CN111856010B

CN111856010B - 一种分子信标、其构建方法及应用

Info

Publication number: CN111856010B
Application number: CN202010694129.2A
Authority: CN
Inventors: 张志庆; 刘娜娜; 杨春天; 王芳; 张国栋; 周亭; 王秀凤
Original assignee: Anqiu Plasticizer Factory; China University of Petroleum East China
Current assignee: Anqiu Plasticizer Factory; China University of Petroleum East China
Priority date: 2020-07-17
Filing date: 2020-07-17
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2040-07-17
Also published as: CN111856010A

Abstract

本发明提供一种分子信标、其构建方法及应用。所述分子信标包括：两条寡核苷酸链，其中，所述两条寡核苷酸链中的一条为主链单链，其核苷酸序列包括：5’端连接序列、适配体序列以及3’端连接序列，所述主链单链在5’端和3’端分别标记淬灭基团和荧光基团，或者在5’端和3’端分别标记荧光基团和淬灭基团；另一条为互补短链cDNA，其无任何修饰基团，所述互补短链cDNA包含与所述主链中的5’端连接序列的部分或全部互补的5’端互补序列、和与所述主链中的3’端连接序列的部分或全部互补的3’端互补序列，以使所述淬灭基团和所述荧光基团不分开。所述分子信标在凝血酶的检测中显示出高灵敏性和灵活性。

Description

一种分子信标、其构建方法及应用

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种用于分子检测的分子信标、其构建方法及其应用。

背景技术

凝血酶是血液中的多功能蛋白酶，在各种关键的生理和病理过程中起重要作用，例如凝血、血栓形成和血管生成。它可以将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白，在许多凝血相关反应中形成纤维蛋白凝胶，其浓度的变化与某些疾病有关。虽然目前已经开发了许多方法来检测凝血酶，比如说电化学法、荧光法等，但这些方法大多数存在操作复杂，检测灵敏度低等缺点，因此仍需要以高灵敏度和高选择性检测凝血酶的检测试剂及检测方法。

分子信标(molecular beacon,MB)自身能形成一个封闭的发卡结构，包括环状区和茎干区，环状区包含对靶标的反义识别结构域或者适配体序，MB序列末端分别标记荧光剂和淬灭剂，在不存在靶标的情况下，MB依赖于“闭合”构型，导致荧光剂和淬灭剂之间发生荧光能量共振转移(FRET)而淬灭。一旦当MB和靶标结合，就会使茎变性，并激活或改变信号。相对于传统的DNA探针，分子信标以操作简单、特异性强、灵敏度高等特点，在蛋白质和多肽的检测、mRNA监测、活细胞实时成像等方面得到了广泛应用，特别是应用于化学、生物和医学等领域中生物分子的识别检测，在疾病诊断和治疗领域中有着潜在的应用前景。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种能简便、快速、灵敏、特异性检测的分子信标。

本发明的另一个目的是提供一种构建上述分子信标的方法。

本发明的再一个目的是提供上述分子信标用于制备检测试剂的用途。

本发明的再一个目的是提供一种利用上述分子信标检测凝血酶的方法。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种分子信标，其包括：

两条寡核苷酸链，

其中，

一条为主链单链(下文称为主链SS)，其核苷酸序列包括：5’端连接序列、适配体序列以及3’端连接序列，所述主链SS在5’端和3’端分别标记淬灭基团和荧光基团或者在5’端和3’端分别标记荧光基团和淬灭基团；

另一条为互补短链cDNA，其无任何修饰基团，所述互补短链cDNA包含与所述主链中的5’端连接序列的部分或全部互补的5’端互补序列、和与所述主链中的3’端连接序列的部分或全部互补的3’端互补序列，以使所述淬灭基团和所述荧光基团不分开。

