KR102202505B1 - Dna 혼성화에 의해 형성된 계층적 구조의 금속나노큐브 조립체를 이용하는 표면증강라만산란에 의한 표적 물질 검출방법 - Google Patents

Dna 혼성화에 의해 형성된 계층적 구조의 금속나노큐브 조립체를 이용하는 표면증강라만산란에 의한 표적 물질 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조절된 길이의 상보적인 서열의 DNA로 수식된 금속나노입자들의 나노미터 간격으로 이격된, 계층적 구조의 조립체 형성에 의한 전기장 증강을 이용하는 표면증강라만산란에 의한 표적 물질의 검출 방법 및 이를 구현하기 위한 표적 물질 검출용 키트에 관한 것이다.

Description

DNA 혼성화에 의해 형성된 계층적 구조의 금속나노큐브 조립체를 이용하는 표면증강라만산란에 의한 표적 물질 검출방법{Method for detecting target material by SERS using assembly of metal nanocubes with hierarchical structure}
본 발명은 조절된 길이의 상보적인 서열의 DNA로 수식된 금속나노입자들의 나노미터 간격으로 이격된, 계층적 구조의 조립체 형성에 의한 전기장 증강을 이용하는 표면증강라만산란에 의한 표적 물질의 검출 방법 및 이를 구현하기 위한 표적 물질 검출용 키트에 관한 것이다.
최근, DNA 및 단백질과 같은 생물분자의 검출을 위한 몇 가지 고감도 기술이 개발되어 임상적 진단, 질병의 치료 및 약물 발굴에 있어서 현저한 발전을 선도하고 있다. 이들 기술은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer; FRET), 표면플라즈몬공명(surface plasmon resonance; SPR), 전기화학(electrochemistry; EC), 비색법(colorimetry), 및 표면증강라만산란(surface-enhanced Raman scattering; SERS) 등을 기초로 한다. PCR은 고속 대용량 스크리닝 능력 및 높은 감도로 인해 가장 선호되는 기법이나, 상대적으로 비용이 높고 시간이 많이 걸리며, 중합효소-유도 돌연변이나 비-표적 DNA 서열의 원하지 않는 증폭과 같은 단점을 수반하여 그릇된 결과를 도출할 수 있다. 이외에, FRET, SPR, EC, 및 비색법을 포함하는 다른 기법들은 생물검출에 있어서 쉽고 빠른 분석을 허용하나, 초고감도 검출에 있어서는 한계를 갖는다.
이에, 금이나 은과 같은 귀금속 표면에서 국부화된 표면 플라즈몬 공명에 의해 유도되는 전기장 증강에 기초하는 SERS가 이의 초고감도(ultrahigh sensitivity)로 인해 화학적 및 생물학적 검출 분야에서 주목받고 있다. SERS의 민감성을 증가시키는 주된 요소인 전기장 증강은 사용되는 귀금속 표면의 형태에 의존적이다. 전기장 증가에 의해, SERS 기법의 민감성은 단일-분자 수준까지 향상될 수 있다. SERS 활성의 향상 및 조절을 위하여, 분지형, 나노다공성 및 비등방성(anisotropic) 나노구조물은 물론 거칠어진 표면 및 코어/쉘 형식을 갖는 물질과 같은, 다양한 형태의 플라즈몬성 나노구조물이 제조되고 있다. 또한, 전기장은 플라즈몬성 나노구조물 사이의 나노미터-크기의 간극 내에서 플라즈몬 커플링에 의해 현저한 영향을 받는다. 이와 관련하여, SERS 활성 향상을 위한, 리소그래피, 습식 화학 합성, 및 나노구조물의 조립에 의한 분자간- 및 분자내-나노갭을 제조하는, 다양한 나노갭-공학-기반(nanogap-engineering-based) 합성 전략이 연구되고 있다. 그러나, 재현성있고 신뢰할만한 SERS-활성 기재를 제조하기 위한 정확한 간극 공학은 여전히 도전적이다.
본 발명자들은 SERS 효과를 현저하면서도 균일하게 증강시킬 수 있는 나노구조물을 발굴하고, 이를 기반으로 하는 재현성 및/또는 민감성을 갖는 DNA 검출 방법을 제공하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 표적 DNA와의 혼성화에 의해 복합체를 형성할 수 있도록, 표적 DNA의 일부와 상보적인 서열을 갖는 DNA 단편으로 수식된 상대적으로 큰 크기의 자성 마이크로비드 및 표적 DNA의 다른 일부와 상보적인 서열을 갖는 DNA 단편으로 수식된 제1금속나노입자를 결합시킨 후, 상기 제1금속나노입자에 결합된 DNA 단편과 특이적으로 결합할 수 있는 상보적인 서열의 DNA 단편으로 수식된 복수의 제2금속나노입자를 반응시켜 DNA 혼성화에 의해 나노입자 조립체를 형성하되 상기 나노입자로서 큐브형태의 입자를 사용하는 경우, DNA 혼성화에 의한 조립체 형성 속도가 향상되며, 면-대-면으로 인접하여 위치하므로 전체 면에 걸친 균일한 전기장 증강 효과를 나타낼 수 있으므로, 제1금속나노입자에 수식된 DNA 상에 라만활성물질을 표지하고, 제1금속나노입자 및 제2금속나노입자 간의 거리를 이들에 수식된 상보적인 서열의 DNA 단편의 길이로 조절함으로써 현저한 SERS 효과를 발휘할 수 있으므로, 시료 중에 존재하는 미량의 표적 DNA를 보다 민감하고 재현성있게 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 검출하고자 하는 표적 DNA의 일부와 상보적인 제1서열을 포함하는 제1DNA로 표지된 자성 마이크로비드 및 검출하고자 하는 표적 DNA의 나머지 일부와 상보적인 제2서열을 포함하는 제2DNA로 표지된 제1금속나노큐브를, 검출하고자 하는 표적 DNA를 함유하는 것으로 예측되는 검체와 반응시켜, 시료 중 표적 DNA 존재시 DNA 혼성화에 의해 자성 마이크로비드에 하나 이상의 제1금속나노큐브가 결합된 제1복합체를 형성하는 제1단계; 상기 제1복합체를, 상기 제1금속나노큐브에 표지된 제2DNA와 상보적인 제3서열을 포함하는 제3DNA가 수식된 제2금속나노큐브와 반응시켜, 상기 제1금속나노큐브의 자성 마이크로비드와 결합하지 않은 다른 면에 제2금속나노큐브가 결합된 제2복합체를 형성하는 제2단계; 및 상기 제2복합체로부터 표면증강라만산란(surface enhanced Raman scattering; SERS) 신호를 측정하는 제3단계;를 포함하는, 표적 DNA의 검출 방법으로서, 상기 제1금속나노큐브에 수식된 제2DNA는 라만활성물질로 표지되어 있어 제1금속나노큐브와 제2금속나노큐브 사이에 상기 라만활성물질이 위치하여 제1금속나노큐브와 제2금속나노큐브 사이에서의 전기장 증강에 의해 향상된 라만신호를 나타내는 것이 특징인 방법을 제공한다.
본 발명은 소정의 간격으로 이격된 2 이상의 나노구조물이 인접하는 지점에서 전기장 증강에 의하여 SERS 효과를 발휘하는 것과 상보적인 서열을 통해 결합하는 DNA 혼성화의 특이성 및 이중나선 구조 형성에 의한 핵산 갯수에 따른 길이의 일정성을 이용하여 민감하면서도 재현성있고, 정량분석까지 가능한 DNA 검출 방법을 발굴하고자 고안되었다. 구체적으로, 상대적으로 큰 크기의 자성 마이크로비드로부터 표적 DNA와의 혼성화를 통해 종자가 되는 제1금속나노큐브와 결합하고, 이로부터 추가적인 DNA 혼성화에 의해 제2, 제3의 금속나노큐브층을 도입하여 조절된 방식으로 소정의 크기 이내에서 조립체를 확장함으로써 현저히 증강된 SERS 효과를 발휘하되 재현성있는 결과를 얻을 수 있으며, 나아가 서브 펨토몰 수준까지 검출한계가 향상되고 정량분석까지도 가능한 DNA 검출 방법을 발굴한 것이 특징이다.
본 발명의 DNA 검출 방법은 제1단계와 제2단계 사이에 외부로부터 자기장을 인가하고 세척하여 자성 마이크로비드에 결합되지 않은 제1금속나노큐브를 제거하는 제1-1단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제1-1단계를 통해 자성 마이크로비드에 결합되지 않은 즉, 표적 DNA와 혼성화하지 않은 제1금속나노큐브가 이후 단계를 통해 조립체를 형성함으로써 위양성(false-positive) 신호를 발생시키는 것을 방지할 수 있다.
상기 제1금속나노큐브 및 제2금속나노큐브는 각각 독립적으로 금, 은, 백금, 팔라듐 및 구리로 구성된 군으로부터 선택되는 금속으로 된 큐브형의 입자를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때, 상기 제1금속나노큐브 및 제2금속나노큐브는 10 내지 300 nm의 모서리 길이를 갖는 입자로서, 제1금속나노큐브와 제2금속나노큐브의 모서리 길이의 편차는 ±20%를 초과하지 않도록 선택할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 본 발명에서 용어, "큐브(형)"은 가로, 세로, 및 높이의 3방향의 모서리 길이가 모두 같은 정육면체만을 의미하는 것은 아니며, 면-대-면으로 인접하여 조립체를 성장시킬 수 있는 육면체를 제한없이 포함할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 검출 방법에서 사용하는 상기 자성 마이크로비드는 평균 직경 0.5 내지 10 μm의 크기를 갖는 입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 자성 마이크로비드의 사용은 반응에 참여하지 않은 제1금속나노큐브를 제거하기 위한 제1-1단계를 보다 용이하게 수행할 수 있게 할 뿐만 아니라, 상대적으로 큰 크기에 의한 낮은 곡률로 인해 이의 표면 상에서 제1금속나노큐브 및 제2금속나노큐브에 의해 형성되는 조립체 제조시 곡면이 아닌 마치 편평한 표면 상에 조립체를 형성하는 것과 유사한 환경을 제공함으로써, 조립체의 무작위적인 성장을 차단하고, 자성 마이크로입자와 인접하는 면 및 이보다 높은 높이 방향으로만 성장할 수 있도록 제어할 수 있다. 이러한 조절된 성장을 토대로 균일한 신호 증강을 달성하여 정량분석을 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 검출 방법에서 상기 제1서열 내지 제3서열은 각각 독립적으로 6 내지 30개 핵산으로 구성될 수 있다. 특히, 각각 제1금속나노큐브 및 제2금속나노큐브 상에 표지된 제2DNA 및 제3DNA에 포함된 상기 제2서열 및 제3서열을 구성하는 핵산의 수는 조립체를 형성한 상태에서 제1금속나노큐브와 제2금속나노큐브 사이의 거리를 결정하게 되므로, 제2DNA에 표지되어 제1금속나노큐브와 제2금속나노큐브 사이에 위치하는 라만활성물질의 신호 증강에 결정적인 영향을 미친다. 따라서, SERS 효과를 극대화할 수 있는 범위인 1 내지 10 nm의 거리를 유지할 수 있도록 핵산의 갯수를 조절하는 것이 바람직하다. 다만, 핵산의 수가 6 미만으로 적은 경우, 불완전한 결합을 유발하거나 및/또는 쉽게 해리될 수 있어 조립체 구조를 안정적으로 유지하기 어려울 수 있다. 한편, 각각 자성 마이크로비드 및 제1금속나노큐브 상에 표지된 제1DNA 및 제2DNA에 포함된 상기 제1서열 및 제2서열을 구성하는 핵산의 수는 자성 마이크로비드와 금속나노큐브 조립체 사이의 간격을 결정한다. 이때, 자성 마이크로비드와 의 종자가 되는 제1금속나노큐브 사이의 거리가 제1금속나노큐브 및/또는 제2금속나노큐브에 비해 길어지는 경우, 종자가 되는 제1금속나노큐브의 자성 마이크로비드와 인접하는 면의 하단으로 조립체가 성장할 수 있다. 이는 상대적으로 협소한 공간에서 이루어지므로 불균일하며 조절되지 않은 임의의 성장을 유도할 수 있는 바, 전술한 바와 같이, 조절된 성장을 토대로 하는 균일한 신호 증강에 의한 정량분석에 불리하게 작용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 DNA 검출 방법에서 상기 검출하고자 하는 표적 DNA는 10 내지 100개 핵산으로 구성된 것일 수 있다. 상기 표적 DNA는 실질적으로 검출에 참여하는 서열을 의미하는 것으로 실제 검체 중에 존재하는 DNA는 이를 포함하여 더 긴 서열로 구성된, 예컨대, 수 천 내지 수 만개의 핵산으로 구성된 DNA일 수 있다. 본 발명의 검출 방법에 있어서, 표적 DNA를 구성하는 핵산의 수가 10 미만인 경우, 견고한 결합이 어려워 복합체를 형성한 후에도 온도 조건 등에 의해 쉽게 복합체로부터 분리될 수 있어 민감한 검출이 어려울 수 있다. 반면, 100 초과인 경우, DNA 혼성화에 긴 시간을 필요로 할 뿐만 아니라 자성 마이크로 입자와 금속나노큐브 조립체 사이의 거리가 멀어 조립체의 형성 정도를 조절하기 어려워 균일한 신호 증강을 유도하지 못하여 정량분석에 불리할 수 있다.
