KR102164579B1

KR102164579B1 - 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자, 이들의 방향성을 지닌 클러스터화된 나노구조체, 제조방법 및 이의 응용

Info

Publication number: KR102164579B1
Application number: KR1020180114918A
Authority: KR
Inventors: 임동우; 아메드알리; 이재희
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2017-09-22
Filing date: 2018-09-27
Publication date: 2020-10-12
Also published as: KR20190034128A

Abstract

본 발명은 이방성 에이콘 타입 이중금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반의 표적 물질 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 나노구조체는 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 금속 나노 프로브로 적용할 수 있다.

Description

이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자, 이들의 방향성을 지닌 클러스터화된 나노구조체, 제조방법 및 이의 응용{Anisotropic acorn-type bimetal nanoparticles, their directionally clustered nanostructures, preparation and surface enhanced Raman scattering-based biosensing applications}

본 발명은 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자, 이들의 방향성을 지닌 클러스터화된 나노구조체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반의 표적 물질 검출 방법에 관한 것이다.

라만 분광법은 소분자 (Small molecules), 생고분자 (Biomacromolecules), 독소 (Toxins), 병원체 (Pathogens)의 검출 및 확인을 위해 연구되어 왔다. 구체적으로, 표면 강화 라만 산란(Surface-enhanced Raman scattering, SERS)은 주로 초고감도, 좁은 대역폭 및 중요한 다중화 능력으로 인해 분광학적 검출 및 작은 분자, 핵산, 단백질 및 세포의 식별에 있어 큰 관심을 받고 있다(비특허문헌 1).

플라스몬 나노구조체 (plasmonic nanostructures)는 생물의학 공학, 환경 과학에서 화학 및 재료 공학에 이르기 까지 다양한 응용 분야에서 유망한 화학적, 물리적 및 광학적 특성을 가지고 있다. 특히, 플라스몬 이중 금속 나노구조체 (plasmonic bimetal nanostructures)는 촉매, 광자, 및 나노의약에서 이의 산업적 및 생물의학적 응용으로 인해 지난 몇 년 동안 많은 관심을 끌어왔다. 이전에 보고된 바와 같이, 이의 특징과 적용은 이의 구조, 모양, 크기 및 조성과 깊게 연관되어 있으며, 다양한 경로를 통한 이의 제어된 제조가 성공적으로 확립되어 왔다. 일반적으로, 이중 금속 나노구조체를 제조하기 위한 시드 성장은 반응 순서에 따라 2개의 단계를 포함한다; 시드로서 작용하는 작은 크기의 금속 나노입자를 합성하는 단계 및 시드 표면 상에 다른 금속 원자를 선택적으로 성장시키는 단계. 코어-쉘, 덤벨형, 및 섬형(island-like) 구조체를 비롯한 다양한 이중 금속 나노구조체의 제조 방법은 매우 효과적이다. 그러나, 제어된 크기 및 균일한 모양을 갖는 이방성 에이콘-타입 이중 금속 나노입자 (AABN)의 제조는 현재까지는 달성하기에는 여전히 문제가 있으며, 대부분의 이중 금속 나노구조체는 구형과 같은 모양이다. 따라서, AABN은 이방성 나노물질의 모양- 또는 크기 의존적인 집합적인 특성을 연구하는데 매우 중요하다.

이중 금속 나노입자 및 리소그래피로 제조된 나노구조체와 같은 플라스몬 나노구조체는 고도로 증폭된 라만 신호를 유도하기 위한 공통 플랫폼이다. 표면 증강 라만 산란 (SERS) 플랫폼의 개발과 함께, 신호 강화의 기원을 이해하고 재현성을 갖는 다수의 연구가 보고되었다. SERS는 은, 금, 및 구리 나노구조체의 플라스몬 특성과 관련이 있다는 사실이 널리 받아들여지고 있다. 이러한 플라스몬 나노구조체는 전자기장을 집중시키고 전자기 향상 현상을 전달한다. 흥미롭게도, 나노구조체가 이의 공유- 또는 비공유 상호작용을 통해 별개의 응집체를 형성할 때, 라만 강도는 플라스몬 결합 효과에 의한 전자기의 핫스팟으로 인해 더욱 증폭될 수 있다. 일반적으로, 핫스팟을 생성하기 위해 용액 상 (solution phase)과 고체 지지체 (solid support)를 사용하는 두 가지 접근법이 있다. 첫 번째로, 용액 상 접근법은 전형적으로 예리한-엣지 (sharp-edged) 금속 나노구조체 또는 구형 나노입자, 및 전해질, 중합체, 용매 및 생물학적 주형의 도움으로 형성된 용액 중에서 클러스터화된 나노구조체와 관련되어 있다. 두 번째로, 고체 지지체 접근법은 리소그래피 제조 방법 예컨대 나노구체 리소그래피, 주형-보조 어셈블리, 전자 빔 리소그래피, 경사각 증착 및 집중 이온 빔 리소그래피를 포함한다. 그러나, 다수의 종류의 핫스팟 생성 접근법이 연구되었음에도 불구하고, 재현성을 갖는 입자 간 결합에 의해 형성된 핫스팟 생성은 라만 신호의 큰 증폭에 여전히 어려움이 있으며, 아마도 고비용, 시간 소모적인 노력 및 복잡한 과정과 같은 어려움 때문일 수 있다.

