KR20190085495A - 탈합금화 기반의 플라즈모닉 내부 나노갭 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents
탈합금화 기반의 플라즈모닉 내부 나노갭 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 코어와 쉘 사이에, 라만활성물질이 배치된 평균 0.1 내지 10 nm 높이의 빈 공간(hollow space)을 갖는 코어-갭-쉘 나노입자의 제조방법으로서, 표면에 라만활성물질이 개질된 제1금속 코어 입자 상에 제2금속 및 제3금속으로 된 합금 쉘을 도입하고 제2금속 부식제(etchant)로 처리하여 제2금속을 선택적으로 제거하여 탈합금화하는 단계를 포함하는 제조방법, 상기 방법으로 제조된 갭 내에 배치된 라만활성물질을 포함하는 코어-갭-쉘 나노입자 및 이의 바이오센싱 및/또는 바이오이미징 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 코어와 쉘 사이에, 라만활성물질이 배치된 평균 0.1 내지 10 nm 높이의 빈 공간(hollow space)을 갖는 코어-갭-쉘 나노입자의 제조방법으로서, 표면에 라만활성물질이 개질된 제1금속 코어 입자 상에 제2금속 및 제3금속으로 된 합금 쉘을 도입하고 제2금속 부식제(etchant)로 처리하여 제2금속을 선택적으로 제거하여 탈합금화하는 단계를 포함하는 제조방법, 상기 방법으로 제조된 갭 내에 배치된 라만활성물질을 포함하는 코어-갭-쉘 나노입자 및 이의 바이오센싱 및/또는 바이오이미징 용도에 관한 것이다.
플라즈몬성 나노구조물 특히, 플라즈몬적으로 결합되고(plasmonically coupled) 증강된 나노갭을 갖는 구조물은 이의 강하고 조절가능한(tunable) 광학적 성질 및 촉매, 센싱 및 이미징과 같은 다양한 분야에서의 잠재적인 활용 가능성으로 인해 매우 중요하다. 플라즈몬성 나노구조물의 광학적 성질은 다양한 나노구조적 특성에 대해 매우 의존적이므로, 이들 나노구조물로부터 조절가능하며, 정량화할 수 있는(quantifiable) 플라즈몬성 신호를 획득하기 위해서는 고수율로 플라즈몬성 나노구조물을 매우 정교한 합성하는 방법이 요구된다. 많은 플라즈몬적으로 증강된 광학 신호 중, 표면증강라만산란(surface-enhanced Raman scattering; SERS)이 단일-분자-수준의 감도까지 확장될 수 있는 이의 초고도의 민감성과 복합화 가능성(multiplexing potential)으로 인해 많은 주목을 받고 있다. 이러한 점에서, SERS-기반 테크닉이, 바이오센싱 및 화학작용제의 검출과 같은, 플라즈모닉스 및 분석적 응용에 널리 사용되고 있다. 플라즈모닉스에 있어서, 귀금속(예컨대, 금 및 은) 나노입자(NP)에서 국부적 표면 플라즈몬 공명의 흡수는, "핫 스팟(hot spots)"이라 불리는, NP 사이의 특정한 위치에서 전자기장(electromagnetic(EM) field)을 현저히 증가시키고 국부화할 수 있음이 잘 알려져 있다. 이에, 나노팁(nanotips), 나노기공(nanopores) 및 나노스케일의 거칠어진 표면(nanoscale-roughened surfaces)과 같은 형태-조절된(morphology-controlled) 귀금속 나노구조물을 이용하여 SERS-활성 구조물을 고안 및 제조하려는 많은 시도가 있었다. 특히, SERS와 관련하여, 전자기장은 금속성 나노구조물 간의 갭 또는 이음부(junctions)에서의 플라즈몬 커플링을 통해 현저히 증강될 수 있다. 그러나, 이러한 갭에서의 플라즈몬 커플링은 입자간 거리에 의해 크게 영향을 받으며, 결과적으로 SERS 신호에 유의한 영향을 미친다. 이는, 이들 SERS-활성 구조물의 상용에 대한 유용성에 주된 장애가 되는, SERS 신호에 조절 불가한 재현불가능성을 부여할 수 있다. 그 결과, 이들 구조물의 양산을 위한 고정밀(high-precision) nm 스케일 또는 준(sub)-nm 스케일 갭 공학(engineering)은 이들 입자들로부터 재현가능하며 신뢰할만한 SERS 신호를 발생시키기 위한 중요한 과제이다.
많은 플라즈몬성 나노갭 구조물 중, nm-스케일의 내부 갭을 갖는 내부(intra)-나노갭 구조물은 다수의 입자에서 나노갭의 균일성 및 조절가능성으로 인해, 강하게 증강되고 조절가능한 SERS 신호를 발생시킬 수 있으므로, 유력한 SERS 기재일 수 있다. SERS-활성 내부 나노갭 구조불을 형성하기 위하여, 다양한 합성 전략이 채택되고 있다. 특히, AuNP 상에 티올화된 DNA를 도입함으로써 Au-Au 코어-쉘 형성 과정 동안 1 nm 내부 갭 형성을 도모하고, 고수율로 균일한 1 nm 내부-갭을 갖는 Au 나노다리결합된 나노갭 입자(Au-NNP)를 제조하고, 나아가 강하고, 안정하며 재현가능한 SERS 신호를 제공할 수 있었다. Au 코어 및 Au 쉘을 포함하는 실리카-층간삽입된(interlayered) 나노갭 구조물(Au 나노마트료시카), 및 고분자 또는 소분자-층간삽입된 플라즈몬성 나노갭 구조물과 같은 내부 나노갭 구조를 형성하는 다른 접근법이 다양한 내부-나노갭 구조물의 합성에 채택되고 있다. 이들 모든 구조물은, 그러나, 복잡한 합성의 복합성(complicated synthetic complexity), 시간 및 경비, 온도를 포함한 반응 조건, nm-수준의 구조적 정밀성, 양산에 있어서의 한계, 입자 안정성, 구조 및 조성의 다양성(versatility), 및 실용성의 부족 등의 여전히 많은 단점 및 해소되어야 할 과제가 있다. 입자의 내부에 내부-나노갭을 형성하기 위한 층간삽입의 필요성 및 내부-나노갭 입자로부터의 광학적 신호의 레이저 분극화-의존적 변화는 전자기장의 세기 및 분포를 포함한 이들 나노구조물의 플라즈몬 성질을 이해하고 조절하는 것을 크게 제한한다. 생물의학적 적용(biomedical application)을 위한 이들 내부-나노갭 입자의 사용 및 이로운 성질에 대한 연구는 미진하며 명확히 밝혀진 바 없다.
비특허문헌 1: Nature Nanotechnology, 2011, 6: 452-460
본 발명자들은 DNA 등의 층간 삽입물 없이 입자의 내부에 나노갭을 가지며, 상기 갭에 배치된 라만활성물질을 포함하여 현저한 SERS 효과를 나타낼 수 있는 코어-갭-쉘 구조의 나노입자 및 마일드한 조건 예컨대, 실온에서 수행할 수 있는 이의 제조방법을 발굴하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 표면에 라만활성물질이 개질된 코어 입자 상에 2종 금속의 합금으로 된 쉘을 도입한 후 이중 1종 금속을 선택적으로 용해시키는 부식제와 접촉시켜 1종 금속을 선택적으로 제거함으로써, 선택적-상호확산적 탈합금화(selective-interdiffusive dealloying; SID) 공정을 통해, 입자 내부에 라만활성물질이 배치된 빈 공간 형태의 나노갭을 갖는 코어-갭-쉘 나노입자를 고수율로 합성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 코어와 쉘 사이에, 라만활성물질이 배치된 평균 0.1 내지 10 nm 높이의 빈 공간(hollow space)을 갖는 코어-갭-쉘 나노입자의 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 제조방법은 표면에 라만활성물질이 개질된 제1금속 코어 입자를 준비하는 제1단계; 표면 개질된 제1금속 코어 입자에 각각 제2금속 전구체, 염기 및 제3금속 전구체를 포함하는 용액 및 환원제 용액을 첨가하여 제1금속 코어 입자의 개질된 표면 상에 제2금속 및 제3금속 합금 쉘(metal alloy shell)을 형성하는 제2단계; 및 (표면에 라만활성물질이 개질된 제1금속 코어)-(제2금속 및 제3금속 합금 쉘) 나노입자를 제2금속 부식제(etchant)로 처리하여 제2금속을 선택적으로 제거하여 탈합금화하는 제3단계;를 포함하며, 상기 제1금속은 제2금속에 비해 더 높은 환원 전위를 갖도록 선택할 수 있다.
본 발명은 중간 삽입층 없이 제1금속 코어-빈 공간으로 된 나노갭-제3금속 쉘의 구조를 갖는 입자를 제조함에 있어서, 제3금속에 비해 빠르게 제1금속 코어 입자의 표면에서 환원될 수 있는 제2금속과 제3금속의 합금으로 쉘을 형성하고, 제2금속을 선택적으로 제거할 수 있는 부식제를 사용함으로써 제2금속이 제거된 자리 즉, 제1금속 코어 부근으로부터 제3금속이 다량 분포하는 쉘 층의 사이에 빈 공간으로 된 나노갭을 형성할 수 있는 조건을 확립한 것에 기초한다. 이를 달성하기 위한 전제 조건은 제2금속과 제3금속의 합금으로 된 쉘 형성시 제2금속이 보다 빠르게 환원되어 제1금속 코어 주변에서 제2금속의 함량이 높고 쉘의 외부로 진행할수록 제3금속의 함량이 높아지는 함량구배를 갖는 합금 쉘을 형성하는 것으로, 이를 위하여 환원 전위차에 따른 환원 속도 차이를 이용하거나, 또는 다소 환원 전위가 낮더라도 제2금속과 높은 결합력을 갖는 물질로 제1금속 코어를 개질하여 제2금속의 접근을 촉진함으로써 초기 반응 속도를 높이는 방식으로 달성할 수 있다.
상기 제1금속 내지 제3금속은 각각 독립적으로 금, 은, 구리, 알루미늄, 백금, 팔라듐 등의 금속일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 다만, 전술한 바와 같이, 제1금속 및 제2금속으로는 제1금속으로 더 높은 환원 전위를 갖는 금속을 조합하여 선택하는 것이 바람직하며, 제2금속과 제3금속은 제2단계의 환원반응에서 제2금속이 보다 빠르게 제1금속 코어 표면에서 환원되어 쉘 내에서 제2금속과 제3금속이 농도 구배를 갖도록 형성되는 것이 바람직하다. 이를 위하여 제2금속과 제3금속은 제3금속에 비해 환원경향이 높은 즉, 더 높은 환원 전위를 갖는 금속을 제2금속으로 선택하거나, 제1금속 코어의 표면에 제2금속과 선택적으로 보다 높은 결합력을 갖는 물질을 개질하여 제2금속의 도입 및 초기 환원을 촉진시키는 방법을 선택할 수 있다.
예컨대, 상기 제2단계는 염기 존재 하에 수행할 수 있다. 염기를 불포함하는 조건에서 제2단계를 수행하는 경우, 용액의 낮은 pH로 인해 환원 속도가 느려지며, 코어 상에 제2금속 및 제3금속이 원활하게 합성상을 형성하기 어려울 수 있고, 합금 생성시 발생할 수 있는 부산물이 공침되어 쉘에 불순물이 혼입될 가능성이 있다. 또한, 원하는 조성의 쉘 즉, 코어 부근에서는 제2금속의 함량이 높고 쉘의 외부로 진행할수록 제3금속의 함량이 증가하는 경향의 구조물을 얻기 어려울 수 있다. 예컨대, 제2금속으로서 은을 사용하는 경우, 염기 부재시 제2단계의 반응으로부터 염화은(AgCl) 침전이 발생할 수 있으나, 염기를 첨가하여 pH를 낮춤으로써 상기 발생되는 부산물을 효과적으로 제거할 수 있다. 상기 염기로는 수산화암모늄(NH4OH), 수산화나트륨(NaOH), 수산화칼륨(KOH) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 제2단계에 첨가하여 반응 용액의 pH를 적정 수준으로 높여줄 수 있는 한, 그 종류에 제한되지 않는다.
예컨대, 제2단계 이전에 상기 표면 개질된 제1금속 코어 입자를 제3금속에 비해 제2금속과 높은 결합력을 갖는 작용기를 갖는 고분자 용액으로 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 고분자 용액을 처리함으로써 상기 고분자와 제2금속 간의 결합력을 바탕으로 제3금속에 비해 제2금속의 초기 환원 속도를 빠르게 하여 쉘 중의 코어와 가까운 부위에 제2금속이 다량 존재하며 쉘의 외부로 진행할수록 제3금속의 함량이 증가하는 농도 구배를 갖는 조성비의 불균일한 쉘이 형성되도록 할 수 있다. 구체적으로, 상기 고분자 용액은 폴리비닐피롤리돈을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 폴리비닐피롤리돈의 피롤리돈은 금에 비해 은 이온과 보다 높은 결합력으로 상호작용할 수 있으므로, 금 이온이 보다 높은 표준 환원 전위를 가짐에도 즉, 보다 높은 환원 경향에도 불구하고 은 이온이 보다 빠르게 코어 주변에서 환원될 수 있도록 한다.
상기 제2단계에 사용되는 제2금속 전구체의 양은 동일한 단계에 사용되는 제3금속 전구체의 양을 고려하여 상호보완적으로 결정할 수 있다. 예컨대, 제2금속의 사용량은 이후 형성되는 나노갭의 두께를 결정하며, 제3금속의 사용량은 쉘의 두께에 영향을 줄 수 있다. 한편, 제3금속의 사용량이 동일하더라도 제1금속 코어의 크기가 크거나 제2금속의 사용량이 많아 제3금속의 분포가 중심으로부터 멀어지는 경우 제3금속에 의해 형성되는 쉘의 두께는 상대적으로 얇아질 수 있다.
