KR101467667B1 - 헤드부 및 바디부로 이루어진 나노스노우맨 형태의 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

헤드부 및 바디부로 이루어진 나노스노우맨 형태의 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헤드부 및 바디부로 이루어진 나노스노우맨 형태의 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 다양한 정렬 및 비정규 나노구조체의 DNA-기초 어셈블리를 위한 플랫폼을 제공할 수 있으며, DNA, 특정 질병의 발병과 진행에 관계있는 분석물의 검출에 고도로 적용이 가능한 나노스노우맨 형태의 헤드-바디부로 이루어진 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.

Description

헤드부 및 바디부로 이루어진 나노스노우맨 형태의 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출 방법{Nanoparticles in the shape of nanosnowman with a head part and a body part, a preparation method thereof and a detection method using the same}
본 발명은 헤드부 및 바디부로 이루어진 나노스노우맨 형태의 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 다양한 정렬 및 비정규 나노구조체의 DNA-기초 어셈블리를 위한 플랫폼을 제공할 수 있으며, DNA, 특정 질병의 발병과 진행에 관계있는 분석물의 검출에 고도로 적용이 가능한 나노스노우맨 형태의 헤드-바디부로 이루어진 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
금속 나노구조체는 이들의 플라즈몬 특성, 촉매 특성, 전자적 특성 및 자기적 특성의 중요성으로 인하여 지난 수십 년에 걸쳐 집중적으로 연구되어 왔다. 다중 금속 나노성분을 단일의 특정 나노구조체로 결합하는 것은 종종 강한 플라즈몬 커플링 및 더욱 높은 화학적 친화도와 같은 독특한 광학 및 화학적 특성을 발생시키고, 더욱 광대하고 다양한 적용 가능한 용도를 제공한다. 그러나, 이러한 복합 나노구조체를 합성하고 조립하는 것은 합성적으로 힘들고, 다중-성분, 다중결합의 금속 나노구조체의 용도는 합성적 접근 불가능함으로 인하여 극히 제한적이다.
비록 코어-쉘, 태드폴-유사, 액체마이셀 경계면(liquidmicelle interface)에 의한 헤테로다이머, 나노폴리헤드론 및 나노로드와 같은 다중금속 나노입자를 포함하는 다양한 나노구조체를 합성하는데 있어 많은 진전이 있었으나(Shi, W. et al., Nano Lett., 2006, 6, 875; Wu, Y. et al., Nature, 2004, 430, 61; Lu, Y. et al., J. Am. Chem . Soc ., 2003, 125, 127, 24; Huang, M. H. et al., Science, 2001, 292, 1897; Lassiter, J. B. et al., Nano Lett ., 2008, 8, 1212), 헤테로금속 하이브리드 나노입자를 위한 대부분의 보고된 방법들은 복잡한 과정과 가혹한 반응 조건에 기초하고, 단지 다이머와 같은 단순한 구조에 대한 공정일 뿐이다. 또한, 특정 방향성을 갖는 복잡한 구조를 형성하는 것은 더욱 힘들고, 복잡한 나노구조체의 비대칭 합성은 기대치 않은 특성과 기능을 갖는 나노구조체를 형성하는데 있어 새로운 차원을 제공할 수 있다(Caswell, K. K. et al., J. Am . Chem . Soc ., 2003, 125, 13914; Salem, A. K. et al., Nano Lett ., 2004, 4, 1163; Gole, A. et al., Langmuir, 2005, 21, 10756; Chen, M. et al., J. Phys . Chem . B, 2006, 110, 211; Salant, A. et al., J. Am . Chem . Soc ., 2006, 128, 10006; Chen, C. -L. et al., J. Am . Chem . Soc ., 2010, 132, 6902).
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 금 또는 은 나노입자 헤드부, 및 금 또는 은 나노입자 바디부를 구비하며, 상기 헤드부는 표면에 복수의 올리고뉴클레오티드가 결합되어 있고, 상기 헤드부의 하방 일부가 상기 바디부 상방의 함몰부 상에 위치한 나노입자를 제조하고, 이들이 다양한 정렬 및 비정규 나노구조체의 DNA-기초 어셈블리를 위한 플랫폼을 제공할 수 있으며, DNA, 특정 질병의 발병과 진행에 관계있는 분석물의 검출에 고도로 적용이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 다양한 정렬 및 비정규 나노구조체의 DNA-기초 어셈블리를 위한 플랫폼을 제공할 수 있으며, DNA, 특정 질병의 발병과 진행에 관계있는 분석물의 검출에 고도로 적용이 가능한 헤드부 및 바디부로 이루어진 나노스노우맨 형태의 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노입자를 이용한 분석물의 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 금 또는 은 나노입자 헤드(head)부, 및 금 또는 은 나노입자 바디(body)부를 구비하며, 상기 헤드부는 표면에 복수의 올리고뉴클레오티드가 결합되어 있고, 상기 헤드부의 하방 일부가 상기 바디부 상방의 함몰부 상에 위치한 나노입자를 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "헤드부"는, 표면에 올리고뉴클레오티드가 결합되어 있는 나노입자로서, 하방 일부가 바디부와 접합되어 있는 구형(sphere) 또는 구형과 유사한 형태, 나노막대(nanorod) 또는 나노직육면체(nanocube)의 형태를 갖는 입자를 의미한다. 상기 헤드부는 구형(sphere) 또는 구형과 유사한 형태를 갖는 경우 직경이 2 nm 내지 200 nm일 수 있으며, 나노막대(nanorod) 또는 나노직육면체(nanocube)의 형태를 갖는 경우 최장축 길이가 2 nm 내지 200nm일 수 있다. 상기 헤드부는 금 또는 은으로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "바디부"는, 상기 헤드부의 하방 일부에 접합되어 있는 구형 또는 구형과 유사한 형태, 나노막대(nanorod) 또는 나노직육면체(nanocube)의 형태를 갖는 입자를 의미한다. 또한, 상기 바디부는 속이 빈(hollow) 형태를 가질 수 있다. 상기 바디부는 구형(sphere) 또는 구형과 유사한 형태를 갖는 경우 직경이 2 nm 내지 900 nm일 수 있으며, 나노막대(nanorod) 또는 나노직육면체(nanocube)의 형태를 갖는 경우 최장축 길이가 2 nm 내지 900nm일 수 있다. 상기 바디부는 금 또는 은으로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 상기 헤드부와 바디부는 비대칭적인 크기를 가질 수 있다. 구체적으로, 헤드부에 비해 바디부가 더 큰 크기를 가질 수 있다.
본 발명에서, 상기 나노입자의 최장축 길이는 4 nm 내지 900nm일 수 있다.
본 발명의 나노입자는 상기와 같이 헤드부와 바디부가 접합되어 스노우맨(snowman)과 동일 또는 유사한 형태를 갖는 것을 특징으로 한다. 이에 따라 헤드부 표면에 결합되어 있는 올리고뉴클레오티드의 일부는 외부로 노출되고 일부는 바디부 상방의 함몰부에 매장됨으로써 올리고뉴클레오티드가 비대칭적으로 개질된 형태를 가질 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는, 적은 수의 뉴클레오티드로 구성된 중합체로 일반적으로 화학적 합성이 가능한 짧은 뉴클레오티드 사슬을 의미하며, 본 발명에 따른 나노입자를 합성하는데 중요한 역할을 한다. 구체적으로, 헤드부 표면에 개질된 올리고뉴클레오티드가 존재할 경우 제어 가능한 유형으로 고수율의 헤드-바디 구조체를 형성할 수 있고, 올리고뉴클레오티드가 존재하지 않을 경우에는 명확한 형태를 갖는 특정 구조체, 즉 헤드-바디 구조체를 형성할 수 없다.
상기 올리고뉴클레오티드는 3' 말단 또는 5' 말단이 링커 화합물로 개질되어 링커 화합물을 통해 헤드부 표면에 부착될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "링커 화합물"은, 올리고뉴클레오티드를 헤드부 표면에 부착시키기 위해 각 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 연결시킨 화합물을 의미한다. 링커 화합물을 통하여 나노입자를 가교-결합시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다(Feldheim, The Electrochemical Society Interface, Fall, 2001, pp. 22-25). 링커 화합물의 한 말단은 코어 표면에 부착되는 기능기를 보유하는데, 바람직하게 황-함유기, 예컨대 티올기 또는 술프히드릴기(sulfhydryl, HS)이다. 상기 기능기는 알코올 및 페놀의 유도체로서 산소 자리에 황이 포함된 RSH의 식을 가지는 화합물일 수 있다. 또는, 상기 기능기는 각각 RSSR' 또는 RSR'의 식을 가지는 티올 에스테르(thiol ester) 또는 다이티올 에스테르(dithiol ester)일 수 있다. 또는, 상기 기능기는 아미노기(-NH2) 또는 알콜기일 수 있다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 기능기와 올리고뉴클레오티드 사이에 스페이서 서열을 포함할 수 있다.
상기 스페이서 서열은 -PEGx-Yy-(CH2)z-이고, 여기서 x는 0 내지 30의 정수이고, y는 0 내지 30의 정수이고, z는 3 내지 6의 정수이고, Y는 각각 아데닌, 티민, 구아닌 또는 시토신이다. 바람직하게는 z는 3 또는 6이다.