이에, 본 발명자들은 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체를 개발하였다.

1. K. Kneipp, Y. Wang, H. Kneipp, L. T. Perelman, I. Itzkan, R. R. Dasari, et al., "Single Molecule Detection Using Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS)," Physical Review Letters, vol. 78, pp. 1667-1670, 03/03/ 1997.

본 발명의 목적은 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체를 이용한 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 금속 나노 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 금속 나노 프로브를 이용한 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반의 표적 물질 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은,

금 시드(seed)-은 쉘(shell)로 구성된 이방성 에이콘(acorn) 타입 이중 금속 나노입자가 나노클러스터로 방향성 있게 자가조립된, 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체를 제공한다.

상기 에이콘 타입 이중 금속 나노입자란, 서로 다른 종류의 금속으로 이루어진 도토리(acorn) 모양의 나노구조체를 말한다.

상기 이중 금속 나노스타 클러스터 구조체란, 상기 개별적인 에이콘 타입 이중 금속 나노구조체가 서로 모여서 응집된 구조체를 말한다.

상기 이방성이란, 완전한 구형이 아닌 특정한 모양을 지니며 그 모양에 따라 특성과 기능이 다양한 것을 의미한다. 구체적으로 본 발명에서 이방성은 금 구획과 은 구획이 서로 구별된 구획을 가지며, 은 구획이 비대칭적으로 금 구획에서 자라 도토리 (acorn) 모양의 나노구조체를 형성하고 그 모양에 따라 다양한 특성을 나타내는 것을 말한다.

상기 방향성을 가진 클러스터 나노구조체란, 금 시드(seed) 특이적인 표면 개질을 통해 금 시드(seed)-은 쉘(shell)로 구획화된 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자가, 특정한 방향으로 클러스터화되어 형성된 나노구조체를 말한다.

상기 금 시드는 표면이 카르복실 기로 개질된 것일 수 있다.

상기 금 시드는 다면체 금 나노입자일 수 있다.

상기 다면체 금 나노입자는 10면체 금 나노입자일 수 있다.

상기 이방성 에이콘 타입 이중금속 나노입자에 라만 리포터가 부착될 수 있다.

상기 라만 리포터는 라만 활성 유기 화합물을 의미하며, 이 기술분야에서 널리 사용되는 것이라면 어느 것이나 제한없이 사용할 수 있다. 구체적인 예를 들면, MGITC(Malachite green isothiocyanate), RBITC(rhodamine B isothiocyanate), 로다민6G, 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 4-머캅토피리딘, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리민딘, 8-머캅토아데닌, 9-아미노-아크리딘 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 "금속 나노입자 클러스터"란, 금속 나노입자들이 모여 있는 것을 의미하는 용어로서 이 분야에서 일반적으로 사용되는 용어이다.

본 발명에서 상기 "에이콘 타입 이중금속 나노입자 클러스터"란, 에이콘 타입 이중금속 나노입자들이 모여 있는 것을 의미한다.

다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 이방성 에이콘 타입 이중금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체를 이용한 표면-증강 라만 산란(SERS) 센싱 및/또는 이미지(image) 측정용 금속 나노 프로브를 제공한다.

본 발명에서 "프로브"란, 검출하고자 하는 표적(타겟) 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명에서 "나노프로브"란, 나노 크기의 프로브를 의미한다.

상기 "나노"란 이 기술분야의 통상의 기술자들이 이해하는 정도의 크기 범위를 포함한다. 구체적으로 상기 크기 범위는 0.1 에서 1000 nm의 크기일 수 있으며, 더 구체적으로는 10 에서 1000 nm, 더욱 바람직하게는 20 에서 500 nm, 더 더욱 바람직하게는 40 에서 250 nm 일 수 있다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 이방성 에이콘 타입 이중금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체 제조방법:

i) 표면이 카르복실기로 개질된 다면체 금 입자 시드 용액을 제조하고;

ⅱ) 은 전구체 포함 용액에 상기 금 입자 시드 용액을 혼합하고;

ⅲ) 상기 혼합물에 수산화암모늄 첨가하여 교반하고;

ⅳ) 상기 iii)의 혼합물을 오븐에 밤새 두어 금 시드 상에서 은을 비대칭적으로 성장시켜서 이방성 에이콘 타입 이중금속 나노입자를 제조하고;

v) 상기 이방성 에이콘 타입 이중금속 나노입자의 금 구획의 카복실기를 활성화하기 위해 EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide ) 용액을 첨가하고;

vi) 상기 EDC 용액 첨가 후에 아민계 화합물을 첨가하여 교반하고;

vi) 상기 금 구획의 EDC-활성화된 카복실 기와 상기 아민계 화합물의 아민기 사이에 아미드 결합을 형성하고; 그리고

vii) 상기 금 구획에서 아민계 화합물의 알킬기 사이의 소수성 상호 작용에 의해 아민계 화합물이 서로 결합함으로써 금 구획끼리 서로 마주하면서, 이방성 에이콘 타입 이중금속 나노입자가 방향성을 가진 클러스터를 형성하면서 자가조립되는;

단계.

