CN114540358B - 一种利用聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶增强作用合成的dna-银纳米团簇及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶增强作用合成的DNA‑银纳米团簇及其应用。具体的，本发明合成β‑淀粉样蛋白寡聚体(AβO)适配体的DNA序列；合成3’端连接聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶的与β‑淀粉样蛋白寡聚体适配体杂交成双链结构的互补DNA序列；通过硼氢化钠还原银离子在AβO适配体上生成发光银纳米团簇的前体；将带有发光银纳米团簇的前体的AβO适配体与3’端连接聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶的互补DNA序列进行杂交，得到强荧光的DNA‑银纳米团簇，其荧光增强达300倍以上。本发明提出了一种全新的荧光增强机理，即poly‑dT或poly‑dA与带有发光银纳米团簇前体的AβO适配体组合成网状结构，形成发强光的银纳米团簇。本发明为银簇的荧光增强提供了新的方式。

Description

一种利用聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶增强作用合成的 DNA-银纳米团簇及其应用
技术领域
本发明涉及DNA-银纳米团簇合成技术领域。更具体地，涉及一种利用聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶增强作用合成的DNA-银纳米团簇及其应用。
背景技术
银纳米团簇(AgNCs)，由几个到几十个银原子组成，是一类可以激发出荧光的银纳米颗粒。由于其独特的优势，如：光稳定性好、尺寸小、生物相容性好、高的量子效率、合成简单，已经被广泛的研究。特别是DNA为模板的银纳米团簇(DNA-AgNCs)，可以通过改变DNA模板的长度、碱基序列和结构来合成具有不同发射波长的银纳米簇，波长范围可从可见到近红外范围内变化，因而被广泛的应用于细胞成像、生物标记以及生物、化学传感。
目前，基于DNA-AgNCs的传感主要利用Yeh等人在2010年报道的富G链增强AgNCs荧光以及Ye等人在2014年报道的两个DNA-AgNCs相互靠近时会产生很强的荧光增强来建立传感体系。在这两种情况中，其荧光增强机理尚不明确，并且往往需要将AgNCs的DNA合成模板连接在与目标物具有特异性结合能力的适配体上。我们需要发展新的增强机理并进行进一步的研究，使其更好的应用于不同物质的检测，扩宽它的应用场景。
发明内容
本发明的一个目的在于提供了一种全新的银纳米团簇荧光增强机理，即利用聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶增强作用合成DNA-银纳米团簇，此方法不需要在适配体上连接现有技术中常用的生成发光银纳米团簇的DNA模板。
本发明的第二个目的在于提供一种通过上述方法制备获得的DNA-银纳米团簇。
本发明的第三个目的在于提供上述DNA-银纳米团簇的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供了一种利用聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶增强作用合成DNA-银纳米团簇的方法，该方法包括：
1)合成β-淀粉样蛋白寡聚体适配体的DNA序列；
2)合成与β-淀粉样蛋白寡聚体适配体杂交成双链结构的互补DNA序列，且其3’端连接聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶；其中，所述与β-淀粉样蛋白寡聚体适配体杂交成双链结构的互补DNA序列中含1-3个错配碱基，所述3’端连接聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶的碱基个数为6-24个；
3)将步骤1)的β-淀粉样蛋白寡聚体适配体DNA序列和硝酸银加入到缓冲溶液中，震荡，冰浴，之后加入硼氢化钠，震荡，冰浴，在β-淀粉样蛋白寡聚体适配体上合成银纳米团簇的前体；
4)将步骤3)获得的带有银纳米团簇前体的β-淀粉样蛋白寡聚体适配体和步骤2)获得的3’端连接聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶的互补DNA序列加入到缓冲溶液中，放置一段时间，即得。
本发明合成DNA-银纳米团簇的方法不需要在适配体上连接现有技术中常用的生成发光银纳米团簇的DNA模板，而是直接在β-淀粉样蛋白寡聚体(AβO)适配体上合成强荧光的银纳米团簇的前体(Apt-Ag)，再通过3’端连接有聚脱氧腺嘌呤(poly-dA)或者聚脱氧胸腺嘧啶(poly-dT)的可与AβO适配体杂交成双链结构的互补DNA链作用，合成具有强荧光的DNA-银纳米团簇(DNA-AgNCs)。基于该DNA-银纳米团簇的荧光强度测定提出一种全新的荧光增强机理，即poly-dT或poly-dA与带有强荧光银纳米团簇前体的AβO适配体通过碱基配对组合成网状结构，形成发强光的银纳米团簇。