在一个具体实施方式中，所述淬灭基团为Dabcyl，所述荧光基团为FAM，或者所述淬灭基团为BHQ2，所述荧光基团为Cy5。

在一个具体实施方式中，所述主链SS自身不能含有五个以上的碱基互补配对；所述互补短链cDNA自身不能含有五个以上的碱基互补配对。

在一个具体实施方式中，所述5’端连接序列可以选择任意碱基，但不连续使用G碱基，这是因为连续的G碱基易形成G-四联体结构，且长度不少于15个碱基，所述3’端连接序列可以选择任意碱基，且长度不少于8个碱基；所述互补短链cDNA在主链SS的5’端和3’端与主链互补的碱基的个数分别不低于8个。

在一个具体实施方式中，所述适配体为凝血酶适配体(SEQ ID NO.1)，该适配体可以和凝血酶特异性结合形成G-四联体结构。

在一个具体实施方式中，所述适配体为癌细胞的适配体，例如白血病细胞的适配体Sgc8，小鼠黑色素瘤细胞的适配体AS1411。含有上述适配体的分子信标可以实现对相应癌细胞的特异性检测。

在一个具体实施方式中，所述主链SS具有SEQ ID NO.2的序列，并在5’端连接淬灭基团Dabcyl，3’端连接荧光基团FAM，所述短链cDNA具有SEQ ID NO.3的序列。

在一个具体实施方式中，所述主链SS具有SEQ ID NO.2的序列，并在5’端连接淬灭基团Dabcyl，3’端连接荧光基团FAM，所述短链cDNA具有SEQ ID NO.4的序列。

另一方面，本发明提供一种构建上述分子信标的方法，其包括以下步骤：

1)主链SS的设计和合成：

所述主链的核苷酸序列包括：5’端连接序列、适配体序列以及3’端连接序列，其中所述适配体为与待检测分子适配的适配体；

2)在步骤1)合成的主链SS的5’端和3’端分别标记淬灭基团和荧光基团；

3)互补短链cDNA的设计与合成：

根据步骤1)中设计的主链SS，相应地设计并合成互补短链cDNA，所述互补短链cDNA包含与所述主链中的5’端连接序列的部分或全部互补的5’端互补序列、和与所述主链中的3’端连接序列的部分或全部互补的3’端互补序列，以使所述淬灭基团和所述荧光基团不分开。

再一方面，本发明提供上述分子信标用作检测试剂的用途。

在一个具体实施方式中，所述检测试剂用于凝血酶、PTK7酶或核仁蛋白的检测。

再一方面，本发明提供一种检测试剂盒，其包含上述分子信标。

又一方面，本发明提供一种检测凝血酶的方法，所述方法包括：

使用上述分子信标检测凝血酶。

在具体实施方式中，所述方法包括：

1)检测液的制备：将含有上述主链、互补短链cDNA、Tris-HCl(pH＝8.0)、Na⁺、Mg²⁺的溶液置于离心管中，加入ddH₂O稀释，然后将溶液混匀、离心，等量分装至PCR离心管中进行梯度退火；

2)线性方程的构建：通过固定分子信标的浓度(体系中主链SS的最终浓度)，改变凝血酶的浓度制备一系列溶液，用荧光分光光度计测定加入凝血酶前后的溶液在518nm荧光峰值强度，以凝血酶浓度x以及(F-F0)/F0构建线性方程，其中凝血酶浓度x的单位为mol/L，F表示加入凝血酶的溶液在518nm的荧光峰值强度，F0表示未加凝血酶的溶液在518nm的荧光峰值强度；

3)凝血酶的测定：测定待测的凝血酶在518nm荧光峰值强度，并代入上述线性方程，计算得到凝血酶的浓度。

在具体实施方式中，在步骤1)中，主链与短链cDNA的比例为1:1-1:10。

在具体实施方式中，在步骤1)中，退火程序为：90℃3min，65℃5min，55℃5min，45℃10min，35℃10min，25℃30min。

在具体实施方式中，在步骤2)和步骤3)中，荧光分光光度计的激发波长设置为490nm，发射扫描范围为500～600nm，激发和发射狭缝分别为2.5nm和5nm，扫描速度是300nm/min。