전술한 바와 같이, 상보적으로 결합하는 핵산의 수를 조절함으로써 이에 의해 결합되는 구조물의 간격을 일정하게 조절하기 위해서는 상기 DNA가 구조물의 표면과 수직이 되도록 위치하는 것을 가정한다. 예컨대, 이것이 보장되지 않은 경우, DNA 혼성화 반응 속도를 장담할 수 없고 균일한 반응 역시 기대하기 어렵다. 따라서, 자성 마이크로비드, 제1금속나노큐브 및 제2금속나노큐브 상에 수식된 제1DNA 내지 제3DNA는 이들 입자와 접하는 방향에 스페이서 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 스페이서 서열은 입자의 표면과 보다 높은 상호작용을 나타내어 표면을 커버함으로써 DNA 혼성화에 관여하는 제1 내지 제3서열을 구성하는 핵산이 표면에 가까이 눕거나 부착되어 DNA 혼성화를 지연할 수 있는 가능성을 차단할 수 있는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위하여 핵산이 아닌 물질을 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명에서는 스페이서 서열로서 A10-PEG를 사용하였으나, 본 발명의 범주가 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 제1 내지 제3DNA는 링커 화합물을 통해 각각의 입자에 결합된 것일 수 있다. 상기 링커 화합물은 상기 제1 내지 제3DNA를 각각의 입자 표면에 부착시키기 위해 DNA의 3' 또는 5' 말단에 연결된 화합물을 의미한다. 이러한 링커 화합물의 유형은 용액에 침전하지 않을 작은 응집체의 나노입자를 생성하는 한 제한되지 않는다. 링커 화합물을 통하여 DNA에 입자를 가교-결합시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다(Feldheim, The Electrochemical Society Interface, Fall, 2001, pp. 22-25 참조). 예컨대, 링커 화합물의 한 말단은 코어 입자 표면에 부착되는 반응기를 보유하는데, 바람직하게 황-함유기, 예컨대 티올기 또는 술프히드릴기(sulfhydryl, HS)이다. 상기 반응기는 알코올 및 페놀의 유도체로서 산소 자리에 황이 포함된 RSH의 식을 가지는 화합물일 수 있다. 또는, 상기 반응기는 각각 RSSR' 또는 RSR'의 식을 가지는 티올 에스테르(thiol ester) 또는 디티올 에스테르(dithiol ester)일 수 있다. 또는, 상기 반응기는 아미노기(-NH2)일 수 있다. 추가적으로, 상기 링커 화합물은 예컨대 -NH2, -COOH, -CHO, -NCO, 및 엑폭사이드기와 같은 다양한 반응기와 연결될 수 있으며, 황-함유기는 금속 예컨대, 금 표면과 결합할 수 있다. 이러한 다양한 반응성 기는 당분야에 공지되어 있고 본 방법에 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "라만활성물질"은 라만분광법에 의해 검출가능한 물질로서, 상기 라만활성물질은 유기 또는 무기 분자, 원자, 복합체 또는 합성 분자, 염료, 천연발생 염료(피코에리스린 등), C60과 같은 유기 나노구조체, 벅키볼, 탄소 나노튜브, 양자점, 유기 형광 분자 등을 포함한다. 구체적으로, 라만활성물질의 예로서, 머캅토벤조산, 아미노티오페놀, FAM, Dabcyl, TRITC(테트라메틸 로다민-5-아이소티오시아네이트), MGITC(말라키트 그린 아이소티오시아네이트), XRITC(X-로다민-5-아이소티오시아네이트), DTDC(3,3-디에틸티아디카보시아닌 아이오다이드), TRIT(테트라메틸 로다민 아이소티올), NBD(7-니트로벤즈-2-1,3-다이아졸), 프탈산, 테레프탈산, 아이소프탈산, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 비오틴, 다이곡시게닌(digoxigenin), 5-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시, 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시로다민, 6-카복시로다민, 6-카복시테트라메틸 아미노 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌(Cy3, Cy3.5, Cy5), 크산틴, 석신일플루오레세인, 아미노아크리딘, 양자점, 탄소동소체, 시아나이드, 티올, 클로린, 브롬, 메틸, 인 또는 황 등이 있으나 이에 제한되지 않고, 사용된 라만활성물질이 뚜렷한 라만 스펙트럼을 나타내어야 한다. 바람직하게는 시아민 계열 형광 유기 분자인 Cy3, Cy3.5, Cy5 또는 FAM, Dabcyl, Rhodamine 계열의 형광분자를 포함하는 유기 형광분자 또는 머캅토벤조산 및 아미노티오페놀을 포함하는 비형광성 라만활성물질들일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 유기 형광분자는 라만 분석 시 사용하는 여기 레이저 파장과 공명하여 더욱 높은 라만 신호의 검출이 가능한 장점이 있으나, 본 발명의 범주가 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 검출 방법은, 상기 제2복합체를, 상기 제2금속나노큐브에 표지된 제3DNA와 상보적인 제2서열을 포함하는 제2DNA가 수식된 제1금속나노큐브와 반응시켜, 제1금속나노큐브와 결합하지 않으면서, 자성 마이크로비드와도 면하지 않는, 제2금속나노큐브의 나머지 면들에 추가적인 제1금속나노큐브들이 결합된 제2-n복합체를 형성하는 제2-n단계(이상 n은 1 이상의 정수)를 추가로 포함할 수 있다.
나아가, 상기 제2-n단계 및 선택적으로 상기 제2단계와 동일하게 수행되는 제2-(n+1)단계를 순차적으로 반복하여 수행할 수 있다. 이때, 상기 추가적으로 수행되는 단계는 최종 생성되는 제2-n복합체 또는 제2-(n+1)복합체로부터 자성 마이크로비드를 제외한, 제1금속나노큐브 및 제2금속나노큐브로된 조립체의 크기가 평균 반경 30 nm 내지 900 nm 이내인 범위에서 형성도록 횟수를 조절하여 반복하여 수행할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 검출 방법은, SERS 효과를 극대화할 수 있도록, 라만활성물질이 표지된 제1금속나노큐브와 제2금속나노큐브 사이의 계면을 수 nm 수준으로 유지하고, 조절된 방식으로 계층적 구조의 조립체를 형성하면서 그 수를 늘려 증가된 라만신호를 측정함으로써 미량의 표적 DNA를 검출하는데 목적이 있다. 따라서, 제1금속나노큐브 및 제2금속나노큐브로 된 층을 교대로 형성함으로써 제1금속나노큐브와 제2금속나노큐브 사이의 계면 수를 급격히 늘릴 수 있다. 다만, 최종 형성되는 조립체의 크기가 라만활성분자를 여기시키기 위해 조사하는 파장보다 커지는 경우 조립체 내부로 침투하는 것이 불가능해져 라만신호 자체를 발생시키지 못할 수 있으므로, 최종 형성되는 조립체의 크기가 이를 초과하지 않도록 조절하는 것이 필요하다. 이에, 통상 라만활성물질의 여기에 사용되는 광원의 파장이 1000 nm 이하의 자외선 내지 근적외선인 것으로 고려하여 조립체의 반경이 900 nm 이하로 유지되는 수준까지 제1금속나노큐브와 제2금속나노큐브의 층을 반복하여 도입할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 전술한 바와 같이, 라만활성물질의 여기에 사용될 파장을 고려하여 결정할 수 있다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 제3단계로부터 측정된 제2복합체에 대한 신호는 동일 파장에서 제1복합체에 대해 측정된 신호에 비해 100배 이상 증강된 신호를 제공할 수 있다. 구체적으로 상기 제1복합체는 자성 마이크로비드에 라만활성물질이 표지된 제1금속나노큐브가 결합된 것으로 이로부터 측정되는 신호는 라만활성물질 자체에 의한 신호일 수 있다. 다만, 하나의 제1금속나노큐브에 복수에 라만활성물질이 표지되며, 하나의 자성 마이크로비드 상에는 상기 제1금속나노큐브가 여러개 부착될 수 있으므로, 단일 라만활성물질의 신호가 아닌 라만활성물질 총 수에 대해 비례적으로 증가된 수치일 수 있다. 반면, 제1복합체는 제1금속나노큐브의 5개 면에 수 nm 간격으로 결합된 제2금속나노큐브를 포함하며, 이에 따라 이들 계면에서 SERS 효과를 발휘할 수 있으므로, 단순한 라만활성물질의 신호의 합이 아닌 계면에서 증강된 전기장에 의해 시너지적으로 향상된 신호의 합으로 나타날 수 있으며, 이에 따른 신호는 상기 제1복합체에 의해 측정된 값에 비해 100배 이상 증강되어 나타날 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 1면에는 검출하고자 하는 물질의 다른 일부와 특이적으로 결합하는 제1생체물질을 포함하며, 다른 5면에는 제1'DNA로 표지된 제1'금속나노큐브를 준비하는 제1단계; 검출하고자 하는 물질의 일부와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제1생체물질로 표지된 자성 마이크로비드 및 상기 제1단계로부터 준비한, 1면에는 검출하고자 하는 물질의 다른 일부와 특이적으로 결합하는 제1생체물질을 포함하며, 다른 5면에는 제1'DNA로 표지된 제1'금속나노큐브를, 검출하고자 하는 물질을 함유하는 것으로 예측되는 검체와 반응시켜, 시료 중 표적 물질 존재시 특이적인 결합에 의해 자성 마이크로비드에 하나 이상의 제1'금속나노큐브가 결합된 제1'복합체를 형성하는 제2단계; 상기 제1'복합체를, 상기 제1'금속나노큐브에 표지된 제1'DNA와 상보적인 서열을 포함하는 제2'DNA가 수식된 제2'금속나노큐브와 반응시켜, 상기 제1금속나노큐브의 자성 마이크로비드와 결합하지 않은 다른 면에 제2'금속나노큐브가 결합된 제2'복합체를 형성하는 제3단계; 및 상기 제2'복합체로부터 표면증강라만산란 신호를 측정하는 제4단계;를 포함하는, 표적 물질의 검출 방법으로서, 상기 제1'금속나노큐브에 수식된 제1'DNA는 라만활성물질로 표지되어 있어 제1'금속나노큐브와 제2'금속나노큐브 사이에 상기 라만활성물질이 위치하여 제1'금속나노큐브와 제2'금속나노큐브 사이에서의 전기장 증강에 의해 향상된 라만신호를 나타내는 것이 특징인 방법을 제공한다.