进一步的，本发明涉及的β-淀粉样蛋白寡聚体适配体为本领域已知，在此提供一种β-淀粉样蛋白寡聚体适配体的DNA序列，如SEQ ID No.1所示：5’-GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCGTTTTTTTTTT-3’，此处3’端的10个T可替换为10个A，同时对应互补链上的3’端的A替换为T，也能达到同样的效果。同样地，对其3’端T或A碱基数量的调节，只要能实现本发明，均属于本发明保护的范围。
进一步的，基于上述β-淀粉样蛋白寡聚体适配体3’端包含10T的情况，本发明示例性地提供了与β-淀粉样蛋白寡聚体适配体杂交成双链结构的互补DNA序列，可以选自下面中的任一种，但不能以此限制本发明的保护范围，本发明中的互补DNA序列可以依据β-淀粉样蛋白寡聚体适配体的DNA序列进行调整：
5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGC-3’，如SEQ ID No.2所示，距离5’端的第8个碱基、第17个碱基和第26个碱基为错配碱基；
5’-AAAAAAATAACGCACCCGCCCCAACACCACAGGC-3’，如SEQ ID No.7所示，距离5’端的第8个碱基为错配碱基；
5’-AAAAAAAAAACGCACCGGCCCCAACACCACAGGC-3’，如SEQ ID No.9所示，在距离5’端的第17个碱基为错配碱基；
5’-AAAAAAAAAACGCACCCGCCCCAACTCCACAGGC-3’，如SEQ ID No.11所示，在距离5’端的第26个碱基为错配碱基；
5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACACCACAGGC-3’，如SEQ ID No.13所示，在距离5’端的第8个碱基和第17个碱基为错配碱基；
5’-AAAAAAAAAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGC-3’，如SEQ ID No.15所示，在距离5’端的第17个碱基和第26个碱基为错配碱基；
5’-AAAAAAATAACGCACCCGCCCCAACTCCACAGGC-3’，如SEQ ID No.17所示，在距离5’端的第8个碱基和第26个碱基为错配碱基。
进一步的，在所述互补DNA的3’端连接聚脱氧腺嘌呤或者聚脱氧胸腺嘧啶的碱基个数优选为12个。
进一步的，上述步骤3)中，所述β-淀粉样蛋白寡聚体适配体DNA序列和硝酸银的物质的量比为1:6；
进一步的，所述硝酸银与硼氢化钠的物质的量比为1:1；
进一步的，所述缓冲液为10mM，pH 7.2-7.4的磷酸缓冲溶液。
进一步的，上述步骤4)中，所述带有银纳米团簇前体的β-淀粉样蛋白寡聚体适配体与3’端连接聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶的互补DNA序列的物质的量比为1:1-2.4；
进一步的，所述缓冲液为为10mM，pH 7.2-7.4的磷酸缓冲溶液。。
第二方面，本发明提供一种利用上述方法合成的DNA-银纳米团簇。
本发明利用poly-dA或者poly-dT的增强作用来合成的强荧光的DNA-AgNCs在荧光光谱上进行测试，激发波长为550nm，发射波长为615nm。
第三方面，本发明还要保护上述DNA-银纳米团簇在检测β-淀粉样蛋白中的应用，及该DNA-银纳米团簇在制备检测β-淀粉样蛋白的适配体传感器中的应用。
本发明的DNA-银纳米团簇可以对AβO实现高灵敏检测。
本发明的有益效果如下：
1.不需要单独在适配体上连接现有技术中常用的生成发光银纳米团簇生成的DNA模板，增强的效果也非常明显。直接用AβO适配体生成发光银纳米团簇的前体，在3’端连接poly-dT或poly-dA的互补DNA链作用下生成发强荧光的银纳米团簇。
2.提出了一种全新的荧光增强机理，即poly-dT或poly-dA与带有发光银纳米团簇前体的AβO适配体组合成网状结构，形成发强光的银纳米团簇。本发明为银簇的荧光增强提供了新的方式。
3.将这种荧光增强机制用于AβO的高灵敏检测。
4.本发明对于AβO或其它物质传感器的构建及目标物质检测提供了一种新的构思。同时，它对理解银纳米团簇荧光增强的机理具有非常重要的作用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出实施例1-3中合成带有强荧光银纳米团簇前体的AβO适配体(Apt-Ag)以及加入3’端连接Poly-dA的互补DNA链后生成强荧光DNA-银纳米团簇的示意图。
图2示出实施例1中带有强荧光银纳米团簇前体的AβO适配体(Apt-Ag)以及加入3’端连接Poly-dA或者Poly-dT的互补DNA链后生成的AgNCs-12A、AgNCs-12T的荧光发射光谱图，所用DNA-AgNCs的浓度为6.25μM(按AβO适配体的浓度计算)。
