CN109813703A - 基于dna行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素a的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，1)制备赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA(dsDNA)；2)制备dsDNA和DNA探针以及三(2‑羧乙基)膦盐酸盐的混合液；3)将上述DNA混合液滴加在CdSQDs/GCE表面，采用6‑巯基‑1‑己醇封闭电极表面非特异性的活性结合位点之后，制得电化学发光适体传感器；4)制备OTA和切刻内切酶的混合液，将混合液滴加到传感器表面，并利用电化学发光分析仪对反应体系进行检测；5)利用透射电子显微镜对CdSQDs进行表征。本发明不需要借助精密昂贵的实验仪器，没有严格复杂的实验操作过程，极大地降低了OTA的检测成本，具有灵敏度高、抗干扰能力强、制备简便且成本低廉的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法。
背景技术
DNA行走机器人作为一种人工合成的分子机器，它是通过设计特定的DNA序列(DNAwalker)并利用DNA walker的定向自主移动达到信号放大的目的。由于具有良好的可控性和精密的可预测性以及制备简单、操作方便的优点，DNA行走机器人现已日渐受到关注并应用于分析检测领域。
赭曲霉毒素A是一种与人类健康关系最为密切的真菌毒素，其不仅能够严重地污染粮谷类农产品和动物性食品，而且对人类和动物还具有高度的肾毒性、肝毒性、致畸性和致癌性和免疫抑制作用，世界卫生组织国际癌症研究机构已将其划定为2B类致癌物。目前已经有许多检测赭曲霉毒素A的相关报道，但是检测过程复杂，高成本低信号，而且选择性差。
因此，提供一种能对赭曲霉毒素A进行特异性识别，具有较高的抗干扰能力，并能对赭曲霉毒素A进行灵敏的定量检测，制备简便且成本低廉的基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器是本发明亟需解决的问题。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A，本发明不需要借助精密昂贵的实验仪器，没有严格复杂的实验操作过程，极大地降低了OTA的检测成本，具有灵敏度高、抗干扰能力强、制备简便且成本低廉的优点。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明先通过OTA与其核酸适体之间的特异性识别作用使aptamer从dsDNA中脱离，然后利用DNA walker、Cy5-DNA以及Nb.BbvCI构建DNA行走机器人。OTA夺走aptamer之后，DNA walker能够循环多次地与电极表面的Cy5-DNA进行杂交，导致大量的Cy5-DNA被Nb.BbvCI切割进而远离电极表面，Cy5-DNA对CdS QDs所产生的光信号的猝灭作用减弱，从而引起传感器表面电化学发光信号强度的变化。OTA的加入量越多，传感器表面自由的DNAwalker越多，被切割的Cy5-DNA越多，CdS QDs的电化学发光信号就越强，以此实现OTA的定量检测。
本发明电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法包括以下步骤：
1)制备赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA(dsDNA)；
2)制备dsDNA和DNA探针(Cy5-DNA)以及三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合液；
3)将上述DNA混合液滴加在CdS QDs/GCE表面，采用6-巯基-1-己醇封闭电极表面非特异性的活性结合位点之后，制得电化学发光适体传感器；
4)制备OTA和切刻内切酶(Nb.BbvCI)的混合液，将混合液滴加到传感器表面，并利用电化学发光分析仪对反应体系进行检测；
5)利用透射电子显微镜对CdS QDs/GCE进行表征。
其中，
进一步的，所述步骤1)赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA选取两条特定序列的单链DNA即aptamer和DNA walker，在DNA杂交缓冲溶液中95～100℃水浴后冷却至室温，形成杂交的dsDNA。
进一步的，所述DNA杂交缓冲溶液为：10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 7.2～7.4。
进一步的，所述步骤2)DNA探针选取一条特定序列的荧光染料修饰的单链DNA；制备dsDNA和DNA探针(Cy5-DNA)以及三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合液具体步骤如下：取一小离心管，依次加入dsDNA溶液、Cy5-DNA溶液和三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，随后加入超纯水使得混合液的最终体积为50μL，混合后并在4℃的条件下静置存放1～2h。