在具体实施方式中，在步骤2)中，固定分子信标的浓度为100nM，改变人Thrombin浓度，37℃孵育30min，测定体系在518nm荧光峰值强度。

有益效果

本发明首先设计一条带有适配体并且在5’端修饰Dabcyl淬灭基团，3’端修饰FAM荧光基团的寡核苷酸主链SS，通过与其部分互补的cDNA结合，形成一种淬灭的分子信标。在自由状态下，SS中的FAM和Dabcyl基团相距较远，荧光较强，然而当SS与cDNA结合后形成分子信标，FAM和Dabcyl基团靠近，发生荧光共振能量转移使荧光淬灭。当分子信标进一步遇到待检测的可以与适配体特异结合的物质时，会破坏分子信标的结构，实现荧光信号的释放，从而达到检测的目标。

本发明的优点：操作简单，检测灵敏度高，其中，包含凝血酶适配体的分子信标对凝血酶的检测限达到0.97nM。此外，本发明的分子信标具有一定的灵活性，通过改变适配体的序列，可以实现对其他蛋白质的检测。

附图说明

图1：本发明的分子信标检测凝血酶的原理图。

图2：cDNA序列长度对于分子信标荧光强度的影响。

图3：cDNA和SS的比例与荧光强度的关系。其中，图3a：主链SS，互补短链cDNA为cDNA2，两者在不同的比例下的荧光强度；图3b：cDNA2的浓度与(F0-F)/F0的关系(其中F0表示只含有SS的溶液在518nm处的荧光强度，F表示SS和cDNA2结合后的溶液在518nm处的荧光强度)；图3c：主链SS，互补短链cDNA为cDNA3，两者在不同的比例下的荧光强度；图3d：cDNA3的浓度与(F0-F)/F0的关系(其中F0表示只含有SS的溶液在518nm处的荧光强度，F表示SS和cDNA3结合后的溶液在518nm处的荧光强度)。

图4：本发明的分子信标在凝血酶检测中，荧光强度变化随凝血酶浓度变化的曲线图(图4a：分子信标MB(15+8)；图4b：分子信标MB(8+8)。)。

图5：本发明的分子信标对于凝血酶的特异性(图5a：分子信标MB(15+8)；图5b：分子信标MB(8+8))。

具体实施方式

下面结合具体实施例来对本发明做进一步的说明。然而这些实施例仅用于说明和解释本发明的技术内容，而并非用于限制本发明的范围。

本发明所用的凝血酶购自Sigma(美国)，溶菌酶、胰蛋白酶购自上海生工生物技术有限公司。其它试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。实验用水为法国密理博Milli-Q IQ7000型超纯水系统制备的超纯水。

实施例1：主链SS以及互补短链cDNA的设计与合成

首先选择出能够特异性靶向凝血酶的适配体序列，凝血酶的适配体有两种，本发明选择29个碱基的适配体，然后再插入连接碱基(目的是加长SS序列的长度)以及互补碱基(与cDNA进行互补配对的碱基)，并且在该寡核苷酸链5’端修饰Dabcyl，3’端修饰FAM基团。根据SS的序列设计了三种不同长度的cDNA序列。cDNA1与SS的5’端和3’端各有15个碱基和6个碱基互补配对，cDNA2分别有15个碱基和8个碱基与SS配对，cDNA3分别有8个碱基和SS的两端互补配对。设计好的SS和cDNA都由上海生工生物技术有限公司合成和纯化。

表1实施例1中所用的所有的寡核苷酸序列

注：加粗及下划线部分的序列为凝血酶适配体，核苷酸序列SEQ NO.1。*括号中的“+”前后的数字分别表示cDNA在SS的5’端和3’端与其互补的碱基的数量。

实施例2：考察各因素对分子信标荧光强度变化的影响

(1)cDNA序列长度对于分子信标荧光强度的影响。

具体步骤为：依次取一定量的SS、实施例1中的cDNA1/cDNA2/cDNA3、Tris-HCl、Na⁺、Mg²⁺于离心管中，使SS和cDNA的终浓度均为100nM，Tris-HCl、Na⁺、Mg²⁺的终浓度分别为20mM、50mM、5mM，混匀离心，然后等量分装至PCR离心管中，进行PCR退火，退火程序为：90℃3min，65℃5min，55℃5min，45℃10min，35℃10min，25℃30min。