예컨대, 상기 제2금속 및 제3금속 전구체는 1:0.3 내지 1:10의 원자% 비율로, 구체적으로, 1:0.4 내지 1:8, 보다 구체적으로는 40:60 내지 10:90의 원자% 비율로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 제2금속의 사용량이 제3금속의 몰수의 3배를 초과하는 경우, 쉘이 불완전하게 형성되거나, 형성되는 나노갭의 간격이 원하는 수준 이상으로 넓어 효율적인 라만신호증강 효과를 달성하기 어렵거나 과도한 부식으로 빈 공간으로서의 갭을 보존할 수 있는 금속브릿지를 유지하기 어려워 나노-갭-쉘의 구조가 붕괴될 수 있다. 반면, 제2금속 전구체의 비율이 10% 미만으로 낮은 경우에는 효율적인 라만신호증강 효과를 나타내기 위한 충분한 갭을 형성하기 어려울 수 있다.
예컨대, 상기 제1금속 및 제3금속은 모두 금이고, 제2금속은 은일 수 있다. 이에 따라 최종적으로 제조되는 코어-갭-쉘 나노입자는 금으로 된 코어에 은을 일부 함유하는 금으로 된 금-은 합금 쉘로서, 상기 코어와 쉘은 금, 은 또는 금과 은의 합금으로 된 나노브릿지에 의해 연결되고, 이들 사이에 형성된 빈 공간으로서의 나노갭을 유지할 수 있다. 아울러, 금과 은은 우수한 SERS 효과를 발휘하는 것으로 잘 알려진 대표적인 물질이다.
전술한 바와 같이, 제3금속으로 금을 제2금속으로 은을 선택하는 경우, 금 이온은 은 이온에 비해 높은 표준 환원 전위를 가지므로 은 이온에 비해 높은 환원 경향을 나타내며 빠른 환원 속도를 나타내지만, 본 발명의 제조방법에서는 제2단계에 앞서 제2금속 즉, 은 이온과 보다 높은 결합력을 나타내는 피롤리돈을 포함하는 폴리피롤리돈으로 코어입자를 처리함으로써 코어 입자 표면으로의 제2금속 즉, 은 이온의 접근을 유도함으로써 환원 반응 초기 은 이온의 빠른 환원을 유도할 수 있고, 이에 따라 코어 주변에는 제2금속 즉, 은 함량이 높고, 외부로 진행할수록 제3금속 즉, 금 함량이 증가하는 경향으로 쉘을 형성할 수 있다.
예컨대, 상기 제2금속 부식제로는 질산철(ferric nitrate; Fe(NO3)3)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 제2금속 및 제3금속의 합금 중 제2금속을 선택적으로 용해시킬 수 있는 물질이면 제한없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로서, 질산철을 부식제로 사용함으로써 금과 은의 합금 중 은을 선택적으로 용해시켜 제거할 수 있다.
한편, 전술한 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 입자의 쉘은 코어 주위에서 제2금속의 함량이 높으며, 쉘의 외부로 진행할수록 제3금속의 함량이 증가하는 경향을 갖는다. 따라서, 상기 제3단계의 탈합금화는 쉘의 외부 표면에 노출된 제2금속 원자들이 부식제와의 접촉에 의해 용해되기 시작하며, 이에 따라 형성된 핀홀형의 공석(pinhole-like vacancies)이 형성되며 이를 통해 부식제가 쉘의 내부로 확산되어 내부의 제2금속을 선택적으로 제거함으로써 코어와 쉘 사이에 빈 공간 형태의 갭을 형성할 수 있다. 이때, 남겨진 금 및/또는 은은 코어와 쉘 사이를 연결하며 빈 공간을 지탱하게 하는 브릿지 및 쉘을 형성할 수 있다.
본 발명에서 용어, "라만활성물질"은 라만분광법에 의해 검출가능한 물질로서, 상기 라만활성물질은 유기 또는 무기 분자, 원자, 복합체 또는 합성 분자, 염료, 천연발생 염료(피코에리스린 등), C60과 같은 유기 나노구조체, 벅키볼, 탄소 나노튜브, 양자점, 유기 형광 분자 등을 포함한다. 구체적으로, 라만활성물질의 예로서, 머캅토벤조산, 아미노티오페놀, FAM, Dabcyl, TRITC(테트라메틸 로다민-5-아이소티오시아네이트), MGITC(말라키트 그린 아이소티오시아네이트), XRITC(X-로다민-5-아이소티오시아네이트), DTDC(3,3-디에틸티아디카보시아닌 아이오다이드), TRIT(테트라메틸 로다민 아이소티올), NBD(7-니트로벤즈-2-1,3-다이아졸), 프탈산, 테레프탈산, 아이소프탈산, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 비오틴, 다이곡시게닌(digoxigenin), 5-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시, 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시로다민, 6-카복시로다민, 6-카복시테트라메틸 아미노 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌(Cy3, Cy3.5, Cy5), 크산틴, 석신일플루오레세인, 아미노아크리딘, 양자점, 탄소동소체, 시아나이드, 티올, 클로린, 브롬, 메틸, 인 또는 황 등이 있으나 이에 제한되지 않고, 사용된 라만활성물질이 뚜렷한 라만 스펙트럼을 나타내어야 한다. 바람직하게는 시아민 계열 형광 유기 분자인 Cy3, Cy3.5, Cy5 또는 FAM, Dabcyl, Rhodamine 계열의 형광분자를 포함하는 유기 형광분자 또는 머캅토벤조산 및 아미노티오페놀을 포함하는 비형광성 라만활성물질들일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 유기 형광분자는 라만 분석 시 사용하는 여기 레이저 파장과 공명하여 더욱 높은 라만 신호의 검출이 가능한 장점이 있으나, 본 발명의 범주가 이에 제한되는 것은 아니다.
예컨대, 본 발명의 제조방법에서 제1금속으로 된 코어의 형태는 최종 형성되는 코어-갭-쉘 나노입자의 형태를 결정한다. 나아가 이는 최종 형성되는 코어-갭-쉘 나노입자의 광학적 특성에 영향을 줄 수 있다. 상기 제1금속으로 된 코어는 구형, 로드형, 큐브형 또는 프리즘형의 입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 표면증강라만산란(surface-enhanced Raman scattering; SERS) 신호를 나타내는, 코어와 쉘 사이에 평균 수 nm 높이의 라만활성물질이 배치된 빈 공간(hollow space)을 갖는, 코어-갭-쉘 나노입자를 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 코어-갭-쉘 나노입자는 제1금속으로 된 코어 및 제2금속 및 제3금속의 합금으로 된 쉘로부터 제2금속을 선택적으로 일부 또는 전부 제거하여 코어와 쉘 사이에 형성된 빈 공간인 갭을 포함하고, 상기 제2금속 및 제3금속의 합금으로 된 쉘은 제1금속 코어 표면으로부터 외부로 진행할수록 제3금속에 대한 제2금속의 함량이 감소하며, 최종적으로 형성된 코어-갭-쉘 나노입자는 코어와 쉘을 연결하는 제2금속, 제3금속 또는 둘 모두를 포함하는 하나 이상의 금속 브릿지를 통해 갭을 유지하는 나노입자일 수 있다.
예컨대, 본 발명의 코어-갭-쉘 나노입자는 이후 바이오센싱 및/또는 바이오이미징에서의 적용을 위하여, 이의 표면에, 검출 또는 영상화 하고자 하는 대상과 특이적으로 상호작용하는 핵산, 폴리펩티드, 또는 리간드가 결합된 나노입자일 수 있다.
상기 본 발명의 나노입자는 전술한 본 발명의 코어-갭-쉘 나노입자의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 코어-갭-쉘 나노입자를 포함하는 바이오센싱 또는 바이오이미징용 조성물을 제공한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 코어-갭-쉘 나노입자는 표면증강라만산란에 의해 검출 가능하므로 이를 통해 바이오센싱 및 바이오이미징에 활용할 수 있다.
이때, 사용되는 코어-갭-쉘 나노입자는 표면에, 검출 또는 영상화 하고자 하는 대상과 특이적으로 상호작용하는 핵산, 폴리펩티드, 또는 리간드가 결합된 나노입자일 수 있다. 예컨대, 특정 DNA 검출을 위해서는 코어-갭-쉘 나노입자는 표면에 검출하고자 하는 표적 DNA의 일부와 상보적으로 결합 가능한 서열을 포함하는 DNA 단편을 결합시키고, 표적 DNA의 다른 일부와 상보적으로 결합 가능한 서열을 포함하는 DNA 단편으로 표지된 마그네틱 비드와 함께 표적 DNA를 함유한 것으로 예상되는 시료와 접촉시킨 후, 자석을 이용하여 마그네틱 비드를 회수하고, 본 발명의 코어-갭-쉘 나노입자에 포함된 라만활성물질로부터의 라만 신호를 측정하여 신호 발생 여부를 확인함으로써 표적 DNA의 존재를 확인할 수 있고, 나아가, 신호의 세기를 측정하여 이를 정량할 수 있다. 또는 영상화하고자 하는 세포에서 특이적으로 발현되는 단백질과 선택적으로 결합 가능한 단백질 또는 폴리펩티드를 코어-갭-쉘 나노입자는 표면에 결합시킨 나노입자를 이용하고 라만 신호를 측정함으로써 원하는 세포를 이미징할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 A형 간염 바이러스 DNA의 일부와 상보적인 서열의 DNA로 표지된 코어-갭-쉘 나노입자를 사용하여 표적 DNA인 A형 간염 바이러스 유전자를 10 내지 100 aM의 낮은 검출한계로 검출할 수 있음을 확인하였으며, 전이성 및 내피 종양 세포에서 과발현되는 ανβ3 인테그린에 특이적으로 결합하는 사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)(c(RGDyK); 이하 cRGD로 표시) 펩타이드로 표지된 코어-갭-쉘 나노입자를 이용하여 인테그린 ανβ3-양성 U87MG 세포에서는 강한 SERS 신호가 관찰되었으나, ανβ3-음성 MCF-7 세포에서는 SERS 신호가 관찰되지 않음을 확인하여 높은 선택성으로 바이오이미징 가능함을 확인하였다.
예컨대, 본 발명에 따른 바이오센싱 또는 바이오이미징용 조성물은 DNA 혼성화 및/또는 단백질, 폴리펩티드, 리간드와 수용체 등의 결합에 적합한 환경을 제공할 수 있도록 완충액과 함께 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 완충액으로는 당업계에 널리 사용되는 완충액 예컨대, PBS, PBSS 등의 인산계 완충액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 선택적-상호확산적 탈합금화(selective-interdiffusive dealloying; SID) 공정을 이용한 코어-갭-쉘 나노입자의 제조방법은 종래 중간 삽입층을 도입하는 방법과 달리 삽입 물질 없이도 수 nm 이내로 조절된 균일한 두께로 입자 내에 나노갭을 형성할 수 있으며, 상기 나노갭에 라만활성물질을 도입하여 제조한 코어-갭-쉘 나노입자는 현저한 SERS 신호를 나타내므로 초고감도의 바이오센싱 및/또는 바이오이미징에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 합성된 그대로의(as-synthesized) NP의 내부 나노갭(interior nanogaps), 쉘 두께, 및 입자 크기 분포를 나타낸 도이다. (A)는 CAS NP, (B)는 DIP, (C)는 Ag 부식(etching) 이전의 갭이 없는(gap-less) AuNP, 및 (D)는 Ag 부식 후의 갭이 없는 AuNP를 나타낸다. 데이터는 100개 개별 입자들의 고해상도 TEM(HR-TEM) 이미지로부터 획득하였다.
도 2는 4-MPy 용액의 입사-레이저-출력-의존적(incident-laser-power-dependent) 라만 세기를 나타낸 도이다. 1,003 cm-1에서의 핑거프린트 피크의 라만 세기를 입사 레이저 출력에 대한 함수로 플롯하였다. 모든 라만 스펙트럼은 30초 노출 시간으로 대물렌즈(20×, NA = 0.4)를 통해 633 nm 레이저를 이용하여 획득하였다. 모든 실험에 대해 동일한 4-MPy 농도(200 mM)를 사용하였다.
도 3은 탈합금화된 내부-나노갭 입자의 합성 전략 및 특성을 나타낸 도이다. (A)는 Au/Au-Ag 코어/합금 쉘(core/alloy shell; CAS) NP로부터 Au-Ag 탈합금화된 내부 나노갭 입자(dealloyed intra-nanogap particle; DIP)의 합성을 위한 선택적이며 상호확산적인 탈합금화(selective, interdiffusive dealloying; SID)-기반 전략을 개략적으로 나타낸 도이다. SID 반응의 제안된 기전을 검은색 점선 박스 내에 나타내었다. (B 내지 J)는 합성된 NP의 TEM 이미지, EDX 원소 맵핑 및 NP의 중심을 가로지르는 EDX 선 스캔 프로파일을 나타낸다. (B 내지 D)는 CAS NP, (E 내지 G)는 DIP, 및 (H 내지 J)는 갭이 없는 Au-Au 코어-쉘 NP에 대한 결과이다. Ag 원자는 CAS NP에서 주로 Au 코어 근처에 위치하며(도 3D 내의 파란색 점선 박스), Au 코어 근처에서 Ag 원자의 수는 탈합금화 반응 후 감소하여(도 3G 내의 파란색 점선 박스), 내부 나노갭이 형성된다. 갭이 없는 AuNP에서, 내부 나노갭은 관찰되지 않았다(도 3J 내의 파란색 점선 박스). 도 3I에 나타난 Ag의 EDX 맵은 노이즈-수준의 신호를 나타내었다. 하얀색 스케일바는 50 nm이다. (K)는 DIP의 나노갭 크기, 쉘 두께, 및 입자 크기 분포를 나타낸다(100개 입자의 HR-TEM 이미지를 분석). (L)은 DIP의 TEM 이미지를 나타낸다. (M)은 DIP의 HR-TEM 이미지를 나타낸다. 여기서, 인접한 격자 둘레(adjacent lattice fringes)에 대한 0.235 nm의 d-공간(d-spacing)은 면심입방구조(face-centered cubic structure)의 (111) 평면에 상응한다. 삽입도는 DIP의 고리형(ring-shaped) SAED 패턴을 나타내며, 이는 다결정성 구조가 존재함을 나타낸다.