图3示出实施例1中以带有强荧光银纳米团簇前体的AβO适配体(Apt-Ag)以及加入3’端连接Poly-dA或者Poly-dT的互补DNA链后生成的AgNCs-12A、AgNCs-12T的紫外吸收图，所用DNA-AgNCs的浓度为6.25μM(按AβO适配体的浓度计算)。
图4示出实施例2中通过改变互补链中错配的数量、位置，合成的不同DNA-AgNCs的荧光发射光谱图中发射峰615nm处的荧光强度所对应的柱状图，所用DNA-AgNCs的浓度为500nM(按AβO适配体的浓度计算)，n＝3。
图5示出实施例3中以改变修饰在互补链3’端的poly-dA的碱基数量，合成的不同AgNCs-0A、AgNCs-6A、AgNCs-12A、AgNCs-18A以及AgNCs-24A的荧光发射光谱图中发射峰615nm处的荧光强度所对应的柱状图，所用DNA-AgNCs的浓度为500nM(按AβO适配体的浓度计算)，n＝3。
图6示出对比例1中以改变修饰在互补链3’端的碱基类型，合成的不同Apt-Ag、AgNCs-12A、AgNCs-12T、AgNCs-12C以及AgNCs-12G的荧光发射光谱图中发射峰615nm处的荧光强度所对应的柱状图，所用DNA-AgNCs的浓度为500nM(按AβO适配体的浓度计算)，n＝3；
图7示出对比例1中DNA-银纳米簇AgNCs-12A在615nm处的荧光强度随β-粉样蛋白寡聚体(AβO)浓度变化的荧光发射光谱图，所用DNA-AgNCs的浓度为250nM(按AβO适配体的浓度计算)。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1 利用聚脱氧腺嘌呤(poly-dA)或聚脱氧胸腺嘧啶(poly-dT)的增强来合成强荧光的DNA-银纳米团簇
包括以下步骤：
1)合成AβO适配体的DNA序列
合成5’-GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCGTTTTTTTTTT-3’(如SEQ ID No.1所示，3’端修饰10T，在本文中将此链定义为AβO适配体)。
2)合成3’端连接聚脱氧腺嘌呤(poly-dA)或聚脱氧胸腺嘧啶(poly-dT)的可与AβO适配体杂交成双链结构的互补DNA序列，此处，poly-dA或poly-dT的碱基个数以12个为例，具体的：
互补DNA序列为：5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGC-3’，如SEQ ID No.2所示，距离5’端的第8个碱基、第17个碱基和第26个碱基为错配碱基；
3’端连接poly-dA的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGCAAAAAAAAAAAA-3’，如SEQ ID No.3所示，划线部分为用于增强荧光的12个脱氧腺嘌呤，将此条链定义为COM-12A；
3’端连接poly-dT的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGCTTTTTTTTTTTT-3’，如SEQ ID No.4所示，划线部分为用于增强荧光的12个脱氧胸腺嘧啶，将此条链定义为COM-12T。
3)按物质的量比为1:6将步骤1)获得的AβO适配体DNA序列和硝酸银加入到10mM，pH7.2-7.4的PB缓冲液中，震荡30s，然后在黑暗中冰浴反应20min，之后加入新配置的硼氢化钠，硝酸银与硼氢化钠的物质的量的比为1:1，震荡30s，置于4℃冰箱中保持5h，即在AβO适配体上合成强荧光银纳米团簇的前体(Apt-Ag)。
4)按物质的量比为1:2将步骤3)获得的带有强荧光银纳米团簇前体的AβO适配体(Apt-Ag)与步骤2)获得的3’端连接poly-dA或poly-dT的互补DNA序列(COM-12A或者COM-12T)，加入到缓冲溶液中，放置2.5h，得到强荧光的AgNCs-12A和AgNCs-12T。具体合成过程如图1所示。
5)将上述制得的带有强荧光银纳米团簇前体的AβO适配体(Apt-Ag)以及合成的强发光AgNCs-12A和AgNCs-12T放在光谱仪上进行测试，选择FL-4600荧光光谱仪(日立)作为检测仪器，选择550nm作为DNA-AgNCs的激发波长。荧光光谱图如图2所示。从图1中可以看出，3’端连接poly-dA或poly-dT的互补DNA链(COM-12A/12T)与带有强荧光银纳米团簇前体的AβO适配体(Apt-Ag)杂交后，最大发射峰615nm处的荧光发生了很强的增强，且增强效果COM-12A>COM-12T，证明3’端连接poly-dA或poly-dT的互补DNA链具有增强AβO适配体上合成的强银纳米团簇前体(Apt-Ag)荧光强度的作用。由于腺嘌呤和胸腺嘧啶对银离子的结合力弱，我们猜测可能是两者引起了DNA结构的变化，导致了荧光的增强。