이때, 상기 스페이서 서열에 PEG가 존재하는 경우에는 PEG가 올리고뉴클레오티드에 결합되고, PEG가 존재하지 않는 경우에는 Y가 올리고뉴클레오티드에 결합되며, 반대측 말단의 (CH2)z는 기능기에 결합되는 것이 바람직하다. 구체적으로, 상기 스페이서 서열은 PEG18-A10-(CH2)3, PEG18-A10-(CH2)6, PEG18-A30-(CH2)3, PEG18-A30-(CH2)6, PEG18-T10-(CH2)3, PEG18-T10-(CH2)6, PEG18-T30-(CH2)3, PEG18-T30-(CH2)6, A10-(CH2)3, A10-(CH2)6, A30-(CH2)3, A30-(CH2)6, T10-(CH2)3, T10-(CH2)6, T30-(CH2)3, T30-(CH2)6, PEG-A10, PEG-A10, PEG-A30, PEG-A30, PEG-T10, PEG-T10, PEG-T30, 및 PEG-T30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는, 상기 올리고뉴클레오티드의 예로서, 5'-TAACAATAATCCCTC-PEG18-A10-(CH2)3-SH-3', 5'-HS-(CH2)6-A10-PEG18-ATCCTTATCAATATT-3'], 또는 5'-CACGAGTTTCTCAAA-PEG18-A10-(CH2)3-SH-3'를 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서, 상기 올리고뉴클레오타이드에 라만 활성 분자가 결합될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "라만 활성분자"란, 본 발명의 나노입자가 하나 이상의 분석물에 부착되었을 때 라만 검출 장치에 의한 분석물의 검출 및 측정을 용이하게 하는 물질을 의미한다. 라만 활성분자는 특정 라만 스펙트럼을 보여주기 때문에, 이후 생체분자를 보다 효과적으로 분석할 수 있게 하는 이점이 있다. 또한, 표면 증강 산란 효과를 고려하여, 상기 올리고뉴클레오타이드가 헤드부에 결합된 부분에 가깝게 라만 활성분자가 결합되는 것이 바람직하다. 라만 분광법에 사용될 수 있는 라만 활성분자는 유기 또는 무기 분자, 원자, 복합체 또는 합성 분자, 염료, 천연발생 염료(피코에리스린 등), C60과 같은 유기 나노구조체, 벅키볼, 탄소 나노튜브, 양자점, 유기 형광 분자 등을 포함한다. 구체적으로, 라만 활성분자의 예로서, FAM, Dabcyl, TRIT(테트라메틸 로다민 아이소티올), NBD(7-니트로벤즈-2-1,3-다이아졸), 텍사스 레드(Texas Red) 염료, 프탈산, 테레프탈산, 아이소프탈산, 크레실 패스트 바이올릿, 크레실 블루 바이올렛, 브릴리언트(brilliant) 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 비오틴, 다이곡시게닌(digoxigenin), 5-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시, 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시 로다민, 6-카복시로다민, 6-카복시테트라메틸 아미노 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 크산틴, 석신일플루오레세인, 아미노아크리딘, 양자점, 탄소 나노튜브, 탄소동소체, 시아나이드, 티올, 클로린, 브롬, 메틸, 인, 황 및 시아닌 염료(Cy3, Cy3.5, Cy5), 또는 로다민(Rhodamine)을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 나노입자의 표면은 다양한 물질을 결합시켜 나노입자의 특성을 향상시킬 수 있다. 예컨대, 생체 내에서 나노입자를 사용할 경우, 생체적합성 고분자를 표면에 개질할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 나노입자의 표면에 바이오분자를 기능화 할 수 있다. 본 발명에 따른 나노입자의 표면이 바이오분자로 기능화 될 경우, 나노입자가 측정 대상에만 결합할 수 있어, 나노입자를 이용한 분석 능력을 더욱 향상시킬 수 있다. 상기 나노입자에 기능화하는 바이오 분자의 예로, 항체, 항체 단편, 유전조작 항체, 단일쇄 항체, 수용체 단백질, 결합 단백질, 효소, 억제제 단백질, 렉틴, 세포 유착 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산 또는 압타머를 들 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 나노입자의 제조방법을 제공한다.
1) 금 또는 은 나노입자를 올리고뉴클레오티드로 개질시키는 단계(단계 1); 및
2) 상기 올리고뉴클레오티드로 개질된 금 또는 은 나노입자와, 금 또는 은 전구체를 NaCl, 환원제 및 안정화제의 존재 하에서 반응시키는 단계(단계 2).
상기 단계 1)은, 금 또는 은 나노입자를 올리고뉴클레오티드로 개질시키는 단계로서, 금 또는 은 나노입자의 표면에 올리고뉴클레오티드를 결합시켜 헤드부를 형성하는 단계이다.
상기 단계 1)은 공지의 문헌에 따라 당업계에 알려진 방법으로 수행될 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 'Hurst, S. J. et al., Anal . Chem ., 2006, 78, 8313' 및 'Lim, D. -K. et al., Nature Mater ., 2010, 9, 60'의 문헌을 참조하였다.
상기 금 또는 은 나노입자는 시판 중인 것을 입수하여 사용하거나, 공지 방법으로 제조하여 사용할 수 있다.
상기 단계 1)에서 사용 가능한 올리고뉴클레오티드는 상기 나노입자에 대한 설명 부분에서 개시한 바와 동일하다.
상기 단계 1)에서 사용되는 금 또는 은 나노입자는 구형(sphere) 또는 구형과 유사한 형태, 나노막대(nanorod) 또는 나노직육면체(nanocube)의 형태를 갖는 것을 사용할 수 있다. 상기와 같이 다양한 형태의 금 또는 은 나노입자를 사용함으로써 다양한 형태의 헤드부를 형성할 수 있다.
상기 단계 2)는, 상기 올리고뉴클레오티드로 개질된 금 또는 은 나노입자와, 금 또는 은 전구체를 NaCl, 환원제 및 안정화제의 존재 하에서 반응시키는 단계로서, 헤드부를 이루는 올리고뉴클레오티드로 개질된 금 또는 은 나노입자에, 금 또는 은 전구체를 첨가하여 NaCl, 환원제 및 안정화제의 존재 하에서 반응시킴으로써 바디부를 형성하는 단계이다.
본 발명에서, 상기 금 전구체로는 HAuCl4 등의 Au 이온이 포함된 어떠한 화합물도 사용가능하다. 또한, 상기 은 전구체로는 Ag 이온이 포함된 어떠한 화합물도 사용가능하며, 구체적으로 AgNO3, AgClO4를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 상기와 같은 제조방법을 통해 Au-Ag 헤드-바디 나노입자, Au-Au 헤드-바디 나노입자, 또는 Ag-Ag 헤드-바디 나노입자를 제조할 수 있다. 특히, 상기 NaCl의 농도를 낮춤으로써 보다 뚜렷한 나노스노우맨 형태의 헤드-바디 나노입자를 제조할 수 있다는 것을 특징으로 한다. 상기 NaCl의 농도는 바람직하기로 1 nM 내지 0.1 M, 더욱 바람직하기로 0.001 M 내지 0.05 M, 가장 바람직하기로 0.003 M일 수 있다. 또한, Au-Au 헤드-바디 나노입자의 경우에는 상기 단계 2)의 pH를 조절함으로써 보다 뚜렷한 나노스노우맨 형태의 헤드-바디 나노입자를 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 단계 2)는 pH 2 내지 8, 바람직하기로 pH 2 내지 7의 조건 하에서 수행할 수 있다.
본 발명에서, 상기 환원제로는 하이드로퀴논(hydroquinone), 소듐보로하이드라이드(NaBH4), 소듐 아스코르베이트(sodium ascorbate), 하이드록실아민(hydroxyl amine) 또는 이의 조합을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 안정화제로는 비공유전자쌍을 갖는 질소 또는 산소, 또는 이를 모두 포함하는 물질을 사용할 수 있다. 예를 들어, 피롤리딘(pyrrolidine), 이미다졸리딘(imidazolodine), 피라졸리딘(pyrazolidine), 피퍼리딘(piperidine), 피퍼라진(piperazine), 소르비톨(sorbitol), 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 또는 카보닐(carbonyl group)을 포함하는 유도체; 글루코스(glucose) 또는 프룩토스(fructose)를 포함하는 사카로스(saccharose) 당류; DNA; PNA; 또는 RNA를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 사용할 수 있다.
또한, 환원제와, 금 또는 은 전구체 간의 몰비, 및 안정화제로 사용 가능한 PVP 반복단위 수와 금 또는 은 전구체 간의 몰비를 변경함으써 구형 또는 구형과 유사한 형태, 나노막대 또는 나노직육면체의 형태를 갖는 다양한 형태의 바디부를 형성할 수 있다. 더 나아가, 금 또는 은 이온 전구체의 첨가 속도를 변경함으로써 보다 용이하게 나노직육면체의 형태를 갖는 바디부를 형성할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 2)는 용매로서 정제수 또는 인산염 완충액 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 2)의 반응 온도는 10 내지 100℃일 수 있다. 만일 상기 반응 온도가 10℃ 미만이면 바디부를 형성시키는데 너무 많은 시간이 소요되는 단점이 있고, 100℃를 초과하면 바디부의 형태가 불균일하게 형성되는 단점이 있다.
본 발명에서, 상기 단계 2)의 반응 시간은 반응 온도에 따라 10 내지 24 시간 내에서 적절히 조절할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 2) 이후에 갈바닉 교환법(galvanic replacement)을 이용하여 속이 빈 형태의 바디부를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, Au-Ag 헤드-바디 구조체를 합성한 다음, 탈이온수 중의 0.01 M cetyltrimethylammonium chloride (CTAC), 및 0.05 mM Gold(III) chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O)을 사용하여 갈바닉 교환법(galvanic replacement)으로 Au-Au 헤드-바디(hollow) 구조체를 형성하였다. 갈바닉 교환 반응을 수행함에 따라, 바디부의 은이 금으로 교환되고 속이 빈 형태가 형성되었다.
본 발명에서는 상기한 바와 같이 사용되는 금 또는 은 전구체의 농도, 환원제와 금 또는 은 전구체 간의 몰비, 안정화제로 사용 가능한 PVP 반복단위 수와 금 또는 은 전구체 간의 몰비, 금 또는 은 전구체의 첨가 속도 등을 변경함으로써 다양한 형태의 나노입자들을 제조할 수 있다. 또한, 이러한 다양한 형태의 복합 구조를 갖는 나노입자를 제조함에 따라 이미징 효과를 상승시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 나노입자의 표면에 검출하고자 하는 분석물을 인식할 수 있는 바이오분자를 기능화하는 단계; 상기 나노입자를 하나 이상의 분석물을 포함하는 샘플에 노출시키는 단계; 및 레이저 여기(excitation) 및 라만 분광법을 이용하여 하나 이상의 분석물을 검출 및 확인하는 단계를 포함하는, 분석물을 검출하는 방법을 제공한다.
상기 분석물의 예로, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 글리코프로테인, 리포프로테인, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 당, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 지방산, 지질, 호르몬, 대사산물, 사이토카인, 케모카인, 수용체, 신경전달물질, 항원, 알레르겐, 항체, 기질, 대사산물, 보조인자, 억제제, 약물, 약학물, 영양물, 프리온, 독소, 독물, 폭발물, 살충제, 화학무기제, 생체유해성 제제, 방사선동위원소, 비타민, 헤테로사이클릭 방향족 화합물, 발암물질, 돌연변이유발요인, 마취제, 암페타민, 바르비투레이트, 환각제, 폐기물 또는 오염물일 수 있다. 또한, 분석물이 핵산일 경우 상기 핵산은 유전자, 바이러스 RNA 및 DNA, 박테리아 DNA, 곰팡이 DNA, 포유동물 DNA, cDNA, mRNA, RNA 및 DNA 단편, 올리고뉴클레오티드, 합성 올리고뉴클레오티드, 개질된 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산, 자연적 및 합성핵산을 들 수 있다.
