明该纳米粒子粒子表面已成功修饰上了羧基。
实施例2
一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
（1）Fe3O4纳米粒子的制备：1.156gFeCl3·6H2O、3.3012g醋酸铵、0.3424g柠檬酸三钠溶于60mL乙二醇，加热至170℃时保持1小时；冷却至室温后，将溶液转移到反应釜中，在200℃反应16小时；反应结束后进行磁分离，用无水乙醇和水洗涤4次，最后分散在无水乙醇中。
（2）Fe3O4纳米粒子的表面改性：① 同实施例1；② 取含30mg Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和1mL氨水加入到100mL无水乙醇中，分散均匀后置于40℃的水浴锅反应；加入45μL TEOS，反应2h；加入30mg APTES-COOH，再反应7h后结束反应，磁分离或离心分离，用去离子水洗涤3次，最后分散在超纯水中。
（3）Au纳米粒子的制备：将洗净的三口烧瓶用王水浸泡过夜，再用超纯水清洗； 将配置浓度为0.01%（w/v）HAuCl4溶液置于200mL的三口烧瓶中，在冷凝回流下将溶液加热至沸腾；快速加入2mL新配置的1%（w/v）柠檬酸三钠溶液，反应10min去除热源继续搅拌15min，得到酒红色的溶液即为胶体金溶液，4℃保存待用。
（4）Fe3O4@Au纳米粒子的制备：取含10mg羧基功能化的Fe3O4@SiO2-COOH纳米粒子的水溶液，用10mL pH7.4的PBS缓冲溶液磁分离清洗3次，最后分散在10mL PBS缓冲溶液中；加入30mg EDC搅拌30min，再加入30mg NHS和20mg BSA，反应过夜，用PBS缓冲溶液洗涤3次并分散在PBS缓冲溶液中；加入过量的胶体金溶液，室温搅拌过夜，磁分离或离心分离，用0.01M PBS(pH7.4)洗涤数次，最后分散在适量0.01M PBS(pH7.4)中。
（5）Fe3O4@Au表面羧基化：将 Fe3O4@Au纳米粒子磁分离，并用超纯水洗涤3次，最后分散在10mL超纯水中；加入Fe3O4@Au纳米粒子6倍质量的MPA，用0.1mol/L NaOH调节溶液pH至11，室温下搅拌过夜，磁分离或离心分离，用0.01M PBS(pH7.4)洗涤3次，最后分散在0.01M PBS(pH7.4)中。
图7为本实施例所制得Fe3O4纳米粒子的透射电镜图，可看出Fe3O4纳米粒子的平均直径约为350nm，分散性好，无团聚。所制得Fe3O4@Au/MPA金磁核壳复合纳米粒子的平均水合粒径为646.6nm，PDI为0.137，平均Zeta电位为-24.6mv。
实施例3
一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
（1）Fe3O4纳米粒子的制备：1.156gFeCl3·6H2O、3.3012g醋酸铵、0.3424g柠檬酸三钠溶于60mL乙二醇，加热至170℃时保持1小时；冷却至室温后，将溶液转移到反应釜中，在200℃反应10小时；反应结束后进行磁分离，用无水乙醇和水交替洗涤3次，最后分散在无水乙醇中。
（2）Fe3O4纳米粒子的表面改性：① 同实施例1；② 取含30mg Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和2mL氨水加入到100mL无水乙醇中，分散均匀后置于40℃的水浴锅反应；加入30μL TEOS，反应2h；加入60mg APTES-COOH，再反应7h后结束反应，磁分离或离心分离，用去离子水洗涤4次，最后分散在超纯水中。
（3）Au纳米粒子的制备：将洗净的三口烧瓶用王水浸泡过夜，再用超纯水清洗； 将配置浓度为0.01%（w/v）HAuCl4溶液置于200mL的三口烧瓶中，在冷凝回流下将溶液加热至沸腾；快速加入2mL新配置的1%（w/v）柠檬酸三钠溶液，反应10min去除热源继续搅拌15min，得到酒红色的溶液即为胶体金溶液，4℃保存待用。
（4）Fe3O4@Au纳米粒子的制备：取含10mg羧基功能化的Fe3O4@SiO2-COOH纳米粒子的水溶液，用10mL pH7.4的PBS缓冲溶液磁分离清洗3次，最后分散在10mL PBS缓冲溶液中；加入50mg EDC搅拌30min，再加入50mg NHS和50mg BSA，反应过夜，用PBS缓冲溶液洗涤3次并分散在PBS缓冲溶液中；加入过量的胶体金溶液，室温搅拌过夜，磁分离或离心分离，用0.01M PBS(pH7.4)洗涤数次，最后分散在适量0.01M PBS(pH7.4)中。