6)将上述制得的带有强荧光银纳米团簇前体的AβO适配体(Apt-Ag)以及合成的强发光AgNCs-12A和AgNCs-12T放在紫外吸收光谱仪上进行测试。紫外吸收如图3所示。从图4中可以看出，3’端连接poly-dA或poly-dT的互补DNA链(COM-12A/12T)与带有强荧光银纳米团簇前体(Apt-Ag)的AβO适配体链杂交后，400nm处的吸收峰降低并分裂为380nm、425nm左右的两个峰(两者略有差异)，550nm处的吸收增强，说明杂交之后，由不发光的银纳团米簇前体(Apt-Ag)转变成了可以发强荧光的银纳米团簇。并且COM-12A加入后550nm处的吸收峰增强大于COM-12T的增强效果，对应于COM-12A加入后的荧光强度增强效果高于COM-12T的增强效果。
实施例2 探究互补DNA序列中错配位置和数量对增强效果的影响。
包括以下步骤：
1)合成AβO适配体的DNA序列
合成5’-GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCGTTTTTTTTTT-3’(如SEQ ID No.1所示，3’端修饰10T，在本文中将此链定义为AβO适配体)。
2)合成3’端连接聚脱氧胸腺嘧啶(poly-dT)的可与AβO适配体杂交成双链结构的互补DNA序列(含0-3个错配)，此处，poly-dT的碱基个数以12个为例，具体的：
无错配碱基情况：
互补DNA序列为：5’-AAAAAAAAAACGCACCCGCCCCAACACCACAGGC-3’，如SEQ ID No.5所示，无错配碱基；
3’端连接poly-dT的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAAAAACGCACCCGCCCCAACACCACAGGCTTTTTTTTTTTT-3’，如SEQ ID No.6所示，划线部分为用于增强荧光的12个脱氧胸腺嘧啶，将此链定义为COM-0-12T；
含1个错配碱基情况：
互补DNA序列为：5’-AAAAAAATAACGCACCCGCCCCAACACCACAGGC-3’，如SEQ ID No.7所示，在距离5’端的第8个碱基为错配碱基；
3’端连接poly-dT的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAATAACGCACCCGCCCCAACACCACAGGCTTTTTTTTTTTT-3’，如SEQ ID No.8所示，划线部分为用于增强荧光的12个脱氧胸腺嘧啶，将此链定义为COM-8-12T；
互补DNA序列为：5’-AAAAAAAAAACGCACCGGCCCCAACACCACAGGC-3’，如SEQ ID No.9所示，在距离5’端的第17个碱基为错配碱基；
3’端连接poly-dT的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAAAAACGCACCGGCCCCAACACCACAGGCTTTTTTTTTTTT-3’，如SEQ ID No.10所示，划线部分为用于增强荧光的12个脱氧胸腺嘧啶，将此链定义为COM-17-12T；
互补DNA序列为：5’-AAAAAAAAAACGCACCCGCCCCAACTCCACAGGC-3’，如SEQ ID No.11所示，在距离5’端的第26个碱基为错配碱基；
3’端连接poly-dT的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAAAAACGCACCCGCCCCAACTCCACAGGCTTTTTTTTTTTT-3’，如SEQ ID No.12所示，划线部分为用于增强荧光的12个脱氧胸腺嘧啶，将此链定义为COM-26-12T；
含2个错配碱基情况：
互补DNA序列为：5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACACCACAGGC-3’，如SEQ ID No.13所示，在距离5’端的第8个碱基和第17个碱基为错配碱基；
3’端连接poly-dT的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACACCACAGGCTTTTTTTTTTTT-3’，如SEQ ID No.14所示，划线部分为用于增强荧光的12个脱氧胸腺嘧啶，将此链定义为COM-8-17-12T)；
互补DNA序列为：5’-AAAAAAAAAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGC-3’，如SEQ ID No.15所示，在距离5’端的第17个碱基和第26个碱基为错配碱基；
3’端连接poly-dT的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAAAAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGCTTTTTTTTTTTT-3’，如SEQ ID No.16所示，划线部分为用于增强荧光的12个脱氧胸腺嘧啶，将此链定义为COM-17-26-12T)；
互补DNA序列为：5’-AAAAAAATAACGCACCCGCCCCAACTCCACAGGC-3’，如SEQ ID No.17所示，在距离5’端的第8个碱基和第26个碱基为错配碱基；
