CN104614358A

CN104614358A - 一种基于纳米粒子信号探针的拉曼放大检测凝血酶的方法

Info

Publication number: CN104614358A
Application number: CN201410741458.2A
Authority: CN
Inventors: 李雪梅; 王琳琳; 罗捷
Original assignee: Linyi University
Current assignee: Linyi University
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2015-05-13

Abstract

本发明涉及一种基于纳米粒子信号探针的拉曼放大检测凝血酶的方法，结合DNA滚环复制和核-壳结构的纳米粒子拉曼信号探针来实现双重信号放大。在磁珠表面结合把氨基修饰的DNA，凝血酶适体与其杂交形成双链DNA探针。在凝血酶存在下，与固定在磁珠表面的双链DNA探针结合，释放其中的一条链。留在磁珠上的探针作为引物发生滚环复制反应，生成长链DNA，与所制备的核-壳结构纳米探针上的DNA杂交，捕获拉曼信号探针，通过检测拉曼信号实现凝血酶的检测。该方法具有广泛的适用性，适体与靶蛋白质结合引起的DNA分子机器过程相对比较简单，因此经过改变靶蛋白适体的序列的方法，来间接的检测相应的靶蛋白，此方法可以得到较为广泛的应用。

Description

一种基于纳米粒子信号探针的拉曼放大检测凝血酶的方法

技术领域

本发明为一种基于纳米粒子信号探针的拉曼放大检测凝血酶的方法，结合DNA滚环复制和核-壳结构的纳米粒子拉曼信号探针来实现双重信号放大。

背景技术

表面增强拉曼检测技术具有制样过程比较简单、非入侵和无损等独特的优点。表面增强拉曼检测手段作为高灵敏的检测技术，越来越受到了科学界的关注，广泛应用于特定序列DNA、检测蛋白质、体内原位检测、单碱基错配等生物分析中。由于其光学透明性，使用二氧化硅壳在表面增强拉曼散射（SERS）为基础的生物传感应用提供了许多优势，能够稳定存在于环境介质中，并改善生物相容性。

我们报告了一种新的层层组装法，由二氧化硅、金纳米粒子（AuNP）和SERS信号分子组成。金纳米粒子因为它们通过粒子结构的针孔的表面电磁场定位能力从单个颗粒强增强效果，这种层层组装方法的提出，使得硅胶封装AuNP标签表现出较强的表面增强拉曼光谱信号以及出色的多路复用功能。

发明内容

本发明的目的是：结合DNA滚环复制和核-壳结构的纳米粒子拉曼信号探针来实现双重信号放大检测凝血酶。在磁珠表面结合把氨基修饰的DNA，凝血酶适体与其杂交形成双链DNA探针。在凝血酶存在下，与固定在磁珠表面的双链DNA探针结合，释放其中的一条链。留在磁珠上的探针作为引物发生滚环复制反应，生成长链DNA，与所制备的核-壳结构纳米探针上的DNA杂交，捕获拉曼信号探针，通过检测拉曼信号实现凝血酶的检测。

本发明采用的技术方案为：

制备了金纳米粒子（AuNP），通过层层组装的方法将罗丹明异硫氰酸酯封装在AuNP和SiO2壳之间。由于一个纳米粒子可封装大量的拉曼信号分子，增大了拉曼信号。制备的核壳结构的纳米粒子表面修饰两种DNA链，形成生物条码探针，减少交叉反应。

用磁珠作为载体，在磁珠表面结合把氨基修饰的DNA，凝血酶适体与其杂交形成双链DNA探针。凝血酶与其适体结合释放到溶液中，磁珠表面留下单链DNA探针作为引物。加入锁扣式DNA，在T4 DNA连接酶和Phi 29 DNA聚合酶作用下，留下的DNA链发生滚环复制反应，生成长链DNA。与所制备的核-壳结构纳米探针上的DNA杂交，捕获拉曼信号探针，从而检测拉曼信号（附图1）。

其具体步骤如下：

1) 通过柠檬酸钠还原HAuCl₄的方法制备了纳米金，通过层层组装的方法将罗丹明异硫氰酸酯封装在AuNP和SiO2壳之间。再与比例为10:1的DNA链结合形成生物条码探针。

2）通过羧基与氨基的共价键将一端带有氨基的探针信标固定在羧基功能化的磁性纳米颗粒上，再与凝血酶适体杂交，获得识别探针。

3）将目标凝血酶分子与识别探针混合，在磁珠表面进行杂交后，释放其中的一条链。留在磁珠上的探针作为引物发生滚环复制反应，生成长链DNA，与所制备的核-壳结构纳米探针上的DNA杂交，捕获拉曼信号探针。

4）在外加磁场的作用下将多余的信号纳米粒子探针清洗干净，检测拉曼信号。利用凝血酶的标准溶液获得检测的工作曲线，从工作曲线进行凝血酶实际样品的分析。

本发明与现有技术相比，具有以下特点：

本发明用制备的核壳结构纳米探针包含大量拉曼信号分子，结合DNA滚环复制形成利用双重信号放大，通过拉曼光谱检测，建立了一种高灵敏的拉曼光谱检测凝血酶的方法。相对于现有的检测方法，有以下特点：

(1)通过表面增强拉曼光谱检测，操作简单，灵敏度高。

(2)设计了一种核壳结构纳米探针，包含大量拉曼信号分子，可通过金增强作用进行拉曼信号放大。制备的核壳结构的纳米粒子表面修饰两种DNA链，形成生物条码探针，减少交叉反应。