또한, 상기 나노입자에 기능화하는 바이오 분자의 예로, 항체, 항체 단편, 유전조작 항체, 단일 쇄항체, 수용체 단백질, 결합 단백질, 효소, 억제제 단백질, 렉틴, 세포 유착 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 핵산 또는 압타머를 들 수 있다. 기능화는 나노입자 표면에 바이오 분자를 정전기적 인력으로 부착시키거나, 직접 결합시키거나 또는 링커를 통하여 작용기화 할 수 있으며, 이러한 기능화 방법은 특별히 제한되지 않는다.
바람직하게, 본 발명의 분석물은 임의의 공지된 라만 분광법에 의해 검출 또는 확인될 수 있으며, 바람직하게는 표면 증강 라만 분광법(SERS, Surface Enhanced Raman Scattering), 표면 증강 공명 라만 분광법(SERRS, Surface enhanced resonance Raman spectroscopy), 하이퍼-라만 및/또는 비간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS, coherent anti-Stokes Raman spectroscopy)을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "표면 증강 라만 산란법(SERS)"이란 거칠게 처리된 특정 금속 표면에 흡착되어 있거나 수백 나노미터 이내의 거리에 위치해 있을 때 발생되는 라만 산란의 일종으로 이때 라만 산란의 세기는 일반 라만의 세기와 비교하여 106~108 배 이상 증가되는 현상을 이용한 분광법을 말한다. 용어 "표면 증강 공명라만 분광법(SERRS)"이란 SERS 활성 표면에서의 흡착물에 대한 레이저 여기 파장의 공명 현상을 이용한 분광법을 말한다. 용어 "비간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS)"이란 라만 활성 매질에 고정가변의 두 레이저 광을 입사시키고, 이들의 결합에 의해 얻어지는 반(反) 스토크스 방사의 스펙트럼을 측정하는 분광법을 말한다.
이러한 실시양태에서, 라만 활성 기판은 하나 이상의 라만 검출 단위장치와 작동가능하게 결합될 수 있다. 라만 분광법에 의한 분석물의 검출을 위한 여러 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예컨대, 미국특허 제6,002,471호, 제6,040,191호, 제6,149,868호, 제6,174,677호, 제6,313,914호). SERS 및 SERRS에서, 라만 검출의 감도는 거친 금속 표면, 예컨대 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄 표면 상에 흡수된 분자에 대해 106 이상으로 증강된다.
라만 검출 장치의 비제한적인 예는 미국특허 제6,002,471호에 개시되어 있다. 여기 빔은 532 nm 파장에서의 주파수 중첩된 Nd:YAG 레이저 또는 365 nm 파장에서의 주파수 중첩된 Ti:사파이어 레이저에 의해 생성된다. 펄스 레이저 빔 또는 연속 레이저 빔이 사용될 수 있다. 여기 빔은 공초점의 광학기 및 현미경 렌즈를 통과하여 하나 이상의 분석물을 함유하는 라만 활성 기판 상으로 초점이 모아진다. 분석물로부터의 라만 방출 광은 현미경 렌즈 및 공초점 광학기에 의해 모아지고 스펙트럼 분리를 위해 단색광장치와 결합된다. 공초점 광학기로는 배경 신호를 감소시키기 위한 다이크로익 필터(dichroic filter), 차단 필터, 공초점 핀홀, 대물렌즈 및 거울의 조합을 포함한다. 공초점 광학기 뿐만 아니라 표준 풀 필드(full field) 광학기도 사용될 수 있다. 라만 방출 신호는 신호를 카운팅하고 디지털화하는 컴퓨터와 인터페이스로 연결된 사태형 광다이오드를 포함하는 라만 검출기)에 의해 검출된다.
검출 장치의 또다른 예는 미국특허 제5,306,403호에 개시되어 있으며, 이로는 단광자 카운팅 방식으로 작동하는 갈륨-비소 광전자증배관(RCA Model C31034 또는 Burle Industries Model C3103402)이 구비된 스펙스 모델(Spex Model) 1403 이중 격자 분광계를 들 수 있다. 여기화 공급원은 스펙트라피직스(SpectraPhysics), 모델 166으로부터의 514.5 nm 선 아르곤-이온 레이저, 및 크립턴(krypton)-이온 레이저(Innova 70, 비간섭성)의 647.1 nm 선을 포함한다.
다른 여기화 공급원으로는 337 nm에서의 질소 레이저(레이저 사이언스 인코포레이티드(Laser Science Inc.) 및 325 nm에서의 헬륨-카드뮴 레이저(라이코녹스(Liconox)(미국특허 제6,174,677호), 발광 다이오드, Nd:YLF 레이저, 및/또는 다양한 이온 레이저 및/또는 염료 레이저를 포함한다. 여기 빔은 밴드패스 필터(Corion)에 의해 스펙트럼으로 정제되어 6X 대물 렌즈(Newport, Model L6X)를 이용하는 라만 활성 기판 상에 초점화될 수 있다. 대물 렌즈는 홀로그래피 빔 스플리터(Kaiser Optical Systems, Inc., Model HB 647-26N18)를 이용하여 분석물을 여기시키고 라만 신호를 수집하여 여기 빔 및 방출된 라만 신호에 대한 직각 형태를 만드는데 모두 사용될 수 있다. 홀로그래피 노치 필터(Kaiser Optical Systems, Inc.)는 레이라이(Rayleigh) 산란 방사선을 감소시키는데 사용될 수 있다. 다른 라만 검출기로는 적색 증강된 고감도 전하 결합 소자(RE-ICCD) 검출 시스템(Princeton Instruments)이 장착된 ISA HR-320 분광기를 포함한다. 푸리에 변환 분광기(마이컬슨 간섭계에 기초함), 하전된 주입 장치, 광다이오드 어레이, InCaAs 검출기, 전자증배 CCD, 고감도 CCD 및/또는 광트랜지스터 어레이 등 다른 유형의 검출기가 사용될 수 있다.
당해 분야에 공지된 임의의 적절한 형태 또는 구성의 라만 분광법 또는 관련 기법이 분석물 검출에 사용될 수 있으며, 이로는 노말 라만 스캐터링, 공명 라만 스캐터링, 표면 증강 라만 스캐터링, 표면 증강 공명 라만 스캐터링, 비간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS), 자극 라만 스캐터링, 역 라만 분광법, 자극 게인 라만 분광법, 하이퍼-라만 스캐터링, 분자 광학 레이저 시험기(molecular optical laser examiner, MOLE) 또는 라만 마이크로탐침 또는 라만 현미경법 또는 공초점 라만 마이크로분광기, 3차원 또는 스캐닝 라만, 라만 포화 분광법, 시간 분해 공명 라만, 라만 해리 분광법 또는 UV-라만 현미경법을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 라만 검출 장치는 컴퓨터와 작동가능하게 결합될 수 있다. 검출 장치로부터의 데이터는 프로세서에 의해 처리되고 데이터는 주기억장치에 저장될 수 있다. 표준 분석물에 대한 방출 프로파일 상의 데이터는 또한 주기억 장치 또는 ROM에 저장될 수 있다. 프로세서는 라만 활성 기판에서의 분석물로부터의 방출 스펙트럼을 비교하여 샘플의 분석물 유형을 확인할 수 있다. 프로세서는 검출 장치로부터의 데이터를 분석하여 여러 분석물의 정체 및/또는 농도를 측정할 수 있다. 서로 다르게 구비된 컴퓨터는 특정 이행에 사용될 수 있다. 따라서, 시스템의 구조는 본 발명의 상이한 실시양태에서 다를 수 있다. 데이터 수집 작업 이후, 전형적으로 데이터는 데이터 분석 작업으로 보내질 것이다. 분석 작업을 용이하게 하기 위해, 검출 장치에 의해 수득된 데이터는 상기한 바와 같이 디지털 컴퓨터를 사용하여 전형적으로 분석할 것이다. 전형적으로, 컴퓨터는 검출 장치로부터의 데이터 수용 및 저장 뿐만 아니라 수집된 데이터의 분석 및 보고를 위해 적절히 프로그래밍될 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 나노입자를 포함하는, 분석물 검출용 키트를 제공한다. 이러한 검출 키트에는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자는, 종래 검출을 위하여 사용되는 분자진단 칩 분야 또는 종래 영상진단에 사용되는 나노입자를 대체할 수 있다. 이에 본 발명에 따른 나노입자는 DNA 칩, 단백질 칩 등 분자진단 칩 분야에 응용이 가능하며, 검출하고자 하는 분석물은 유전자, 바이러스 RNA 및 DNA, 박테리아 DNA, 곰팡이 DNA, 포유동물 DNA, cDNA, mRNA, RNA, DNA 단편, 올리고뉴클레오타이드, 합성 올리고뉴클레오티드, 개질된 올리고뉴클레오티드, 단일 및 이중가닥 핵산, 자연적 및 합성 핵산, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 글리코프로테인, 리포프로테인, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 당, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 지방산, 지질, 호르몬, 대사산물, 사이토카인, 케모카인, 수용체, 신경전달물질, 항원, 알레르겐, 항체, 기질, 대사산물, 보조인자, 억제제, 약물, 약학물, 영양물, 프리온, 독소, 독물, 폭발물, 살충제, 화학무기제, 생체유해성 제제, 방사성 동위원소, 비타민, 헤테로사이클릭 방향족 화합물, 발암 물질, 돌연변이 유발요인, 마취제, 암페타민, 바르비투레이트, 환각제, 폐기물, 오염물 등에 적용 가능하다.
또한, DNA, 특정 질병의 발병과 진행에 관계있는 단백질(바이오 마커) 등 분석물의 검출에 고도로 적용이 가능하며, 대규모 게놈 서열 분석, 단일염기 다형성(SNP)의 검출, 서열 비교, 유전자형별 분석, 질병 상관 및 약제 개발 등의 분자 진단방법 및 분자영상분야에 응용이 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 나노입자의 표면에는 다른 신호를 나타낼 수 있는 물질을 나노입자의 내부 또는 외부에 포함할 수 있으며, 예컨대 CT 조영제, MRI 조영제, 광학 조영제, 초음파 조영제 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 이에 따라 나노입자에 의한 라만 분석과 함께 CT, MRI, 광학 또는 초음파 분석을 동시에 할 수 있다는 특징이 있다.
또한, 본 발명에 따른 나노입자는 유전자, 항체 또는 약물 등을 포함할 수 있으며, 이에 따라 나노입자를 약물의 전달체(carrier)로 사용하여 질병의 치료에 사용할 수 있다.
이하 본 발명의 구성을 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
본 발명은 수성 조건 하에서 단순히 염의 농도(일 실시예로서 NaCl의 농도)를 조절함으로써 고수율(>95%)로 Au-Ag 헤드-바디 나노스노우맨 입자를 합성하기 위한 DNA-기초 방법을 제공한다(도 1).