进一步的，所述dsDNA溶液的浓度为2μM～5μM。
进一步的，所述Cy5-DNA溶液的浓度为20μM～30μM。
进一步的，所述混合液中Cy5-DNA与dsDNA的摩尔浓度比值为1～25：1。
进一步的，所述步骤3)DNA混合液滴加在CdS QDs/GCE表面的具体步骤如下：取10μL混合液小心地滴加到CdS QDs/GCE表面，4℃的条件下静置反应10～16h；采用的6-巯基-1-己醇的浓度为0.1mM～1mM，用量为5μL。
进一步的，所述步骤4)Nb.BbvCI的剂量为0～10U；混合液滴加到传感器表面的具体步骤如下：取10μL混合液小心地滴加到传感器表面，37℃的条件下反应1.5～3.5h。
进一步的，所述步骤5)透射电子显微镜对CdS QDs的表征的具体步骤如下：将10μL经过稀释的CdS QDs溶液滴加到铜网上，室温下自然晾干之后，进行透射电子显微镜检测。
有益效果：本发明原理简单、所用材料成本较低，在相同的条件下可以准确地检测出更低含量的待测物。本发明主要利用OTA与适体之间的特异性识别作用和DNA行走机器人的信号放大作用。OTA夺走aptamer之后，DNA walker能够循环多次地与电极表面的Cy5-DNA进行杂交，导致大量的Cy5-DNA被Nb.BbvCI切割进而远离电极表面，Cy5-DNA对CdS QDs所产生的光信号的猝灭作用减弱，从而引起传感器表面电化学发光信号强度的变化。OTA的加入量越多，传感器表面自由的DNA walker越多，被切割的Cy5-DNA越多，CdS QDs/GCE的电化学发光信号就越强，以此实现OTA的定量检测。本发明不需要借助精密昂贵的实验仪器，没有严格复杂的实验操作过程，极大地降低了OTA的检测成本，具有灵敏度高、抗干扰能力强、制备简便且成本低廉的优点。
附图说明
图1显示了CdS QDs/GCE的制备过程；
图2显示了基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A(OTA)的流程图；
图3显示了硫化镉量子点(CdS QDs)的透射电子显微镜(TEM)图像；
图4显示了电化学发光分析仪定量检测OTA的电化学发光强度变化图。A：在不同浓度的OTA作用下，得到的电化学发光强度-时间曲线；B：电化学发光强度峰信号值与OTA浓度的关系图，插图为OTA浓度的线性校准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例1：
基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A(OTA)的分析方法，检测步骤是：
赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA(dsDNA)的制备：选取两条浓度均为25μM的特定序列的单链DNA(aptamer，DNA walker)各1μL，95℃与8μL杂交缓冲溶液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 7.4)水浴5分钟后冷却至室温。
dsDNA和DNA探针(Cy5-DNA)以及三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合液的制备：取上述10μL 2.5μM的dsDNA溶液和5μL 25μM的Cy5-DNA溶液、5μL 10mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液混合，然后加入超纯水使得DNA混合液的最终体积为50μL；最后将DNA混合液在4℃的条件下静置存放1h。
硫化镉量子点修饰的玻碳电极(CdS QDs/GCE)的制备：首先对玻碳电极进行预先处理，然后取5μL 5mg/mL的CdS QDs溶液滴加到干燥后的玻碳电极表面，在4℃的温度下静置干燥3h，得到CdS QDs/GCE，如图1所示。
制备电化学发光适体传感器的具体步骤：先取10μL DNA混合液小心地滴加到CdSQDs/GCE表面，4℃的条件下静置反应12h；然后在电极上继续滴加5μL 1mM的6-巯基-1-己醇溶液，在室温下孵育1h。
OTA浓度检测：取一小离心管，加入NE缓冲溶液(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mMMgCl2，100μg/ml BSA，pH 7.9)、4U的Nb.BbvCI和2μL 0.25nM的OTA溶液，将OTA配制成浓度为0.05nM、体积为10μL的溶液；然后取上述制得的10μL溶液小心地滴加到传感器的表面，在37℃烘箱里孵育3h；随后将传感器浸泡在10mL含有0.1M过硫酸钾的10×PBS溶液(0.1MNa2HPO4，0.1M NaH2PO4，pH 7.4)中进行电化学发光信号的检测：激发电压为700V，电势扫描范围为0V到-1.5V，电势扫描速率为0.1V/s。实验结果如图4所示，OTA在0.05nM-5nM范围内与电化学发光强度呈现良好的线性关系，检测限是12pM。
实施例2：
基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A(OTA)的分析方法，检测步骤是：
赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA(dsDNA)的制备：选取两条浓度均为25μM的特定序列的单链DNA(aptamer，DNA walker)各1μL，95℃与8μL杂交缓冲溶液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 7.4)水浴5分钟后冷却至室温。
dsDNA和DNA探针(Cy5-DNA)以及三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合液的制备：取上述10μL 2.5μM的dsDNA溶液和5μL 25μM的Cy5-DNA溶液、5μL 10mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液混合，然后加入超纯水使得DNA混合液的最终体积为50μL；最后将DNA混合液在4℃的条件下静置存放1h。
硫化镉量子点修饰的玻碳电极(CdS QDs/GCE)的制备：首先对玻碳电极进行预先处理，然后取5μL 5mg/mL的CdS QDs溶液滴加到干燥后的玻碳电极表面，在4℃的温度下静置干燥3h，得到CdS QDs/GCE。
制备电化学发光适体传感器的具体步骤：先取10μL DNA混合液小心地滴加到CdSQDs/GCE表面，4℃的条件下静置反应12h；然后在电极上继续滴加5μL 1mM的6-巯基-1-己醇溶液，在室温下孵育1h。
OTA浓度检测：取一小离心管，加入NE缓冲溶液(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mMMgCl2，100μg/ml BSA，pH 7.9)、4U的Nb.BbvCI和2μL 2.5nM的OTA溶液，将OTA配制成浓度为0.5nM、体积为10μL的溶液；然后取上述制得的10μL溶液小心地滴加到传感器的表面，在37℃烘箱里孵育3h；随后将传感器浸泡在10mL含有0.1M过硫酸钾的10×PBS溶液(0.1MNa2HPO4，0.1M NaH2PO4，pH 7.4)中进行电化学发光信号的检测：激发电压为700V，电势扫描范围为0V到-1.5V，电势扫描速率为0.1V/s。实验结果如图4所示，OTA在0.05nM-5nM范围内与电化学发光强度呈现良好的线性关系，检测限是12pM。
实施例3：
基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A(OTA)的分析方法，检测步骤是：
赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA(dsDNA)的制备：选取两条浓度均为25μM的特定序列的单链DNA(aptamer，DNA walker)各1μL，95℃与8μL杂交缓冲溶液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 7.4)水浴5分钟后冷却至室温。
dsDNA和DNA探针(Cy5-DNA)以及三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合液的制备：取上述10μL 2.5μM的dsDNA溶液和5μL 25μM的Cy5-DNA溶液、5μL 10mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液混合，然后加入超纯水使得DNA混合液的最终体积为50μL；最后将DNA混合液在4℃的条件下静置存放1h。
硫化镉量子点修饰的玻碳电极(CdS QDs/GCE)的制备：首先对玻碳电极进行预先处理，然后取5μL 5mg/mL的CdS QDs溶液滴加到干燥后的玻碳电极表面，在4℃的温度下静置干燥3h，得到CdS QDs/GCE。
制备电化学发光适体传感器的具体步骤：先取10μL DNA混合液小心地滴加到CdSQDs/GCE表面，4℃的条件下静置反应12h；然后在电极上继续滴加5μL 1mM的6-巯基-1-己醇溶液，在室温下孵育1h。
OTA浓度检测：取一小离心管，加入NE缓冲溶液(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mMMgCl2，100μg/ml BSA，pH 7.9)、4U的Nb.BbvCI和2μL 25nM的OTA溶液，将OTA配制成浓度为5nM、体积为10μL的溶液；然后取上述制得的10μL溶液小心地滴加到传感器的表面，在37℃烘箱里孵育3h；随后将传感器浸泡在10mL含有0.1M过硫酸钾的10×PBS溶液(0.1M Na2HPO4，0.1M NaH2PO4，pH 7.4)中进行电化学发光信号的检测：激发电压为700V，电势扫描范围为0V到-1.5V，电势扫描速率为0.1V/s。实验结果如图4所示，OTA在0.05nM-5nM范围内与电化学发光强度呈现良好的线性关系，检测限是12pM。
图2显示了基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A(OTA)的流程图。图中显示了a线：没有OTA存在下CdS QDs的电致化学发光强度的大小，可以看出信号很低，说明Cy5-DNA有效地猝灭了CdS QDs所产生的光信号；b线：在OTA存在的情况下，电致化学发光强度明显增大，表明OTA与dsDNA中的aptamer进行特异性的结合之后，DNAwalker能够循环多次地与电极表面的Cy5-DNA进行杂交，导致大量的Cy5-DNA被Nb.BbvCI切割进而远离电极表面，引起CdS QDs电化学发光信号强度的增强。说明可以通过该电化学发光适体传感器检测OTA。