(3)DNA滚环复制可形成具有重复碱基序列的DNA长链，一个靶分子可以结合大量纳米粒子探针。

(4)双重信号放大提高了检测灵敏度。

四、附图说明

图1.拉曼光谱检测凝血酶方法的示意图

五、具体实施方式

实施例1：核-壳结构的拉曼信号标记纳米粒子制备

在快速搅拌下，将混合拉曼标签(罗丹明异硫氰酸酯) 6μL （1.0×10^-4M）加入到 3mL 的金胶溶液，使该混合物平衡反应 20 分钟。接下来，加入 3mL PAA溶液（4g.L^-1），用0.1M 的 NaOH 调节 pH 值至 7.0，在剧烈搅拌下逐滴加入，并搅拌 3 小时。聚合物包封的纳米球的溶液，进行离心分离两次，以除去过量的聚合物分子，并再分散到水中。加偶联剂 3 - 氨基丙基三甲氧基硅烷加入到该溶液中至终浓度为3×10^-7 M，平衡反应 20 分钟。然后二氧化硅壳长大使用改进的St€ober’s方法，即通过使用氨作为催化剂在醇溶液中的正硅酸乙酯（TEOS）的水解和缩合。简单地说，依次加入17mL 异丙醇和200μL 氨水（25％）。在温和搅拌下，加入 8μL 正硅酸乙酯，把它分成四个部分平均每个部分 1 小时。正硅酸乙酯添加完成后，使该混合物进行反应 12 小时，在 4500 rpm的转速下，将混合物离心分离 15 分钟，清洗三次。最后，析出的染料编码拉曼标签再分散到水中。

实施例2：核-壳结构的拉曼信号标记纳米粒子的DNA功能化

把 200 μL 3-三乙氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐（ TEPSA， 200 mM）加入到 400μL上述核-壳结构水溶液中，反应过夜。羧基修饰的核-壳结构离心洗涤三次，分散到 200 μL PBS（0.1M，pH 7.4）中以供以后使用。把100 μL含有50 mM NHS and 200 mM EDC 溶液加入到核-壳结构的溶液中来激活-COOH基团。孵育2小时后，加入 50 μL的氨基修饰的生物条码探针溶液，静置过夜后，将溶液离心，并用 PBS 洗涤三次，得到洗涤适配体官能化的颗粒，将其分散在800 μL 的PBS 溶液，放在4℃下以备将来使用。

实施例2：磁珠表面探针的固定

用0.1 M，咪唑-HCl缓冲溶液（pH 6.8，3×100μL）将50μL羧基修饰的磁珠的悬浮液（10 mg·mL^-1）洗涤三次。然后把0.1 M的EDC溶液（100μL）加入到该MB溶液中，将混合物在室温下震荡反应20分钟，以激活磁性纳米颗粒的羧酸酯基团。然后加入将氨基修饰的捕获探针和凝血酶适体链(1.0×10-10 mol·L^-1)溶液，将所得混合物于37 ℃下震荡反应12 小时。磁性分离后，用0.1 M PBS 缓冲液把磁性纳米颗粒洗涤三次。洗涤后的MNP/S₁再分散到200μL的PBS溶液。

实施例3：拉曼检测凝血酶

在10μL探针修饰的磁性纳米颗粒分散液中滴入10μL不同浓度的凝血酶溶液反应40分钟。加入10μL锁扣式DNA（10 nM），然后加入T4 DNA连接酶Buffer（400 U/μL，10 mM Tris-HCl，pH 7.4，含10 mM MgCl₂、10 mM DTT和1 mM ATP），室温下孵育30分钟，最后加入T4 DNA连接酶（10×）和去离子水混合，在22 ℃条件下反应1小时。锁扣DNA连接成环状，并把修饰在磁珠上的DNA（S₁）捕获。磁性分离以除去未被捕获的锁扣DNA，加入Phi 29 DNA聚合酶的缓冲溶液（40 mM Tris HCl，pH 7.5，含50 mM KCl、10 mM MgCl₂和5 mM (NH₄)₂SO₄）、Phi 29 DNA聚合酶（0.5 μL，10 U/μL），dNTPs（5 μL，1 mM），在 37 ℃下反应1小时。反应完成后将反应液加热到65 ℃ 10分钟至Phi29聚合酶失活以此终止RCA反应。记录不同浓度凝血酶溶液与样品的拉曼信号，获得凝血酶检测的工作曲线，并求出样品中的凝血酶浓度。

专利中所用DNA序列及修饰基团

Claims

1.一种基于纳米粒子信号探针的拉曼放大检测凝血酶的方法，其特征在于：制备了一种携带有大量拉曼信号分子的核-壳结构的生物条码作为拉曼信号探针；在凝血酶存在下，与固定在磁珠表面的双链脱氧核糖核酸（以下简称DNA）探针结合，释放其中的一条链；留在磁珠上的探针发生滚环复制反应，生成长链DNA，与所制备的核-壳结构纳米探针上的DNA杂交，捕获拉曼信号探针，从而检测拉曼信号。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的方法在磁珠表面结合滚环复制和核-壳结构的纳米粒子信号探针来实现双重信号放大。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的方法用磁珠作为载体，在磁珠表面结合把氨基修饰的DNA，凝血酶适体与其杂交形成双链DNA探针；凝血酶与其适体结合释放到溶液中，磁珠表面留下单链DNA探针作为引物；加入锁扣式DNA，在T4 DNA连接酶和Phi 29 DNA聚合酶作用下，留下的DNA链发生滚环复制反应，生成长链DNA。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于制备了金纳米粒子（AuNP），通过层层组装的方法将罗丹明异硫氰酸酯封装在AuNP和SiO2壳之间；由于一个纳米粒子可封装大量的拉曼信号分子，增大了拉曼信号。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于制备的核壳结构的纳米粒子表面修饰两种DNA链，形成生物条码探针，减少交叉反应。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于检测靶标为凝血酶。