제2단계 및 제3단계는 역의 순으로 실시하여, 제1'금속나노큐브를 제2'금속나노큐브와 먼저 결합시킨 후, 제1생체물질로 표지된 자성 마이크로비드 및 시료와 반응시키는 것인, 표적 물질의 검출 방법.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 검출하고자 하는 표적 물질의 일부와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제1생체물질로 표지된 자성 마이크로비드; 1면에는 검출하고자 하는 물질의 다른 일부와 특이적으로 결합하는 제1생체물질을 포함하며, 다른 5면에는 제1'DNA로 표지된 제1금속나노큐브; 및 상기 제1'금속나노큐브에 표지된 제1'DNA와 상보적인 서열을 포함하는 제2'DNA가 수식된 제2'금속나노큐브를 포함하는, SERS에 의한 표적 물질 검출용 키트를 제공한다.
구체적으로, 표적 물질로서 DNA 검출을 위하여, 본 발명의 키트에 포함된 상기 자성 마이크로비드는 검출하고자 하는 표적 DNA의 일부와 상보적인 제1서열을 포함하는 제1DNA로 표지되고, 제1'금속나노큐브는 검출하고자 하는 표적 DNA의 나머지 일부와 상보적인 제2서열을 포함하고 라만활성분자가 결합된 제2DNA로 표지되며, 제2'금속나노큐브는 상기 제1금속나노큐브에 표지된 제2DNA와 상보적인 제3서열을 포함하는 제3DNA가 수식된 것일 수 있다.
예컨대, 본 발명에 따른 표적 DNA 검출용 키트는 DNA 혼성화에 적합한 환경을 제공할 수 있도록 완충액과 함께 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 완충액으로는 당업계에 널리 사용되는 완충액 예컨대, PBS, PBSS 등의 인산계 완충액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
나아가, 본 발명에 따른 표적 DNA 검출용 키트는 서열 특이적이며 순차적인 일련의 DNA 혼성화에 의해 현저히 증강된 라만 신호를 제공하는, 계층적이며 크기 및/또는 간격이 조절된 나노큐브의 조립체를 형성함으로써 높은 민감성으로 표적 DNA를 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 키트를 이용한 표적 DNA의 검출은 전술한 본 발명의 표적 DNA 검출 방법에 따라 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 본 발명의 표적 DNA와의 상보적인 결합에 의한 복합체의 형성 및 추가적인 DNA의 상보적인 결합을 이용한 증가된 갯수의 나노큐브를 포함하는 계층적이며 크기 및/또는 간격이 조절된 나노큐브 조립체의 형성에 의해 달성되는 높은 민감성으로 표적 DNA를 검출하는 원리, 즉, 본 발명은 DNA의 검출에만 제한되는 것은 아니며, DNA를 대신하여 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 수식한 자성 마이크로비드 및 금속나노큐브를 이용함으로써, 상호 특이적인 결합을 형성하는, 항원-항체 간의 결합 또는 리간드-수용체 간의 결합을 이용한 표적 분석물질의 검출에 제한없이 적용될 수 있다.
예컨대, 나노큐브 조립체 제조를 위하여 금속나노큐브의 표면에 DNA를 표지하기에 앞서, 금속나노큐브의 표면을 SDS 등으로 개질하여 음전하를 띄도록 함으로써 APTES((3-aminopropyl)triethoxysilane) 등으로 기능화된 유리 또는 실리콘 웨이퍼 기재에 큐브의 일면을 통해 정전기적으로 부착되도록 유도할 수 있으며, 이후 DNA를 표지함으로써 기재에 접한 면을 제외한 나머지 5개 면에 선택적으로 DNA가 표지되도록 할 수 있고, 이와 같이 선택적으로 DNA 표지된 금속나노큐브는 초음파 처리 등 물리적 자극을 가하여 기재로부터 탈착시킬 수 있다. 따라서, 이와 같이 제조한 1개 면을 제외한 5개 면에 선택적으로 DNA 표지된 금속나노입자를 이용함으로써 DNA가 표지되지 않은 1개 면에 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 도입할 수 있으므로, 본 발명의 금속나노큐브 조립체는 DNA의 상보적인 결합은 물론, 상호 특이적으로 결합하는 항원-항체 반응, 리간드와 수용체의 반응 등을 통해 SERS를 기반으로 하는 표적 물질의 검출에 적용할 수 있다.
본 발명의 검출 방법은 종래 구형의 금속나노입자를 이용하는 대신에 금속나노큐브를 사용함으로써 전체 면적에 걸친 면-대-면 상호작용에 의해 보다 빠른 결합 속도로 조립될 수 있을 뿐만 아니라, 전체 면적에 걸친 고른 전기장 증강 효과를 나타내므로 균일한 신호증강을 구현할 수 있으므로 100 aM 내지 10 pM 범위의 미량의 표적 DNA를 보다 빠른 시간 이내에 민감하게 정량적으로 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 검출을 위한 계층적-나노큐브-조립체-기반 표면증강라만산란(hierarchic-nanocube-assembly-based surface enhanced Raman scattering; H-Cube-SERS) 어세이의 원리를 도식화하여 나타낸 도이다. 표적 DNA(target DNA, hepatitis A virus; HAV) 가닥의 존재 하에, 표적-포획 Au 나노큐브(target-capturing Au nanocube; TC-AuNC) 및 DNA-개질된 자성 마이크로입자(DNA-modified magnetic microparticle; DNA-MMP)는 샌드위치-혼성화(sandwich-hybridization)를 통해 "TC-AuNC"-"MMP" 복합체(NC-복합체-1)를 형성하므로(표적 포획 단계; target-capturing step), TC-AuNC 상의 라만 분자(Cy3)로부터 표면증강라만산란 신호를 제공할 수 있다. 그러나, NC-복합체-1의 SERS 신호 세기는, 플라즈몬성 커플링의 부재로, 너무 약하여 낮은 농도의 표적 DNA는 검출하기 어렵다. 신호-증폭 Au 나노큐브(signal-amplifying Au nanocube; SA-AuNC)와의 혼성화에 의해 조립된 플라즈몬성 AuNC 클러스터(NC-complex-2)를 형성할 때, SERS 신호 세기는, AuNC 클러스터의 조립된 영역에서의 강한 플라즈몬성 커플링에 의해, 높이 증강되었다(신호 증폭 단계; signal-amplifying step). 따라서, 표적 DNA에 대한 민감도는 현저히 향상되었으며, 낮은 검출 한계(limit of detection; LOD)를 유도하였다.
도 2는 50 nm 크기의 AuNC 및 AuNS의 DNA 로딩 능력의 정량분석을 위한 Cy3-표지된 DNA 가닥(파란색 도트)의 기지 농도에 대한 형광(Cy3) 신호 세기의 표준 곡선(Standard curve, 빨간색 선)을 나타낸 도이다. AuNC(검은색 도트) 및 AuNS(빨간색 도트)로부터 탈착된 DNA 형광 신호 세기를 표준 곡선 상에 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조립된 AuNC 클러스터의 TEM 이미지를 나타낸 도이다. 스케일 바는 50 nm이다.
도 4는 (a 내지 c) AuNC 및 AuNS의 합성과 이들의 분광학적 특성 및 (d) AuNC를 이용한 DNA 서열 특이적 혼성화에 의한 AuNC 조립체의 제조 및 이들의 특성을 나타낸 도이다. (a 및 b)는 각각 합성된 나노입자, AuNC 및 AuNS의 TEM 이미지이다. 50 nm 크기의 AuNC(모서리 길이) 및 AuNS(길이)가 95% 이상의 고수율로 균일하게 합성되었다. (c)는 합성된 나노입자들의 UV-vis 스펙트럼을 나타낸다. AuNC 및 AuNS에 대해 각각 563 nm 및 529 nm에서 예리한 소광 피크가 나타났다. (d 내지 g)는 표적 DNA 가닥 및 SA-AuNC의 선택적인 포획을 위한 DNA-서열-특이적 혼성화 능력을 나타낸다. (d 및 f)는 각각 표적 포획 단계 이후와 신호 증폭 단계 이후 외부 자기장을 이용하여 회수한 어세이 용액의 UV-vis 스펙트럼에서의 변화를 나타낸다. 삽입도는 DNA 혼성화 이후 자기장 하에서 어세이 용액의 색을 나타낸다. (e 및 g)는 각각 표적 포획 단계 동안 상이한 링커 DNA에 의해 형성되는, 신호 증폭 단계 동안 상이한 SA-AuNC에 의해 형성되는 서열 특이적 샌드위치 혼성화 복합체의 TEM 이미지이다. 상보적인 표적 DNA 또는 SA-AuNC 존재 하에, 어세이 용액은 무색으로 변하였으며, UV-vis 소광 피크 세기는 급격히 감소하였다. 이는 각각 DNA-서열-특이적 NC-복합체-1 또는 NC-복합체-2의 형성을 나타낸다. DNA-서열-특이적 혼성화에 의해 형성되는 AuNC-MMP 복합체를 TEM 이미지 상에서 명확히 확인할 수 있다.
도 5는 DNA-개질된 나노입자의 형태(곡률) 효과-유도 결합 및 및 이의 해리 특성을 나타낸 도이다. (a)는 DNA-개질된 Au 나노입자 간의 혼성화에 대한 형태(곡률) 효과를 도식화하여 나타낸 도이다. 구조적 특성으로 인해, AuNC(편평한 표면)의 경우, 혼성화에 참여하는 DNA 가닥("유효 결합 DNA 가닥"으로 지칭)의 수는 AuNS(볼록한 표면)의 경우에 비해 더 높으며, 이는 형태(곡률) 효과가 발생함을 나타낸다. "유효 결합 DNA 가닥"의 수는 DNA-개질된 나노입자의 결합 및 해리 특성에 영향을 미친다. 즉, 더 높은 수의 "유효 결합 DNA 가닥"은 보다 빠른 결합 속도 및 보다 높은 용융전이온도를 유도한다. (b 및 c)는 각각 도 1에 나타난 표적-포획 및 신호-증폭 단계 동안의 구조-의존적 DNA 결합 속도론을 나타낸다. TC-탐침이 MMP와 혼성화할 때(b, 표적-포획 단계), 각각의 TC-탐침의 결합 속도론은, 마이크론 크기의 MMP의 거친 표면으로 인한 과다한 결합 자리로 인해, 나노탐침의 형태와 무관하게 유사하다. 반대로, 큐브형 나노탐침(SA-AuNC)은, 나노탐침 사이의 DNA 혼성화에 대한 보다 높은 수의 "유효 결합 DNA 가닥"의 존재로 인해, 구형 나노탐침(SA-AuNS)에 비해 더 높은 결합 속도를 나타내었다(c, 신호-증폭 단계). (d)는 나노탐침 응집체의 구조 의존적 해리를 나타낸다. AuNC 응집체는, 형태(곡률) 효과로 인해, AuNS 응집체에 비해 보다 높은 녹는점( T m ) 및 보다 좁은 용융전이온도 범위를 나타내었다. 삽입도는 AuNC 및 AuNS 응집체의 해리(변성) 곡선의 1차 미분을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 혼성화에 의한 MMP와 금 나노큐브의 결합에 따른 어세이 용액의 UV-vis 스펙트럼을 혼성화 시간의 함수로서 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 응집된 AuNC의, 용액의 온도에 따른, 용액 색상 및 UV-vis 스펙트럼 변화를 나타낸 도이다.