도 4는 합성된 그대로의 NP의 EDX 원소 맵을 나타낸 도이다. (A)는 CAS NP, (B)는 DIP, 및 (C)는 갭이 없는 AuNP를 나타낸다. 맵은 쉘 영역 내의 Au 및 Ag의 원소 분포를 나타낸다(좌측 도면의 검은색 점선 박스). 스케일바는 10 nm이다.
도 5는 합금 쉘 형성 과정 동안 CAS NP 반응 혼합물의 UV-Vis 스펙트럼 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 Ag 부식 반응 동안 갭이 없는 AuNP의 구조적 변화 및 광학적 성질을 나타낸 도이다. (A 및 B)는 각각 Ag 부식 전과 후의 갭이 없는 AuNP의 TEM 이미지이다. (C)는 Ag 부식 반응 전과 후 갭이 없는 AuNP의 UV-Vis 스펙트럼이다. (D)는 Ag 부식 반응 전과 후 갭이 없는 AuNP의 용액-기반 SERS 스펙트럼이다. 모든 스펙트럼은 동일한 입자 농도(100 pM)를 사용하여 10초의 노출 시간 및 4 mW 레이저 출력의 633 nm 레이저를 이용하여 획득하였다. 형태, UV-Vis 스펙트럼 및 SERS 스펙트럼은 Ag 부식 반응 수행 여부와 무관하게 유사하였으며, 이는 질산철-기반 탈합금화 반응이 Ag-특이적/선택적 용해 반응임을 나타낸다.
도 7은 탈합금화 반응에 따른 DIP의 구조 및 광학적 성질의 변화를 나타낸 도이다. (A)는 Fe(NO3)3 첨가량 증가에 따른 DIP의 구조적 변화를 나타낸다. 탈합금화 반응이 진행됨에 따라 내부 나노갭이 점차 발달한다. (B)는 DIP의 SERS 세기에서의 내부-나노갭-형성-의존적 변화를 나타낸다. 용액-기반 SERS 세기는 완전한 내부 나노갭의 형성에 따라 증가하며 보다 높은 Fe(NO3)3 농도에서 최대화되며(15 mM 이상), 이는 탈합금화 반응이 완성되었음을 나타낸다. DIP의 SERS 세기는 CAS NP의 것의 6배에 달한다. 이는 SERS 증강이 내부 나노갭에서 형성되는 강하고 국부화된 전자기장에 의함을 나타낸다. (C)는 DIP의 내부-나노갭-형성-의존적 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸다. 흡수 피크는 탈합금화 반응이 진행됨에 따라 다소 변화한다. 탈합금화 반응에 의해, ~660 nm에서 새로운 흡수 숄더 피크가 나타났으며(빨간 실선), 이는 내부 나노갭의 형성을 나타낸다. 상기 피크는 ~700 nm로 다소 장파장 이동되며 완전하고 대칭적인 내부 나노갭의 형성 후 점차 안정화된다(자주색 실선).
도 8은 NP의 실험적 UV-Vis 스펙트럼 및 DIP의 이론적 계산을 나타낸 도이다. (A)는 합성된 그대로의 NP의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸다. 삽입도는 NP 용액의 색상을 나타낸다. (B)는 내부 나노갭 내에 다양한 금속 조성을 함유하는 DIP에 대해 시뮬레이션된 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 해당 모델에서 내부-나노갭 영역은 금속 잔여물과 물의 혼합물로 채웠다. (C 및 D)는 다른 조성의 금속 잔여물을 내부 나노갭 내에 함유하는 DIP에 대해 계산된 근접장(near-field) 전자기장(EM field) 분포를 나타낸다[(C) 12.5몰% 및 (D) 0몰%]. 여기 레이저 파장은 633 nm이며, 스케일바는 20 nm이다.
도 9는 합성된 그대로의 NP에 대해 시뮬레이션된 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다. (A)는 CAS NP, (B)는 DIP에 대한 결과이다. 미 이론(Mie theory)을 이용하여 이론적 계산을 수행하였다. 합성된 그대로의 NP에 대해 사용된 구조적 데이터(평균 입자 크기, 내부 나노갭 크기, 쉘 두께, 및 원자 조성)는 도 1 및 표 1에 나타낸다. 바탕(background) 및 내부-나노갭 영역은 굴절률 1.33의 물로 모델링하였다. DIP의 경우에만 약 950 nm에서 새로운 공명 피크가 관찰되었으며, 이는 내부-나노갭으로 인해 새로운 플라즈몬성 모드의 생성을 나타낸다.
도 10은 용액 상태의 합성된 그대로의 NP에 대한 나노구조-, 라만-염료 위치-, 입자 농도- 및 시간-의존적 SERS 성질을 나타낸 도이다. (A)는 용액 상태의 합성된 그대로의 NP에 대한 SERS 스펙트럼이다. 라만-염료 분자(4-MPy)는 Au 코어 표면에 부착되었다. (B)는 4-MPy-개질된 NP에 대한 용액-기반 SERS 스펙트럼이다. 모든 염료는 입자 표면에 개질되었다. (C)는 DIP에 대한 SERS 신호 세기에서 입자 농도-의존적 변화를 나타낸다(500 fM 내지 50 pM; 1,097 cm-1). (D)는 DIP의 시간-의존적 프로파일이다. 모든 스펙트럼은 10초의 노출 시간 및 4 mW 레이저 출력의 633 nm 레이저를 이용하여 획득하였다. 입자 농도는 (A 및 B)에서 100 pM 및 (D)에서 20 pM이다.
도 11은 DIP의 흡수-파장-의존적 SERS 스펙트럼을 나타낸 도이다. 스펙트럼은 동일한 입자 농도(100 pM)를 사용하여 획득하였다. 노출 시간은 10초이며, 레이저 출력은 5 mW(514 nm) 및 4 mW(785 nm)였다.
도 12는 DIP에 대한 AFM-상관(correlated) 라만 분광법-기반 단일-입자 맵핑 분석, SERS 증강인자(enhancement factor; EF) 분포, 및 분극화(polarization)-분해(resolved) SERS 플롯을 나타낸 도이다. (A)는 AFM-상관 단일-입자 라만 분광법에 사용된 기기 셋업을 나타낸다. (B)는 DIP에 대한 AFM 이미지(좌측) 및 레일리 산란 이미지(우측)의 형태적 매칭을 나타낸다. (C)는 단일 DIP의 확대된 AFM 이미지(좌측) 및 NP를 가로지르는 높이 프로파일(우측, AFM 이미지에서 빨간색 선을 따름)을 나타낸다. (D)는 개별 DIP로부터 측정된 1,003 cm-1에서 SERS EF 값의 분포를 나타낸다(110개 입자를 분석함). EF 값은 큰 SERS EFs의 좁은 분포(1.1×108 내지 2.5×109 및 1.1×108 내지 5.3×109 범위에서 각각 90.0% 및 97.3% 입자 존재)를 나타낸다. 모든 분석된 입자는 1.1×108 이상의 EF 값을 나타내었다. (E)는 1,097 cm-1에서 SERS 세기의 회전각(rotation angle, θ)에 대한 단일-입자 분극화-분해 플롯이다. (F 및 G)는 각각 DIP 및 Au-NNP에 대한 내부-나노갭 영역에서 전자기장의 회전각에 대한 계산된 분극화-분해 플롯이다. COMSOL을 이용한 유한원소법(finite element method)을 사용하여 이론적 계산을 수행하였으며, 각각의 회전각에서 전기장 증강의 최대값을 플롯하였다. 도 12G의 검은색 화살표는 Au 나노브릿지를 나타낸다.
도 13은 DNA-기능화된 DIP를 이용한 SERS-기반 초고감도 DNA 검출 어세이를 나타낸 도이다. (A)는, DNA-개질된 자성 마이크로입자와 표적 DNA의 샌드위치-포획에 의한, DNA-개질된 DIP 나노탐침을 이용한 SERS-기반 초고감도 DNA 검출 어세이의 개략도이다. (B 및 C)는 상이한 링커 DNA를 이용하여 형성된 표적-DNA-특이적 샌드위치 혼성화 복합체(표적-포획된 DIP 탐침-MMP 복합체)의 SEM 이미지이다[(B) 상보적 서열 DNA(HAV); (C) 비상보적 서열 DNA(HBV)]. 삽입도는 DNA 샌드위치 혼성화 후 외부 자기장 하에서 어세이 용액의 색상을 나타낸다. 스케일바는 500 nm이다. (D)는 DNA-개질된 DIP를 이용한 SERS-기반 DNA 검출 어세이 결과이다. HAV(10 aM 내지 1 pM) 및 HBV(1 pM)의 상이한 DNA 농도에서 1,003 cm-1에서 SERS 세기를 측정하였다. 삽입도는 표적 DNA의 농도에 따른 SERS 스펙트럼의 변화를 나타낸다. 모든 스펙트럼은 2 mW 레이저 출력의 785 nm 여기 레이저를 이용하여 5초의 수집 시간으로 획득하였다. SERS 세기를 획득하고, 각 농도에서 5회 측정을 연속적으로 축적하여 평균하였다.
도 14는 펩타이드-기능화된 DIP를 이용한 SERS-기반 인테그린 ανβ3-특이적 세포 이미징을 나타낸 도이다. (A)는 cRGD--개질된 DIP 나노탐침을 이용한 SERS-기반 표적-특이적 세포 이미징의 개략도이다. (B 및 C)는 각각 cRGD-기능화된 DIP와 인큐베이션한 U87MG 세포(고도의 인테그린 ανβ3 발현) 및 MCF-7 세포(인테그린 ανβ3 음성)의 (좌측) 명시야 현미경 이미지 및 (우측) SERS 맵을 나타낸다. 스케일바는 10 μm이다. 각 맵핑 픽셀(2 μm×2 μm)에서 SERS 세기를 도 14D의 음영으로 표시된 983 cm-1로부터 1,023 cm-1까지의 범위의 SERS 스펙트럼에 대해 통합하고, 세포 이미징을 위해 색상-스케일화하였다(color-scaled). 모든 스펙트럼은 4 mW 레이저 출력의 785 nm 여기 레이저를 이용하여 1초의 수집 시간으로 획득하였다. (D)는 도 14B 및 도 14C의 숫자로 표시된 위치로부터 얻어진 SERS 스펙트럼이다. (E)는 도 14B의 빨간색 박스 내에서 측정된 세포 내의 cRGD-기능화된 DIP의 시간-의존적 라만 프로파일이다. (F 및 G)는 각각 cRGD-기능화된 DIP 및 cRGD-기능화된 AuNP(평균 입자 직경 80 nm)와 인큐베이션한 U87MG의 SERS 맵이다. 스케일바는 10 μm이다. 각 맵핑 픽셀(2 μm×2 μm)에서 SERS 세기를 도 14D의 음영으로 표시된 983 cm-1로부터 1,023 cm-1까지의 범위의 SERS 스펙트럼에 대해 통합하고, 세포 이미징을 위해 색상-스케일화하였다. 모든 스펙트럼은 400 μW 레이저 출력의 633 nm 여기 레이저를 이용하여 1초의 수집 시간으로 획득하였다.
도 15는 cRGD-기능화된 상이한 이미징 탐침과 인큐베이션한 U87MG 세포의 SERS 맵을 나타낸 도이다. (A)는 DIP, (B)는 AuNP(평균 직경 80 nm)에 대한 결과이다. 스케일바는 10 μm이다. 각 맵핑 픽셀(2 μm×2 μm)에서 SERS 세기를 도 14D의 음영으로 표시된 983 cm-1로부터 1,023 cm-1까지의 범위의 SERS 스펙트럼에 대해 통합하고, 세포 이미징을 위해 색상-스케일화하였다. 모든 스펙트럼은 400 μW 레이저 출력의 633 nm 여기 레이저를 이용하여 1초의 수집 시간으로 획득하였다.
도 2는 4-MPy 용액의 입사-레이저-출력-의존적(incident-laser-power-dependent) 라만 세기를 나타낸 도이다. 1,003 cm-1에서의 핑거프린트 피크의 라만 세기를 입사 레이저 출력에 대한 함수로 플롯하였다. 모든 라만 스펙트럼은 30초 노출 시간으로 대물렌즈(20×, NA = 0.4)를 통해 633 nm 레이저를 이용하여 획득하였다. 모든 실험에 대해 동일한 4-MPy 농도(200 mM)를 사용하였다.