DNA-개질된 금 나노입자(DNA-AuNP)의 표면 상의 은 나노입자(AgNP)의 비대칭적인 성장이 반응 용액에 낮은 염 농도가 가해졌을 때 관찰되었다. 중요한 것은, 비대칭적으로 개질된 DNA를 갖는 이러한 나노스노우맨 입자들이 다양한 복합 나노구조체의 배향된 어셈블리를 위한 빌딩 블록으로서 사용될 수 있음을 확인하였다는 것이다. 전형적으로, 은 쉘 형성제가 DNA-AuNP에 첨가되었을 때, 구형 Au-Ag 코어-쉘 구조체가 형성된다(Lim, D. -K. et al., Chem . Comm ., 2008, 5312; Lim, D. -K. et al., Nature Mater ., 2010, 9, 60; Lim, D. -K. et al., Nature Nanotech ., 2011, 6, 452). 그러나, 본 발명에서는 비등방성의 Au-Ag 헤드-테일 나노스노우맨 구조체가 단순히 염 농도를 낮추고 DNA-AuNP 표면 상에서 AgNP를 형성시켜 성장시키기 위한 적절한 환원제 및 폴리머를 첨가함으로써 얻어질 수 있음을 확인하였다. AuNP 표면 상의 DNA는 높은 입자 안정성, 효과적인 표면 보호 및 배향된 입자 성장의 제어가능성을 제공한다. Au 표면 상의 Ag 성장의 반응 속도는 더욱 낮은 염 농도에서 훨씬 빨라지며, 염은 AuNP 상의 DNA 스트랜드 사이의 반발력을 감소시킬 수 있다(Hurst, S. J. et al., Anal . Chem ., 2006, 78, 8313). 이는 낮은 염 농도가 AuNP 표면 상의 DNA 스트랜드 사이의 공간을 보다 자유롭게 하고, 핵형성 부위 상에서 Ag 전구체를 보다 쉽게 통제할 수 있게 한다는 점을 나타낸다. 일단 Au 표면 상의 한 부위에서 Ag 구조체가 버딩(budding)되기 시작하면, Ag 구조체가 버딩된 부위 상에서 더욱 쉽게 증착되게 된다. 흥미롭게도, 이러한 비대칭적 성장으로 인하여, DNA 스트랜드가 Ag가 성장하는 면에 묻히게 되면서, Ag가 버딩되지 않은 다른 Au 표면은 혼성화될 수 있는 노출된 DNA를 갖는다. 비대칭적으로 개질된 DNA를 갖는 이러한 스노우맨 입자는 다양한 정렬 및 비정규 나노구조체의 DNA-기초 어셈블리를 위한 플랫폼을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 비등방성 나노입자 합성 및 나노구조 재료의 어셈블리 및 적용을 위한 새로운 이해와 기초를 제공할 수 있다.
본 발명은 다양한 정렬 및 비정규 나노구조체의 DNA-기초 어셈블리를 위한 플랫폼을 제공할 수 있으며, DNA, 특정 질병의 발병과 진행에 관계있는 단백질(바이오마커) 등 분석물의 검출에 고도로 적용이 가능하고, 대규모 게놈 서열 분석, 단일 염기 다형성(SNP)의 검출, 서열 비교, 유전자형별 분석, 질병 상관 및 약제 개발 등에 사용할 수 있는 나노스노우맨 형태의 헤드-바디부로 이루어진 나노입자를 제공할 수 있는 효과가 있다.
도 1a는 염(NaCl)의 농도를 변화시킴에 따른 Au-Ag 헤드-바디 나노입자의 형태 변화를 도식적으로 나타낸 것(상단)과, 반응 용액의 색 변화(하단)를 나타낸다.
도 1b는 0.3 M(b-1), 0.1 M(b-2) 및 0.003 M(b-3)의 다른 염 농도에서 합성된 나노입자의 HR-TEM 이미지, 및 UV-Vis 스펙트럼(b-4)이다.
도 2는 염(NaCl)의 농도를 변화시킴에 따른 염-의존적인 반응 동력학 그래프를 나타낸다. 이때 삽입도는 0 내지 30분의 반응 시간 영역을 확대한 도이다.
도 3은 <1 nM 염 농도에서 합성된 Au-Ag 헤드-바디 나노입자의 HR-TEM 이미지이다.
도 4는 0 M(a) 및 0.003 M(b) 염 농도에서 DNA 없이 제조된 Au-Ag 헤드-바디 나노입자의 HR-TEM 이미지이다.
도 5는 0.003 M 염 농도에서 4개의 다른 서열, A30-SH, A10-SH, T30-SH, T10-SH를 이용하여 제조된 Au-Ag 헤드-바디 나노입자의 DNA 서열-의존적 반응 동력학을 나타내는 그래프 및 TEM 이미지이다.
도 6은 0.003 M 염 농도에서 2개의 다른 서열, 15mer-PEG-A10-SH, 15mer-A10-SH를 이용하여 제조된 Au-Ag 헤드-바디 나노입자의 반응 동력학을 나타내는 그래프 및 TEM 이미지이다.
도 7은 다른 염 농도에서의 반응 메커니즘을 도식화한 것(a), 0.003 M 및 0.3 M 염 농도에서의 DNA-AuNP의 제타 전위 결과(b-좌), 및 중간 단계에서 DNA-AuNP 표면상에 Ag 나노구조체가 형성된 모습을 보여주는 HR-TEM 이미지(b-우)이다.
도 8은 비대칭적인 DNA 개질을 갖는 본 발명의 DNA-나노스노우맨 형태의 나노입자의 방향성 있는 어셈블리 과정을 도식적으로 나타낸 것(a)과, 상기 어셈블리 나노구조체의 HR-TEM 이미지(b)이다.
도 9a는 전구체 첨가량을 증가시킴에 따른 반응 용액의 색 변화를 나타낸 것이다.
도 9b는 전구체 첨가량을 증가시킴에 따른 Au-Au 헤드-바디 나노입자의 HR-TEM 이미지이다.
도 9c는 전구체 첨가량을 증가시킴에 따른 Au-Au 헤드-바디 나노입자의 UV-Vis 스펙트럼이다.
도 10은 다른 크기를 갖는 Au-Au 헤드-바디 나노입자의 표면 증강 라만 산란(SERS) 스펙트럼이다.
도 11은 나노스노우맨 형태의 Ag-Ag 헤드-바디 나노입자의 고분해능 투과 전자 현미경 사진이다.
도 12는 나노스노우맨 형태의 Ag-Ag 헤드-바디 나노입자의 표면 증강 라만 산란(SERS) 스펙트럼이다.
도 13 내지 16은 나노스노우맨 형태의 Au-Ag 헤드-바디 나노입자의 표면 증강 라만 산란(SERS) 스펙트럼 분석 결과이다.
도 17은 나노막대 형태의 헤드부와 구형의 Ag 바디부를 갖는 나노입자를 형성하는 반응 메커니즘을 도식적으로 나타내고, 상기 형성된 나노구조체의 고분해능 투과 전자 현미경 사진을 보여준다.
도 18은 나노직육면체 형태의 헤드부와 구형의 Ag 바디부를 갖는 나노입자를 형성하는 반응 메커니즘을 도식적으로 나타내고, 상기 형성된 나노구조체의 고분해능 투과 전자 현미경 사진을 보여준다.
도 19는 구형의 헤드부와, 나노막대 또는 나노직육면체형의 Ag 바디부를 갖는 나노입자를 형성하는 반응 메커니즘을 도식적으로 나타내고, 상기 형성된 나노구조체의 고분해능 투과 전자 현미경 사진을 보여준다.
도 20은 구형의 헤드부와, 속이 빈 형태의 Au 바디부를 갖는 나노입자를 형성하는 반응 메커니즘을 도식적으로 나타내고, 상기 형성된 나노구조체의 고분해능 투과 전자 현미경 사진을 보여준다.
이하 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되지는 않는다.
실시예 1: 재료 및 방법
재료
모든 화학 물질[AgNO3, 폴리비닐피롤리돈(MW 40,000 및 10,000, K value: 29-32), (+)-소듐 L-아스코르베이트, 히드록실 아민, 디티오트레이톨 및 소듐 도데실 설페이트]은 시그마-알드리치사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 추가 정제 없이 사용하였다. Au 나노입자(AuNPs)는 테드 펠라사(Ted Pella, Inc., Redding, CA, USA)로부터 구입하였다. HPLC로 정제된 올리고뉴클레오티드 및 NAP-5 컬럼은 각각 아이디티사(IDT, Inc., Coralville, IA, USA) 및 지이 헬쓰케어사(GE Healthcare, Sephadex G-25 medium, DNA grade)로부터 구입하였다. 초순수 (NANOpure water, >18.0 MΩ, Milli-Q)를 모든 실험에 사용하였다.
방법
HR - TEM 분석
Formvar/carbon이 코팅된 copper grid(Ted Pella, Inc. Redding, CA, USA) 및 HR-TEM(JEOL, Japan, 300 kV)을 HR-TEM 분석을 위해 사용하였다.