도 8은 3D-조립된 플라즈몬성 나노탐침 클러스터를 이용한 SERS-기반 초민감성 DNA 검출을 나타낸 도이다. (a)는 표적 DNA(HAV, 100 aM 내지 10 pM) 및 비-상보적 표적 DNA(HBV, 10 pM)의 농도에 따른 AuNC-MMP 복합체(NC-복합체-1 및 NC-복합체-2)의 SERS 신호 세기 플롯을 나타낸다. 형성된 AuNC 클러스터의 SERS 신호 세기는 클러스터의 조립된 부분에서의 강한 플라즈몬성 커플링에 의해 고도로 증강되어(빨간색 도트), 향상된 LOD를 나타내었다. 대조 실험(파란색 및 초록색 도트)과 비교하여, NC-복합체-1 및 NC-복합체-2에 대한 LOD는 각각 1 pM 및 100 aM이다. (b)는 표적 DNA 가닥의 농도에 따른 AuNC-MMP 복합체(NC-복합체-1 및 NC-복합체-2)의 SERS 스펙트럼을 나타낸다. (c)는 표적 DNA 가닥(HAV, 100 aM 내지 10 pM) 및 비-상보적 표적 DNA(HBV, 10 pM)의 농도에 따른 AuNC- 및 AuNS-MMP 복합체(NC-복합체-2 및 NS-복합체-2)의 SERS 신호 세기 플롯을 나타낸다. NS-복합체-2의 경우, 비효율적인 결합(혼성화) 및 불균일한 플라즈몬성 커플링으로 인해, NS-복합체-2와 비교하여, SERS 신호 세기는 보다 낮았으며, 보다 높은 표준 편차를 나타내었다. 모든 스펙트럼은 633 nm(190 μW)의 여기 레이저를 이용하여 10초의 수집시간(acquisition time)으로 획득하였으며, 500 내지 1,800 cm-1의 파수(wavenumber)에 대해 기록하였다.
도 9는 단일 플라즈몬성 나노입자 및 3D-조립된 나노입자 클러스터의 전기적 근접장의 경계요소법(boundary element method; BEM) 시뮬레이션 결과를 나타낸다. (a 내지 c)는 각각 단일 AuNC, 3D-조립된 AuNC 클러스터, 및 (c) 3D-조립된 AuNS 클러스터에 대한 전기적 근접장 분포의 2D(상단) 및 3D(하단) 플롯을 나타낸다. 삽입도는 BEM 시뮬레이션에 사용된 3D 구조적 모델을 나타낸다. 파란색-음영된 영역은 전기장을 평가한 평면(y-z 평면)을 나타낸다. 모든 경우에서, x-방향에서 선형으로 편광된 빛(linearly polarized light)(파장 633 nm)은 z-방향으로 조사되었다. (b)에 나타난 3D-조립된 AuNC 클러스터의 경우, 전기장은, (a)에 나타난 단일 AuNC의 경우와 달리, 면-대면 계면에서의 강한 플라즈몬성 커플링으로 인해, AuNC 클러스터의 조립된 부분에서 눈에 띄게 보다 강하게 나타났다. 또한, 넓은 영역에 걸쳐 강한 전기장을 유도하는 면-대-면 계면에서의 플라즈몬성 커플링과 달리, AuNS의 경우 형성되는 점-대-점 접점은, AuNS의 볼록한 표면으로 인해, (c)에 나타난 바와 같이, 단지 좁은 국부적 지점에서만 전기장 증강을 유도하였다. (d 내지 i)는 3D-조립된 클러스터에 대한 전기적 근접장 분포의 2D 플롯을 나타낸다. 구체적으로, (d 내지 f)는 AuNC에 대한, (g 내지 i)는 AuNS에 대한 결과이다. 파란색 음영의 영역은 평가되는 전기장의 평면을 나타낸다: (d 및 g)는 y-z 평면, (e 및 h)는 x-z 평면, 및 (f 및 i)는 x-y 평면. 모든 경우에서, x-방향에서 선형으로 편광된 빛(파장 633 nm)은 z-방향으로 조사되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<시약 및 물질>
자성 마이크로입자(Dynabeads® MyOne™ Carboxylic Acid, 평균 직경 1 mm)를 인비트로젠 다이날 에이에스사(Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway)로부터 구입하였다. HPLC-정제된 올리고뉴클레오티드는 IDT사(IDT, Inc., Coralville, IA, USA)로부터 구입하였다. 염화금(III) 삼수화물(gold(III) chloride trihydrate; HAuCl4·3H2O, ≥99.9%), 브롬화세틸트리메틸암모늄(cetyltrimethylammonium bromide; CTAB), 염화벤질디메틸헥사데실암모늄(benzyldimethylhexadecylammonium chloride; BDAC), L-아스코르브산(L-ascorbic acid; AA, ≥99.9%), DL-디티오트레이톨(DL-dithiothreitol; DTT, ≥99.0%), 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate; SDS, ≥98.5%), 2-(N-몰포리노)에탄술폰산(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid; MES, ≥99.0%), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 염산염(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride; EDC, commercial grade), 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA, 99.4-100.06%), 시안화칼륨(potassium cyanide; KCN, ≥96.0%), 및 트윈-20(Tween®-20)은 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 염화세틸트리메틸암모늄(cetyltrimethylammonium chloride; CTAC)은 도쿄화학공업사(Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan)로부터 구입하였다. 수소화붕소나트륨(Sodium borohydride; NaBH4, 97.0%) 및 브롬화나트륨(sodium bromide; NaBr, ≥99.0%)은 각각 대정화학 & 금속사(DAEJUNG Chemicals & Metals Co., Siheung, Gyeonggi, Korea) 및 삼전순수화학사(Samchun Pure Chemical Co., Pyungtack, Gyeonggi, Korea)로부터 구입하였다. 모든 화학 약품은 추가적인 정제 없이 사용하였다. 모든 실험에는 NANO퓨어 워터(Millipore, Milli-Q 18.2 MQ.cm)를 사용하였다.
<특성분석방법>
합성된 나노탐침 및 AuNC 조립된 클러스터의 형태를 TEM 시스템(H-7600, Hitachi)을 사용하여 확인하였다. UV-vis 스펙트럼은 UV-vis 분광광도계(HP 8453, Agilent Technologies)를 사용하여 획득하였다. DNA-로딩 용량(DNA-loading capacity)의 정량화를 위한 형광 측정은 형광광도계(fluorophotometer, FP-8300, JASCO Inc.)를 사용하여 수행하였다.
제조예 1: 50 nm 크기의 Au 나노스피어(AuNS)의 합성
변형된 종자-매개 성장법을 이용하여 금 나노스피어(gold nanosphere; AuNS)를 합성하였다(Zheng, Y. et al., Part. Part. Syst. Charact., 2014, 31: 266-273). 구체적으로, i) CTAB-캡핑된 Au 종자를 합성하고, ii) 10 nm 크기의 AuNS를 합성한 후, iii) 50 nm 크기의 AuNS로 성장시키는, 하기 3단계의 반응을 수행하여 50 nm 크기의 AuNS를 합성하였다.
먼저, 50 mL 둥근바닥 플라스크에 CTAB 수용액(200 mM, 5 mL)과 HAuCl4 수용액(0.5 mM, 5 mL)을 27℃에서 교반(300 rpm)하면서 혼합하였다. 즉석에서 준비한 NaBH4 수용액(10 mM, 0.6 mL)을 상기 플라스크에 빠르게 투입하였으며, 이후 혼합물은 즉시 갈색으로 변하였다. 상기 반응 혼합물을 300 rpm에서 3분 동안 교반한 후, 교반없이(without agitation) 27℃에서 3시간 동안 인큐베이션하여, CTAB-캡핑된 Au 종자를 합성하였다.
다음으로, 상기 수득한 CTAB-캡핑된 Au 종자 50 μL를 CTAC 용액(200 mM, 2 mL) 및 AA 용액(100 mM, 1.5 mL) 혼합물에 첨가하였다. 이어 상기 반응 혼합물에 HAuCl4 수용액(0.5 mM, 2 mL)을 빠르게 주입하고, 27℃에서 300 rpm으로 15분 동안 교반하였다. 20,000 ×g에서 30분 동안 원심분리하여 생성물을 증류수로 1회 세척하여, 10 nm 크기의 AuNS를 합성하였다. 이후 사용을 위하여, CTAC 용액(20 mM, 1 mL)에 분산시켰다.
마지막으로, 실린지 펌프를 사용하여 2 mL/h의 주입속도로, CTAC 용액(100 mM, 2 mL), AA 용액(10 mM, 130 μL), 및 상기 수득한 10 nm 크기의 AuNS(6 μL)의 혼합물에 HAuCl4 수용액(0.5 mM, 2 mL)을 투입하였다. HAuCl4 용액을 투입하는 동안, 반응 혼합물은 27℃에서 500 rpm으로 계속 교반하였다. 결과로 수득한 용액을 4,000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 증류수로 2회 세척하여 50 nm 크기의 AuNS를 수득하였다.
제조예 2: 50 nm 크기의 Au 나노큐브(AuNC)의 합성
50 nm 크기의 금 나노큐브(gold nanocube; AuNC)를 합성하기 위하여, 20 mL 바이알에 CTAC 수용액(100 mM, 6 mL), NaBr 수용액(20 mM, 30 μL), 및 AA 수용액(10 mM, 390 μL)을 27℃에서 500 rpm으로 계속 교반하면서 혼합하였다. 상기 제조예 1에서와 같이 준비한 10 nm 크기의 AuNS(3.9 O.D.) 10 μL를 상기 혼합물에 첨가하였다. 이어서 HAuCl4 수용액(0.5 mM, 6 mL)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을500 rpm으로 25분 동안 교반한 후, 정치시켰다(left undisturbed). 4,000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 생성물을 2회 세척하고, 최종 부피를 1 mL로 조절하였다. 고수율로 AuNC를 수득하기 위하여, 공지된 방법에 따라 정제 단계를 수행하였다(Park, K. et al., Nano Lett., 2010, 10: 1433-1439). 먼저, 합성한 50 nm 크기의 AuNC를 최종 농도가 1 mM이 되도록 CTAB 용액에 분산시켰다. 이어서, CTAB 용액에 분산된 상기 AuNC의 분산액 100 μL을 100 μL의 BDAC 용액(180 mM)과 혼합하고, 결과로 얻은 혼합물을 30℃에서 교반하지 않고 밤새도록 정치시켰다. 최종적으로, 상층액을 조심스럽게 제거하고, 4,000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛을 증류수로 2회 세척하였다.