도 3은 탈합금화된 내부-나노갭 입자의 합성 전략 및 특성을 나타낸 도이다. (A)는 Au/Au-Ag 코어/합금 쉘(core/alloy shell; CAS) NP로부터 Au-Ag 탈합금화된 내부 나노갭 입자(dealloyed intra-nanogap particle; DIP)의 합성을 위한 선택적이며 상호확산적인 탈합금화(selective, interdiffusive dealloying; SID)-기반 전략을 개략적으로 나타낸 도이다. SID 반응의 제안된 기전을 검은색 점선 박스 내에 나타내었다. (B 내지 J)는 합성된 NP의 TEM 이미지, EDX 원소 맵핑 및 NP의 중심을 가로지르는 EDX 선 스캔 프로파일을 나타낸다. (B 내지 D)는 CAS NP, (E 내지 G)는 DIP, 및 (H 내지 J)는 갭이 없는 Au-Au 코어-쉘 NP에 대한 결과이다. Ag 원자는 CAS NP에서 주로 Au 코어 근처에 위치하며(도 3D 내의 파란색 점선 박스), Au 코어 근처에서 Ag 원자의 수는 탈합금화 반응 후 감소하여(도 3G 내의 파란색 점선 박스), 내부 나노갭이 형성된다. 갭이 없는 AuNP에서, 내부 나노갭은 관찰되지 않았다(도 3J 내의 파란색 점선 박스). 도 3I에 나타난 Ag의 EDX 맵은 노이즈-수준의 신호를 나타내었다. 하얀색 스케일바는 50 nm이다. (K)는 DIP의 나노갭 크기, 쉘 두께, 및 입자 크기 분포를 나타낸다(100개 입자의 HR-TEM 이미지를 분석). (L)은 DIP의 TEM 이미지를 나타낸다. (M)은 DIP의 HR-TEM 이미지를 나타낸다. 여기서, 인접한 격자 둘레(adjacent lattice fringes)에 대한 0.235 nm의 d-공간(d-spacing)은 면심입방구조(face-centered cubic structure)의 (111) 평면에 상응한다. 삽입도는 DIP의 고리형(ring-shaped) SAED 패턴을 나타내며, 이는 다결정성 구조가 존재함을 나타낸다.
도 4는 합성된 그대로의 NP의 EDX 원소 맵을 나타낸 도이다. (A)는 CAS NP, (B)는 DIP, 및 (C)는 갭이 없는 AuNP를 나타낸다. 맵은 쉘 영역 내의 Au 및 Ag의 원소 분포를 나타낸다(좌측 도면의 검은색 점선 박스). 스케일바는 10 nm이다.
도 5는 합금 쉘 형성 과정 동안 CAS NP 반응 혼합물의 UV-Vis 스펙트럼 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 Ag 부식 반응 동안 갭이 없는 AuNP의 구조적 변화 및 광학적 성질을 나타낸 도이다. (A 및 B)는 각각 Ag 부식 전과 후의 갭이 없는 AuNP의 TEM 이미지이다. (C)는 Ag 부식 반응 전과 후 갭이 없는 AuNP의 UV-Vis 스펙트럼이다. (D)는 Ag 부식 반응 전과 후 갭이 없는 AuNP의 용액-기반 SERS 스펙트럼이다. 모든 스펙트럼은 동일한 입자 농도(100 pM)를 사용하여 10초의 노출 시간 및 4 mW 레이저 출력의 633 nm 레이저를 이용하여 획득하였다. 형태, UV-Vis 스펙트럼 및 SERS 스펙트럼은 Ag 부식 반응 수행 여부와 무관하게 유사하였으며, 이는 질산철-기반 탈합금화 반응이 Ag-특이적/선택적 용해 반응임을 나타낸다.
도 7은 탈합금화 반응에 따른 DIP의 구조 및 광학적 성질의 변화를 나타낸 도이다. (A)는 Fe(NO3)3 첨가량 증가에 따른 DIP의 구조적 변화를 나타낸다. 탈합금화 반응이 진행됨에 따라 내부 나노갭이 점차 발달한다. (B)는 DIP의 SERS 세기에서의 내부-나노갭-형성-의존적 변화를 나타낸다. 용액-기반 SERS 세기는 완전한 내부 나노갭의 형성에 따라 증가하며 보다 높은 Fe(NO3)3 농도에서 최대화되며(15 mM 이상), 이는 탈합금화 반응이 완성되었음을 나타낸다. DIP의 SERS 세기는 CAS NP의 것의 6배에 달한다. 이는 SERS 증강이 내부 나노갭에서 형성되는 강하고 국부화된 전자기장에 의함을 나타낸다. (C)는 DIP의 내부-나노갭-형성-의존적 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸다. 흡수 피크는 탈합금화 반응이 진행됨에 따라 다소 변화한다. 탈합금화 반응에 의해, ~660 nm에서 새로운 흡수 숄더 피크가 나타났으며(빨간 실선), 이는 내부 나노갭의 형성을 나타낸다. 상기 피크는 ~700 nm로 다소 장파장 이동되며 완전하고 대칭적인 내부 나노갭의 형성 후 점차 안정화된다(자주색 실선).
도 8은 NP의 실험적 UV-Vis 스펙트럼 및 DIP의 이론적 계산을 나타낸 도이다. (A)는 합성된 그대로의 NP의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸다. 삽입도는 NP 용액의 색상을 나타낸다. (B)는 내부 나노갭 내에 다양한 금속 조성을 함유하는 DIP에 대해 시뮬레이션된 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 해당 모델에서 내부-나노갭 영역은 금속 잔여물과 물의 혼합물로 채웠다. (C 및 D)는 다른 조성의 금속 잔여물을 내부 나노갭 내에 함유하는 DIP에 대해 계산된 근접장(near-field) 전자기장(EM field) 분포를 나타낸다[(C) 12.5몰% 및 (D) 0몰%]. 여기 레이저 파장은 633 nm이며, 스케일바는 20 nm이다.
도 9는 합성된 그대로의 NP에 대해 시뮬레이션된 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다. (A)는 CAS NP, (B)는 DIP에 대한 결과이다. 미 이론(Mie theory)을 이용하여 이론적 계산을 수행하였다. 합성된 그대로의 NP에 대해 사용된 구조적 데이터(평균 입자 크기, 내부 나노갭 크기, 쉘 두께, 및 원자 조성)는 도 1 및 표 1에 나타낸다. 바탕(background) 및 내부-나노갭 영역은 굴절률 1.33의 물로 모델링하였다. DIP의 경우에만 약 950 nm에서 새로운 공명 피크가 관찰되었으며, 이는 내부-나노갭으로 인해 새로운 플라즈몬성 모드의 생성을 나타낸다.
도 10은 용액 상태의 합성된 그대로의 NP에 대한 나노구조-, 라만-염료 위치-, 입자 농도- 및 시간-의존적 SERS 성질을 나타낸 도이다. (A)는 용액 상태의 합성된 그대로의 NP에 대한 SERS 스펙트럼이다. 라만-염료 분자(4-MPy)는 Au 코어 표면에 부착되었다. (B)는 4-MPy-개질된 NP에 대한 용액-기반 SERS 스펙트럼이다. 모든 염료는 입자 표면에 개질되었다. (C)는 DIP에 대한 SERS 신호 세기에서 입자 농도-의존적 변화를 나타낸다(500 fM 내지 50 pM; 1,097 cm-1). (D)는 DIP의 시간-의존적 프로파일이다. 모든 스펙트럼은 10초의 노출 시간 및 4 mW 레이저 출력의 633 nm 레이저를 이용하여 획득하였다. 입자 농도는 (A 및 B)에서 100 pM 및 (D)에서 20 pM이다.
도 11은 DIP의 흡수-파장-의존적 SERS 스펙트럼을 나타낸 도이다. 스펙트럼은 동일한 입자 농도(100 pM)를 사용하여 획득하였다. 노출 시간은 10초이며, 레이저 출력은 5 mW(514 nm) 및 4 mW(785 nm)였다.
도 12는 DIP에 대한 AFM-상관(correlated) 라만 분광법-기반 단일-입자 맵핑 분석, SERS 증강인자(enhancement factor; EF) 분포, 및 분극화(polarization)-분해(resolved) SERS 플롯을 나타낸 도이다. (A)는 AFM-상관 단일-입자 라만 분광법에 사용된 기기 셋업을 나타낸다. (B)는 DIP에 대한 AFM 이미지(좌측) 및 레일리 산란 이미지(우측)의 형태적 매칭을 나타낸다. (C)는 단일 DIP의 확대된 AFM 이미지(좌측) 및 NP를 가로지르는 높이 프로파일(우측, AFM 이미지에서 빨간색 선을 따름)을 나타낸다. (D)는 개별 DIP로부터 측정된 1,003 cm-1에서 SERS EF 값의 분포를 나타낸다(110개 입자를 분석함). EF 값은 큰 SERS EFs의 좁은 분포(1.1×108 내지 2.5×109 및 1.1×108 내지 5.3×109 범위에서 각각 90.0% 및 97.3% 입자 존재)를 나타낸다. 모든 분석된 입자는 1.1×108 이상의 EF 값을 나타내었다. (E)는 1,097 cm-1에서 SERS 세기의 회전각(rotation angle, θ)에 대한 단일-입자 분극화-분해 플롯이다. (F 및 G)는 각각 DIP 및 Au-NNP에 대한 내부-나노갭 영역에서 전자기장의 회전각에 대한 계산된 분극화-분해 플롯이다. COMSOL을 이용한 유한원소법(finite element method)을 사용하여 이론적 계산을 수행하였으며, 각각의 회전각에서 전기장 증강의 최대값을 플롯하였다. 도 12G의 검은색 화살표는 Au 나노브릿지를 나타낸다.
도 13은 DNA-기능화된 DIP를 이용한 SERS-기반 초고감도 DNA 검출 어세이를 나타낸 도이다. (A)는, DNA-개질된 자성 마이크로입자와 표적 DNA의 샌드위치-포획에 의한, DNA-개질된 DIP 나노탐침을 이용한 SERS-기반 초고감도 DNA 검출 어세이의 개략도이다. (B 및 C)는 상이한 링커 DNA를 이용하여 형성된 표적-DNA-특이적 샌드위치 혼성화 복합체(표적-포획된 DIP 탐침-MMP 복합체)의 SEM 이미지이다[(B) 상보적 서열 DNA(HAV); (C) 비상보적 서열 DNA(HBV)]. 삽입도는 DNA 샌드위치 혼성화 후 외부 자기장 하에서 어세이 용액의 색상을 나타낸다. 스케일바는 500 nm이다. (D)는 DNA-개질된 DIP를 이용한 SERS-기반 DNA 검출 어세이 결과이다. HAV(10 aM 내지 1 pM) 및 HBV(1 pM)의 상이한 DNA 농도에서 1,003 cm-1에서 SERS 세기를 측정하였다. 삽입도는 표적 DNA의 농도에 따른 SERS 스펙트럼의 변화를 나타낸다. 모든 스펙트럼은 2 mW 레이저 출력의 785 nm 여기 레이저를 이용하여 5초의 수집 시간으로 획득하였다. SERS 세기를 획득하고, 각 농도에서 5회 측정을 연속적으로 축적하여 평균하였다.
도 14는 펩타이드-기능화된 DIP를 이용한 SERS-기반 인테그린 ανβ3-특이적 세포 이미징을 나타낸 도이다. (A)는 cRGD--개질된 DIP 나노탐침을 이용한 SERS-기반 표적-특이적 세포 이미징의 개략도이다. (B 및 C)는 각각 cRGD-기능화된 DIP와 인큐베이션한 U87MG 세포(고도의 인테그린 ανβ3 발현) 및 MCF-7 세포(인테그린 ανβ3 음성)의 (좌측) 명시야 현미경 이미지 및 (우측) SERS 맵을 나타낸다. 스케일바는 10 μm이다. 각 맵핑 픽셀(2 μm×2 μm)에서 SERS 세기를 도 14D의 음영으로 표시된 983 cm-1로부터 1,023 cm-1까지의 범위의 SERS 스펙트럼에 대해 통합하고, 세포 이미징을 위해 색상-스케일화하였다(color-scaled). 모든 스펙트럼은 4 mW 레이저 출력의 785 nm 여기 레이저를 이용하여 1초의 수집 시간으로 획득하였다. (D)는 도 14B 및 도 14C의 숫자로 표시된 위치로부터 얻어진 SERS 스펙트럼이다. (E)는 도 14B의 빨간색 박스 내에서 측정된 세포 내의 cRGD-기능화된 DIP의 시간-의존적 라만 프로파일이다. (F 및 G)는 각각 cRGD-기능화된 DIP 및 cRGD-기능화된 AuNP(평균 입자 직경 80 nm)와 인큐베이션한 U87MG의 SERS 맵이다. 스케일바는 10 μm이다. 각 맵핑 픽셀(2 μm×2 μm)에서 SERS 세기를 도 14D의 음영으로 표시된 983 cm-1로부터 1,023 cm-1까지의 범위의 SERS 스펙트럼에 대해 통합하고, 세포 이미징을 위해 색상-스케일화하였다. 모든 스펙트럼은 400 μW 레이저 출력의 633 nm 여기 레이저를 이용하여 1초의 수집 시간으로 획득하였다.