3’端连接poly-dT的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAATAACGCACCCGCCCCAACTCCACAGGCTTTTTTTTTTTT-3’，如SEQ ID No.18所示，划线部分为用于增强荧光的12个脱氧胸腺嘧啶，将此链定义为COM-8-26-12T；
含3个错配碱基情况：
互补DNA序列为：5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGC-3’，如SEQ ID No.2所示，在距离5’端的第8个碱基、第17个碱基和第26个碱基为错配碱基；
3’端连接poly-dT的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGCTTTTTTTTTTTT-3’，如SEQ ID No.4所示，划线部分为用于增强荧光的12个脱氧胸腺嘧啶，将此条链定义为COM-12T。
3)按物质的量比为1:6将步骤1)获得的AβO适配体DNA序列和硝酸银加入到10mM，pH7.2-7.4的PB缓冲液中，震荡30s，然后在黑暗中冰浴反应20min，之后加入新配置的硼氢化钠，硝酸银与硼氢化钠的物质的量的比为1:1，震荡30s，置于4℃冰箱中保持5h，即在AβO适配体上合成强荧光银纳米团簇的前体(Apt-Ag)；
4)按物质的量比为1:2将步骤3)获得的Apt-Ag分别与步骤2)获得的3’端连接poly-dT的互补DNA链(不同错配位置、错配数量)，例如，COM-0-12T、COM-8-12T、COM-17-12T、COM-26-12T、COM-8-17-12T、COM-17-26-12T、COM-8-26-12T以及COM-12T加入到缓冲溶液中，放置2.5h，即得AgNCs-COM-0-12T、AgNCs-COM-8-12T、AgNCs-COM-17-12T、AgNCs-COM-26-12T、AgNCs-COM-8-17-12T、AgNCs-COM-17-26-12T、COM-8-26-12T以及AgNCs-12T。
5)将上述制得的带有强荧光银纳米团簇前体的AβO适配体(Apt-Ag)、AgNCs-COM-0-12T、AgNCs-COM-8-12T、AgNCs-COM-17-12T、AgNCs-COM-26-12T、AgNCs-COM-8-17-12T、AgNCs-COM-17-26-12T、AgNCs-COM-8-26-12T以及AgNCs-12T放在光谱仪上进行测试，选择FL-4600荧光光谱仪(日立)作为检测仪器，选择550nm作为DNA-AgNCs的激发波长。荧光光谱图如图4所示。从图中可以看到荧光强度AgNCs-12T>AgNCs-COM-17-26-12T>AgNCs-COM-8-17-12T>AgNCs-COM-8-26-12T≈AgNCs-COM-26-12T≈AgNCs-COM-17-12T≈AgNCs-COM-8-12T>Apt-Ag，说明错配的位置和错配的数量会影响增强的效果，最终影响形成的DNA-AgNCs的荧光强度。并且错配位点第17和26个碱基同时存在时，才会产生很强的荧光增强效果，而三错配的增强效果最强，我们猜测这可能是因为形成双链DNA结构后，由于碱基互补配对，有着更刚性的构象，影响着银原子与AβO适配体上的结合，从而影响最终的荧光增强效果。
实施例3 探究聚脱氧腺嘌呤(poly-dA)或聚脱氧胸腺嘧啶(poly-dT)的碱基个数对增强效果的影响。
1)合成AβO适配体的DNA序列
合成5’-GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCGTTTTTTTTTT-3’(如SEQ ID No.1所示，3’端修饰10T，在本文中将此链定义为AβO适配体)。
2)合成3’端连接不同数量聚脱氧胸腺嘌呤(poly-dA)的可与AβO适配体杂交成双链结构的互补DNA序列(含3个错配)，具体的：
互补DNA序列为：5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGC-3’，如SEQ ID NO.2所示，距离5’端的第8个碱基、第17个碱基和第26个碱基为错配碱基；将此链定义为COM-0A。
3’端连接不同数量poly-dA的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGCAAAAAA-3’，如SEQ ID NO.19所示，将此链定义为COM-6A。
5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGCAAAAAAAAAAAA-3’，如SEQ ID NO.3所示，将此链定义为COM-12A。
5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGCAAAAAAAAAAAAAAAAA A-3’，如SEQ IDNO.20所示，将此链定义为COM-18A。