제조예 3: DNA-수식된 자성 마이크로입자(DNA-MMP)의 제조
제조사의 지시에 따라 DNA-수식된 자성 마이크로입자(DNA-modified magnetic microparticle; DNA-MMP)를 준비하였다. 5' 말단에 아민기가 수식된 올리고뉴클레오티드(서열번호 1: 5'-NH2-A10-PEG6-AGAAAGAGGAGTTAA-3')를 카르복실 작용기로 코팅된 MMP에 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 커플링을 통해 부착시켰다. 구체적으로, 200 μL의 MMP 용액(10 mg/mL)을 100 mM MES 완충액(pH 4.8)으로 2회 세척하고, 20 μL의 MES 완충액에 재분산시켰다. 이후, 10 μL의 아민-수식된 올리고뉴클레오티드(1 mM) 및 10 μL의 1 M EDC 용액(MES 완충액)을 상기 MMP 분산액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반(shaken)하였다. 이와 같이 제조된 DNA-수식된 MMP는 세척 완충액(250 mM, Tris pH 8.0, 0.01% Tween®-20)으로 3회 세척하여, 200 μL의 Tris-EDTA 완충액(10 mM, Tris pH 8.0, 1 mM EDTA)에 재분산시켰다.
제조예 4: DNA-수식된 AuNC 및 AuNS의 제조
표적 포획(target capturing; TC)-탐침으로서 금 나노큐브(TC-AuNC) 및 금 나노스피어(TC-AuNS), 약간 변형된 염숙성법(salt-aging method, J. Am. Chem. Soc., 2000, 122: 9071-9077)을 이용하여 50 nm 크기의 AuNC 및 AuNS의 표면에 형광체인 Cy3가 표지된 DNA 가닥(서열번호 2: 5'-TCCATGCAACTCTAA-A10-Cy3-SH-3')을 부착시켰다. AuNC 및 AuNS 상에 DNA 가닥을 도입하기에 앞서, 합성된 50 nm 크기의 AuNC 및 AuNS를 0.1%(wt/vol) SDS 용액으로 3회 세척하였다. 먼저, 디설파이드-수식된 올리고뉴클레이티드를 0.17 M 인산 완충액(pH 8.0)으로 제조된 0.1 M DTT 용액에 의해 환원시키고, 탈염화(desalting) NAP-5 컬럼(Sephadex™ G-25 DNA Grade, GE Healthcare, UK)으로 정제하였다. 50 nm 크기의 나노입자(AuNC 및 AuNS) 분산액에 과량의 정제된 올리고뉴클레오티드(나노입자 수의 2×105배)를 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 상기 용액은 10 mM의 최종 인산 농도(pH 7.4) 및 0.1%(wt/vol)의 SDS 농도가 되도록 조절하였다. 이후 상기 용액을 실온에서 1시간 동안 서서히 교반하였다. 상기 혼합물에 염화 용액(2 M NaCl, 10 mM PB, 0.1% SDS) 6개 분액을 매 시간마다 첨가하여 0.3 M NaCl 용액이 되도록 조절하였다. 염숙성 과정 동안, 금 표면 상에서 DNA의 비특이적인 상호작용을 최소화하기 위하여 혼합물을 60℃의 수조에서 인큐베이션하였다. 상기 염화 단계 후, 혼합물을 실온에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 이후 혼합물을 4,000 ×g에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 제거하였다. 침전물은 0.3 M 인산염-완충염수(phosphate-buffered saline solution; PBSS, 10 mM PB, 0.3 M NaCl, 0.01% SDS, pH 7.4)에 재분산시켰다. 상기 세척 단계를 2회 반복하여 수행하였다. 상기 DNA 가닥을 형광체를 불포함하는 서열번호 3의 DNA 가닥(TTAGAGTTGCATGGA-A10-SH)으로 대체하는 것을 제외하고는 TC-AuNC 및 TC-AuNS와 동일한 방법으로, 신호 증폭(signal amplifying; SA)-탐침, 예컨대, SA-AuNC 및 SA-AuNS를 제조하였다.
실시예 1: 금 나노큐브를 이용한 SERS용 나노탐침 응집체의 제조 및 이의 구조의존적 DNA 결합 속도론(binding kinetics)
도 1의 표적-포획 단계(target-capturing step)에 상응하는, DNA-수식된 자성 마이크로입자(DNA-MMP)와 DNA-수식된 AuNC 및 AuNS와의 복합체(각각 NC-복합체-1 및 NS-복합체-1로 표기)의 형성에 있어서 구조의존적 DNA 결합 속도를 확인하기 위하여, DNA-MMP(10 mg/mL, 1 μL)를 검출하고자 하는 표적 DNA(HAV DNA, 서열번호 4: 5'-TTAGAGTTGCATGGATTAACTCCTCTTTCT-3') 용액(1 nM, 100 μL)에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 구체적으로, 혼성화 시간(hybridization time)에 대한 함수로 결합하지 않은 나노탐침의 수를 모니터하기 위하여 6개 반응 시료를 준비하였다. 자기력 하에 결합하지 않은 HAV DNA 가닥을 제거하고, 수득한 용액은 0.3 M PBSS 완충액으로 3회 세척하였다. 다음으로, 미리 준비한 TC-탐침 용액(3 pM, 60 μL)을 각각의 반응 시료에 첨가하고, 혼합물을 상이한 혼성화 시간 동안 인큐베이션하였다. 특정 혼성화 시간(0, 5, 10, 15, 20, 및 25분)에, 자석으로 NC-복합체-1과 NS-복합체-1을 회수하였다. 즉시, 각 반응 시료로부터 회수한, 결합하지 않은 TC-탐침을 포함하는, 상층액의 소광 스펙트럼(extinction spectrum)을 측정하여 결합하지 않은 TC-탐침의 수를 모니터하였다.
나아가, 도 1의 신호-증폭 단계(signal-amplifying step)에 상응하는, NC-복합체-1과 SA-AuNC 및 NS-복합체-1과 SA-AuNS(각각 NC-복합체-2 및 NS-복합체-2로 표기)의 형성에 있어서 구조의존적 DNA 결합 속도를 확인하기 위하여, 상기 TC-탐침의 결합 속도 모니터링 방법을 변형하였다. 간략히, 100 μL의 HAV DNA(1 nM), 1 μL의 DNA-MMP(10 mg/mL), 및 60 μL의 TC-탐침(2 pM)을 이용하여 NC-복합체-1 및 NS-복합체-1을 준비하였다. 수득한 복합체들은 0.3 M PBSS 완충액으로 3회 세척하였다. 이어, SA-AuNC 및 SA-AuNS(6 pM, 60 μL) 용액을 상기 준비한 NC-복합체-1 및 NS-복합체-1 용액에 각각 첨가하였다. 상이한 혼성화 시간(0, 10, 20, 30, 40, 50, 및 60분)에서 결합되지 않은 SA-탐침의 소광 스펙트럼을 측정하였다.
비교예 1: 금 나노스피어를 이용한 나노탐침 응집체의 제조
제조예 2의 금 나노큐브 대신에 제조예 1의 금 나노스피어를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 나노탐침 응집체를 제조하였다.
실험예 1: 50 nm 크기의 AuNC 및 AuNS에 대한 DNA-로딩 용량의 정량분석
Au 나노탐침의 표면 상에 결합되는 DNA 가닥의 수를 결정하기 위하여, Cy3-표지된 DNA 가닥을 사용하여 제조된 TC-AuNC 및 TC-AuNS를 이용하였다. KCN 용액을 TC-AuNC 및 TC-AuNS의 분산액과 혼합하고, 이들 혼합물을 90℃에서 5분 동안 가열하여 TC-탐침을 분해시켰다(dissolved); KCN의 최종 농도는 100 mM이었으며, 입자 농도는 TC-AuNC 및 TC-AuNS에 대해 각각 11.7 및 10.2 pM이었다. 분리되어 방출되는 Cy3-표지된 DNA 가닥의 형광 방출 세기를 형광분광계(fluorophotometer, λexcitation = 546 nm 및 λemission = 560 nm)를 사용하여 측정하였다. 부착된 DNA 가닥의 수를, 기지 농도의 동일한 DNA를 이용하여 획득한, 표준곡선으로부터 계산하였다(도 2).
실험예 2: 나노탐침 응집체의 구조의존적 해리 평가를 위한 용융전이 (melting transition) 측정
나노탐침 응집체(nanoprobe aggregate)를 준비하기 위하여, 3 pM의 TC-탐침과 SA-탐침(2 mL)을 실온에서 4시간 동안 혼성화되도록 하였다. 2가지 탐침이 혼성화됨에 따라, 생성된 화합물은 무색으로 변하였으며, 이는 나노탐침 응집체가 형성됨을 나타내는 것이다. 용액의 온도가 25℃로부터 85℃까지 증가함에 따른 해리되는 나노탐침의 소광 피크의 변화를 모니터링하여 상기 클러스터의 온도-유도 해리(용융전이; melting transitions)를 확인하였다. AuNC 및 AuNS 응집체의 용융 온도(melting temperatures; T m )는 해리(변성)곡선(dissociation (denaturation) curve)의 1차 미분의 최대값에 상응하는 온도로부터 결정되었다.
실시예 2: 3D -조립된- 플라즈몬성 - AuNC -클러스터-기반 DNA 검출 어세이
DNA 검출 어세이를 위하여, DNA-MMP, 표적 DNA 가닥, TC-AuNC, 및 SA-AuNC를 이용한 샌드위치-혼성화 방법을 수행하였다. 먼저, 표적 DNA(hepatitis A virus; HAV, 서열번호 4: 5'-TTAGAGTTGCATGGATTAACTCCTCTTTCT-3') 용액을 0.3 M PBSS 완충액을 이용하여 100 aM 내지 10 pM 범위의 다른 농도로 준비하였다. 또한, 10 pM 농도의 비-상보적(non-complementary) DNA(hepatitis B virus; HBV, 서열번호 5: 5'-TTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTA-3') 용액을 준비하여 대조군으로 사용하였다. 다음으로, 1 μL의 DNA-MMP 용액을 100 μL의 희석된 표적 DNA 용액에 첨가하고, 상기 혼합물을 교반하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 20 μL의 TC-AuNC 용액(10 pM)을 표적 DNA-포획 MMP 용액(target-DNA-capturing MMP solution)에 첨가하고, 상기 혼합물을 교반하면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 도 1의 표적-포획 단계에 상응하는, 인큐베이션 과정 동안, 샌드위치 혼성화 복합체, NC-복합체-1이 형성되었다. 획득한 NC-복합체-1 용액을 0.3 M PBSS 완충액으로 3회 세척하고, 용액의 부피가 10 μL가 되도록 조절하였다. AuNC 클러스터를 형성하기 위하여, 20 μL의 SA-AuNC 용액(50 pM)을 상기 준비된 NC-복합체-1 용액에 첨가하고, 상기 혼합물을 교반하면서 실온에서 30분 더 인큐베이션하였다. 도 1의 신호-증폭 단계에 상응하는, 인큐베이션 과정 동안, 조립된 AuNC 클러스터-MMP 혼성화 복합체(NC-복합체-2)가 형성되었다. 마지막으로, NC-복합체-2 용액을 0.3 M PBSS 완충액으로 3회 세척하고, 10 μL 부피로 농축하였다. TC-AuNC 및 SA-AuNC 대신에 TC-AuNS 및 SA-AuNS를 사용하는 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 NS-복합체-2를 제조하였다.