도 15는 cRGD-기능화된 상이한 이미징 탐침과 인큐베이션한 U87MG 세포의 SERS 맵을 나타낸 도이다. (A)는 DIP, (B)는 AuNP(평균 직경 80 nm)에 대한 결과이다. 스케일바는 10 μm이다. 각 맵핑 픽셀(2 μm×2 μm)에서 SERS 세기를 도 14D의 음영으로 표시된 983 cm-1로부터 1,023 cm-1까지의 범위의 SERS 스펙트럼에 대해 통합하고, 세포 이미징을 위해 색상-스케일화하였다. 모든 스펙트럼은 400 μW 레이저 출력의 633 nm 여기 레이저를 이용하여 1초의 수집 시간으로 획득하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<시약 및 물질>
금 나노입자(AuNP, 평균 직경 40 nm) 및 자성 마이크로입자(magnetic microparticle; MMP, Dynabeads® MyOne™ Carboxylic Acid, 평균 직경 1 μm)를 각각 Ted Pella, Inc.(Redding, CA, USA) 및 Invitrogen Dynal AS(Oslo, Norway)로부터 구입하였다. HPLC-정제된 올리고뉴클레오티드는 Bioneer(Daejeon, South Korea)로부터, 카르복시메킬-PEG-티올(CM-PEG-SH, Mw 
5,000)은 Laysan Bio, Inc.(Arab, AL, USA)로부터 구입하였다. 사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)(c(RGDyK), cRGD) 펩타이드는 Peptides International, Inc.(Louisville, KY, USA)로부터 구입하였다. 염화금(III) 3수화물(gold(III) chloride trihydrate; HAuCl4 .3H2O, ≥99.9%), 질산은(silver nitrate; AgNO3, 99.9999%), 4-머캅토피리딘(4-mercaptopyridine; 4-MPy, 95%), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone; PVP, Mw 
40,000), 수산화암모늄 용액(ammonium hydroxide solution; NH4OH, 28.0-30.0% NH3 기초), L-아스코르브산(L-ascorbic acid; AA, ≥99.0%), 질산철(III) 9수화물(iron(III) nitrate nonahydrate; (Fe(NO3)3 .9H2O, ≥98.0%), 2-(N-몰포리노)에탄술폰산(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid; MES, ≥99.0%), 염화 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride; EDC, commercial grade), N-히드록시술폰석신이미드 나트륨염(N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt; Sulfo-NHS, ≥98%), 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA, 99.4-100.06%), DL-디티오트레이톨(DL-dithiothreitol; DTT, ≥99.0%), 트윈(Tween)®-20, 및 황산 도데실 나트륨(sodium dodecyl sulfate; SDS, ≥98.5%)은 모두 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 트리스[히드록시메틸]아미노메탄(Tris[hydroxymethyl]aminomethane; Tris, 99.8-100.1%)은 USB Corporation(Cleveland, OH, USA)으로부터 구입하였다. 에탄올(무수물, 99.9%) 및 염화나트륨(sodium chloride; NaCl, ≥99.0%)은 DAEJUNG Chemicals & Metals Co.(Siheung, Gyeonggi, Korea)로부터 구입하였다. 모든 화학 시약은 수령하는 대로 추가적인 정제 없이 사용하였다. 전 실험에 걸쳐 NANOpure water(Millipore, Milli-Q 18.2 MΩ.cm)를 사용하였다.
제조예 1: 4-MPy-개질된 Au 나노입자의 제조
금 나노입자(AuNP) 상에 라만 리포터 분자로서 4-머캅토피리딘(4-MPy)을 부착하기 위하여, 10 μL의 4-MPy 에탄올 용액(1 mM)을 1 mL의 AuNP(평균 직경 40 nm) 용액(100 pM)에 주입하였다. 상기 혼합물을 2시간에 걸쳐 교반한(shaken) 후, 형성된 4-MPy-개질된 AuNP(MPy-AuNP)를 6,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 증류수로 세척하고, 이후 사용을 위하여 증류수에 재분산시켰다.
제조예 2: Au/Au-Ag 코어/합금 쉘 나노입자의 합성
공지의 방법을 다소 변형하여 Au/Au-Ag 코어/합금 쉘(core/alloy shell NP; CAS NP)을 합성하였다(Nanoscale, 2016, 8: 11707-11717). 구체적으로, 200 μL의 MPy-AuNP 용액(100 pM)과 200 μL의 폴리비닐피롤리돈(PVP, Mw
40,000) 용액(1중량%) 가볍게(gently) 혼합하였다. 이후 상기 혼합물에 50 μL의 AgNO3 용액(1 mM), 16 μL의 NH4OH 용액 및 150 μL의 HAuCl4 용액(1 mM)을 차례로 첨가하였다. 이후, 가볍게 교반하면서 200 μL의 L-아스코르브산(AA) 용액(20 mM)을 상기 혼합물에 즉시 주입하였다. 최종 수득한 혼합물을 실온에서 1시간 동안 가볍게 교반하였다. 최종적으로, 상기 용액을 6,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 증류수로 2회 세척하고, 증류수에 재분산시켰다.
비교예 1: 무간극(gap-less) Au/Au 코어/쉘 나노입자의 합성
무간극 Au/Au 코어/쉘 NP(gap-less AuNP)를 합성하기 위하여, 상기 제조예 2의 CAS NP 합성 방법을 변형하여 수행하였다. 구체적으로, 합성 과정 동안 50 μL의 AgNO3 용액(1 mM)과 150 μL의 HAuCl4 용액(1 mM) 대신에 200 μL의 HAuCl4 용액(1 mM)을 첨가하였다. 나머지 과정은 상기 제조예 2의 CAS NP 합성 방법과 동일하게 수행하였다.
실시예 1: Au-Ag 탈합금화된 내부(intra)-나노갭 입자의 합성
상기 제조예 2에 따라 준비된 CAS NP에 Ag 부식제(etchant)로서 Fe(NO3)3을 주입하여 Au-Ag 탈합금화된(dealloyed) 내부-나노갭 NP(DIP)를 합성하였다. 구체적으로, 100 μL의 CAS NP 용액(100 pM)을 100 μL의 PVP 용액(1중량%)과 혼합하였다. 이후, 가볍게 교반하면서 125 μL의 Fe(NO3)3 용액(20 mM)을 상기 혼합물에 주입하였다. 상기 수득한 혼합물을 실온에서 30분 동안 부드럽게 교반한 후, 6,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 증류수로 2회 세척하고, 증류수에 재분산시켰다.
실험예 1: 마이크로-라만 분광법
용액-상태 라만 분석을 위하여, 합성된 그대로의(as-synthesized) NP 용액(100 pM)을 모세관 튜브(soda lime glass; CAT. NO: 2502, Kimble Chase, Vineland, NJ, USA)에 로딩하였다. 모든 라만 측정은 514 nm(5 mW), 633 nm(4 mW), 및 785 nm(4 mW) 여기 레이저, 20× 대물렌즈(NA = 0.40, Leica), 및 표준 전하결합소자(charge-coupled device; CCD) 어레이 검출기(576×384 픽셀; Peltier; -70℃까지 냉각)를 구비한 Renishaw inVia 현미경을 사용하여 수행하였다. 표면증강라만산란(surface-enhanced Raman scattering; SERS) 스펙트럼은 10초의 획득시간(acquisition period)을 사용하여 취득하고, 800-1,800 cm-1 파수에서 기록하였다.
실험예 2: AFM-상관(correlated) 라만 분광법
개별 NP로부터 SERS 스펙트럼을 얻기 위하여, 도립 광학 현미경(inverted optical microscope, IX 73, Olympus)을 구비한 AFM-상관 라만 현미경(Ntegra, NT-MDT)을 사용하였다. AFM 팁의 끝과 레이저 초점을 정확하게 매치시키기 위하여, 이전의 연구들을 기초로하여 AFM-기반 다단계(multistep) 팁-매칭 과정을 수행하였다. 먼저, 레이저빔을 입자가 로딩된 커버글래스 슬립(폴리-L-라이신 코팅된 커버글래스)의 상부 표면에 집중시키고(focused), 비디오 카메라를 사용하여 마이크로미터-수준의 정확도로 관찰하여 AFM 팁의 끝을 레이저 초점 상에 위치시켰다. 다음으로, x-축 및 y-축을 따라 팁을 스캔하면서 레일리 산란(Rayleigh scattering) 이미지를 기록하고, 이후 AFM 팁을 가장 높은 산란세기를 갖는 영역으로 이동시킴으로써, 팁이 레이저 초점에 위치하도록 하였다. 마지막으로, AFM 팁에서 실리콘의 라만 신호 세기(520 cm- 1)를 관찰하면서 AFM 팁의 끝을 나노미터-수준의 정확도로 이동시켰다. 가장 높은 라만 신호 세기는 AFM 팁의 끝이 정확하게 레이저 초점의 중심에 위치할 때 얻어졌다. 이러한 팁-매칭 상태에서, 압전적 x, y 시료 스캐너를 사용하여 레일리 산란 이미지 및 AFM 지형적(topographical) 이미지를 동시에 획득하였다. CCD 검출기(1024×256 픽셀; Peltier; -70℃까지 냉각, Andor) 및 a 633 nm 여기 레이저(He-Ne laser, Thorlabs)를 사용하여 개별 NP의 SERS 스펙트럼을 얻었다. 노출시간은 20초였으며, 레이저 파워는 60 μW였다. 오일 침지형(oil-immersed) 현미경 대물렌즈(100×, NA = 1.4, Olympus)를 사용하여 레이저빔을 회절 한계점(diffraction-limited spot, 633 nm 레이저 사용시 약 250 nm)에 집중시켰다.
실험예 3: 이론적 계산
미 이론(Mie theory)으로 NP의 흡광 스펙트럼(extinction spectrum)을 계산하였다. Au 및 Au-Ag 합금의 유전 함수(dielectric functions)에 대한 분석적 모델을 사용하였다. 상기 입자들은 물(ε = 1.332) 속에 박힌(embedded) 것으로 간주하였다. 합성된 그대로의 NP의 평균 입자 크기, 내부-나노갭 크기, 쉘 두께 및 원자 조성(atomic compositions)을 도 1 및 표 1에 나타내었다. DIP의 내부-나노갭 영역의 효과적인 유전 함수를 위해 스미스법(Smith's method)을 사용하였으며, 내부-나노갭 영역은 금과 물의 혼합물로서 모델링하였다. 금속-과잉(metal-rich) 혼합물에 대해, 내부 나노갭 내의 평균 단위(average unit)는 금속 구형 쉘로 둘러싸인 구형 유전체 내포물(inclusion)로 간주되었다. 효과적인 유전 함수는 단위 구조물(unit structure)의 동종 유효 매질(homogeneous effective medium)로의 치환 하에서 전기장을 변화시키지 않는 값이다. 이러한 모델은 주로 금속-과잉 혼합물을 표적으로 하지만, 금속 부분이 서로 연결되어 종합적인 거동이 전도성인, 유전체-과잉 혼합물에도 적용될 수 있다. 본 발명의 구조물은 내부-나노갭 내부의 혼합물이 얇은 쉘의 형태이고, 금속성 코어와 쉘 사이에 압착되어 있으며 각각의 내포물은 전도성일 수 있다.
| Au (원자%)† |
Ag (원자%)† |
|
| 합성시 첨가되는 금속 전구체의 양‡ | 75.0 | 25.0 |
| CAS NP | 77.2 | 22.8 |
| DIP | 91.4 | 8.6 |
| 무간극(Gap-less) AuNP | 100 | 0 |
†원자조성(atomic composition was estimated by EDX elemental mapping.
‡합금쉘의 합성에 사용되는 금속 전구체의 부피 차이(Au = 150 μL, Ag = 50 μL)를 사용하였다.
실험예 4: SERS 증강 인자(enhancement factor)의 계산
SERS 증강 인자(EF)는 하기 방정식 1에 따라 계산될 수 있다:
상기 ISERS 및 IBULK는 각각 개별 DIP 및 순수 4-MPy 용액(200 mM, 22.23 mg/mL)에 대한 1,003 cm-1에서의 라만 피크 세기이며, NSERS 및 NBULK는 각각 단일 DIP 상의 4-MPy 분자의 수, 및 그리고 용액 내의 4-MPy 분자의 수이다. 단일 DIP 상의 4-MPy 분자의 수(NSERS)는, 단일분자 면적이 약 0.18 nm2인 4-MPy 분자가 최대 수로 AuNP(평균 직경 40 nm) 상에 채워지는 것을 가정하여 산출하였다. IBULK 및 NBULK를 산출하기 위하여, 12 μL의 4-MPy 용액(200 mM, 22.23 mg/mL)을 유리 기재 상에 위치한 스티커 챔버에 주입하고 대물렌즈(20×, NA = 0.4)를 통해 633 nm 레이저로 30초 동안 조사하였다. 유효 여기 부피(effective excitation volume; VBULK)가 원통형임을 가정하여 하기 방정식 2를 이용하여 높이(height; h)를 계산하였다:
상기 η는 매질의 굴절율(물에 대해 1.33)이며, r은 레이저빔의 반경(radius, 5 μm)이다. 나아가, NBULK는 하기 방정식 3에 의해 계산될 수 있다:
상기 D는 4-MPy의 밀도(22.23 mg/mL), M은 4-MPy의 분자량(molar mass, 111.16 g/mol), 및 NA는 아보가드로상수(Avogadro's constant, 6.02×1023 mol- 1)이다. 마지막으로, SERS EF를 계산하기 위한 IBULK 값을 결정하기 위하여 4-MPy 용액의 입사-레이저-출력-의존적(incident-laser-power-dependent) 라만 세기를 측정하여 도시하였다(도 2).