5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGCAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAA-3’，如SEQ ID NO.21所示，将此链定义为COM-24A。
3)按物质的量比为1:6将步骤1)获得的AβO适配体DNA序列和硝酸银加入到10mM，pH7.2-7.4的PB缓冲液中，震荡30s，然后在黑暗中冰浴反应20min，之后加入新配置的硼氢化钠，硝酸银与硼氢化钠的物质的量的比为1:1，震荡30s，置于4℃冰箱中保持5h，即在AβO适配体上合成强荧光银纳米团簇的前体(Apt-Ag)；
4)按物质的量比为1:2将步骤3)获得的Apt-Ag分别与步骤2)获得的3’端连接poly-dT的互补DNA链(不同错配位置、错配数量)，例如，COM-0A、COM-6A、COM-12A、COM-18A以及COM-24A加入到缓冲溶液中，放置2.5h，即得AgNCs-COM-0A、AgNCs-COM-6A、AgNCs-COM-12A、AgNCs-COM-18A以及AgNCs-COM-24A。
5)将上述制得的带有强荧光银纳米团簇前体的AβO适配体(Apt-Ag)、AgNCs-0A、AgNCs-COM-6A、AgNCs-12A、AgNCs-18A以及AgNCs-24A放在光谱仪上进行测试，选择FL-4600荧光光谱仪(日立)作为检测仪器，选择550nm作为DNA-AgNCs的激发波长。荧光光谱图如图5所示。从图中可以看到荧光强度(Apt-Ag)<AgNCs-0A<AgNCs-6A<AgNCs-12A<AgNCs-18A<AgNCs-24A，随着腺嘌呤的个数的增强，荧光强度也逐渐增加，在腺嘌呤个数为12时，增强逐渐平稳，即在12时，基本达到了稳定。
对比例1 探究聚脱氧胞嘧啶(poly-dC)和聚脱氧鸟嘌呤(poly-dG)是否也可以达到聚脱氧腺嘌呤(poly-dA)和聚脱氧胸腺嘧啶(poly-dT)的增强效果。
包括以下步骤：
1)合成AβO适配体的DNA序列
合成5’-GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCGTTTTTTTTTT-3’(如SEQ ID No.1所示，3’端修饰10T，在本文中将此链定义为AβO适配体)。
2)合成3’端分别连接poly-dA、poly-dT、poly-dC、poly-dG的可与AβO适配体杂交成双链结构的互补DNA序列，此处，poly-dA、poly-dT、poly-dC、poly-dG的碱基个数均以12个为例，具体的：
互补DNA序列为：5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGC-3’，如SEQ ID No.2所示，在距离5’端的第8个碱基、第17个碱基和第26个碱基为错配碱基。
3’端连接poly-dA的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGCAAAAAAAAAAAA-3’，如SEQ ID No.3所示，划线部分为用于增强荧光的12个脱氧腺嘌呤，将此条链定义为COM-12A。
3’端连接poly-dT的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGCTTTTTTTTTTTT-3’，如SEQ ID No.4所示，划线部分为用于增强荧光的12个脱氧胸腺嘧啶，将此条链定义为COM-12T。
3’端连接poly-dC的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGCCCCCCCCCCCCC-3’，如SEQ ID No.22所示，划线部分为用于增强荧光的12个脱氧胞嘧啶，将此条链定义为COM-12C。
3’端连接poly-dG的互补DNA序列为：
5’-AAAAAAATAACGCACCGGCCCCAACTCCACAGGCGGGGGGGGGGGG-3’如SEQ ID No.23所示，划线部分为用于增强荧光的12个脱氧鸟嘌呤，将此条链定义为COM-12G。
3)按物质的量比为1:6将步骤1)获得的AβO适配体DNA序列和硝酸银加入到10mM，pH7.2-7.4的PB缓冲液中，震荡30s，然后在黑暗中冰浴反应20min，之后加入新配置的硼氢化钠，硝酸银与硼氢化钠的物质的量的比为1:1，震荡30s，置于4℃冰箱中保持5h，即在AβO适配体上合成强荧光银纳米团簇的前体(Apt-Ag)；
4)按物质的量比为1:2将步骤3)获得的带有强荧光银纳米团簇前体的AβO适配体(Apt-Ag)分别与步骤2)获得的COM-12A、COM-12T、COM-12C、COM-12G加入到缓冲溶液中，放置2.5h，即得强发光的AgNCs-12A、AgNCs-12T、AgNCs-12C以及AgNCs-12G。