상기 iv) 단계에서, 금 시드 용액을 제조할 때 이용하는 캡핑제(PVP)로 인해 금 시드로부터 은 쉘이 비대칭적으로 합성된다. 캡핑제는 10면체 및 8면체와 같은 안정한 모양을 형성하기 위한 것이다.

상기 v) 금 구획의 카복실 기 활성화는, 금 구획의 노출된 카복실 기(잔여 카복실기, 은 쉘과 접하지 않은 카복실 기)를 아민기와 결합시키기 위해 활성화시키는 것을 의미한다.

상기 금 시드는 다면체 금 나노입자일 수 있다.

상기 다면체 금 나노입자는 10면체 금 나노입자일 수 있다.

상기 iv) 단계 이후에, 상기 이중 금속 나노막대 표면에 라만 리포터를 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 아민계 화합물은, 헥사데실아민(hexadecylamine), 헵타데실아민(heptadecylamine), 옥타데실아민 (octadecylamine), 노나데실아민(nonadecylamine) 및 도데실아민(dodecylamine)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반의 표적 물질 검출 방법을 제공한다:

a) 검출하고자 하는 표적 물질이 포함된 시료액을 준비하고;

b) 자성 나노입자에 상기 표적에 대한 제1 항체를 고정하여 준비하고;

c) 본 발명에 따른 금속 나노 프로브에 상기 표적에 대한 제2 항체를 고정하여 준비하고;

d) 상기 제1 항체가 고정된 자성 나노입자를 상기 시료액에 첨가하여 상기 표적과 상기 자성 나노입자의 제1항체가 접합된 면역복합체를 형성하고;

e) 상기 제2 항체가 고정된 금속 나노 프로브를 상기 제1 항체가 접합된 면역복합체가 포함된 용액에 첨가하여 금속 나노 프로브 제2 항체-표적-자성 나노입자의 제1 항체의 샌드위치 면역복합체를 형성하고;

f) 자기장을 이용하여 상기 샌드위치 면역복합체를 형성하지 않은 자성 나노입자 및 금속 나노 프로브를 분리하고; 그리고

g) 상기 샌드위치 면역복합체의 라만 신호를 측정하는;

단계.

상기 표적 물질은 단백질 또는 병원균인 것일 수 있다.

상기 단백질은 항원, 생물학적 압타머(biological aptamer), 수용체, 효소 및 리간드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에서 "샌드위치형 면역 복합체"란 항체-항원(타겟)-항체 반응을 통해 결합된 면역복합체를 의미한다. 항원이 항체 중간에 삽입되어 샌드위치 모양을 나타냄에 따라 명명되었다.

본 발명의 일 실시예에서, AABNs를 합성하고 그리고 비공유 상호작용을 통한 방향성 클러스터링 구조체를 합성하였다. 잘 정의된 모양을 가진 오각-쌍정 (penta-twinned) Au 10면체가 에이콘-타입(acorn-type)의 형태로 은 구획을 성장시키기 위한 시드로서 작용하였다. AABN은 이의 표면 상의 다수의 핫스팟, 엣지, 및 팁으로 인해 향상된 표면 증강 라만 산란 (SERS) 강도를 나타냈다. 또한, -COOH 작용성을 가진 Au 구획이 옥타데실아민 (octadecylamine, ODA)에 의해 변형되는 경우, AABN의 Au 표면 상에서 ODA의 소수성 상호작용으로 인해 ASBN의 방향 클러스터링이 발생하였다. 또한 본 발명의 실시예에서는 AABN 클러스터 및 생물학적 모이어티의 존재 하에 자기장-기반 분리 도구로서 자성 비드 (MB)를 이용하여 샌드위치형 면역복합체의 형성을 입증하였다. 이는 AABN 클러스터가 안정하고, 재현성있으며, 고도로 민감한 SERS 나노프로브로서 유용함을 증명하는 것이다.

본 발명에 따른 이방성 에이콘 타입 이중금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체는, 라만 강도가 향상된 표면-증강 라만 산란(SERS) 이미지(image) 측정용 금속 나노 프로브로 적용할 수 있다.