DNA - 개질된 금 나노입자의 제조
문헌에 개시된 과정에 기초하여 금 나노입자(AuNP)를 올리고뉴클레오티드로 개질하고 특성을 분석하였다(Hurst, S. J. et al., Anal . Chem ., 2006, 78, 8313; Lim, D. -K. et al., Nature Mater ., 2010, 9, 60). 올리고뉴클레오티드는 인산염 완충액(0.17 M, pH = 8.0) 중에서 디티오트레이톨(DTT, 0.1 M)로 환원시킨 다음 탈염 NAP-5 컬럼을 이용하여 정제하였다. DNA 개질된 금 나노입자의 제조를 위하여, 정제된 DNA[5'-TAACAATAATCCCTC-PEG18-A10-(CH2)3-SH-3']를 30 nm AuNP 용액과 혼합하였다. 30 nm 금 나노입자 당 ~200 스트랜드의 DNA 로딩양을 나타냄을 문헌에 기초하여 확인하였다(Lim, D. -K. et al., Nature Mater ., 2010, 9, 60). 구체적으로, 193 ㎕의 44.9 μM DNA 용액을 5 mL의 1.0 nM AuNP 용액과 혼합하였다. 과량의 DNA(30 배 이상)를 DNA-개질 과정을 위해 첨가하였다. 상기 혼합물을 100 mM 인산염 완충액을 이용하여 최종 인산염 농도가 10 mM(pH 7.4)이 되도록 조정하였다. 상기 생성된 용액을 호일로 싸고 상온에서 60 분 동안 오비탈 쉐이커 상에 두었다. 그 다음, 상기 혼합물을 매 20 분 마다 염 완충액(2 M NaCl, 10 mM PB)을 첨가하여 0.3 M NaCl(0.05 M × 2 및 0.1 M × 2)로 조정하였으며, 이때 DNA 염기와 금 표면의 상호작용을 최소화하기 위하여 매 단계 이후 수조 내에서 70℃로 5 분 동안 가열하였다. 상기 염-숙성 과정 후, 상기 용액을 상온에서 하룻밤 동안 배양하였다. 그 다음 상기 용액을 10,000 rpm으로 15 분 동안 원심분리하고 상등액을 조심스럽게 제거하여 비개질된 DNA를 제거하고 염 농도를 낮추었다. 상기 침전물을 10 mM PB 용액 중에 재분산시켰다(pH 7.4; 이 과정은 5회 반복하였다). 예를 들어, 1 mL의 DNA 개질된 용액을 10,000 rpm으로 15 분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하여 20 ㎕의 침전물을 함유하는 용액을 남긴 다음 980 ㎕의 10 mM PB 중에 재분산시켰다. 결과적으로, 상기 반복 세척 과정(5회) 이후 염의 최종 농도를 ~1 nM로 조정하였다. 마지막으로, 상기 침전물을 0.3 M, 0.1 M, 0.003 M NaCl(10 mM PB, pH 7.4)의 원하는 PBS 용액 중에 재분산시켰다. 이러한 DNA 개질된 금 나노입자를 비대칭 Ag 나노구조 성장을 위한 시드(seed)로서 사용하였다. DNA 개질된 금 나노입자의 농도는 UV-Vis 분광기(Agilent 8453 spectrophotometer, USA)를 이용하여 분석하였다.
단일 상보 DNA2 개질된 13 nm 금 나노입자를 제조하기 위하여, 미리 혼합한 프로브 DNA2[5'-HS-(CH2)6-A10-PEG18-ATCCTTATCAATATT-3'] 및 보호 DNA[5'-CACGAGTTTCTCAAA-PEG18-A10-(CH2)3-SH-3']를 금 나노입자에 접합시켰다. DNA 로딩 수는 화학량론적으로 조절하였다(문헌에 기초하여 13 nm 금 나노입자에 대하여 [보호 DNA] : [프로브 DNA] = 69 : 1)(Hurst, S. J. et al., Anal . Chem ., 2006, 78, 8313; Lim, D. -K. et al., Nature Mater ., 2010, 9, 60). 과량의 DNA(금 나노입자의 수보다 ~30 배 이상)를 DNA 개질 과정을 위해 첨가하였다. 예를 들어, 656.1 ㎕(31.0 μM)의 보호 DNA 및 51.1 ㎕(5.8 μM)의 프로브 DNA2를 2 mL(4.9 nM)의 13 nm 금 나노입자에 첨가하였다. 상기 혼합물을 상기와 동일한 과정으로 0.3 M NaCl까지 조정하였다.
실시예 2: 나노스노우맨 형태의 Au - Ag 헤드- 바디 나노입자의 제조
DNA-AuNP 표면상에 Ag 구조체를 성장시키기 위하여, 시드(seed)로서 상기 실시예 1에서 제조한 DNA-AuNP를 이용하고 Ag 전구체 및 다른 시약을 첨가하여 나노스노우맨 구조체를 합성하였다.
탈이온수 중의 1% 폴리비닐피롤리돈(PVP), 0.1 M (+)-소듐 L-아스코르베이트(L-SA) 및 1 mM 질산은(AgNO3)을 사용하여 폴리머 보조의 화학적 환원법으로 Au-Ag 헤드-바디 나노스노우맨 구조체를 형성하였다. PVP, L-SA 및 Ag 전구체를 상기 실시예 1에서 제조한 DNA-개질 AuNP 시드 용액에 순차적으로 첨가하였다. 환원제와 Ag+ 간의 몰비(L-SA/Ag), 및 PVP 반복단위 수와 Ag+ 간의 몰비(PVP/Ag)는 각각 50 및 30이었다. 전형적으로, 100 ㎕의 0.2 nM DNA-AuNP는 상온에서 각각 19.8 ㎕의 1% PVP 및 29.7 ㎕의 0.1 M L-SA의 존재하에 59.4 ㎕의 1 mM AgNO3 용액과 반응하였다. 상기 생성된 혼합물을 오비탈 쉐이커 상에서 부드럽게 흔들어주었다. 반응이 완료된 후, 상기 용액을 7 분 동안 8,000 rpm으로 원심분리하여 미반응 잔여물을 제거한 다음, 탈이온수 중에 재분산시켰다.
실시예 3: 염 농도에 따른 나노입자의 구조적 변형 조사
높은 농도로부터 매우 낮은 농도(0.3 M, 0.1 M 및 0.003 M NaCl)까지 염의 양을 변화시킴으로써, 구형의 Au-Ag 코어-쉘 입자로부터 Au-Ag 헤드-바디 나노스노우맨 입자로 구조적 변형이 일어남에 따라 용액의 색이 노란색으로부터 오렌지색, 암녹색 및 밝은 녹색으로 달라지는 것으로 나타났다(도 1a).
형성된 나노구조체는 고분해능 투과 전자 현미경(HR-TEM; JEOL, Japan, 300 kV) 및 UV-Vis 분광광도계(Agilent 8453 spectrophotometer, USA)로 확인하였다. 도 1b는 다른 염 농도에서 반응시킨 후 얻어진 나노구조체의 HRTEM 이미지를 나타낸다. 도 1b를 통해, 구형 입자로부터 스노우맨-유사 나노구조체로의 구조적 변화를 확인할 수 있다. UV-Vis 데이터를 통해(도 1b-4), 나노구조체 유래의 플라즈몬 피크가 염의 양이 변화함에 따라 크게 영향을 받으며, 매우 낮은 염 농도에서 630 nm의 새로운 플라즈몬 밴드가 나타남을 알 수 있다. 일반적으로, 전하가 거울 대칭으로 분리될 때, 이것이 전자 진동을 위한 주요 복원력을 제공하기 때문에, 공명 피크의 세기가 증가한다. 그러므로, 일반적으로 세로 피크의 세기는 입자의 효과적인 쌍극자 모멘트의 증가로 인하여 가로 피크보다 더욱 높으며, 이는 거울 대칭으로 전하가 분리되는 경우 더욱 커진다. 본 발명에서 세로 밴드의 진폭이 가로 모드의 진폭보다 더 낮은 이유는 나노스노우맨 구조체의 거울 대칭이 완전히 등방성이 아니고, 또한 Au-Ag 이중금속 조성이 거울 대칭의 비등방성에 영향을 줄 수 있기 때문이다(Tan, S. J. et al., Nature Nanotech, 2011, 6, 268; Wiley, B. J. et al., J. Phys. Chem ., 2006, 110, 15666).
AuNP 표면상에서의 비대칭적인 Ag 성장은 도 1b-2 및 도 1b-3의 이미지 모두에서 명확히 나타났으나, 매우 낮은 염의 경우(도 1b-3)에 스노우맨 나노구조체가 훨씬 더욱 높은 수율로 더욱 재현성있게 성장하였다. 구형 코어-쉘, 나노스노우맨 중간체 및 나노스노우맨의 최장축 길이는 각각 대략 46 nm, 50 nm 및 64 nm이었다(각각의 경우 200개의 입자를 측정함).
구조적 변화에 대한 TEM 결과는 UV-Vis 결과와 잘 일치하였으며, 이는 염 농도가 감소함에 따라 구형 형태로부터 로드 또는 다이머 형태로의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 밴드 특징이 나타남을 보여주었다(도 1b-4). 세로축을 초래하는, 2차 SPR 모드는 나노입자 형태가 길어지는(예를 들어, 로드 및 다이머) 장파장 영역에서 나타나기 시작하는 것으로 알려져 있다(Lassiter, J. B. et al., Nano Lett ., 2008, 8, 1212).
실시예 4: 염-의존적 반응 동력학 분석
반응 메커니즘과 DNA 및 염 농도의 역할을 조사하기 위하여 UV-Vis 분광광도계를 통해 염-의존적 반응 동력학을 분석하였다.
염 농도를 변경시키는 것을 제외하고, 모든 실험에서 동일한 양의 PVP, L-SA 및 Ag 전구체를 사용하고 온도(상온)를 동일하게 유지하였다.
도 2는 3가지 경우의 다른 염 농도(0.3 M, 0.1 M 및 0.003 M NaCl)에서 시간의 함수로서 400 nm에서의 흡광도 변화를 보여준다. UV-Vis 스펙트럼은 매분마다 측정하였다. 전체적으로, 염 농도를 0.3 M로부터 0.003 M로 낮춤에 따라 반응 속도가 급격하게 빨라지는 것으로 나타났다. 반응 완료 시간은 0.003 M, 0.1 M 및 0.3 M NaCl에 대하여 각각 대략 15 분, 3 시간 및 5 시간이었다. 반응은 매우 낮은 염 농도에서 특히 매우 빠르게 완료되었다(도 2의 삽입도 참조). 나노스노우맨 입자를 형성하는데 있어 0.003M NaCl의 이러한 빠른 동력학은, AuNP 표면상에서의 Ag의 빠른 핵형성 및 성장이 고수율로 특정 나노구조체를 형성하는데 있어 중요하고 낮은 염 농도가 이러한 과정을 촉진시킨다는 점을 나타낸다. 거의 염이 없는 조건(<1 nM)의 경우, 반응은 ~2 분 이내에 완료되었다. TEM 이미지 분석 결과, 나노스노우맨 구조체가 단지 부분적으로 형성되고, 구형 코어-쉘 입자 및 불규칙적인 형태의 나노구조체를 포함하는 많은 다른 구조체가 제어 불가능하게 빠른 반응 동력학으로 인하여 또한 형성되었다(도 3). 이는 낮은 농도가 보다 빠른 동력학 및 고수율의 균일한 나노스노우맨 구조체의 형성을 위해 바람직하나, 용액 중에 염이 거의 없는 경우 반응이 제어 불가능하게 되고 다소 무작위적인 나노구조체가 발생한다는 점을 나타낸다.
