CN107202785A - 基于比率型sers传感原理检测重金属离子的方法 - Google Patents

基于比率型sers传感原理检测重金属离子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法，该方法利用银包金纳米颗粒作为SERS基底，修饰拉曼信标分子的富T序列作为目标分子识别探针通过Au‑S键功能化修饰于SERS基底表面，修饰另一种拉曼信标分子的互补DNA序列与识别探针互补杂交形成刚性的双螺旋DNA结构用于构建比率型SERS传感平台，基于目标分子介导识别探针发生构型转变使信号发生改变，以两种信标分子的SERS信号强度的比值为定量标准，提高检测重金属离子的灵敏度。本发明所述的重金属检测方法具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、选择性强、重现性好等优点，能够实现对最低浓度为pM级重金属离子的检测。

Description

基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法
技术领域
本发明属于重金属离子检测领域，尤其是涉及一种基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法。
背景技术
表面增强拉曼光谱法(SERS)作为分析化学领域中一种重要的分析检测手段，它具有许多独特的优点，例如，检测灵敏度高、独特的分子指纹信息、拉曼光谱谱带窄、操作简单、响应快速以及无需复杂的样品预处理等。因此，SERS作为一种有效的传感平台具有潜在的应用，并且已经被成功用于DNA、小分子和蛋白质的分析检测中。SERS信号的稳定性和重现性易受 SERS基底的影响。分光光度法测定重金属离子适用于常量和半微量分析；在测定微量和痕量元素时，条件要求较严格，灵敏度较低。化学发光分析法和电化学分析法选择性较差。HPLC分析成本高。IC检测时间长，浓度范围小，浓度大无法检测。光谱法测试成本高，模型需不断变化，易受光学系统参数等外部或内部因素影响。ICP-MS技术检测成本高，主要检测微量、痕量元素。SERS基底往往局限于铜、金、银等贵金属。传统的SERS基底的物理性质，比如纳米颗粒的形状、大小、团聚程度、形状、吸附能以及SERS 信标分子在不同金属颗粒表面的分布和取向等，会影响SERS信号的稳定性和重现性。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法，以解决SERS信号的不稳定和重现性差等问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法，该方法包括如下步骤：
(1)设计识别探针和与之互补的DNA；
(2)合成金纳米颗粒；
(3)识别探针功能化修饰金纳米颗粒；
(4)合成双链DNA修饰的银包金纳米颗粒；
(5)表面拉曼光谱检测重金属离子。
进一步的，所述步骤(1)识别探针末端增加间隔序列。
进一步的，所述间隔序列为4～9个C碱基。
进一步的，步骤(2)金纳米颗粒的合成方法如下：
将50mL的0.02％～0.1％HAuCl4溶液，搅拌加热至沸，然后快速加入 0.5mL新配制的1.0％柠檬酸钠溶液，继续加热搅拌10～25min，溶液的最终颜色为酒红色，移除热源，搅拌冷却至室温，然后用0.22μm孔径的滤膜进行纯化分离后置于4℃下保存，以备待用。
进一步的，步骤(3)识别探针功能化修饰金纳米颗粒的合成方法如下：
将巯基化的识别探针通过Au-S键功能化修饰于金纳米颗粒表面，其步骤如下：取1～5.0μL的100μM的识别探针与1～5.0μL的100mM含5.0mM TCEP的Tris-HCl在室温下孵育反应0.2～1h，然后与3.0mL步骤(1)制备的金纳米颗粒溶液避光孵育反应24h后在12000rpm下离心10～25min，除去上清液，下层沉淀物重新分散于3.0mL超纯水中。
进一步的，双链DNA修饰的银包金纳米颗粒的合成方法如下：
取30～80μL的10mM的L-抗坏血酸溶液与识别探针修饰的金纳米颗粒溶液充分混合，不断搅拌下将5mM的硝酸银溶液逐滴滴加到上述溶液中，形成识别探针修饰的银包金纳米颗粒，取60～120μL的cDNA加入到识别探针修饰的银包金纳米颗粒的混合溶液中，置于80～110℃下热变性2～10 min，自然冷却至室温，12000rpm下离心10～25min。
进一步的，步骤(5)表面拉曼光谱检测重金属离子的操作步骤如下：
不同浓度的重金属离子与上述制备双链DNA修饰的银包金纳米颗粒溶液在12000rpm下离心10～25min，除去上清液，下层沉淀物重新分散于超纯水中，重复三次得到样品，用点样毛细管吸取样品，进行SERS光谱测定。
一种基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法在微量或痕量重金属离子检测中的应用。
相对于现有技术，本发明所述的基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法具有以下优势：
(1)本发明所述的基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，能够实现对最低浓度为pM级重金属离子的检测；
(2)本发明所述的基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法克服了SERS技术中最常见的重现性差的问题，本方法能够克服银壳厚度对结果的影响，传感器表现出更好的响应性能。实现了对重金属离子简单、选择性好、重现性强的高灵敏检测。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明的原理示意图；
图2为本发明实施例1所述的Hg2+检测的SERS光谱图；
图3是本发明实施例1所述的该方法的重现性考察；
图4本发明实施例1所述的该方法的选择性考察；
图5本发明实施例1所述的该方法的稳定性考察。
具体实施方式
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例1
1、设计识别探针和与之互补的DNA，具体序列信息见表1。
表1.