실험예 5: DNA-개질된 자성 마이크로입자의 제조
약간의 변형을 가하여 제조업자(Invitrogen Dynal AS)의 지시에 따라 DNA-개질된 자성 마이크로입자(DNA-modified magnetic microparticle; DNA-MMP)를 제조하였다. 구체적으로, 200 μL의 카르복실 작용기로 코팅된 MMP 용액(10 mg/mL)을 튜브에 옮기고 자성 분리기(magnetic separator)에 위치시켜 상층액을 제거하였다. 상층액을 제거한 후, MMP를 200 μL의 100 mM MES 완충액(pH 4.8)으로 2회 세척하고 20 μL의 MES 완충액에 재분산시켰다. 다음으로, 10 μL의 5'-아민-개질된 올리고뉴클레오티드(1 mM, 서열번호 1: 5'-NH2-A10-PEG6-AGAAAGAGGAGTTAA-3') 및 10 μL의 1 M EDC의 MES 완충액(100 mM, pH 4.8) 용액을 세척한 MMP에 첨가하고, 상기 혼합물을 상온에서 4시간 동안 교반하였다. 마지막으로, 상기 혼합물을 200 μL의 세척 완충액(250 mM, Tris pH 8.0, 0.01% Tween®-20)으로 3회 세척하고, 200 μL의 저장 완충액(10 mM, Tris pH 8.0, 1 mM EDTA)에 분산시켰다.
실험예 6: DNA-개질된 DIP 라만 탐침의 제조
DNA-개질된 DIP 라만 탐침(DIP 탐침)을 제조하기 위하여, Au-S 결합을 통해 티올화된 올리고뉴클레오티드를 DIP 상에 부착하였다. 먼저, 이황화(disulfide)-개질된 올리고뉴클레오티드를 실온에서 2시간 동안 100 mM DTT 용액으로 환원시키고, NAP-5 컬럼(Sephadex™ G-25 DNA Grade, GE Healthcare, UK)으로 정제하여 티올화된 올리고뉴클레오티드를 수득하였다. 이후, 신선하게 DTT-환원된 티올화된 올리고뉴클레오티드(서열번호 2: 5'-TCCATGCAACTCTAA-A10-SH-3')를 DIP 용액에 첨가하고, 부드럽게 교반하면서 실온에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 상기 용액의 최종 인산 농도는 10 mM(pH 7.4) 및 SDS 농도는 0.1%(wt/vol)가 되도록 조절하였다. 1시간 동안 인큐베이션 후, 상기 혼합물에 1시간 간격으로 2 M NaCl 용액 6 분액을 점진적으로 부가하여 0.3 M NaCl이 되도록 하였다. 이후, 상기 혼합물을 부드럽게 교반하면서 실온에서 밤새도록 유지하였다. 다음으로, 상기 혼합물을 어세이 완충액(10 mM phosphate buffer, 0.3 M NaCl, 0.01% SDS, pH 7.4)으로 6,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 3회 세척하고, DNA 검출 어세이에 사용하기 위하여 어세이 완충액에 재분산하였다.
실험예 7: SERS-기반 DNA 검출 어세이
전형적인 샌드위치-혼성화(sandwich-hybridization) 어세이를 이용하여 SERS-기반 DNA 검출 어세이를 수행하였다. 먼저, 표적 DNA(hepatitis A virus; HAV, 서열번호 3: 5'-TTAGAGTTGCATGGATTAACTCCTCTTTCT-3') 용액을 어세이 완충액(10 mM phosphate buffer, 0.3 M NaCl, 0.01% SDS, pH 7.4)으로 희석하여 10 aM로부터 1 pM 농도로 준비하였다. 또한, 탐침의 DNA 표적화 특이성을 확인하기 위하여 비상보적(non-complementary) DNA(hepatitis B virus; HBV, 서열번호 4: 5'-TTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTA-3')를 이용하였다. 다음으로, 100 μL의 희석된 표적 DNA 용액을 1 μL의 DNA-MMP 용액(10 mg/mL)과 혼합하고, 상기 혼합물을 교반하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 20 μL의 DIP 탐침 용액(100 pM)을 표적(target)-DNA-포획(capturing) MMP 용액에 첨가하고, 상기 혼합물을 교반하면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 표적-포획된(target-captured) DIP 탐침-MMP 복합체를 어세이 완충액으로 3회 세척하고, 최종 용액의 부피가 10 μL가 되도록 조절하였다. 라만 측정을 위하여, 5 μL의 상기 농축된 용액을 자석 상에 위치시킨 커버 글래스 상에 옮겼다. 적용된 자기력(magnetic force)으로 인해, 상기 복합체는 커버 글래스의 표면 상에 수집되었다. 여분의 용매는 티슈로 닦아내고, 수집된 복합체는 대기 조건 하에 건조 후 라만 측정에 사용하였다. 준비된 시료의 초점의 요철감(unevenness)에서의 변동량(variance)을 줄이기 위하여, 건조된 커버 글래스를 뒤집어 시료의 뒷면에 초점이 생기도록 하였다. 모든 라만 측정은 785 nm 여기 레이저(2 mW)를 구비한 Renishaw inVia 현미경을 사용하여 수행하였다. SERS 스펙트럼은 5초의 수집 시간으로 획득하였다. 명확한 식별(identificaion)을 위하여, SERS 세기는 5회 측정을 연속적으로 누적(consecutive accumulation)하여 획득하였다.
실험예 8: cRGD 펩타이드-개질된 DIP 이미징 탐침의 제조
SERS-기반 표적-특이적 세포 이미징을 위하여, DIP의 표면을, ανβ3 인테그린(integrin)에 대해 높은 친화성(affinity)을 갖는, cRGD 펩타이드로 기능화하였다. 페길화된(PEGlyated) DIP를 제조하기 위하여, 먼저, 0.5 mM 농도의 CM-PEG-SH(Mw 
5,000) 용액 50 μL를 0.01% SDS에 준비한 500 μL의 DIP 분산액(50 pM)에 첨가하고, 상기 혼합물을 부드럽게 교반하면서 실온에서 밤새도록 방치하였다. 상기 혼합물을 6,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 50 mM MES 완충액 용액(pH 4.8)으로 2회 세척하였다. 다음으로, DIP 상에 부착된 PEG의 카르복실산 부분을 EDC/설포-NHS 커플링 반응을 통해 cRGD 펩타이드와 결합시켰다. 구체적으로, 25 μL의 신선하게 준비한 20 mM EDC 및 설포-NHS 용액을 차례로 500 μL의 방금 준비한 페길화된 DIP(25 pM)에 첨가하고 상기 반응 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 상기 수득한 혼합물을 6,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 10 mM 인산 완충액(pH 7.4)으로 2회 세척하고, 상층액은 제거하였다. 이와 같이 농축된 용액에, 10 mM 인산 완충액(pH 7.4)에 용해시킨 cRGD 펩타이드(1 mM) 125 μL를 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 6시간 동안 교반하였다. 이후 6,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 10 mM 인산 완충액(pH 7.4)으로 2회 세척하고 이후 사용을 위하여 인산 완충 염용액(10 mM phosphate buffer, 0.15 M NaCl, pH 7.4)에 분산시켰다.
실험예 9: SERS-기반 표적-특이적 세포 이미징
인간 악성(malignant) U87MG 교종세포주(glioma cell line) 및 인간 유방암종(breast carcinoma) MCF-7 세포주를 미국 미생물자원센터(American Type Culture Collection; ATCC)로부터 입수하여, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 100 U/mL 페니실린(penicillin), 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)을 함유하는 최소필수배지(Minimum Essential Medium; MEM) 및 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 이용하여 5% CO2 하에 37℃에서 배양하였다. 상기 2종의 세포 모두를 트립신으로 떼어내어 폴리-d-라이신-코팅된(poly-d-lysine-coated) 50 mm 유리 바닥 접시(MatTek Corporation, Ashland, MA, USA) 상에 분주(5×103 cells/mL)하고, 밤새도록 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 배양한 접시를 PBS 완충액(10 mM phosphate buffer, 0.15 M NaCl, pH 7.4)으로 세척하고, cRGD-기능화된 DIP 분산된 배지(12.5 pM)로 채우고, 5% CO2 하에 37℃에서 6시간 동안 유지하였다. 인큐베이션 후, 세포 단층(monolayer)을 PBS 완충액으로 세척하고 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하였다. SERS-기반 표적-특이적 세포 이미징을 수행하기 위하여, cRGD-기능화된 DIP와 인큐베이션한 세포를 스캔하고, 각각의 맵핑 픽셀(2 μm×2 μm)에서 SERS 스펙트럼을 기록하였다. 모든 라만 측정은 785 nm(4 mW) or 633 nm(400 μW) 여기 레이저를 구비한 Renishaw inVia 현미경 시스템을 이용하여 수행하고, SERS 신호는 각 맵핑 픽셀에 대해 1초의 수집 시간 동안 기록하였다. 마지막으로, 세포 이미징을 위하여 각 맵핑 픽셀에 대해 통합된(integrated) SERS 세기(983 cm-1로부터 1,023 cm-1까지)를 색상화하였다(color-scaled).
실험예 10: 특성분석
TEM 시스템(JEM-2100, JEOL), 고해상도 TEM(HR-TEM) 시스템(JEM-2100F, JEOL), 및 전계방사(field-emission) SEM(FE-SEM) 시스템(JSM-7800F Prime, JEOL)을 이용하여 합성된 그대로의 NP 및 표적-DNA-유도 샌드위치 혼성화 복합체의 형태학적 특징을 확인하였다. 또한, HR-TEM 시스템과 결합된 EDX 시스템(INCA, Oxford Instruments)을 이용하여 NP의 원소맵과 선 스캔 프로파일을 획득하였다. 나아가, UV-Vis 분광광도계(HP 8453, Agilent Technologies)를 이용하여 UV-Vis 스펙트럼을 얻었다.
<결과>
층간(
interlayer
)-자유 내부
나노갭
(free interior
nanogap
)을 갖는 나노입자의 선택적 및 상호확산적(interdiffusive) 탈합금-기반 합성
SID 공정을 이용한 DIP 합성을 위하여, 먼저, 4-MPy-개질된 AuNP(MPy-AuNP) 상에서 HAuCl4 및 AgNO3의 동시 환원을 수반하는 공-환원 공정(co-reduction process)을 통해 Au/Au-Ag 코어/합금 쉘 나노입자(CAS NP)를 형성하였다(도 3B). 투과전자현미경(transmission electron microscopy; TEM) 이미지로부터 측정된 CAS NP의 평균 크기는 약 87.0 nm였으며(도 1), 쉘 영역의 원자 조성은 Au77 . 2Ag22 .8로 산출되었다(표 1). 흥미롭게도, 환원된 Au 및 Ag 원자는 전체 쉘 영역을 통해 균일하지 분포하지 않았다(도 3C 및 도 4A). CAS NP의 중심을 가로지르도록 수행한 에너지-분산형 X-선 분광법(energy-dispersive X-ray spectroscopy; EDX) 선 스캔은, Au 코어 근처에서 금 원자의 수는 감소하면서, 대부분의 Ag 원자가 Au 코어 근처에 위치함을 나타내었다(도 3D, 파란색 점선 박스). 일반적으로, 금 전구체의 더 높은 표준 환원 전위는 Ag 전구체의 경우와 비교하여 보다 빠른 환원을 유도한다(AuCl4 -/Au = 0.99 V 및 Ag+/Ag = 0.8 V 대 표준 수소 전극). Ag와 폴리비닐피롤리돈(PVP)의 피롤리돈 그룹 간의 강한 결합력은 초기 단계에서 Ag 전구체의 환원 속도를 증가시키며, Au 코어 근처에서 더 빠른 속도로 Ag 원자의 축적을 유도한다. 이러한 현상을 보다 구체적으로 확인하기 위하여, 합금 쉘 형성 과정 동안 CAS NP의 흡수 피크의 변화를 모니터하였다(도 5). 상기 합금 쉘 형성 과정 초기에는 흡광 피크가 빠르게 단파장으로 이동(blue shift)하였으며, 이는 Ag 층이 형성됨을 나타내는 것이다. 이후 반응이 진행됨에 따라, 흡수 피크는 점차적으로 장파장 이동하였으며, 피크의 세기는 증가하였다. 이는 보다 큰 CAS NP의 형성을 나타내는 것이다.
다음으로, CAS NP에 질산철(Fe(NO3)3)을 투입하여 Ag 원자를 선택적으로 용해시켰다(도 3A). 도 3E에 나타난 바와 같이 Ag-부식된(etched) CAS NP는 탈합금화 공정을 통해 코어와 쉘 사이에 존재하는 나노갭을 가짐을 확인하였다. DIP의 평균 크기(~87.2 nm)는 CAS NP의 크기와 유사하였으며, 이에 포함된 내부 나노갭 및 쉘 크기는 각각 약 2.1 nm 및 20.1 nm였다(도 3K). DIP의 EDX 원소 맵은 Au 코어 주위의 Ag 원자는 거의 완전히 부식되었음을 나타내었으며(도 3F 및 도 4B), EDX 선 스캔 프로파일은 Au 코어 주위의 Ag 원자의 수가 탈합금화 반응 이후 급격히 감소됨을 나타내었다(도 3G, 파란색 점선 상자). 쉘 영역에서 Ag 원자의 비율은CAS NP에서에 비해 더 낮았다(표 1). 나아가, Ag-Lα 피크가 사라졌을 때, Au 코어 주위 영역의 Au-Lα 곡선은 계곡형으로 나타났으며(도 3G, 파란색 점선 상자), 이는 Au 코어 주위의 Ag 원자의 선택적 제거에 의해 내부 나노갭이 형성되었음을 나타낸다. DIP의 경우와 달리, 내부 나노갭은, 쉘이 Au-Ag 합금이 아닌 Au만으로 구성되는, 무간극(gap-less) Au/Au 코어/쉘 NP(gap-less AuNP)의 경우에는 관찰되지 않았다(도 3H). 무간극 AuNP의 평균 크기는 CAS NP와 유사하였으며(도 1), 쉘은 모두 Au 원자로 구성되었다(도 3I, 도 4C 및 표 1). 또한, 계곡 형태의 Au-Lα 플롯은 관찰되지 않았으며(도 3J, 파란색 점선 상자), 이는 NP가 나노갭이 없는 구조를 가짐을 나타내는 것이다. Fe(NO3)3을 합성된 그대로의 무간극 AuNP에 첨가하였을 때, NP의 형태 또는 UV-Vis 및 SERS 스펙트럼의 어떠한 변화도 나타나지 않았으며, 이는 질산은-기반 탈합금화 반응이 Ag만을 용해시킴을 나타내는 것이다(도 64). 이러한 합성 전략에 의해 약 95% 수율로 DIP를 생산하였다(도 3L). DIP의 인접한 격자 둘레(adjacent lattice fringes)의 d-공간(d-spacing)은 0.235 nm이며, 그 선택된-영역의 전자 회절(selected-area electron diffraction; SAED)은 고리형이었고, 전자는 면심입방구조(face-centered cubic)의 (111) 평면에 상응하는 반면, 후자는 다결정성을 나타내었다(도 3M).