실시예 5: 본 발명 나노입자 형성에 대한 DNA 및 염의 존재의 영향 조사
DNA의 영향 및 염의 존재와 이의 관계를 이해하기 위하여, 2개의 다른 염 농도(0.003 M 및 염 무처리시)에서 DNA로 개질되지 않은 AuNP를 사용하여 반응을 수행하였다. 염이 없는 경우, 반응은 수초 내에 완료되었으며, Ag 구조체가 불규칙적인 형태로 많은 다른 방향으로 AuNP 표면으로부터 성장하고 버딩되었다(도 4-a). 0.003 M 염의 경우, 비록 반응 속도가 느리고(~15 분), AuNP 표면으로부터 Ag의 성장이 보다 방향성이 있는 것으로 관찰되었으나, DNA 없이는 명확한 형태를 갖는 특정 구조체가 합성되지 않았다(도 4-b). 이러한 결과를 통해, AuNP 표면상에 DNA가 존재하는 것이 제어 가능한 유형으로 고수율의 나노스노우맨 구조체를 형성하는데 있어 중요하고, 또한 염을 조절하는 것이 AuNP 표면상의 Ag 구조체의 방향성이 있는 성장을 유도하는데 중요한 역할을 한다는 점을 알 수 있었다.
실시예 6: 본 발명 나노입자 형성에 대한 PEG 또는 DNA 서열의 영향 조사
Ag 성장에 대한 PEG 또는 DNA 서열의 영향을 확인하기 위하여, 5개의 다른 DNA 서열(DNA 서열 영향에 대한 A30-SH, A10-SH, T30-SH, T10-SH, 및 PEG 영향에 대한 15mer-PEG- A10-SH, 15mer-A10-SH)을 사용하여 실험을 수행하였다.
그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
A 염기는 T 염기보다 Au 표면에 대한 더욱 강한 바인더이므로, 결과적으로 폴리 A DNA는 폴리 T DNA보다 AuNP 당 더욱 적은 로딩 양을 갖게 되는 것으로 보고된바 있다(Storhoff, J. J. et al., Langmuir, 2002, 18, 6666). 도 5는 생성된 나노스노우맨 구조체가 서로 유사하나, 폴리 A 서열이 폴리 T 서열에 비해 더욱 빠른 동력학을 발생시킨다는 것을 보여준다. 이는 더욱 긴 A30 또는 T30 서열이 A10 또는 T10 서열보다 더욱 빠른 동력학을 유도하는 것으로 인하여 더욱 명확해졌다. PEG의 경우, AuNP 당 개질된 DNA의 수는 티올화 DNA 서열 내에 PEG를 삽입시킴으로써 증가한다(Hurst, S. J. et al., Anal . Chem ., 2006, 78, 8313). 실험 결과, PEG의 추가는 Ag 성장 동력학을 늦추는 것으로 나타났다(도 6).
실시예 7: 본 발명 나노입자 형성에 대한 PVP 의 영향 조사
Ag 성장에 대한 PVP의 역할을 조사하기 위하여, PVP의 존재 여부에 따른 나노입자 형성 과정을 분석하였다.
그 결과, PVP 없이 AuNP 표면상의 Ag 증착이 일어나지 않음을 확인하였다. PVP는 PVP의 산소 또는 질소 원자의 비공유 전자쌍을 공여함으로써 킬레이트화를 통해 Ag 이온을 통제하고 전달함으로써, 수용액 중에서 배위 착체를 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다(Zhang, Z. et al. J. Solid State Chem ., 1996, 121, 105). 또한, 많은 클로라이드 이온이 존재하기 때문에, 은 이온은 PVP가 없으면 AgCl의 침전물을 형성할 수 있으나, 용액 중에서 침전물은 관찰되지 않았다.
실시예 8: 나노스노우맨 형태의 Au - Ag 헤드- 바디 나노입자 형성을 위한 반응 메커니즘 분석
상기 실시예 3 내지 7의 결과를 통해, Au-Ag 나노스노우맨을 형성하기 위하여 AuNP 표면상에서 Ag 나노구조체가 비대칭적으로 성장하는 반응 메커니즘이 도 7a와 같음을 알 수 있었다.
염은 DNA 스트랜드 사이의 반발력을 감소시켜, AuNP 표면상의 DNA 로딩을 증가시키고 DNA 구조를 더욱 곧게 하고 균일하게 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다(Hurst, S. J. et al., Anal . Chem ., 2006, 78, 8313). 더욱 낮은 염 농도가 가해진 경우, 더욱 적은 양의 염이 AuNP 주변에 존재하고, AuNP 표면상에 덜 균일한 DNA 구조를 형성시킬 수 있게 된다. AuNP 상의 염 분포 및 DNA 구조는, 특히 Ag 전구체가 벌키한 PVP에 의해 핵형성 및 이어지는 Ag 구조체 성장을 위하여 AuNP 표면에 전달되어지는 경우에, DNA-AuNP 상에서의 Ag 구조체 성장에 있어 중요한 인자이다.
도 7a(상단)에서 보여주듯이, 고도의 염 농도에서 염은 DNA-AuNP 주변에 치밀하게 채워져 보호층(passivation layer)을 형성할 수 있고, DNA 스트랜드는 AuNP 주변에 상당히 균일하게 분포된다. 결과적으로, 고도의 염 농도에서는, Ag-PVP 착체가 이러한 염 층을 침투하기 어려워 더욱 느린 반응 동력학이 관찰되었다. DNA 구조의 균일성으로 인하여, 다중의 핵형성 부위가 천천히 형성될 수 있고 이와 동시에 Au-Ag 코어-쉘 나노구체를 형성할 수 있다. 반대로, 낮은 염 농도의 경우, 덜 균일한 DNA 구조가 AuNP 표면상에 형성될 수 있어 특정 방향으로 Ag-PVP의 도입을 촉진하고 덜 치밀하고 불완전한 염 층이 DNA-AuNP 주변에 형성된다(도 7a, 하단). Ag-PVP 착체는 AuNP 표면으로 보다 용이하게 접근할 수 있고, 일단 Ag 핵형성 부위가 형성되면, 접근된 Ag-PVP 착체로부터 Ag가 이미 형성된 Ag 부위에 우선적으로 증착되어져 더욱 빠른 반응 동력학을 발생시키고 AuNP 표면상의 Ag 나노구조체의 방향성 있는 성장을 유도한다.
제타 전위 값은 더욱 낮은 염 농도에서 더욱 음의 값이었으며, 이는 DNA 인산 골격이 음으로 하전되어 있고 DNA 스트랜드 사이의 염이 전하 스크리닝 효과를 발생시켜, 결과적으로 더 낮은 염 조건하에서는 더 적은 양의 염이 DNA-AuNP 주변에 분포하게 되기 때문인 것으로 보인다(도 7b).
또한 낮은 염 농도에서는 Cl- 이온이 덜 존재하여, 화학적 평형(Ag+ + Cl- ↔ AgCl)에 영향을 줄 수 있다. 제안된 메커니즘은 또한 중간 단계(0.3 M 및 0.003 M NaCl 조건에 대하여 반응 개시 이후 120분 및 3분) 도중의 입자의 HR-TEM 이미지에 의해 뒷받침된다(도 7b). TEM 이미지는 0.003 M NaCl 경우에 비대칭적인 Ag 버딩 과정이 관찰되나, 0.3 M NaCl의 경우 Au 표면 전체에 Ag 쉘이 다소 균일하게 성장하는 것을 보여준다. 성장 단계에서, 초기 핵형성 단계 이후 이미 존재하는 핵형성 부위 상에 증착되는 것이 훨씬 더 쉽기 때문에, Ag 전구체의 환원은 핵형성 부위에서 우선적으로 발생한다(Gu, H. et al., J. Am . Chem . Soc ., 2005, 127, 34; Gu, H. et al., J. Am . Chem . Soc ., 2004, 126, 5664).
실시예 9: 본 발명의 나노입자를 이용한 방향성 있는 어셈블리 제조
DNA-나노스노우맨 입자는 비대칭적으로 성장되는 나노구조체를 가질 뿐만 아니라 이들 표면상의 비대칭적인 DNA 개질도 가짐을 알 수 있다. Au 헤드 부위 상에서, DNA는 상보적 DNA에 노출되어 쉽게 혼성화될 수 있다. 다른 한편으로, Ag 바디 부위상에서, DNA는 Ag 구조 내에 묻혀 상보적 DNA 커플링이 불가능하다(도 8a). 이러한 비대칭적인 특징을 이용하여, 다양하고 독특한 나노구조체의 방향성 있는 어셈블리를 제공할 수 있다.
먼저, DNA1-나노스노우맨(5'-TAACAATAATCCCTC-PEG18-A10-(CH2)3-SH-3'-Au)에 단일의 상보적 DNA2-개질된 AuNP(직경 13 nm, Au-5'-HS-(CH2)6-A10-PEG18-ATCCTTATCAATATT-3')를 첨가하였다. 2개의 반-상보적(half-complementary) DNA-개질된 나노입자를 연결하는, 과량의 링커 DNA(5'-GAGGGATTATTGTTAAATATTGATAAG-GAT-3', AuNP 농도 대비 10,000-배 더 많은 양)를, 0.15 M PBS 용액 중에서 DNA-개질된 나노입자를 혼성화시키기 위하여 사용하였다. 도 8b-1은 단일의 상보적 DNA2-개질된 AuNP와 함께 DNA1-나노스노우맨을 갖는 조립된 구조체의 HR-TEM 이미지를 보여준다. 이들 결과를 통해, 13 nm AuNP가 특히 Au 헤드 영역에 조립되는 것을 알 수 있다. 상보적 DNA2-개질된 AuNP(직경 30 nm)가 DNA1-나노스노우맨에 첨가되었을 때, 나노스노우맨 내 Au 헤드 부분으로의 AuNP의 우선적인 결합을 통한 다양한 나노구조체의 배향된 어셈블리들이 관찰되었다(도 8b-2). 마지막으로, DNA2-나노스노우맨 및 링커 DNA가 DNA1-나노스노우맨에 첨가되었다. 그 결과, DNA-나노스노우맨 입자의 Au 헤드 부분 간의 우선적인 결합을 통해 고도로 배향된 나노어셈블리 구조체들이 형성되었다(도 8b-3).
실시예 10: 나노스노우맨 형태의 Au - Au 헤드- 바디 나노입자의 제조
DNA-AuNP 표면상에 Au 구조체를 성장시키기 위하여, 시드(seed)로서 상기 실시예 1의 방법으로 제조한 DNA-AuNP(20nm 금나노입자)를 이용하고 Au 전구체 및 다른 시약을 첨가하여 나노스노우맨 구조체를 합성하였다.