2、溶液的配制
DNA干冻粉用灭菌超纯水稀释成100μM储存液；100mM的Tris-HCl 缓冲液(150mMNaCl，5.0mM TCEP，pH 7.0)用于配制识别探针；10mM 的PBS缓冲液(100mMNaCl，5.0mM MgCl2，pH 7.4)用于配制低浓度的互补DNA链；Hg2+溶液以及其它的金属离子溶液用超纯水配制和稀释。
3、纳米颗粒的合成
3.1金纳米颗粒的合成
首先，将50mL的0.03％HAuCl4溶液，搅拌加热至沸，然后快速加入 0.5mL新配制的1.0％柠檬酸钠溶液，可以观察到溶液的颜色由浅黄色变为蓝色，继续加热搅拌20min，溶液的最终颜色为酒红色，移除热源，搅拌冷却至室温，然后用0.22μm孔径的滤膜进行纯化分离后置于4℃下保存，以备待用。
2.2识别探针功能化修饰的金纳米颗粒
巯基化的识别探针通过Au-S键功能化修饰于金纳米颗粒表面，其步骤如下：取2.0μL的100μM的识别探针与在室温下孵育反应0.5h，以除去双硫键，然后与3.0mL上述制备的金纳米颗粒溶液避光孵育反应24h后在 12000rpm下离心15min，除去上清液，下层沉淀物重新分散于3.0mL超纯水中，以上步骤重复三次，以除去未被结合的识别探针。
2.3银包金纳米颗粒的合成
在识别探针修饰的金纳米颗粒表面包裹一层银以增强拉曼信号：取50 μL的10mM的L-抗坏血酸溶液与上述识别探针修饰的金纳米颗粒溶液充分混合，不断搅拌下将10mM的硝酸银溶液逐滴滴加到上述溶液中，形成识别探针修饰的银包金纳米颗粒。为了形成双链DNA修饰的银包金纳米颗粒 (dsDNA-Au@Ag NPs)，取80μL的cDNA加入到以上混合溶液中，置于 90℃下热变性8min，自然冷却至室温，12000rpm下离心20min，以除去未被结合的cDNA。
3、表面增强拉曼光谱检测Hg2+
不同浓度的Hg2+(或其他金属离子)与上述制备dsDNA-Au@Ag NPs 溶液在常温下避光孵育40min后在12000rpm下离心15min，除去上清液，下层沉淀物重新分散于超纯水中，重复三次，以除去被解离下来的cDNA和未反应的物质。
用点样毛细管吸取样品，进行SERS光谱测定，每个样本平行测量5次。实验中，SERS光谱测定采用英国雷尼绍公司生产的Invia-Reflex激光共聚焦倒置显微拉曼光谱仪，选用633nm和532nm HeNe激光器，50倍长焦物镜，SERS光谱扫描范围为900～1900cm-1，曝光时间为3s，累积次数为2 次，对其它金属离子也在同样的条件下测定。
4、重现性考察
除了灵敏度，重现性也是SERS传感检测方法的一个重要的性能指标。本发明考察了相同Hg2+浓度下10个平行样本的重现性，结果如图3所示。为了使数据更加具有统计学意义，我们分别计算了采用单信号响应Cy3在拉曼位移1586cm-1和Rox在1646cm-1处特征峰的峰强度的RSD，分别为 13.4％和13.3％，而当以ICy3/IRox的值作为定量标准时，RSD为3.6％。以上数据表明，相比于以单独的拉曼信标分子的SERS信号强度作为考察标准，该传感方法以ICy3/IRox的值作为考察重现性的标准时，结果的重现性有明显的提高。
5、选择性考察
我们进一步对该方法的选择性进行了考察，结果如图4所示，只有Hg2+ 产生明显的ICy3/IRox值的改变，而其它的金属离子基本没有变化。表明，由于Hg2+能特异性与T碱基结合形成T-Hg2+-T复合物，该传感方法对Hg2+ 的检测具有良好的选择性。
6、稳定性考察