내부 나노갭의 발달(evolution)을 확인하기 위하여, Fe(NO3)3 첨가량을 증가시키면서, 탈합금화 반응을 통한 CAS NP로부터 DIP로의 전환에 따른 구조적 변화를 모니터하였다(도 7). 내부-나노갭 구조의 형성을 설명하기 위하여 제안된 기전을 도 3A에 나타내었다(검은색 점선 박스 참조). CAS NP에 Fe(NO3)3 용액을 투입하였을 때, 쉘 표면 근처의 Ag 원자들은 Fe(NO3)3에 의해 용해되기 시작하였으며(제안된 기전을 나타내는 개략도 중의 회색 선), Fe(NO3)3는 Ag-부식된 자리를 통해 CAS NP 내로 침투하였다. 탈합금화 반응이 진행함에 따라, 핀홀형(pinhole-like) 공석(vacancies)(제안된 기전에서 검은색 점선의 열린 원)이 Ag-부식된 자리에서 발생하여 내부로 확산되고(제안된 기전의 파란색 실선), 금속 원자(주로 Ag 원자)는 나노미터-규모의 커켄달 효과(Kirkendall effect)에 의해 외부로 확산(diffuse outward)되었다. Au-Ag 합금 시스템의 경우 Au 내에서 Ag의 확산은 Ag 내에서 Au의 확산보다 더 빠르므로, 금속(Au 및 Ag)의 알짜 흐름(net flux)은 주로 Ag의 확산 속도에 의존한다. 이는 쉘 표면으로부터 Au 코어로의 공석의 알짜 흐름으로 나타났다. 따라서, 확산된 Ag 원자는 Fe(NO3)3에 의해 지속적으로 제거되었다(제안된 기전의 회색 점선). 한편, Au 원자는 표면 에너지를 최소화하기 위하여 보다 적은 정도로 확산되며 서로 연결(interconnect)되었다. 상기 반응이 지속됨에 따라, 금 코어 근처에 축적된 공석은 궁극적으로 나노갭을 형성하였으며, 서로 연결된 Au 원자들은 조밀한 쉘을 형성하였다. 제안된 기전과 유사하게, 사용된 Fe(NO3)3 양이 적을 때(5 mM), Ag 원자는 부분적으로 부식되며 불완전한 내부 나노갭을 형성하였다. 그러나, 다량의 Fe(NO3)3 사용시(>15 mM), 용해된 Ag 원자의 수는 더 많으며(10 mM), 내부 나노갭은 균일하게 형성되었다(도 7).
나노갭의 존재시(DIP) 또는 부재시(CAS NP 및 무간극 AuNP)의 구조 사이의 형태적 차이로 인해, 이들 구조물의 UV-Vis 스펙트럼 역시 상이하였다(도 8). 나아가, 도 8A에 나타난 바와 같이, 쉘 구조의 형성에 의해 입자 용액의 색상이 분홍색(MPy-AuNP)으로부터 진한 분홍색(CAS NP), 더 나아가 청-보라(blue-violet)(DIP)까지, 최종적으로 적-보라(red-violet)(무간극 AuNP)까지 변화하였다. 또한, 쉘 구조를 갖는 NP의 흡수 피크는 쉘이 없는 NP에 비해 장파장으로 이동하였다(MPy-AuNP, CAS NP, DIP, 및 무간극 AuNP에 대해 각각 λ= 528, 549, 554, 및 571 nm). 그러나, 내부 나노갭을 갖는 NP(DIP)의 경우 ~700 nm에서 새로운 흡수 숄더 피크가 관찰되었다. DIP로부터의 상기 플라즈몬성 피크의 기원을 밝히고, 나노갭 영역의 광학적 성질을 연구하기 위하여, 미 이론에 기초한 컴퓨터 시뮬레이션을 수행하였다. 해당 모델에서, 금속 잔여물(residues)은 내부-나노갭 영역에 존재하고 임의로 분포되며, 부분적으로 코어와 쉘을 상호연결한다. 내부-나노갭 영역은 금속 잔여물과 물의 혼합물로 모델링되었으며, 갭 영역의 유효 유전 함수(effective dielectric function)는, 낮은 금속 부피 분율(metallic volume fraction)의 혼합물의 금속성 거동을 묘사하는, 스미스 접근법(Smith's approach)으로 계산하였다. 물로 채워진 내부 갭이 NP의 내부에 형성되었을 때, 새로운 흡수 피크가 장파장(~950 nm)에서 나타났다(도 9). 그러나, 내부-나노갭 영역이 금속 잔여물과 물의 혼합물로 채워졌을 때, 공명 피크는 나노갭의 광학적/물리적 상태(예컨대, 유효 유전 함수)의 변화에 의해 장파장으로부터 단파장 이동되었다. 또한, 공명 피크는 나노갭의 금속 성분이 감소함에 따라 계속적으로 장파장 이동되었다(도 8B). 이러한 경향은 탈합금화 반응의 정도 차이에 따른 DIP의 UV-Vis 스펙트럼에서의 변화와도 일치하였다(도 7). 용액에서 각 DIP에 대한 부식 정도가 다소 상이하므로, 실험결과로부터 넓어진 숄더 피크는 나노갭 내에 상이한 금속 조성을 갖는 DIP들의 UV-Vis 스펙트럼의 중첩으로 설명될 수 있다. 도 8C는 나노갭 내에 12.5몰%의 금속 잔여물을 포함하는 DIP의 계산된 근접장 전자기장(EM field) 분포를 나타낸다. 물이 채워진 내부 나노갭을 갖는 DIP와 달리(도 8D), 금속 잔여물이 채워진 나노갭을 갖는 DIP는 고도로 증강된 전자기장을 형성하였으며, 이는 내부 나노갭 내의 상기 금속 잔여물이 전자기장 증강에 중요한 역할을 함을 나타내는 것이다.
용액 중의 DIP의 SERS 분석
다음으로, 합성된 그대로의 NP로부터 획득한 용액-상태 SERS 신호를 1,097 cm-1에서의 핑거프린트 피크에 대해 비교하였다(도 10A). 쉘이 없는(shell-less) Au NP(MPy-AuNP)의 SERS 신호 세기와 비교하여, CAS NP, 무간극 AuNP, 및 DIP의 신호 세기는 각각 ~8.6배, 7.7배, 및 50배 더 높았다. 이 경우, 라만 리포터 분자(4-MPy)는 내부-나노갭 영역에 위치되었다. 나노갭이 없는(nanogap-less) NP들은 모두(CAS NP 및 무간극 AuNP) 유사한 SERS 신호 증가를 나타내었다. 따라서, 이는 내부 나노갭이 현저히 증강된 SERS 신호를 보장하며, 금속 상의 조성은 SERS 현상에 단지 작은 효과만을 가짐을 나타내는 것이다. SERS 증강에 대한 내부 나노갭의 역할을 추가적으로 확인하기 위하여, Au 코어 표면 대신에 최외각 쉘 표면 상에 라만 리포터 분자(4-MPy)를 위치시켰다(도 10B). 내부 나노갭의 존재 여부와 무관하게, 모든 유사한 크기의 NP(CAS NP, 무간극 AuNP, 및 DIP)는 모두 유사한, 매우 약한, SERS 신호를 나타내었다. 이러한 결과는 유의적으로 강해진 SERS 증강은 내부 나노갭 내에서 전자기장의 증강에 주로 기인함을 나타낸다.
내부 나노갭 내의 고도로 증강된 전자기장 및 균일하게 제한된(confined) 핫 스팟으로 인해, 매우 낮은 농도(500 fM)에서도 DIP 용액의 SERS 신호가 검출될 수 있었으며, NP 농도와 SERS 신호 세기는 고도의 선형적 상관관계(R2 = 0.99)를 나타내었다(도 10C). 또한, 연속적인 레이저 노출 하에 수행되는 시간에 따른 측정 동안에도 안정적인 SERS 신호를 획득할 수 있었다(도 10D). 이러한 실험적 결과는 고도의 SERS-활성적인(active) 좁은 내부 나노갭 내에 라만 분자들을 안정적으로 보유함으로써 DIP가 견고하며 지속가능한 SERS 신호를 발생시킴을 나타낸다. 높은 감도로 균일하고 정량적으로 재현가능한 SERS 신호를 생산하는, DIP의 이러한 성질은 바이오센싱/이미징으로의 이용을 가능케할 수 있다. 나아가, DIP는 785 nm의 파장에서의 여기 하에 높은 반응성을 나타내며(도 11), 이는 광열 치료 탐침(photothermal therapeutic probes)은 물론 생체 내/외(in/ex vivo) 및 시험관 내(in vitro) SERS 이미징에 적합할 수 있다. 반면, DIP는 514 nm 파장에서의 여기 하에서는 검출가능한 신호를 제공하지 않았다(도 11). SERS 효과의 근접장 증강은 공명 피크 근처에서의 플라즈몬성 여기 모드에 의해 결정되므로, 내부 나노갭의 플라즈몬성 여기 모드에 의해 유도되는 근접장 공명 피크에 상응하는 파장과는 상당히 다른 파장을 갖는 514 nm 레이저는 내부-나노갭 영역에서 충분히 강한 전자기장을 형성할 수 없었다.
DIP 상에서의 단일-입자-수준
SERS
분석
DIP의 광학적 성질을 보다 구체적으로 연구하기 위하여, 원자력현미경-상관 나노-라만 기기를 이용한 단일-입자-수준에서 DIP의 SERS 스펙트럼 분석을 수행하였다(도 12A). 개별 DIP의 SERS 스펙트럼을 획득하기 위하여, 먼저 AFM 팁의 끝을 대물렌즈의 초점과 정확히 일치시켰다. 이후, 동일한 입자로부터 AFM 형태 이미지와 레일리 산란 이미지를 동시에 획득하였다(도 12B). 대표적인 탭핑-모드 AFM 이미지(10×10 μm2)는 개별 DIP가 잘 분산되었으며 레이저 노출 초점(~250 nm) 내에 중첩되지 않음을 나타내었다. 뿐만 아니라, 고배율 AFM 이미지는 DIP의 구형임을 입증하였으며, 이들의 높이 프로파일은 TEM 이미지로부터 결정된 전체 크기와 잘 일치하였다(도 12C). 110개 개별 DIP의 SERS 스펙트럼을 측정하고 1,003 cm-1에서의 핑거프린트 피크에 대한 증강인자(enhancement factor; EF) 값을 계산하였다.
도 12D는 개별 DIP에 대한 EF 값의 분포 다이어그램을 나타낸다(110개 입자를 측정). 개별 NP는 검출가능한 높은 세기의 SERS 신호를 나타내었으며, DIP의 EF 값은 1.1×108 내지 2.5×109 범위에 90.0%가 위치하는 좁은 분포를 나타내었다. 나아가, 1.1×108 내지 5.3×109 범위에는 97.3%가 위치하였다. 또한, EF 값은 몇몇 경우 2.1×1010 의 높은 값을 나타내었다. 전반적으로, 모든 입자는 ≥1.1×108의 EFs를 나타내었다. 좁은 분포의 EF 값은 균일하게 제한된 내부 나노갭 및 고수율로 표적한 구조를 높은 정확성으로 합성하는 방법에 의한다. 따라서, 나노갭을 갖는 이러한 구조물은 재현가능하며 신뢰할만한 SERS 탐침으로의 사용을 고려할 수 있다. DIP의 EF 값은 최대 수의 4-MPy가 AuNP 코어 표면 상에 균일하게 패킹되었다는 가정하에 보수적으로 과소평가되었다. 또한, 본 발명에서는 작은 단면적(cross-section)의 비-공명(non-resonant) 라만 염료(4-MPy)를 사용하였다. DIP의 EF 값은 동일한 라만 염료 분자(4-MPy)에 대해 이전에 보고된 다른 나노구조물에 비해 102 내지 103배 더 높았다. 106 내지 108의 EF는 단일-분자 검출에 충분한 것으로 허용된다. 이러한 점에서, 높은 민감성으로 강한 SERS 신호를 생성하는 합성된 그대로의 DIP는 다양한 분석적 응용에서 SERS 탐침으로 사용될 수 있다. 단일-입자 수준에서 DIP의 입사-레이저-분극화-의존적 SERS 특성을 연구하였다(도 12E). 비등방성(anisotropic) 또는 조립된(assembled) 나노구조물의 경우, 광학적 성질은 기하학적 배열(geometric configuration) 및 레이저 분극화 방향(laser polarization direction)에 의존한다. 반면, DIP는, 내부 나노갭 내에 대칭적으로 분포된 핫 스팟으로 인해, 입사 레이저의 분극화 방향과 무관하게 안정적이며 균일한 SERS 신호를 나타내었다. 이러한 분극화-독립적 성질은 DIP를 고도로 신뢰할만한, 정량적 분석용 탐침으로의 사용에 적합하게 한다. Au 코어와 Au 쉘을 연결하는 나노다리(nanobridges)를 갖는 Au-NNP의 합성 초기단계에서, 흡수 스펙트럼은, DNA-개질된 Au 코어 상의 비등방적으로 분지된 버딩 구조에 의해 야기되는, ~680 nm에서 새로운 플라즈몬성 공명 피크를 나타내었다. 반면, 새로운 흡수 피크는 CAS NP의 합성과정 동안은 관찰되지 않았다(도 5). 이는 제안된 공-환원 합성 과정에 의해 금과 은 원자의 혼합물로 채워진 쉘 구조가 형성되며 Au 분지된 버딩 구조물과 같은 상대적으로 큰 구조는 형성되지 않음을 나타낸다. 또한, 이는, Au-NNP와 달리, DIP의 내부 나노갭이, 내부 나노갭 내에서 대칭적으로 분포된 전자기장을 형성하는, 임의로 분포된 금속 잔여물로 구성됨을 나타낸다(도 12F 및 12G).