도 1은 이방성 에이콘-타입 Au-Ag 이중금속 나노입자 (AABN)의 합성 및 방향성의 자가 조립에 의해 형성된 이의 클러스터의 개략적인 모식도이다. AABN을 폴리올 방법에 의해 제조된 -COOH 작용화된 Au 10면체로부터 Ag를 방향성있게 과성장시켜 제조하였다. MUA-변형된 Au 구획을 가진 AABN을 EDC 및 설포-NHS로 활성화시키고, ODA로 변형시켜 ODA의 소수성 상호작용을 통해 방향성을 가진 자가-조립에 의해 클러스터화된 AABN이 형성되었다.
도 2는 (A) 0.2 mM 내지 2 mM의 범위에서의 NH₄OH 농도의 함수로서 시드로서 Au 10면체 및 AABN의 UV-vis 흡광도. (B) 시드로서 Au 10면체 및 AABN의 DLS 프로파일이다.
도 3은 (A) 시드로서 Au 10면체 TEM 이미지 및 (B - D) 상이한 크기 막대 (scale bar)를 가진 AABN의 TEM 및 HAADF(high-angle annular dark-field) 이미지 및 (E - F) 상이한 크기 막대 (scale bar)를 가진 방향성 있게 클러스터화 된 AABN의 HAADF(high-angle annual dark-field) 이미지이다.
도 4는 (A, B) 단일 AABN 및 이의 클러스터의 UV/Vis 흡광도 스펙트럼 및 DLS 프로파일 및 (C, D) MGITC 농도가 1.0 x10^-6 M일 때 ODA 농도에 따른 MGITC-인코딩된 AABN 클러스터의 SERS 스펙트럼이다.
도 5은 (A) MGITC-인코딩된 AABN 클러스터를 사용하는 SERS-기반 면역분석 방법의 개략적인 모식도이다. (B, C) SERS-기반 정량적 분석을 위한 IgG 농도의 함수로서 라만 스펙트럼이며, 상대적인 라만 강도와 표적으로서 IgG 농도 사이에는 선형 상관관계가 있었다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 또한 본 발명에서 인용하고 있는 참고문헌은 본 발명의 명세서의 일부로 통합된다.

<실시예 1> 재료

다이에틸렌 글리콜 (DEG), 금 (III) 클로라이드 수화물 (HAuCl₄.3H₂O), 질산은 (AgNO₃, ≥ 99.0 %), 폴리비닐필롤리돈 (PVP; MW 55,000), 에탄올 (99.5 %), 수성 암모니아 (NH₄OH), 옥타데실아민 (ODA), 머캅토운데카논산 (MUA)을 Sigma-Aldrich (세인트루이스, 미주리주, 미국)로부터 구입하였다. 유리 제품을 수성 왕수 (Regia, HCl: HNO₃, 3:1)로 세척하고 탈이온수로 완전히 헹구었다. Milli-Q (Millipore Water Purification Systems; EMD Millipore, 베드포드, 매사추세츠주, 미국)로 정제한 탈이온수를 사용하였다.

<실시예 2> 시드로서 Au 10면체의 제조

시드로서 금 10면체를 이전의 보고에 기초하여 약간 변형하여 제조하였다(Seo, D., Yoo, C. I., Jung, J., & Song, H. (2008). Journal of the American Chemical Society, 130(10), 2940-2941.). PVP (3.0 g, 단량체에 대해 27.0 mmol)를 실온에서 2시간 동안 교반 하에 13 mL DEG 중에 용해하고 상기 용액을 약 260 °C의 비등점으로 가열하고 격렬한 교반 하며 5분 동안 환류하였다. 1 mL DEG 중의 HAuCl₄ (10 mg, 5.1 × 10^-5 mol) 용액을 약 260 ℃에서 중합체 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 환류하여 시드로서 균질한 금 10면체를 수득하였다. Au 10면체를 에탄올 (25 mL)과 혼합하고, 10,000 rpm에서 10분 동안 반복적으로 원심분리하여 정제하였다. 이러한 과정의 결과로서 약 92 %의 형상 수율을 갖는 42 nm의 평균 엣지를 갖는 Au 10면체가 형성되었다. 방향성 클러스터링을 위해 상기 금 10면체의 표면을 카복실 기로 변형하기 위해, 에탄올 중에 용해된 1 × 10^-5M MUA를 금 10면체 용액에 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하며 유지하였다. MUA를 갖는 Au 10면체를 에탄올로 세척하고 DEG 중에 수 회 재현탁하였다.

<실시예 3> 이방성 에이콘-타입 이중금속 나노입자 (AABN) 및 이의 클러스터의 합성

DEG는 금속 염을 환원시키는 능력을 가지며, 상기 용액을 DEG를 사용하여 신선하게 제조하였다. 시약의 용해에는 초음파분해 및 강한 볼텍싱을 사용하지 않았다. 시드로서 정제된 Au 10면체를 10 mL DEG 중에 용해하고 상기 용액을 2분 동안 강하게 교반하였다. 10면체 금 시드를 사용하여 이방성 에이콘-타입 이중금속 나노입자 (AABNs)를 제조하기 위해, 0.13 mM PVP, 3.4 × 10^-2 M AgNO₃및5 × 10^-2 M NaCl을 포함하는 수성 용액을 금 10면체 시드 용액에 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 1 mL의 혼합물을 2 mM의 최종 농도의 수산화 암모늄과 함께 인큐베이션하고 5분 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 60 ℃ 오븐에 밤새 두었다. 마지막으로, Au 및 Ag로 구성된 AABNs을 500 rpm에서 5분 동안 원심분리로 정제하여 큰 응집체를 제거한 다음, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 물 중에서 추가로 정제하였다. 생성된 AABN을 특성분석을 위해 1 mL의 물에 재현탁하였다.

라만 리포터로서 MGITC를 10^-5M 내지 10^-8M의 농도 범위의 AABNs 용액에 첨가하고 10분 동안 교반하고 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 MGITC-인코딩된 AABNs을 정제하였다. 긴 소수성 알킬 기를 가진 ODA를 AABNs의 Au 구획 상에 화학적으로 접합시키기 위해, 1 × 10^-5M EDC를 AABNs 용액 내로 도입하여 Au 구획 상의 잔여 카복실 기를 활성화시키고 1시간 동안 교반하였다. 10^-7 M 내지 10^-9M의 농도 범위의 THF 중의 ODA를 AABNs 용액에 적하 방식으로 서서히 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. ODA-접합된 AABNs 용액을 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 탈이온수 중에 재현탁하였다.