5)将上述制得的带有强荧光银纳米团簇前体的AβO适配体(Apt-Ag)以及合成的强发光AgNCs-12A、AgNCs-12T、AgNCs-12C以及AgNCs-12G放在光谱仪上进行测试，选择FL-4600荧光光谱仪(日立)作为检测仪器，选择550nm作为DNA-AgNCs的激发波长。荧光光谱图如图6所示。从图中可以看到荧光强度AgNCs-12A>AgNCs-12T>AgNCs-12C>AgNCs-12G>Apt-Ag，说明聚脱氧胞嘧啶(poly-dC)和聚脱氧鸟嘌呤(poly-dG)不能达到聚脱氧腺嘌呤(poly-dA)和聚脱氧胸腺嘧啶(poly-dT)的增强效果，说明A和T相对C和G来说，对带有银纳米团簇前体的AβO适配体(Apt-Ag)的荧光增强效果更好，我们猜测可能是由于AβO适配体的3’端是由10个T连接，互补链的3’端由9A(T)、5’端由12A连接，导致带有强荧光银纳米团簇前体的AβO适配体(Apt-Ag)与AβO适配体互补链修饰的poly-dA或者poly-dT的AβO适配体互补链之间通过碱基配对结合起来，从而使银簇的荧光实现明显的增强。因此，最终我们选择了聚脱氧腺嘌呤(poly-dA)和聚脱氧胸腺嘧啶(poly-dT)。
6)将上述制得的强荧光DNA-AgNCs：AgNCs-12A，加入到PB缓冲溶液中，其浓度为250nM(传感器的浓度按体系中AβO适配体(序列如SEQ1D No.1所示)的浓度计算)，再分别加入40μl不同浓度的AβO(0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml)，最终溶液体积为1ml，在25℃下培育1.5h。将上述加有不同浓度AβO的样品在光谱仪上进行测试，选择的激发波长为550nm，荧光光谱图如图7所示。从图7中可以看出，随着AβO浓度的增加，615nm处的荧光强度逐渐降低，说明该强荧光DNA-银纳米簇可以用来检测AβO。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院理化技术研究所
<120> 一种利用聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶增强作用合成的DNA-银纳米团簇及其应用
<130> JLP21I1809
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctgtggtg ttggggcggg tgcgtttttt tttt 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaaaaataa cgcaccggcc ccaactccac aggc 34
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaaaaataa cgcaccggcc ccaactccac aggcaaaaaa aaaaaa 46
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaaaaataa cgcaccggcc ccaactccac aggctttttt tttttt 46
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaaaaaaaa cgcacccgcc ccaacaccac aggc 34
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaaaaaaaa cgcacccgcc ccaacaccac aggctttttt tttttt 46
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaaaaaataa cgcacccgcc ccaacaccac aggc 34
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaaaaaataa cgcacccgcc ccaacaccac aggctttttt tttttt 46
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaaaaaaaaa cgcaccggcc ccaacaccac aggc 34
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaaaaaaaaa cgcaccggcc ccaacaccac aggctttttt tttttt 46
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaaaaaaaaa cgcacccgcc ccaactccac aggc 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaaaaaaaaa cgcacccgcc ccaactccac aggctttttt tttttt 46
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaaaaaataa cgcaccggcc ccaacaccac aggc 34
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaaaaaataa cgcaccggcc ccaacaccac aggctttttt tttttt 46