DIP를 이용한 DNA
어세이
SERS 센싱 바이오탐침으로서 DIP의 사용 가능성을 시험하기 위하여, NP를 이용한 SERS-기반 초고감도(ultrasensitive) DNA 검출 어세이를 수행하였다. 표적 DNA의 효율적인 포획 및 분리를 위하여, DNA-개질된 자성 마이크로입자(DNA-MMP) 및 DIP 라만 탐침(DIP 탐침)을 이용하여, 전형적인 샌드위치-혼성화 어세이에 기초하여 표적 DNA 가닥(hepatitis A virus DNA; HAV DNA)을 검출하였다(도 13A). 샌드위치-혼성화 복합체(표적-포획된 DIP 탐침-MMP 복합체)의 형성 및 이의 표적-DNA-특이적 혼성화를 수행하는 능력을 확인하기 위하여, 상보적(complementary, HAV) 및 비상보적(non-complementary, HBV) DNA 서열을 이용한 혼성화 어세이를 수행하였다(도 13B 및 13C). 상보적 DNA 존재시, 상기 용액은 이에 적용되는 외부 자기장에 의해 무색으로 변하였으며, 이는 샌드위치 혼성화 복합체가 형성되었음을 나타낸다(도 13B 삽입도). 그러나, 비상보적 DNA 존재시, 용액은 자석을 이용하여 MMP를 회수한 이후에도 색상을 유지하였으며, 이는 DIP 탐침이 DNA-MMP에 의해 포획되지 않았음을 나타낸다(도 13C 삽입도). 또한, 샌드위치 혼성화 복합체의 형성은 SEM 이미지상에서도 명확히 나타났다(도 13B 및 13C). 이러한 결과는 DIP를 이용하는 제안된 DNA 검출 방법이 DNA 검출 어세이에 사용되기 적합함을 나타낸다. 도 13D는 표적 DNA(HAV) 용액의 농도 변화에 따라(10 aM로부터 1 pM까지, 검은색 사각형) 1,003 cm-1에서의 SERS 세기의 변화를 나타내었다. SERS 세기는 넓은 범위에 걸쳐 표적 DNA의 농도가 감소함에 따라 정량적으로 감소하였다. 반면, 표적 DNA를 비상보적 DNA(HBV) 가닥으로 대체한 대조 실험 동안(1 pM, 빨간색 원형 도트) SERS 신호의 세기는 매우 낮았다. 검출 한계(limit of detection; LOD)는 약 10 내지 100 aM로, 다른 나노구조물 및 방법을 이용한 DNA 검출 결과에 비해 약 10 내지 1000배 더 민감하였다. 합성 수율, 구조적 정확성, SERS EF 분포 및 SERS 신호 안정성 및 재현성의 관점에서, DIP는 다른 SERS 구조물에 비해 우수한 결과를 나타내므로 고감도 및 정량적 DNA 검출이 가능하였다. 이러한 결과는 SID 과정에 의해 제조된 플라즈몬성 DIP가 표적-선택적, 초고감도 및 정량적 분석용 SERS 탐침으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
DIP를 이용한
표적화된
세포
이미징
마지막으로, 표면-기능화된 DIP를 이용한 SERS-기반 표적-특이적 세포 이미징을 수행하였다(도 14A). DIP의 인테그린-표적화 특이성을 확인하기 위하여, ανβ3 인테그린(전이성 및 내피 종양 세포에서 과발현됨)에 특이적으로 결합하는 사이클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)(c(RGDyK); 이하 cRGD로 표시) 펩타이드를 DIP의 표면에 부착하였다. 이어서, cRGD-기능화된 DIP를 상이한 세포주, 예컨대, U87MG(높은 인테그린 ανβ3 발현) 및 MCF-7 (인테그린 ανβ3 음성)에 도입하였다. U87MG 세포에서 인테그린 ανβ3의 높은 발현 및 이의 cRGD 펩타이드에 대한 우선적 결합력으로 인해, 강한 SERS 신호가 인테그린-ανβ3-양성 U87MG 세포에서 관찰되었으며, 이는 cRGD-기능화된 DIP의 표적-특이적 결합 및 SERS 이미징 능력을 나타내는 것이다(도 14B 및 14D). 반면, 인테그린-ανβ3-음성 MCF-7 세포에서 SERS 신호는 거의 검출되지 않았으며, 이는 SERS-기반 세포 이미징에 대한 cRGD-기능화된 DIP의 우수한 표적 선택성을 나타내는 것이다(도 14C 및 14D). cRGD-기능화된 DIP는, 장시간 레이저에 지속적으로 노출되었을 때, 균일한 SERS 신호를 지속적을 발생시켰다(도 14E). DIP는 세포 이미징에 대해 유사한 크기의 AuNP에 비해 보다 신뢰할만하며 강한 SERS 신호를 발생시켰다(도 14F, 도 14G 및 도 15). 이는 DIP를 이용하여, 세포 및 조직 손상의 최소화 및 장기간의 안정적인 세포 이미징에 필수적인, 저출력 레이저(400 μW) 및 짧은 노출 시간(각 픽셀 당 1초)으로 SERS-기반 세포 이미징을 수행할 수 있음을 나타내는 것이다.
<결론>
고수율(~95%)로 균일하게 제한된 내부 나노갭을 포함하는 고도의 SERS-활성적 Au-Ag NP(DIP)를 형성하기 위한 선택적이며, 상호확산적인(interdiffusive) 탈합금화-기반의 용이한 합성 전략을 개발하였다. 이러한 방법은 DNA, 고분자 또는 실리카 쉘과 같은 조절용 층간 물질(modulating interlayer materials)을 사용하지 않고 층간 자유 내부 나노갭 입자를 제조하는 매우 간단하며, 저렴하고 효율적이다. Au-Ag 합금 쉘로부터의 선택적 Ag-부식 및 Ag 원자의 상호-확산(SID 고정)에 의해 약 2 nm 크기의 작은 내부 나노갭이 형성됨을 확인하였다. 금속 잔여물은 갭의 내부에 임의로 분포되었다. 내부 나노갭을 갖는 NP은, 코어와 쉘 사이의 강한 플라즈몬 커플링에 의해 내부 나노갭에 발생하는 강한 전자기장으로 인해, 비슷한 크기의 쉘이 없거나 나노갭이 없는 NP에 비해, 고도로 증강된 SERS 신호를 나타내었다. 나아가, DIP는 강하고 안정하며 정량적으로 재현가능한 SERS 신호를 방출하며, 1.1×108 내지 5.3×109 범위에 97.3% 입자가 존재하는 고도로 증강되고 좁게 분포된 EF를 나타내었다. 유의적으로, 모든 분석된 입자는 ≥1.1×108의 EF를 나타내었다. DNA-개질된 DIP로부터의 SERS 신호로 명확히 식별할 수 있는 10 aM 내지 1 pM 표적 농도를 검출하기 위한 DIP를 이용하는 초고감도 DNA 검출 어세이를 개발하였다. 또한, cRGD-기능화된 DIP가 효과적으로 인테그린-과발현된 세포를 표적하고, 장기간 동안 레이저에 노출시 지속적으로 균일한 SERS 신호를 발생시킬 수 있음을 확인하였다. DIP는 저출력 레이저(400 μW) 및 짧은 노출 시간(각 픽셀에 대해 1초)으로 SERS 세포 이미징을 가능하게 하며, 이에 따라 세포 및 조직 손상을 최소화하고 장시간 동안 안정적으로 세포를 이미징할 수 있었다(>30분). SID 공정을 이용하는 합성 전략은, 두개 나노구조물(예컨대, 코어와 쉘) 사이의 중간층을 필요로 하지 않는, 나노갭을 갖는 플라즈몬성 나노구조물 또는 강한 플라즈몬 커플링을 형성하는 새로운 방법을 제공한다. DIP는, 레이저 분극화 방향에 대한 의존성 없이 좁은 분포의 높은 EF를 갖는, 강하고, 조절가능하며 정량적인 SERS 탐침으로서의 잠재성을 나타내며, 이는 SERS 신호 재현성, 신뢰성 및 정량분석능에 대한 오랜 쟁점을 해소할 수 있다. 마지막으로, 바이오-기능화된 DIP 탐침을 이용한 DNA 검출 및 세포 이미징 결과는 높은 신뢰성을 갖는 민감하고, 선택적인 바이오센싱, 바이오이미징 및 진단치료적(theranostic) 응용에서 SERS 탐침의 사용에 대한 기회를 입증 및 제공한다.
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<213> Artificial Sequence
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<400> 3
ttagagttgc atggattaac tcctctttct 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> non-complementary DNA_HBV
<400> 4
ttggctttca gttatatgga tgatgtggta 30
Claims (12)
- 코어와 쉘 사이에, 라만활성물질이 배치된 평균 0.1 내지 10 nm 높이의 빈 공간(hollow space)을 갖는 코어-갭-쉘 나노입자의 제조방법으로서,
표면에 라만활성물질이 개질된 제1금속 코어 입자를 준비하는 제1단계;
표면 개질된 제1금속 코어 입자에 각각 제2금속 전구체, 염기 및 제3금속 전구체를 포함하는 용액 및 환원제 용액을 첨가하여 제1금속 코어 입자의 개질된 표면 상에 제2금속 및 제3금속 합금 쉘(metal alloy shell)을 형성하는 제2단계; 및
(표면에 라만활성물질이 개질된 제1금속 코어)-(제2금속 및 제3금속 합금 쉘) 나노입자를 제2금속 부식제(etchant)로 처리하여 제2금속을 선택적으로 제거하여 탈합금화하는 제3단계;를 포함하며,
상기 제1금속은 제2금속에 비해 더 높은 환원 전위를 갖는 것인, 제조방법.
- 제1항에 있어서,
제2단계 이전에 상기 표면 개질된 제1금속 코어 입자를 제3금속에 비해 제2금속과 높은 결합력을 갖는 작용기를 갖는 고분자 용액으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 제조방법.
- 제2항에 있어서,
상기 고분자 용액은 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 것인, 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2금속 및 제3금속 전구체는 40:60 내지 10:90의 원자% 비율로 사용하는 것인, 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1금속 및 제3금속은 모두 금이고, 제2금속은 은인 것인, 제조방법.
- 제5항에 있어서,
상기 제2금속 부식제는 질산철(ferric nitrate; Fe(NO3)3)인 것인, 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제3단계의 탈합금화는 쉘의 외부 표면의 제2금속 원자들이 부식제에 의해 용해되기 시작하며, 이에 따라 형성된 핀홀형의 공석(pinhole-like vacancies)이 형성되며 이를 통해 부식제가 쉘의 내부로 확산되어 내부의 제2금속을 선택적으로 제거함으로써 코어와 쉘 사이에 빈 공간 형태의 갭을 형성하는 인 것인, 제조방법.
- 표면증강라만산란(surface-enhanced Raman scattering; SERS) 신호를 나타내는, 코어와 쉘 사이에 평균 수 nm 높이의 라만활성물질이 배치된 빈 공간(hollow space)을 갖는, 코어-갭-쉘 나노입자로서,
제1금속으로 된 코어 및 제2금속 및 제3금속의 합금으로 된 쉘로부터 제2금속을 선택적으로 일부 또는 전부 제거하여 코어와 쉘 사이에 형성된 빈 공간인 갭을 포함하고,
상기 제2금속 및 제3금속의 합금으로 된 쉘은 제1금속 코어 표면으로부터 외부로 진행할수록 제3금속에 대한 제2금속의 함량이 감소하며,
최종적으로 형성된 코어-갭-쉘 나노입자는 코어와 쉘을 연결하는 제2금속, 제3금속 또는 둘 모두를 포함하는 하나 이상의 금속 브릿지를 통해 갭을 유지하는 것인 나노입자.
- 제8항에 있어서,
상기 코어-갭-쉘 나노입자는 표면에, 검출 또는 영상화 하고자 하는 대상과 특이적으로 상호작용하는 핵산, 폴리펩티드, 또는 리간드가 결합된 것인, 나노입자.
- 제8항에 있어서,
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 것인, 나노입자.
- 제8항 또는 제9항의 코어-갭-쉘 나노입자를 포함하는 바이오센싱 또는 바이오이미징용 조성물.
- 제11항에 있어서,
표면증강라만산란에 의해 검출 가능한 것인, 조성물.
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