<실시예 4> 특성 분석

AABNs의 콜로이드 특성을 결정하기 위해, 633 nm의 파장을 갖는 Ne-He 레이저가 장착되어 있고 산란 각이 및 90 °인 Zeta sizer Nano ZS 장비 (Malvern Instruments, 말번, 영국)를 사용하여 동적 광 산란 (DLS) 및 제타 전위 측정을 수행하였다. 샘플을 탈이온수를 사용하여 10:1로 희석하고 온도를 25 ℃로 조절하였다. AABNs 및 이의 클러스터 구조체의 UV-Vis 흡광도 스펙트럼을 UV-가시광 분광기 (UV-1800, 시마츄, 일본)를 사용하여 25 ℃의 온도에서 중간 스캔 속도로 단일 10 스캔 모드에서 1 nm의 고정 슬릿 폭으로 300 nm에서 800 nm로 파장을 변화시키면서 수득하였다. 기준선을 탈이온수로 채워진 2개의 빈 셀을 사용하여 조정하였고 적어도 20회의 스캔 사이클로부터 이의 평균 크기를 수득하였다. 또한, 탈이온수 중의 이의 표면 전하를 결정하기 위해 제타-전위 측정을 수행하였다. 80 kV 내지 200 kV의 가속 전압에서 작동하는 JEM-2100F FE-STEM (JEOL, 독일)을 사용하여 투과 전자 현미경 분석을 수행하여 AABNs 및 이의 클러스터 구조체를 연구하였다. 샘플을 탄소의 초박막 층 (Ted Pella, Inc. 미국)으로 코팅된 400 메쉬 구리 격자 상에 증착시켰다. 주사 전자 현미경 (SEM)으로 직경, 직경 분포, 및 표면 형태를 특성분석 하기 위해, 몇 방울의 샘플을 실리콘 위에 두고 K575X Turbo Sputter Coater를 사용하여 백금으로 코팅하고 0.5 kV 내지 30 kV의 가속 전압에서 작동하는 SEM VEGA (TESCAN, 미국)를 사용하여 이미지화하였다. 또한, 12.5 mW의 레이저 출력을 가진 여기 소스에 대해 632.8 nm의 파장 (λ)에서 작동하는 Renishaw He-Ne 레이저가 장착된 Renishaw inVia 라만 현미경 시스템 (Renishaw, 영국)을 사용하여 모든 라만 특성분석을 수행하였다. Rayleigh 선을 수집 필터에 위치한 홀로그램 노치 필터를 사용하여 수집된 SERS 프로파일로부터 제거하였다. SERS 강도를 1 cm^-1의 분광 분해능의 전하-결합된 소자 (CCD) 카메라를 사용하여 수득하고, 모든 SERS 스펙트럼을 520 cm^-1 실리콘 선으로 보정하였다. MGITC-인코딩된 AABNs 및 이의 클러스터의 콜로이드 용액을 작은 유리 모세관 (Kimble Chase, 일반 모세관, 소다 석회 유리, 내경: 1.1 - 1.2 mm, 벽: 0.2 ± 0.02 mm, 길이: 75 mm) 내에 탑재하였다. SERS 스펙트럼을 1초의 노출 시간 동안 수집하였으며, 이때 20x 대물 렌즈를 사용하여 608 내지 1738 cm^-1의 파장 수 범위에서 유리 모세관 상에 레이저 스팟을 집중시켰다.

<실시예 5> AABN 클러스터와 IgG의 생체접합

클러스터화된 AABNs을 항-인간 IgG pAb에 화학적으로 결합시키고 항-인간 IgG mAb를 자성 비드 (MB)와 접합시켜 항체-항원-항체 상호작용을 통해 샌드위치형 면역복합체를 형성하였으며, 이때, 표적으로서 IgG는 상기 용액 중에 존재하였다. 클러스터화된 AABN을 항-인간 IgG pAb와 접합시키기 위해, 1 × 10^-5M의 MUA를 AABN 클러스터와 혼합하였다. 이에 따라, 클러스터화된 AABN의 전체 표면 상에 존재하는 MUA 분자의 카복실 기를 사용하여 항원 커플링이 달성되었다. 대표적인 실험에서, PBS 중의 AABN 클러스터 용액을 1.5 시간 동안 교반하면서 10 mL의 0.2 mg/mL EDC와 함께 인큐베이션한 후, 10 ml의 0.50 mg/ml 항-인간 IgG pAb 용액을 추가의 1.5시간 동안 교반하며 EDC-활성화된 클러스터화된 AABN에 첨가하였다. 마지막으로, PBS 중의 SERS 나노프로브로서 항-인간 IgG pAb-접합된 AABN 클러스터를 5,000 rpm의 원심력을 사용하여 정제하였다. 마찬가지로, 이전에 보고된 바와 같이, 잔여 카복실 작용기를 사용하여 MB를 항-인간 IgG mAb에 화학적으로 결합시켰다. 대표적인 실험에서, 1.25 mg의 MB를 2.0 mL PBS에 현탁하고 팁 초음파분쇄기 (VC 505; Sonics and Materials, Inc.)를 사용하여 30%의 진폭에서 1분 동안 초음파처리를 수행하였다. 콜로이드 상태로 균일하게 현탁된 MB를, 1.766 M의 EDC 및 설포-NHS의 최종 농도에서 pH 7.4의 PBS 완충액 중의 100 mL의 3.5 mg/mL EDC 및 100 μL의 3.5 mg/ml 설포-NHS와 함께 인큐베이션 하였다. 결합되지 않은 항-인간 IgG mAb를 자기력을 사용하여 제거하고 표적으로 IgG의 바이오센싱을 위해 상기 용액을 PBS 중에 재현탁하였다.