（5）Fe3O4@Au表面羧基化：将 Fe3O4@Au纳米粒子磁分离，并用超纯水洗涤3次，最后分散在10mL超纯水中；加入Fe3O4@Au纳米粒子12倍质量的MPA，用0.1mol/L KOH溶液调节溶液pH至10，室温下搅拌过夜，磁分离或离心分离，用0.01M PBS(pH7.4)洗涤4次，最后分散在0.01M PBS(pH7.4)中。
所制得Fe3O4@Au/MPA金磁核壳复合纳米粒子的平均水合粒径为757.6nm，PDI为0.200，平均Zeta电位为-28.9mv。
实施例4
一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
（1）Fe3O4纳米粒子的制备：同实施例1。
（2）Fe3O4纳米粒子的表面改性：①同实施例1；② 取含30mg Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和2mL氨水加入到100mL无水乙醇中，分散均匀后置于40℃的水浴锅反应；加入30μL TEOS，反应2h；加入60mg APTES-COOH，再反应7h后结束反应，磁分离或离心分离，用去离子水洗涤4次，最后分散在超纯水中。
（3）Au纳米粒子的制备：同实施例1。
（4）Fe3O4@Au纳米粒子的制备：同实施例1。
（5）Fe3O4@Au表面羧基化：将 Fe3O4@Au纳米粒子磁分离，并用超纯水洗涤3次，最后分散在10mL超纯水中；加入Fe3O4@Au纳米粒子20倍质量的MPA，用0.1mol/L KOH溶液调节溶液pH至10，室温下搅拌过夜，磁分离或离心分离，用0.01M PBS(pH7.4)洗涤4次，最后分散在0.01M PBS(pH7.4)中。
所制得Fe3O4@Au/MPA金磁核壳复合纳米粒子的平均水合粒径为639.4nm，PDI为0.113，平均Zeta电位为-24.6mv。
实施例5
一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
（1）Fe3O4纳米粒子的制备：同实施例1。
（2）Fe3O4纳米粒子的表面改性：① 同实施例1；② 取含30mg Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和2mL氨水加入到100mL无水乙醇中，分散均匀后置于40℃的水浴锅反应；加入45μL TEOS，反应2h；加入60mg APTES-COOH，再反应7h后结束反应，磁分离或离心分离，用去离子水洗涤3次，最后分散在超纯水中。
（3）Au纳米粒子的制备：同实施例1。
（4）Fe3O4@Au纳米粒子的制备：取含10mg羧基功能化的Fe3O4@SiO2-COOH纳米粒子的水溶液，用10mL pH7.4的PBS缓冲溶液磁分离清洗3次，最后分散在10mL PBS缓冲溶液中；加入50mg EDC搅拌30min，再加入50mg NHS和60mg BSA，反应过夜，用PBS缓冲溶液洗涤3次并分散在PBS缓冲溶液中；加入过量的胶体金溶液，室温搅拌过夜，磁分离或离心分离，用0.01M PBS(pH7.4)洗涤数次，最后分散在适量0.01M PBS(pH7.4)中。
（5）Fe3O4@Au表面羧基化：将 Fe3O4@Au纳米粒子磁分离，并用超纯水洗涤3次，最后分散在10mL超纯水中；加入Fe3O4@Au纳米粒子3倍质量的MPA，用0.1mol/LKOH溶液调节溶液pH至9，室温下搅拌过夜，磁分离或离心分离，用0.01M PBS(pH7.4)洗涤4次，最后分散在0.01M PBS(pH7.4)中。
所制得Fe3O4@Au/MPA金磁核壳复合纳米粒子的平均水合粒径为873nm， PDI为0.220，平均Zeta电位为-27mv。
实施例6
一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
（1）Fe3O4纳米粒子的制备：同实施例1。
（2）Fe3O4纳米粒子的表面改性：①同实施例1；② 取含30mg Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和2mL氨水加入到100mL无水乙醇中，分散均匀后置于40℃的水浴锅反应；加入30μL TEOS，反应2h；加入90mg APTES-COOH，再反应7h后结束反应，磁分离或离心分离，用去离子水洗涤3次，最后分散在超纯水中。