탈이온수 중의 1% 폴리비닐피롤리돈(PVP), 0.1 M (+)-소듐 L-아스코르베이트(L-SA) 또는 hydroxyl amine(HA) 및 1 mM HAuCl4를 사용하여 폴리머 보조의 화학적 환원법으로 Au-Au 헤드-바디 나노스노우맨 구조체를 형성하였다. PVP, HA 및 Au 전구체를 상기 실시예 1에서 제조한 DNA-개질 AuNP 시드 용액에 순차적으로 첨가하였다. 환원제와 Au+ 간의 몰비(HA/Au), 및 PVP 반복단위 수와 Au+ 간의 몰비(PVP/Au)는 각각 50 및 2이었다. 전형적으로, 100 ㎕의 0.2 nM DNA-AuNP는 상온에서 각각 3.5 ㎕의 1% PVP 및 4.2 ㎕의 0.005 M HA의 존재하에 10.4 ㎕의 1 mM HAuCl4 용액과 반응하였다. 상기 생성된 혼합물을 오비탈 쉐이커 상에서 부드럽게 흔들어주었다. 반응이 완료된 후, 상기 용액을 7 분 동안 8,000 rpm으로 원심분리하여 미반응 잔여물을 제거한 다음, 탈이온수 중에 재분산시켰다.
실시예 11: 전구체 첨가량에 따른 나노입자의 크기 변화 조사
금 전구체, 즉 1 mM HAuCl4 용액의 첨가량을 1.5 ㎕(A-1) 대신, 각각 5.3 ㎕(A-2), 10.4 ㎕(A-3) 및 36.3 ㎕(A-4)로 하는 것을 제외하고는 상기 실시예 9와 같이 나노스노우맨 형태의 Au-Au 헤드-바디 나노입자를 제조하였다.
금 전구체의 첨가량이 증가(A-1으로부터 A-4까지)함에 따라, 용액의 색이 진해지는 것을 확인할 수 있다(도 9a).
형성된 상기 각각의 나노구조체는 고분해능 투과 전자 현미경(HR-TEM; JEOL, Japan, 300 kV) 및 UV-Vis 분광광도계(Agilent 8453 spectrophotometer, USA)로 확인하였다. 도 9b는 다른 전구체 첨가량에서 반응시킨 후 얻어진 나노구조체의 HRTEM 이미지를 나타낸다. AuNP 표면상에서의 비대칭적인 Au 성장은 도 9b의 이미지 모두에서 명확히 나타났으나, 전구체 첨가량이 증가함에 따라 스노우맨-유사 나노구조체의 크기가 증가하였다. 또한, UV-Vis 데이터를 통해(도 9c), 나노구조체 유래의 플라즈몬 피크가 전구체 첨가량이 변화함에 따라 크게 영향을 받지 않으나, 전구체 첨가량이 증가함에 따라 피크의 세기는 커짐을 알 수 있다.
따라서, 도 9b 및 도 9c를 통해, 전구체 첨가량이 증가함에 따라 스노우맨-유사 나노구조체의 크기가 증가함을 확인할 수 있다.
실시예 12: 나노입자 크기에 따른 검출 능력 조사
나노입자의 크기에 따른 검출 능력의 정도를 비교하기 위하여, 상기 실시예 10 및 11에서 제조한 다른 크기를 갖는 Au-Au 헤드-바디 나노입자에 대하여 표면 증강 라만 산란(SERS) 스펙트럼을 측정하였다. 라만 측정은 514 nm, 633 nm 및 785 nm 레이저가 장착된 RENISHAW사의 inVia Raman Microscope 모델을 사용하여 측정하였다. 본 실험에서 633 nm 레이져가 사용되었으며, 파워는 10 mW, acquisition time은 30초의 조건으로 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10을 통해 나노입자의 크기가 증가함에 따라 더욱 강한 SERS 신호를 나타냄을 확인할 수 있다. 따라서, 나노입자의 크기를 증가시킴으로써 검출 능력을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
실시예 13: 나노스노우맨 형태의 Ag - Ag 헤드- 바디 나노입자의 제조
먼저, 시드(seed)로서 사용할 DNA-AgNP를 은 나노입자의 크기가 40 nm 인 것을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
다음으로, DNA-AgNP 표면상에 Ag 구조체를 성장시키기 위하여, 시드(seed)로서 상기 DNA-AgNP를 이용하고 Ag 전구체 및 다른 시약을 첨가하여 나노스노우맨 구조체를 합성하였다.
탈이온수 중의 1% 폴리비닐피롤리돈(PVP), 0.1 M (+)-소듐 L-아스코르베이트(L-SA) 및 1 mM 질산은(AgNO3)을 사용하여 폴리머 보조의 화학적 환원법으로 Ag-Ag 헤드-바디 나노스노우맨 구조체를 형성하였다. PVP, L-SA 및 Ag 전구체를 상기 DNA-개질 AgNP 시드 용액에 순차적으로 첨가하였다. 환원제와 Ag+ 간의 몰비(L-SA/Ag), 및 PVP 반복단위 수와 Ag+ 간의 몰비(PVP/Ag)는 각각 50 및 30이었다. 전형적으로, 100 ㎕의 9.5 pM DNA-AgNP는 상온에서 각각 14.8 ㎕의 0.1% PVP 및 22.1 ㎕의 0.01 M L-SA의 존재하에 44.3 ㎕의 0.1 mM AgNO3 용액과 반응하였다. 상기 생성된 혼합물을 오비탈 쉐이커 상에서 부드럽게 흔들어주었다. 반응이 완료된 후, 상기 용액을 7분 동안 8,000 rpm으로 원심분리하여 미반응 잔여물을 제거한 다음, 탈이온수 중에 재분산시켰다.
상기 형성된 나노구조체는 고분해능 투과 전자 현미경(HR-TEM; JEOL, Japan, 300 kV) 및 UV-Vis 분광광도계(Agilent 8453 spectrophotometer, USA)로 확인하여, 그 결과를 도 11 및 12에 나타내었다.
실시예 14: 나노스노우맨 형태의 Au - Ag 헤드- 바디 나노입자의 SERS 스펙트라 분석
실시예 1 및 2와 동일한 방법으로 나노스노우맨 형태의 Au-Ag 헤드-바디 나노입자를 제조하되, SERS 스펙트라 분석을 위하여 올리고뉴클레오타이드를 라만 다이가 개질된 올리고뉴클레오티드(DNA[5'-TAACAATAATCCCTC-PEG18-A10-(Cy3)-(CH2)3-SH-3'], DNA[5'-TAACAATAATCCCTC-PEG18-A10-(Cy5)-(CH2)3-SH-3'], DNA[5'-TAACAATAATCCCTC-PEG18-A10-(Dabcyl)-(CH2)3-SH-3'], DNA[5'-TAACAATAATCCCTC-PEG18-A10-(ROX)-(CH2)3-SH-3'])를 사용하여 나노스노우맨 형태의 Au-Ag 헤드-바디 나노입자 및 대조군으로 DNA-개질된 금 나노입자를 제조하였다.
라만 측정은 514 nm, 633 nm 및 785 nm 레이저가 장착된 RENISHAW사의 inVia Raman Microscope 모델을 사용하여 측정하였다. 본 실험에서 파워는 10-70 mW, acquisition time은 10초의 조건으로 측정하였으며, 그 결과를 도 13 내지 16에 나타내었다. 도 13 내지 16에 나타난 바와 같이, 나노스노우맨 형태의 나노입자는 대조군인 금 나노입자에 비하여 SERS 강도가 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 15: 다양한 모양의 나노입자를 시드( seed )로 이용한 나노스노우맨 형태의 Au - Ag 헤드- 바디 나노입자의 제조
먼저, 나노막대(nanorod, 15nm-50nm), 나노직육면체(nanocube, 45nm) 또는 구형(30nm)의 모양을 갖는 금 나노입자를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 시드(seed)로서 사용할 DNA-AuNP를 제조하였다.
다음으로, DNA-AuNP 표면상에 나노막대(nanorod), 나노직육면체(nanocube) 또는 구형(sphere) 모양의 Ag 구조체를 성장시키기 위하여, 시드(seed)로서 상기 DNA-AuNP를 이용하고 Ag 전구체, 및 다른 시약을 첨가하여 Au-Ag 헤드-바디 구조체를 합성하였다.
구체적으로, 먼저, 탈이온수 중의 1% 폴리비닐피롤리돈(PVP), 0.1 M (+)-소듐 L-아스코르베이트(L-SA) 또는 hydroxyl amine(HA) 및 1 mM 질산은(AgNO3)을 사용하여 폴리머 보조의 화학적 환원법으로 Au-Ag 헤드-바디 구조체를 형성하였다. PVP, L-SA 및 Ag 전구체를 상기 DNA-개질 AgNP 시드 용액에 순차적으로 첨가하였다.
전형적으로, 나노막대(nanorod)에 구형의 Ag 바디 구조를 형성하기 위해 0.1mM 염(NaCl) 용액에 분산되어 있는 70 ㎕의 0.1 pM DNA-AuNP는 상온에서 각각 7.9 ㎕의 1% PVP 및 11.9 ㎕의 0.1 M L-SA의 존재하에 23.8 ㎕의 1 mM AgNO3 용액과 반응하였다. 환원제와 Ag+ 간의 몰비(L-SA/Ag), 및 PVP 반복단위 수와 Ag+ 간의 몰비(PVP/Ag)는 각각 50 및 30이었다. 상기 생성된 혼합물을 오비탈 쉐이커 상에서 부드럽게 흔들어주었다. 반응이 완료된 후, 상기 용액을 7 분 동안 8,000 rpm으로 원심분리하여 미반응 잔여물을 제거한 다음, 탈이온수 중에 재분산시켰다 (도 17). 상기 형성된 나노구조체는 고분해능 투과 전자 현미경(TEM; JEOL, Japan, 200 kV)으로 확인하여, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
전형적으로, 나노직육면체(nanocube)에 구형의 Ag 바디 구조를 형성하기 위해 0.003 M 염(NaCl) 용액에 분산되어 있는 70 ㎕의 0.23 pM DNA-AuNP는 상온에서 각각 57 ㎕의 1% PVP 및 85 ㎕의 0.1 M L-SA의 존재하에 170.5 ㎕의 1 mM AgNO3 용액과 반응하였다. 상기 생성된 혼합물을 오비탈 쉐이커 상에서 부드럽게 흔들어주었다. 환원제와 Ag+ 간의 몰비(L-SA/Ag), 및 PVP 반복단위 수와 Ag+ 간의 몰비(PVP/Ag)는 각각 50 및 30이었다. 반응이 완료된 후, 상기 용액을 7 분 동안 8,000 rpm으로 원심분리하여 미반응 잔여물을 제거한 다음, 탈이온수 중에 재분산시켰다 (도 18). 상기 형성된 나노구조체는 고분해능 투과 전자 현미경(TEM; JEOL, Japan, 200 kV)으로 확인하여, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
전형적으로, 구형에 나노막대 또는 나노직육면체형의 Ag 바디 구조를 형성하기 위해 0.003 M 염(NaCl) 용액에 분산되어 있는 100 ㎕의 0.2 pM DNA-AuNP는 상온에서 각각 4.45 ㎕의 1% PVP 및 20 ㎕의 0.1 M L-SA의 존재하에 200 ㎕의 1 mM AgNO3 용액과 반응하였다. 상기 생성된 혼합물을 오비탈 쉐이커 상에서 부드럽게 흔들어주었다. 환원제와 Ag+ 간의 몰비(L-SA/Ag), 및 PVP 반복단위 수와 Ag+ 간의 몰비(PVP/Ag)는 각각 10 및 2이었다. 특히 나노직육면체형의 Ag 바디 구조를 형성하기 위해서는 AgNO3 전구체를 펌프를 이용해 5ml/hour 의 속도로 방울방울 첨가해 주었다. 반응이 완료된 후, 상기 용액을 7 분 동안 8,000 rpm으로 원심분리하여 미반응 잔여물을 제거한 다음, 탈이온수 중에 재분산시켰다 (도 19). 상기 형성된 나노구조체는 고분해능 투과 전자 현미경(TEM; JEOL, Japan, 200 kV)으로 확인하여, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
실시예 16: 나노스노우맨 형태의 Au - Ag 헤드- 바디 나노입자를 이용한 속이 빈( hollow ) 형태의 Au 바디 제조
먼저, 구형(30nm)의 모양을 갖는 금 나노입자를 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 시드(seed)로서 사용할 DNA-AuNP를 제조하였다.