<실시예 6> AABN 클러스터를 사용한 IgG의 SERS-기반 바이오센싱

PBS 중의 항-인간 IgG mAb-접합된 MB를 사용하여 항원인 IgG에 결합시키고 항-인간 IgG pAb-접합된 AABN 클러스터를 샌드위치형 면역복합체의 형성을 통해 IgG를 검출하기 위한 SERS 나노프로브로서 사용하였다. 첫 번째로, 항-인간 IgG mAb-결합된 MB를 0.1 ng/mL 내지 100 ng/mL의 농도 범위의 IgG 용액에 첨가하였다. 항-인간 mAb-접합된 MB와 IgG 사이의 면역복합체를 자기력을 인가하여 단리한 다음, 상기 용액을 PBS를 이용하여 2회 정제하고 PBS 중에 재현탁하였다. 두 번째로, 상기 제조한 항-인간 mAb-접합된 MB 및 IgG의 면역복합체를 항-인간 IgG mAb-접합된 AABN 클러스터와 혼합하고 1시간 동안 교반하여 특정 분자 상호작용을 통해 항-인간 IgG pAb, IgG, 및 항-인간 IgG mAb 중에서 샌드위치형 면역복합체를 생성하였다. 항-인간 IgG pAb, IgG, 및 항-인간 IgG mAb 중의 샌드위치형 면역복합체를 자기력을 사용하여 단리하고 SERS 기록을 위해 현탁하였다. MB 및 AABN 클러스터 둘 모두의 IgG 및 항체 접합이 없는 2개의 대조군 연구를 수행하여 비특이적인 결합을 평가하였다.

도 1은 시드로서 금 10면체, AABN 및 SERS-기반 바이오센싱 적용을 위한 방향성 자가 조립에 의해 형성된 이의 클러스터의 합성에 대한 개략적인 모식도를 나타낸다. -COOH 작용화된 Au 10면체로부터의 방향성 Ag 과성장을 통해 AABNs을 제조하였다. ODA를 사용하여 AABNs의 Au 구획의 선택적인 표면 변형을 통한 비공유적 상호작용에 의해 이의 방향성 클러스터링을 유도하였다. 시드로서 MUA-작용화된 Au 10면체, 은 쉘 및 캡핑제의 전구체로서 Ag 염 및 PVP, 및 환원제로서 NH₄OH를 사용하여 Au 및 Ag로 구성된 AABNs을 제조하였다. 교반 없이 60℃에서 Au 10면체 시드 상에 Ag 나노구조체를 비대칭적으로 성장시켜 AABNs을 형성하였다. Au 시드의 잔여 카복실 기와 ODA의 1차 아민 기 사이의 아미드 결합 형성을 통해 긴 소수성 알킬 기를 갖는 ODA를 이용하여 AABNs의 금 구획을 선택적으로 작용화시켰다. AABNs의 표면 Au 구획의 ODA를 소수성 상호작용을 통해 서로 결합시켜, AABN을s 방향성을 가지고 자가-조립되게 하여 클러스터화된 AABNs이 되게 하였다.

도 2는 플라스몬 흡광도 변화 및 크기 분포를 조사하기 위한 Au 10면체 및 AABNs의 UV/가시광 스펙트럼, 및 DLS 프로파일을 나타낸다. 다중-쌍정 (multi-twinned) 10면체를 갖는 시드는 금 10면체의 전형적인 플라스몬 공명과 같이 550 nm 부근에서 흡광도 피크를 나타냈다. 500 nm 이하에서 보이는 흡광도 피크는 AgCl의 침전에 의해서 생기는 것을 나타낸다. 은이 금 시드로부터 직접 성장한 경우, 은-기반 흡광도가 400 nm 부근에서 발생하기 때문에 AABNs의 흡광도 피크는 보다 짧은 파장으로 이동한다. 수산화 암모늄에 의한 은의 환원으로 인해 AgCl의 흡광도 피크는 없었다. 수성 수산화 암모늄 농도는 AgCl의 환원 속도에 영향을 미쳤으며 상이한 크기 및 모양으로 인해 540 nm 및 600 nm 부근에서 상이한 UV 흡광도 피크를 나타냈다. Au 10면체 시드 및 AABNs의 DLS 프로파일은 Au 시드 입자로부터의 은의 성장을 명확하게 나타냈다. PVP로 캡핑된 Au 시드의 평균 크기는 약 28.24 ± 10 nm였고, Au 시드로부터 직접 성장한 AABNs의 평균 크기는 약 43.82 ± 10 nm였다.