（3）Au纳米粒子的制备：同实施例1。
（4）Fe3O4@Au纳米粒子的制备：取含10mg羧基功能化的Fe3O4@SiO2-COOH纳米粒子的水溶液，用10mL pH7.4的PBS缓冲溶液磁分离清洗三次，最后分散在10mL PBS缓冲溶液中；加入30mg EDC搅拌30min，再加入30mg NHS和30mg BSA，反应过夜，用PBS缓冲溶液洗涤3次并分散在PBS缓冲溶液中；加入过量的胶体金溶液，室温搅拌过夜，磁分离或离心分离，用0.01M PBS(pH7.4)洗涤数次，最后分散在适量0.01M PBS(pH7.4)中。
（5）Fe3O4@Au表面羧基化：将 Fe3O4@Au纳米粒子磁分离，并用超纯水洗涤3次，最后分散在10mL超纯水中；加入Fe3O4@Au纳米粒子12倍质量的MPA，用0.1mol/LNaOH调节溶液pH至9，室温下搅拌过夜，磁分离或离心分离，用0.01M PBS(pH7.4)洗涤5次，最后分散在0.01MPBS(pH7.4)中。
所制得Fe3O4@Au/MPA金磁核壳复合纳米粒子的平均水合粒径为761.4nm，PDI为0.143，平均Zeta电位为-24.9mv。

Claims (2)

1.一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：
（1）Fe3O4纳米粒子的制备：将六水合氯化铁、醋酸铵、柠檬酸三钠溶于乙二醇中，加热至170℃时保持1小时；冷却至室温后，将溶液转移到反应釜中，在200℃反应8～16小时；反应结束后进行磁分离，用无水乙醇和水交替洗涤3～4次，最后分散在无水乙醇中；
（2）Fe3O4纳米粒子的表面改性：① 取马来酸酐置于圆底烧瓶中，冰水浴的条件下逐滴加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，放入转子搅拌，待反应物变成白色固体APTES-COOH即停止反应；② 取步骤（1）含 Fe3O4纳米粒子的无水乙醇溶液和氨水加入到无水乙醇中，分散均匀后置于40℃的水浴锅反应；加入正硅酸四乙酯，反应2h；加入步骤① 的APTES-COOH，再反应7h后结束反应，磁分离或离心分离，用去离子水洗涤3～5次，最后分散在超纯水中；
APTES-COOH与Fe3O4纳米粒子的质量比为1～5:1；
所述 Fe3O4纳米粒子、氨水、正硅酸四乙酯用量比为1:0.03～1:0.2～10；
（3）Au纳米粒子的制备：将洗净的三口烧瓶用王水浸泡过夜，再用超纯水清洗；将氯金酸溶液置于三口烧瓶中，在冷凝回流下将溶液加热至沸腾；快速加入柠檬酸三钠溶液，反应10min去除热源继续搅拌15min，得到酒红色的溶液即为胶体金溶液，4℃保存待用；
（4）Fe3O4@Au纳米粒子的制备：取步骤（2）含羧基功能化的Fe3O4@SiO2-COOH纳米粒子的水溶液，用PBS缓冲溶液磁分离清洗3～5次，最后分散在PBS缓冲溶液中；加入1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐搅拌30min，再加入N-羟基丁二酰亚胺和牛血清白蛋白，反应过夜，用PBS缓冲溶液洗涤3～5次并分散在PBS缓冲溶液中；加入过量的步骤（3）的胶体金溶液，室温搅拌过夜，磁分离或离心分离，用PBS洗涤数次，最后分散在适量PBS中；
所述的1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、BSA与Fe3O4@SiO2-COOH纳米粒子的质量比为2～10:2～10:2～10:1；
（5）Fe3O4@Au表面羧基化：将步骤（4）的Fe3O4@Au纳米粒子磁分离，并用超纯水洗涤3次，最后分散在超纯水中；加入3-巯基丙酸，用碱溶液调节pH至9～11，室温下搅拌过夜，磁分离或离心分离，用PBS洗涤3～5次，最后分散在PBS中，所述3-巯基丙酸与Fe3O4@Au纳米粒子的质量比为3～20:1。
2.如权利要求1所述的一种表面羧基化金磁核壳复合纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤（5）中的溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液中的一种，碱液浓度为0.1mol/L。
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