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaaaaaaaa cgcaccggcc ccaactccac aggc 34
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaaaaaaaa cgcaccggcc ccaactccac aggctttttt tttttt 46
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaaaaaataa cgcacccgcc ccaactccac aggc 34
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaaaaaataa cgcacccgcc ccaactccac aggctttttt tttttt 46
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaaaaaataa cgcaccggcc ccaactccac aggcaaaaaa 40
<210> 20
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaaaaaataa cgcaccggcc ccaactccac aggcaaaaaa aaaaaaaaaa aa 52
<210> 21
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aaaaaaataa cgcaccggcc ccaactccac aggcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 58
<210> 22
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aaaaaaataa cgcaccggcc ccaactccac aggccccccc cccccc 46
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aaaaaaataa cgcaccggcc ccaactccac aggcgggggg gggggg 46

Claims (4)

1.一种利用聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶增强作用合成DNA-银纳米团簇的方法，其特征在于，该方法包括：
1）合成β-淀粉样蛋白寡聚体适配体的DNA序列；所述β-淀粉样蛋白寡聚体适配体的DNA序列如SEQ ID No.1所示；
2）合成与β-淀粉样蛋白寡聚体适配体杂交成双链结构的互补DNA序列，且其3’端连接聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶；所述3’端连接聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶的碱基个数为6-24个；其中，所述与β-淀粉样蛋白寡聚体适配体杂交成双链结构的互补DNA序列选自下面中的任一种：
如SEQ ID No.2所示，距离5’端的第8个碱基、第17个碱基和第26个碱基为错配碱基；
如SEQ ID No.13所示，在距离5’端的第8个碱基和第17个碱基为错配碱基；
如SEQ ID No.15所示，在距离5’端的第17个碱基和第26个碱基为错配碱基；
3）将步骤1）的β-淀粉样蛋白寡聚体适配体DNA序列和硝酸银加入到缓冲溶液中，震荡，冰浴，之后加入硼氢化钠，震荡，冰浴，在β-淀粉样蛋白寡聚体适配体上合成银纳米团簇的前体；所述β-淀粉样蛋白寡聚体适配体DNA序列和硝酸银的物质的量比为1: 6；所述硝酸银与硼氢化钠的物质的量比为1:1；
4）将步骤3）获得的带有银纳米团簇前体的β-淀粉样蛋白寡聚体适配体和步骤2）获得的3’端连接聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶的互补DNA序列加入到缓冲溶液中，所述带有银纳米团簇前体的β-淀粉样蛋白寡聚体适配体与3’端连接聚脱氧腺嘌呤或聚脱氧胸腺嘧啶的互补DNA序列的物质的量比为1:2，放置一段时间，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚脱氧腺嘌呤或者聚脱氧胸腺嘧啶的碱基个数为12个。
3.一种如权利要求1-2任一所述方法合成的DNA-银纳米团簇。
4.如权利要求3所述的DNA-银纳米团簇在制备检测β-淀粉样蛋白产品中的应用。
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聚胸腺嘧啶单链DNA-CuNCs荧光增强法用于汞离子的高灵敏检测;李婷;曹忠;李盼盼;何婧琳;肖慧;杨婵;;高等学校化学学报(09);第36-41页 *

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