AABNs의 이방성 및 모양을 TEM 및 HAADF 이미지기반 분석으로 특성을 분석하였다. 도 3은 도 3(A)의 Au 10면체 시드의 TEM 이미지, 도 3(B-D)의 Au 시드 상의 은 쉘의 일 방향 성장을 가진 AABN의 TEM 및 HAADF 이미지 및 도3(E-F)의 에이콘-모양의 AABN 및 이의 방향성을 가진 클러스터화된 나노구조체의 HAADF 이미지를 나타낸다. 캡핑제로서 PVP로 인해 금 10면체로부터 은 쉘이 비대칭적으로 합성되었다. PVP는 10면체 및 8면체와 같은 안정한 모양을 형성하기 위한 캡핑제로서 보고되어 있다. PVP의 산소 분자는 이의 모양 및 콜로이드 안정성을 유지하면서 금속 나노입자에 대한 전자 공여체 역할을 했다. 또한, Au 표면에 코팅된 PVP는 Au 표면에서 은 성장을 매개하고 은의 환원 정도도 또한 AABNs의 모양에 영향을 미쳤다. 은 이온은 Au 시드 용액에서 염화물 이온과 함께 침전물을 형성하였고 상기 침전물은 은 쉘 성장의 전구체였다. 침전된 AgCl은 수산화 암모늄의 존재 하에 AABNs의 성장에 기여하였다. 침전된 AgCl은 가용성 Ag(NH₃)²⁺로 변환되어 AABNs의 성장을 위한 전구체로서 작용하였다. AABNs은 모양과 크기가 균일하게 합성되었으며, 무작위로 선택된 50개의 나노입자를 계수한 결과 AABNs의 평균 길이가 40 ± 20 nm인 것으로 확인되었다. 또한, 이러한 단일 에이콘-모양의 AABN의 금 표면 특이적인 처리를 통해 방향성 있는 클러스터를 형성하였다.

라만 리포터로서 MGITC를 이소티오시아네이트 기 (-N=C=S)의 배위 결합을 통해 AABN에 선택적으로 결합시켜 라만 강도를 측정하였다. MGITC-인코딩된 AABN의 금 구획의 -COOH 기를 N-(3-다이메틸아미노프로필)-N′-에틸카보다이이미드 히드로클로라이드 (EDC)로 활성화시키고 1차 아민 기와 함께 소수성 알킬 쇄를 갖는 ODA를 아미드 결합 형성을 통해 Au 구획의 표면과 공유적으로 결합시켰다. 그 결과, ODA를 사용하여 변형시킨 ASBN은 방향성을 갖는 클러스터화된 구조체를 형성하였으며, 이때, AABN의 Au 구획은 ODA의 소수성 알킬 쇄의 소수성 상호작용에 의해 서로 결합하였다. 또한, ODA 농도는 AABN의 클러스터링 정도에 크게 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 도 4는 단일 AABN 및 이의 클러스터의 (A, B) UV/Vis 흡광도 스펙트럼 및 DLS 프로파일, 및 (C, D) MGITC 농도가 1.0 x10^-6 M일 때 ODA 농도에 따른 MGITC-인코딩된 AABN 클러스터의 SERS 스펙트럼을 나타낸다. AABN 클러스터의 UV-Vis 흡광도 피크는, 개별적인 AABN의 피크에 비해 더 긴 파장에서 흡광도 값의 증가에 따라 510 nm에서 530 nm로 붉은색 쪽으로 이동하였다. 또한, 수성 조건 하에서 MGITC-인코딩된 AABN 및 이의 클러스터의 평균 크기, 크기 분포, 및 콜로이드 안정성을 특성분석 하기 위해 동적 광 산란 (DLS) 측정을 수행하였다. AABN의 평균 직경은 약 43.82 nm였고 이의 클러스터의 평균 직경은 약 190.13 nm였다. 표 1에 나타난 바와 같이, 수성 조건 하의 MGITC-인코딩된 AABN 및 이의 클러스터의 제타 전위 값은 각각 - 19.2 mV 및 - 10.3 mV였다. 클러스터화된 크기 및 제타 전위 값은 제어된 클러스터링으로 인해 증가하였다. 1617 cm^-1에서의 MGITC-인코딩된 AABN 클러스터의 SERS 강도는 방향성 클러스터링을 통한 AABN 사이의 핫스팟 형성이 증가하여 단일 AABN에 비해 약 3.5배 크게 향상되었다.

[표 1]

ODA가 클러스터링되었을 때 ODA의 농도는 AABN의 클러스터링 정도에 크게 영향을 미치는 것으로 확인되었다.