실시예 3: SERS -기반 DNA 검출 어세이를 위한 마이크로-라만 측정
라만 분석을 위하여, 합성된 복합체 용액 5 μL을 커버글래스 상에 붓고, 커버글래스 아래 위치시킨 자석을 이용하여 농축시켰다. 잔류 용매는 대기 조건 하에 건조시켜 제거하였다. 건조한 커버글래스를 뒤집고, 촛점을 시료의 뒷면에 오도록 조절하였다. 모든 라만 측정은 633 nm 여기 레이저(190 μW), 표준 전하결합소자(charge-coupled device; CCD) 어레이 검출기(576 픽셀×384 픽셀; Peltier; -70℃까지 냉각) 및 50× 대물렌즈(NA = 0.75, Leica)를 구비한 Renishaw inVia 라만 현미경 시스템을 이용하여 수행하였다. 10초 수집시간(acquisition time)으로 SERS 스펙트럼을 획득하고, 500 내지 1,800 cm-1의 파수에 대해 기록하였다.
실시예 4: 전기적 근접장(electric near-field)의 이론적 계산
MNPBEM 툴박스를 사용하여 경계요소법(boundary element method; BEM) 시뮬레이션을 수행하였다. AuNC의 가장자리 길이(edge length) 및 모서리(corner)에서의 곡률 반경(radius of curvature)은 각각 50 nm 및 6 nm였다. AuNS의 직경은 50 nm였다. 투과전자현미경(transmission electron microscopy; TEM) 이미지에 기초한, 조립된 AuNC 클러스터에서 AuNC 사이의 간격 크기(gap size)는 2 nm였다(도 3). 주변 환경(surrounding environment)은 공기(n=1)로 간주하고, 금의 유전함수(dielectric function)로는 존슨과 크리스티의 데이터(Johnson and Christy's data)를 사용하였다. 여기 파장은 633 nm였다.
<결론>
SERS-기반 DNA 검출 어세이를 위한 플라즈몬성 나노탐침을 제조하기 위하여, 종자-매개 성장법(seed-mediated growth method)을 이용하여, 큐브(AuNC)와 스피어(AuNS), 2가지 형태의 나노입자를 먼저 합성하였다. 특히, 합성된 AuNC를 계면활성제 마이셀 용액에서의 고갈-유도 응집(depletion-induced flocculation)에 의해 정제하였다. 합성된 AuNC 및 AuNS는 목표한 구조에 대해 우수한 균일성을 나타내었으며, 95% 이상의 높은 수율을 나타내었다(도 4a 및 4b). 또한, 이들의 평균 크기(edge length for the AuNC에 대한 가장자리 길이 및AuNS에 대한 직경)은 유사하며, AuNC에 대해 50.7 ± 0.6 nm 및 AuNS에 대해 50.6 ± 0.7 nm의 좁은 크기 분포를 나타내었다. AuNC 및 AuNS의 UV-vis 스펙트럼은 각각 563 nm 및 529 nm에서 예리한 소광 피크를 나타내었다(도 4c). 플라즈몬성 나노입자의 광학적 성질, 특히, SERS에 대한 전기장 증강은 고도로 형태 의존적이다. 따라서, 구조적 균일성 및 좁은 크기 분포는 생성물로부터의 SERS 신호에서의 낮은 가변성을 보장하고, 신뢰할 수 있고 재현성있게 하므로, SERS-기반 DNA 검출에 적합하였다.
이후, AuNC 및 AuNS의 표면을 SERS-기반 DNA 검출을 위한 라만 탐침으로서 표적 DNA 가닥-포획 올리고뉴클레오티드로 기능화하였다. DNA-수식된 플라즈몬성 나노입자는 DNA 검출 시 서열-특이적 혼성화를 수반하였다(도 4d 내지 4g). 표적-포획 단계 동안(도 1), 상보적 DNA 가닥(hepatitis A virus; HAV)의 존재시, 자석을 이용하여 수집한 어세이 용액은 무색으로 변하였으며, 소광 피크의 세기는 급격히 감소하였다(도 4d). 이는 TC-AuNC가 표적 DNA 가닥을 포획하여 DNA-MMP와 혼성화되어 샌드위치 혼성화 복합체(도 1의 NC-복합체-1)를 형성하였음을 나타낸다(도 4e 우측). 그러나, 링커 DNA를 비-상보적 DNA 가닥(hepatitis B virus; HBV)으로 대체하였을 때, 소광 스펙트럼은 물론 용액의 색은 변하지 않았으며, 이는 NC-복합체-1이 형성되지 않았음을 나타내는 것이다(도 4d 및 4e 좌측). 이러한 DNA-서열-특이적 혼성화 과정은 신호-증폭 단계 동안에도 발생하였다. 서열-상보적 SA-AuNC를 NC-복합체-1 용액에 첨가하였을 때, 어세이 용액은 외부 자기장 하에 투명하게 되었으며, 소광 피크의 세기는 혼성화 복합체(2의 NC-복합체-2)의 형성으로 인해 현저히 감소되었다(도 4f 및 4g 우측). 반면, 비-상보적 SA-AuNC의 경우, 용액 색상 및 소광 스펙트럼은 변하지 않았다(도 4f 및 4g 좌측).
다음으로, 개별 나노입자의 DNA-로딩 용량, 즉, 나노입자의 표면 상에 부착되는 DNA의 총량을 측정하였다. 단일 나노입자의 DNA-로딩 용량을 정량화하기 위하여, 시안화칼륨(potassium cyanide; KCN)을 이용하여 DNA-수식된 나노입자를 용해시키고 형광체(Cy3)-표지된 DNA 가닥의 형광 신호를 측정하였다. 개별 나노입자의 표면 상에 부착된 DNA 가닥의 총수는 기지의 농도의 동일한 DNA를 사용하여 획득한 표준곡선으로부터 계산되었다(도 2). 단일 AuNC의 DNA-로딩 용량(5004 ± 9)은, 동일한 크기를 가짐에도 불구하고 보다 넓은 표면적으로 인해, 단일 AuNS에 대한 값(2934 ± 21)에 비해 더 높았다. 그러나, 상기 2가지 형태의 나노입자의 DNA-로딩 밀도, 즉, 나노입자의 단위 표면적 당 부착된 DNA 가닥의 수는 AuNC에 대해 0.325 nm-2 및 AuNS에 대해 0.365 nm-2로 유사하였다. AuNC의 DNA-로딩 밀도는 AuNS의 그것에 비해 유사하거나 또는 더 낮음에도 불구하고, 실제 혼성화에 참여할 수 있는 "유효 결합 DNA 가닥(effective binding DNA strand)"의 수는, AuNC의 구조적 특성으로 인해, 더 높았다(도 5a). 구형의 나노입자가 조립체를 형성할 때, 그 볼록한(convex) 표면 구조로 인해 좁은 자리(점 접촉; point junction)에서만 결합하므로, 유효 결합 DNA 가닥의 수는 낮다.
다양한 표적 포획 나노탐침(TC-탐침; TC-AuNC 및 TC-AuNS)의 DNA 혼성화 동안의 구조 의존적 결합 속도론을 비교 연구하였다(도 1 내의 표적 포획 단계). 대상 포획 MMP 및 상보적인 대상 DNA 가닥(HAV)을 1시간 동안 혼합하고, 세척하여 결합하지 않은 DNA 가닥을 제거하였다. 이어서, TC-탐침을 세척한 MMP 용액에 첨가하였다. DNA 혼성화 과정 동안, 샌드위치 혼성화 복합체(NC- 또는 NS-복합체-1)의 형성으로 인한 나노탐침의 소모를 나타내는, 어세이 용액의 소광(extinction) 피크 세기의 감소를 모니터하였다(도 6). 특정 시간( A t )에서 소광 세기는 초기 세기( A 0 )로 나누고, 상대 소광 세기( A t / A 0 )를 혼성화 시간( t )에 대해 플롯하였다. A t / A 0 대 t 플롯은 지수 감쇠 함수(exponential decay function)를 사용하여 최적화할 수 있었다: A t / A 0 = C·exp(- k ·t) + b( k 는 감쇠 상수). 예상과 달리, 도 5b에 나타난 바와 같이, DNA 혼성화 동안 표적 포획 MMP에 의해 소모된 TC-탐침의 양은 2개 구조체에서 비슷하였으며, 이는 유사한 감쇠 상수( k TC - AuNC = 0.1203 및 k TC - AuNS = 0.1257 min-1) 및 반감기( t 1/2; t 1/2, TC - AuNC = 5.76 and t 1/2, TC - AuNS = 5.51 min)를 가짐을 나타낸다(표 1). 이러한 결과는 분명한 구조적 특성의 존재로 인한 보다 높은 수의 "유효 결합 DNA 가닥(effective binding DNA strand)"의 결합이 더 높은 결합(감쇠) 속도를 유도한다는 가설과는 상반되는 것이었다. 이에 대한 몇가지 이유를 생각할 수 있다. 먼저, MMP는 이의 마이크론 크기의 표면 상에 많은 수의 결합 자리를 포함하므로, MMP에 대한 TC-AuNC 및 TC-AuNS의 결합 가능성은 아마도 유사하다. 둘째로, DNA 혼성화와 관련하여 형태(곡률; curvature) 효과는 MMP의 거친 표면으로 인해 무시할만 하다(도 4e). 셋째로, TC-탐침은 유사한 형태의 나노입자와 혼성화하는 대신에 MMP에 의해 직접 포획되었으며, 따라서 구조(곡률) 효과에 의해 유도되는 "유효 결합 DNA 가닥"의 개념은 본 발명에는 적용되지 않았다(도 1의 표적 포획 단계). 이러한 이유로, AuNC 및 AuNS의 경우 "유효 결합 DNA 가닥"의 수가 상이함에도 불구하고, 형태(곡률)은 결합 가능성 또는 효율에 유효한 효과를 갖지 않는 것으로 간주하였다.
감쇠상수
(k, min-1)		 반감기
(t 1/2, min)		 t 1/2까지의 평균 감쇠 속도
(R half -life, amole/min)
TC-탐침 TC-AuNC 0.1203±0.0110 5.76±0.53 13.51±1.26
TC-AuNS 0.1257±0.0130 5.51±0.58 13.79±1.47
SA-탐침 SA-AuNC 0.0428±0.0038 16.21±1.45 7.54±0.68
SA-AuNS 0.0367±0.0036 18.87±1.88 4.35±0.44
반대로, 결합 속도론에 대한 형태(곡률)의 효과는, 신호 증폭 나노탐침(SA-탐침; SA-AuNC 및 SA-AuNS)이 복합체-1에 결합하였을 때, 명확하였다(도 1의 신호 증폭 단계). SA-AuNC는 SA-AuNS에 비해 보다 빠르게 복합체-1에 의해 소모되었으며, 이는 큐브형 나노탐침(SA-AuNC)의 결합(혼성화) 속도가 높음을 나타내는 것이다(도 5c). 결과적으로, 상기 표 1에 나타난 바와 같이, SA-AuNC의 결합 속도론은, SA-AuNS의 속도론( k SA-AuNS = 0.0367 min-1, t 1/2, SA-AuNS = 18.87 min)에 비해 더 높은 감쇠 상수 및 더 짧은 반감기( k SA-AuNC = 0.0428 min-1, t 1/2, SA- AuNC = 16.21 min)를 나타내었다. 나아가, t 1/2(단위 반감기 당 반감기까지 소모되는 나노탐침의 몰수로 정의됨)까지의 평균 감쇠 속도는 SA-AuNC 및 SA-AuNS에 대해 각각 7.54 및 4.35 attomoles/min로 계산되었다. 흥미롭게도, 나노탐침 및 MMP 간의 결합(도 1의 표적 포획 단계)과는 반대로, 큐브형 나노탐침은, 구형 나노탐침의 경우에 비해 약 73% 더 높은 결합 속도를 갖는, 증가된 결합(혼성화) 효율을 나타내었다(도 1의 신호 증폭 단계). 형태(곡률) 효과에 의한 보다 높은 수의 "유효 결합 DNA 가닥"의 존재가 증가된 결합 속도를 유도하는 것으로 사료되었다. 나노탐침과 MMP 간의 결합에 대한 경우와 달리, SA-탐침은 MMP에 결합하는 대신에 TC-탐침의 표면에 결합하여야 하며, 따라서, 나노탐침 간의 혼성화 효율은 그들의 표면 형태에 의해 결정되었다(도 5a). 큐브형 나노탐침 간의 보다 높은 수의 "유효 결합 DNA 가닥"의 존재는, 보다 높은 결합 속도(즉, 보다 높은 감쇠 상수)를 유도할 수 있는 이용 가능하며 증가된 결합율의, 보다 큰 수의 결합 자리를 유도하였다. 따라서, 형태(곡률) 효과와 관련되는 증가된 결합(혼성화) 속도론은 SERS-기반 DNA 검출을 위한 DNA 혼성화의 어세이 시간을 단축할 수 있다.