实验中，进一步对传感器的稳定性进行了考察，结果如图5所示。将该传感器分别置于4℃下一周和两周后仍对Hg2+具有较好的响应，对相同浓度的Hg2+进行检测后，ICy3/IRox的值分别1.52、1.50和1.48，三者之间偏差较小，表明该传感器稳定性较好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)设计识别探针和与之互补的DNA；
(2)合成金纳米颗粒；
(3)识别探针功能化修饰金纳米颗粒；
(4)合成双链DNA修饰的银包金纳米颗粒；
(5)表面拉曼光谱检测重金属离子。
2.根据权利要求1所述的基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法，其特征在于：步骤(1)识别探针末端增加间隔序列。
3.根据权利要求2所述的基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法，其特征在于：所述间隔序列为4～9个C碱基。
4.根据权利要求1所述的基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法，其特征在于：步骤(2)金纳米颗粒的合成方法如下：
将50mL的0.02％～0.1％HAuCl4溶液，搅拌加热至沸，然后快速加入0.5mL新配制的1.0％柠檬酸钠溶液，继续加热搅拌10～25min，溶液的最终颜色为酒红色，移除热源，搅拌冷却至室温，然后用0.22μm孔径的滤膜进行纯化分离后置于4℃下保存，以备待用。
5.权利要求1所述的基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法，其特征在于：步骤(3)识别探针功能化修饰金纳米颗粒的合成方法如下：
将巯基化的识别探针通过Au-S键功能化修饰于金纳米颗粒表面，其步骤如下：取1～5.0μL的100μM的识别探针与1～5.0μL的100mM含5.0mM TCEP的Tris-HCl在室温下孵育反应0.2～1h，然后与3.0mL步骤(1)制备的金纳米颗粒溶液避光孵育反应24h后在12000rpm下离心10～25min，除去上清液，下层沉淀物重新分散于3.0mL超纯水中。
6.根据权利要求1所述的基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法，其特征在于：双链DNA修饰的银包金纳米颗粒的合成方法如下：
取30～80μL的10mM的L-抗坏血酸溶液与识别探针修饰的金纳米颗粒溶液充分混合，不断搅拌下将5mM的硝酸银溶液逐滴滴加到上述溶液中，形成识别探针修饰的银包金纳米颗粒，取60～120μL的cDNA加入到识别探针修饰的银包金纳米颗粒的混合溶液中，置于80～110℃下热变性2～10min，自然冷却至室温，12000rpm下离心10～25min。
7.根据权利要求1所述的基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法，其特征在于：步骤(5)表面拉曼光谱检测重金属离子的操作步骤如下：
不同浓度的重金属离子与上述制备双链DNA修饰的银包金纳米颗粒溶液在12000rpm下离心10～25min，除去上清液，下层沉淀物重新分散于超纯水中，重复三次得到样品，用点样毛细管吸取样品，进行SERS光谱测定。
8.一种如权利要求1～7任一权利要求所述的基于比率型SERS传感原理检测重金属离子的方法在微量或痕量重金属离子检测中的应用。
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