荧光分光光度计激发波长设置为490nm，发射扫描范围为500～600nm，激发和发射狭缝分别为2.5nm和5nm，扫描速度是300nm/min。用荧光分光光度计测定上述反应后的溶液在518nm荧光峰值强度。

实验结果如图2所示，SS与cDNA1反应后，荧光强度升高，说明cDNA1与SS无法形成淬灭的组装体，这主要是因为6个碱基互补配对的作用力太弱，淬灭剂和荧光剂无法靠近，而cDNA2和cDNA3在加入SS后荧光强度都明显降低，说明cDNA2和cDNA3都能和SS形成淬灭的组装体，因此，选择cDNA2和cDNA3构建分子信标。

(2)SS和cDNA的比例对荧光强度变化的影响。

具体步骤为：固定SS的终浓度为100nM，Tris-HCl、Na⁺、Mg²⁺的终浓度分别为20mM、50mM、5mM，改变cDNA2/cDNA3的浓度，其中cDNA2的浓度分别为：20、50、100、200、500、1000、2000nM，cDNA3的浓度分别为：50、100、200、500、1000、2000、5000nM，混匀离心后，等量分装至PCR管中，进行退火程序(90℃3min，65℃5min，55℃5min，45℃10min，35℃10min，25℃30min)。

实验结果如图3所示，随着cDNA2浓度的升高，荧光淬灭效率先升高后降低，荧光淬灭的最佳比例为1:1，当比例超过1:1，荧光淬灭效率又降低，可能是由于环的张力的原因，SS和cDNA2之间的组装发生意外，即，有可能cDNA2(15+8)浓度越高，暴露在外面的荧光剂越多，因此可固定SS和cDNA2的比例为1:1来构建SS与cDNA2结合形成的分子信标(文中称为：MB(15+8))；而SS和cDNA3的结合是随着cDNA3浓度的逐渐升高，淬灭效率也越来越大，考虑到原料的节省和淬灭效率，可以固定SS和cDNA3的比例为1:10来构建SS与cDNA3结合形成的分子信标(文中称为：MB(8+8))。

实施例3：分子信标检测凝血酶。

具体步骤为：固定MB(15+8)的终浓度为100nM，Tris-HCl：20mM，K⁺：20mM，Mg²⁺：5mM，改变Thr浓度：3，10，30，100，300，1000，3000、5000nM，37℃孵育30min，同样固定MB(8+8)的终浓度为100nM，Tris-HCl：20mM，K⁺：20mM，Mg²⁺：5mM，改变Thr浓度：0.1、0.3、1、3、10、30、100nM，37℃孵育30min。

实验结果如图4所示，MB(15+8)检测凝血酶的线性方程为(F-F0)/F0＝0.1142x+0.3702(其中x为Thrombin的浓度，F表示加入凝血酶后的荧光峰值强度；F0表示未加入凝血酶的荧光峰值强度)，相关系数为0.988，凝血酶的检出限为1.2nM。

MB(8+8)检测凝血酶的线性方程为(F-F0)/F0＝0.214x+0.3702(其中x为Thrombin的浓度，F表示加入凝血酶后的荧光峰值强度；F0表示未加入凝血酶的荧光峰值强度)，相关系数为0.993，凝血酶的检出限为0.97nM。

MB(8+8)比MB(15+8)的检出限低，可能是因为形成MB(8+8)杂交的碱基数较少，在遇到凝血酶后更易形成G-四联体结构。

实施例4：采用实施例3中的方法，将凝血酶替换为胰蛋白酶和溶菌酶，两种分子信标MB(15+8)和MB(8+8)和胰蛋白酶、溶菌酶以及凝血酶的浓度比例都为1：1，37℃孵育30min。

实验结果如图5所示，两种分子信标MB(15+8)和MB(8+8)对非特异性蛋白(如胰蛋白酶、溶菌酶)几乎都没有荧光反应，然而，在加入凝血酶后，产生了较高的荧光信号变化(参见图5a和5b)，说明本发明构建的分子信标对于凝血酶具有高特异性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但不是对实施方式的限制。对于所属领域的人员来说，在上述说明的基础上做出的其它不同形式的改变都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国石油大学（华东）；安丘市增塑剂厂