다음으로, "유효 결합 DNA 가닥"의 수가 높으면 조립된 나노탐침이 서로 보다 견고하게(tightly) 결합한다는 가설을 시험하였다. 형태(곡률) 효과에 의해 "유효 결합 DNA 가닥"의 수가 조립된 클러스터의 결합 세기를 결정함을 가정하였다. 이를 입증하기 위하여, 클러스터에 대해 온도-유도 해리를 시험하였다. 특히, 나노탐침 간의 구조-의존적 결합 세기를 정확히 결정하고, 나노탐침과 MMP 간의 혼성화로 인해 발생할 수 있는 오차를 방지하기 위하여, MMP 지지체가 없는 AuNC 또는 AuNS 응집체(aggregate)를 사용하였다. 나노탐침이 용액 내에서 응집되었을 때, 입자간 거리는 평균 입자 크기보다 감소하였으며, 그 결과로 수반되는 용액 색상 및 UV-vis 스펙트럼에서의 변화를 유도하였다(도 7). 용액의 온도가 증가할수록, 나노탐침 응집체는 DNA의 녹는점(melting temperature, T m )에 가까운 온도에서 해리되기 시작하였다. 이에, 용액의 온도가 25℃로부터 85℃까지 증가함에 따라 해리하는 나노탐침의 소광 피크의 세기 변화를 모니터하였다. AuNC 응집체는 AuNS 응집체(71.2℃)에 비해 더 높은 녹는점(74.8℃)을 갖는 것으로 나타났다(도 5d). 나아가, AuNC 응집체에 대한 해리(변성, denaturation) 곡선은 AuNS 응집체에 대한 것에 비해 더 가파르게 나타났다(도 5d); 해리(변성) 곡선의 1차 미분(first-order derivatives)으로부터 얻어진 반높이너비(full width at half maximum; FWHM)는 AuNC 응집체 및 AuNS 응집체에 대해 각각 2.8℃ 및 4.0℃였다(도 5d, 삽입도). 일반적으로, DNA-수식된 Au 나노입자에 의해 형성된 응집체는, 보다 큰 협력(cooperation)에 의해 동일한 염기서열의 자유 이중나선 DNA에 비해 훨씬 급격한 용융전이(melting transition, 즉, 좁은 FWHM)는 물론 훨씬 더 높은 녹는점( T m )을 나타내었다. DNA의 용융전이에 대한 이러한 협력의 효과는 실험적으로 및 이론적으로 연구되고 있으며, 표면 DNA 밀도, 염 농도, 입자간 거리 및 입자와 같은 조건에 크게 의존적이다. 본 발명에서는 DNA의 나노입자-구조-의존적 용융전이를 연구하여, DNA 용융전이에 대하여 AuNC 및 AuNS에 의해 형성된 응집체 간의 유일한 차이점이 "유효 결합 DNA 가닥"의 수에서의 차이를 유도하는 나노입자의 표면 형태에 있음을 확인하였다. 용액의 온도가 증가함에 따라 "유효 결합 DNA 가닥"의 일부는 해리되었으나; "유효 결합 DNA 가닥"의 완전한 해리에 의해 나노탐침이 응집체로부터 탈착되기 전 UV-vis 스펙트럼은 변화하지 않았다. 따라서, 적은 수의 "유효 결합 DNA 가닥"의 존재는 상대적으로 용이하게 발생하는 해리 과정을 유도하여, 넓은 전이 온도 범위는 물론 낮은 온도에서 UV-vis 스펙트럼의 변화를 나타내었다. 반면, 많은 수의 "유효 결합 DNA 가닥"의 존재는, "유효 결합 DNA 가닥"의 완전한 해리점(dissociation point) 근처에서 응집체의 갑작스러운 해리에 의해 급격히 변화하는 UV-vis 스펙트럼을 갖는 응집체가 상대적으로 높은 온도에서도 손상되지 않고 유지되도록 하였다. 유사하게, AuNS 클러스터의 해리는, AuNC 사이의 "유효 결합 DNA 가닥"의 결여로 인해, 상대적으로 보다 용이하게, 보다 낮은 온도에서(더 낮은 T m ), 그리고 넓은 전이 범위에 걸쳐(넓은 FWHM) 발생하였다. 대조적으로, AuNC 응집체의 경우에서 더 높은 수의 "유효 결합 DNA 가닥"의 존재는, 매우 좁은 범위의 전이 온도에 걸쳐(좁은 FWHM) 발생하는 나노탐침의 해리를 수반하는, 보다 높은 온도(더 높은 T m )에서도 구조를 유지할 수 있도록 하였다. 따라서, AuNC 응집체의 보다 높은 녹는점 및 좁은 FWHM은 더 높은 수의 "유효 결합 DNA 가닥"의 존재가 형태(곡률) 효과에 의해 조립된 클러스터 사이의 보다 강한 결합을 유도함을 나타내는 것이다. 이러한 효과는 조립된 클러스터가 오래 지속되고 안정하게 하여 어세이 또는 측정 과정 동안 SERS 신호의 손실을 억제한다.
마지막으로, SERS 기법을 이용하여 3D-조립된(assembled)-플라즈몬성(plasmonic)-AuNC-클러스터-기반 초민감성(ultrasensitive) DNA 검출을 수행하였다. 표적 DNA(HAV)를 검출하기 위하여, DNA-MMP 및 TC-AuNC를 이용하여, NC-복합체-1을 형성하는, 전형적인 샌드위치-혼성화 어세이를 수행하였다. NC-복합체-1로부터의 SERS 신호 세기를 증강시키기 위하여, NC-복합체-1에 SA-AuNC를 도입하여 MMP 상에 조립된 플라즈몬성 AuNC 클러스터(NC-복합체-2)를 형성할 수 있었다. 도 8은 표적 DNA(HAV) 농도의 함수로서 NC-복합체의 SERS 신호 세기의 변화를 나타낸다. 제안된 시스템의 서열 특이적 혼성화 능력(hybridization ability)(도 4d 내지4g)은, HAV DNA를 비-상보적 HBV DNA로 대체한, 대조 실험 동안 NC-복합체-1 및 NC-복합체-2의 SERS 신호 세기는 무시할만큼 낮음을 의미하였다(도 8a에서 파란색 및 초록색 도트; 도 8b에서 파란색 및 초록색 선). NC-복합체-1의 경우, SERS 신호 세기(도 8a에서 검은색 도트; 도 8b에서 검은색 선)는 식별가능하였으나(distinguishable), 대조 실험 동안과는 반대로 검출한계(limid of detection; LOD)는 약 1 pM에 불과하였다. 반면, 조립된 플라즈몬성 AuNC 클러스터(NC-복합체-2)의 SERS 신호 세기는 높이 증강되었으며, LOD는 약 100 aM로 더 높았다(도 8a에서 빨간색 도트; 도 8b에서 빨간색 선). 전술한 바와 같이, AuNC 클러스터의 조립된 영역에서 강한 플라즈몬성 커플링은 라만 분자 근처에서 보다 강한 전기장을 유도하여, 증강된 SERS 신호를 발생시키고 DNA 검출에 대한 민감성을 약 10000배 향상시켰다. 다음으로, 상이한 형태를 갖는 나노탐침을 이용한 SERS-기반 DNA 검출의 특징을 비교하였다(도 8c). AuNS에 의해 형성된 3D-조립된 플라즈몬성 클러스터(NS-복합체-2)의 경우, SERS 신호 세기는, 형태(곡률) 효과로 인한 AuNS 간의 불충분하고 보다 느린 결합(혼성화) 속도론으로 인해, NC-복합체-2의 그것에 비해 더 낮았다. 따라서, LOD는 약 10 fM에 제한되었다. 나아가, NC-복합체-2와의 비교에서, NS-복합체-2는 반복적인 실험 동안 그 신호 세기에서 더 큰 변이(즉, 더 높은 표준 편차)를 나타내었으며, 이는 DNA 검출에 대한 상대적으로 보다 열악한 재현성 및 신뢰성을 나타내는 것이다. AuNS의 볼록한 표면 구조로 인해, 전기장은 NS-복합체-2의 조립된 부분의 국부적인 중심에서만 증강되었으며, 플라즈몬성 커플링의 정도는 조립된 부분의 중심으로부터 벗어남에 따라 급격히 감소하였다(점-대-점 커플링; point-to-point coupling). AuNC-기반 클러스터 사이에서 발생하는, 조립된 부분의 넓은 영역에 걸쳐 안정하고 균일한 플라즈몬성 커플링을 유도하는, 면-대-면 커플링(facet-to-facet coupling)과 달리, AuNS-기반 클러스터 사이의 점-대-점 커플링은 불안정하고 불균일하며 재생불가한 SERS 신호를 유도하였다. 이러한 결과로부터, AuNC가 안정적이고, 고도로 민감하며, 재현가능하고 신뢰할만한 결과를 요구하는 SERS-기반 분석적 적용에서의 사용을 위한 유망한 나노구조물임을 확인하였다.
