CN110734962A - 一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法 - Google Patents

一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法，包括以下步骤：1)将带凹槽的玻片进行清洗后，对玻片表面进行氨基硅烷化、醛基化修饰；2)将捕获探针capture DNA固定到醛基化玻片上；3)加入NPS‑aptamer，滴加10.0μL 3×SSC缓冲液，将其放入振荡培养箱中30‑45℃杂交25‑40min；4)在玻璃凹槽中加入食品毒素溶液，45℃反应20min；5)将反应液转移至PCR管，加入H2O2和TMB溶液，808nm波长的光照10s‑25min，温度计测定溶液温度变化；6)建立温度的变化和食品毒素加入量的拟合曲线图，实现食品毒素的测定。本发明操作简便，选择性好，无需使用昂贵的仪器。

Description

一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法
技术领域
本发明涉及食品毒素检测领域，具体涉及一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法。
背景技术
随着现代检测技术的快速发展，重金属、真菌毒素、残留农药、药物和个人护理品(Phrmaceuticals and Personal CareProducts,PPCPs)等环境污染物，在地表水、地下水、土壤、水生生物体、饮用水中不断被检出，直接或间接地对人类的健康造成危害。由于实际环境样品基质复杂，环境污染物检测方法须高效、灵敏和选择性好。基于核酸适配体技术的检测方法相比其他方法具有很强的竞争力。
传统的测定方法主要包括色谱分析(薄层色谱分析法，质谱、紫外等联用的高效液相色谱法，气相色谱法等)和酶联免疫吸附测定方法，这两种方法对操作人员的要求比较高，样品处理繁琐，且仪器昂贵，特别在低浓度的时候准确度还不够高。因此，在过去的十几年里，分子水平的生物传感器的研究被大量的报道。各类环境污染物的测定从检测限、准确度、简单操作等方面都有了很大的提高，但是离实际应用还距离很远，还需要投入大量的研究。目前，科研工作者研究重点主要集中在传感器受体的选择、信号传导策略、新材料应用、信号产生机制等方面的研究，以期得到灵敏度高、线性范围宽、使用寿命长、小型便捷的，可以推广应用的传感体系。
核酸适配体(aptamer)技术由美国Gold和Szostak两个研究组最早提出，其在生物传感应用领域具有靶分子范围广、亲和力强、制备和修饰方便、快速、稳定性好等优势。aptamer的这些优势使其成为生物传感器的理想识别分子。aptamer是一段与靶物质具有高亲和力和高特异性的寡核苷酸链。核酸适配体法不同于抗原-抗体的特异性反应，可以克服免疫分析易受到pH值、温度等干扰问题，基于aptamer的生物传感器的构建与应用已经成为生物分析领域的研究热点之一。目前，大部分传感器都是基于荧光检测和电化学检测传感系统，需要借助昂贵的仪器和繁琐的操作。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法，以解决现有技术中存在的基于aptamer的生物传感器大部分都是基于荧光检测和电化学检测传感系统，需要借助昂贵的仪器和繁琐的操作的问题。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法，包括以下步骤：
1)将带凹槽的玻片进行清洗后，对玻片表面进行氨基硅烷化、醛基化修饰；
2)将捕获探针capture DNA固定到醛基化玻片上；将capture DNA用蒸馏水稀释到5.0g/mL，滴加到醛基化玻片表面，室温静置过夜，然后用质量百分浓度为0.2％的SDS清洗，蒸馏水清洗，室温晾干；
3)加入NPS-aptamer，滴加10.0μL 3×SSC缓冲液来维持湿度，将其放入振荡培养箱中30-45℃杂交25-40min，用配制好的杂交后清洗液1、清洗液2和清洗液3清洗；
4)在玻璃凹槽中加入食品毒素溶液，45℃反应20min；
5)将反应液转移至PCR管，加入H2O2和TMB溶液，808nm波长的光照10s-25min，温度计测定溶液温度变化；
6)建立温度的变化和食品毒素加入量的拟合曲线图，实现食品毒素的测定。
进一步的，步骤3)中，杂交温度为45℃，杂交时间为25min。
进一步的，步骤3)中，清洗液1为1×SSC+0.03％SDS；清洗液2为0.20×SSC；清洗液3为0.05×SSC。