图3显示了硫化镉量子点(CdS QDs)的透射电子显微镜图像，标尺为20纳米，由图可以得知，硫化镉量子点的直径约为3.5nm，而且分布良好。
图4(A)、(B)显示了定量检测OTA的电化学发光强度变化图。A：在不同浓度的OTA的作用下，得到的电化学发光强度-时间曲线；B：电化学发光强度峰信号值与OTA浓度的关系图，从图中可以看出OTA在0.05nM-5nM呈良好的线性关系。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)制备赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA即dsDNA；
2)制备dsDNA和DNA探针即Cy5-DNA以及三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合液；
3)将上述DNA混合液滴加在CdS QDs/GCE表面，采用6-巯基-1-己醇封闭电极表面非特异性的活性结合位点之后，制得电化学发光适体传感器；
4)制备OTA和切刻内切酶Nb.BbvCI的混合液，将混合液滴加到传感器表面，并利用电化学发光分析仪对反应体系进行检测；
5)利用透射电子显微镜对CdS QDs/GCE进行表征。
2.根据权利要求1所述的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述步骤1)赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA选取两条特定序列的单链DNA即aptamer和DNA walker，在DNA杂交缓冲溶液中95～100℃水浴5min后冷却至室温，形成杂交的dsDNA。
3.根据权利要求2所述的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述DNA杂交缓冲溶液为：10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 7.2～7.4。
4.根据权利要求1所述的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述步骤2)DNA探针选取一条特定序列的荧光染料修饰的单链DNA；制备dsDNA和DNA探针即Cy5-DNA以及三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合液具体步骤如下：取一小离心管，依次加入dsDNA溶液、Cy5-DNA溶液和三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，随后加入超纯水使得混合液的最终体积为50μL，混合后并在4℃的条件下静置存放1～2h。
5.根据权利要求4所述的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述的dsDNA溶液和Cy5-DNA溶液的浓度分别为2μM～5μM和20μM～30μM。
6.根据权利要求1或4所述的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述混合液中Cy5-DNA与dsDNA的摩尔浓度比值为1～25：1。
7.根据权利要求1所述的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述步骤3)DNA混合液滴加在CdS QDs/GCE表面的具体步骤如下：取10μL混合液滴加到CdS QDs/GCE表面，4℃的条件下静置反应10～16h；采用的6-巯基-1-己醇的浓度为0.1mM～1mM，用量为5μL。
8.根据权利要求1所述的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述步骤3)中，硫化镉量子点修饰的玻碳电极CdS QDs/GCE的制备方法为：首先对玻碳电极进行预先处理，然后取5μL 5mg/mL的CdS QDs溶液滴加到干燥后的玻碳电极表面，在4℃的温度下静置干燥3h，得到CdS QDs/GCE。
9.根据权利要求1所述的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述步骤4)Nb.BbvCI的剂量为0～10U；OTA的浓度为0～6nM；混合液滴加到传感器表面的具体步骤如下：取10μL混合液滴加到传感器表面，37℃的条件下反应1.5～3.5h。
10.根据权利要求1所述的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述步骤5)透射电子显微镜对CdS QDs/GCE的表征的具体步骤如下：将10μL经过稀释100倍的CdS QDs溶液滴加到铜网上，室温下自然晾干之后，进行透射电子显微镜检测。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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