AuNC 클러스터의 간극 영역(gap region) 내에서 강하고 균일한 전기장이 형성됨을 입증하기 위하여, 경계요소법(boundary element method; BEM) 및 MNPBEM 툴박스를 이용한 시뮬레이션을 수행하였다(도 9). BEM 시뮬레이션 동안, 선형적으로 편광화된 빛(파장 633 nm)을 단일 AuNC 상에 조사하였을 때, 플라즈몬성 커플링의 부재로 인해 AuNC의 모서리에서만 약한 전기장이 형성되었다(도 9a). 반면, 강한 플라즈몬성 커플링으로 인해 AuNC 클러스터의 간극 영역 내에 현저하게 더 강한 전기장이 형성되었다(도 9b). 특히, 강한 전기장은 면-대-면 커플링으로 인해 조립된 AuNC 클러스터의 넓은 영역에 걸쳐 분포되었다. 이러한 현상은, 볼록한 표면 형태로 인해 국부적인 작은 지점에서만 전기장이 형성되는(점-대-점 커플링), AuNS 클러스터의 경우 관찰되는 것과는 상당히 다르다(도 9c). 따라서, 입사광에 평행한 플라즈몬성 커플링 방향을 갖는 특정한 갭 영역에서만 전기장을 증폭시키는 AuNS 클러스터와 달리, AuNC 클러스터는 조립된 평면의 넓은 면적에 걸쳐 클러스터 내의 모든 상이한 커플링 방향에 대해 전기장을 강하게 증폭시켰다(도 9d 내지 9i). 평면의 금속/절연체/금속 기하학으로 인해, AuNC 조립체는 금속/절연체/금속 계면을 따라 진행하는 표면 플라즈몬인, 횡단 갭 플라즈몬(transverse gap plasmon; TGP)을 수반하였다. 광 조사시, TGP는 입사 분극에 수직인 면에서 여기되었다. 모서리에 도달하였을 때, 여기된 TGP는 입사 분극에 평행한 이웃한 면으로 진행되었다. 따라서, AuNS 조립체와 달리, 증강된 전기장은 AuNC 조립체 내의 모든 나노갭에 걸쳐 분포하였으며, 훨씬 높은 확률로 라만 분자가 핫 스팟 내에 존재할 수 있으므로 강하고 균일하게 증강된 전기장을 생성하였다. 계층적으로 조립된 클러스터가 구형 자성 마이크로입자의 표면 상에서 다양한 배향으로 무작위로 형성됨을 고려할 때, 입사광의 방향과 무관하게 모든 조립된 표면에서 균일하고 강하게 전기장을 증강시키는 큐브형-플라즈몬성-나노입자-기반 클러스터는, 구형-플라즈몬성-나노입자-기반 클러스터에 비해, SERS-기반 DNA 검출을 위한 보다 균일하고 재현성있고, 정량적인 신호를 제공할 수 있다. 결론적으로, 본 발명에 따른 H-cube-SERS 전략은 분석적 적용시 재현성있고 신뢰할만한 결과를 획득하기 위한 안정하며 초민감성의 SERS 플랫폼을 제공할 수 있다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation BioNano Health Guard Research Center <120> Method for detecting target material by SERS using assembly of metal nanocubes with hierarchical structure <130> KPA180358-KR <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA attached on MMP <400> 1 agaaagagga gttaa 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA attached on 1st AuNP <400> 2 tccatgcaac tctaa 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA attached on 2nd AuNP <400> 3 ttagagttgc atgga 15 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Hepatitis A virus <400> 4 ttagagttgc atggattaac tcctctttct 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 5 ttggctttca gttatatgga tgatgtggta 30

Claims (16)

  1. 검출하고자 하는 표적 DNA의 일부와 상보적인 제1서열을 포함하는 제1DNA로 표지된 자성 마이크로비드 및 검출하고자 하는 표적 DNA의 나머지 일부와 상보적인 제2서열을 포함하는 제2DNA로 표지된 제1금속나노큐브를, 검출하고자 하는 표적 DNA를 함유하는 것으로 예측되는 검체와 반응시켜, 시료 중 표적 DNA 존재시 DNA 혼성화에 의해 자성 마이크로비드에 하나 이상의 제1금속나노큐브가 결합된 제1복합체를 형성하는 제1단계;
    상기 제1복합체를, 상기 제1금속나노큐브에 표지된 제2DNA와 상보적인 제3서열을 포함하는 제3DNA가 수식된 제2금속나노큐브와 반응시켜, 상기 제1금속나노큐브의 자성 마이크로비드와 결합하지 않은 다른 면들에 복수의 제2금속나노큐브가 결합된 제2복합체를 형성하는 제2단계; 및
    상기 제2복합체로부터 표면증강라만산란(surface enhanced Raman scattering; SERS) 신호를 측정하는 제3단계;를 포함하는, 표적 DNA의 검출 방법으로서,
    상기 제1금속나노큐브에 수식된 제2DNA는 라만활성물질로 표지되어 있어 제1금속나노큐브와 제2금속나노큐브 사이에 상기 라만활성물질이 위치하여 제1금속나노큐브와 제2금속나노큐브 사이에서의 전기장 증강에 의해 향상된 라만신호를 나타내는 것이 특징인 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    제1단계와 제2단계 사이에 외부로부터 자기장을 인가하고 세척하여 자성 마이크로비드에 결합되지 않은 제1금속나노큐브를 제거하는 제1-1단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1금속나노큐브 및 제2금속나노큐브는 각각 독립적으로 금, 은, 백금, 팔라듐 및 구리로 구성된 군으로부터 선택되는 금속으로 된 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1금속나노큐브 및 제2금속나노큐브는 10 내지 300 nm의 모서리 길이를 갖는 입자로서, 제1금속나노큐브와 제2금속나노큐브의 모서리 길이의 편차는 ±20%를 초과하지 않는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 자성 마이크로비드는 0.5 내지 10 μm의 직경을 갖는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제1서열 내지 제3서열은 각각 독립적으로 6 내지 30개 핵산으로 구성된 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 검출하고자 하는 표적 DNA는 10 내지 100개 핵산으로 구성된 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 라만활성물질은 Cy3, Cy3.5, 및 Cy5를 포함하는 시아닌 계열의 형광 유기 분자, 또는 FAM, Dabcyl 또는 로다민 계열의 유기 형광분자 또는 머캅토벤조산 및 아미노티오페놀을 포함하는 비형광성 라만활성물질인 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제2복합체를, 상기 제2금속나노큐브에 표지된 제3DNA와 상보적인 제2서열을 포함하는 제2DNA가 수식된 제1금속나노큐브와 반응시켜,
    제1금속나노큐브와 결합하지 않으면서, 자성 마이크로비드와도 면하지 않는, 제2금속나노큐브의 나머지 면들에 추가적인 제1금속나노큐브들이 결합된 제2-n복합체를 형성하는 제2-n단계(이상 n은 1 이상의 정수)를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제2-n단계 및 선택적으로 상기 제2단계와 동일하게 수행되는 제2-(n+1)단계를 순차적으로 반복하는 방법으로서, 상기 추가적으로 수행되는 단계는 최종 생성되는 제2-n복합체 또는 제2-(n+1)복합체로부터 자성 마이크로비드를 제외한, 제1금속나노큐브 및 제2금속나노큐브로 된 조립체의 크기가 평균 반경 30 nm 내지 900 nm 이내인 범위에서 반복하여 수행되는 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    제3단계로부터 측정된 제2복합체에 대한 신호는 동일 파장에서 제1복합체에 대해 측정된 신호에 비해 100배 이상 증강된 것인, 방법.
  12. 1면에는 검출하고자 하는 물질의 다른 일부와 특이적으로 결합하는 제1생체물질을 포함하며, 다른 5면에는 제1'DNA로 표지된 제1'금속나노큐브를 준비하는 제1단계;
    검출하고자 하는 물질의 일부와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제1생체물질로 표지된 자성 마이크로비드 및 상기 제1단계로부터 준비한, 1면에는 검출하고자 하는 물질의 다른 일부와 특이적으로 결합하는 제1생체물질을 포함하며, 다른 5면에는 제1'DNA로 표지된 제1'금속나노큐브를, 검출하고자 하는 물질을 함유하는 것으로 예측되는 검체와 반응시켜, 시료 중 표적 물질 존재시 특이적인 결합에 의해 자성 마이크로비드에 하나 이상의 제1'금속나노큐브가 결합된 제1'복합체를 형성하는 제2단계;
    상기 제1'복합체를, 상기 제1'금속나노큐브에 표지된 제1'DNA와 상보적인 서열을 포함하는 제2'DNA가 수식된 제2'금속나노큐브와 반응시켜, 상기 제1'금속나노큐브의 자성 마이크로비드와 결합하지 않은 다른 면들에 복수의 제2'금속나노큐브가 결합된 제2'복합체를 형성하는 제3단계; 및
    상기 제2'복합체로부터 표면증강라만산란 신호를 측정하는 제4단계;를 포함하는, 표적 물질의 검출 방법으로서,
    상기 제1'금속나노큐브에 수식된 제1'DNA는 라만활성물질로 표지되어 있어 제1'금속나노큐브와 제2'금속나노큐브 사이에 상기 라만활성물질이 위치하여 제1'금속나노큐브와 제2'금속나노큐브 사이에서의 전기장 증강에 의해 향상된 라만신호를 나타내는 것이 특징인 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    제2단계 및 제3단계는 역의 순으로 실시하여, 제1'금속나노큐브를 제2'금속나노큐브와 먼저 결합시킨 후, 제1생체물질로 표지된 자성 마이크로비드 및 시료와 반응시키는 것인, 표적 물질의 검출 방법.
  14. 검출하고자 하는 표적 물질의 일부와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제1생체물질로 표지된 자성 마이크로비드;
    1면에는 검출하고자 하는 물질의 다른 일부와 특이적으로 결합하는 제1생체물질을 포함하며, 다른 5면에는 제1'DNA로 표지된 제1'금속나노큐브; 및
    상기 제1'금속나노큐브에 표지된 제1'DNA와 상보적인 서열을 포함하는 제2'DNA가 수식된 복수의 제2'금속나노큐브를 포함하는, SERS에 의한 표적 물질 검출용 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    표적 물질로서 DNA 검출을 위하여 상기 자성 마이크로비드는 검출하고자 하는 표적 DNA의 일부와 상보적인 제1서열을 포함하는 제1DNA로 표지되고, 제1'금속나노큐브는 검출하고자 하는 표적 DNA의 나머지 일부와 상보적인 제2서열을 포함하고 라만활성분자가 결합된 제2DNA로 표지되며, 제2'금속나노큐브는 상기 제1금속나노큐브에 표지된 제2DNA와 상보적인 제3서열을 포함하는 제3DNA가 수식된 것인, SERS에 의한 표적 물질 검출용 키트.
  16. 제14항에 있어서,
    완충액을 추가로 포함하는 것인, 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113231643B (zh) * 2021-05-06 2022-09-13 中南大学 一种生物医用贵金属框架材料及其制备方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101247610B1 (ko) * 2009-12-11 2013-03-26 서울대학교산학협력단 라만 활성분자가 나노입자 이합체의 접합부에 위치한 이합체 코어쉘 나노 입자, 이의 용도 및 이의 제조방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101247610B1 (ko) * 2009-12-11 2013-03-26 서울대학교산학협력단 라만 활성분자가 나노입자 이합체의 접합부에 위치한 이합체 코어쉘 나노 입자, 이의 용도 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rycenga 등, J Phys Chem A., Vol. 113, No. 16, 페이지 3932-3939 (2009.01.28.)*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022182126A1 (ko) * 2021-02-23 2022-09-01 모던밸류 주식회사 타겟 핵산의 라만 검출을 위한 핵산 기반 자가조립 복합체 및 이의 용도

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Li et al. Programmable DNA tweezer-actuated SERS probe for the sensitive detection of AFB1
Ray et al. Nanoscopic optical rulers beyond the FRET distance limit: fundamentals and applications
Li et al. Plasmon-enhanced electrochemiluminescence for nucleic acid detection based on gold nanodendrites
Wang et al. Single-molecule detection of polynucleotide kinase based on phosphorylation-directed recovery of fluorescence quenched by au nanoparticles
Wang et al. Application of Au based nanomaterials in analytical science
Fong et al. Localized surface plasmon resonance: a unique property of plasmonic nanoparticles for nucleic acid detection
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Xie et al. Single plasmonic nanoparticles as ultrasensitive sensors
Yaraki et al. Recent advances in metallic nanobiosensors development: colorimetric, dynamic light scattering and fluorescence detection
Ng et al. Optical aptasensors for adenosine triphosphate
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