进一步的，步骤5)中，H2O2的摩尔浓度为1.0M，TMB的摩尔浓度为0.4mM。
进一步的，步骤5)中，光照辐射度为5.26W·cm-2，光照时间为20min。
进一步的，捕获探针capture DNA与NPS-aptamer的体积比为3-6:1。
优选，捕获探针capture DNA与NPS-aptamer的体积比为4:1。
进一步的，NPS的粒径为100nm-1μm。
优选，NPS的粒径为1μm。
进一步的，NPS-aptamer是由生物素标记的aptamer和链霉亲和素-NPS结合而成，aptamer核酸适配体序列为5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'；捕获探针capture DNA序列为5'-TTTTTTTTTCCGATGCTCCCT-3'，且在5'端修饰了氨基。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)测定过程步骤简单、快速；
(2)无需使用昂贵的光学仪器，一般温度计读取温度信号即可；
(3)灵敏度高，可以最低检测OTA浓度已经达到nm级别。
附图说明
图1是OTA浓度与温度变化之间的拟合曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。
实施例1
一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法，包括以下步骤：
(1)将带凹槽的普通玻璃浸入铬酸溶液中浸泡过夜，蒸馏水洗；浸入25％(质量百分浓度)氨水中过夜，二次蒸馏水水洗；浸入2％(质量百分浓度)的氨基硅烷95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH至4.5，室温作用30min，用乙醇超声清洗，用二次蒸馏水超声清洗，室温晾干；室温下含2.5％(质量百分浓度)戊二醛的0.10mol·L-1，pH＝7.2的PBS溶液与氨基玻片作用2h，PBS冲洗，再用二次蒸馏水水洗，晾干。
(2)将捕获探针capture DNA(捕获探针capture DNA序列为5'-TTTTTTTTTCCGATGCTCCCT-3'，且在5'端修饰了氨基)固定到醛基化玻片上。将capture DNA用二次蒸馏水稀释到5.0g·mL-1，将样品滴加到醛基化玻片表面，室温静置过夜，然后用0.2％(质量百分浓度)的SDS洗2次，蒸馏水洗两次，室温晾干。
(3)加入一定量的NPS-aptamer(NPS-aptamer是由生物素标记的aptamer和链霉亲和素-NPS结合而成，aptamer核酸适配体序列为5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3')，滴加10.0μL3×SSC来维持湿度，将其放入振荡培养箱中30-45℃杂交25-40min。用配制好的杂交后清洗液1(1×SSC+0.03％SDS)、清洗液2(0.20×SSC)和清洗液3(0.05×SSC)洗液清洗。
(4)在玻璃凹槽中加入OTA溶液，45℃反应20min。
(5)将反应液转移至PCR管，加入H2O2和TMB溶液(H2O2的摩尔浓度为1.0M，TMB的摩尔浓度为0.4mM)。溶液变成蓝色，用808nm波长的光照射10s-25min，光照辐射度为5.26W·cm-2，温度计测溶液温度变化。
(6)建立温度的变化和食品毒素加入量的拟合曲线图，实现食品毒素的测定。
步骤(3)中，清洗液由20×SSC与10％SDS按照一定比例配制，具体配置如表1所示。20×SSC含3M氯化钠和0.3M柠檬酸钠，pH为7.0，10％SDS溶液含100g/L的十二烷基硫酸钠。
表1清洗液配制
清洗液 清洗液1/mL 清洗液2/mL 清洗液3/mL
二次蒸馏水 190.0 198.0 200.0
20×SSC 10.0 2.0 0.5
10％SDS 0.6 ― ―
终体积 200.0 200.0 200.0
实施例2
1)改变捕获探针capture DNA与NPS-aptamer的比例关系(磁珠粒径使用100nm)，溶液温度变化如表2所示。
表2 capture DNA与NPS-aptamer的体积比对溶液温度的影响
Figure BDA0002263199880000041
2)改变NPS磁珠粒径，溶液温度变化如表3所示。
表3磁珠粒径对溶液温度的影响
Figure BDA0002263199880000042
3)改变NPS-aptamer的结合量，溶液温度变化如表4所示。
表4 NPS-aptamer的结合量对溶液温度的影响