마지막으로, MGITC-인코딩된 AABN 클러스터를 모델로서 IgG를 검출하기 위한 SERS 나노프로브로서 사용하였다. 도 5(A)의 개략적인 모식도는 MGITC-인코딩된 AABN 클러스터를 사용하는 SERS-기반 면역분석 방법을 나타낸다. 첫 번째로, 항-인간 IgG mAb 접합된 MB 용액을 상이한 농도의 IgG를 포함하는 용액에 첨가하였다. 표적으로서 IgG를 특정 분자 상호작용을 통해 이의 상응하는 MB에 선택적으로 결합시키고, 외부 자기장을 인가하여 정제하고, PBS 중에 재현탁하였다. 두 번째로, 항-인간 IgG pAb 접합된 AABN 클러스터 용액을 복합체화된 항-인간 IgG mAb-접합된 MB 및 IgG 용액에 첨가하여, 항-인간 IgG mAb-접합된 MB, IgG 및 항-인간 IgG pAb 접합된 AABN 클러스터로 구성된 샌드위치형 면역복합체를 형성하였다. 이어서, 비부착된 SERS 나노프로브를 자기장을 인가하여 제거하고, 남아있는 샌드위치형 면역복합체를 PBS 중에 재현탁하였다. 마지막으로, 도 5(B, C)에 나타난 바와 같이, SERS-기반 정량적 분석을 위해 IgG 농도의 함수로서 라만 강도를 수득하였다. IgG 농도가 0.1 ng/mL 내지 100 ng/mL의 농도 범위에서 증가함에 따라, MGITC-표지된 AABN 클러스터의 라만 강도가 IgG의 농도에 따라 선형적으로 증가하였다.

Claims

금 시드(seed)-은 쉘(shell)로 구성된 이방성 에이콘(acorn) 타입 이중 금속 나노입자를 포함하고, 상기 나노입자들의 금 구획끼리 서로 마주하여 나노클러스터로 방향성 있게 자가조립된, 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체.
제1항에 있어서,
상기 금 시드는 표면이 카르복실 기로 개질된 것인, 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체.
제1항에 있어서,
상기 금 시드는 다면체 금 나노입자인, 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체.
제3항에 있어서,
상기 다면체 금 나노입자는 10면체 금 나노입자인, 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체.
제1항에 있어서,
상기 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자에 라만 리포터가 부착되는 것인, 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체.
제5항의 클러스터 나노구조체를 이용한 표면-증강 라만 산란(SERS) 센싱 및/또는 이미지(image) 측정용 금속 나노 프로브.
i) 표면이 카르복실기로 개질된 다면체 금 입자 시드 용액을 제조하고;
ⅱ) 은 전구체 포함 용액에 상기 금 입자 시드 용액을 혼합하고;
ⅲ) 상기 혼합물에 수산화암모늄 첨가하여 교반하고;
ⅳ) 상기 iii)의 혼합물을 오븐에 밤새 두어 금 시드 상에서 은을 비대칭적으로 성장시켜서 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자를 제조하고;
v) 상기 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 금 구획의 카복실기를 활성화하기 위해 EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) 용액을 첨가하고;
vi) 상기 EDC 용액 첨가 후에 아민계 화합물을 첨가하여 교반하고;
vi) 상기 금 구획의 EDC-활성화된 카복실 기와 상기 아민계 화합물의 아민기 사이에 아미드 결합을 형성하고; 그리고
vii) 상기 금 구획에서 아민계 화합물의 알킬기 사이의 소수성 상호 작용에 의해 아민계 화합물이 서로 결합함으로써 금 구획끼리 서로 마주하면서, 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자가 방향성을 가진 클러스터를 형성하면서 자가조립되는;
단계를 포함하는, 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 금 시드는 다면체 금 나노입자인, 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 다면체 금 나노입자는 10면체 금 나노입자인, 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 iv) 단계 이후에, 상기 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자 표면에 라만 리포터를 부착하는 단계를 더 포함하는, 이방성 에이콘 타입 이중 금속 나노입자의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 아민계 화합물은, 헥사데실아민(hexadecylamine), 헵타데실아민(heptadecylamine), 옥타데실아민 (octadecylamine), 노나데실아민(nonadecylamine) 및 도데실아민(dodecylamine)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 구획화된 이중 금속 나노막대의 방향성을 가진 클러스터 나노구조체 제조방법.
a) 검출하고자 하는 표적 물질이 포함된 시료액을 준비하고;
b) 자성 나노입자에 상기 표적에 대한 제1 항체를 고정하여 준비하고;
c) 제6항의 금속 나노 프로브에 상기 표적에 대한 제2 항체를 고정하여 준비하고;
d) 상기 제1 항체가 고정된 자성 나노입자를 상기 시료액에 첨가하여 상기 표적과 상기 자성 나노입자의 제1항체가 접합된 면역복합체를 형성하고;
e) 상기 제2 항체가 고정된 금속 나노 프로브를 상기 제1 항체가 접합된 면역복합체가 포함된 용액에 첨가하여 금속 나노 프로브 제2 항체-표적-자성 나노입자의 제1 항체의 샌드위치 면역복합체를 형성하고;
f) 자기장을 이용하여 상기 샌드위치 면역복합체를 형성하지 않은 자성 나노입자 및 금속 나노 프로브를 분리하고; 그리고
g) 상기 샌드위치 면역복합체의 라만 신호를 측정하는;
단계를 포함하는, 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반의 표적 물질 검출 방법.
제12항에 있어서,
상기 표적 물질은 단백질 또는 병원균인, 표면-증강 라만 산란(SERS) 기반의 표적 물질 검출 방법.