다음으로, DNA-AuNP 표면상에 구형(sphere) 모양의 Ag 구조체를 성장시키기 위하여, 시드(seed)로서 상기 DNA-AuNP를 이용하고 Ag 전구체, 및 다른 시약을 첨가하여, 실시예 13과 동일한 방법으로 Au-Ag 헤드-바디 구조체를 합성하였다.
다음으로, 속이 빈 형태의 Au 바디 구조체를 형성하기 위하여, 시드(seed)로서 상기 나노스노우맨 형태의 Au-Ag 헤드-바디 나노입자를 이용하고 Au 전구체 및 다른 시약을 첨가하여 Au-Au 헤드-바디(hollow) 형태의 구조체를 합성하였다. 반응이 완료된 후, 상기 용액을 7 분 동안 6,000 rpm으로 원심분리하여 미반응 잔여물을 제거한 다음, 탈이온수 중에 재분산시켰다.
구체적으로, 탈이온수 중의 0.01 M cetyltrimethylammonium chloride (CTAC), 및 0.05 mM Gold(III) chloride trihydrate (HAuCl4·3H2O)을 사용하여 갈바닉 교환법(galvanic replacement)으로 Au-Au 헤드-바디(hollow) 구조체를 형성하였다. CTAC 및 Au 전구체를 상기 나노스노우맨 형태의 Au-Ag 헤드-바디 나노입자 시드 용액에 순차적으로 첨가하였다. 전형적으로, 200 ㎕의 0.23 pM 나노스노우맨 형태의 Au-Ag 헤드-바디 나노입자는 80 ℃에서 각각 800 ㎕의 0.01 M CTAC의 존재하에 432 ㎕의 Au 전구체 용액과 반응하였다. 특히 속이 빈 구조를 형성하기 위해서는 Au 전구체를 펌프를 이용해 2.5ml/hour의 속도로 방울방울 첨가해 주었다. 반응이 완료된 후, 상기 용액을 7 분 동안 5,000 rpm으로 원심분리하여 미반응 잔여물을 제거한 다음, 탈이온수 중에 재분산시켰다 (도 20).
상기 형성된 나노구조체는 고분해능 투과 전자 현미경(TEM; JEOL, Japan, 200 kV)로 확인하여, 그 결과를 도 20에 나타내었다.
특히 속이 빈 형태의 경우 일반적인 속이 찬 나노입자에 비해 빛을 흡수시 (absorbance=absorption + scattering) 산란(scattering)에 비해 흡수(absorption)가 커지게 된다. 이러한 현상은 특히 광음향이미징 (photoacoustic imaging) 등에 중요한 요소가 될 수 있다. 광음향의 경우 나노입자가 빛을 흡수해서 흡수한 입자가 입자 주변에 국부적인 열팽창을 일으켜 음파를 생성하기 때문이다. 따라서 흡수에 대한 부분이 증가할 경우 그 영향이 더 커지게 된다. 또한 헤드-바디 형태로 형성될 경우 이미 상기한 바와 같이 라만 신호 증폭 효과가 더해질 수 있기 때문에 복합 이미징 프로브로 이용될 수 있다.

Claims (28)

  1. 금 또는 은 나노입자 헤드(head)부, 및 은 나노입자 바디(body)부를 구비하며, 상기 헤드부는 표면에 복수의 올리고뉴클레오티드가 결합되어 있고, 상기 헤드부의 하방 일부가 상기 바디부 상방의 함몰부 상에 위치하면서, 헤드부와 바디부의 인접부에 갭이 없는 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 헤드부의 직경은 2 내지 200 nm인 나노입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 바디부의 직경은 2 내지 900 nm인 나노입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 헤드부와 바디부가 비대칭적인 크기를 갖는 나노입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 나노입자의 최장축 길이는 4 nm 내지 900 nm인 나노입자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 헤드부는 구형(sphere), 나노막대(nanorod) 또는 나노직육면체(nanocube)의 모양을 갖는 나노입자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 바디부는 구형, 나노막대 또는 나노직육면체의 모양을 갖는 나노입자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 바디부는 속이 빈(hollow) 형태를 갖는 나노입자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 헤드부 표면에 결합되어 있는 올리고뉴클레오티드의 일부는 외부로 노출되고 일부는 바디부 상방의 함몰부에 매장됨으로써 올리고뉴클레오티드가 비대칭적으로 개질된 나노입자.
  10. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 티올기, 아미노기 및 알콜기로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기능기로 금 또는 은 헤드부 표면에 결합된 나노입자.
  11. 제10항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 기능기와 올리고뉴클레오티드 사이에 스페이서 서열을 포함하는 나노입자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 스페이서 서열은 -PEGx-Yy-(CH2)z-이고, x는 0 내지 30 의 정수이고, y는 0 내지 30 의 정수이고, z는 3 내지 6의 정수이고, Y는 각각 아데닌, 티민, 구아닌 또는 시토신인 나노입자.
  13. 제12항에 있어서, 상기 스페이서 서열은 PEG18-A10-(CH2)3, PEG18-A10-(CH2)6, PEG18-A30-(CH2)3, PEG18-A30-(CH2)6, PEG18-T10-(CH2)3, PEG18-T10-(CH2)6, PEG18-T30-(CH2)3, PEG18-T30-(CH2)6, A10-(CH2)3, A10-(CH2)6, A30-(CH2)3, A30-(CH2)6, T10-(CH2)3, T10-(CH2)6, T30-(CH2)3, T30-(CH2)6, PEG-A10, PEG-A10, PEG-A30, PEG-A30, PEG-T10, PEG-T10, PEG-T30, 및 PEG-T30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 나노입자.
  14. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드에 라만 활성 분자가 결합된 나노입자.
  15. 제14항에 있어서, 상기 라만 활성분자는 FAM, Dabcyl, TRIT(테트라메틸 로다민 아이소티올), NBD(7-니트로벤즈-2-1,3-다이아졸), 텍사스 레드(Texas Red) 염료, 프탈산, 테레프탈산, 아이소프탈산, 크레실 패스트 바이올릿, 크레실 블루 바이올렛, 브릴리언트(brilliant) 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 비오틴, 다이곡시게닌(digoxigenin), 5-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시, 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시 로다민, 6-카복시로다민, 6-카복시테트라메틸 아미노 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 크산틴, 석신일플루오레세인, 아미노아크리딘, 양자점, 탄소 나노튜브, 탄소동소체, 시아나이드, 티올, 클로린, 브롬, 메틸, 인, 황 및 시아닌 염료(Cy3, Cy3.5, Cy5) 및 로다민(Rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 나노입자.
  16. 제1항의 나노입자의 제조방법으로서,
    금 또는 은 나노입자를 올리고뉴클레오티드로 개질시키는 단계(단계 1); 및
    상기 올리고뉴클레오티드로 개질된 금 또는 은 나노입자와, 은 전구체를 NaCl, 환원제 및 안정화제의 존재 하에서 반응시키는 단계(단계 2)를 포함하고,
    단계 2에서 NaCl의 농도는 1 nM 내지 0.1 M인 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 금 또는 은 전구체는 AgNO3, AgClO4 또는 HAuCl4인 제조방법.
  18. 삭제
  19. 제16항에 있어서, 상기 단계 2)는 pH 2 내지 7의 조건 하에서 수행하는 제조방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 환원제는 하이드로퀴논(hydroquinone), 소듐보로하이드라이드(NaBH4), 소듐 아스코르베이트(sodium ascorbate), 하이드록실아민(hydroxyl amine) 또는 이의 조합인 제조방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 안정화제는 피롤리딘(pyrrolidine), 이미다졸리딘(imidazolodine), 피라졸리딘(pyrazolidine), 피퍼리딘(piperidine), 피퍼라진(piperazine), 소르비톨(sorbitol), 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 또는 카보닐(carbonyl group)을 포함하는 유도체; 글루코스(glucose) 또는 프룩토스(fructose)를 포함하는 사카로스(saccharose) 당류; DNA; PNA; 또는 RNA인 제조방법.
  22. 제16항에 있어서, 상기 안정화제는 폴리비닐피롤리돈(PVP)인 제조방법.
  23. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 나노입자의 표면에 검출하고자 하는 분석물을 인식할 수 있는 바이오분자를 기능화하는 단계;
    상기 나노입자를 하나 이상의 분석물을 포함하는 샘플에 노출시키는 단계; 및
    레이저 여기(excitation) 및 라만 분광법을 이용하여 하나 이상의 분석물을 검출 및 확인하는 단계를 포함하는, 분석물을 검출하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 라만 분광법이 표면 증강 라만 분광법(SERS), 표면증강 공명 라만 분광법(SERRS), 또는 하이퍼-라만 및/또는 비간섭성 반스톡스 라만분광법(CARS)인 방법.
  25. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 나노입자를 포함하는, 분석물 검출용 키트.
  26. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 나노입자를 포함하는, 분자진단 칩 또는 영상진단용 조성물.
  27. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 나노입자; 및 상기 나노입자의 내부 또는 외부에 CT 조영제, MRI 조영제, 광학 조영제 및 초음파 조영제로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가로 포함하는 나노입자.
  28. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 나노입자; 및 유전자, 항체 및 약물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가로 포함하는 나노입자.
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