Figure BDA0002263199880000051
4)改变杂交时间，溶液温度变化如表5所示。
表5杂交时间对溶液温度的影响
Figure BDA0002263199880000052
5)改变杂交温度，溶液温度变化如表6所示。
表6杂交温度对溶液温度的影响
Figure BDA0002263199880000053
6)改变光照时间，溶液温度变化如表7所示。
表7光照时间对溶液温度的影响
Figure BDA0002263199880000054
Figure BDA0002263199880000061
7)在捕获探针capture DNA与NPS-aptamer的比例为4:1，磁珠粒径为1μm，NPS-aptamer的结合量为450pmol的aptamer加入31μL的1μm磁珠，45℃杂交25min，光照时间为20min的条件下，发现温度的变化与OTA的浓度(2.5×10-6、2.5×10-7、2.5×10-8、2.5×10-9、2.5×10-10M)有一定的相关性，具体如图1所示。当OTA浓度到达0.25nM时都能检测出来，证明最低检测OTA浓度已经达到nM级别。
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将带凹槽的玻片进行清洗后，对玻片表面进行氨基硅烷化、醛基化修饰；
2)将捕获探针capture DNA固定到醛基化玻片上；将capture DNA用蒸馏水稀释到5.0g/mL，滴加到醛基化玻片表面，室温静置过夜，然后用质量百分浓度为0.2％的SDS清洗，蒸馏水清洗，室温晾干；
3)加入NPS-aptamer，滴加10.0μL 3×SSC缓冲液维持湿度，将其放入振荡培养箱中30-45℃杂交25-40min；用配制好的杂交后清洗液1、清洗液2和清洗液3清洗；
4)在玻璃凹槽中加入食品毒素溶液，45℃反应20min；
5)将反应液转移至PCR管，加入H2O2和TMB溶液，808nm波长的光照10s-25min，温度计测定溶液温度变化；
6)建立温度的变化和食品毒素加入量的拟合曲线图，实现食品毒素的测定。
2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，步骤3)中，所述杂交温度为45℃，杂交时间为25min。
3.根据权利要求1所述的基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，步骤3)中，所述清洗液1为1×SSC+0.03％SDS；所述清洗液2为0.20×SSC；所述清洗液3为0.05×SSC。
4.根据权利要求1所述的基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，步骤5)中，所述H2O2的摩尔浓度为1.0M，所述TMB的摩尔浓度为0.4mM。
5.根据权利要求1所述的基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，步骤5)中，所述光照辐射度为5.26W·cm-2，所述光照时间为20min。
6.根据权利要求1所述的基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，所述捕获探针capture DNA与NPS-aptamer的体积比为3-6:1。
7.根据权利要求5所述的基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，所述捕获探针capture DNA与NPS-aptamer的体积比为4:1。
8.根据权利要求1所述的基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，所述NPS的粒径为100nm-1μm。
9.根据权利要求1所述的基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，所述NPS的粒径为1μm。
10.根据权利要求1至9任一项所述的基于核酸适配体检测食品毒素的方法，其特征在于，所述NPS-aptamer是由生物素标记的aptamer和链霉亲和素-NPS结合而成，所述aptamer核酸适配体序列为5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'；所述捕获探针capture DNA序列为5'-TTTTTTTTTCCGATGCTCCCT-3'，且在5'端修饰了氨基。
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