<120> 一种分子信标、其构建方法及应用

<130> DI20-0911-XC03

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 凝血酶适配体

<400> 1

agtccgtggt agggcaggtt ggggtgact 29

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SS

<400> 2

cttcttgttt cctttaaagt ccgtggtagg gcaggttggg gtgactaagt cttc 54

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cDNA2（15+8）

<400> 3

aaaggaaaca agaaggaaga ctt 23

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cDNA3（8+8）

<400> 4

acaagaagga agactt 16

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cDNA1（15+6）

<400> 5

aaaggaaaca agaaggaaga c 21

Claims

1.一种检测凝血酶的方法，所述方法包括以下步骤：

1）检测液的制备：将含分子信标、Tris-HCl pH=8.0、Na⁺、Mg²⁺的溶液置于离心管中，加入ddH₂O稀释，然后将溶液混匀、离心，等量分装至PCR离心管中进行梯度退火，

其中，所述分子信标包括：

两条寡核苷酸链，

其中，

所述两条寡核苷酸链中的一条为主链单链，其核苷酸序列包括：5’ 端连接序列、适配体序列以及3’ 端连接序列，所述主链单链在 5’ 端和 3’ 端分别标记淬灭基团和荧光基团或者在5’ 端和 3’ 端分别标记荧光基团和淬灭基团，并且所述主链单链具有SEQ IDNO.2的序列；

述两条寡核苷酸链中的另一条为互补短链cDNA，其无任何修饰基团，所述互补短链cDNA包含与所述主链单链中的5’ 端连接序列的部分或全部互补的5’ 端互补序列、和与所述主链单链中的3’ 端连接序列的部分或全部互补的3’ 端互补序列，以使所述淬灭基团和所述荧光基团不分开其中，所述互补短链cDNA在主链单链的5’ 端和3’ 端与主链单链互补的碱基的个数分别不低于8个，并且所述短链cDNA具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的序列；

2）线性方程的构建：通过固定分子信标的浓度，也即，体系中主链单链的最终浓度，改变凝血酶的浓度制备一系列溶液，用荧光分光光度计测定加入凝血酶前后的溶液在518nm荧光峰值强度，以凝血酶浓度x以及（F-F0）/F0构建线性方程，其中凝血酶浓度x的单位为mol/L，F表示加入凝血酶的溶液在518nm的荧光峰值强度，F0表示未加凝血酶的溶液在518nm的荧光峰值强度；

3）凝血酶的测定：测定待测的凝血酶在518nm荧光峰值强度，并代入上述线性方程，计算得到凝血酶的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1）中，主链与短链cDNA的比例为1:1-1:10。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2）和步骤3）中，荧光分光光度计的激发波长设置为490nm，发射扫描范围为500～600nm，激发和发射狭缝分别为2.5nm和5nm，扫描速度是300nm/min。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1）至步骤3）中，Mg²⁺的浓度为1-10mM。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1）至步骤3）中，Mg²⁺的浓度为5mM。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2）中，固定分子信标的浓度为100nM，改变人Thrombin浓度，37℃孵育30min，测定体系在518nm荧光峰值强度。

7. 根据权利要求1所述的方法，其中，

所述淬灭基团为Dabcyl，所述荧光基团为FAM，或者

所述淬灭基团为BHQ2，所述荧光基团为Cy5。

8.一种分子信标，所述分子信标包括：

两条寡核苷酸链，

其中，

所述两条寡核苷酸链中的另一条为互补短链cDNA，其无任何修饰基团，所述互补短链cDNA包含与所述主链单链中的5’ 端连接序列的部分或全部互补的5’ 端互补序列、和与所述主链单链中的3’ 端连接序列的部分或全部互补的3’ 端互补序列，以使所述淬灭基团和所述荧光基团不分开，并且所述短链cDNA具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的序列。

9. 根据权利要求8所述的分子信标，其中，

所述淬灭基团为Dabcyl，所述荧光基团为FAM，或者

所述淬灭基团为BHQ2，所述荧光基团为Cy5。